CN104293751A - 包含丝氨酸蛋白酶变体的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了用于蛋白改造的方法，以及从其产生的丝氨酸蛋白酶变体。具体而言，本发明提供了相比参照的丝氨酸蛋白酶，具有一个或多个取代的丝氨酸蛋白酶变体。此外，本发明提供了包含这些丝氨酸蛋白酶变体的组合物。在一些实施方案中，本发明提供了包含至少一种这些丝氨酸蛋白酶变体的清洁组合物。
Description
本申请为2009年11月10日提交的、发明名称为“包含丝氨酸蛋白酶变体的组合物和方法”的PCT申请PCT/US2009/063808的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2011年5月11日，申请号为200980144959.X。
本申请要求美国临时专利申请系列号61/113,545、61/113,552、61/113,548的优先权，上述申请均于2008年11月11日提交，以及61/218,802的优先权，它是2009年6月19日提交的，所有上述优先权申请均通过引用并入本文中。
技术领域
本发明提供了蛋白质改造的方法，以及从所述方法产生的丝氨酸蛋白酶。具体而言，本发明提供相比参照丝氨酸蛋白酶具有一个或多个取代的丝氨酸蛋白酶。此外，本发明提供包含这类丝氨酸蛋白酶变体的组合物。在一些实施方案中，本发明提供了包含至少一种的这类丝氨酸蛋白酶变体的清洁组合物。
背景技术
各种蛋白质改造方法是本领域技术人员已知的。一般而言，为了获得理想的蛋白质性质而修饰蛋白质。在大部分方法中，突变编码蛋白质的克隆基因的核苷酸序列，并表达修饰的基因来产生变体，筛选所述变体的目标活性。通常，比较变体的性质与野生型蛋白质的性质。
从历史的观点而言，所探讨的蛋白质设计方法等价于这样的问题，即在所有的蛋白质空间(space)中发现一条适合理想应用的最佳序列。这一问题非常棘手，是“NP困难(NP-hard)的”。在复杂性理论中，定义为P类的问题被认为是简单有效的，其解法存在多项式时间算法。NP困难问题是有效的多项式时间算法目前尚未知的问题，而如果可以解决任何NP困难问题，则可以解决所有的NP困难问题(见，例如，Pierce和Winfree，Protein Engineer.，15：779-782，2002)。目前用于建立和筛选文库的策略一般涉及在整个序列中随机产生蛋白质序列多样性，或者在蛋白质的定义位置上以受控的随机方式产生所述多样性。这类文库一般具有对主要的目的性质是“阴性”的大量成员，为了发现相对少量的阳性突变，需要筛选很大数量。一般而言，忽视阴性突变，仅获得阳性成员的序列信息。
饱和诱变(Estell等，在World Biotech Report 1984，第2卷，USA，Online Publications，London，第181-187页，1984；和Wells等，Gene，34：315-323，1985中)是一种技术，可用于搜索蛋白空间中优化蛋白质的若干性质的突变。一些小组已经开发了鉴别通过饱和诱变所改变的位点的策略(Reetz等，Angew.Chem.Int Edn，44：4192-4196，2005；Kato等，J MolBiol，351：683-692，2005；和Sandberg等，Proc Natl Acad Sci USA，90：8367-8371，1993)，但尚未提出用于位点鉴别的一般系统。
此外，由于大部分蛋白质改造方法产生大量的氨基酸突变选型，故产生理想的蛋白质性质一般需要筛选大量的变体。一般而言，重复多次筛选来产生有益的变体。因而，大部分方法是耗费劳动力和时间的。本领域对于有效的且产生理想结果的蛋白质改造方法存在持续的需求。
发明概述
本发明提供了用于蛋白质改造的方法，具体而言，本发明提供了利用位点评估文库(site evaluation library)的方法。特别是，本发明提供了使用所获得的关于多种理想性质的信息的手段，为了理性而有效的设计将优化所述性质的文库。在一些实施方案中，本发明提供了设计文库的手段，所述文库针对至少两种理想性质进行了改良。本发明还提供了相比参照的丝氨酸蛋白质，具有一个或多个取代的丝氨酸蛋白酶变体，所述变体是使用本文所述的蛋白质改造方法产生的。
本发明提供了鉴别蛋白质的氨基酸序列内的位置的手段，所述位置涉及改善蛋白质的理想性质。在一些特别优选的实施方案中，本发明提供了为了产生具有这类理想性质以及改良性质的蛋白质，确定何种突变是期望的之手段。在其他一些特别优选的实施方案中，本发明提供了鉴别氨基酸位置和突变的手段，所述位置和突变比野生型蛋白质改善了特定的百分比(例如，一种性质比野生型的110％好)。在其他的优选实施方案中，本发明提供了鉴别突变的手段，所述突变提供了至少一种极大改良的性质和至少一种不显著差于野生型蛋白质的其他性质(例如，一种性质比野生型的110％好，另一种性质不比野生型的90％差)。在其他的优选实施方案中，基于该信息构建文库。在一些实施方案中，使用所有已鉴别的突变构建文库，而在一些其他的实施方案中，使用所鉴别突变的子集来构建文库。实际上，文库并非意在限于任何特定的突变数量和/或类型。
本发明提供了用于蛋白质过程的方法，其包括步骤：提供蛋白质变体的文库；在目标测试中，测试蛋白质变体文库的至少一种目标性质；针对至少一种目标性质鉴别值域；鉴别值域内与目标测试的有利结果相关的最小值；以及，提供复数的具有至少一种突变的蛋白质变体，所述突变在至少一种目标性质的域中高于最小值，从而提供包含至少一种突变的蛋白质变体文库，其中所述文库富含在目标测试中具有有利结果的成员。在一些实施方案中，与上文第一步中所述测试中观察到的最大值相比，有利的结果对应的值大于大约50％、约60％、约70％、约80％、约90％或约95％。在一些可选的实施方案中，在本发明的方法中使用一种以上的目标测试。在一些优选的实施方案中，所述蛋白质是酶。在一些特别优选的实施方案中，所述酶选自蛋白酶、转移酶、金属蛋白酶、酯酶、淀粉酶、纤维素酶、氧化酶、角质酶(cutinase)和脂肪酶。
本发明还提供了蛋白质改造的方法，其包括步骤：提高野生型蛋白质，和野生型蛋白质的蛋白质变体文库；在目标测试中，针对至少一种目标性质，测试蛋白质变体和野生型蛋白质的文库；鉴别至少一种目标性质的值域；鉴别与目标测试的有利结果相关的值域中的最小值；鉴别相比从野生型获得的结果，具有有利结果的蛋白质变体，其中有利的结果是改良的目标性质；和提供复数的蛋白质变体，所述变体高于至少一种目标性质的域中的最小值，从而提供改良的蛋白质变体的文库，所述文库富含在目标测试中具有有利结果的成员。在一些优选的实施方案中，该方法进一步包括确定性能指数的步骤，其中所述性能指数是通过每种改良的蛋白质变体所获得的值除以野生型蛋白质所获得的值来确定的。在一些特别优选的实施方案中，该方法进一步包括鉴别改良的蛋白质变体的步骤，其中改良的蛋白质变体在目标测试中达到大于约1.1的性能指数值。在一些其他的实施方案中，所述蛋白质是酶。在一些特别优选的实施方案中，所述酶选自蛋白酶、转移酶、金属蛋白酶、酯酶、淀粉酶、纤维素酶、氧化酶、角质酶和脂肪酶。在一些可选的实施方案中，所述蛋白质选自抗体和生长因子。在其他的优选的实施方案中，野生型蛋白质是酶的成熟形式，所述酶选自蛋白酶、转移酶、金属蛋白酶、酯酶、淀粉酶、纤维素酶、氧化酶、角质酶和脂肪酶。在一些优选的实施方案中，目标性质选自电荷、洗涤性能、硬表面清洁性能、热稳定性、储藏稳定性、去垢剂稳定性、底物结合、酶抑制、表达水平、反应速率，和底物降解。在一些实施方案中，野生型蛋白质和蛋白质变体是至少一种去垢剂组合物的组分。在一些优选的实施方案中，在配制成粉末状或液体去垢剂的去垢剂组合物中测试洗涤性能，所述粉末状或液体去垢剂具有在约5和约12.0之间的pH。
本发明还提供了产生参照蛋白质在蛋白质折叠(protein fold)中的改良变体的方法，其包括：在目标测定中，测定测试蛋白质在蛋白质折叠中的多个变体，所述蛋白质折叠覆盖一系列的目标性质；鉴别与目标测定的有利结果相关的一系列的目标性质中的最小值；测定目标测定中蛋白质折叠的参照蛋白质；通过将氨基酸取代导入参照蛋白质中，产生参照蛋白质的改良变体，使得改良变体高于目标性质域的最小值。在一些优选的实施方案中，参照蛋白质和测试蛋白质是不同的。在一些实施方案中，该方法进一步包括确定性能指数的步骤，其中所述性能指数是通过改良的蛋白质变体所获得的值除以参照蛋白质所获得的值来确定的。在一些实施方案中，所述测试蛋白质和参照蛋白质是酶。在一些特别优选的实施方案中，所述酶选自蛋白酶、转移酶、金属蛋白酶、酯酶、淀粉酶、纤维素酶、氧化酶、角质酶和脂肪酶。在一些可选的实施方案中，所述测试和参照蛋白质选自抗体和生长因子。在其他的优选的实施方案中，参照蛋白质是酶的成熟形式，所述酶选自蛋白酶、转移酶、金属蛋白酶、酯酶、淀粉酶、纤维素酶、氧化酶、角质酶和脂肪酶。在一些优选的实施方案中，目标性质选自电荷、洗涤性能、硬表面清洁性能、热稳定性、储藏稳定性、去垢剂稳定性、底物结合、酶抑制、表达水平、反应速率，和底物降解。在一些实施方案中，测试和参照蛋白质是至少一种去垢剂组合物的组分。在一些可选的实施方案中，改良的蛋白质变体是去垢剂组合物的组分。在一些优选的实施方案中，在配制成粉末状或液体去垢剂的去垢剂组合物中测试洗涤性能，所述粉末状或液体去垢剂具有在约5和约12.0之间的pH。
在一些实施方案中，本发明提供了包含至少一种本文所述丝氨酸蛋白酶变体的清洁组合物。在一些优选的实施方案中，清洁组合物是衣物洗涤去垢剂。在这类实施方案的子集中，衣物洗涤去垢剂是冷水型去垢剂、低pH型去垢剂，或压缩型去垢剂。在其他实施方案中，清洁组合物是餐具洗涤去垢剂。在一些实施方案中，餐具洗涤去垢剂是无磷去垢剂，而在其他实施方案中，餐具洗涤去垢剂是含磷去垢剂。在一些优选的实施方案中，清洁组合物进一步包含至少一种其他的酶，在特别优选的实施方案中，所述酶选自中性金属蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶(mannanase)、阿拉伯糖酶(arabinase)、半乳聚糖酶(galactanase)、木聚糖酶、氧化酶和过氧化物酶。本发明还提供了编码丝氨酸蛋白酶变体的分离的核酸，包含所述核酸的表达载体，和包含所述表达载体的宿主细胞。
此外，本发明提供了产生芽孢杆菌属(Bacillus)丝氨酸蛋白酶的丝氨酸蛋白酶变体的方法，其包括：用包含编码丝氨酸蛋白酶变体的核酸的表达载体转化宿主细胞；和在适合丝氨酸蛋白酶变体产生的条件下培养转化的宿主细胞。在一些实施方案中，该方法进一步包括收获所产生的丝氨酸蛋白酶变体的步骤。在一些实施方案中，宿主细胞是芽孢杆菌属物种，而在这类实施方案的子集中，芽孢杆菌属物种是枯草芽孢杆菌(B.subtilis)。进一步的，本发明提供了清洁的方法，其包括将包含织物的表面和/或物品与清洁组合物接触的步骤，所述清洁组合物包含分离的丝氨酸蛋白酶变体。在一些可选的方法中，本发明提供了清洁的方法，其包括将包含餐具的表面和/或物品与清洁组合物接触的步骤，所述清洁组合物包含分离的丝氨酸蛋白酶变体。
此外，本发明提供了用于蛋白质改造的方法，其包括步骤：a)提供复数的位点评估文库(SEL)，每个文库包含复数的蛋白酶变体，所述蛋白酶变体在与蛋白酶相同的氨基酸位置上具有不同的取代；b)在目标性质的测试中，测试SEL的蛋白酶变体和标准蛋白酶；c)确定所测试的每种蛋白酶变体的性能指数(PI)；d)鉴别两个或多个氨基酸位置作为非限制性位置，其中复数的蛋白酶变体中的至少一个在2个SEL中的每一个都具有大于约0.5的PI；和f)提供多个突变文库，所述文库包含复数的多取代蛋白酶变体，每个所述变体在两个或多个非限制性位置上包含取代。在一些实施方案中，该测试包括两个或多个选自菌株去除测定(微样品)、LAS稳定性测定、去垢剂稳定性测定和比活测定的不同测定。在一些其他实施方案中，可使用其他的和/或可选的测定方法。
在一些其他实施方案中，本发明提供了这样的方法，所述方法用于产生芽孢杆菌属丝氨酸蛋白酶的多取代丝氨酸蛋白酶变体，其包括：在第一种性质的第一测试和第二种性质的第二测试中，测试复数的单取代丝氨酸蛋白酶变体，其中，参照丝氨酸蛋白酶的性质在每种测试中给定为值1.0，有利的第一或第二性质具有大于1.0的值，而非常不利的第一或第二性质具有小于0.80的值，或者在一些优选的实施方案中，小于约0.60；鉴别至少一个在单取代的丝氨酸蛋白酶变体中的取代，所述变体是与有利的第一性质相关的，并且不与非常不利的第二性质相关；鉴别至少一个单取代丝氨酸蛋白酶变体中的取代，所述变体是与有利的第二性质相关的，并且不与非常不利的第一性质相关；将来自在先步骤中的取代导入丝氨酸蛋白酶中，产生多取代的丝氨酸蛋白酶变体。在一些实施方案中，该方法进一步包括在第一测试和第二测试中测试多取代的丝氨酸蛋白酶变体，其中，改良的丝氨酸蛋白酶变体在第一和第二测试中都获得大于约1.0的值，或者在第一测试中获得大于约1.0的值，而在第二测试中获得在约0.80至约1.0的值。在一些实施方案中，该方法进一步包括产生改良的丝氨酸蛋白酶变体在一些实施方案中，第一和第二性质是阴性相关的。在一些实施方案中，有利的第一或第二性质具有大于约1.2的值。在一些实施方案中，非常不利的第一或第二性质具有小于约0.40的值。在一些实施方案中，第一性质是稳定性，而第二性质是洗涤性能。在这类的子集中，稳定性包括在去垢剂中的稳定性，而洗涤性能包括在去垢剂中的血液、奶渍、墨水(BMI)洗涤性能。在一些实施方案中，参照细菌丝氨酸蛋白酶是解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)丝氨酸蛋白酶BPN’的野生型的成熟形式，具有SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列。在其他实施方案中，参照细菌丝氨酸蛋白酶是GG36丝氨酸蛋白酶的野生型，具有SEQ ID NO：2提出的氨基酸序列(即，用于产生“GG36变体”的参照细菌丝氨酸蛋白酶)。在本发明的一些实施方案中，在具有在约5和约12.0之间的pH的粉末状或液体去垢剂组合物中测试洗涤性能。不旨在将这些步骤限定到上面列出的精确的顺序，因为发现在本发明中使用任何合适的顺序。但是，在一些优选的实施方案中，取代位于这样的参照丝氨酸蛋白酶的位置上，所述参照丝氨酸蛋白酶具有大于约50％或大于约65％的溶剂可及表面(SAS)。
此外，本发明提供了枯草杆菌蛋白酶变体，其中变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且在一个或多个(优选，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个)位置上包含取代，所述位置选自：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18，19，20，21，22，24，25，26，27，28，29，30，31，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，66，67，68，69，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274和275，其中所述位置对照SEQ ID NO：1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。
在一些优选的实施方案中，取代包括一个或多个的：X001A、X001C、X001E，X001F，X001G，X001H，X001I，X001K，X001L，X001N，X001P，X001Q，X001R，X001S，X001T，X001V，X001Y，X002A，X002C，X002E，X002G，X002K，X002L，X002M，X002N，X002P，X002Q，X002R，X002S，X002T，X002V，X002W，X002Y，X003D，X003E，X003F，X003G，X003H，X003I，X003L，X003M，X003N，X003P，X003R，X003S，X003T，X003V，X003W，X003Y，X004A，X004C，X004D，X004E，X004F，X004G，X004H，X004K，X004L，X004N，X004P，X004R，X004S，X004T，X004V，X004W，X005A，X005C，X005D，X005E，X005G，X005I，X005M，X005P，X005Q，X005S，X005T，X005W，X005Y，X006A，X006D，X006E，X006M，X006W，X007A，X007C，X007D，X007G，X007H，X007N，X007P，X007Q，X007S，X007T，X008A，X008F，X008G，X008I，X008L，X008M，X008Q，X008T，X008V，X008W，X008Y，X009A，X009C，X009D，X009E，X009F，X009G，X009H，X009L，X009N，X009P，X009Q，X009R，X009S，X009T，X009V，X009W，X009Y，X010A，X010C，X010F，X010G，X010H，X010I，X010K，X010L，X010M，X010N，X010Q，X010R，X010S，X010T，X010V，X010W，X010Y，X011A，X011C，X011D，X011G，X011I，X011M，X011R，X011S，X011T，X011V，X011Y，X012D，X012F，X012G，X012H，X012I，X012K，X012L，X012M，X012N，X012P，X012Q，X012R，X012S，X012T，X012V，X012W，X012Y，X013A，X013G，X013I，X013M，X013Q，X013T，X013V，X014A，X014C，X014D，X014E，X014F，X014G，X014H，X014I，X014K，X014L，X014P，X014Q，X014S，X014T，X014V，X014Y，X015A，X015D，X015F，X015G，X015I，X015K，X015L，X015M，X015P，X015Q，X015R，X015S，X015V，X015W，X016A，X016D，X016E，X016G，X016L，X016N，X016P，X016Q，X016R，X016S，X016T，X016V，X017A，X017D，X017E，X017F，X017G，X017H，X017I，X017K，X017M，X017N，X017R，X017S，X017T，X017V，X017W，X017Y，X018A，X018C，X018D，X018E，X018F，X018G，X018H，X018I，X018K，X018L，X018M，X018N，X018P，X018Q，X018R，X018S，X018T，X018V，X018W，X018Y，X019A，X019C，X019D，X019E，X019F，X019G，X019H，X019K，X019L，X019M，X019N，X019P，X019R，X019S，X019T，X019V，X019W，X019Y，X020A，X020C，X020D，X020F，X020G，X020I，X020K，X020L，X020M，X020P，X020Q，X020R，X020S，X020T，X020V，X020W，X020Y，X021A，X021C，X021D，X021E，X021G，X021H，X021I，X021K，X021L，X021M，X021N，X021P，X021Q，X021R，X021S，X021T，X021V，X021W，X022A，X022C，X022G，X022I，X022K，X022L，X022M，X022N，X022P，X022Q，X022R，X022S，X022T，X022V，X022W，X022Y，X023A，X023G，X023S，X024A，X024C，X024D，X024F，X024G，X024H，X024L，X024M，X024N，X024P，X024Q，X024R，X024S，X024T，X024V，X024W，X025C，X025D，X025E，X025F，X025G，X025H，X025K，X025L，X025M，X025N，X025Q，X025R，X025S，X025T，X025V，X025W，X026C，X026F，X026G，X026I，X026L，X026M，X026N，X026P，X026R，X026S，X026T，X026V，X027A，X027C，X027D，X027F，X027G，X027I，X027K，X027L，X027M，X027N，X027P，X027R，X027S，X027T，X027V，X027W，X027Y，X028A，X028E，X028G，X028H，X028I，X028L，X028M，X028N，X028P，X028S，X028V，X028Y，X029A，X029C，X029G，X029I，X029K，X029S，X029T，X029V，X030A，X030C，X030D，X030E，X030F，X030G，X030L，X030M，X030Q，X030S，X030T，X030V，X031A，X031F，X031I，X031L，X031M，X031S，X031T，X031V，X032A，X032C，X032D，X032E，X032G，X032V，X032W，X033A，X033C，X033D，X033E，X033G，X033H，X033I，X033L，X033M，X033N，X033Q，X033R，X033S，X033T，X033V，X033Y，X034E，X034G，X034H，X034L，X034Q，X034S，X035A，X035F，X035H，X035I，X035K，X035L，X035M，X035P，X035Q，X035R，X035S，X035A，X035C，X035E，X035F，X035G，X035H，X035I，X035L，X035M，X035N，X035P，X035Q，X035R，X035T，X035V，X035W，X035Y，X038C，X038F，X038G，X038H，X038I，X038K，X038L，X038M，X038N，X038Q，X038R，X038T，X038V，X038W，X038Y，X039A，X039E，X039G，X039H，X039L，X039M，X039N，X039Q，X039S，X039T，X039V，X039Y，X040A，X040C，X040D，X040E，X040G，X040H，X040I，X040K，X040L，X040M，X040N，X040P，X040R，X040S，X040T，X040V，X040W，X040Y，X041C，X041D，X041E，X041N，X041P，X041Q，X041S，X042A，X042C，X042F，X042G，X042H，X042I，X042L，X042M，X042N，X042Q，X042S，X042T，X042V，X042Y，X043A，X043C，X043D，X043E，X043F，X043G，X043I，X043L，X043M，X043N，X043P，X043R，X043S，X043T，X043V，X043W，X043Y，X044A，X044C，X044D，X044F，X044G，X044I，X044K，X044L，X044M，X044N，X044P，X044Q，X044R，X044S，X044T，X044V，X044W，X044Y，X045A，X045D，X045F，X045G，X045H，X045I，X045K，X045L，X045M，X045N，X045P，X045Q，X045R，X045S，X045T，X045V，X045W，X045Y，X046C，X046D，X046E，X046F，X046G，X046H，X046I，X046K，X046L，X046M，X046N，X046P，X046Q，X046R，X046S，X046T，X046V，X046W，X047A，X047C，X047E，X047F，X047G，X047H，X047K，X047L，X047M，X047N，X047P，X047Q，X047R，X047S，X047T，X047W，X048A，X048C，X048E，X048F，X048G，X048H，X048I，X048K，X048L，X048M，X048N，X048P，X048Q，X048R，X048S，X048T，X048V，X048Y，X049A，X049E，X049F，X049G，X049H，X049K，X049L，X049M，X049P，X049Q，X049R，X049S，X049T，X050C，X050F，X050G，X050H，X050I，X050L，X050N，X050T，X050V，X050Y，X051F，X051G，X051H，X051K，X051L，X051N，X051P，X051R，X051S，X051T，X051V，X051W，X052A，X052C，X052E，X052F，X052G，X052H，X052I，X052L，X052M，X052N，X052P，X052Q，X052R，X052T，X052V，X052W，X052Y，X053A，X053C，X053D，X053E，X053G，X053H，X053I，X053K，X053L，X053M，X053P，X053Q，X053R，X053S，X053T，X053V，X053W，X053Y，X054A，X054C，X054D，X054E，X054F，X054G，X054H，X054I，X054K，X054L，X054M，X054N，X054P，X054Q，X054R，X054S，X054V，X054W，X054Y，X055A，X055C，X055E，X055F，X055G，X055H，X055I，X055K，X055L，X055M，X055N，X055P，X055Q，X055R，X055S，X055T，X055W，X055Y，X056A，X056C，X056D，X056E，X056H，X056L，X056M，X056N，X056P，X056Q，X056R，X056S，X056T，X056V，X057A，X057C，X057E，X057F，X057G，X057H，X057I，X057K，X057L，X057M，X057N，X057P，X057Q，X057R，X057S，X057T，X057V，X057W，X057Y，X059A，X059C，X059D，X059E，X059F，X059G，X059I，X059K，X059L，X059M，X059N，X059P，X059Q，X059R，X059S，X059T，X059V，X059W，X059Y，X060A，X060C，X060D，X060F，X060G，X060K，X060L，X060M，X060N，X060P，X060Q，X060S，X060T，X060V，X060W，X060Y，X061A，X061C，X06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X275Q、X275R、X275V和X275W。
本发明还提供了包含枯草杆菌蛋白酶变体的餐具洗涤组合物，和包含枯草杆菌蛋白酶变体的衣物去垢剂。在一些优选的实施方案中，餐具洗涤和衣物去垢剂进一步包含至少一种其他的酶。在一些优选的实施方案中，其他的酶选自：蛋白酶(例如，中性金属蛋白酶、野生型丝氨酸蛋白酶或第二变体丝氨酸蛋白酶)、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、糖酶、纤维素酶、果胶酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶和过氧化物酶。此外，本发明提供了餐具洗涤方法，其包括步骤：提供i)包含枯草杆菌蛋白酶变体的餐具洗涤组合物，和ii)需要清洁的餐具；和在有效提供餐具清洁的条件下，将餐具与餐具洗涤组合物接触。相似的，本发明提供了织物清洁方法，其包括步骤：提供i)包含枯草杆菌蛋白酶变体的衣物去垢剂，和ii)需要清洁的衣物；和在有效提供衣物清洁的条件下，将衣物与衣物去垢剂接触。在其他的实施方案中，本发明提供了编码变体的分离的核酸，还提供了包含所述分离的核酸与启动子的有效组合的表达载体，和/或包含所述表达载体的宿主细胞。
本发明还提供了芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且在三个或更多个位置上包含取代，所述位置选自：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274和275，其中所述位置对照SEQ ID NO：1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。在一些实施方案中，枯草杆菌蛋白酶变体包含4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个上述位置。
在一些实施方案中，枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且在三个或更多个位置上包含取代，所述位置选自：1、3、4、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，33，35，36，38，40，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，59，61，62，68，69，72，73，76，78，84，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，114，115，116，117，118，119，120，121，122，124，126，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，156，158，159，160，165，166，167，170，171，172，173，174，175，176，177，180，182，183，184，185，186，187，188，191，194，195，198，199，203，204，206，209，210，211，212，213，215，216，217，218，222，223，224，227，228，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，255，256，258，259，260，261，262，265、267、268、269、270、271、272、273、274和275，其中所述位置对照SEQ ID NO：1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。在一些实施方案中，枯草杆菌蛋白酶变体包含4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个上述位置。
本发明还提供了分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形式，并且在三个或更多个位置上包含取代，所述位置选自：1、2、3、4、5、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、3031，33，35，36，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，59，60，61，62，63，66，68，69，71，72，73，74，75，76，77，78，79，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，156，158，159，160，165，166，167，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，191，192，194，195，196，197，198，199，200，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，220，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260、261、262、263、264、265、267、268、269、270、271、272、273、274和275，其中所述位置对照SEQ ID NO：1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。在一些实施方案中，枯草杆菌蛋白酶变体包含4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个上述位置。
本发明进一步包括分离的枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体包含在三个或更多个位置上的取代，所述取代选自：X001A、X001C、X001E、X001F、X001G、X001H、X001I、X001K、X001L，X001N，X001P，X001Q，X001R，X001S，X001T，X001V，X001Y，X002A，X002C，X002E，X002G，X002K，X002L，X002M，X002N，X002P，X002Q，X002R，X002S，X002T，X002V，X002W，X002Y，X003D，X003E，X003F，X003G，X003H，X003I，X003L，X003M，X003N，X003P，X003R，X003S，X003T，X003V，X003W，X003Y，X004A，X004C，X004D，X004E，X004F，X004G，X004H，X004K，X004L，X004N，X004P，X004R，X004S，X004T，X004V，X004W，X005A，X005C，X005D，X005E，X005G，X005I，X005M，X005P，X005Q，X005S，X005T，X005W，X005Y，X006A，X006D，X006E，X006M，X006W，X007A，X007C，X007D，X007G，X007H，X007N，X007P，X007Q，X007S，X007T，X008A，X008F，X008G，X008I，X008L，X008M，X008Q，X008T，X008V，X008W，X008Y，X009A，X009C，X009D，X009E，X009F，X009G，X009H，X009L，X009N，X009P，X009Q，X009R，X009S，X009T，X009V，X009W，X009Y，X010A，X010C，X010F，X010G，X010H，X010I，X010K，X010L，X010M，X010N，X010Q，X010R，X010S，X010T，X010V，X010W，X010Y，X011A，X011C，X011D，X011G，X011I，X011M，X011R，X011S，X011T，X011V，X011Y，X012D，X012F，X012G，X012H，X012I，X012K，X012L，X012M，X012N，X012P，X012Q，X012R，X012S，X012T，X012V，X012W，X012Y，X013A，X013G，X013I，X013M，X013Q，X013T，X013V，X014A，X014C，X014D，X014E，X014F，X014G，X014H，X014I，X014K，X014L，X014P，X014Q，X014S，X014T，X014V，X014Y，X015A，X015D，X015F，X015G，X015I，X015K，X015L，X015M，X015P，X015Q，X015R，X015S，X015V，X015W，X016A，X016D，X016E，X016G，X016L，X016N，X016P，X016Q，X016R，X016S，X016T，X016V，X017A，X017D，X017E，X017F，X017G，X017H，X017I，X017K，X017M，X017N，X017R，X017S，X017T，X017V，X017W，X017Y，X018A，X018C，X018D，X018E，X018F，X018G，X018H，X018I，X018K，X018L，X018M，X018N，X018P，X018Q，X018R，X018S，X018T，X018V，X018W，X018Y，X019A，X019C，X019D，X019E，X019F，X019G，X019H，X019K，X019L，X019M，X019N，X019P，X019R，X019S，X019T，X019V，X019W，X019Y，X020A，X020C，X020D，X020F，X020G，X020I，X020K，X020L，X020M，X020P，X020Q，X020R，X020S，X020T，X020V，X020W，X020Y，X021A，X021C，X021D，X021E，X021G，X021H，X021I，X021K，X021L，X021M，X021N，X021P，X021Q，X021R，X021S，X021T，X021V，X021W，X022A，X022C，X022G，X022I，X022K，X022L，X022M，X022N，X022P，X022Q，X022R，X022S，X022T，X022V，X022W，X022Y，X023A，X023G，X023S，X024A，X024C，X024D，X024F，X024G，X024H，X024L，X024M，X024N，X024P，X024Q，X024R，X024S，X024T，X024V，X024W，X025C，X025D，X025E，X025F，X025G，X025H，X025K，X025L，X025M，X025N，X025Q，X025R，X025S，X025T，X025V，X025W，X026C，X026F，X026G，X026I，X026L，X026M，X026N，X026P，X026R，X026S，X026T，X026V，X027A，X027C，X027D，X027F，X027G，X027I，X027K，X027L，X027M，X027N，X027P，X027R，X027S，X027T，X027V，X027W，X027Y，X028A，X028E，X028G，X028H，X028I，X028L，X028M，X028N，X028P，X028S，X028V，X028Y，X029A，X029C，X029G，X029I，X029K，X029S，X029T，X029V，X030A，X030C，X030D，X030E，X030F，X030G，X030L，X030M，X030Q，X030S，X030T，X030V，X031A，X031F，X031I，X031L，X031M，X031S，X031T，X031V，X032A，X032C，X032D，X032E，X032G，X032V，X032W，X033A，X033C，X033D，X033E，X033G，X033H，X033I，X033L，X033M，X033N，X033Q，X033R，X033S，X033T，X033V，X033Y，X034E，X034G，X034H，X034L，X034Q，X034S，X035A，X035F，X035H，X035I，X035K，X035L，X035M，X035P，X035Q，X035R，X035S，X035A，X035C，X035E，X035F，X035G，X035H，X035I，X035L，X035M，X035N，X035P，X035Q，X035R，X035T，X035V，X035W，X035Y，X038C，X038F，X038G，X038H，X038I，X038K，X038L，X038M，X038N，X038Q，X038R，X038T，X038V，X038W，X038Y，X039A，X039E，X039G，X039HX039L，X039M，X039N，X039Q，X039S，X039T，X039V，X039Y，X040A，X040C，X040D，X040E，X040G，X040H，X040I，X040K，X040L，X040M，X040N，X040P，X040R，X040S，X040T，X040V，X040W，X040Y，X041C，X041D，X041E，X041N，X041P，X041Q，X041S，X042A，X042C，X042F，X042G，X042H，X042I，X042L，X042M，X042N，X042Q，X042S，X042T，X042V，X042Y，X043A，X043C，X043D，X043E，X043F，X043G，X043I，X043L，X043M，X043N，X043P，X043R，X043S，X043T，X043V，X043W，X043Y，X044A，X044C，X044D，X044F，X044G，X044I，X044K，X044L，X044M，X044N，X044P，X044Q，X044R，X044S，X044T，X044V，X044W，X044Y，X045A，X045D，X045F，X045G，X045H，X045I，X045K，X045L，X045M，X045N，X045P，X045Q，X045R，X045S，X045T，X045V，X045W，X045Y，X046C，X046D，X046E，X046F，X046G，X046H，X046I，X046K，X046L，X046M，X046N，X046P，X046Q，X046R，X046S，X046T，X046V，X046W，X047A，X047C，X047E，X047F，X047G，X047H，X047K，X047L，X047M，X047N，X047P，X047Q，X047R，X047S，X047T，X047W，X048A，X048C，X048E，X048F，X048G，X048H，X048I，X048K，X048L，X048M，X048N，X048P，X048Q，X048R，X048S，X048T，X048V，X048Y，X049A，X049E，X049F，X049G，X049H，X049K，X049L，X049M，X049P，X049Q，X049R，X049S，X049T，X050C，X050F，X050G，X050H，X050I，X050L，X050N，X050T，X050V，X050Y，X051F，X051G，X051H，X051K，X051L，X051N，X051P，X051R，X051S，X051T，X051V，X051W，X052A，X052C，X052E，X052F，X052G，X052H，X052I，X052L，X052M，X052N，X052P，X052Q，X052R，X052T，X052V，X052W，X052Y，X053A，X053C，X053D，X053E，X053G，X053H，X053I，X053K，X053L，X053M，X053P，X053Q，X053R，X053S，X053T，X053V，X053W，X053Y，X054A，X054C，X054D，X054E，X054F，X054G，X054H，X054I，X054K，X054L，X054M，X054N，X054P，X054Q，X054R，X054S，X054V，X054W，X054Y，X055A，X055C，X055E，X055F，X055G，X055H，X055I，X055K，X055L，X055M，X055N，X055P，X055Q，X055R，X055S，X055T，X055W，X055Y，X056A，X056C，X056D，X056E，X056H，X056L，X056M，X056N，X056P，X056Q，X056R，X056S，X056T，X056V，X057A，X057C，X057E，X057F，X057G，X057H，X057I，X057K，X057L，X057M，X057N，X057P，X057Q，X057R，X057S，X057T，X057V，X057W，X057Y，X059A，X059C，X059D，X059E，X059F，X059G，X059I，X059K，X059L，X059M，X059N，X059P，X059Q，X059R，X059S，X059T，X059V，X059W，X059Y，X060A，X060C，X060D，X060F，X060G，X060K，X060L，X060M，X060N，X060P，X060Q，X060S，X060T，X060V，X06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2C，X252D，X252F，X252G，X252H，X252I，X252K，X252L，X252M，X252N，X252P，X252R，X252S，X252V，X252W，X252Y，X253A，X253D，X253E，X253F，X253G，X253H，X253I，X253K，X253M，X253R，X253S，X253T，X253V，X253W，X254A，X254C，X254D，X254E，X254G，X254N，X254P，X254S，X254T，X254V，X255A，X255C，X255D，X255E，X255F，X255H，X255I，X255L，X255N，X255P，X255Q，X255R，X255S，X255T，X255V，X255W，X255Y，X256A，X256C，X256D，X256E，X256G，X256H，X256I，X256K，X256L，X256M，X256N，X256P，X256R，X256S，X256T，X256V，X256W，X256Y，X257A，X257C，X257E，X257F，X257G，X257H，X257I，X257K，X257L，X257M，X257P，X257S，X257T，X257V，X257W，X257Y，X258A，X258C，X258D，X258E，X258F，X258G，X258H，X258I，X258L，X258M，X258P，X258Q，X258R，X258S，X258T，X258V，X258W，X258Y，X259A，X259C，X259E，X259G，X259I，X259L，X259M，X259P，X259Q，X259R，X259S，X259T，X259V，X260A，X260D，X260E，X260F，X260H，X260I，X260L，X260M，X260N，X260P，X260R，X260S，X260T，X260V，X260Y，X261A，X261C，X261E，X261F，X261G，X261I，X261K，X261L，X261N，X261P，X261Q，X261R，X261S，X261T，X261V，X261W，X261Y，X262A，X262C，X262D，X262F，X262G，X262H，X262I，X262K，X262L，X262M，X262P，X262Q，X262R，X262S，X262T，X262V，X262W，X262Y，X263A，X263C，X263D，X263F，X263G，X263H，X263I，X263K，X263L，X263M，X263N，X263P，X263Q，X263R，X263W，X263Y，X264A，X264C，X264E，X264F，X264G，X264H，X264I，X264L，X264P，X264Q，X264S，X264T，X264V，X264Y，X265A，X265C，X265D，X265F，X265G，X265H，X265I，X265K，X265L，X265M，X265N，X265P，X265Q，X265R，X265S，X265T，X265V，X265W，X265Y，X266G，X266W，X266Y，X267A，X267C，X267D，X267E，X267F，X267G，X267H，X267I，X267K，X267L，X267M，X267N，X267S，X267T，X267V，X267Y，X268A，X268D，X268E，X268G，X268H，X268K，X268L，X268M，X268N，X268P，X268Q，X268R，X268S，X268V，X268W，X268Y，X269C，X269D，X269F，X269G，X269H，X269I，X269L，X269M，X269N，X269Q，X269R，X269S，X269T，X269V，X270A，X270C，X270D，X270E，X270F，X270G，X270H，X270I，X270L，X270M，X270N，X270P，X270Q，X270S，X270T，X270V，X271A，X271C，X271E，X271F，X271G，X271H，X271I，X271K，X271L，X271M，X271N，X271P，X271T，X271V，X271Y，X272A，X272C，X272D，X272E，X272F，X272G，X272H，X272K，X272L，X272M，X272N，X272P，X272R，X272S，X272T，X272W，X272Y，X273A，X273C，X273D，X273E，X273F，X273G，X273H，X273I，X273K，X273L，X273R，X273S，X273T，X273V，X273W，X273Y，X274A，X274C，X274D，X274E，X274G，X274H，X274K，X274L，X274M，X274N，X274P，X274Q，X274R，X274S，X274T，X274W，X275A，X275C，X275D，X275E，X275F，X275G、X275H、X275K、X275L、X275M、X275P、X275Q、X275R、X275V和X275W，其中所述位置对照SEQ ID NO：1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。在一些实施方案中，枯草杆菌蛋白酶变体包含4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个上述位置。
在一些优选的实施方案中，本发明提供了分离的枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体在选自BMI测定、蛋黄微样品测定和/或AAPF活性测定的至少一种测定中具有大于1的性能指数(performance index)，以及在LAS稳定性或TCA测定中具有大于0.8的性能指数，其中所述变体在一个或多个位置上包含至少一个取代，所述位置选自：1、2、3、4、5、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26，27，28，29，30，31，33，35，36，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，59，60，61，62，63，66，68，69，71，72，73，74，75，76，77，78，79，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，156，158，159，160，165，166，167，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，191，192，194，195，196，197，198，199，200，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，220，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、267、268、269、270、271、272、273、274和275，其中所述位置对照SEQ ID NO：1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。在一些实施方案中，枯草杆菌蛋白酶变体包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个上述位置。
在一些优选的实施方案中，本发明提供了分离的枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体在选自BMI测定、蛋黄微样品测定和/或AAPF活性测定的至少一种测定中具有大于1的性能指数，以及在LAS稳定性或TCA测定中具有大于0.8的性能指数，其中所述变体在一个或多个位置上包含至少一个取代，所述位置选自：1、2、3、4、5、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26，27，28，29，30，31，33，35，36，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，59，60，61，62，63，66，68，69，71，72，73，74，75，76，77，78，79，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，156，158，159，160，165，166，167，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，191，192，194，195，196，197，198，199，200，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，220，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、267、268、269、270、271、272、273、274和275，其中所述位置对照SEQ ID NO：1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。在一些实施方案中，枯草杆菌蛋白酶变体包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个上述位置。
在一些其他实施方案中，本发明提供了分离的枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体在选自BMI测定、蛋黄微样品测定和/或AAPF活性测定的至少一种测定中具有大于0.8的性能指数，以及在LAS稳定性或TCA测定中具有大于0.8的性能指数，其中所述变体在一个或多个位置上包含至少一个取代，所述位置选自：1、3、4、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29，30，31，33，35，36，38，40，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，59，61，62，68，69，72，73，76，78，84，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，114，115，116，117，118，119，120，121，122，124，126，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，156，158，159，160，165，166，167，170，171，172，173，174，175，176，177，180，182，183，184，185，186，187，188，191，194，195，198，199，203，204，206，209，210，211，212，213，215，216，217，218，222，223，224，227，228，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，255，256，258，259，260，261，262，265，267，268，269，270，271，272，273，274，和275，其中所述位置对照SEQ ID NO：1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。在一些实施方案中，枯草杆菌蛋白酶变体包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个上述位置。
在一些其他实施方案中，本发明提供了分离的枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体在选自BMI测定、蛋黄微样品测定和/或AAPF活性测定的至少一种测定中具有大于1的性能指数，以及在LAS稳定性或TCA测定中具有大于0.8的性能指数，其中所述变体包含至少3个取代，所述取代选自：X001A、X001C，X001E，X001F，X001G，X001H，X001I，X001K，X001L，X001N，X001Q，X001R，X001S，X001T，X001V，X001Y，X002A，X002C，X002E，X002G，X002K，X002L，X002M，X002N，X002P，X002Q，X002R，X002S，X002T，X002V，X002W，X002Y，X003D，X003E，X003F，X003G，X003H，X003I，X003L，X003M，X003N，X003P，X003R，X003S，X003T，X003V，X003W，X003Y，X004A，X004C，X004D，X004E，X004F，X004H，X004K，X004L，X004N，X004P，X004R，X004S，X004T，X004V，X004W，X005A，X005C，X005D，X005E，X005G，X005P，X005Q，X005S，X005T，X007A，X007C，X007D，X007G，X007H，X007N，X007S，X007T，X008A，X008F，X008I，X008L，X008M，X008T，X008V，X009D，X009E，X009F，X009G，X009H，X009L，X009N，X009P，X009Q，X009R，X009S，X009T，X009V，X009W，X009Y，X010A，X010C，X010G，X010H，X010K，X010M，X010N，X010Q，X010R，X010S，X010T，X010W，X011A，X011I，X011M，X011S，X011V，X012D，X012F，X012G，X012H，X012I，X012K，X012L，X012M，X012N，X012Q，X012R，X012S，X012T，X012V，X012W，X013A，X013G，X013I，X013T，X013V，X014A，X014D，X014E，X014F，X014H，X014I，X014K，X014L，X014P，X014Q，X014S，X014T，X014V，X014Y，X015A，X015D，X015F，X015G，X015I，X015K，X015L，X015M，X015P，X015Q，X015R，X015S，X015V，X015W，X016A，X016G，X016L，X016N，X016P，X016Q，X016S，X016T，X016V，X017A，X017F，X017H，X017I，X017K，X017M，X017N，X017R，X017S，X017V，X017W，X017Y，X018A，X018C，X018D，X018E，X018F，X018G，X018H，X018K，X018L，X018M，X018N，X018P，X018Q，X018R，X018S，X018T，X018V，X018W，X018Y，X019A，X019C，X019D，X019E，X019F，X019G，X019H，X019K，X019L，X019M，X019N，X019R，X019S，X019T，X019V，X019W，X019Y，X020A，X020C，X020D，X020F，X020G，X020I，X020K，X020L，X020M，X020P，X020Q，X020R，X020S，X020T，X020V，X020W，X020Y，X021A，X021C，X021D，X021E，X021G，X021H，X021I，X021K，X021L，X021M，X021N，X021P，X021Q，X021R，X021S，X021T，X021V，X021W，X022A，X022C，X022G，X022I，X022K，X022L，X022M，X022N，X022P，X022Q，X022R，X022S，X022T，X022V，X022W，X022Y，X023A，X023G，X023S，X024A，X024C，X024D，X024F，X024G，X024H，X024L，X024M，X024N，X024P，X024Q，X024R，X024S，X024T，X024V，X024W，X025C，X025D，X025E，X025F，X025G，X025H，X025K，X025L，X025M，X025N，X025Q，X025R，X025S，X025T，X025V，X025W，X026C，X026F，X026G，X026I，X026L，X026M，X026N，X026P，X026R，X026S，X026T，X026V，X027A，X027C，X027D，X027F，X027G，X027I，X027K，X027L，X027M，X027N，X027P，X027R，X027S，X027T，X027V，X027W，X027Y，X028A，X028E，X028H，X028I，X028L，X028M，X028N，X028S，X028V，X029A，X029C，X029G，X029S，X029V，X030C，X030E，X030L，X030S，X030T，X030V，X031A，X031F，X031I，X031L，X031M，X031S，X031T，X031V，X033A，X033D，X033E，X033G，X033H，X033M，X033N，X033Q，X033S，X033T，X033Y，X035A，X035F，X035I，X035L，X035M，X035P，X036A，X036C，X036E，X036F，X036G，X036H，X036I，X036L，X036M，X036N，X036Q，X036R，X036S，X036T，X036V，X038C，X038F，X038G，X038H，X038I，X038K，X038L，X038M，X038N，X038Q，X038R，X038T，X038V，X038W，X038Y，X039H，X039V，X040A，X040C，X040D，X040E，X040G，X040H，X040I，X040K，X040L，X040M，X040N，X040P，X040R，X040S，X040T，X040V，X040W，X040Y，X041D，X041E，X042C，X042H，X042I，X042L，X042M，X042N，X042T，X042V，X043A，X043C，X043D，X043E，X043F，X043G，X043I，X043L，X043M，X043N，X043P，X043R，X043S，X043T，X043V，X043W，X043Y，X044A，X044C，X044D，X044G，X044I，X044K，X044L，X044M，X044N，X044P，X044Q，X044R，X044S，X044T，X044V，X044W，X044Y，X045A，X045D，X045F，X045G，X045H，X045I，X045K，X045L，X045M，X045N，X045P，X045Q，X045R，X045S，X045T，X045V，X045W，X045Y，X046C，X046D，X046E，X046F，X046G，X046H，X046I，X046K，X046L，X046M，X046N，X046P，X046Q，X046R，X046S，X046T，X046V，X046W，X047A，X047F，X047G，X047N，X047R，X047S，X047T，X047W，X048A，X048C，X048E，X048F，X048G，X048H，X048I，X048K，X048L，X048M，X048N，X048P，X048Q，X048R，X048S，X048T，X048V，X048Y，X049A，X049F，X049G，X049L，X049M，X049P，X049S，X049T，X050C，X050F，X050H，X050I，X050L，X050N，X050T，X050V，X050Y，X051F，X051G，X051H，X051K，X051L，X05IN，X051P，X051R，X051S，X051T，X051V，X051W，X052A，X052C，X052E，X052F，X052G，X052H，X052I，X052L，X052M，X052N，X052P，X052Q，X052R，X052T，X052V，X052W，X052Y，X053A，X053C，X053D，X053E，X053G，X053H，X053K，X053L，X053M，X053P，X053Q，X053R，X053S，X053T，X053V，X053W，X053Y，X054A，X054C，X054D，X054E，X054F，X054I，X054M，X054N，X054Q，X054S，X054V，X055A，X055C，X055E，X055F，X055G，X055H，X055I，X055K，X055L，X055M，X055N，X055P，X055Q，X055S，X055T，X055W，X055Y，X056A，X056C，X056D，X056E，X056H，X056L，X056M，X056N，X056P，X056Q，X056S，X056T，X057A，X057C，X057E，X057F，X057G，X057H，X057I，X057K，X057L，X057M，X057N，X057P，X057Q，X057R，X057S，X057T，X057V，X057W，X057Y，X059A，X059C，X059D，X059E，X059F，X059G，X059I，X059L，X059M，X059N，X059P，X059Q，X059R，X059S，X059T，X059V，X059W，X059Y，X060D，X060S，X060V，X061A，X061C，X061D，X061F，X061G，X061H，X061I，X061L，X061M，X061N，X061P，X061R，X061S，X061T，X061V，X061Y，X062C，X062E，X062F，X062G，X062H，X062I，X062K，X062L，X062M，X062N，X062P，X062Q，X062R，X062S，X062T，X062V，X062Y，X063A，X063C，X063D，X063E，X063F，X063G，X063H，X063K，X063M，X063Q，X063R，X063S，X063W，X066K，X066S，X066T，X068I，X068T，X068V，X069A，X069E，X069G，X069N，X069S，X069T，X071A，X071I，X071N，X071T，X071V，X072C，X072F，X072I，X072L，X072M，X072T，X072V，X073A，X073C，X073D，X073E，X073H，X073K，X073L，X073N，X073S，X073T，X073V，X074A，X074C，X074S，X075A，X075H，X075I，X075L，X075M，X075N，X075P，X075Q，X075R，X075S，X075V，X076D，X076E，X076F，X076G，X076H，X076K，X076M，X076N，X076Q，X076R，X076S，X076T，X076W，X076Y，X077D，X077N，X078A，X078C，X078E，X078F，X078G，X078H，X078I，X078K，X078L，X078M，X078N，X078P，X078Q，X078R，X078S，X078T，X078V，X07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256V，X256W，X256Y，X257C，X257F，X257I，X257K，X257L，X257M，X257V，X258A，X258C，X258D，X258E，X258F，X258G，X258H，X258I，X258L，X258M，X258P，X258Q，X258R，X258S，X258T，X258V，X258W，X258Y，X259A，X259C，X259E，X259G，X259I，X259L，X259M，X259P，X259Q，X259R，X259S，X259T，X259V，X260A，X260D，X260E，X260F，X260H，X260I，X260L，X260M，X260N，X260P，X260R，X260S，X260T，X260V，X260Y，X261A，X261C，X261E，X261F，X261G，X261I，X261K，X261L，X261N，X261P，X261Q，X261R，X261S，X261T，X261V，X261W，X261Y，X262A，X262C，X262D，X262F，X262G，X262H，X262I，X262K，X262L，X262M，X262Q，X262R，X262S，X262T，X262V，X262W，X262Y，X263C，X263F，X263L，X263Y，X264A，X264G，X265A，X265C，X265D，X265F，X265G，X265H，X265K，X265M，X265Q，X265R，X265S，X265T，X265W，X265Y，X267G，X267I，X267L，X267M，X267N，X267V，X268A，X268G，X268H，X268L，X268M，X268N，X268P，X268Q，X268S，X268V，X269C，X269D，X269F，X269G，X269H，X269I，X269L，X269M，X269N，X269Q，X269R，X269S，X269T，X269V，X270A，X270C，X270D，X270G，X270I，X270L，X270M，X270N，X270S，X270T，X270V，X271A，X271C，X271E，X271F，X271G，X271H，X271I，X271K，X271L，X271M，X271N，X271P，X271T，X271V，X271Y，X272A，X272C，X272D，X272E，X272F，X272G，X272H，X272K，X272L，X272M，X272N，X272P，X272R，X272S，X272T，X272W，X272Y，X273A，X273C，X273D，X273E，X273F，X273G，X273H，X273I，X273L，X273S，X273T，X273V，X274A，X274C，X274D，X274E，X274G，X274H，X274L，X274M，X274N，X274P，X274Q，X274R，X274S，X274T，X274W，X275A，X275C，X275D，X275E，X275F，X275G，X275H，X275K，X275L，X275M，X275P，X275Q，X275R，X275V和X275W，其中所述位置对照SEQ ID NO：1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。在一些实施方案中，枯草杆菌蛋白酶变体包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个上述位置。
在一些实施方案中，本发明提供了分离的枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体在选自BMI测定、蛋黄微样品测定和/或AAPF活性测定的至少一种测定中具有大于1的性能指数，以及在LAS稳定性或TCA测定中具有大于0.8的性能指数，其中所述变体包含至少3个取代，所述取代选自：X001A，X001E，X001G，X001H，X001Q，X001V，X003E，X003H，X003I，X003M，X003S，X003T，X003V，X004T，X004V，X008I，X008V，X009E，X009H，X009N，X009Q，X009S，X009T，X010A，X010C，X010G，X010H，X010K，X010M，X010N，X010R，X010S，X010T，X011I，X011V，X012G，X012I，X012N，X012Q，X012S，X012T，X012V，X013A，X013G，X015A，X015D，X015F，X015G，X015I，X015L，X015M，X015P，X015Q，X015S，X015V，X015W，X016A，X016G，X016N，X016P，X016S，X016T，X016V，X017H，X017I，X017M，X017N，X018A，X018C，X018D，X018E，X018G，X018H，X018L，X018M，X018N，X018P，X018Q，X018S，X018T，X018V，X018Y，X019A，X019C，X019D，X019E，X019F，X019G，X019H，X019K，X019L，X019M，X019N，X019R，X019S，X019V，X019W，X019Y，X020A，X020C，X020D，X020F，X020G，X020I，X020K，X020L，X020M，X020P，X020Q，X020R，X020S，X020T，X020V，X020W，X020Y，X021A，X021C，X021E，X021G，X021H，X021I，X021K，X021L，X021M，X021N，X021P，X021Q，X021S，X021T，X021V，X021W，X022A，X022C，X022G，X022I，X022L，X022M，X022N，X022P，X022Q，X022T，X022V，X022W，X023A，X023G，X023S，X024A，X024C，X024D，X024F，X024G，X024H，X024L，X024M，X024N，X024P，X024Q，X024R，X024S，X024T，X024V，X024W，X025C，X025D，X025E，X025F，X025G，X025K，X025L，X025M，X025Q，X025R，X025S，X025T，X025V，X025W，X026C，X026F，X026G，X026M，X026N，X026R，X026S，X026T，X026V，X027A，X027C，X027D，X027F，X027G，X027K，X027L，X027M，X027N，X027P，X027R，X027S，X027T，X027W，X028A，X028I，X028L，X028M，X028V，X029A，X029C，X029G，X029S，X029V，X030A，X030C，X030L，X030M，X030T，X030V，X031A，X031F，X031I，X031L，X031M，X031S，X031V，X033C，X033M，X033S，X033T，X035I，X035L，X035M，X035P，X036A，X036E，X036S，X036T，X036V，X038C，X038F，X038H，X038I，X038K，X038L，X038M，X038N，X038Q，X038R，X038T，X038V，X038Y，X040A，X040D，X040E，X040I，X040L，X040P，X040V，X043A，X043C，X043D，X043E，X043F，X043G，X043I，X043L，X043M，X043N，X043R，X043S，X043T，X043W，X043Y，X044A，X044C，X044D，X044F，X044G，X044I，X044K，X044L，X044M，X044N，X044Q，X044R，X044S，X044T，X044V，X044Y，X045A，X045D，X045F，X045G，X045H，X045I，X045K，X045L，X045M，X045N，X045P，X045Q，X045R，X045S，X045T，X045V，X045W，X045Y，X046C，X046D，X046E，X046G，X046H，X046I，X046K，X046L，X046M，X046N，X046P，X046Q，X046R，X046S，X046T，X046V，X047G，X047R，X048A，X048C，X048E，X048F，X048H，X048I，X048K，X048L，X048M，X048N，X048P，X048Q，X048R，X048S，X048T，X048V，X048Y，X049A，X049G，X049H，X049S，X049T，X050F，X050H，X050I，X050L，X050T，X050V，X050Y，X051F，X051H，X051K，X051L，X051R，X051S，X051T，X051V，X051W，X052A，X052C，X052E，X052F，X052G，X052H，X052I，X052L，X052M，X052N，X052P，X052Q，X052R，X052T，X052V，X052W，X052Y，X053A，X053C，X053D，X053E，X053G，X053H，X053K，X053L，X053M，X053Q，X053R，X053S，X053T，X053W，X053Y，X054A，X054C，X054D，X054E，X054F，X054H，X054M，X054N，X054Q，X054S，X055C，X055E，X055G，X055H，X055K，X055L，X055P，X055Q，X055S，X055T，X055W，X056A，X056C，X056D，X056E，X056H，X056L，X056M，X056N，X056P，X056Q，X056S，X056T，X057C，X057E，X057F，X057G，X057H，X057I，X057L，X057M，X057N，X057P，X057Q，X057R，X057S，X057T，X057V，X057W，X057Y，X059A，X059D，X059G，X059I，X059L，X059M，X059N，X059Q，X059R，X059S，X059T，X059V，X059W，X061A，X061C，X061D，X061F，X061G，X061H，X061I，X061L，X061M，X061N，X061P，X061R，X061S，X061T，X061V，X061Y，X062C，X062E，X062F，X062H，X062I，X062K，X062L，X062M，X062N，X062Q，X062R，X062S，X062T，X062V，X068I，X068L，X068V，X069A，X069G，X069S，X069T，X072I，X072L，X072T，X072V，X073A，X073C，X073S，X076D，X076N，X078A，X078C，X078E，X078H，X078L，X078M，X078N，X078Q，X078S，X078T，X084C，X084G，X084I，X084M，X084V，X086C，X086P，X087A，X087C，X087D，X087E，X087G，X087K，X087L，X087N，X087S，X087V，X088A，X088C，X088G，X088S，X089A，X089D，X089E，X089G，X089H，X089I，X089N，X089Q，X089R，X089S，X089T，X089W，X090C，X090I，X090L，X090M，X090Q，X090T，X090V，X091D，X091F，X091I，X091N，X091S，X091V，X091W，X091Y，X092A，X092G，X092P，X092R，X092V，X093A，X093C，X093G，X093L，X093M，X093T，X093V，X094K，X094R，X095A，X095C，X095I，X095S，X095V，X096F，X096I，X096L，X096M，X097A，X097D，X097E，X097F，X097G，X097H，X097K，X097L，X097M，X097N，X097P，X097Q，X097R，X097S，X097T，X097V，X097W，X097Y，X098A，X098C，X098D，X098E，X098F，X098G，X098K，X098L，X098N，X098P，X098Q，X098R，X098S，X098T，X098V，X098Y，X099A，X099C，X099F，X099G，X099K，X099M，X099P，X099Q，X099R，X099S，X099T，X099V，X099Y，X100D，X100E，X100G，X100I，X100K，X100N，X100R，X100S，X100T，X100V，X100Y，X101A，X101C，X101D，X101E，X101F，X101G，X101H，X101I，X101K，X101N，X101P，X101Q，X101R，X101S，X101T，X101V，X101Y，X102A，X102G，X102T，X103A，X103C，X103D，X103F，X103G，X103I，X103L，X103N，X103P，X103Q，X103R，X103S，X103T，X103V，X103W，X104C，X104F，X104H，X104I，X104L，X104R，X104S，X104T，X104V，X104W，X104Y，X105A，X105C，X105D，X105E，X105F，X105G，X105K，X105L，X105N，X105Q，X105R，X105S，X105T，X105V，X106A，X106D，X106E，X106G，X106I，X106L，X106R，X106S，X106T，X106V，X106W，X107A，X107C，X107F，X107I，X107L，X107M，X107Q，X107S，X107T，X107V，X108A，X108C，X108I，X108S，X108T，X108V，X109A，X109E，X109F，X109G，X109H，X109I，X109K，X109L，X109M，X109N，X109Q，X109R，X109S，X109T，X109W，X109Y，X110A，X110G，X111F，X111I，X111L，X111M，X112D，X112E，X112I，X112Q，X112V，X114A，X114C，X115C，X11SE，X115G，X115L，X11SM，X115P，X115Q，X115S，X115T，X115W，X115Y，X116A，X116C，X116D，X116F，X116G，X116I，X116K，X116L，X116M，X116N，X116Q，X116S，X116T，X116V，X116W，X117A，X117C，X117N，X117Q，X117R，X117T，X117Y，X118A，X118C，X118D，X118E，X118F，X118G，X118K，X118M，X118N，X118R，X118S，X118V，X118W，X119A，X119F，X119M，X119T，X120A，X120C，X120E，X120F，X120G，X120H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268V，X269D，X269H，X269N，X269Q，X269S，X270A，X270C，X270G，X270I，X270L，X270N，X270S，X270T，X270V，X271C，X271E，X272A，X272C，X272D，X272E，X272F，X272G，X272H，X272L，X272M，X272N，X272P，X272S，X272T，X272W，X272Y，X273A，X273C，X273G，X273S，X274A，X274C，X274G，X274L，X274M，X274N，X274S，X274T，X275D，X275E，X275F，X275H、X275K、X275L、X275M、X275P、X275Q和X275R，其中所述位置对照SEQ ID NO：1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。在一些实施方案中，枯草杆菌蛋白酶变体包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个上述位置。
在一些实施方案中，本发明提供了分离的枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体在选自BMI测定、蛋黄微样品测定和/或AAPF活性测定的至少一种测定中具有大于1的性能指数，以及在LAS稳定性或TCA测定中具有大于0.8的性能指数，其中所述变体包含至少3个取代，所述取代选自：X001A，X001E，X001G，X001H，X001Q，X001V，X003E，X003H，X003I，X003M，X003S，X003T，X003V，X004T，X004V，X008I，X008V，X009E，X009H，X009N，X009Q，X009S，X009T，X010A，X010C，X010G，X010H，X010K，X010M，X010N，X010R，X010S，X010T，X011I，X011V，X012G，X012I，X012N，X012Q，X012S，X012T，X012V，X013A，X013G，X015A，X015D，X015F，X015G，X015I，X015L，X015M，X015P，X015Q，X015S，X015V，X015W，X016A，X016G，X016N，X016P，X016S，X016T，X016V，X017H，X017I，X017M，X017N，X018A，X018C，X018D，X01SE，X018G，X018H，X018L，X018M，X018N，X018P，X018Q，X018S，X018T，X018V，X018Y，X019A，X019C，X019D，X019E，X019F，X019G，X019H，X019K，X019L，X019M，X019N，X019R，X019S，X019V，X019W，X019Y，X020A，X020C，X020D，X020F，X020G，X020I，X020K，X020L，X020M，X020P，X020Q，X020R，X020S，X020T，X020V，X020W，X020Y，X021A，X021C，X021E，X021G，X021H，X021I，X021K，X021L，X021M，X021N，X021P，X021Q，X021S，X021T，X021V，X021W，X022A，X022C，X022G，X022I，X022L，X022M，X022N，X022P，X022Q，X022T，X022V，X022W，X023A，X023G，X023S，X024A，X024C，X024D，X024F，X024G，X024H，X024L，X024M，X024N，X024P，X024Q，X024R，X024S，X024T，X024V，X024W，X025C，X025D，X025E，X025F，X025G，X025K，X025L，X025M，X025Q，X025R，X025S，X025T，X025V，X025W，X026C，X026F，X026G，X026M，X026N，X026R，X026S，X026T，X026V，X027A，X027C，X027D，X027F，X027G，X027K，X027L，X027M，X027N，X027P，X027R，X027S，X027T，X027W，X028A，X028I，X028L，X028M，X028V，X029A，X029C，X029G，X029S，X029V，X030A，X030C，X030L，X030M，X030T，X030V，X031A，X031F，X031I，X031I，X031M，X031S，X031V，X033C，X033M，X033S，X033T，X035I，X035L，X035M，X035P，X036A，X036E，X036S，X036T，X036V，X038C，X038F，X038H，X038I，X038K，X038L，X038M，X038N，X038Q，X038R，X038T，X038V，X038Y，X040A，X040D，X040E，X040I，X040L，X040P，X040V，X043A，X043C，X043D，X043E，X043F，X043G，X043I，X043L，X043M，X043N，X043R，X043S，X043T，X043W，X043Y，X044A，X044C，X044D，X044F，X044G，X044I，X044K，X044L，X044M，X044N，X044Q，X044R，X044S，X044T，X044V，X044Y，X045A，X045D，X045F，X045G，X045H，X045I，X045K，X045L，X045M，X045N，X045P，X045Q，X045R，X045S，X045T，X045V，X045W，X045Y，X046C，X046D，X046E，X046G，X046H，X046I，X046K，X046L，X046M，X046N，X046P，X046Q，X046R，X046S，X046T，X046V，X047G，X047R，X048A，X048C，X048E，X048F，X048H，X048I，X048K，X048L，X048M，X048N，X048P，X048Q，X048R，X048S，X048T，X048V，X048Y，X049A，X049G，X049H，X049S，X049T，X050F，X050H，X050I，X050L，X050T，X050V，X050Y，X051F，X051H，X051K，X051L，X051R，X051S，X051T，X051V，X051W，X052A，X052C，X052E，X052F，X052G，X052H，X052I，X052L，X052M，X052N，X052P，X052Q，X052R，X052T，X052V，X052W，X052Y，X053A，X053C，X053D，X053E，X053G，X053H，X053K，X053L，X053M，X053Q，X053R，X053S，X053T，X053W，X053Y，X054A，X054C，X054D，X054E，X054F，X054H，X054M，X054N，X054Q，X054S，X055C，X055E，X055G，X055H，X055K，X055L，X055P，X055Q，X055S，X055T，X055W，X056A，X056C，X056D，X056E，X056H，X056L，X056M，X056N，X056P，X056Q，X056S，X056T，X057C，X057E，X057F，X057G，X057H，X057I，X057L，X057M，X057N，X057P，X057Q，X057R，X057S，X057T，X057V，X057W，X057Y，X059A，X059D，X059G，X059I，X059L，X059M，X059N，X059Q，X059R，X059S，X059T，X059V，X059W，X061A，X061C，X061D，X061F，X061G，X061H，X061I，X061L，X061M，X061N，X061P，X061R，X061S，X061T，X061V，X061Y，X062C，X062E，X062F，X062H，X062I，X062K，X062L，X062M，X062N，X062Q，X062R，X062S，X062T，X062V，X068I，X068L，X068V，X069A，X069G，X069S，X069T，X072I，X072L，X072T，X072V，X073A，X073C，X073S，X076D，X076N，X078A，X078C，X078E，X078H，X078L，X078M，X078N，X078Q，X078S，X078T，X084C，X084G，X084I，X084M，X084V，X086C，X086P，X087A，X087C，X087D，X087E，X087G，X087K，X087L，X087N，X087S，X087V，X088A，X088C，X088G，X088S，X089A，X089D，X089E，X089G，X089H，X089I，X089N，X089Q，X089R，X089S，X089T，X089W，X090C，X090I，X090L，X090M，X090Q，X090T，X090V，X091D，X091F，X091I，X091N，X091S，X091V，X091W，X091Y，X092A，X092G，X092P，X092R，X092V，X093A，X093C，X093G，X093L，X093M，X093T，X093V，X094K，X094R，X095A，X095C，X095I，X095S，X095V，X096F，X096I，X096L，X096M，X097A，X097D，X097E，X097F，X097G，X097H，X097K，X097L，X097M，X097N，X097P，X097Q，X097R，X097S，X097T，X097V，X097W，X097Y，X098A，X098C，X098D，X098E，X098F，X098G，X098K，X098L，X098N，X098P，X098Q，X098R，X098S，X098T，X098V，X098Y，X099A，X099C，X099F，X099G，X099K，X099M，X099P，X099Q，X099R，X099S，X099T，X099V，X099Y，X100D，X100E，X100G，X100I，X100K，X100N，X100R，X100S，X100T，X100V，X100Y，X101A，X101C，X101D，X101E，X101F，X101G，X101H，X101I，X101K，X101N，X101P，X101Q，X101R，X101S，X101T，X101V，X101Y，X102A，X102G，X102T，X103A，X103C，X103D，X103F，X103G，X103I，X103L，X103N，X103P，X103Q，X103R，X103S，X103T，X103V，X103W，X104C，X104F，X104H，X104I，X104L，X104R，X104S，X104T，X104V，X104W，X104Y，X105A，X105C，X105D，X105E，X105F，X105G，X105K，X105L，X105N，X105Q，X105R，X105S，X105T，X105V，X106A，X106D，X106E，X106G，X106I，X106L，X106R，X106S，X106T，X106V，X106W，X107A，X107C，X107F，X107I，X107L，X107M，X107Q，X107S，X107T，X107V，X108A，X108C，X108I，X108S，X108T，X108V，X109A，X109E，X109F，X109G，X109H，X109I，X109K，X109L，X109M，X109N，X109Q，X109R，X109S，X109T，X109W，X109Y，X110A，X110G，X111F，X111I，X111L，X111M，X112D，X112E，X112I，X112Q，X112V，X114A，X114C，X115C，X115E，X115G，X115L，X115M，X115P，X115Q，X115S，X115T，X115W，X115Y，X116A，X116C，X116D，X116F，X116G，X116I，X116K，X116L，X116M，X116N，X116Q，X116S，X116T，X116V，X116W，X117A，X117C，X117N，X117Q，X117R，X117T，X117Y，X118A，X118C，X118D，X118E，X118F，X118G，X118K，X118M，X118N，X118R，X118S，X118V，X118W，X119A，X119F，X119M，X119T，X120A，X120C，X120E，X120F，X120G，X120H，X120I，X120L，X120M，X120N，X120R，X120S，X120T，X120W，X121A，X121C，X121F，X121I，X121L，X121M，X121S，X121T，X121V，X122A，X122G，X122S，X122V，X124G，X124L，X124T，X126A，X126F，X126I，X126L，X126M，X126V，X128A，X128F，X128G，X128I，X128K，X128L，X128M，X128N，X128Q，X128R，X128S，X128T，X128W，X129A，X129E，X129F，X129G，X129M，X129N，X129P，X129R，X129S，X129Y，X130C，X130K，X130L，X130N，X130Q，X130R，X130S，X130V，X130W，X130Y，X131A，X131D，X131E，X131F，X131G，X131K，X131P，X131Q，X132A，X132H，X132I，X132N，X132Q，X132R，X132S，X132T，X133A，X133F，X133K，X133N，X133P，X133S，X133T，X133V，X133Y，X134A，X134S，X134T，X134V，X135L，X135M，X135W，X136E，X136Q，X137A，X137C，X137E，X137H，X137K，X137L，X137M，X137Q，X137R，X137S，X137W，X139C，X139I，X139V，X140D，X140E，X140N，X141D，X141E，X141G，X141H，X141I，X141K，X141L，X141N，X141Q，X141R，X141S，X141V，X141Y，X142A，X142C，X142V，X143C，X143D，X143F，X143H，X143N，X143T，X144A，X144C，X144D，X144G，X144H，X144I，X144L，X144M，X144N，X144R，X144S，X144T，X144V，X144Y，X145A，X145C，X145D，X145F，X145K，X145L，X145N，X145Q，X145R，X146D，X146G，X147I，X147L，X147T，X147V，X148C，X148I，X148L，X148M，X148N，X148V，X149C，X149I，X149L，X149V，X150A，X150L，X150T，X150V，X151A，X151S，X152A，X152S，X156D，X156E，X156L，X156N，X156S，X156T，X158A，X158C，X158E，X158F，X158H，X158K，X158L，X158M，X158Q，X158R，X158S，X158T，X158V，X159A，X159C，X159E，X159G，X159H，X159M，X159P，X159S，X160A，X160C，X160D，X160F，X160I，X160L，X160M，X160N，X160Q，X160S，X160T，X160V，X160Y，X165I，X165L，X165V，X166A，X166C，X166D，X166E，X166H，X166M，X166S，X166T，X167F，X167Y，X170A，X170D，X170E，X170G，X170H，X170K，X170Q，X170R，X170S，X170V，X170Y，X171C，X171Y，X172A，X172C，X172D，X172G，X172I，X172K，X172L，X172M，X172P，X172Q，X172R，X172S，X172V，X172Y，X173A，X173C，X173D，X173H，X173M，X173N，X173Q，X173T，X174A，X174S，X174T，X174V，X175L，X175M，X175V，X176A，X176S，X177C，X177V，X180T，X180V，X182A，X182D，X182E，X182Q，X183A，X183D，X183N，X183Q，X183S，X184D，X184N，X185A，X185C，X185E，X185H，X185K，X185M，X185N，X185Q，X185T，X185V，X186I，X186K，X186L，X186R，X187A，X187C，X188A，X188D，X188E，X188F，X188H，X188I，XI88K，X188L，X188P，X188Q，X188S，X188T，X191A，X191D，X191Q，X191S，X194A，X194C，X194D，X194E，X194F，X194H，X194I，X194L，X194M，X194P，X194Q，X194R，X194S，X194T，X194W，X194Y，X195C，X195D，X195E，X195G，X195Q，X198I，X198L，X199C，X199M，X199S，X199V，X203C，X203E，X203T，X203V，X204A，X204C，X204E，X204G，X204N，X204S，X206D，X206E，X206H，X206L，X206N，X206Q，X206S，X209F，X209M，X209W，X209Y，X210A，X210C，X210I，X210L，X210M，X210N，X210P，X211A，X211C，X211E，X211G，X211H，X211I，X211M，X211P，X211Q，X211T，X211V，X212C，X212F，X212G，X212H，X212M，X212N，X212R，X212S，X212Y，X213A，X213D，X213E，X213N，X213Q，X213S，X213T，X215A，X215C，X215D，X215E，X215H，X215I，X215K，X215M，X215N，X215S，X215T，X215V，X215Y，X216A，X216C，X216D，X216E，X216F，X216H，X216I，X216L，X216M，X216N，X216Q，X216S，X216V，X216W，X216Y，X217A，X217C，X217D，X217E，X217F，X217K，X217L，X217M，X217Q，X218C，X218D，X218E，X218N，X218Q，X222C，X222M，X222S，X223A，X223S，X224A，X224N，X224S，X224T，X227A，X227C，X227V，X228A，X228G，X228S，X228V，X230A，X230G，X230N，X230S，X230T，X230V，X231A，X231C，X231F，X231G，X231S，X232A，X232L，X232M，X233A，X233C，X233E，X233G，X233I，X233L，X233N，X233Q，X233S，X233T，X233V，X234L，X234M，X234N，X234Q，X234S，X234T，X234V，X235C，X235F，X235G，X235H，X235I，X235K，X235L，X235M，X235N，X235Q，X235R，X235S，X235V，X235W，X235Y，X236A，X236C，X236E，X236F，X236H，X236N，X236Q，X236S，X236T，X236Y，X237A，X237C，X237F，X237G，X237H，X237I，X237K，X237L，X237M，X237Q，X237R，X237S，X237T，X237V，X237W，X237Y，X238C，X238D，X238E，X238F，X238G，X238H，X238I，X238K，X238L，X238M，X238N，X238Q，X238R，X238S，X238T，X238V，X238Y，X239C，X239D，X239F，X239G，X239H，X239K，X239L，X239M，X239N，X239P，X239Q，X239R，X239S，X239T，X239V，X239W，X239Y，X240A，X240C，X240E，X240F，X240I，X240K，X240M，X240N，X240Q，X240R，X240S，X240T，X240W，X240Y，X241A，X241C，X241D，X241E，X241F，X241G，X241H，X241I，X241K，X241L，X241M，X241N，X241Q，X241R，X241S，X241T，X241V，X241W，X241Y，X242A，X242C，X242D，X242G，X242H，X242I，X242L，X242M，X242P，X242Q，X242S，X242T，X242V，X243C，X243D，X243E，X243F，X243G，X243H，X243I，X243L，X243M，X243N，X243P，X243Q，X243S，X243T，X243V，X243W，X244D，X244E，X244F，X244H，X244I，X244L，X244M，X244N，X244Q，X244S，X244T，X244V，X244W，X245A，X245C，X245E，X245G，X245H，X245K，X245L，X245P，X245Q，X245S，X245V，X245W，X245Y，X246A，X246C，X246I，X246L，X246M，X246T，X246V，X247A，X247C，X247F，X247G，X247H，X247K，X247L，X247M，X247N，X247R，X247S，X247T，X247V，X247W，X247Y，X248C，X248D，X248E，X248G，X248H，X248I，X248L，X248N，X248P，X248R，X248S，X248T，X248V，X248Y，X249A，X249D，X249E，X249F，X249G，X249H，X249I，X249K，X249L，X249M，X249N，X249Q，X249S，X249T，X249W，X249Y，X250C，X250I，X250L，X250M，X250V，X251A，X251D，X251E，X251F，X251G，X251K，X251L，X251M，X251Q，X251R，X251T，X251V，X251Y，X252A，X252C，X252D，X252F，X252G，X252H，X252I，X252K，X252L，X252M，X252N，X252R，X252S，X252V，X252W，X253A，X253E，X253H，X253M，X253S，X253T，X253W，X255A，X255C，X255D，X255E，X255I，X255L，X255N，X255Q，X255T，X255V，X255Y，X256A，X256C，X256D，X256E，X256G，X256H，X256I，X256K，X256L，X256M，X256N，X256P，X256S，X256V，X256W，X256Y，X258D，X258G，X259A，X259C，X259E，X259P，X259Q，X259S，X260A，X260D，X260E，X260H，X260I，X260N，X260P，X260S，X260T，X260V，X261A，X261C，X261E，X261F，X261I，X261K，X261L，X261N，X261P，X261Q，X261S，X261T，X261V，X261W，X261Y，X262A，X262C，X262D，X262F，X262H，X262I，X262L，X262M，X262Q，X262T，X262V，X262Y，X265A，X265D，X265S，X267I，X267L，X268A，X268L，X268V，X269D，X269H，X269N，X269Q，X269S，X270A，X270C，X270G，X270I，X270L，X270N，X270S，X270T，X270V，X271C，X271E，X272A，X272C，X272D，X272E，X272F，X272G，X272H，X272L，X272M，X272N，X272P，X272S，X272T，X272W，X272Y，X273A，X273C，X273G，X273S，X274A，X274C，X274G，X274L，X274M，X274N，X274S，X274T，X275D，X275E，X275F，
X275H、X275K、X275L、X275M、X275P、X275Q和X275R，其中所述位置对照SEQ ID NO：1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。在一些实施方案中，枯草杆菌蛋白酶变体包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12或更多个上述位置。
在一些实施方案中，枯草杆菌蛋白酶变体在一个或多个位置上包含进一步的取代，所述位置选自：18、52、72、117、119、127、144、185、209和213，其中所述位置对照SEQ ID NO：1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。
在一些特别优选的实施方案中，前文和本文中描述的分离的枯草杆菌蛋白酶变体是GG36变体。在一些优选的实施方案中，GG36变体是SEQID NO：2的变体。在一些可选的实施方案中，前文和本文中描述的分离的枯草杆菌蛋白酶变体是BPN'变体。
在一些其他的实施方案中，分离的枯草杆菌蛋白酶变体包含取代的组合，所述取代选自：
S87N/Q109Q/G118D/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R，
S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248D，S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S1888/T213T/N248N，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248N，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/8188D/T213T/N248R，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248R，S87R/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R，S87R/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248R，S87R/Q109R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248R，S87N/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248R，S87R/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248N，S87R/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R，S87D/Q109D/G118D/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248R，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213T/N248R，S87R/Q109R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R，S87R/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248N，S87N/Q109R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248N，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248R，S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248N，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248D，S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248R，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248R，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248N，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248D，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248N，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248N，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213T/N248D，S87R/Q109D/G118D/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R，S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248R，S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248N，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248N，S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248N，S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248N，S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248R，S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248R，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248N，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213T/N248N，S87R/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R，S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R，S87N/Q109D/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248N，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248D，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248D，S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248D，S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248N，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248D，S87R/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248N，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248R，S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248N，S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213T/N248R，S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248D，和S87N/Q109Q/G118V/S128LP129Q/S130A/S188R/T213E/N248R，其中所述位置对照SEQ ID NO：1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。
在一些其他的实施方案中，分离的枯草杆菌蛋白酶变体包含取代的组合，所述取代选自：S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248D，S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248N，S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248D，S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248D，S87R/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R，S87R/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R，S87N/Q109D/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248D，和S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248D，其中所述位置对照SEQ ID NO：1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。
在一些其他的实施方案中，分离的枯草杆菌蛋白酶变体包含取代的组合，所述取代选自：S87D/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248D，S87N/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R，S87D/Q109Q/G118D/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248D，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248D，S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248D，S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213T/N248D，S87R/Q109D/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R，S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248D，
和S87R/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248R，其中所述位置对照SEQ ID NO：1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。
在一些其他的实施方案中，本发明提供了分离的枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体包含选自以下的取代的组合：A001C/S024V/I107L、A001I/R045T/I107R/A172T，A001K/A172L，A001K/A172W，A001K/I072C/L126F，A001K/I072C/L126F/S164Q，A001K/I072C/V104I/L126F，A001K/I072C/V104I/L126F/S164Q，A001K/I072V，A001K/I072V/L126F，A001K/I072V/L126F/S164F，A001K/I072V/V104I，A001K/I072V/V104I/L126F/S164I，A001K/I072V/V104I/S164F，A001K/I072V/V104I/S164Q，A001K/I107T/A172Q，A001K/I107V/G127Q，A001K/I107V/G127Q/A172Q，A001K/I107V/G127R/A172Q，A001K/L126F，A001K/L126F/S164F，A001K/L126F/S164I，A001K/L126F/S164Q，A001K/R045F/I072C，A001K/R045F/I072C/L126F，A001K/R045F/I072C/V104I/S164F，A001K/R045F/I072V/L126F/S164I，A001K/R045F/I072V/L126F/S164Q，A001K/R045F/I072V/S164F，A001K/R045F/I072V/V104G/S164T，A001K/R045F/I107L/A172N，A001K/R045F/I107T，A001K/R045F/I107V/G127Q，A001K/R045F/L126F/S164F，A001K/R045F/L126F/S164I，A001K/R045F/S164F，A001K/R045F/V104I/L126F/S164Q，A001K/R045K/I072C/L126F/S164Q，A001K/R045K/I072V/L126F，A001K/R045K/I072V/L126F/S164F，A001K/R045K/I072V/L126F/S164Q，A001K/R045K/I072V/S164F，A001K/R045K/I072V/S164Q，A001K/R045K/I072V/V104I/L126F/S164F，A001K/R045K/I072V/V104I/L126F/S164I，A001K/R045K/I072V/V104I/L126F/S164Q，A001K/R045K/I107A/A172T，A001K/R045K/I107R/G127A/A172N，A001K/R045K/I107T/G127R，A001K/R045K/I107T/G127R/A172Q，A001K/R045K/L126F，A001K/R045K/L126F/S164I，A001K/R045K/L126F/S164P，A001K/R045K/L126F/S164Q，A001K/R045K/S164F，A001K/R045K/V104I/S164Q，A001K/R045K/V104L/S164A，A001K/R045N/I107T/G127Q，A001K/R045S/V104C/L126Y/S164F，A001K/S024H/I107T/G127Q，A001K/S024H/I107T/G127R，A001K/S024H/I107V，A001K/S024H/R045N/I107T，A001K/S024H/R045N/I107T/G127Q/A172Q，A001K/S024L/R045A，A001K/S024N/I107V/G127T，A001K/S024N/R045K/A172Y，A001K/S024R/I107T，A001K/S024R/R045N/A172C，A001K/S024R/R045N/I107T，A001K/S024R/R045N/I107T/G127R，A001K/S024T/I107T/G127Q/A172Q，A001K/S024T/R045N/G127Q/A172Q，A001K/S024W/I107T/G127R，A001K/S024W/I107V/G127T/A172Q，A001K/S164Q，A001K/V104E，A001K/V104I/L126F，A001K/V104I/L126F/S164I，A001K/V104I/L126F/S164Q，A001L/I072C，A001L/R045Q/G127H/A172R，A001L/S024D/R045Y/I107Y，A001M/R045S/I107E/A172D，A001P/A172V，A001Q/R045K/I107T，A001R/A172G，A001R/A172Q，A001R/I107T，A001R/I107T/A172Q，A001R/I107T/G127Q/A172Q，A001R/I107V/A172Q，A001R/R045F，A001R/R045K/A172Q，A001R/R045K/G127R，A001R/R045K/I107T/G127Q，A001R/R045K/I107V/G127R，A001R/R045N/A172K，A001R/R045N/A172Q，A001R/R045N/I107T，A001R/R045N/I107T/G127Q，A001R/R045N/I107V/A172V，A001R/R045N/I107V/G127Q/A172Q，A001R/R045N/I107V/G127R，A001R/S024H/I107T，A001R/S024H/R045K/I107T，A001R/S024H/R045K/I107T/A172Q，A001R/S024H/R045N/I107T/A172Q，A001R/S024N，A001R/S024R，A001R/S024R/A172H，A001R/S024R/A172Q，A001R/S024R/I107V/A172L，A001R/S024R/I107V/G127R，A001R/S024R/R045F/I107T/G127Q，A001R/S024R/R045F/I107T/G127R，A001R/S024R/R045K/I107T/G127Q，A001R/S024T/I107T/A172Q，A001R/S024T/R045K/A172Q，A001R/S024T/R045K/I107L/G127P/A172P，A001R/S024T/R045N/I107T/A172Q，A001R/S024W/I107V/A172S，A001R/S024W/R045F/I107V/G127Q，A001R/S024W/R045F/I107V/G127R，A001R/S024W/R045K，A001R/S024W/R045K/I107T/A172Q，A001R/S024W/R045N/I107T，A001S/A172V，A001S/S024L/I107Y/A172S，A001T/S024H/I107L/A172Y，A001V/I107L/A172I，G097P/N185Q/A215I，G097P/Y209W/A215V/S256W，G118L/G127R/S132L，G118T/G127Q，I107A/G127K/A172G，I107C/A172S，I107P/A172S，I107Q/A172D，L126A/S164N，L126F/S164V，M119F/N185R，M119F/N185R/Y209W/S256T，M119F/N185V/Y209W，M119F/S144T/N185V/S256I，M119F/S144W/N185R/S256L，M119F/Y209W，M119F/Y209W/S256I，N018K/A215I，N018K/A215R，N018K/A215V，N018K/G097P/A215I/S256W，N018K/G097P/N185K/S256W，N018K/G097P/N185K/Y209W/A215I/S256W，N018K/G097P/N185Q/Y209W/A215V/S256W，N018K/G097P/N185R/A215R/S256W，N018K/G097P/N185R/A215V/S256W，N018K/G097P/N185R/S256W，N018K/G097P/N185R/Y209W，N018K/G097P/N185R/Y209W/S256W，N018K/G097P/Y209W/A215V/S256W，N018K/N185K，N018K/N185K/A215V/S256W，N018K/N185K/S256W，N018K/N185K/Y209W/A215R，N018K/N185Q/A215R/S256W，N018K/N185Q/A215V/S256W，N018K/N185Q/S256W，N018K/N185Q/Y209W/S256W，N018K/N185R/A215I/S256W，N018K/N185R/A215R/S256W，N018K/N185R/A215V，N018K/N185R/Y209W/A215V/S256W，N018K/S256W，N018Q/G097P/N185K/A215V，N018Q/G097P/N185K/Y209W，N018Q/N185K，N018Q/N185K/S256W，N018Q/N185K/Y209W/A215I/S256W，N018Q/N185K/Y209W/A215V，N018Q/N185K/Y209W/A215V/S256W，N018Q/N185Q/A215V，N018Q/N185Q/S256W，N018Q/N185Q/Y209W/S256W，N018Q/N185R/A215R，N018Q/N185R/S256W，N018R/G097P/N185Q/A215I，N018R/G097P/Y209W/A215V，N018R/G097P/Y209W/S256W，N018R/N185K/A215V/S256W，N018R/N185K/S256W，N018R/N185Q/A215V/S256W，N018R/N185Q/Y209W/S256W，N018R/N185R/A215R，N018R/N185R/S256W，N018R/N185R/Y209W/S256W，N018R/Y209W/A215V/S256W，N018R/Y209W/S256W，N043E/S101E，N043E/S101E/N248K，N043E/S101F，N043E/S101N/N117Y，N043E/S101V，N043E/S101Y/N117I/N248K，N043E/S101Y/N117Y/N248K，N043F/N117I，N043F/S101E/N117I/N248K，N043F/S101R，N043I/N117Y，N043I/S101E/N248I，N043I/S101F/N117Y/N248K，N043I/S101N/N117Y/N248K，N043I/S101R/N248K，N043I/S101Y/N117I/N248I，N043I/S101Y/N117Y/N248K，N043S/N117Y/N248K，N043S/N248I，N043S/S101E，N043S/S101E/N117I/N248I，N043S/S101E/N117Y/N248K，N043S/S101E/N248K，N043S/S101F，N043S/S101F/N248K，N043S/S101N/N117I，N043S/S101R/N117I/N248K，N043S/S101V/N117I/N248I，N043S/S101Y，N043S/S101Y/N117I，N0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18V/S128L/P129Q/S130A/S144T/S256I，S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144T/Y209W/S256I，S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144V，S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144V/N185R/S256I，S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144V/N185R/Y209W，S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144V/N185V，S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144V/N185V/S256I，S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144V/N185V/Y209W，S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144V/Y209W/S256I，S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144V/Y209W/S256T，S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144W/Y209W，S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144Y/N185R，S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144Y/N185R/Y209W/S256T，S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S144Y/N185V/Y209W，S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S164I，S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S164Q，S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/V104I，S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/V104I/L126F/S164F，S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/V104I/L126F/S164I，S087N/G118WS128L/P129Q/S130A/V104I/S164I，S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/V104I/S164Q，S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/Y209W，S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/Y209W/A215I/S256W，S087N/G118V/S128L/P129Q/S130A/Y209W/S256W，S099H/S103I/G118N，S099K/G118R，S099K/S103N/G118T，S099K/S103P/G118L/S132N，S099K/S103P/G127Q，S099K/S103P/S132H，S099K/S103R/G118A/S132P，S099N/S132R，S099Q/G118F/G127R，S099Q/G118T/G127Q，S099Q/S103N/G118R/S132N，S099Q/S103N/G118T，S099Q/S103N/G118T/S132H，S099Q/S103N/S132H，S099Q/S103P/G118R，S099Q/S103P/G118R/S132N，S099Q/S103P/S132H，S099Q/S132R，S099T/G118F，S099T/G118R/S132H，S099T/G118T/S132H，S099T/G118T/S132N，S099T/S103P，S099T/S103P/G118L/S132H，S101E/N117I，S101E/N117Y/N248K，S101F/N117I/N248I，S101F/N117Y/N248I，S101F/N117Y/N248K，S101F/N248K，S101R/N117I/N248K，S101R/N117Y，S101R/N248K，S101T/N117Y/N248K，S101T/N248I，S101V/N248K，S101Y/N117I/N248K，S101Y/N117Y，S101Y/N248K，S103G/G118I/G127E/S132E，S103L/S132E，S103R/S132P，S144T/N185R，S144T/N185R/Y209W/S256I，S144T/N185R/Y209W/S256T，S144T/N185V，S144V/N185R/S256I，S144V/N185R/Y209W，S144V/N185R/Y209W/S256T，S144V/S256I，S144V/Y209W，S144W/N185R/Y209W/S256T，
S144W/N185V/Y209W/S256I、S144W/S256I、S144Y/Y209W/S256I、V104E/L126I/S164L，其中所述位置对照SEQ ID NO：1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。
在一些其他的实施方案中，本发明提供了分离的枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体包含选自以下的取代的组合：TS87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S24W/S101L/Q109K，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101L/Q109R/N185R/A215R，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/Q109R/S164I，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/Q109R/S188D/N248R，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101Y/Q109L/N185R/A215R，S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101K/S188D/N248R，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S24W/S101L/Q109L，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101Y/Q109R/N185R/A215R，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101L/Q109R/S164I，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/Q109R/S188D/T213E/N248R，S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/I72V/S164I/S188D/N248R，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N76D，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S24W/S101Y/Q109K，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N43S/P52V/S101R/Q109R，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101Y/Q109R/S164I，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101L/Q109L/S188D/N248R，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/Q109R/S164I/S188D/N248R，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N76D/S101L，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S24W/S101Y/Q109L，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N76D/S164I，S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/N76D/S188D/N248R，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/Q109L/S188D/N248R，S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/V118R/S188D/N248R，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N76D/S101M，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/N76D/G97P/N185R/A215R，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101L/S164I，S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101L/S188D/N248R，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/Q109L/S188D/T213E/N248R，S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/Q109L/S188D/N248R，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101L/N185R/A215R，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101Y/S164I，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/T213E/N248R，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101L/Q109L/S164I，S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101V/S188D/N248R，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101Y/N185R/A21SR，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101V/S164I，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101L/T213E/N248R，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101Y/Q109L/S164I，S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101H/S188D/N248R，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/Q109R/N185R/A215R，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101H/S164I，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101L/Q109R/S188D/N248R，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101L/Q109L/N185R/A215R，S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101M/S188D/N248R，N76D/S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D，N76D/S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/N248K，S87N/G118V/G127S/S128L/P129Q/S130A，S87N/S101H/G118V/S128L/P129Q/S130A，S87N/S101K/G118V/S128L/P129Q/S130A，S87N/S101V/G118V/S128L/P129Q/S130A，S87N/S101Y/G118V/S128L/P129Q/S130A，
S87N/S101L/G118V/S128L/P129Q/S130A、I72V/S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A//S164I，其中所述位置对照SEQID NO：1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。
本发明还提供了分离的核酸，所述核酸编码前文和本文中提出的枯草杆菌蛋白酶变体。本发明进一步提供了包含所述核酸的表达载体，所述核酸编码前文和本文中提出的枯草杆菌蛋白酶变体。此外，本发明提供了包含所述表达载体的宿主细胞，所述载体编码的核酸编码前文和本文中提出的枯草杆菌蛋白酶变体。
本发明还提供了包含本文提供的枯草杆菌蛋白酶变体的清洁组合物。在一些实施方案中，清洁组合物包含液体的、凝胶的、片剂的、粉末的和/或颗粒状的去垢剂。在一些其他实施方案中，所述清洁组合物选自衣物洗涤去垢剂和餐具去垢剂。在一些优选的实施方案中，清洁组合物包含衣物洗涤去垢剂。在一些特别优选的实施方案中，所述起劲组合物是重垢型去垢剂。在其他一些实施方案中，清洁组合物包含选自手洗餐具去垢剂和自动化餐具洗涤去垢剂的餐具去垢剂。在一些优选的实施方案中，本文提供的清洁组合物进一步包含至少一种漂白试剂。在其他一些实施方案中，本文提供的清洁组合物是无磷的，而在一些可选的实施方案中，本文提供的清洁组合物是含磷的去垢剂。在一些其他的实施方案中，本文提供的清洁组合物是冷水型去垢剂。在一些其他的实施方案中，本文提供的清洁组合物进一步包含至少一种其他的酶。在一些实施方案中，所述清洁组合物包含至少一种其他的酶，所述酶选自半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、金属蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过水解酶(perhydrolasess)、角质酶、果胶酶、果胶裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂加氧酶、木质酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanases、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和淀粉酶，或其混合物。
本发明还提供了用于清洁的方法，其包括提供待清洁的物品和包含至少一种本文提供的清洁组合物的组合物，以及在有效提供所述物品的清洁的条件下，将所述物品与所述组合物接触。在一些实施方案中，该方法进一步包括在将所述物品与所述清洁组合物接触后，清洗所述物品的步骤。在一些优选的实施方案中，所述待清洁的物品包括餐具。在一些可选的实施方案中，所述待清洁的的物品包括织物。
附图简介
图1提供了多种参照蛋白酶的比对，所述参照蛋白酶包括：BPN’(SEQID NO：1)、GC GCI-P036(SEQ ID NO：2)、GCI-P037(SEQ ID NO：3)和GCI-P038(SEQ ID NO：4)。除非另外说明，则取代位置相对于BPN’给出。
图2提供了pHPLT-GG36的图。
图3提供了p2JH-GG36ci的图。
图4描述了使用用于变体蛋白酶的eglin c抑制测定所确定的蛋白酶浓度。
图5描述了变体蛋白酶的洗涤性能(BMI微样品)。
发明详述
本发明提供了用于蛋白质改造的方法，和从所述方法产生的丝氨酸蛋白酶变体。具体而言，本发明提供相比参照丝氨酸蛋白酶具有一个或多个取代的丝氨酸蛋白酶。此外，本发明提供包含这类丝氨酸蛋白酶变体的组合物。在一些实施方案中，本发明提供了包含至少一种的这类丝氨酸蛋白酶变体的清洁组合物。
出于实践的目的，为了产生对特定应用最优的蛋白质，通常并非必须发现蛋白质空间中的最佳序列。对于大部分应用，待解决的问题是鉴别至少一种满足或超过多个特性要求的最小值的蛋白质序列。这要求关于对特定特性有益的突变的知识，以及对任何理想的特性不利的突变的知识。本发明提供了满足所述目标的手段，通过鉴别蛋白质中这样的位置，所述位置可以被改变从而改良主要特性，并且保持其他特性的值落入理想的范围内。
本发明提供了针对所有的目标特性，评估蛋白质中所有位置的手段，通过在每个位点建立“位点评估文库”。在优选的实施方案中，这类文库在每个位置含有9-19个突变，并用于评估每个位置在改造蛋白质和构建文库中的用途。相对于参照酶测量每种特性，并计算每种变体对比野生型的表观自由能差异。然后，将这类delta delta G(“即，ΔΔG”)表观值用于确定相加性(additivity)。
分析变体的一种理想方式可以是通过在目标过程中变体对比参照蛋白的自由能差异。过程的Gibbs自由能表示系统可以做的最大的功。相对于参照酶(ΔΔG)，自由能的改变如下：
ΔΔG＝-RT ln(k变体/k参照)
其中，k变体是变体酶的速率常数，k参照是参照酶的速率常数，R是Gas法定常数，而T是绝对温度。大部分测定并非被构建以允许确定真实的自由能，所以利用了这样的数：
ΔΔGapp＝-RT ln(P变体/P参照)
其中，P变体是变体的性能值，而P参照是处于相同条件下的参照酶的性能值。可以预期，关于数据分布和相加性，ΔΔGapp值以相似的方式与ΔΔG相似的方式行动。然而，由于ΔΔG是变体相比参照酶可以做的最大量的功，故一般ΔΔGapp的量低估了ΔΔG，导致结果似乎是协同的，因为2个相加位置的特性可能大于通过将它们的ΔΔGapp值加在一起所预测的值。
此外，本发明提供了枯草杆菌蛋白酶变体和包含这类变体的组合物。
定义
除非另外指出，本发明的实践涉及分子生物学、蛋白质改造、微生物学和重组DNA中常用的常规技术，落入本领域技术人员的范围内。此类技术是本领域技术人员已知的，描述在多种本领域技术人员熟知的教科书和参考文献中。本文(不论上下文)提及的所有专利、专利申请、文章和出版物，都通过引用并入本文中。
除非本文中另外定义，否则本文中使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域领域普通技术人员通常理解的相同含义。许多技术词典是本领域技术人员已知的。虽然任何与本文所述相似或等价的方法和材料都可用于本发明的实践中，但优选的方法和材料是本文所述的。因而，通过整体的参照说明书更详细的描述了下文直接定义的术语。如本文中使用的，单数“一”、“该”和“这个”也包括了复数的指代，除非语境中另外明确指出。数值范围包括了定义范围的数。除非另外指出，核酸按从左到右5’至3’方向书写；氨基酸序列按从左到右氨基至羧基方向书写。可以理解，本发明并非意在限于所述特定的方法、规程和试剂，因其可以根据它们被本领域技术人员所使用的环境而改变。
除非另外指出，本发明的实践使用蛋白质纯化、分子生物学、微生物学、重组DNA技术和蛋白质测序的常规技术，均落入本领域技术人员的知识范围内。
此外，本文提供的小标题不是对本发明的各方面或实施方案的限制，所述限制可以通过整体参照说明书得出。因而，通过整体的参照说明书更详细的定义了下文直接定义的术语。无论如何，为了促进对发明的理解，下文定义的多个术语。
如本文中使用的，术语“蛋白酶”和“蛋白水解活性”指表现出水解肽或具有肽键的底物的能力的蛋白质或肽。存在许多普遍已知的用于测量蛋白水解活性的程序(Kalisz，“Microbial Proteinases，”In：Fiechter(编著)，Advances in Riochemical Engineering/Biotechnol0gy，[1988])。例如，可以通过比较性测定来确定蛋白水解活性，所述测定分析了各种蛋白酶水解商业底物的能力。可用于分析蛋白酶或蛋白水解活性的示例性底物包括但不限于二甲基酪蛋白(Sigma C-9801)、牛胶原蛋白(Sigma C-9879)、牛弹性蛋白(Sigma E-1625)和牛角蛋白(ICN Biomedical902111)。比色测定利用的这类底物是本领域普遍已知的(见例如，WO 99/34011和U.S.专利号6,376,450，均通过引用并入本文中)。pNA测定(见例如，Del Mar等，Anal.Biochem.，99：316-320[1979])也可用于确定在梯度洗脱过程中收集的级分的活性酶浓度。该测定测量了酶水解可溶性的合成底物——琥珀酰-丙氨酰-丙氨酰-脯氨酰-苯丙氨酰-对硝基苯胺(suc-AAPF-pNA)——时释放对硝基苯胺的速率。在分光光度计上，测量410nm处从水解反应产生黄色的速率，所述速率与活性酶浓度成正比。此外，280nm处的吸收测量值可以用于确定总蛋白浓度。活性酶/总蛋白比例给出酶纯度。
如本文中使用的，术语“枯草杆菌蛋白酶”指MEROPS——肽酶数据库(Rawlings等，MEROPS：the peptidase database，Nucl Acids Res，34Database issue，D270-272，2006)中描述的S8蛋白酶家族的任何成员。如本文中使用的，肽酶家族S8含有丝氨酸内肽酶枯草杆菌蛋白酶及其同源物(Biochem J，290：205-218，1993)。家族S8也称为subtilase家族，是丝氨酸肽酶中的第二大家族，可以分为2个亚族，枯草杆菌蛋白酶(S08.001)是亚族S8A的典型例子，kexin(S08.070)是亚族S8B的典型例子。以前认为三肽基肽酶II(TPP-II；S08.090)是第三亚族的典型例子，但已确定为错误分类。家族S8成员的序列中具有顺序为Asp、His和Ser的催化三联体，与家族S1、S9和S10的三联体顺序不同。在亚族S8A中，活性位点残基经常存在于基序Asp-Thr/Ser-Gly(与集团(clan)AA中的天冬氨酸内肽酶家族中的序列基序相似)、His-Gly-Thr-His和Gly-Thr-Ser-Met-Ala-Xaa-Pro中。在亚族S8B中，催化残基经常存在于基序Asp-Asp-Gly、His-Gly-Thr-Arg和Gly-Thr-Ser-Ala/Val-Ala/Ser-Pro中。S8家族的大部分成员是内肽酶，在中性-弱碱性pH下是活性的。该家族中的许多肽酶是热稳定的。酪蛋白通常用作蛋白质底物，而一般合成底物是suc-AAPF。该家族中的大部分成员是非特异性的肽酶，优先在疏水性残基之后切割。然而，亚族S8B的成员，例如kexin(S08.070)和弗林蛋白酶(S08.071)，在氨基二元酸之后切割。S8家族的大部分成员被普通的丝氨酸肽酶抑制剂抑制，例如DFP和PMSF。由于家族的大部分成员出于稳定性的目的结合钙，因而用EDTA和EGTA可观察到抑制作用，后两者通常被认为是金属肽酶的特异性抑制剂。蛋白质抑制剂包括火鸡卵粘蛋白第三结构域(I01.003)、链霉菌属(Streptomyces)枯草杆菌蛋白酶抑制剂(I16.003)，和家族I13的成员，例如eglin C(I13.001)和大麦抑制剂CI-1A(I13.005)，其中许多也抑制胰凝乳蛋白酶(S01.001)。枯草杆菌蛋白酶前肽自身抑制的，而来自酵母属(Saccharomyces)的同源蛋白酶B抑制剂则抑制cerevisin(S08.052)。现已确定了家族S8的若干成员的三级结构。一般S8蛋白质结构由3层具有夹在2层螺旋之间的7条链β片层组成。枯草杆菌蛋白酶(S08.001)是集团SB(SB)的典型结构。尽管结构不同，但枯草杆菌蛋白酶和胰凝乳蛋白酶(S01.001)的活性位点可以重叠，提示相似性是趋同进化而非趋异进化的结果。
如本文中使用的，术语“蛋白酶变体”和“变体蛋白酶”用于指代与参照蛋白酶相似，特别是功能相似，但其氨基酸序列中具有突变的蛋白酶，使它们的序列在从1个至20个位置上与野生型蛋白酶不同。在图1的比对中显示了若干示例性参照蛋白酶的成熟区域的氨基酸序列。在一些优选的实施方案中，本发明提供了“GG36变体”，其中突变存在于SEQ ID NO：2所示的成熟GG36序列中。
如本文中使用的，“芽孢杆菌属”包括本领域技术人员已知落入“芽孢杆菌”属中的所有物种，包括但不限于枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、耐盐芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝结芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。认识到芽孢杆菌属持续经历着分类学的重新组织。因而，预计所述属包括已重分类的物种，包括但不限于此类生物体，例如嗜热脂肪芽孢杆菌，现称为“嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)”。在存在氧的条件下产生耐受性内孢子被认为是芽孢杆菌属的决定性特征，虽然该特征也应用于目前称为脂环酸杆菌属(Alicyclobacillus)、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、解硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌(Brevibacillus)、Filobacillus、薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus)、喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、需盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、耐热芽孢杆菌属(Thermobacillus)、Ureibacillus和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。
术语“多核苷酸”和“核酸”，在本文中可互换的使用，指任意长度的核苷酸的聚合形式，核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸。这类术语包括但不限于单链、双链或三链DNA、基因组DNA、cDNA、RNA、DNA-RNA杂合体，或包含嘌呤和嘧啶碱基，或其他天然的、化学的、生物化学的修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基的多聚体。下列是多核苷酸的非限制性实例：基因、基因片段、染色体片段、EST、外显子、内含子、mRNA、tRNA、rRNA、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支的多核苷酸、质粒、载体、任意序列的分离的DNA、任意序列的分离的RNA、核酸探针，和引物。在一些实施方案中，多核苷酸包含修饰的核苷酸，例如甲基化的核苷酸和核苷酸类似物、尿嘧啶、其他的糖类和链接基团，例如氟核糖和硫酰，以及核苷酸支链。在可选的实施方案中，通过非核苷酸组分中断核苷酸的序列。
如本文中使用的，术语“DNA构建体”和“转化DNA”可互换的用于指用于将序列导入宿主细胞或生物体中的DNA。可以通过PCR或任何本领域技术人员已知的其他合适的技术，在体外产生DNA。在特别优选的实施方案中，DNA构建体包括目标序列(例如，作为引入序列)。在一些实施方案中，序列与其他元件有效连接，例如控制元件(例如，启动子等)。DNA构建体可以进一步包含选择性标志物。它可以进一步包含两侧有同源盒的引入序列。在进一步的实施方案中，转化DNA包含添加在其末端的其他非同源序列(例如，填充序列或侧翼)。在一些实施方案中，引入序列的末端是封闭的，使得转化DNA形成封闭的环。转化序列可以是野生型、突变或修饰的。在一些实施方案中，DNA构建体包含与宿主细胞染色体同源的序列。在其他实施方案中，DNA构建体包含非同源的序列。一旦在体外装配了DNA构建体，则它可用于：1)将异源序列插入到宿主细胞的理想的靶序列中，和/或2)突变宿主细胞染色体的区域(即，用异源序列替换内源序列)，3)删除靶基因，和/或4)将复制质粒导入宿主中。
如本文中使用的，术语“表达盒”和“表达载体”指重组或合成产生的核酸构建体，具有一系列专门的核酸元件，所述核酸元件允许特定核酸在靶细胞中的转录。可以将重组表达盒整合到质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。一般的，除其他序列外，表达载体的重组表达盒部分包括待转录的核酸序列和启动子。在优选的实施方案中，表达载体具有在宿主细胞中整合和表达异源DNA片段的能力。许多原核和真核表达载体是可商购的。适当的表达载体的选择落入本领域技术人员的知识范围内。术语“表达盒”在本文中可与“DNA构建体”及其语法学的等价体互换的使用。适当表达载体的选择落入本领域技术人员的知识范围内。
如本文中使用的，术语“载体”指涉及用于将核酸导入一种或多种细胞类型中的多核苷酸构建体。载体包括克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、盒等。在一些实施方案中，多核苷酸构建体包含编码蛋白酶(例如，前体或成熟的蛋白酶)的DNA序列，所述DNA序列与能够在合适的宿主中进行DNA表达的合适的前序列(例如，分泌性的等)有效连接。
如本文中使用的，术语“质粒”指用作克隆载体的环状双链(ds)DNA构建体，所述构建体在一些真核或原核细胞中形成染色体外的自我复制性遗传元件，或整合到宿主染色体中。
如本文中使用的，在将核酸序列导入到细胞中的语境中，术语“导入”指适合将核酸序列转移到细胞中的任何方法。此类用于导入的方法包括但不限于原生质体融合、转染、转化、接合和转导(见例如，Ferrari等，“Genetics，”in Hardwood等，(编著)，Bacillus，Plenum Publishing Corp.，第57-72页，[1989])。
如本文中使用的，术语“转化”和“稳定的转化”指具有这样的非天然(异源的)多核苷酸序列的细胞，所述序列整合到所述细胞的基因组中，或作为附加体质粒维持至少2个世代。
如本文中使用的，当核酸置于与另一种核酸序列的功能性关系中时，所述核酸是“有效连接”的。例如，如果作为参与多肽分泌的前蛋白质表达，则编码分泌性前导子(即，信号肽)的DNA是与多肽的DNA有效连接的；如果启动子或增强子影响序列的转录，则它们是与编码序列有效连接的；或者如果核糖体结合位点的放置有利于翻译，则它是与编码序列有效连接的。一般而言，“有效连接”意指所连接的DNA序列是连续的，和在分泌性前导子的情况下，是以可读相(reading phase)连续的。然而，增强子不是必须连续的。通过在方便的限制性位点连接而完成连接。如果不存在此类位点，则根据常规实践使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。
如本文中使用的，术语“基因”指编码多肽的多核苷酸(例如，DNA片段)，并包括在编码区之前和之后的区域，以及在单个的编码片段(外显子)之间的间插序列(内含子)。
如本文中使用的，“同源基因”指来自不同但通常相关的物种的成对基因，它们彼此对应，并且彼此相同或高度相似。该术语涵盖了被物种形成(即，新物种的产生)分开的基因(例如，直向同源基因)，以及被基因复制分开的基因(例如，旁系同源基因)。
如本文中使用的，如果蛋白质具有相同排列的相同的主要二级结构且具有相同的分类学联系，则所述蛋白质定义为具有共同“折叠(fold)”。具有相同折叠的不同蛋白质通常具有大小和构象不同的二级结构的外周元件和转角区。在一些情况下，这些不同的外周区可以包含一半的所述结构。一起置于相同的折叠类别中的蛋白质不必需具有共同的进化起源(例如，源自蛋白质的物理和化学的、有利于某些压缩排列(packing arrangement)和链拓扑学的结构相似性)。
如本文中使用的，“同源性”指序列的相似性或同一性，优选指同一性。这种同源性是使用本领域已知的标准技术确定的(见例如，Smith和Waterman，Adv.Appl.Math.，2：482[1981]；Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.，48：443[1970]；Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：2444[1988]；程序例如Wisconsin遗传学软件包(Wisconsin Genetics SoftwarePackage)中的GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA(Genetics ComputerGroup、Madison、WI)；以及Devereux等，Nucl.Acid Res.，12：387-395[1984])。
有效算法的一个实例是PILEUP。PILEUP使用渐进的、成对的比对，从一组相关的序列中产生多重序列比对。它还可以绘制树状图，显示用于产生比对的成簇关系。PILEUP使用Feng和Doolittle的渐进比对方法的简化版(Feng和Doolittle，J.Mol.Evol.，35：351-360[1987])。所述方法与Higgins和Sharp所述的方法相似(Higgins和Sharp，CABIOS5：151-153[1989])。有效的PILEUP参数包括默认的空位权重3.00，默认的空位长度权重0.10，和加权的末端空位。
有效算法的另一个实例是BLAST算法，如Altschul等(Altschul等，J.Mol.Biol.，215：403-410，[1990]；和Karlin等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5787[1993])所述。特别有效的BLAST程序是WU-BLAST-2程序(见，Altschul等，Meth.Enzymol.，266：460-480[1996])。WU-BLAST-2使用若干搜索参数，大部分设定为默认值。可调节的参数用下列值设定：重叠跨度＝1，重叠分数＝0.125，字节阈值(T)＝11。HSP S和HSP S2参数是动态值，由程序本身根据特定序列的组成和将搜索目标序列的特定数据库的组成而确定的。然而，可以调节所述值以增加灵敏度。通过匹配的相同残基数除以比对区域中“较长”序列的残基总数，来确定A％氨基酸序列同一性的值。“较长”序列是在比对区域中具有最多实际残基的序列(忽视WU-Blast-2为了最大化比对分数而导入的空位)。
因而，“百分比(％)核酸序列同一性”定义为候选序列中，与起始序列(即，目标序列)的核苷酸残基相同的核苷酸残基的百分比。优选的方法利用WU-BLAST-2的BLASTN模块，设定为默认参数，具有重叠跨度和重叠分数分别设为1和0.125。
如本文中使用的，“重组”包括指代细胞或载体，其通过引入异源核酸序列而进行修饰，或者该细胞来源于上述修饰的细胞。因此，例如，由于有意的人为干预，重组细胞表达不以相同形式存在于天然(非重组)形式的细胞中的基因，或者表达本来异常表达、低表达或完全不表达的天然基因。“重组”和产生“重组”核酸一般组装两个或更多个核酸片段，其中这种组装产生嵌合基因。
在一些优选的实施方案中，产生在至少一个密码子处进行位点饱和诱变的突变DNA序列。在另一优选的实施方案中，对两个或多个密码子进行位点饱和诱变。在进一步的实施方案中，突变DNA序列与野生型序列具有高于约50％、高于约55％、高于约60％、高于约65％、高于约70％、高于约75％、高于约80％、高于约85％、高于约90％、高于约95％或高于约98％的同源性。在备选实施方案中，突变DNA使用任何已知的诱变方法在体内产生，例如辐射、亚硝基胍等。接着分离期望的DNA序列并用于本文提供的方法。
如本文中使用的，术语“扩增”和“基因扩增”指不成比例的复制特定DNA序列的过程，使得所扩增的基因成为高于其初始存在于基因组中的拷贝数而存在。在一些实施方案中，通过在存在药物(例如，可抑制的酶的抑制剂)的条件下生长，来选择细胞，导致编码基因产物的内源基因的扩增，或者导致编码该基因产物的外源(即，输入的)序列的扩增，或者两者的扩增，其中所述基因产物是在存在药物的条件下的生长所必需的。
“扩增”是涉及模板特异性的核酸复制的特殊情况。它与非特异性模板复制(即，是模板依赖性的复制，但并不依赖于特定的模板)相反。模板特异性在此有别于复制的保真性(即，正确的多核苷酸序列的合成)和(核糖或脱氧核糖)核苷酸特异性。模板特异性经常以“靶”特异性来描述。靶序列是这样含义的“靶”，即它们被视为是从其他核酸中挑选出来的。扩增技术主要是出于该挑选而设计的。
如本文中使用的，术语“引物”指当置于引物延伸产物合成的条件下时，能够作为合成起点发挥作用的寡核苷酸，不论是作为纯化的限制性酶消化产物而天然存在的，还是合成产生的，其中所述延伸产物是与诱导的核酸链互补的(即，在存在核苷酸和诱导剂如DNA聚合酶的条件，以及合适的温度和pH)。出于复制的最大效率，引物优选是单链，但可以可选的是双链的。如果是双链的，则首先处理引物，在用于制备延伸产物前分离它的链。优选的，引物是寡聚脱氧核糖核苷酸。引物必需足够长，以在存在诱导剂的条件下引发延伸产物的合成。引物的实际长度将取决于多种因素，包括温度、引物来源和所使用的方法。
如本文中使用的，术语“探针”指能够与另一种目标寡核苷酸杂交的寡核苷酸(即核苷酸的序列)，不论是作为纯化的限制性酶消化产物而天然存在的，还是合成的、重组的或通过PCR扩增而产生的。探针可以是单链的或双链的。探针可用于检测、鉴别和分离特定的基因序列。可以预期，可以用任何“报告分子”标记用于本发明中的任何探针，使得它在任何检测系统中是可检测的，包括但不限于酶(例如，ELISA，以及基于酶的组织化学测定)、荧光、放射性自显影和化学发光系统。本发明并非意在限于任何特定的检测系统或标记。
如本文中使用的，当用于指代聚合酶链式反应时，术语“靶”指用于聚合酶链式反应的引物所结合的核酸区域。因而，“靶”被认为是从其他核酸序列中挑选出来的。“片段”定义为靶序列中的核酸区域。
如本文中使用的，术语“聚合酶链式反应(PCR)”指美国专利号4,683,195、4,683,202和4,965,188(引入本文作为参考)的方法，其包括在不进行克隆或纯化的条件下，用于增加基因组DNA混合物中靶序列片段浓度的方法。该用于扩增靶序列的过程是本领域普遍已知的。
如本文中使用的，术语“扩增试剂”指这样的试剂(脱氧核糖核苷酸三磷酸、缓冲液，等)，所述试剂是除引物、核酸模板和扩增酶以外，扩增所需要的。一般的，将扩增试剂与其他反应组分一起放置，并包含在反应容器(试管、微孔等)中。
如本文中使用的，术语“限制性内切酶”和“限制性酶”指细菌的酶，每种所述的酶在特定的核苷酸序列处或其附近切割双链DNA。
“限制性位点”指被给定的限制性内切酶识别和切割的核苷酸序列，经常是DNA片段插入物的位点。在本发明的某些实施方案中，将限制性位点改造到选择性标志物中，以及DNA构建体的5’和3’末端中。
“同源重组”意指在相同或几乎相同的核苷酸序列的位点，两种DNA分子或成对染色体之间的DNA片段的交换。在优选的实施方案中，染色体整合是同源重组。
如本文中使用的，“氨基酸”指肽或蛋白质序列或其部分。术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”可互换的使用。
如本文中使用的，“目标蛋白”和“目标多肽”指理想的和/或正在进行评估的蛋白质/多肽。在一些实施方案中，目标蛋白在胞内表达，而在其他实施方案中，目标蛋白是分泌的多肽。在特别优选的实施方案中，这些酶包括本发明的丝氨酸蛋白酶。在一些实施方案中，目标蛋白是与信号肽(即，待分泌蛋白质的氨基端延伸)融合的分泌多肽。几乎所有的分泌蛋白质都利用氨基端末端的蛋白质延伸，其在前体蛋白跨膜的靶向和转运中发挥关键作用。这种延伸在膜转运过程中或转运后立即被信号肽酶通过蛋白水解切除。
如果多核苷酸的天然状态或当通过本领域技术人员已知的方法操作时，它可以转录和/或翻译成产生RNA、多肽或其片段，则所述多核苷酸被称为“编码”所述RNA或所述多肽。此类核酸的反义链也被称为编码所述序列。如本领域已知的，DNA可以通过RNA聚合酶转录来产生RNA，而RNA可以通过逆转录酶逆转录来产生DNA。因而，DNA可以编码RNA，反之亦然。
“宿主菌株”或“宿主细胞”指用于表达载体的合适的宿主，所述表达载体包含根据本发明的DNA。
如果酶在细胞中表达的水平高于它在相应的野生型细胞中表达的水平，则所述酶在宿主细胞中是“过表达的”。
术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。本公开文本中全篇均使用与IUPAC-IUB生物化学命名委员会(JCBN)一致的3字母氨基酸代码。可以理解，由于遗传密码的简并性，可以由一种以上的核苷酸序列编码一种多肽。
“前序列”是在信号序列和成熟蛋白酶之间的氨基酸序列，是蛋白酶的分泌所必需的。前序列的切割导致成熟的活性蛋白酶。
术语“信号序列”或“信号肽”指可参与成熟或前体形式的蛋白质分泌的任何核苷酸和/或氨基酸序列。信号序列的该定义是功能性的，意在包括所有上述的氨基酸序列，所述信号序列是由蛋白质基因的N端部分编码的，参与蛋白质分泌的实行。它们通常但不总是与蛋白质的N端部分或前体蛋白质的N端部分结合。信号序列可以是内源性的或外源性的。信号序列可以是与所述蛋白质(例如，蛋白酶)正常相关的，或者可以来自编码另一种分泌蛋白质的基因。一个示例性的外源信号序列包含来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的信号序列的前七个氨基酸残基，所述残基与迟缓芽孢杆菌(ATCC21536)的枯草杆菌蛋白酶的信号序列剩余部分融合。
术语“杂交信号序列”指这样的信号序列，其一部分是从表达宿主获得的，所述部分与待表达的基因的信号序列融合。在一些实施方案中，利用合成序列。
术语“成熟”形式的蛋白质或肽指蛋白质或肽的最终功能形式。
术语蛋白质或肽的“前体”形式指具有与蛋白质的氨基或羧基端有效连接的前序列的蛋白质的成熟形式。前体也可以具有与前序列的氨基端有效连接的“信号”序列。前体还可以具有涉及翻译后活性(例如，从其切除多核苷酸，留下成熟形式的蛋白质或肽)的其他多核苷酸。
“天然存在的酶”指具有与自然界中相同的未修饰氨基酸序列的酶。天然存在的酶包括天然酶，由特定的微生物表达或存在于其中的那些酶。
术语“来自”和“得自”不仅指由或可由目的生物菌株产生的蛋白酶，还指由从这些菌株中分离的DNA序列编码并在含有此类DNA序列的宿主生物中产生的蛋白酶。此外，该术语指由合成和/或cDNA来源的DNA序列编码并具有目的蛋白酶的所述鉴定特征的蛋白酶。例如，“来自芽孢杆菌的蛋白酶”指具有芽孢杆菌天然产生的蛋白水解活性的酶，以及这样的丝氨酸蛋白酶，其与芽孢杆菌来源所产生的酶相似，但使用遗传工程技术由转化有编码该丝氨酸蛋白酶的核酸的非芽孢杆菌生物产生。
该定义范围内的“衍生物”通常保留野生型、天然或亲本(reference)形式中观察到的特征性蛋白水解活性，其保留程度使得该衍生物可用于与所述野生型、天然或亲本形式相似的目的。丝氨酸蛋白酶的功能性衍生物包括天然存在的、合成或重组产生的肽或肽片段，其具有本发明丝氨酸蛋白酶的一般特征。
术语“功能性衍生物”指核酸的衍生物，其具有编码丝氨酸蛋白酶的核酸的功能性特征。编码本发明丝氨酸蛋白酶的核酸的功能性衍生物包括天然存在的、合成或重组产生的核酸或片段，并编码本发明的特征性丝氨酸蛋白酶。编码本发明丝氨酸蛋白酶的野生型核酸包括天然存在的等位基因以及基于本领域已知的遗传密码简并性的同源物。
术语“相同”在两个核酸或多肽序列的情况下指以最高对应性为目的比对后在两序列中相同的残基，这使用以下序列比较或分析算法之一来测量。
术语“最佳比对”指该比对给出最高的百分比同一性分数。
就两个氨基酸、多核苷酸和/或基因序列(适当地)而言，“百分比序列同一性”、“百分比氨基酸序列同一性”、“百分比基因序列同一性”和/或“百分比核酸/多核苷酸序列同一性”指所述序列在最佳比对后两序列中相同残基的百分比。因此，80％氨基酸序列同一性表示在两个最佳比对的多肽序列中80％的氨基酸是相同的。
因而，短语“基本相同”在两个核酸或多肽的情况下指使用程序或算法(例如，BLAST、ALIGN、CLUSTAL)使用标准参数与参考序列比较时包含至少约70％序列同一性、优选至少约75％、优选至少约80％、优选至少约85％、优选至少约90％、优选至少约95％、优选至少约97％、优选至少约98％并优选至少约99％序列同一性的多核苷酸或多肽。两多肽基本相同的一个指标是第一个多肽与第二个多肽具有免疫学交叉反应性。一般地，由于保守性氨基酸替换而不同的多肽具有免疫学交叉反应性。因此，当两多肽仅由于保守性替换而不同时，一个多肽与另一多肽基本相同。两核酸序列基本相同的另一指标是这两个分子在严格条件下(例如，在中至高严格条件下)彼此杂交。
术语“等同的”在本文中指由在中至高严格条件下，能够与具有SEQID NO：1或SEQ ID NO：5所示序列的多核苷酸杂交的多核苷酸所编码的丝氨酸蛋白酶。例如，等同的表示等同的成熟丝氨酸蛋白酶与具有SEQID NO：1或SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的成熟BPN’或GG36丝氨酸蛋白酶包含至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约91％、至少约92％、至少约93％、至少约94％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％和/或至少约99％序列同一性。
术语“分离的”或“纯化的”指从其原始环境(例如，如果是天然存在的，则为其天然环境)从移出的材料。例如，如果材料在特定组合物中以高于天然或野生型生物中的浓度存在，或者与在天然或野生型生物中表达后通常不存在的组分组合，则它是“纯化的“。例如，存在于活动物中的天然多核苷酸或多肽不是分离的，但相同的多核苷酸或多肽在与该天然系统中的一些或所有共存材料分开后则是分离的。这样的多核苷酸可以是载体的一部分，和/或这样的多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分，但仍然是分离的，因为此类载体或组合物不是其天然环境的一部分。例如，在优选的实施方案中，如果核酸或蛋白质在电泳凝胶或印迹中基本给出一条带，则称其是纯化的。
在涉及DNA序列使用时，术语“分离的”指这样的DNA序列，其从其天然遗传环境中移出，因此不含有其他外来的或不想要的编码序列，并且为适于在经遗传改造的蛋白质产生系统中使用的形式。这样的分离的分子是从其天然环境中分离的分子，包括cDNA和基因组克隆。本发明的分离的DNA分子不含有与其通常相关联的其他基因，但可能包含天然存在的5’和3’非翻译区，例如启动子和终止子。相关区域的鉴定对于本领域普通技术人员而言是很明显的(见例如，Dynan和Tijan，Nature316：774-78[1985])。术语“分离的DNA序列”也称为“克隆的DNA序列”。
在涉及蛋白质使用时，术语“分离的”指在其天然环境以外的条件下存在的蛋白质。在一种优选形式中，分离的蛋白质基本不含其他蛋白质，特别是其他同源蛋白质。通过SDS-PAGE测定时，分离的蛋白质的纯度高于约10％，优选高于约20％，甚至更优选高于约30％。本发明的另一些方面包括通过SDS-PAGE测定为高纯化形式(即纯度高于约40％、高于约60％、高于约70％、高于约80％、高于约90％、高于约95％、高于约97％，甚至高于约99％)的蛋白质。
如本文中使用的，术语“组合诱变”指产生起始序列的变体文库的方法。在这些文库中，变体含有选自预定突变组的一个或多个突变。此外，该方法提供了引入不在预定突变组中的随机突变的方法。在一些实施方案中，该方法包括2000年10月26日提交的美国专利申请序列号09/699.250中公开的方法，该申请并入本文作为参考。在备选实施方案中，组合诱变方法包括市售的试剂盒(例如，Multisite(Stratagene))。
如本文中使用的，术语“突变体文库”指基因组大部分相同但包含一个或多个基因的不同同源物的细胞群。这样的文库可用于例如鉴定具有改进性状的基因或操纵子。
如本文中使用的，术语“起始基因”指编码待使用本发明进行改进和/或改变的目的蛋白的目的基因。
如本文中使用的，术语“多重序列比对”(“MSA”)指使用算法(例如，Clustal W)比对的起始基因的多个同源物的序列。
如本文中使用的，术语“共有序列”和“范例序列”指将特定蛋白质或目的序列的所有变体与其进行比较的原型氨基酸序列。该术语还指显示目的DNA序列中最常存在的核苷酸的序列。对基因的每个位置而言，共有序列给出在MSA中该位置上丰度最高的氨基酸。
如本文中使用的，术语“共有突变”指起始基因与共有序列之间的序列差异。共有突变通过将起始基因的序列与从MSA所得共有序列进行比较来鉴定。在一些实施方案中，将共有突变引入起始基因中，以使其与共有序列更为相似。共有突变还包括这样的氨基酸改变：该改变将起始基因中的氨基酸改变成MSA中发现的在该位置上频率高于起始基因中氨基酸的频率的氨基酸。因此，术语共有突变包括将起始基因中的氨基酸替换为比MSA中氨基酸更丰富的氨基酸的所有单个氨基酸改变。
如本文中使用的，术语“初始命中”指通过筛选组合共有诱变文库而鉴定的变体。在优选的实施方案中，初始命中与起始基因相比具有改进的性能特征。
如本文中使用的，术语“改进命中”指通过筛选增强的组合共有诱变文库而鉴定的变体。
如本文中使用的，术语“改进突变”和“性能增强突变”指在引入起始基因时导致性能改善的突变。在一些优选的实施方案中，通过在所述方法的筛选步骤过程中鉴别的测序命中来鉴别这类突变。在多数实施方案中，与未筛选的组合共有诱变文库相比，命中中更频繁出现的突变很可能是改善的突变。
如本文中使用的，术语“增强的组合共有诱变文库”指基于之前轮次的CCM诱变和筛选的筛选和/或测序结果而设计和构建的CCM文库。在一些实施方案中，增强的CCM文库是基于之前轮次的CCM所得初始命中的序列。在另一些实施方案中，设计增强的CCM以有利于在之前轮次的诱变和筛选中的初始命中中更常见的突变。在一些优选的实施方案中，这通过省略编码性能降低突变的引物来实现，或者通过相对于之前的CCM文库中所使用其他引物提高编码性能增强突变的引物的浓度来实现。
如本文中使用的，术语“性能降低突变”指在组合共有诱变文库中的突变，其在筛选所得命中中的频率与未筛选的组合共有诱变文库相比更低。在优选的实施方案中，筛选方法除去和/或降低含有“性能降低突变”的变体的丰度。
如本文中使用的，术语“功能性测定”指提供蛋白质活性的指标的测定。在特别优选的实施方案中，该术语指分析蛋白质以其通常的能力发挥功能的测定系统。例如，对于酶的情况，功能性测定包括测定该酶在催化反应方面的有效性。
如本文中使用的，术语“靶特性”指待改变的起始基因的特性。本发明并不意在仅限于任何特定的靶特性。然而，在一些优选的实施方案中，靶特性为基因产物的稳定性(例如，对变性、蛋白水解或其他降解因素的抗性)，而在另一些实施方案中，改变了在产生宿主中的产生水平。事实上，起始基因的任何特性均可用于本发明。
如本文中使用的，在核酸的情况下，术语“特性”或其语法等同语指核酸的任何可以选择或检测的特性或属性。这些特性包括但不限于影响与多肽结合的特性、赋予包含特定核酸的细胞的特性、影响基因转录的特性(如启动子强度、启动子识别、启动子调节、增强子功能)、影响RNA加工的特性(例如，RNA剪接、RNA稳定性、RNA构象和转录后修饰)、影响翻译的特性(例如，水平、调节、mRNA与核糖体蛋白的结合、翻译后修饰)。例如，可以改变核酸的转录因子、聚合酶、调节因子等的结合位点，以产生期望的特征或鉴定不期望的特征。
如本文中使用的，在多肽的情况下，术语“特性”或其语法等同语指多肽的任何可选择或检测的特征或属性。这些特性包括但不限于氧化稳定性、底物特异性、催化活性、热稳定性、碱稳定性、pH活性谱、对蛋白水解降解的抗性、KM、kcat、kcat/kM比、蛋白质折叠、诱导免疫应答、结合配体的能力、结合受体的能力、分泌能力、展示于细胞表面的能力、寡聚化能力、信号能力、刺激细胞增殖的能力、抑制细胞增殖的能力、诱导凋亡的能力、通过磷酸化或糖基化进行修饰的能力，和/或治疗疾病的能力等。
如本文中使用的，术语“筛选”具有本领域的通常含义，一般为多步骤过程。在第一步中，提供突变核酸或其变体多肽。在第二步中，测定该突变核酸或变体多肽的特性。在第三步中，将所测特性与相应的前体核酸的特性、相应天然多肽的特性或产生该突变核酸的起始材料(例如，初始序列)的特性进行比较。
对于本领域技术人员而言很明显的是，用于获得具有改变特性的核酸或蛋白质的筛选方法取决于起始材料的特性，将通过产生该突变核酸来促进其修饰。因此，本领域技术人员会理解，本发明不受限于任何待筛选的具体特性，以下特性描述仅列出了说明性的实例。用于筛选任何特定特性的方法已在本领域中有一般性描述。例如，可以在突变前后测量结合、pH、特异性等，其中的变化表明产生了改变。优选地，以高通量方式进行筛选，包括同时筛选多个样品，包括但不限于使用芯片、噬菌体展示和多种底物和/或指示剂进行的测定。
在一些实施方案中，本文使用的筛选涵盖了选择步骤，其中从变体群中富集目的变体。这些实施方案的实例包括选择赋予宿主生物生长优势的变体，以及噬菌体展示或任何其他展示方法，其中变体可基于其结合或催化特性而从变体群中被捕获。在优选的实施方案中，使变体文库暴露于胁迫(例如，热、蛋白酶、变性等)，其后在筛选中鉴定仍完整的变体或通过选择来富集所述变体。该术语旨在涵盖任何合适的选择方法。事实上，本发明并非意在限于任何特定的筛选方法。
如本文中使用的，术语“靶向随机化”指产生其中一个或多个位置已被随机化的复数序列的方法。在一些实施方案中，随机化是完全随机化(即，所有的四种碱基A、T、G和C都可出现在随机化位置)。在备选实施方案中，核苷酸的随机化仅限于这四种核苷酸的一个亚组。靶向随机化可应用于序列的一个或多个密码子，编码一种或多种目的蛋白。表达时，所得的文库产生蛋白质群，其中一个或多个氨基酸位置可含有所有20种氨基酸或氨基酸亚组的混合物，这是由随机化密码子的随机化方案决定。在一些实施方案中，靶向随机化所得群体中的个体成员由于密码子的靶向或随机插入或缺失而存在氨基酸数目的差异。在另一些实施方案中，所产生的蛋白质群中包括合成的氨基酸。在一些优选的实施方案中，靶向随机化所得群体中的多数成员与起始基因相比与共有序列显示更高的序列同源性。在一些实施方案中，所述序列编码一种或多种目的蛋白。在备选实施方案中，所述蛋白质具有不同的生物功能。在一些优选的实施方案中，引入序列包含至少一个选择性标志物。该序列可以编码一种或多种目的蛋白。它可以具有其他的生物学功能。在许多情况下，引入序列可包括选择性标志物，例如产生对抗生素抗性的基因。
术语“修饰序列”和“修饰基因”在本文中可互换使用，指包含天然核酸序列的缺失、插入或中断的序列。在一些优选的实施方案中，修饰序列的表达产物是截短的蛋白质(例如，如果修饰是序列的缺失或中断的话)。在一些特别优选的实施方案中，所述截短的蛋白质保留生物活性。在备选实施方案中，修饰序列的表达产物是延长的蛋白质(例如，包含核酸序列中的插入的修饰)。在一些实施方案中，插入导致截短的蛋白质(例如，当插入导致形成终止密码子时)。因此，插入可产生截短蛋白或延长的蛋白作为表达产物。
如本文中使用的，术语“突变序列”和“突变基因”可互换使用，指在宿主细胞的野生型序列的至少一个密码子处含有改变的序列。突变序列的表达产物是相对于野生型含有改变的氨基酸序列的蛋白质。表达产物可具有改变的功能能力(例如增强的酶活性)。
术语“诱变引物”或“诱变寡核苷酸”(在本文中可互换使用)意在表示对应于模板序列的一部分并能与其杂交的寡核苷酸组合物。就诱变引物而言，该引物可以不与模板核酸精确匹配，引物中的错配用于将期望的突变引入核酸文库中。如本文中使用的，“非诱变引物”或“非诱变寡核苷酸”指与模板核酸精确匹配的寡核苷酸组合物。在本发明的一个实施方案中，仅使用诱变引物。在本发明的另一优选实施方案中，将引物设计成使得对于至少一个包含诱变引物的区域而言，寡核苷酸混合物中还包括了非诱变引物。通过加入诱变引物和对应于至少一个诱变引物的非诱变引物的混合物，有可能产生存在多种组合诱变模式的核酸文库。例如，如果期望突变核酸文库中的一些成员在某些位置保留其前体序列，而其他成员在这些位点处是突变的，则非诱变引物提供了在核酸文库中对于给定残基获得特定水平的非突变体成员的能力。本发明的方法利用诱变及非诱变寡核苷酸，它们一般长度为约10至50个碱基，更优选长度为约15至45个碱基。然而，可能有必要使用小于约10个碱基或大于约50个碱基的引物来获得期望的诱变结果。对于相应的诱变及非诱变引物而言，相应的寡核苷酸不一定长度相同，而是在对应于待加入的突变的区域中有重叠。可以根据本发明以预定的比例加入引物。例如，如果期望所得的文库含有显著水平的某特定突变以及相同或不同位点处较少量的不同突变，则通过调节所添加引物的量，有可能产生期望的偏好文库。或者，通过加入更少或更多量的非诱变引物，有可能调整突变核酸文库中产生相应突变的频率。
如本文中使用的，术语“连续突变”指存在于同一寡核苷酸引物中的突变。例如，连续突变可彼此毗邻或接近，然而，它们将通过同一引物引入所得的突变体模板核酸中。
如本文中使用的，术语“不连续突变”指存在于不同寡核苷酸引物中的突变。例如，不连续突变将通过分别制备的寡核苷酸引物引入所得的突变体模板核酸中。
术语“野生型序列”或“野生型基因”在本文中可互换使用，指宿主细胞中天然或天然存在的序列。在一些实施方案中，野生型序列指作为蛋白质改造计划的起点的目的序列。野生型序列可编码同源或异源的蛋白质。同源蛋白是宿主细胞无需干预即产生的蛋白质。异源蛋白是宿主细胞没有干预将不产生的蛋白质。
如本文中使用的，术语“抗体”指免疫球蛋白。抗体包括但不限于直接得自期望产生抗体的任何物种的免疫球蛋白。此外，本发明涵盖了修饰的抗体。该术语还指保留与完整抗体所结合表位结合的能力的抗体片段，并包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、抗独特型(抗ID)抗体。抗体片段包括但不限于互补性决定区(CDR)、单链片段可变区(scFv)、重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)。多克隆抗体和单克隆抗体也包括在本发明之内。优选地，所述抗体为单克隆抗体。
如本文中使用的，短语“底物特异性的改变”指酶的底物特异性的变化。在一些实施方案中，底物特异性的变化定义为由于酶的突变或反应条件的改变而导致的，针对特定的底物的kcat和/或Km的变化。通过比较使用不同底物时表现出的催化效率来确定酶的底物特异性。这类确定可特别的用于评估突变酶的效率，因其一般预期产生针对目的底物，表现出更大比例的kcat/Km的变体酶。然而，本发明并非意在限于任何特定的底物组合物或底物特异性。
如本文中使用的，“表面特性”用于指代蛋白质表面表现出来的静电电荷以及特性，例如疏水性和亲水性。
如本文中使用的，短语“独立的选自......”意指选自所指代的马库什组的所述部分或元素可以与下列例子所示的元素相同、不同或者是其任意的混合物：
具有3个R基团的分子，其中每个R基团独立的选自基团A、B和C。在此，R基团可以是AAA、BBB、CCC、AAB、AAC、BBA、BBC、CCA、CCB或ABC。
指代化学组合物时，本文使用的术语“取代”意指应用所述术语的有机组合物或基团是：
(a)通过消除至少一个元素或基团而产生不饱和的；或
(b)化合物或基团中的至少一个氢原子被含有一个或多个(i)碳、(ii)氧、(iii)硫、(iv)氮或(v)卤素原子的部分替换；或
(c)(a)和(b)。
只含碳和氢原子的、可以如上文(b)中所述替换氢的部分是碳氢化合物部分，包括但不限于烷基、烯基、炔基、亚烃基、环烷基、苯基、烷基苯基、萘基、蒽基、菲基、氟基、类固醇基团，及这类基团相互之间以及与多价碳氢化合物基团的组合，例如亚烃基、亚烷基和alkylidyne基团。可如上文(b)中所述替换氢的含有氧原子的部分包括但不限于含有羟基、酰基或酮基、醚、环氧、羧基和酯的基团。可如上文(b)中所述替换氢的含有硫原子的部分包括但不限于含硫的酸和酸酯基团、硫醚基团、巯基基团和硫酮基团。可如上文(b)中所述替换氢的含有氮原子的部分包括但不限于氨基基团、硝基基团、偶氮基团、铵基基团、酰胺基团、叠氮基团、异氰酸基团、氰酸基团和腈基基团。可如上文(b)中所述替换氢的含有卤素原子的部分包括但不限于氯、溴、氟、碘基团，和任意前述部分，其中氢或悬挂的(pendant)烷基被卤素基团取代，形成稳定的取代部分。
可以理解，任意上述部分(b)(i)至(b)(v)都可以彼此取代，以单价取代或通过丢失氢的多价取代的形式，形成另一种单价部分，所述部分可以替换有机化合物或基团中的氢。
术语“氧化稳定的”指本发明的蛋白酶，其在蛋白水解、水解、清洁或其他本发明过程中常见条件(如暴露于或接触漂白剂或氧化剂)下保持一段时间后保留特定的酶活性量。在一些实施方案中，蛋白酶在接触漂白剂或氧化剂一段时间(例如，至少约1分钟、约3分钟、约5分钟、约8分钟、约12分钟、约16分钟、约20分钟，等)后保留至少约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约92％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的蛋白水解活性。在一些实施方案中，如实施例所述测定稳定性。
术语“螯合剂稳定的”指本发明的蛋白酶，其在蛋白水解、水解、清洁或其他本发明过程中常见条件(如，暴露于或接触螯合剂)下保持给定的一段时间后保留指定的酶活性量。在一些实施方案中，蛋白酶在接触螯合剂给定的一段时间(例如，至少约10分钟、约20分钟、约40分钟、约60分钟、约100分钟等)后保留至少约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约92％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的蛋白水解活性。在一些实施方案，如实施例所述测定螯合剂稳定性。
术语“热稳定的”和“热稳定”指本发明的蛋白酶，其在蛋白水解、水解、清洁或其他本发明过程中常见条件(如暴露于改变的温度)下暴露于指定温度一段时间后，保留指定的酶活性量。改变的温度包括升高或降低的温度。在一些实施方案中，蛋白酶在暴露于改变的温度一段时间(例如，至少约60分钟、约120分钟、约180分钟、约240分钟、约300分钟，等)后保留至少约50％、约60％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约92％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的蛋白水解活性。在一些实施方案中，如实施例所述测定热稳定性。
术语“增强的稳定性”在氧化、螯合剂、热和/或pH稳定性蛋白酶的情况中，指与其他丝氨酸蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶)和/或野生型酶相比，随着时间的流逝而保留的蛋白水解活性更高。
术语“降低的稳定性”在氧化、螯合剂、热和/或pH稳定性蛋白酶的情况中，指与其他丝氨酸蛋白酶(例如，枯草杆菌蛋白酶)和/或野生型酶相比，随着时间的流逝而保留的蛋白水解活性更低。
术语“清洁活性”指蛋白酶在蛋白水解、水解、清洁或本发明的其他过程中常见的条件下获得的清洁性能。在一些实施方案中，通过应用多种涉及酶敏感性污渍(例如，草、血、乳或卵蛋白质)的清洁测定来确定清洁性能，通过将污渍置于标准洗涤条件后进行多种层析、分光光度或其他定量方法进行测定。示例性测定法包括但不限于WO 99/34011和美国专利6,605,458(均并入本文作为参考)中所述的测定，以及实施例中包括的那些方法。
术语蛋白酶的“清洁有效量”指在特定的清洁组合物中，实现期望的酶活性水平的上述蛋白酶的量。这样的有效量易于为本领域技术人员所确定，并取决于许多因素，例如所使用的具体蛋白酶、清洁应用、清洁组合物的具体组成，以及需要液体组合物还是干燥(例如，颗粒、条形)组合物等。
本文使用的术语“清洁附加材料”意指为理想的清洁组合物的具体类型和产品形式(例如，液体、颗粒、粉末、条形、糊状、喷雾、片剂、凝胶；或泡沫组合物)而选择的任何液体、固体或气体材料，所述材料还优选地与该组合物中所使用的蛋白酶相容。在一些实施方案中，颗粒组合物为“致密”形式，而在另一些实施方案中，液体组合物为“浓缩”形式。
术语“增强的性能”在清洁活性的情况中指对某些酶敏感性污渍，例如卵、乳、草或血，增加的或更高的清洁活性，通过标准洗涤循环和/或多个洗涤循环后的常用评估来确定。
术语“减弱的性能”在清洁活性的情况中指对某些酶敏感性污渍，例如卵、乳、草或血，减少的或更低的清洁活性，通过标准洗涤循环后的常用评估来确定。
术语“相当的性能”在清洁活性的情况中指比较的或参照蛋白酶(例如，市售的蛋白酶)的清洁活性的至少约60％，至少约70％，至少约80％，至少约90％，至少约95％，所述蛋白酶包括但不限于OPTIMASETM蛋白酶(Genencor)、PURAFECTTM蛋白酶产品(Genencor)、SAVINASETM蛋白酶(Novozymes)、BPN’变体(见例如，美国专利申请号Re34,606)、RELASETM、DURAZYMETM、EVERLASETM、KANNASETM蛋白酶(Novozymes)、MAXACALTM、MAXAPEMTM、PROPERASETM蛋白酶(Genencor；还参见美国专利申请号Re34,606，和美国专利号5,700,676、5,955,340、6,312,936和6,482,628)，以及迟缓芽孢杆菌变体蛋白酶产品(例如，WO 92/21760、WO 95/23221和/或WO 97/07770中所述)。可通过将本发明蛋白酶与上述枯草杆菌蛋白酶在多种清洁测定中进行比较，来确定清洁性能，所述清洁测定涉及酶敏感性污渍(如草、血或乳)，在标准洗涤循环条件后通过分光光度法或分析性方法来测定。
如本文使用的，“清洁组合物”和“清洁配方”指可用于从待清洁的物品上去除不理想的化合物的组合物，所述物品例如织物、餐具、隐形眼镜、其他固体物质、头发(香波)、皮肤(香皂和乳霜)、牙齿(漱口水、牙膏)等。术语涵盖了为理想的清洁组合物的具体类型和产品形式(例如，液体、凝胶、颗粒或喷雾组合物)而选择的任何材料/化合物，只要所述组合物与组合物中使用的蛋白酶和其他的酶相容。通过考虑待清洁的表面、物品或织物，以及在使用过程中用于清洁条件的组合物的理想形式，可以方便的确定清洁组合物材料的具体选择。
该术语进一步指适合清洁、漂白、消毒和/或灭菌任何对象和/或表面的任何组合物。术语意在包括但不限于去垢剂组合物(例如，液体和/或固体的衣物去垢剂和精细织物去垢剂；硬表面清洁配方、如用于玻璃、木头、陶瓷和金属柜台顶部和窗户；地毯清洁剂；烤箱清洁剂；织物清新剂(freshener)；织物软化剂；和织物和衣物去渍剂(pre-spotter)，以及餐具去垢剂)。
实际上，除非另外指出，本文使用的术语“清洁组合物”包括颗粒或粉末状形式的全用途或重垢型洗涤剂，特别是清洁去垢剂；液体、凝胶或糊状形式的全用途洗涤剂，特别是所谓的重垢型液体(HDL)类型；液体的精细织物去垢剂；手洗餐具洗涤剂或轻垢型餐具洗涤剂，特别是高泡类型的；机洗餐具洗涤剂，包括用于家务和机构用途的各种片剂、颗粒、液体和清洗辅助型；液体清洁和消毒剂，包括抗菌的手洗类型、清洁条、漱口水、牙齿清洁剂、车用香波、地毯香波、浴室清洁剂；洗发香波和/或用于人和其他动物的毛发洗剂；沐浴凝胶和泡沫浴液和金属清洁剂；以及清洁助剂，如漂白添加剂和“去污棒”或预处理类型。
本文使用的“衣物去垢剂”包括手洗和机洗洗衣去垢剂组合物，包括洗衣添加组合物和适用于浸泡和/或预处理污损织物(例如，衣物、亚麻和其他纺织材料)的组合物。
本文使用的“非衣物去垢剂”包括非纺织(即织物)表面清洁组合物，包括但不限于洗碗去垢剂组合物、口腔清洁组合物、牙齿清洁组合物和个人清洁组合物。
本文使用的术语“去垢剂组合物”和“去垢剂配方”用于指代预期用于洗涤基质中进行污染对象清洁的混合物。在优选的实施方案中，术语用于指代用于清洁餐具、刀叉等的去垢剂(例如，“餐具去垢剂”或“洗碗去垢剂”)。本发明并非意在限于任何特定的去垢剂配方或组合物。实际上，术语意在除含有至少一种本发明的蛋白酶的去垢剂外，涵盖了含有表面活性剂、转移酶、水解酶、氧化还原酶、增洁剂(builder)、漂白剂、漂白活化剂、上蓝剂和荧光染料、结块抑制剂、掩蔽剂、酶激活剂、抗氧化剂和助溶剂的去垢剂。
本文使用的“洗碗组合物”指用于清洁餐具(包括刀叉)的所有类型的组合物，包括但不限于颗粒的和液体的形式。在一些实施方案中，洗碗组合物是可用于自动化洗碗机的“自动化洗碗”组合物。本发明并非意在限于任何特定类型或餐具的组合物。实际上，本发明可用于清洁任意材料的餐具(例如，餐具，包括但不限于盘子、杯子、玻璃杯、碗等)和刀叉(例如，用具(utensil)，包括但不限于勺子、刀、叉子、上菜用具(servingutensil)等)，所述材料包括但不限于陶瓷、塑料、金属、瓷、玻璃、丙烯酸树脂等。本文使用的术语“餐具”指代碗碟和刀叉。
本文使用的术语“漂白”指对材料(例如，织物、衣物、纸浆等)或表面处理足够长的时间，并且在适当的pH和温度条件下产生材料的增亮(即，增白)和/或清洁。适合漂白的化学品的实例包括但不限于ClO2、H2O2、过氧酸、NO2，等。
本文使用的变体蛋白酶的“洗涤性能”指变体蛋白酶对洗涤的贡献，即为没有向组合物中添加变体蛋白酶的去垢剂提供额外的清洁性能。洗涤性能是在相关的洗涤条件下进行比较的。
本文使用的术语“相关的洗涤条件”表示在餐具或洗衣去垢剂市场分类的家庭实际使用中的条件，特别是洗涤温度、时间、洗涤机械、泡沫浓度(sud concentration)、去垢剂类型和水硬度。
术语“改善的洗涤性能”用于表示相对于相应的野生型或起始亲本蛋白酶，在相关的洗涤条件下的去渍中获得的更好的最终结果，或者基于重量，获得相同的最终结果需要较少的变体蛋白酶。
本文使用的术语“消毒”指从表面去除污染物，以及抑制或杀死物品表面的微生物。本发明并非意在限于任何特定的表面、物品或待去除的污染物或微生物。
本文清洁组合物的“致密”形式最好通过密度来反映，对组合物而言，通过无机填充盐的量来反映。无机填充盐是粉末形式去垢剂组合物的常规成分。在常规去垢剂组合物中，填充盐以显著的量存在，一般按总组合物的重量计，占约17％至约35％。相比，在致密组合物中，存在的填充盐的量不超过总组合物的约15％。在一些实施方案中，按组合物的重量计，填充盐存在的量不超过约10％，或更优选不超过约5％。在一些实施方案中，无机填充盐选自碱金属和碱土金属的硫酸盐和盐酸盐。在一些实施方案中，优选的填充盐是硫酸钠。
清洁组合物
除非另外提出，本文提供的所有组分或组合物水平都参照所述组分或组合物的活性水平来制备，并且排除可能存在于市售来源中的杂质，例如残余的溶剂或副产物。酶组分重量是基于总活性蛋白的。除非另外指出，按重量计算所有的百分比和比例。除非另外指出，基于总组合物计算所有的百分比和比例。在示例性的去垢剂组合物中，按总组合物的重量计，通过纯酶表示酶水平，并且除非另外说明，按总组合物的重量表示去垢剂成分。
如本文所示，在一些实施方案中，本发明的清洁组合物进一步包含附加材料，包括但不限于表面活性剂、增洁剂、漂白剂、漂白活化剂、漂白催化剂、其他的酶、酶稳定体系、螯合剂、光学增亮剂、污垢释放聚合物、染料转移剂、分散剂、抑泡剂、染料、香料、着色剂、填充盐、助水溶物(hydrotrope)、光活化剂、荧光剂、织物软化剂、可水解的表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗缩水剂、抗皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、色粒(colorspeckle)、银护理剂(silvercare)、抗晦暗剂(anti-tarnish)和/或抗腐蚀剂、碱度源、助溶剂、载体、加工助剂、色素和pH控制剂(见例如，美国专利号6,610,642、6,605,458、5,705,464、5,710,115、5,698,504、5,695,679、5,686,014和5,646,101，均通过引用并入本文中)。下文详细示例了具体的清洁组合物材料的实施方案。在清洁组合物中的清洁附加材料与本发明的变体蛋白酶不相容的实施方案中，使用合适的方法保持清洁附加材料和蛋白酶分离(即，彼此不接触)直到两种组分的结合恰当之时。此类分离方法包括本领域已知的任何合适的方法(例如，软胶囊(gelcap)、封装、片剂、物理分离等)。
本发明的清洁组合物有利的用于例如洗衣应用、硬表面清洁、洗碗应用，以及化妆应用如假牙、牙齿、头发和皮肤。此外，由于在低温溶液中效率增加的独特优势，本发明的酶理想地适用于洗衣应用。此外，本发明的酶可用于颗粒的和液体的组合物中。
本发明的变体蛋白酶还可用于清洁性添加产物中。在一些实施方案中，可使用低温溶液清洁应用。在一些实施方案中，本发明提供了包括至少一种本发明的酶的清洁性添加产物，所述产物理想地适合包括在需要额外的漂白效果的洗涤过程中。此类例子包括但不限于低温溶液清洁应用。在一些实施方案中，添加产物的最简单的形式是一种或多种蛋白酶。在一些实施方案中，添加产物是包装成剂量形式，用于向清洁过程添加。在一些实施方案中，添加产物是包装成剂量形式，用于向清洁过程添加，在所述过程中使用了过氧化物源，并且增加漂白效果是理想的。本发明可使用任何合适的单剂量形式，包括但不限于丸剂、片剂、软胶囊或其他的单剂量单位，如预测量的粉末或液体。在一些实施方案中，包括了填充剂或载体材料，以增加此类组合物的体积。此类填充剂或载体材料包括但不限于硫酸、碳酸和硅酸的各种盐类，以及云母、粘土等。用于液体组合物的合适的填充剂或载体材料包括但不限于水或低分子量的伯醇和仲醇，包括多元醇和二醇。此类醇的实例包括但不限于甲醇、乙醇、丙醇和异丙醇。在一些实施方案中，组合物含有从约5％至约90％的此类材料。酸性填充剂可用于降低pH。可选的，在一些实施方案中，清洁性添加物包括辅助成分，如下文详述。
本发明的清洁组合物和清洁添加物需要有效量的至少一种本文提供的蛋白酶变体，单独的或与其他蛋白酶和/或额外的酶组合。所需的酶水平是通过添加一种或多种本发明的蛋白酶变体实现的。本发明一般包含至少约0.0001重量百分比，从约0.0001至约10，从约0.001至约1，或者甚至从约0.01至约0.1重量百分比的至少一种本发明的变体蛋白酶。
本文的清洁组合物一般配制成在用于含水清洁操作的过程中，使得洗涤水将具有从约5.0至约11.5，或者甚至从约7.5至约10.5的pH。液体产物配方一般配制成具有从约3.0至约9.0，或者甚至从约3至约5的pH。颗粒状的洗衣产物一般配制成具有从约9至约11的pH。用于控制pH在推荐使用水平的技术包括使用缓冲液、碱、酸等，且是本领域技术人员普遍已知的。
合适的低pH清洁组合物一般具有从约3至约5的净pH，且一般不含在此类pH环境下水解的表面活性剂。此类表面活性剂包括烷基磺酸钠表面活性剂，其包含至少一种环氧乙烷部分，或者甚至从约1至约16摩尔的环氧乙烷。此类清洁组合物一般包含有效量的pH修饰剂，如氢氧化钠、单乙醇胺或盐酸，以提供此类清洁组合物具有从约3至约5的净pH。此类组合物一般包含至少一种酸稳定的酶。在一些实施方案中，组合物是液体的，而在其他的实施方案中，是固体的。一般以净pH测量此类液体组合物的pH。以所述组合物的10％固体溶液来测量此类固体组合物的pH，其中溶剂是蒸馏水。在这类实施方案中，除非另外指出，所有的pH测量都在20℃下进行。
在一些实施方案中，当在颗粒状的组合物或液体中使用变体蛋白酶时，所述变体蛋白酶理想地是封装的颗粒形式，以在储存过程中保护变体蛋白酶离开颗粒组合物的其他组分。此外，封装也是控制变体蛋白酶在清洁过程中的可利用度的手段。在一些实施方案中，封装增强了变体蛋白酶和/或其他酶的性能。鉴于这一点，用本领域已知的任何合适的封装材料将本发明的变体蛋白酶封装。在一些实施方案中，封装材料一般封装了至少一部分本发明的变体蛋白酶催化剂。一般的，封装材料是可溶于水的和/或可分散于水中的。在一些实施方案中，封装材料具有0℃或更高的玻璃态转变温度(Tg)。玻璃态转变温度更详细的描述在WO 97/11151中。封装材料一般选自糖类、天然的或合成的树胶、几丁质、壳聚糖、纤维素和纤维素衍生物、硅酸盐、磷酸盐、硼酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇、石蜡，及其组合物。当封装材料是糖类时，它一般选自单糖、寡糖、多糖，及其组合物。在一些典型的实施方案中，封装材料是淀粉(见例如，EP 0 922 499；US 4,977,252；US 5,354,559和US 5,935,826)。在一些实施方案中，封装材料是由塑料制造的微球，如热塑性塑料、丙烯腈、甲基丙烯腈、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈及其混合物；可使用的市售微球包括但不限于由(Stockviksverken，瑞士)供应的，和PM 6545、PM 6550、PM 7220、PM 7228、和(PQ Corp.、Valley Forge、PA)。
如本文所述，本发明的变体蛋白酶可特别用于清洁工业，包括但不限于洗衣和洗碗去垢剂。这类应用将酶置于各种环境压力下。由于在各种条件下的稳定性，本发明的变体蛋白酶提供了超过许多目前使用的酶的优点。
实际上，参与洗涤的蛋白酶暴露于多种洗涤条件下，包括变化的去垢剂配方、洗涤水体积、洗涤水温度和洗涤时间长度。此外，用于不同的地理区域的去垢剂配方在洗涤水中存在的相关组分具有不同的浓度。例如，欧洲去垢剂一般在洗涤水中具有约4500-5000ppm的去垢剂组分，而日本去垢剂一般在洗涤水中具有约667ppm的去垢剂组分。在北美，特别是在美国，去垢剂一般一般在洗涤水中具有约975ppm的去垢剂组分。
低去垢剂浓度系统包括去垢剂，其中洗涤水中存在低于约800ppm的去垢剂组分。日本去垢剂通常被认为是低去垢剂浓度系统，因为它们通常在洗涤水中存在约667ppm的去垢剂组分。
中去垢剂浓度系统包括去垢剂，其中洗涤水中存在在约800ppm至约2000ppm之间的去垢剂组分。北美去垢剂通常被认为是低去垢剂浓度系统，因为它们通常在洗涤水中存在约975ppm的去垢剂组分。巴西通常在洗涤水中存在约1500ppm的去垢剂组分。
高去垢剂浓度系统包括去垢剂，其中洗涤水中存在高于约2000ppm的去垢剂组分。欧洲去垢剂通常被认为是高去垢剂浓度系统，因为它们通常在洗涤水中含有约4500-5000ppm的去垢剂组分。
拉丁美洲去垢剂一般是高泡磷酸增洁剂去垢剂，拉丁美洲使用的去垢剂范围可落入中和高去垢剂浓度中，因为它们在洗涤水中含有1500ppm至6000ppm的去垢剂组分。如上所述，巴西一般在洗涤水中存在约1500ppm的去垢剂组分。然而，其他高泡磷酸增洁剂去垢剂地区(不仅限于其他拉丁美洲国家)可能具有在洗涤水中含有高达约6000ppm去垢剂组分的高去垢剂浓度系统。
鉴于以上内容，很显然，典型洗涤溶液中的去垢剂组合物浓度在世界范围内从低于约800ppm去垢剂组合物(“低去垢剂浓度地区”，例如日本的约667ppm)，到约800ppm至约2000ppm(“中去垢剂浓度地区”，例如美国的约975ppm和巴西的约1500ppm)到高于约2000ppm(“高去垢剂浓度地区”，例如欧洲的约4500ppm至约5000ppm，以及高泡磷酸增洁剂地区的约6000ppm)不等。
根据经验确定典型洗涤溶液的浓度。例如，在美国，典型洗衣机容纳约64.4L体积的洗涤溶液。因此，为了获得洗涤溶液中约975ppm的去垢剂浓度，必须向约64.4L洗涤溶液中加入约62.79g去垢剂组合物。该量是消费者使用随去垢剂所提供的量杯衡量的加入洗涤水中的典型量。
作为进一步的实例，不同地区使用不同的洗涤温度。日本的洗涤水的温度一般低于欧洲所使用的。例如，北美和日本的洗涤水温度一般在约10℃和约30℃之间(例如，约20℃)，而欧洲洗涤水的温度一般在约30℃和约60℃之间(例如，约40℃)。然而，为了节省能源，许多消费者转为使用冷水洗涤。此外，在其他一些地区，一般使用冷水进行洗衣和洗碗应用。在一些实施方案中，本发明的“冷水洗涤”在从约10℃至约40℃，或者从约20℃至约30℃，或者从约15℃至约25℃的温度下，以及落入约15℃至约35℃和落入10℃至40℃的范围内的所有其他组合，进行洗涤。
作为进一步的实例，不同的地区一般具有不同的水硬度。水硬度一般通过每加仑混合的Ca2+/Mg2+的格令(grain)数来描述。硬度是水中钙(Ca2+)和镁(Mg2+)量的度量。美国的多数水是硬的，但硬度不同。中等硬度水(60-120ppm)至硬水(121-181ppm)具有60至181ppm(ppm转换为格令/美制加仑为：ppm数除以17.1等于格令/加仑)的硬度矿物质(见表13-1)。
| 水 | 格令/如仑 | 百万分之 |
| 软 | 小于1.0 | 小于17 |
| 轻度硬 | 1.0至3.5 | 17至60 |
| 中度硬 | 3.5至7.0 | 60至120 |
| 硬 | 7.0至10.5 | 120至180 |
| 非常硬 | 大于10.5 | 大于180 |
欧洲的水硬度一般高于约10.5(例如，约10.5至约20.0)格令/加仑混合Ca2+/Mg2+(例如，约15格令/加仑混合的Ca2+/Mg2+)。北美的水硬度一般高于日本的水硬度，但低于欧洲的水硬度。例如，北美水的硬度可为约3至约10格令，约3至约8格令或约6格令。日本的水硬度一般低于北美的水硬度，通常低于约4，例如，约3格令/加仑混合的Ca2+/Mg2+。
因此，在一些实施方案中，本发明提供在至少一组洗涤条件(例如，水温、水硬度和/或去垢剂浓度)下，显示意想不到的洗涤性能的变体蛋白酶。在一些实施方案中，本发明的变体蛋白酶在洗涤性能方面与枯草杆菌蛋白酶相当。在一些实施方案中，本发明的变体蛋白酶显示与目前市售的枯草杆菌蛋白酶相比增强的洗涤性能。因此，在本发明一些优选的实施方案中，本文所提供的变体蛋白酶在各种条件下显示出增强的氧化稳定性、增强的热稳定性、增强的清洁能力，和/或增强的螯合剂稳定性。此外，本发明的变体蛋白酶可用于不包括去垢剂的清洁组合物，再次是单独的或与增洁剂和稳定剂组合。
在本发明的一些实施方案中，所述清洁组合物包含至少一种本发明的变体蛋白酶，其水平按组合物的重量计是从约0.00001％至约10％，以及按组合物的重量计的、包含清洁附加材料的余量(例如，约99.999％至约90.0％)。在本发明的其他方面中，本发明的清洁组合物包含按组合物的重量计约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％水平的至少一种变体蛋白酶，以及包含清洁附加材料的清洁组合物余量(例如，约99.9999％至约90.0％，约99.999％至约98％，约99.995％至约99.5％，按重量计)。
在一些实施方案中，本发明的清洁组合物包含一种或多种额外的去垢剂酶，其提供清洁性能和/或织物护理和/或洗碗的益处。合适的酶的例子包括但不限于半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、几丁质酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角质酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂加氧酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β-葡糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和淀粉酶，或其混合物。在一些实施方案中，使用酶的组合物，包括常规可获得的酶，如使用蛋白酶、脂肪酶、几丁质酶和/或纤维素酶与淀粉酶的结合。
除本文提供的蛋白酶变体外，本发明可使用任何其他合适的蛋白酶。合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的蛋白酶。在特别优选的实施方案中，使用微生物蛋白酶。在一些实施方案中，包括以化学或遗传方式修饰的突变体。在一些实施方案中，所述蛋白酶为丝氨酸蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例包括枯草杆菌蛋白酶，特别是来自芽孢杆菌属的那些(例如，枯草杆菌蛋白酶、lentus、amyloliquefaciens、枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和168)。其他实例包括以下专利中描述的突变蛋白酶：美国专利号RE 34,606、5,955,340、5,700,676、6,312,936和6,482,628，以上均并入本文作为参考。其他蛋白酶实例包括但不限于胰蛋白酶(例如，猪或牛来源的)和WO 89/06270中描述的镰刀霉蛋白酶。在一些实施方案中，可用于本发明的市售蛋白酶包括但不限于MAXACALTM、MAXAPEMTM、 OXP、PURAMAXTM、EXCELLASETM和PURAFASTTM(Genencor)； DURAZYMTM、 和(Novozymes)；以及BLAPTM(HenkelKommanditgesellschaft auf Aktien、Duesseldorf，德国)。多种蛋白酶描述于WO95/23221、WO 92/21760、美国专利公开号2008/0090747和美国专利号5,801,039、5,340,735、5,500,364、5,855,625、US RE 34,606、5,955,340、5,700,676、6,312,936和6,482,628中，以及多种其他专利中。在其他实施方案中，金属蛋白酶可用于本发明中，包括但不限于WO 07/044993中描述的中性金属蛋白酶。
此外，本发明可使用任何合适的脂肪酶。合适的脂肪酶包括但不限于细菌或真菌来源的那些。经化学或遗传修饰的突变体也包括在本发明之内。有用的脂肪酶的实例包括Humicola lanuginosa脂肪酶(见例如，EP 258068和EP 305216)、米赫根毛霉(Rhizomucor miehei)脂肪酶(见例如，EP238023)、假丝酵母(Candida)脂肪酶，例如南极假丝酵母(C.antarctica)脂肪酶(例如，南极假丝酵母脂肪酶A或B；见例如，EP214761)、假单胞菌(Pseudomonas)脂肪酶，例如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)和类产碱假单胞菌(P.pseudoalcaligenes)脂肪酶(见例如，EP 218272)、洋葱假单胞菌(P.cepacia)脂肪酶(见例如，EP 331376)、斯氏假单胞菌(P.stutzeri)脂肪酶(见例如，GB 1,372,034)、荧光假单胞菌(P.fluorescens)脂肪酶、芽孢杆菌脂肪酶(例如，枯草芽孢杆菌脂肪酶[Dartois等，Biochem.Biophys.Acta 1131：253-260[1993])；嗜热脂肪芽孢杆菌脂肪酶[见例如，JP 64/744992]；以及短芽孢杆菌脂肪酶[见例如，WO 91/16422])。
此外，多种克隆的脂肪酶均可用于本发明的一些实施方案，包括但不限于沙门柏干酪青霉(Penicillium camembertii)脂肪酶(见，Yamaguchi等，Gene 103：61-67[1991])、白地霉(Geotricum candidum)脂肪酶(见，Schimada等，J.Biochem.，106：383-388[1989])，以及多种根霉属(Rhizopus)脂肪酶，例如德氏根霉(R.delemar)脂肪酶(见，Hass等，Gene 109：117-113[1991])、雪白根霉(R.niveus)脂肪酶(Kugimiya等，Biosci.Biotech.Biochem.56：716-719[1992])和米曲霉(R.oryzae)脂肪酶。
其他类型的脂解酶(如角质酶)也可用于本发明的一些实施方案，包括但不限于来自门多萨假单胞菌(Pseudomonas mendocina)的角质酶(见，WO 88/09367)或者来自腐皮镰孢(Fusarium solanipisi)的角质酶(见，WO 90/09446)。
其他合适的脂肪酶包括市售的脂肪酶，例如M1LIPASETM、LUMAEASTTM和LIPOMAXTM(Genencor)；和ULTRA(Novozymes)；和LIPASE PTM″Amano″(Amano PharmaceuticalCo.Ltd.，日本)。
在本发明的一些实施方案中，本发明的清洁组合物进一步包含按组合物的重量计，从约0.00001％至约10％的其他脂肪酶水平的脂肪酶，以及按组合物重量计的清洁附加材料的余量。在本发明的其他方面中，本发明的清洁组合物还包含按组合物重量计约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％脂肪酶水平的脂肪酶。
在一些实施方案中，本发明可使用任何合适的淀粉酶。在一些实施方案中，还可以使用适合用于碱性溶液中的任何淀粉酶(例如，α和/或β)。合适的淀粉酶包括但不限于细菌或真菌来源的那些。经化学或遗传修饰的突变体也包括在一些实施方案中。可用于本发明的淀粉酶包括但不限于得自地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶(见例如，GB 1,296,839)。可用于本发明的市售淀粉酶包括但不限于 和BANTM(Novozymes)，以及POWERASETM、和P(Genencor)。
在本发明的一些实施方案中，本发明的清洁组合物进一步包含按组合物重量计，约0.00001％至约10％其他淀粉酶水平的淀粉酶，以及按组合物重量计清洁附加材料的余量。在本发明的其他方面中，本发明的清洁组合物还包含按组合物重量计约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％淀粉酶水平的淀粉酶。
在一些其他实施方案中，本发明的清洁组合物可使用任何合适的纤维素酶。合适的纤维素酶包括但不限于细菌或真菌来源的那些。经化学或遗传修饰的突变体也包括在一些实施方案中。合适的纤维素酶包括但不限于特异腐质酶(Humicola insolens)纤维素酶(见例如，美国专利号4,435,307)。特别合适的纤维素酶是具有颜色护理益处的纤维素酶(见例如，EP0495257)。可用于本发明的市售纤维素酶包括但不限于 (Novozymes)和KAC-500(B)TM(Kao Corporation)。在一些实施方案中，纤维素酶作为成熟野生型或变体纤维素酶的部分或片段掺入，其中缺失了N端部分(见例如，美国专利号5,874,276)。在一些实施方案中，本发明的清洁组合物进一步包含按组合物重量计约0.00001％至约10％的其他纤维素酶水平的纤维素酶，以及按组合物重量计的清洁附加材料的余量。在本发明的其他方面中，本发明的清洁组合物还包含按组合物重量计约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％纤维素酶水平的纤维素酶。
任何适用于去垢剂组合物的甘露聚糖酶也可用于本发明。合适的甘露聚糖酶包括但不限于细菌或真菌来源的那些。经化学或遗传修饰的突变体也包括在一些实施方案中。已知多种甘露聚糖酶可用于本发明(见例如，美国专利号6,566,114、美国专利No.6,602,842和美国专利号6,440,991，均通过引用并入本文中)。在一些实施方案中，本发明的清洁组合物进一步包含按组合物重量计约0.00001％至约10％的其他甘露聚糖酶水平的甘露聚糖酶，以及按组合物重量计的清洁附加材料的余量。在本发明的其他方面中，本发明的清洁组合物还包含按组合物重量计约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％甘露聚糖酶水平的甘露聚糖酶。
在一些实施方案中，将过氧化物酶与过氧化氢或其来源(例如，过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐)组合使用。在一些备选实施方案中，将氧化酶与氧组合使用。这两种类型的酶都用于“溶液漂白”(即，防止织物在洗涤液体中一起洗涤时纺织染料从染色的织物转移至其他织物)，优选与增效剂一起使用(见例如，WO 94/12621和WO 95/01426)。合适的过氧化物酶/氧化酶包括但不限于植物、细菌或真菌来源的那些。经化学或遗传修饰的突变体也包括在一些实施方案中。在一些实施方案中，本发明的清洁组合物进一步包含按组合物重量计约0.00001％至约10％的其他过氧化物酶和/或氧化酶水平的过氧化物酶和/或氧化酶，以及按组合物重量计的清洁附加材料的余量。在本发明的其他方面中，本发明的清洁组合物还包含按组合物重量计约0.0001％至约10％、约0.001％至约5％、约0.001％至约2％、约0.005％至约0.5％的过氧化物酶和/或氧化酶水平的过氧化物酶和/或氧化酶。
在一些实施方案中，可以使用其他的酶，包括但不限于过水解酶(见例如，WO 05/056782)。此外，在一些特别优选的实施方案中，上述酶的混合物涵盖在本文中，特别是一种或多种其他的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、甘露聚糖酶，和/或至少一种纤维素酶。实际上，可以预计本发明可使用这类酶的多种混合物。还可以预计，变体蛋白酶和一种或多种其他酶的变化水平都可以独立的达到约10％，清洁组合物的余量是清洁附加材料。考虑待清洁的表面、物品或织物，以及在使用过程中组合物用于清洁条件的理想形式(例如，通过洗涤去垢剂用途)，可以方便的确定清洁附加材料的具体选择。
合适的清洁附加材料的实例包括但不限于表面活性剂、增洁剂、漂白剂、漂白活化剂、漂白催化剂、其他酶、酶稳定系统、螯合试剂、光学增白剂、污垢释放聚合物、染料转移剂、染料转移抑制剂、催化材料、过氧化氢、过氧化氢源、preformed peracis、聚合分散剂、粘土去除剂、结构弹性剂(structure elasticizing agent)、分散剂、消泡剂、染料、香料、着色剂、填充盐、水溶助长剂、光活化剂、荧光剂、织物柔软剂(conditioners)、织物软化剂(softeners)、载体、水溶助长剂、加工助剂、溶剂、色素、可水解的表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗收缩剂、抗皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、色粒、银护理剂(silvercare)、抗晦暗剂和/或抗腐蚀剂、碱度来源、增溶剂、载体、加工助剂、色素和pH控制剂(见例如，美国专利号6,610,642，6,605,458，5,705,464，5,710,115，5,698,504，5,695,679，5,686,014和5,646,101，均通过引用并入本文中)。下文详细示例了具体清洁组合物材料的实施方案。在清洁附加材料与清洁组合物中的本发明蛋白酶不相容的实施方案中，则使用合适的方法将清洁附加材料与蛋白酶分离(即，不彼此接触)直至这两种组分适于组合时。此类分离方法包括本领域任何已知方法(例如，软胶囊、封装、片剂、物理分离等)。
在一些优选的实施方案中，将有效量的一种或多种本文提供的变体蛋白酶包含在这样的组合物中，所述组合物可用于清洁多种需要清除蛋白污渍的表面。此类清洁组合物包括用于这些应用的清洁组合物，其用于清洁硬表面、织物和餐具。事实上，在一些实施方案中，本发明提供了衣物去垢剂，而在其他实施方案中，本发明提供了非衣物去垢剂。值得注意的是，本发明还提供了适于个人卫生的清洁组合物，包括口腔护理(包括洁牙剂、牙膏、漱口剂等，以及牙齿清洁组合物)、皮肤和头发清洁组合物。本发明旨在涵盖任何形式(即液体、颗粒、条形、半固体、凝胶、乳液、片剂、胶囊剂等)的去垢剂组合物。
作为示例，下文更详细地描述了可使用本发明变体蛋白酶的一些清洁组合物。在一些将本发明清洁组合物制备为适用于洗衣机洗方法的实施方案中，本发明的组合物优选含有至少一种表面活性剂和至少一种增洁剂化合物，以及一种或多种清洁附加材料，其优选选自有机聚合化合物、漂白剂、其他酶、消泡剂、分散剂、石灰皂分散剂、土壤悬浮剂和抗再沉积剂以及缓蚀剂。在一些实施方案中，洗衣(laundry)组合物还含有软化剂(即，作为其他清洁附加材料)。本发明的组合物还可以用于固体或液体形式的去垢剂添加剂产品。此类添加剂产品旨在补充和/或增强常规去垢剂组合物的性能，并可在洗涤过程的任何阶段加入。在一些实施方案中，本文的洗衣去垢剂组合物的密度范围是从约400至约1200g/升，而在其他实施方案中，在20℃下测量时，范围是从约500至约950g/l组合物。
在制备为用于手工洗碗方法的组合物的实施方案中，本发明的组合物优选含有至少一种表面活性剂，并且优选含有至少一种其他清洁附加材料，其选自有机聚合化合物、增泡剂、II族金属离子、溶剂、助水溶剂和其他酶。
在一些实施方案中，多种清洁组合物(如美国专利号6,605,458中提供的)可与本发明的变体蛋白酶一起使用。因此，在一些实施方案中，包含至少一种本发明的变体蛋白酶的组合物是致密的颗粒状衣物去垢剂，而在其他实施方案中，所述组合物是可用于洗涤有色织物的颗粒状衣物去垢剂，在另一些实施方案中，所述组合物是在洗涤能力中提供软化的颗粒状衣物去垢剂，在另一些实施方案中，所述组合物为重垢型液体衣物去垢剂。在一些实施方案中，包含至少一种本发明变体蛋白酶的组合物是衣物去垢剂，如美国专利号6,610,642和6,376,450中所述。此外，本发明的变体蛋白酶可用于在欧洲或日本洗涤条件下特别有用的颗粒状洗衣去垢剂组合物中(见例如，美国专利6,610,642)。
在一些备选实施方案中，本发明提供了包含至少一种本文所提供的变体蛋白酶的硬表面清洁组合物。因此，在一些实施方案中，包含至少一种本发明变体蛋白酶的组合物是硬表面清洁组合物，如美国专利号6,610,642、6,376,450和6,376,450中所述的。
在其他的实施方案中，本发明提供包含至少一种本文所提供变体蛋白酶的洗碗组合物。因此，在一些实施方案中，包含至少一种本发明的变体蛋白酶的组合物是硬表面清洁组合物，如美国专利号6,610,642和6,376,450中所述的那些。在一些其他的实施方案中，本发明提供包含至少一种本文所提供变体蛋白酶的洗碗组合物。因此，在一些实施方案中，包含至少一种本发明的变体蛋白酶的组合物包含口腔护理组合物，如美国专利号6,376,450和6,376,450中所述的。上述美国专利号6,376,450、6,605,458、6,605,458和6,610,642中包含的配方以及对化合物和清洁附加材料的描述都可用于本文提供的变体蛋白酶。
将本发明的清洁组合物配制成任何合适的形式，并通过制剂师选择的任何工艺进行制备，其非限制性的例子描述在美国专利号5,879,584、5,691,297、5,574,005、5,569,645、5,565,422、5,516,448、5,489,392和5,486,303中，这些申请均通过引用并入本文作为参考。当低pH清洁组合物是理想的时，通过添加材料来调节此类组合物的pH，所述材料例如单乙醇胺或酸性材料，如HCl。
虽然对本发明的目的不是必需的，后文中示例的附加物的非限制性列表适用于瞬间清洁组合物。在一些实施方案中，整合这类附加物，例如帮助或增强清洁性能，用于处理待清洁的底物，或者修饰清洁组合物的美感，如使用香料、着色剂、染料等的情况下。可以理解，此类附加物是除本发明的变体蛋白酶之外的。这类额外组分的精确特性，及其整合的水平，将取决于组合物的物理形式和使用它的清洁操作的本质。合适的附加材料包括但不限于表面活性剂、增洁剂、螯合试剂、染料转移抑制剂、沉淀助剂、分散剂、其他酶、酶稳定系统、催化材料、漂白活化剂、漂白增强剂、过氧化氢、过氧化氢源、preformed peraeis、聚合分散剂、粘土去除剂/抗重沉淀剂、增白剂、消泡剂、染料、香料、结构弹性剂(structure elasticizingagent)、织物软化剂(softeners)、载体、水溶助长剂、加工助剂和/或色素。除下文公开的之外，此类其他附加物的合适实例和使用水平可见于美国专利号5,576,282、6,306,812和6,326,348中，这些申请均通过引用并入本文作为参考。前述附加成分可构成本发明的清洁组合物的余量。
在一些实施方案中，根据本发明的清洁组合物包含至少一种表面活性剂和/或表面活性剂体系，其中，所述表面活性剂选自非离子型表面活性剂、阳离子型表面活性剂、阴离子型表面活性剂、两性表面活性剂、两性离子型表面活性剂、半极性非离子型表面活性剂及其混合物。在一些低pH清洁组合物实施方案中(例如，具有从约3至约5的净pH的组合物)，组合物一般不合有烷基乙氧基硫酸盐，因认为此类表面活性剂可被此类组合物水解为酸性内容物。在一些实施方案中，表面活性剂存在的水平是从约0.1％至约60％，而在可选的实施方案中，按清洁组合物的重量计，该水平是从约1％至约50％，而在其他的实施方案中，该水平是从约5％至约40％。
在一些实施方案中，本发明的清洁组合物包含一种或多种去垢剂增洁剂或增洁剂体系。在一些整合了至少一种增洁剂的实施方案中，按清洁组合物的重量计，清洁组合物包含展示约1％，从约3％至约60％，或者甚至从约5％至约40％的增洁剂。增洁剂包括但不限于多聚磷酸的碱金属、铵和烷醇铵的盐、碱金属硅酸盐、碱土金属和碱金属碳酸盐、铝硅酸盐、聚羟酸酯化合物、羟基多元羧酸醚、马来酸酐与乙烯或乙烯甲醚的共聚物、1，3，5-三羟基苯-2，4，6-三磺酸，和羧甲氧基琥珀酸、聚醋酸的各种碱金属、铵和取代铵的盐，如乙二铵四乙酸和氨三乙酸，以及多聚羧酸，如苯六甲酸、琥珀酸、柠檬酸、氧基二琥珀酸、多聚苹果酸、苯基1，3，5-三羧酸、羧甲氧基琥珀酸，及其可溶性的盐。实际上，可以预期本发明的各个实施方案中可使用任何合适的增洁剂。
在一些实施方案中，增洁剂形成可溶于水的硬离子复合物(例如，鳌和增洁剂)，例如柠檬酸和多聚磷酸(例如，三聚磷酸钠和三聚磷酸钠六水合物、三聚磷酸钾，和混合的三聚磷酸钠和钾，等)。可以预期本发明可使用任何合适的增洁剂，包括本领域已知的(见例如，EP 2 100 949)。
在一些实施方案中，本发明的清洁组合物含有至少一种螯合剂。合适的螯合剂包括但不限于铜、铁和/或镁的螯合剂，及其混合物。在使用至少一种螯合剂的实施方案中，本发明的清洁组合物按清洁组合物对象的重量计，包含从约0.1％至约15％，或者甚至从约3.0％至约10％螯合剂。
在一些其他的实施方案中，本文提供的清洁组合物含有至少一种沉淀助剂。合适的沉淀助剂包括但不限于聚乙二醇、聚丙二醇、聚羧酸、污垢释放聚合物如polytelephthalic acid、粘土例如高岭石、蒙脱石、凹凸棒土、伊利石、斑脱土、埃洛石，及其混合物。
如本文所示，在一些实施方案中，本发明的一些实施方案可使用抗沉淀剂。在一些优选的实施方案中，可使用非离子型表面活性剂。例如，在自动化洗碗的实施方案中，非离子型表面活性剂可用于表面修饰目的，特别是用于包覆(sheeting)，以避免产生薄膜和污点，并改善光泽。这类非离子型表面活性剂还可用于阻止污垢的再沉淀。在一些优选的实施方案中，抗沉淀剂是本领域已知的非离子型表面活性剂(见例如，EP 2 100 949)。
在一些实施方案中，本发明的清洁组合物包括一种或多种染料转移抑制剂。合适的多聚染料转移抑制剂包括但不限于聚乙烯吡咯烷酮聚合物、聚氨基N-氧聚合物、N-乙烯吡咯烷酮和N-乙烯咪唑的共聚物、聚乙烯唑烷酮和聚乙烯咪唑或其混合物。在使用至少一种染料转移抑制剂的实施方案中，按清洁组合物的重量计，本发明的清洁组合物包含从约0.0001％至约10％，从约0.01％至约5％，或者甚至从约0.1％至约3％。
在一些实施方案中，本发明的组合物中包括硅酸盐。在一些此类实施方案中，可使用硅酸钠(例如，二硅酸钠、偏硅酸钠和结晶叶硅酸钠)。在一些实施方案中，存在的硅酸盐水平是从约1％至约20％。在一些优选的实施方案中，存在的硅酸盐水平按组合物的重量计是从约5％至约15％。
在一些实施方案中，本发明的清洁组合物还含有分散剂。合适的可溶于水的有机材料包括但不限于同聚或共聚酸或其盐，其中多聚羧酸包含至少两个彼此分离但不超过2个碳原子的羧基。
在一些其他实施方案中，用于所述清洁组合物的酶是以任何合适的技术稳定化的。在一些实施方案中，通过向酶提供此类离子的终组合物中存在的可溶于水的钙源和/或镁离子源，来稳定用于本文中的酶。在一些实施方案中，酶稳定剂包括寡糖、多糖和无机二价金属盐，包括碱土金属，例如钙盐。可以预期用于酶稳定化的各种技术都可用于本发明中。例如，在一些实施方案中，用于本文中的酶是通过向酶提供此类离子的终组合物中存在的可溶于水的锌(II)、钙(II)和/或镁(II)离子，以及其他金属离子(例如，钡(II)、钪(II)、铁(II)、锰(II)、铝(III)、锡(II)、钴(II)、铜(II)、镍(II)和六配位钒氧(IV)源来稳定的。盐酸和硫酸盐也可用于本发明的一些实施方案中。合适的寡糖和多糖(例如，糊精)的例子是本领域已知的(见例如，WO 07/145964)。在一些实施方案中，也可使用可逆的蛋白酶抑制剂，例如，当需要时，含硼的化合物(例如，硼酸盐、4-甲酰基苯基硼酸)和/或三肽醛可用于进一步改善稳定性。
在一些实施方案中，本发明的组合物中存在漂白剂、漂白活化剂和/或漂白催化剂。在一些实施方案中，本发明的清洁组合物包含无机的和/或有机的漂白化合物。无机漂白剂包括但不限于过氧化氢合物的盐(例如，过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐)。在一些实施方案中，无机过氧化氢合物的盐是碱金属盐。在一些实施方案中，无机过氧化氢合物的盐作为结晶固体包括，没有额外的保护，但在其他一些实施方案中，所述盐是经包被的。本领域已知的任何合适的盐可用于本发明中(见例如，EP 2 100 949)。
在一些实施方案中，本发明的组合物中使用漂白活化剂。漂白活化剂一般是在60℃和更低温度下的清洁过程中，增强漂白作用的有机过酸前体。适用于本文中的漂白活化剂包括这样的化合物，其在过水解的条件下产生两性过氧羧酸，所述两性过氧羧酸优选具有从约1至约10个碳源子，特别是从约2至约4个碳源子，和/或任选取代的过安息香酸。其他的漂白活化剂是本领域已知的，可用于本发明中(见例如，EP 2 100 949)。
此外，在一些实施方案中和如本文进一步所述，本发明的清洁组合物进一步包含至少一种漂白催化剂。在一些实施方案中，可使用三氮杂环壬烷锰和相关的复合物，以及钴、铜、锰和铁复合物。其他的漂白催化剂可用于本发明中(见例如，US 4,246,612、5,227,084、4,810410、WO 99/06521和EP 2 100 949)。
在一些实施方案中，本发明的清洁组合物含有一种或多种催化金属复合物。在一些实施方案中，可使用含金属的漂白催化剂。在一些优选的实施方案中，金属漂白催化剂包含催化系统，所述催化系统包含确定漂白催化活性的过渡金属阳离子(例如，铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子)、具有或无漂白催化活性的辅助金属阳离子(例如，锌或铝阳离子)和对催化和辅助性的金属阳离子具有确定的稳定常数的多价鳌和剂，特别是使用乙二铵四乙酸、乙二铵四(亚甲基磷酸)及其可溶于水的盐(见例如，美国专利号4,430,243)。在一些实施方案中，本发明的清洁组合物是通过锰化合物催化的。此类化合物和使用水平是本领域普遍已知的(见例如，美国专利号5,576,282)。在其他实施方案中，钴漂白催化剂是本领域已知的(见例如，美国专利号5,597,936和5,595,967)，且是通过已知的程序易于制备的。
在其他一些实施方案中，本发明的清洁组合物包括巨多环刚性配体(MRL)的过渡金属复合物。作为实践的模式而非进行限制，在一些实施方案中，调节本发明提供的组合物和清洁过程，在含水的清洗基质中提供数量级为至少百万分之一的活性MRL，在一些优选的实施方案中，在清洗液中提供从约0.005ppm至约25ppm，更优选从约0.05ppm至约10ppm，最优选从约0.1ppm至约5ppm的MRL。
在一些实施方案中，在速溶的过渡金属漂白催化剂中优选的过渡金属包括但不限于锰、铁和铬。优选的MRL也包括但不限于交联的特定超刚性配体(例如，5,12-二乙基-1,5,8,12-四氮杂双环[6.6.2]十六烷)。通过已知的程序可以方便的制备合适的过渡金属MRL(见例如，WO 2000/32601和美国专利号6,225,464)。
在一些实施方案中，本发明的清洁组合物包含金属护理剂。金属护理剂可用于防止和/或降低金属的晦暗、腐蚀和/或氧化，包括铝、不锈钢和非铁金属(例如，银和铜)。合适的金属护理剂包括在EP 2 100 949、WO9426860和WO 94/26859中描述的。在一些实施方案中，金属护理剂是锌盐。在一些其他实施方案中，按一种或多种金属护理剂的重量计，本发明的清洁组合物包含从约0.1％至约5％。
如前所述，本发明的清洁组合物可配制成任何合适的形式，并通过制剂师选定的任何工艺来制备，其非限制性的实例描述在美国专利号5,879,584、5,691,297、5,574,005、5,569,645、5,516,448、5,489,392和5,486,303中，这些申请均通过引用并入本文中作为参考。在一些低pH清洁组合物是理想的实施方案中，通过添加酸性材料如HCl，来调节此类组合物的pH。
本文公开的清洁组合物可用于清洁部位(situs)(例如，表面、餐具或织物)。一般的，至少一部分的所述部位与本发明清洁组合物的实施方案接触，所述组合物是以纯的形式或稀释在清洗液中，然后，任选的清洗和/或漂洗所述部位。出于本发明的目的，“清洗”包括但不限于擦洗和机械搅拌。在一些实施方案中，清洁组合物一般以从约500ppm至约15,000ppm的溶液浓度使用。当清洗溶剂是水时，水温一般范围是从约5℃至约90℃，而当所述部位是包括织物时，水与织物质量的比例一般是从约1：1至约30∶1。
实施例
本发明更详细地描述在以下实施例中，所述实施例并非意在以任何方式限制本发明的范围。
在下文的实验公开内容中将使用以下缩写：PI(蛋白酶抑制剂)；ppm(百万分之一)；M(摩尔/升)；mM(毫摩尔)；μM(微摩尔)；nM(纳摩尔)；mol(摩尔)；mmol(毫摩尔)；μmol(微摩尔)；nmol(纳摩尔)；gm(克)；mg(毫克)；μg(微克)；pg(皮克)；L(升)；ml和mL(微升)；μl和μL(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；μm(微米)；nm(纳米)；U(单位)；V(伏特)；MW(分子量)；sec(秒)；min(分钟)；h和hr(小时)；℃(摄氏度)；QS(有效量)；ND(未进行)；rpm(每分钟转数)；H2O(水)；dH2O(去离子水)；HCl(盐酸)；aa(氨基酸)；bp(碱基对)；kb(千碱基对)；kD(千道尔顿)；cDNA(拷贝或互补DNA)；DNA(脱氧核糖核酸)；ssDNA(单链DNA)；dsDNA(双链DNA)；dNTP(脱氧核糖核苷酸三磷酸)；RNA(核糖核酸)；MgCl2(氯化镁)；NaCl(氯化钠)；w/v(重量/体积)；v/v(体积/体积)；g(重力)；OD(光密度)；ppm(百万分之)；Dulbecco磷酸缓冲液(DPBS)；SOC(2％细菌用胰蛋白胨、0.5％细菌用酵母提取物、10mM NaCl、2.5mM KCl)；Terrific培养液(TB；12g/l细菌用胰蛋白胨、24g/l甘油、2.31g/l KH2PO4和12.54g/lK2HPO4)；OD280(280nm处的光密度)；OD600(600nm处的光密度)；A405(405nm处的吸光度)；Vmax(酶催化反应的最高起始速率)；PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)；PBS(磷酸缓冲盐水[150mM NaCl、10mM磷酸钠缓冲液，pH 7.2])；PBST(PBS+0.25％20)；PEG(聚乙二醇)；PCR(聚合酶链式反应)；RT-PCR(逆转录PCR)；SDS(十二烷基硫酸钠)；Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)；HEPES(N-[2-羟乙基]哌嗪-N-[2-乙磺酸])；HBS(HEPES缓冲盐水)；Tris-HCl(三[羟甲基]氨基甲烷-盐酸盐)；Tricine(N-[三(羟甲基)-甲基]-甘氨酸)；CHES(2-(N-环己基氨基)乙磺酸)；TAPS(3-{[三(羟甲基)-甲基]-氨基}-丙磺酸)；CAPS(3-(环己基氨基)-丙磺酸；DMSO(二甲亚砜)；DTT(1，4-二硫代-DL-苏糖醇)；SA(芥子酸(s，5-二甲氧基-4-羟基肉桂酸)；TCA(三氯乙酸)；Glut和GSH(还原型谷胱甘肽)；GSSG(氧化型谷胱甘肽)；TCEP(三[2-羧乙基]膦)；Ci(居里)；mCi(毫居里)；μCi(微居里)；HPLC(高压液相层析)；RP-HPLC(反向高压液相层析)；TLC(薄层层析)；MALDI-TOF(基质辅助的激光解吸/电离飞行时间)；Ts(甲苯磺酰基)；Bn(苄基)；Ph(苯基)；Ms(甲磺酰基)；Et(乙基)，Me(甲基)；Taq(栖热水生菌(Thermus aquaticus)DNA聚合酶)；Klenow(DNA聚合酶I大(Klenow)片段)；EGTA(乙二醇-双(β-氨基乙醚)N，N，N′，N′-四乙酸)；EDTA(乙二胺四乙酸)；bla(β-内酰胺酶或氨苄青霉素抗性基因)；HDL(高密度液体)；MJ Research(MJ Research，Reno，NV)；Baseclear(Baseclear BV，Inc.，Leiden，荷兰)；PerSeptive(PerSeptiveBiosystems、Framingham、MA)；ThermoFinnigan(ThermoFinnigan，San Jose，CA)；Argo(Argo BioAnalytica，Morris Plains，NJ)；Seitz EKS(SeitzSchenkFiltersystems GmbH，Bad Kreuznach，Germany)；Pall(Pall Corp.，East Hills，NY and Bad Kreuznach，Germany)；Spectrum(Spectrum Laboratories，Dominguez Rancho，CA)；Molecular Structure(MolecularStructure Corp.，Woodlands，TX)；Accelrys(Accelrys，Inc.，San Diego，CA)；Chemical Computing(Chemical Computing Corp.，Montreal，Canada)；New Brunswick(New Brunswick Scientific，Co.，Edison，NJ)；CFT(Center for Test Materials，Vlaardingen，the Netherlands)；Procter&Gamble(Procter&Gamble，Inc.，Cincinnati，OH)；GE Healthcare(GE Healthcare，Chalfont St.Giles，United Kingdom)；DNA2.0(DNA2.0，Menlo Park，CA)；OXOID(Oxoid，Basingstoke，Hampshire，UK)；Megazyme(Megazyme International Ireland Ltd.，Bray Business Park，Bray，Co.，Wicklow，Ireland)；Finnzymes(Finnzymes Oy，Espoo，Finland)；Kelco(CP Kelco，Wilmington，DE)；Corning(Corning Life Sciences，Corning，NY)；(NEN(NEN Life Science Products，Boston，MA)；Pharma AS(Pharma AS，Oslo，Norway)；Dynal(Dynal，Oslo，Norway)；Bio-Synthesis(Bio-Synthesis，Lewisville，TX)；ATCC(American Type Culture Collection，Rockville，MD)；Gibco/BRL(Gibco/BRL，Grand Island，NY)；Sigma(Sigma Chemical Co.，St.Louis，MO)；Pharmacia(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)；NCBI(National Center for Biotechnology Information)；Applied Biosystems(Applied Biosystems，Foster City，CA)；BD Biosciences and/or Clontech(BD Biosciences CLONTECH Laboratories，Palo Alto，CA)；Operon Technologies(Operon Technologies，Inc.，Alameda，CA)；MWG Biotech(MWG Biotech，HighPoint，NC)；Oligos Etc(Oligos Etc.Inc，Wilsonville，OR)；Bachem(Bachem Bioscience，Inc.，King ofPrussia，PA)；Difco(Difco Laboratories，Detroit，MI)；Mediatech(Mediatech，Herndon，VA；Santa Cruz(Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Santa Cruz，CA)；Oxoid(Oxoid Inc.，Ogdensburg，NY)；Worthington(Worthington Biochemical Corp.，Freehold，NJ)；GIBCO BRL or Gibco BRL(Life Technologies，Inc.，Gaithersburg，MD)；Millipore(Millipore，Billerica，MA)；Bio-Rad(Bio-Rad，Hercules，CA)；Invitrogen(Invitrogen Corp.，San Diego，CA)；NEB(New England Biolabs，Beverly，MA)；Sigma(Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO)；Pierce(Pierce Biotechnology，Rockford，IL)；Takara(Takara Bio Inc.Otsu，Japan)；Roche(Hoffmann-La Roche，Basel，Switzerland)；EM Science(EM Science，Gibbstown，NJ)；Qiagen(Qiagen，Inc.，Valencia，CA)；Biodesign(Biodesign Intl.，Saco，Maine)；Aptagen(Aptagen，Inc.，Herndon，VA)；Sorvall(Sorvall brand，from Kendro Laboratory Products，Asheville，NC)；MolecularDevices(Molecular Devices，Corp.，Sunnyvale，CA)；R&D Systems(R&D Systems，Minneapolis，MN)；Stratagene(Stratagene Cloning Systems，La Jolla，CA)；Marsh(Marsh Biosciences，Rochester，NY)；Geneart(Geneart GmbH，Regensburg，Germany)；Bio-Tek(Bio-Tek Instruments，Winooski，VT)；(Biacore(Biacore，Inc.，Piscataway，NJ)；PeproTech(PeproTech，Rocky Hill，NJ)；SynPep(SynPep，Dublin，CA)；New Objective(New Objective brand；Scientific Instrument Services，Inc.，Ringoes，NJ)；Waters(Waters，Inc.，Milford，MA)；Matrix Science(Matrix Science，Boston，MA)；Dionex(Dionex，Corp.，Sunnyvale，CA)；Monsanto(Monsanto Co.，St.Louis，MO)；Wintershall(Wintershall AG，Kassel，Germany)；BASF(BASF Co.，Florham Park，NJ)；Huntsman(Huntsman Petrochemical Corp.，Salt LakeCity，UT)；Enichem(Enichem Iberica，Barcelona，Spain)；Fluka Chemie AG(Fluka Chemie AG，Buchs，Switzerland)；Gist-Brocades(Gist-Brocades，NV，Delft，theNetherlands)；DowCorning(Dow ComingCorp.，Midland，MI)和Microsoft(Microsoft、Inc.、Redmond、WA)。
如本文使用的，在一些列表中，开头的“0”是为了为每个位点提供三位数命名而标出的(例如，“001”与“1”相同，所以“A001C”与“A1C”相同)。在一些列表中，没有包括开头的“0”。此外，如本文使用的，“X”指任何氨基酸。
在本文提供的示例性去垢剂组合物中，除非另外说明，则通过按总组合物的重量计的纯酶来表示酶水平，按总组合物的重量表示去垢剂成分。其中的缩写组分标识符具有下列含义：
缩写 成分
LAS ：线性C11-13烷基苯磺酸钠.
NaC16-17HSAS ：C16-17高可溶的烷基磺酸钠
TAS ：牛油(tallow)烷基硫酸钠
CxyAS ：C1x-C1y烷基磺酸钠
CxyEz ：主要是C1x-C1y线性伯醇与平均z摩尔的环氧乙烷缩合
CxyAEzS ：C1x-C1y烷基硫酸钠与平均z摩尔的环氧乙烷缩合。在例子中添加分子名称。
非离子型 ：混合的乙氧化/丙氧化脂肪醇，例如Plurafac LF404是具有平均乙氧化程度为3.8和平均丙氧化程度为4.5的醇
QAS ：R2.N+(CH3)2(C2H4OH)，含R2＝C12-C14·
硅酸盐 ：无定形硅酸钠(SiO2∶Na2O比例＝1.6-3.2∶1).
偏硅酸盐 ：偏硅酸钠(SiO2∶Na2O比例＝1.0).
沸石A ：配方为Na12(A1O2SiO2)12.27H2O的水合硅酸铝
SKS-6 ：配方为δ-Na2Si2O5的结晶层化硅酸盐
磺酸盐 ：无水硫酸钠
STPP ：三聚磷酸钠
MA/AA ：4∶1丙烯酸/马来酸的随机共聚物，平均分子量约70，000-80，000.
AA ：平均分子量4,500的聚丙烯酸钠聚合物
多聚羧酸 ：包含分子量范围在2,000-80,000之间的羧酸单体如丙烯酸、马来酸和甲基丙烯酸的共聚物，例如可从BASF商购的Sokolan，是丙烯酸，MW4,500的共聚物。
BB1 ：3-(3，4-二氢异喹啉)丙烷磺酸
BB2 1-(3，4-二氢异喹啉)-癸烷-2-磺酸
PB1 ：一水合过硼酸钠.
PB4 ：名称通式为NaBO3.4H2O的四水合过硼酸钠
过碳酸盐 ：名称通式为2Na2CO3.3H2O2的过碳酸钠
TAED ：四乙酰乙二胺.
NOBS ：钠盐形式的壬酸磺苯酯
DTPA ：二乙烯三胺五醋酸.
HEDP ：1，1-羟基乙叉二膦酸.
DETPMP ：二烯三胺五甲叉膦酸，由Monsanto以商标名Dequest2060出售
EDDS ：乙二胺-N，N′-二琥珀酸，(S，S)异构体的钠盐形式
二胺 ：二甲基氨丙基胺；1，6-己二胺；1，3-丙二胺；2-甲基-1，5-戊二胺；1，3-戊二胺；1-甲基-二氨基丙烷
DETBCHD 5，12-二乙基-1，5，8，12-四氮杂[6，6，2]十六烷、二氯、Mn(II)盐
PAAC ：五胺醋酸钴(III)盐
石蜡 ：Wintershall以商标名Winog70出售的石蜡油
磺酸石蜡 ：一些氢原子已被磺酸基替换的石蜡油或蜡
醛糖氧化酶 ：Novozymes A/S以商标名醛糖氧化酶出售的氧化酶
半乳糖氧化酶 ：Sigma的半乳糖氧化酶
nprE ：在枯草芽孢杆菌中表达的重组形式的中性金属蛋白酶(见例如，WO 07/044993)
PMN ：从解淀粉芽孢杆菌中纯化的中性金属蛋白酶
淀粉酶 ：合适的淀粉水解酶，例如WO 94/18314、WO96/05295中描述的由Genencor以商标名Ox出售的；可从Novozymes A/S获得的 和DURAMYLTM
脂肪酶 ：合适的脂肪水解酶，例如由Novozymes A/S以商标名Ultra出售的和Gist-Brocades以LipomaxTM出售的
纤维素酶 ：合适的纤维素水解酶，例如由Novozymes A/S以商标名和/或出售的
果胶酸裂解酶 ：合适的果胶酸裂解酶，如可从Novozymes A/S获得的以商标名和出售的
PVP ：聚乙烯吡咯烷酮，具有平均分子量为60,000
PVNO ：聚乙烯吡咯烷酮-N-氧化物，具有平均分子量为50,000.
PVPVI ：乙烯咪唑和乙烯吡咯烷酮的共聚物，具有平均分子量为20,000.
增白剂1 ：4，4′-双(2-磺基苯乙烯基)二苯基二钠.
硅氧烷消泡剂 ：含硅氧烷-氧化烯共聚物作为分散剂的聚二甲基硅氧烷泡沫控制剂，所述泡沫控制剂与所述分散剂的比例为10∶1至100∶1.
抑泡剂 ：颗粒形式的12％硅氧烷/硅石、18％硬脂醇、70％淀粉
SRP1 ：阴离子末端加帽的聚酯
PEG X ：分子量X的聚乙二醇
：乙烯吡咯烷酮同聚物(平均MW 160,000)
ED-2001 ：Huntsman的加帽聚乙二醇
AS ：Enichem的分支醇烷基硫酸盐
MME PEG(2000) ：Fluka Chemic AG的聚乙二醇单甲酯(MW 2000)
DC3225C ：硅氧烷抑泡剂，Dow Corning的硅油和硅石的混合物
TEPAE ：四乙烯五胺乙氧酸盐(Tetreaethylenepentaamine ethoxylate)
BTA ：苯并三唑.
甜菜碱 ：(CH3)3N+CH2COO-
糖 ：工业级的D-葡萄糖或食品级糖
CFAA ：C12-C14烷基N-甲基葡糖酰胺
TPKFA ：C12-C14完整切除顶端的(topped whole cut)脂肪酸.
粘土 ：通式为A12O3SiO2·xH2O的水合硅酸铝。类型：高岭石、蒙脱石、凹凸棒土、伊利石、斑脱土、埃洛石
pH ：在20℃下，以蒸馏水中的1％溶液测量的
实施例1
测定
在以下实施例中，为易于阅读，下文给出了所使用的各种测定。并标明了与下文提供的规程的任何偏差。
A.在96孔微量滴定板中进行用于蛋白质合量确定的TCA测定(“TCA
测定”)
对于BPN’(例如，参照蛋白酶)及其变体，使用来自在33℃下以230RPM摇动，并在加湿通风条件下培养4天已过滤培养物上清液来开始该测定。将新的96孔平底板(MTP)用于该测定。首先，将100μL/孔的0.25N HCl置于孔中。接着，向孔中加入50μL经过滤的培养液。接着测定405nm处的光散射/吸光度(在平板读数器中使用5秒混合模式)，以提供“空白”读数。为进行测试，将100μL/孔的15％(w/v)三氯乙酸(TCA)置于平板中，并在室温下孵育5至30分钟。接着测定405nm处的光散射/吸光度(在平板读数器中使用5秒混合模式)。
对于GCI-P036及其变体的蛋白质含量，使用来自在37℃下以300RPM摇动，并在加湿通风条件下生长约3天的微滴度平板的已过滤培养物上清液来开始该测定。在该测定中，将100μL的0.25M HCl加入96孔平底微滴度平板的每个孔中。接着，向孔中加入25μL等分的经过滤的培养上清液(含蛋白酶)。接着测定405nm处的光散射/吸光度(在平板读数器中使用5秒混合模式)，以提供“空白”读数。在该测量后，将100μL的30％(w/v)TCA加入每个孔中，并在室温下孵育微滴度平板5至15分钟。最后，测定405nm处的所获得的光散射/吸光度(在平板读数器中使用5秒混合模式)。使用的仪器是Biomek FX Robot(Beckman Coulter)和SpectraMAX(340型；Molecular Devices)MTP读板器；MTP是来自Costar的(9017型)。
通过从TCA测试读数中减去空白(无TCA的)来进行计算，以提供样品中蛋白质含量的相对测定值。必要时，可通过用具有已知转换因数的克隆的AAPF测定校准TCA读数，以产生标准曲线。然而，TCA结果就50至500毫克蛋白酶/ml(ppm)的蛋白质浓度而言是线性的，因此可直接对酶性能作图，以用于选择高性能变体的目的。样品的浊度/光散射的增加与培养上清液中可沉淀的蛋白质总量相关。
B.在96孔微量滴定板中进行AAPF蛋白酶测定(“AAPF测定”)
为了确定本发明的蛋白酶及其变体的蛋白酶活性，测量N-琥珀酰-丙氨酰-丙氨酰-脯氨酰-苯丙氨酰-对硝基苯胺(suc-AAPF-pNA)的水解。使用的试剂溶液是：100mM Tris/HCl，pH8.6，含有0.005％的(Tris稀释缓冲液)；100mM Tris缓冲液，pH8.6，含有10mM CaCl2和0.005％(Tris/Ca缓冲液)；和DMSO中的160mMsuc-AAPF-pNA(suc-AAPF-pNA储液)(Sigma：S-7388)。为了制备suc-AAPF-pNA工作液，将1ml suc-AAPF-pNA储液加入100ml Tris/Ca缓冲液中，充分混合至少10秒钟。如下进行测定：向每个孔中加入10μl稀释的蛋白酶溶液，其后迅速加入190μl的1mg/ml suc-AAPF-pNA工作液。将溶液混合5秒钟，25℃下，在MTP读数器中的动态模式下读出410nm的吸光度改变(5分钟内20次读数)。蛋白酶活性表达为AU(活性＝ΔOD·min-1.ml-1)。
AAPF水解方法
在68℃孵育蛋白酶变体1小时后，使用AAPF测定提供测定蛋白酶活性来确定丝氨酸蛋白酶的热稳定性。在所述测定的条件下，参照蛋白酶(例如，野生型GG36＝GCI-P036)的剩余活性是约50％。所使用的仪器是：F-底MTPs(Costar No.9017)、Biomek FX和/或Biomek FXp Robot(Beckman Coulter)、Spectramax Plus 384MTP读数器(MolecularDevices)、iEMS培养箱/摇床(1mm振幅)(Thermo/Labsystems)、封条(Nunc No.236366)和冰浴。通过将3.75g甘氨酸(Merck No.1.04201.1000)溶解在960mL水中，来制备甘氨酸缓冲液。向该溶液中加入1ml的5％Tween 80(Sigma No.P-8074)和10ml的1000mM CaCl2(Merck No.1.02382.1000)储液(29.4g溶解至200ml)。用4N NaOH调节pH至10.5，并将体积补至1000ml。甘氨酸、CaCl2和的终浓度分别是：50mM、10mM和0.005％。将培养箱设定为68℃(进行孵育)和25℃(进行AAPF测定)。向空白稀释中加入90μl和190μl甘氨酸缓冲液，分别孵育平板。任何向稀释平板中加入10μl上清液，再从稀释平板中取10μl加入孵育平板中。然后，将孵育平板的10μl混合物加入预暖的、含suc-AAPF-pNA底物的平板中。在MTP读数器中读取410nm下的suc-AAPF-pNA平板(t＝0测量)。用封条覆盖孵育平板，并在68℃和400rpm下孵育1小时。在孵育结束时，从培养箱中移出平板，在冰上冷却至少5分钟。将孵育平板的10μl混合物移入含suc-AAPF-pNA底物的平板中，读取410nm下的平板(t＝60测量)。百分比剩余活性计算为：
％剩余活性：(在t＝60处的mOD.min-1)/(在t＝0处的mOD.min-1)x100
C.LAS/EDTA稳定性测定(“LAS/EDTA测定”或“LAS-EDTA测定”
或“LAS测定”)
在将测试蛋白酶分别在存在LAS/EDTA的条件下孵育后，测量LAS/EDTA稳定性，作为使用AAPF测定所确定的剩余活性的函数。
在定义的条件下孵育后，测量蛋白酶变体在存在代表性的非离子型表面活性剂(LAS＝线性烷基苯磺酸、十二烷基磺酸钠-DOBS)和EDTA二钠的条件下的稳定性，使用AAPF测定来测量残留活性。使用的试剂是十二烷基苯磺酸钠盐(DOBS，Sigma D-2525)、(SigmaP-8074)、EDTA二钠(Siegfried Handel No.164599-02)、HEPES(SigmaNo.H-7523)、无压力缓冲液：50mM HEPES(11.9g/l)+0.005％pH8.0；压力缓冲液：50mM HEPES(11.9g/l)、0.1％(w/v)DOBS(1g/l)、10mM EDTA(3.36g/l)、pH8.0；参照蛋白酶和蛋白酶变体培养上清液，含200-400μg/ml蛋白质。使用的仪器是V-或U-底MTP作为稀释平板(分别是Greiner 651101和650161)、F-底MTP(Corning9017)用于无压力和LAS/EDTA缓冲液以及suc-AAPF-pNA平板，BiomekFX(Beckman Coulter)、Spectramax Plus 384MTP读数器(MolecularDevices)、Thermo Electron Corporation的iEMS培养箱/摇床(1mm振幅)、封条：Nunc(236366)。
iEMS培养箱/摇床(Thermo/Labsystems)设定为29℃。将培养上清液稀释到含无压力缓冲液的平板中，浓度为～25ppm(主稀释平板)。将主稀释平板的20μl样品加入到含180μl无压力缓冲液的平板中，产生2.5ppm的终孵育浓度。混合内容物，在室温下保持，并在该平板上实施AAPF测定。将主稀释平板的20μl样品也加入到含180μl压力缓冲液(50mMHEPES(11.9g/l)、0.1％(w/v)DOBS(1g/l)、10mM EDTA(3.36g/l)、pH8.0)的平板中。混合溶液，并立即置于29℃iEMS摇床上400rpm30min。在孵育30分钟后，在压力平板上实施AAPF测定。通过如下计算剩余和起始的AAPF活性比例，确定样品的稳定性：
剩余活性(％)＝[mOD.min-1压力的]＊100/[mOD.min-1无压力的]
D.清洁性能测定
在市售去垢剂中确定蛋白酶变体的污渍去除性能。市售去垢剂配方的失活帮助破坏任何蛋白质组分的酶活性，而保留了非酶组分的特性。因而，该方法适合制备用于测试本发明的酶变体的可商购去垢剂。
微样品(Microswatch)测定
订购1/4英寸环状直径的微样品，由CFT(Vlaardingen，TheNetherlands)供货。将单个微样品或两个微样品垂直置于96孔MTP的每个孔中，以暴露整个表面区域(即，不是平铺在孔底)。
BMI微样品测定
从CFT Vlaardingen获得2.5英寸环状直径的含血、奶和墨水(BMI)微样品。在切割微样品前，用水洗涤织物(EMPA 116)。将一个微样品垂直置于96孔微滴度平板的每个孔中，以暴露整个表面区域(即，不是平铺在孔底)。如本文所述制备理想的去垢剂溶液。在Thermomixer中25℃下平衡后，将190μl去垢剂溶液添加到MTP的每个含微样品的孔中。将10μl稀释的酶溶液加入到该混合物中，使得最终的酶浓度是1μg/ml(BCA测定所确定)。用封条密封MTP，并置于孵育箱中30分钟，在1400rpm下搅拌。在合适条件下孵育后，从每个孔转移100μl的溶液至新鲜的MTP中。使用MTP SpectraMax读数器在405nm下，读取含100μl溶液/孔的新MTP。还包括空白对照和含有2个微样品和去垢剂，但不含酶的对照。
烤干的蛋黄(baked egg)微滴度测定
为该测定，从鸡蛋黄制备96孔的烤干的蛋黄底物平板。将鸡蛋黄与蛋白分离，从囊膜中释放，用Milli-Q水稀释20％(体积/重量)。使用磁性搅拌器在室温下搅拌稀释的蛋黄15min。使用8通道移液器，将5μL小心的移入96孔V底平板(Costar#3894)的每个孔的中心处。平板在90℃下烘烤1小时，并在室温下冷却。将烤干的蛋黄底物平板储存在室温下，并在制备的一个星期内使用。如本文所述制备自动化洗碗去垢剂，并预热至50℃。使用8通道移液器，向96孔平板的每个孔添加190μL等份的去垢剂。使用96通道的移液装置，向每个孔添加10μL稀释的酶。用粘附的锡箔封条仔细密封平板，并在50℃下振荡孵育30min。将120μL的反应混合物移至新的96孔平底平板中，并在405nm处确定吸收值/光散射。405nm的吸收值/光散射与蛋黄去除成比例。
蛋黄微样品测定(“CS-38微样品测定”；或“EGG”或“Dish”)
如本文所述制备自动化洗碗去垢剂。使用的仪器包括New BrunswickInnova 4230摇床/孵育箱和SpectraMAX(type 340)MTP读数器。从Costar(type 9017)获得MTP。从Center for Test Materials(Vlaardingen、Netherlands)获得含色素样品(CS-38)的老化蛋黄。在切割0.25英寸的环状微样品前，用水洗涤织物。将一个微样品垂直置于96孔微滴度平板的每个孔中。在50℃下平衡测试去垢剂，将190μl去垢剂溶液添加到MTP的每个含微样品的孔中。将10μl稀释的酶溶液加入到该混合物中。用附着的锡箔密封MTP，并置于孵育箱中30分钟，搅拌。在孵育后，从每个孔转移100μl的溶液至新鲜的MTP中。使用MTP SpectraMax读数器在405nm下读取该MTP。还包括空白对照和含有微样品和去垢剂，但不含酶的对照。
“预洗型”样品(“Pre-washed”Swatch)
该类型的微样品是在环境温度下，在去离子水中预洗涤20分钟。在预洗涤步骤后，将样品放在纸巾表面干燥。然后，将空气干燥的样品在冲压仪(expulsion press)上使用1/4英寸环状模具打孔。最后，将2个微样品垂直置于96孔MTP的每个孔中，以暴露整个表面区域(即，不是平铺在孔底)。
去垢剂
对于北美(NA)和西欧(WE)重垢型液体洗衣(HDL)去垢剂，将预称重的液体去垢剂(在玻璃瓶中)在95℃水浴中进行热失活2小时。所有用于实施例中的去垢剂都是从当地超市购买的市售去垢剂。如本文所述，通过热处理失活这类去垢剂中存在的酶。北美(NA)和日本(JPN)重垢型颗粒洗衣(HDG)去垢剂的热失活孵育时间为8小时，而西欧(WE)HDG去垢剂的热失活孵育时间为5小时.热失活NA和WE自动洗碗(ADW)去垢剂的孵育时间为8小时。在将去垢剂溶解至精确确定的失活百分比的5分钟内，测定未加热和加热的去垢剂。通过AAPF测定测试酶活性。
为了测试热失活的去垢剂中的酶活性，从热失活的储液制备去垢剂的工作液。向去垢剂溶液中加入合适量的水硬度(6gPg或12gPg)和缓冲液，以符合理想的条件。通过漩涡或颠倒瓶子，混合溶液。表1-1提供了关于一些本文使用的市售去垢剂和测试条件的信息。在一些实施方案中，如下列实施例中所述使用额外的和/或其他的市售去垢剂。
＊缩写：Procter&Gamble(P&G)；和Reckitt Benckiser(RB)
酶和仪器
从生长在MTP平板中的培养物的已过滤培养液中获得GCI-P036及其变体的样品。使用的仪器是Biomek FX Robot(Beckman Coulter)、SpectraMAX MTP读数器(340型；Molecular Devices)、iEMS孵育箱/摇床(Thermo/Labsystems)；F-底MTPs(用于孵育后读取反应平板的Costar 9017型)；和V-底MTPs(用于上清液的预稀释的Greiner 651101)。在该测定中，蛋白酶水解底物，并从底物释放色素和不溶性颗粒。因而，浊度的速率是酶活性的测量。
在MTP标尺(scale)中确定市售去垢剂(Calgonit 5in1)中的参照丝氨酸蛋白酶及其变体对微样品上的污渍去除性能。使用从CFTVlaardingen获得的CS-38微样品(含色素的蛋黄，通过加热老化)作为底物。每个孔使用2个微样品。使用Calgonit 5in1的ADW片剂制备去垢剂溶液。为了失活片剂中存在的蛋白酶活性，将21g片剂溶解在温度为60℃的水浴加热的Milli-Q水中。冷却所述溶液至室温，并将水的体积调节至700mL。将溶液进一步用水稀释，达到3g/l的终浓度。通过添加1.46ml的Ca/Mg-混合物(Ca/Mg mixture[(3∶1)，1.92M CaCl2＝282.3g/LCaCl2.2H2O；0.64M MgCl2＝130.1g/L MgCl2.6H2O，15000gpg])，将水硬度调节至21°GH。在10mM NaCl，0.1mM CaCl2，0.005％溶液中预稀释酶样品，并测试合适的浓度。
将孵育箱设定为50℃的理想温度。向V-底平板(即，“稀释平板”)中加入72μl稀释缓冲液，然后8μl上清液。从稀释平板中将9μl加入平板中，所述平板含孵育在171去垢剂溶液中的微样品。从稀释平板中将9μl加入平板中，所述平板含微样品产生200X总稀释度的上清液。用封条覆盖微样品平板(含去垢剂和酶)，并置于孵育箱/摇床中1400rpm30分钟。在孵育后，将75μl反应混合物移至空的F-底平板中，用干发器除气泡后，在MTP读数器中测量405nm的吸光值。空白对照、含一个或两个微样品和去垢剂但未添加含参照蛋白酶的样品也包括在所述测试中。
在MTP标尺(scale)中还确定市售去垢剂(Calgonit 5in1)中的参照丝氨酸蛋白酶及其变体的污渍去除性能。使用的试剂是：5mM HEPES，pH8.0或5mM MOPS，pH7缓冲液，3∶1Ca∶Mg用于中度水硬度。将(CaCl2∶MgCl2·6H2O)；15000格令/加仑(gpg)储液稀释为6gPg，2BMI(血/奶/墨水)样品/平板：由CFT加工的EMPA-116BMI棉样品：预漂洗并每个孔打孔2个样品，热失活冷水型现售去垢剂，其中经验证缺少蛋白酶活性。在本文描述的一些实施方案中，使用下列溶液，如实施例所示。
将培养箱设置成期望的温度(16℃或32℃)。对所述测试，将来自～10ppm酶的主稀释平板的10μL样品加入BMI 2-样品平板中，后者含有190μL上文列举的工作性去垢剂溶液。对于测定平板中的变体，将体积调节为0.5ppm的给定终浓度。将平板立即转移到iEMS孵育箱中，在给定温度下用1400rpm振荡孵育30分钟。孵育后，将100μL上清液移入新的96孔板中，在MTP读数器中测量405nm和/或600nm处的吸光值。含一个或两个微样品和去垢剂但未添加含蛋白酶样品的对照孔也包括在所述测试中。405nm处的测量提供了较高的值，和追踪了色素移动，同时，600nm处的测量追踪了浊度和清洁。
所有微样品测定方法的污渍去除活性的计算
根据空白值(底物不含酶)校正所获得的吸光值，提供水解活性的测量。对于每个样品(变体)，计算性能指数。性能指数比较了相同的蛋白质浓度下的变体(实际值)和标准酶(理论值)的性能。此外，使用标准酶的Langmuir等式的参数，可以计算理论值。
E.蛋白酶及其变体的相对比活
为了区分蛋白酶变体，使用suc-AAPF-pNA作为底物，计算相对比活，使得能够比较和排列变体与野生型或标准蛋白酶。使用上述测定，通过用蛋白水解活性除以每个样品所测量的TCA值，确定对suc-AAPF-pNA底物的比活，使用这些值，计算相对比活(变体的比活/参照蛋白酶的比活)。
F.Eglin C抑制测定
如本文所述，通过用抑制剂滴定，确定丝氨酸蛋白酶浓度和比活。来自水蛭欧洲医蛭(Hirudo medicinalis)的Eglin C是枯草杆菌蛋白酶的紧密结合的蛋白酶抑制剂(Heinz等，Biochemistry，31：8755-66，1992)，因此可用于测量酶浓度，反过来允许计算比活。简而言之，测量若干已知浓度的eglin c产生的酶抑制的量。根据该信息，计算完全抑制所需的eglinc的浓度。这等价于样品中的酶浓度。
使用上述显色的AAPF测定，测量蛋白酶活性。通过标准方法，在大肠杆菌中合成和表达eglin c的基因。它的特性和抑制特性与从Sigma购买的eglin c是相同的。通过测量已知比活的迟缓芽孢杆菌的芽孢杆菌蛋白酶样品的抑制，确定eglin c储液的浓度。任何，经校正的eglin c样品用于确定枯草杆菌蛋白酶变体的浓度和比活。这些值用于产生归一化的96孔酶储液平板，其中所有的变体都稀释为共同的浓度。
G.性能指数
性能指数比较了相同的蛋白质浓度下的变体(实际值)和标准或参照蛋白酶(理论值)的性能。此外，使用标准蛋白酶的Langmuir等式的参数，可以计算理论值。大于1(PI＞1)的性能指数(PI)鉴别出比标准(例如，野生型)更好的变体，而等于1的PI(PI＝1)鉴别出与标准相同性能的变体，小于1的PI(PI＜1)则鉴别出比标准性能差的变体。因而，PI鉴别出优胜者，以及对于在某些环境下使用较不理想的变体。
实施例2
在枯草芽孢杆菌中产生GCI-P036蛋白酶
在本实施例中，如所述在枯草芽孢杆菌中进行实验以产生GCI-P036蛋白酶。如前所述(见例如，WO 2002/014490)，实施编码GCI-P036及其变体的表达载体向枯草芽孢杆菌细胞(ΔaprE、ΔnprE、oppA、ΔspoIIE、degUHy32、ΔamyE：：[xylR，pxylA-comK])的转化。
GCI-P036蛋白酶生产-pAC-GCI-P036ci
提供了在枯草芽孢杆菌中生产GCI-P036(本文中也称为“迟缓芽孢杆菌枯草杆菌蛋白酶”和“GG36”)的示例性方法。使用GCI-P036密码子改良的基因融合在aprE信号序列的第八个密码子处，处于共同序列aprE启动子和BPN’转录终止子的控制下，来装配表达质粒pAC-GG36ci。在下文提供的序列中，粗体和斜体表示共同的aprE启动子，标准字体表示信号序列，下划线表示原序列，粗体字表示编码GCI-P036成熟蛋白酶的DNA，而下划线的斜体字体表示BPN’终止子。GCI-P036成熟蛋白酶的编码区侧翼是用于克隆目的的KpnI和XhoI限制性位点：
atctcaaaaaaatgggtctactaaaatattactccatctattataataaattcacagaatagtcttttaagtaagtctactctgaatttttttaaaaggagagggtaaagagtgagaagcaaaaaattgtggatcgtcgcgtcgaccgcattgctgatttctgttgcttttagctcatccatcgcatccgctgctgaagaagc aaaagaaaaatatttaattggctttaatgagcaggaagctgtcagtgagtttgtagaacaagttgaggcaaatgacgaggtagccattctctctgaggaag aggaagtcgaaattgaattgcttcatgaatttgaaacgattcctgttctgtccgttgagttaagcccagaagatgtggacgcgttagagctcgatccagctat ttcttatattgaagaggatgcagaagtaactacaatggcgcaatcggtaccatggggaattagcagagtacaagccccagctgcacataaccgtggattgacaggttctggtgtaaaagttgctgtccttgataccggtatttccactcatccagacttaaatattcgtggtggagctagctttgtaccaggggaaccatccactcaagatggcaatggacatggcactcatgttgccggcacaatcgcggctcttaacaattcaattggtgttcttggcgtagcgccaagcgcagaactatacgctgttaaagtattaggagcaagcggttcaggctctgtcagctctattgcccaaggattggaatgggcagggaacaatggcatgcacgttgctaatcttagtttaggatctccttcgccaagtgccacacttgagcaagctgttaatagcgcgacttctagaggcgttcttgttgtagcggcctctggaaattcaggtgcaggctcaatcagctatccggcccgttatgcgaacgctatggcagtcggagctactgaccaaaacaacaaccgcgccagcttttcacagtatggcgcagggcttgacattgtcgcaccaggtgtaaacgtgcagagcacttacccaggttcaacatatgccagcttaaacggtacatcaatggctactcctcatgttgcaggtgcggctgcacttgttaaacaaaagaacccatcttggtccaatgtacaaatccgcaatcatcttaagaatacggcaactagcttaggaagcacaaacttgtatggaagcggacttgtcaatgcagaagctgcaactcgttaaaagctta actcgagataaaaaaccggccttggccccgccggttttttat(SEQ ID NO：5).
下文提供了GCI-P036前体蛋白酶的氨基酸序列。在该序列中，信号肽以斜体显示(始于N端甲酰甲硫氨酸)，原序列是下划线的，而成熟的GCI-P036蛋白酶序列是以粗体显示的：
MRSKKLWIVASTALLISVAFSSSIASAAEEAKEKYLIGFNEQEAVSEFVEQVEANDEVAILSEEEEVEI ELLHEFETIPVLSVELSPEDVDALELDPAISYIEEDAEVTTMAQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR(SEQ ID NO：6).
成熟的GCI-P036蛋白酶的氨基酸序列：
AQSVPWGISRVQAPAAHNRGLTGSGVKVAVLDTGISTHPDLNIRGGASFVPGEPSTQDGNGHGTHVAGTIAALNNSIGVLGVAPSAELYAVKVLGASGSGSVSSIAQGLEWAGNNGMHVANLSLGSPSPSATLEQAVNSATSRGVLVVAASGNSGAGSISYPARYANAMAVGATDQNNNRASFSQYGAGLDIVAPGVNVQSTYPGSTYASLNGTSMATPHVAGAAALVKQKNPSWSNVQIRNHLKNTATSLGSTNLYGSGLVNAEAATR(SEQ ID NO：2).
质粒pAC-GG36ci的元件包括：pUB110＝来自质粒pUB110的DNA片段(McKenzie等，Plasmid 15：93-103，1986)、pBR322＝来自质粒pBR322的DNA片段(Bolivar等，Gene 2：95-113，1977)、pC194＝来自质粒pC194的DNA片段(Horinouchi等，J Bacteriol，150：815-825，1982)。质粒特征如下：Ori for B.subtilis＝pUB110的复制起点、CAT＝pC194的氯霉素抗性基因、pMB1起点＝pBR322的复制起点、bla＝pBR322的β内酰胺酶、短aprE启动子＝共同转录启动子、Signal Peptide＝信号肽、ProPeptide＝GCI-P036原区域、GG36ci Mature Peptide＝成熟的GCI-P036(被该文献中表达的每种变体的编码区替换)、BPN’Terminator＝枯草杆菌蛋白酶BPN’的转录终止子。
GCI-P036蛋白酶生产-pHPLT-GCI-P036
描述了在枯草芽孢杆菌中生产GCI-P036参照蛋白酶的其他方法。从合成的寡核苷酸和PCR产物装配编码GCI-P036蛋白酶前体的合成基因。使用BsmBI和HindIII限制性位点，将片段克隆到质粒骨架pHPLT(美国专利号5,024,943)中。pHPLT-GCI-P036成熟的GCI-P036蛋白酶的氨基酸序列(SEQ ID NO：2)与pAC-GG36ci的序列相同。pHPLT枯草芽孢杆菌表达载体含有地衣芽孢杆菌LAT启动子(Plat)和来自pUB110的其他元件(McKenzie等，Plasmid，15：93-103，1986)，包括复制酶基因(reppUB)、新霉素/卡那霉素抗性基因(neo)和博来霉素抗性标志物(bleo)。使用Pure YieldTM Plasmid Midiprep试剂盒(Promega)，从转化的细菌中纯化质粒DNA，并按本领域已知的，通过UV分光光度计确定DNA浓度。通过GCI-P036基因的DNA测序验证最终的载体构建体，表现出与预期序列100％的序列符合度。下文显示了pHPLT-GCI-P036的GCI-P036蛋白酶基因的DNA序列，而克隆位点SacI和HindIII是下划线的：GTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCGTCGCGTCGACCGCACTACTCATTTCTGTTGCTTTCAGTTCATCGATCGCATCGGCTGCTGAAGAAGCAAAAGAAAAATATTTAATTGGCTTTAATGAGCAGGAAGCTGTCAGTGAGTTTGTAGAACAAGTAGAGGCAAATGACGAGGTCGCCATTCTCTCTGAGGAAGAGGAAGTCGAAATTGAATTGCTTCATGAATTTGAAACGATTCCTGTTTTATCCGTTGAGTTAAGCCCAGAAGATGTGGACGCGCTTGAGCTCGATCCAGCGATTTCTTATATTGAAGAGGATGCAGAAGTAACGACAATGGCGCAATCAGTGCCATGGGGAATTAGCCGTGTGCAAGCCCCAGCTGCCCATAACCGTGGATTGACAGGTTCTGGTGTAAAAGTTGCTGTCCTCGATACAGGTATTTCCACTCATCCAGACTTAAATATTCGTGGTGGCGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACCATCCACTCAAGATGGGAATGGGCATGGCACGCATGTGGCCGGGACGATTGCTGCTTTAAACAATTCGATTGGCGTTCTTGGCGTAGCGCCGAGCGCGGAACTATACGCTGTTAAAGTATTAGGGGCGAGCGGTTCAGGTTCGGTCAGCTCGATTGCCCAAGGATTGGAATGGGCAGGGAACAATGGCATGCACGTTGCTAATTTGAGTTTAGGAAGCCCTTCGCCAAGTGCCACACTTGAGCAAGCTGTTAATAGCGCGACTTCTAGAGGCGTTCTTGTTGTAGCGGCATCTGGAAATTCAGGTGCAGGCTCAATCAGCTATCCGGCCCGTTATGCGAACGCAATGGCAGTCGGAGCTACTGACCAAAACAACAACCGCGCCAGCTTTTCACAGTATGGCGCAGGGCTTGACATTGTCGCACCAGGTGTAAACGTGCAGAGCACATACCCAGGTTCAACGTATGCCAGCTTAAACGGTACATCGATGGCTACTCCTCATGTTGCAGGTGCAGCAGCCCTTGTTAAACAAAAGAACCCATCTTGGTCCAATGTACAAATCCGCAATCATCTAAAGAATACGGCAACGAGCTTAGGAAGCACGAACTTGTATGGAAGCGGACTTGTCAATGCAGAAGCTGCAACTCGTTAAAGCTT(SEQ ID NO：7).
重组蛋白酶-2ml标尺(scale)
用96孔复制器将含蛋白酶表达载体的枯草芽孢杆菌克隆从甘油储藏物中复制到含200μl LB基质+25μg/ml氯霉素的96孔培养平板(BD、353075)中，在加湿的封闭空间内37℃、220rpm下生长过夜。将过夜培养物的200μl等份试样用于接种5ml塑料培养管中的2000μl定义的基质+25μg/ml氯霉素。培养基质富含基于MOPS缓冲液的半定义基质，以尿素为主要氮源，葡萄糖为主要碳源，补充了1％大豆蛋白胨强化细胞生长。培养管在37℃、220rpm下孵育60小时。在上述孵育后，以大于8000x RCF离心培养液。将上清溶液弃入15ml的聚丙烯锥形管中储藏。不进行进一步的纯化或浓缩。将上清液储液配制成40％丙二醇终浓度，用于长期稳定性，并储藏在4℃。
重组蛋白酶-微滴度平板(MTP)标尺
可选的，通过在96孔微滴度板(MTP)中的200μL基于MOPS的定义基质(“MBD”)中生长枯草芽孢杆菌转化子，来生产变体蛋白酶。基本如本领域已知的制备MBD基质(见，Neidhardt等，J Bacteriol，119：736-747，1974)，除NH4Cl2、FeSO4和CaCl2被排除在基本培养基之外，使用3mM K2HPO4，并且基础培养基补充了60mM尿毒、75g/L葡萄糖和1％大豆蛋白胨。此外，微量营养物制备成100X储液，一升所述储液含：400mg FeSO4.7H2O、100mg MnSO4.H2O、100mg ZnSO4.7H2O、50mg CuCl2.2H2O、100mg CoCl2.6H2O、100mg NaMoO4.2H2O、100mgNa2B4O7.10H2O、10ml的1M CaCl2和10ml的0.5M柠檬酸钠。平板在37℃孵育68小时，通过离心分离细胞，并从培养基获得目标蛋白。
实施例3
产生GCI-P036变体
在该实施例中，描述了用于生产蛋白酶变体的方法。
GCI-P036位点评估文库(SEL)的产生
使用专利所有的方法(WO 2004/059556A3)，通过GENEART进行SEL生产。出于PCR表达蛋白质的目的，用于优化核苷酸序列的方法和装置，以及利用技术制造DNA分子都由GENEART所有或许可的(欧洲专利号0 200 362和0 201 184；以及美国专利号4,683,195、4,683,202和6,472,184)。该实施例中描述的GCI-P036SEL构建是使用它们的用于基因优化、基因合成和文库生成和分析的方法和技术平台，由GENEART实施的。
GCI-P036SEL是在发明人预先选定的位置由GENEART生产的。用SacI和HindIII限制性酶消化pHPLT-GCI-P036质粒DNA9(见图2)，释放的3.9kb片段随后使用Qiagen凝胶纯化试剂盒从琼脂糖凝胶中纯化。将成熟序列的每个氨基酸突变成至少16种不同的氨基酸。为了构建GCI-P036 SEL，实施了三种PCR反应：两种诱变反应以在成熟的GCI-P036 DNA序列中导入突变的目标密码子，和第三种反应，将2种诱变PCR产物融合在一起，构建在成熟的GCI-P036序列中具有理想的突变密码子的pHPLT-GCI-P036表达载体。
诱变的方法是基于密码子特异性突变方法的，所述方法中使用长度为25至45个核苷酸的正向和反向寡核苷酸引物，在特定的DNA三联体中进行所有可能的突变的一次产生，所述引物是使用特殊设计的三联体DNA序列NNS((A、C、T或G)、(A、C、T或G)、(C或G))，与待突变的密码子序列对应，并确保在特定的目标密码子随机整合核苷酸。用于构建位点评估文库的两种额外引物包括含SacI位点的上游引物，和含HindIII位点的下游引物。每种SEL的构建开始于两步主要的PCR扩增，所述PCR扩增使用正向SacI引物和特定的GCI-P036反向诱变引物，而对于第二步PCR反应，使用反向HindIII引物和特定的GCI-P036正向诱变引物(对于正向和反向诱变引物，GCI-P036成熟的密码子位置相等)。
使用Phusion高保真DNA聚合酶(Finnzymes货号F-530L)实施在成熟的GCI-P036序列中导入突变。根据随聚合酶一起提供的生产商的规程，进行所有的PCR反应。PCR条件如下：
用于初级PCR1：
FW SacI引物和特定的GCI-P036反向诱变引物——均1μL(10μM)；
和
用于初级PCR2：
RV HindIII引物和特定的GCI-P036正向诱变引物——均1μL(10μM)。
下文提供了用于该实施例的引物序列：
每种反应包括：10μL的5X Phusion HF缓冲液，1μL的10mM dNTP混合物，0.75μL的Phusion DNA聚合酶(2单位/μL)，1μL不掺水的DMSO、1μL的pHPLT-GCI-P036模板DNA(0.1-1ng/μL)，和加dH2O至50μL总体积。
使用MJ Research PTC-200Peltier热循环仪按下列程序完成PCR：30秒98℃，30X(10秒98℃，20秒55℃，1分钟72℃)和5分钟72℃。反应产生约2至3kb的两种片段，围绕GCI-P036的成熟的目标密码子具有约30个核苷酸重叠。
使用2种上述片段和正向和反向SacI-Fw和HindIII-Rv引物，在第三步反应中将片段融合。在溶液中进行融合PCR反应，所述溶液含有：1μL各种SacI-Fw和HindIII-Rv引物(10μM)、10μL的5X Phusion HF缓冲液、1μL的10mM dNTP混合物、0.75μL的PhusionTM DNA聚合酶(2单位/μL)、1μL不掺水的DMSO、1μL初级PCR 1反应混合物、1μL初级PCR 2反应混合物和补dH2O至调节终体积为50μL。PCR融合程序如下：30秒98℃，30X(10秒98℃、20秒55℃、40秒72℃)和5min 72℃，使用MJ Research PTC-200 Peltier热循环仪。纯化(使用Qiaquick PCR纯化试剂盒，货号Qiaquick PCR编码GCI-P036基因的所扩增的线性859bp片段，并用SacI和HindIIII限制性酶消化，在融合片段的两侧产生粘性末端。用SacI和HindIIII限制性酶消化约50ng的质粒pHPLT-GCI-P036。分离3.9kb载体骨架片段，并与50ng编码变体酶的已消化的859bp片段连接，根据生产商用于克隆粘性末端的规程，使用T4DNA连接酶(Invitrogen)。之后，如所述(WO 2002/014490)将连接混合物用于转化枯草芽孢杆菌细胞(ΔaprE、ΔnprE、oppA、ΔspoIIE、degUHy32、ΔamyE：：[xylR，pxylA-comK])。
对于每个文库，挑取96个单克隆，并在新霉素选择条件下，生长在TSB(基于胰蛋白胨和大豆的培养液)液体培养基中，进行后续的DNA分离和基因序列分析。文库成员从1至269个，每个编号代表所突变的成熟GCI-P036序列的密码子。每个文库含有最多19种GCI-P036变体。
产生GCI-P036多重突变文库(MML)
每个合成的GCI-P036多重突变文库都含有GCI-P036基因的混合物，其中2个或多个密码子被特定的DNA序列替换。由Sloning BioTechnologyGmbH使用Slonomax Technology对组合的GCI-P036基因进行克隆。下表3-1和3-2列举了MML成员中存在的取代，分别根据GCI-P036参照序列和BPN’参照序列进行编号。
实施例4
GCI-P036变体的性能
描述了进行这样的实验，所述实验用于确定各种单取代GCI-P036变体在BMI测定(Cold；32℃，pH8)和CS-38微样品测定(WE ADW)中的污渍去除性能。还确定了关于LAS/EDTA稳定性、AAPF活性和蛋白质含量的性能指数。所有测定都使用实施例1的方法实施。
表4-1显示269个位置上的4,210个枯草杆菌蛋白酶GCI-P036的变体的性能指数值。将变体GCI-P036的性能与野生型GCI-P036酶相比。具有大于1的性能指数(PI＞1)的那些变体具有改善的性能。而性能指数小于或等于0.05则固定为0.05，并在表中以粗斜体表示。对于稳定性测量，如果稳定性测定中的活性的性能指数小于或等于0.05，则将相关的稳定性性能指数定为值ND，即不能确定的。此外，没有确定的值的变体也列为ND。
性能指数(PI)是变体与亲本或参照蛋白酶的性能比例。下文提出的各种术语用于描述所述突变：高表达突变(up mutation)具有PI＞1；中性突变具有PI＞0.5；无害突变具有PI＞0.05；有害突变具有PI＝0.05；可组合的突变是这样的突变，即，所述变体具有至少一种特性的性能指数值＝0.5，而对于所有的特性＞0.05。可组合的突变是这样的突变，即，所述突变可以组合使蛋白质的一种或多种理想的特性具有适当的性能指数。将发生突变的位置分类如下：非限制性位置对至少一种特性具有≥20％中性突变；而限制性位置对活性和稳定性具有＜20％中性突变。
这些数据可用于改造任何的枯草杆菌蛋白酶/subtilase。即使待改造的subtilase在特定的位置具有不同于枯草杆菌蛋白酶GCI-P036的氨基酸，通过鉴别进行取代的最佳选择，包括取代GCI-P036野生型氨基酸，这些数据可用于发现可以改变理想特性的取代。
实施例5
GCI-P036变体数据的比较性评估
在该实施方案中，比较了这样的实验结果，所述实验是对确定GCI-P036和GCI-PO36变体的蛋白酶表达、污渍去除活性、LAS/EDTA稳定性和AAPF活性(对目标特性的测试)。如全文所述，以性能指数(PI)定量化GCI-PO36变体的功能，所述性能指数是变体相对于参照蛋白酶的性能的比例。用于本文的PI分类包括：上突变(PI＞1.0)；中性突变(PI＞0.5)；无害突变(PI＞0.05)；和有害突变(PI≤0.05)。
在GCI-PO36变体的初筛中，下列位置上的至少一种突变是与至少一种特性的大于1.0(PI＞1.0)的性能指数相关：1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，32，33，34，35，36，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，59，60，61，62，63，66，67，68，69，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，165，166，167，168，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，221，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，266，267、268、269、270、271、272、273、274和275(例如，上突变)。在这些位置上的突变可以组合以改善活性或稳定性或表达。
特别而言，GCI-P036的下列取代与在至少一种目标测试中的有利结果相关(例如，优于野生型酶)。这类突变对改善单个特性是特别有效的。如本文别处所示，在该列表中，开头的“0”是为了为每个位点提供三位数命名而被囊括的(例如，“001”与“1”相同，所以“A001C”与“A1C”相同)。此外，如本文使用的，“X”指任何氨基酸。
X001A，X001C，X001E，X001F，X001G，X001H，X001I，X001K，X001L，X001N，X001P，X001Q，X001R，X001S，X001T，X001V，X001Y，X002A，X002C，X002E，X002G，X002K，X002L，X002M，X002N，X002P，X002Q，X002R，X002S，X002T，X002V，X002W，X002Y，X003D，X003E，X003F，X003G，X003H，X003I，X003L，X003M，X003N，X003P，X003R，X003S，X003T，X003V，X003W，X003Y，X004A，X004C，X004D，X004E，X004F，X004G，X004H，X004K，X004L，X004N，X004P，X004R，X004S，X004T，X004V，X004W，X005A，X005C，X005D，X005E，X005G，X005I，X005M，X005P，X005Q，X005S，X005T，X005W，X005Y，X006A，X006D，X006E，X006M，X006W，X007A，X007C，X007D，X007G，X007H，X007N，X007P，X007Q，X007S，X007T，X008A，X008F，X008G，X008I，X008L，X008M，X008Q，X008T，X008V，X008W，X008Y，X009A，X009C，X009D，X009E，X009F，X009G，X009H，X009L，X009N，X009P，X009Q，X009R，X009S，X009T，X009V，X009W，X009Y，X010A，X010C，X010F，X010G，X010H，X010I，X010K，X010L，X010M，X010N，X010Q，X010R，X010S，X010T，X010V，X010W，X010Y，X011A，X011C，X011D，X011G，X011I，X011M，X011S，X011T，X011V，X012D，X012F，X012G，X012H，X012I，X012K，X012L，X012M，X012N，X012P，X012Q，X012R，X012S，X012T，X012V，X012W，X013A，X013G，X013I，X013M，X013Q，X013T，X013V，X014A，X014C，X014D，X014E，X014F，X014G，X014H，X014I，X014K，X014L，X014P，X014Q，X014S，X014T，X014V，X014Y，X015A，X015D，X015F，X015G，X015I，X015K，X015L，X015M，X015P，X015Q，X015R，X015S，X015V，X015W，X016A，X016D，X016E，X016G，X016L，X016N，X016P，X016Q，X016R，X016S，X016T，X016V，X017A，X017D，X017E，X017F，X017G，X017H，X017I，X017K，X017M，X017N，X017R，X017S，X017T，X017V，X017W，X017Y，X018A，X018C，X018D，X018E，X018F，X018G，X018H，X018K，X018L，X018M，X018N，X018P，X018Q，X018R，X018S，X018T，X018V，X018W，X018Y，X019A，X019C，X019D，X019E，X019F，X019G，X019H，X019K，X019L，X019M，X019N，X019P，X019R，X019S，X019T，X019V，X019W，X019Y，X020A，X020C，X020D，X020F，X020G，X020I，X020K，X020L，X020M，X020P，X020Q，X020R，X020S，X020T，X020V，X020W，X020Y，X021A，X021C，X021D，X021E，X021G，X021H，X021I，X021K，X021L，X021M，X021N，X021P，X021Q，X021R，X021S，X021T，X021V，X021W，X022A，X022C，X022G，X022I，X022K，X022L，X022M，X022N，X022P，X022Q，X022R，X022S，X022T，X022V，X022W，X022Y，X023A，X023G，X023S，X024A，X024C，X024D，X024F，X024G，X024H，X024L，X024M，X024N，X024P，X024Q，X024R，X024S，X024T，X024V，X024W，X025C，X025D，X025E，X025F，X025G，X025H，X025K，X025L，X025M，X025N，X025Q，X025R，X025S，X025T，X025V，X025W，X026C，X026F，X026G，X026I，X026L，X026M，X026N，X026P，X026R，X026S，X026T，X026V，X027A，X027C，X027D，X027F，X027G，X027I，X027K，X027L，X027M，X027N，X027P，X027R，X027S，X027T，X027V，X027W，X027Y，X028A，X028E，X028H，X028I，X028L，X028M，X028N，X028S，X028V，X028Y，X029A，X029C，X029G，X029K，X029S，X029T，X029V，X030C，X030D，X030E，X030F，X030L，X030M，X030Q，X030S，X030T，X030V，X031A，X031F，X031I，X031L，X031M，X031S，X031T，X031V，X032C，X032D，X032G，X033A，X033C，X033D，X033E，X033G，X033H，X033I，X033L，X033M，X033N，X033Q，X033R，X033S，X033T，X033V，X033Y，X034E，X034G，X034S，X035A，X035F，X035H，X035I，X035K，X035L，X035M，X035P，X035Q，X035R，X035S，X036A，X036C，X036E，X036F，X036G，X036H，X036I，X036L，X036M，X036N，X036P，X036Q，X036R，X036S，X036T，X036V，X036W，X036Y，X038C，X038F，X038G，X038H，X038I，X038K，X038L，X038M，X038N，X038Q，X038R，X038T，X038V，X038W，X038Y，X039A，X039E，X039G，X039H，X039N，X039Q，X039S，X039T，X039V，X039Y，X040A，X040C，X040D，X040E，X040G，X040H，X040I，X040K，X040L，X040M，X040N，X040P，X040R，X040S，X040T，X040V，X040W，X040Y，X041C，X041D，X041E，X041N，X041Q，X042A，X042C，X042F，X042G，X042H，X042I，X042L，X042M，X042N，X042Q，X042S，X042T，X042V，X042Y，X043A，X043C，X043D，X043E，X043F，X043G，X043I，X043L，X043M，X043N，X043P，X043R，X043S，X043T，X043V，X043W，X043Y，X044A，X044C，X044D，X044F，X044G，X044I，X044K，X044L，X044M，X044N，X044P，X044Q，X044R，X044S，X044T，X044V，X044W，X044Y，X045A，X045D，X045F，X045G，X045H，X045I，X045K，X045L，X045M，X045N，X045P，X045Q，X045R，X045S，X045T，X045V，X045W，X045Y，X046C，X046D，X046E，X046F，X046G，X046H，X046I，X046K，X046L，X046M，X046N，X046P，X046Q，X046R，X046S，X046T，X046V，X046W，X047A，X047C，X047E，X047F，X047G，X047H，X047K，X047L，X047M，X047N，X047Q，X047R，X047S，X047T，X047W，X048A，X048C，X048E，X048F，X048G，X048H，X048I，X048K，X048L，X048M，X048N，X048P，X048Q，X048R，X048S，X048T，X048V，X048Y，X049A，X049E，X049F，X049G，X049H，X049K，X049L，X049M，X049P，X049Q，X049R，X049S，X049T，X050C，X050F，X050H，X050I，X050L，X050N，X050T，X050V，X050Y，X051F，X051G，X051H，X051K，X051L，X051N，X051P，X051R，X051S，X051T，X051V，X051W，X052A，X052C，X052E，X052F，X052G，X052H，X052I，X052L，X052M，X052N，X052P，X052Q，X052R，X052T，X052V，X052W，X052Y，X053A，X053C，X053D，X053E，X053G，X053H，X053I，X053K，X053L，X053M，X053P，X053Q，X053R，X053S，X053T，X053V，X053W，X053Y，X054A，X054C，X054D，X054E，X054F，X054G，X054H，X054I，X054K，X054L，X054M，X054N，X054P，X054Q，X054R，X054S，X054V，X054Y，X055A，X055C，X055E，X055F，X055G，X055H，X055I，X055K，X055L，X055M，X055N，X055P，X055Q，X055R，X055S，X055T，X055W，X055Y，X056A，X056C，X056D，X056E，X056H，X056L，X056M，X056N，X056P，X056Q，X056R，X056S，X056T，X056V，X057A，X057C，X057E，X057F，X057G，X057H，X057I，X057K，X057L，X057M，X057N，X057P，X057Q，X057R，X057S，X057T，X057V，X057W，X057Y，X059A，X059C，X059D，X059E，X059F，X059G，X059I，X059L，X059M，X059N，X059P，X059Q，X059R，X059S，X059T，X059V，X059W，X059Y，X060A，X060C，X060D，X060F，X060G，X060K，X060L，X060M，X060N，X060P，X060Q，X060S，X060T，X060V，X060W，X060Y，X061A，X061C，X061D，X061F，X061G，X061H，X061I，X061L，X061M，X061N，X061P，X061R，X061S，X061T，X061V，X061Y，X062C，X062E，X062F，X062G，X062H，X062I，X062K，X062L，X062M，X062N，X062P，X062Q，X062R，X0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X204W，X204Y，X205A，X205F，X205G，X205I，X205L，X205M，X205Q，X205T，X205V，X206A，X206C，X206D，X206E，X206F，X206G，X206H，X206I，X206K，X206L，X206N，X206P，X206Q，X206R，X206S，X206T，X206V，X206W，X206Y，X207A，X207G，X207S，X208A，X208C，X208L，X208N，X208P，X208S，X208T，X208V，X209A，X209C，X209D，X209E，X209F，X209G，X209H，X209I，X209K，X209L，X209M，X209N，X209R，X209S，X209T，X209V，X209W，X209Y，X210A，X210C，X210D，X210E，X210F，X210G，X210H，X210I，X210L，X210M，X210N，X210P，X210Q，X210R，X210S，X210V，X210W，X210Y，X211A，X211C，X211E，X211F，X211G，X211H，X211I，X211L，X211M，X211P，X211Q，X211R，X211T，X211V，X211W，X211Y，X212C，X212F，X212G，X212H，X212I，X212M，X212N，X212P，X212R，X212S，X212T，X212V，X212Y，X213A，X213C，X213D，X213E，X213F，X213G，X213I，X213K，X213L，X213M，X213N，X213P，X213Q，X213R，X213S，X213T，X213V，X213W，X213Y，X214A，X214C，X214E，X214F，X214G，X214H，X214I，X214K，X214L，X214M，X214N，X214P，X214Q，X214R，X214S，X214T，X214V，X214W，X214Y，X215A，X215C，X215D，X215E，X215F，X215G，X215H，X215I，X215K，X215M，X215N，X215P，X215R，X215S，X215T，X215V，X215W，X215Y，X216A，X216C，X216D，X216E，X216F，X216G，X216H，X216I，X216K，X216L，X216M，X216N，X216P，X216Q，X216R，X216S，X216V，X216W，X216Y，X217A，X217C，X217D，X217E，X217F，X217G，X217I，X217K，X217L，X217M，X217N，X217Q，X217S，X217T，X217V，X217Y，X218C，X218D，X218E，X218F，X218G，X218H，X218I，X218L，X218M，X218N，X218P，X218Q，X218R，X218S，X218T，X218V，X218W，X218Y，X219A，X219G，X220A，X220G，X220H，X220N，X220S，X220T，X220V，X221G，X221S，X222A，X222C，X222E，X222F，X222G，X222I，X222K，X222L，X222M，X222N，X222P，X222Q，X222R，X222S，X222T，X222V，X222W，X223A，X223C，X223G，X223M，X223S，X224A，X224D，X224E，X224G，X224I，X224L，X224N，X224P，X224S，X224T，X225A，X225C，X225G，X225N，X225P，X225S，X225T，X225V，X226C，X226F，X226G，X226H，X226I，X226L，X226M，X226N，X226R，X226S，X226T，X226V，X226Y，X227A，X227C，X227F，X227G，X227I，X227L，X227M，X227Q，X227S，X227T，X227V，X227Y，X228A，X228C，X228G，X228I，X228L，X228M，X228S，X228V，X229A，X229G，X229P，X229S，X230A，X230D，X230E，X230F，X230G，X230H，X230I，X230L，X230N，X230P，X230Q，X230S，X230T，X230V，X230W，X230Y，X231A，X231C，X231F，X231G，X231H，X231I，X231L，X231S，X231T，X231W，X231Y，X232A，X232G，X232H，X232L，X232M，X232S，X232V，X233A，X233C，X233E，X233F，X233G，X233I，X233L，X233M，X233N，X233P，X233Q，X233R，X233S，X233T，X233V，X233Y，X234D，X234F，X234G，X234H，X234L，X234M，X234N，X234P，X234Q，X234S，X234T，X234V，X234Y，X235C，X235D，X235E，X235F，X235G，X235H，X235I，X235K，X235L，X235M，X235N，X235Q，X235R，X235S，X235V，X235W，X235Y，X236A，X236C，X236E，X236F，X236G，X236H，X236K，X236L，X236N，X236P，X236Q，X236R，X236S，X236T，X236V，X236W，X236Y，X237A，X237C，X237F，X237G，X237H，X237I，X237K，X237L，X237M，X237P，X237Q，X237R，X237S，X237T，X237V，X237W，X237Y，X238C，X238D，X238E，X238F，X238G，X238H，X238I，X238K，X238L，X238M，X238N，X238Q，X238R，X238S，X238T，X238V，X238Y，X239C，X239D，X239F，X239G，X239H，X239I，X239K，X239L，X239M，X239N，X239P，X239Q，X239R，X239S，X239T，X239V，X239W，X239Y，X240A，X240C，X240E，X240F，X240I，X240K，X240L，X240M，X240N，X240Q，X240R，X240S，X240T，X240W，X240Y，X241A，X241C，X241D，X241E，X241F，X241G，X241H，X241I，X241K，X241L，X241M，X241N，X241P，X241Q，X241R，X241S，X241T，X241V，X241W，X241Y，X242A，X242C，X242D，X242F，X242G，X242H，X242I，X242L，X242M，X242P，X242Q，X242R，X242S，X242T，X242V，X242W，X243C，X243D，X243E，X243F，X243G，X243H，X243I，X243K，X243L，X243M，X243N，X243P，X243Q，X243R，X243S，X243T，X243V，X243W，X244A，X244D，X244E，X244F，X244H，X244I，X244L，X244M，X244N，X244P，X244Q，X244R，X244S，X244T，X244V，X244W，X244Y，X245A，X245C，X245E，X245G，X245H，X245K，X245L，X245P，X245Q，X245R，X245S，X245V，X245W，X245Y，X246A，X246C，X246E，X246F，X246G，X246H，X246I，X246L，X246M，X246N，X246P，X246Q，X246R，X246S，X246T，X246V，X246W，X246Y，X247A，X247C，X247D，X247E，X247F，X247G，X247H，X247I，X247K，X247L，X247M，X247N，X247P，X247Q，X247R，X247S，X247T，X247V，X247W，X247Y，X248C，X248D，X248E，X248G，X248H，X248I，X248K，X248L，X248M，X248N，X248P，X248R，X248S，X248T，X248V，X248W，X248Y，X249A，X249D，X249E，X249F，X249G，X249H，X249I，X249K，X249L，X249M，X249N，X249Q，X249R，X249S，X249T，X249V，X249W，X249Y，X250A，X250C，X250E，X250F，X250G，X250H，X250I，X250L，X250M，X250N，X250Q，X250S，X250V，X250Y，X251A，X251D，X251E，X251F，X251G，X251K，X251L，X251M，X251P，X251Q，X251R，X251S，X251T，X251V，X251Y，X252A，X252C，X252D，X252F，X252G，X252H，X252I，X252K，X252L，X252M，X252N，X252P，X252R，X252S，X252V，X252W，X252Y，X253A，X253D，X253E，X253F，X253G，X253H，X253I，X253K，X253M，X253R，X253S，X253T，X253V，X253W，X254A，X254C，X254D，X254G，X254N，X254P，X254S，X254T，X254V，X255A，X255C，X255D，X255E，X255F，X255H，X255I，X255L，X255N，X255P，X255Q，X255R，X255S，X255T，X255V，X255W，X255Y，X256A，X256C，X256D，X256E，X256G，X256H，X256I，X256K，X256L，X256M，X256N，X256P，X256R，X256S，X256T，X256V，X256W，X256Y，X257A，X257C，X257E，X257F，X257G，X257H，X257I，X257K，X257L，X257M，X257P，X257S，X257T，X257V，X257W，X257Y，X258A，X258C，X258D，X258E，X258F，X258G，X258H，X258I，X258L，X258M，X258P，X258Q，X258R，X258S，X258T，X258V，X258W，X258Y，X259A，X259C，X259E，X259G，X259I，X259L，X259M，X259P，X259Q，X259R，X259S，X259T，X259V，X260A，X260D，X260E，X260F，X260H，X260I，X260L，X260M，X260N，X260P，X260R，X260S，X260T，X260V，X260Y，X261A，X261C，X261E，X261F，X261G，X261I，X261K，X261L，X261N，X261P，X261Q，X261R，X261S，X261T，X261V，X261W，X261Y，X262A，X262C，X262D，X262F，X262G，X262H，X262I，X262K，X262L，X262M，X262P，X262Q，X262R，X262S，X262T，X262V，X262W，X262Y，X263A，X263C，X263D，X263F，X263G，X263H，X263I，X263L，X263M，X263N，X263P，X263Q，X263R，X263W，X263Y，X264A，X264C，X264E，X264F，X264G，X264H，X264I，X264P，X264Q，X264S，X264V，X264Y，X265A，X265C，X265D，X265F，X265G，X265H，X265I，X265K，X265L，X265M，X265P，X265Q，X265R，X265S，X265T，X265V，X265W，X265Y，X266G，X266W，X267A，X267C，X267D，X267E，X267F，X267G，X267H，X267I，X267K，X267L，X267M，X267N，X267S，X267T，X267V，X267Y，X268A，X268D，X268E，X268G，X268H，X268K，X268L，X268M，X268N，X268P，X268Q，X268R，X268S，X268V，X268W，X268Y，X269C，X269D，X269F，X269G，X269H，X269I，X269L，X269M，X269N，X269Q，X269R，X269S，X269T，X269V，X270A，X270C，X270D，X270E，X270F，X270G，X270H，X270I，X270L，X270M，X270N，X270P，X270Q，X270S，X270T，X270V，X271A，X271C，X271E，X271F，X271G，X271H，X271I，X271K，X271L，X271M，X271N，X271P，X271T，X271V，X271Y，X272A，X272C，X272D，X272E，X272F，X272G，X272H，X272K，X272L，X272M，X272N，X272P，X272R，X272S，X272T，X272W，X272Y，X273A，X273C，X273D，X273E，X273F，X273G，X273H，X273I，X273K，X273L，X273R，X273S，X273T，X273V，X273W，X273Y，X274A，X274C，X274D，X274E，X274G，X274H，X274K，X274L，X274M，X274N，X274P，X274Q，X274R，X274S，X274T，X274W，X275A，X275C，X275D，X275E，X275F，X275G、X275H、X275K、X275L、X275M、X275P、X275Q、X275R、X275V、X275W、X275W。相反，在位置64、65和70的位置上的初筛没有鉴别出任何与至少一种特性的性能指数大于1.0(PI＞1.0)相关的突变。
在筛选GCI-P036变体过程中，在下列248个位置中至少一个突变是关于BMI、CS-38微样品测定或AAPF活性具有大于约1的性能指数相关的，并且在LAS稳定性或TCA测定中具有大于0.8的性能指数：1、2、3、4、5，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，33，35，36，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，59，60，61，62，63，66，68，69，71，72，73，74，75，76，77，78，79，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，156，158，159，160，165，166，167，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，191，192，194，195，196，197，198，199，200，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，220，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263、264、265、267、268、269、270、271、272、273、274和275。在这些位置的突变可以组合，以改善活性而同时维持稳定性或表达。在这些位置的突变还可以组合，以产生具有改善的活性性或表达，同时保留或增强活性的变体。
下表提供了这样的取代，所述取代对于BMI、CS-38微样品测定或AAPF测定，具有大于1的性能指数，对于LAS稳定性或在TCA测定中具有大于0.8的性能指数(如本文使用的，“X”指任意氨基酸)。这类突变可以组合，以改善活性而同时维持或增强稳定性或表达，或者改善稳定性或表达，同时维持或增强活性：X001A、X001C、X001E、X001F、X001G，X001H，X001I，X001K，X001L，X001N，X001Q，X001R，X001S，X001T，X001V，X001Y，X002A，X002C，X002E，X002G，X002K，X002L，X002M，X002N，X002P，X002Q，X002R，X002S，X002T，X002V，X002W，X002Y，X003D，X003E，X003F，X003G，X003H，X003I，X003L，X003M，X003N，X003P，X003R，X003S，X003T，X003V，X003W，X003Y，X004A，X004C，X004D，X004E，X004F，X004H，X004K，X004L，X004N，X004P，X004R，X004S，X004T，X004V，X004W，X005A，X005C，X005D，X005E，X005G，X005P，X005Q，X005S，X005T，X007A，X007C，X007D，X007G，X007H，X007N，X007S，X007T，X008A，X008F，X008I，X008L，X008M，X008T，X008V，X009D，X009E，X009F，X009G，X009H，X009L，X009N，X009P，X009Q，X009R，X009S，X009T，X009V，X009W，X009Y，X010A，X010C，X010G，X010H，X010K，X010M，X010N，X010Q，X010R，X010S，X010T，X010W，X011A，X011I，X011M，X011S，X011V，X012D，X012F，X012G，X012H，X012I，X012K，X012L，X012M，X012N，X012Q，X012R，X012S，X012T，X012V，X012W，X013A，X013G，X013I，X013T，X013V，X014A，X014D，X014E，X014F，X014H，X014I，X014K，X014L，X014P，X014Q，X014S，X014T，X014V，X014Y，X015A，X015D，X015F，X015G，X015I，X015K，X015L，X015M，X015P，X015Q，X015R，X015S，X015V，X015W，X016A，X016G，X016L，X016N，X016P，X016Q，X016S，X016T，X016V，X017A，X017F，X017H，X017I，X017K，X017M，X017N，X017R，X017S，X017V，X017W，X017Y，X018A，X018C，X018D，X018E，X018F，X018G，X018H，X018K，X018L，X018M，X018N，X018P，X018Q，X018R，X018S，X018T，X018V，X018W，X018Y，X019A，X019C，X019D，X019E，X019F，X019G，X019H，X019K，X019L，X019M，X019N，X019R，X019S，X019T，X019V，X019W，X019Y，X020A，X020C，X020D，X020F，X020G，X020I，X020K，X020L，X020M，X020P，X020Q，X020R，X020S，X020T，X020V，X020W，X020Y，X021A，X021C，X021D，X021E，X021G，X021H，X021I，X021K，X021L，X021M，X021N，X021P，X021Q，X021R，X021S，X021T，X021V，X021W，X022A，X022C，X022G，X022I，X022K，X022L，X022M，X022N，X022P，X022Q，X022R，X022S，X022T，X022V，X022W，X022Y，X023A，X023G，X023S，X024A，X024C，X024D，X024F，X024G，X024H，X024L，X024M，X024N，X024P，X024Q，X024R，X024S，X024T，X024V，X024W，X025C，X025D，X025E，X025F，X025G，X025H，X025K，X025L，X025M，X025N，X025Q，X025R，X025S，X025T，X025V，X025W，X026C，X026F，X026G，X026I，X026L，X026M，X026N，X026P，X026R，X026S，X026T，X026V，X027A，X027C，X027D，X027F，X027G，X027I，X027K，X027L，X027M，X027N，X027P，X027R，X027S，X027T，X027V，X027W，X027Y，X028A，X028E，X028H，X028I，X028L，X028M，X028N，X028S，X028V，X029A，X029C，X029G，X029S，X029V，X030C，X030E，X030L，X030S，X030T，X030V，X031A，X031F，X031I，X031L，X031M，X031S，X031T，X031V，X033A，X033D，X033E，X033G，X033H，X033M，X033N，X033Q，X033S，X033T，X033Y，X035A，X035F，X035I，X035L，X035M，X035P，X036A，X036C，X036E，X036F，X036G，X036H，X036I，X036L，X036M，X036N，X036Q，X036R，X036S，X036T，X036V，X038C，X038F，X038G，X038H，X038I，X038K，X038L，X038M，X038N，X038Q，X038R，X038T，X038V，X038W，X038Y，X039H，X039V，X040A，X040C，X040D，X040E，X040G，X040H，X040I，X040K，X040L，X040M，X040N，X040P，X040R，X040S，X040T，X040V，X040W，X040Y，X041D，X041E，X042C，X042H，X042I，X042L，X042M，X042N，X042T，X042V，X043A，X043C，X043D，X043E，X043F，X043G，X043I，X043L，X043M，X043N，X043P，X043R，X043S，X043T，X043V，X043W，X043Y，X044A，X044C，X044D，X044G，X044I，X044K，X044L，X044M，X044N，X044P，X044Q，X044R，X044S，X044T，X044V，X044W，X044Y，X045A，X045D，X045F，X045G，X045H，X045I，X045K，X045L，X045M，X045N，X045P，X045Q，X045R，X045S，X045T，X045V，X045W，X045Y，X046C，X046D，X046E，X046F，X046G，X046H，X046I，X046K，X046L，X046M，X046N，X046P，X046Q，X046R，X046S，X046T，X046V，X046W，X047A，X047F，X047G，X047N，X047R，X047S，X047T，X047W，X048A，X048C，X048E，X048F，X048G，X048H，X048I，X048K，X048L，X048M，X048N，X048P，X048Q，X048R，X048S，X048T，X048V，X048Y，X049A，X049F，X049G，X049L，X049M，X049P，X049S，X049T，X050C，X050F，X050H，X050I，X050L，X050N，X050T，X050V，X050Y，X051F，X051G，X051H，X051K，X051L，X051N，X051P，X051R，X051S，X051T，X051V，X051W，X052A，X052C，X052E，X052F，X052G，X052H，X052I，X052L，X052M，X052N，X052P，X052Q，X052R，X052T，X052V，X052W，X052Y，X053A，X053C，X053D，X053E，X053G，X053H，X053K，X053L，X053M，X053P，X053Q，X053R，X053S，X053T，X053V，X053W，X053Y，X054A，X054C，X054D，X054E，X054F，X054I，X054M，X054N，X054Q，X054S，X054V，X055A，X055C，X055E，X055F，X055G，X055H，X055I，X055K，X055L，X055M，X055N，X055P，X055Q，X055S，X055T，X055W，X055Y，X056A，X056C，X056D，X056E，X056H，X056L，X056M，X056N，X056P，X0560，X056S，X056T，X057A，X057C，X057E，X057F，X057G，X057H，X057I，X057K，X057L，X057M，X057N，X057P，X057Q，X057R，X057S，X057T，X057V，X057W，X057Y，X059A，X059C，X059D，X059E，X059F，X059G，X059I，X059L，X059M，X059N，X059P，X059Q，X059R，X059S，X059T，X059V，X059W，X059Y，X060D，X060S，X060V，X061A，X061C，X061D，X061F，X061G，X061H，X061I，X061L，X061M，X061N，X061P，X061R，X061S，X061T，X061V，X061Y，X062C，X062E，X062F，X062G，X062H，X062I，X062K，X062L，X062M，X062N，X062P，X062Q，X062R，X062S，X062T，X062V，X062Y，X063A，X063C，X063D，X063E，X063F，X063G，X063H，X063K，X063M，X063Q，X063R，X063S，X063W，X066K，X066S，X066T，X068I，X068T，X068V，X069A，X069E，X069G，X069N，X069S，X069T，X071A，X071I，X071N，X071T，X071V，X072C，X072F，X072I，X072L，X072M，X072T，X072V，X073A，X073C，X073D，X073E，X073H，X073K，X073L，X073N，X073S，X073T，X073V，X074A，X074C，X074S，X075A，X075H，X075I，X075L，X075M，X075N，X075P，X075Q，X075R，X075S，X075V，X076D，X076E，X076F，X076G，X076H，X076K，X076M，X076N，X076Q，X076R，X076S，X076T，X076W，X076Y，X077D，X077N，X078A，X078C，X078E，X078F，X078G，X078H，X078I，X078K，X078L，X078M，X078N，X078P，X078Q，X078R，X078S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172G，X172I，X172K，X172L，X172M，X172P，X172Q，X172R，X172S，X172T，X172V，X172Y，X173A，X173C，X173D，X173E，X173F，X173G，X173H，X173K，X173L，X173M，X173N，X173Q，X173R，X173T，X173V，X173W，X174A，X174G，X174S，X174T，X174V，X175A，X175C，X175I，X175L，X175M，X175Q，X175T，X175V，X175Y，X176A，X176G，X176S，X177A，X177C，X177I，X177T，X177V，X178A，X178G，X179A，X179G，X180C，X180I，X180L，X180S，X180T，X180V，X181D，X181N，X182A，X182D，X182E，X182F，X182G，X182H，X182I，X182K，X182L，X182M，X182N，X182P，X182Q，X182R，X182S，X182T，X182V，X182W，X182Y，X183A，X183D，X183F，X183G，X183H，X183I，X183K，X183L，X183M，X183N，X183Q，X183R，X183S，X183T，X183V，X183W，X183Y，X184D，X184N，X185A，X185C，X185E，X185F，X185G，X185H，X185I，X185K，X185L，X185M，X185N，X185Q，X185R，X185S，X185T，X185V，X185Y，X186H，X186I，X186K，X186L，X186R，X187A，X187P，X187W，X188A，X188D，X188E，X188F，X188G，X188H，X188I，X188K，X188L，X188P，X188Q，X188R，X188S，X188T，X188V，X188W，X188Y，X191D，X191Q，X192W，X192Y，X194A，X194C，X194D，X194E，X194F，X194G，X194H，X194I，X194L，X194M，X194P，X194Q，X194R，X194S，X194T，X194V，X194W，X194Y，X195A，X195C，X195D，X195E，X195G，X195Q，X195Y，X196L，X196M，X197A，X197C，X197D，X197E，X197G，X197N，X197Q，X197S，X197T，X198A，X198F，X198G，X198H，X198I，X198L，X198M，X198N，X198R，X198S，X198T，X198Y，X199A，X199C，X199I，X199M，X199S，X199T，X199V，X200A，X200C，X200G，X200S，X203A，X203C，X203E，X203I，X203L，X203S，X203T，X203V，X204A，X204C，X204E，X204F，X204G，X204I，X204K，X204L，X204N，X204R，X204S，X204T，X204W，X204Y，X205I，X205T，X205V，X206A，X206C，X206D，X206E，X206G，X206H，X206I，X206K，X206L，X206N，X206P，X206Q，X206R，X206S，X206T，X206V，X206W，X206Y，X207A，X207S，X208C，X208L，X208S，X208T，X208V，X209A，X209C，X209F，X209G，X209H，X209I，X209K，X209L，X209M，X209N，X209R，X209S，X209V，X209W，X209Y，X210A，X210C，X210E，X210G，X210H，X210I，X210L，X210M，X210N，X210P，X210R，X210S，X210V，X210Y，X211A，X211C，X211E，X211F，X211G，X211H，X211I，X211L，X211M，X211P，X211Q，X211R，X211T，X211V，X211W，X211Y，X212C，X212F，X212G，X212H，X212I，X212M，X212N，X212P，X212R，X212S，X212T，X212V，X212Y，X213A，X213C，X213D，X213E，X213F，X213G，X213I，X213K，X213L，X213M，X213N，X213Q，X213R，X213S，X213T，X213V，X213W，X213Y，X214F，X214L，X214W，X214Y，X215A，X215C，X215D，X215E，X215F，X215G，X215H，X215I，X215K，X215M，X215N，X215P，X215R，X215S，X215T，X215V，X215W，X215Y，X216A，X216C，X216D，X216E，X216F，X216G，X216H，X216I，X216K，X216L，X216M，X216N，X216P，X216Q，X216R，X216S，X216V，X216W，X216Y，X217A，X217C，X217E，X217F，X217G，X217I，X217K，X217L，X217M，X217Q，X218C，X218D，X218E，X218F，X218G，X218H，X218I，X218M，X218N，X218Q，X218R，X218S，X218T，X218V，X218Y，X220S，X220T，X222A，X222M，X222Q，X223A，X223G，X223S，X224A，X224G，X224L，X224N，X224S，X224T，X225C，X225P，X226C，X226F，X226H，X226M，X226V，X227A，X227C，X227G，X227I，X227L，X227M，X227S，X227T，X227V，X228A，X228C，X228G，X228I，X228S，X228V，X229A，X229G，X229P，X229S，X230A，X230D，X230E，X230G，X230H，X230I，X230L，X230N，X230Q，X230S，X230T，X230V，X231A，X231C，X231F，X231G，X231H，X231I，X231L，X231S，X231T，X231Y，X232A，X232G，X232H，X232L，X232M，X232S，X232V，X233A，X233C，X233E，X233F，X233G，X233I，X233L，X233M，X233N，X233P，X233Q，X233S，X233T，X233V，X233Y，X234D，X234F，X234G，X234H，X234L，X234M，X234N，X234Q，X234S，X234T，X234V，X234Y，X235C，X235D，X235E，X235F，X235G，X235H，X235I，X235K，X235L，X235M，X235N，X235Q，X235R，X235S，X235V，X235W，X235Y，X236A，X236C，X236E，X236F，X236H，X236K，X236N，X236P，X236Q，X236R，X236S，X236T，X236V，X236W，X236Y，X237A，X237C，X237F，X237G，X237H，X237I，X237K，X237L，X237M，X237P，X237Q，X237R，X237S，X237T，X237V，X237W，X237Y，X238C，X238D，X238E，X238F，X238G，X238H，X238I，X238K，X238L，X238M，X238N，X238Q，X238R，X238S，X238T，X238V，X238Y，X239C，X239D，X239F，X239G，X239H，X239I，X239K，X239L，X239M，X239N，X239P，X239Q，X239R，X239S，X239T，X239V，X239W，X239Y，X240A，X240C，X240E，X240F，X240I，X240K，X240L，X240M，X240N，X240Q，X240R，X240S，X240T，X240W，X240Y，X241A，X241C，X241D，X241E，X241F，X241G，X241H，X241I，X241K，X241L，X241M，X241N，X241P，X241Q，X241R，X241S，X241T，X241V，X241W，X241Y，X242A，X242C，X242D，X242F，X242G，X242H，X242I，X242L，X242M，X242P，X242Q，X242R，X242S，X242T，X242V，X242W，X243C，X243D，X243E，X243F，X243G，X243H，X243I，X243K，X243L，X243M，X243N，X243P，X243Q，X243R，X243S，X243T，X243V，X243W，X244A，X244D，X244E，X244F，X244H，X244I，X244L，X244M，X244N，X244P，X244Q，X244R，X244S，X244T，X244V，X244W，X244Y，X245A，X245C，X245E，X245G，X245H，X245K，X245L，X245P，X245Q，X245R，X245S，X245V，X245W，X245Y，X246A，X246C，X246E，X246F，X246G，X246H，X246I，X246L，X246M，X246N，X246Q，X246S，X246T，X246V，X246W，X246Y，X247A，X247C，X247D，X247E，X247F，X247G，X247H，X247I，X247K，X247L，X247M，X247N，X247P，X247Q，X247R，X247S，X247T，X247V，X247W，X247Y，X248C，X248D，X248E，X248G，X248H，X248I，X248K，X248L，X248N，X248P，X248R，X248S，X248T，X248V，X248W，X248Y，X249A，X249D，X249E，X249F，X249G，X249H，X249I，X249K，X249L，X249M，X249N，X249Q，X249R，X249S，X249T，X249V，X249W，X249Y，X250A，X250C，X250F，X250I，X250L，X250M，X250Q，X250S，X250V，X251A，X251D，X251E，X251F，X251G，X251K，X251L，X251M，X251Q，X251R，X251T，X251V，X251Y，X252A，X252C，X252D，X252F，X252G，X252H，X252I，X252K，X252L，X252M，X252N，X252R，X252S，X252V，X252W，X252Y，X253A，X253D，X253E，X253F，X253G，X253H，X253I，X253K，X253M，X253R，X253S，X253T，X253V，X253W，X254A，X254C，X254G，X254S，X254T，X255A，X255C，X255D，X255E，X255F，X255H，X255I，X255L，X255N，X255P，X255Q，X255R，X255S，X255T，X255V，X255W，X255Y，X256A，X256C，X256D，X256E，X256G，X256H，X256I，X256K，X256L，X256M，X256N，X256P，X256R，X256S，X256T，X256V，X256W，X256Y，X257C，X257F，X257I，X257K，X257L，X257M，X257V，X258A，X258C，X258D，X258E，X258F，X258G，X258H，X258I，X258L，X258M，X258P，X258Q，X258R，X258S，X258T，X258V，X258W，X258Y，X259A，X259C，X259E，X259G，X259I，X259L，X259M，X259P，X259Q，X259R，X259S，X259T，X259V，X260A，X260D，X260E，X260F，X260H，X260I，X260L，X260M，X260N，X260P，X260R，X260S，X260T，X260V，X260Y，X261A，X261C，X261E，X261F，X261G，X261I，X261K，X261L，X261N，X261P，X261Q，X261R，X261S，X261T，X261V，X261W，X261Y，X262A，X262C，X262D，X262F，X262G，X262H，X262I，X262K，X262L，X262M，X262Q，X262R，X262S，X262T，X262V，X262W，X262Y，X263C，X263F，X263L，X263Y，X264A，X264G，X265A，X265C，X265D，X265F，X265G，X265H，X265K，X265M，X265Q，X265R，X265S，X265T，X265W，X265Y，X267G，X267I，X267L，X267M，X267N，X267V，X268A，X268G，X268H，X268L，X268M，X268N，X268P，X268Q，X268S，X268V，X269C，X269D，X269F，X269G，X269H，X269I，X269L，X269M，X269N，X269Q，X269R，X269S，X269T，X269V，X270A，X270C，X270D，X270G，X270I，X270L，X270M，X270N，X270S，X270T，X270V，X271A，X271C，X271E，X271F，X271G，X271H，X271I，X271K，X271L，X271M，X271N，X271P，X271T，X271V，X271Y，X272A，X272C，X272D，X272E，X272F，X272G，X272H，X272K，X272L，X272M，X272N，X272P，X272R，X272S，X272T，X272W，X272Y，X273A，X273C，X273D，X273E，X273F，X273G，X273H，X273I，X273L，X273S，X273T，X273V，X274A，X274C，X274D，X274E，X274G，X274H，X274L，X274M，X274N，X274P，X274Q，X274R，X274S，X274T，X274W，X275A，X275C，X275D，X275E，X275F、X275G、X275H、X275K、X275L、X275M、X275P、X275Q、X275R、X275V和X275W。
在GCI-P036变体筛选中，在下列204个位置上的至少一种突变是与这样的性能指数相关的，所述性能指数对于BMI、EGG或AAPF活性具有大于0.8的性能指数，并对于LAS稳定性和TCA测定具有大于0.8的性能指数：1、3、4、8、9、10、11、12、13，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，33，35，36，38，40，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，59，61，62，68，69，72，73，76，78，84，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，114，115，116，117，118，119，120，121，122，124，126，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，156，158，159，160，165，166，167，170，171，172，173，174，175，176，177，180，182，183，184，185，186，187，188，191，194，195，198，199，203，204，206，209，210，211，212，213，215，216，217，218，222，223，224，227，228，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，255，256，258，259，260、261、262、265、267、268、269、270、271、272、273、274和275。
可以组合在这些位置的突变，以改善活性同时维持稳定性和/或表达。也可以组合在这些位置的突变，以产生具有改善稳定性和/或表达，同时保持或增强活性的变体。
下表提供了这样的取代，所述取代对于BMI、CS-38微样品测定或AAPF测定，具有大于0.8的性能指数，对于LAS稳定性或在TCA测定中具有大于0.8的性能指数(如本文使用的，“X”指任意氨基酸)。可以组合这类变体，以改善活性而同时维持或增强稳定性和/或表达，或者改善稳定性和/或表达，同时维持或增强活性：X001A、X001E、X001G、X001H，X001Q，X001V，X003E，X003H，X003I，X003M，X003S，X003T，X003V，X004T，X004V，X008I，X008V，X009E，X009H，X009N，X009Q，X009S，X009T，X010A，X010C，X010G，X010H，X010K，X010M，X010N，X010R，X010S，X010T，X011I，X011V，X012G，X012I，X012N，X012Q，X012S，X012T，X012V，X013A，X013G，X015A，X015D，X015F，X015G，X015I，X015L，X015M，X015P，X015Q，X015S，X015V，X015W，X016A，X016G，X016N，X016P，X016S，X016T，X016V，X017H，X017I，X017M，X017N，X018A，X018C，X018D，X018E，X018G，X018H，X018L，X018M，X018N，X018P，X018Q，X018S，X018T，X018V，X018Y，X019A，X019C，X019D，X019E，X019F，X019G，X019H，X019K，X019L，X019M，X019N，X019R，X019S，X019V，X019W，X019Y，X020A，X020C，X020D，X020F，X020G，X020I，X020K，X020L，X020M，X020P，X020Q，X020R，X020S，X020T，X020V，X020W，X020Y，X021A，X021C，X021E，X021G，X021H，X021I，X021K，X021L，X021M，X021N，X021P，X021Q，X021S，X021T，X021V，X021W，X022A，X022C，X022G，X022I，X022L，X022M，X022N，X022P，X022Q，X022T，X022V，X022W，X023A，X023G，X023S，X024A，X024C，X024D，X024F，X024G，X024H，X024L，X024M，X024N，X024P，X024Q，X024R，X024S，X024T，X024V，X024W，X025C，X025D，X025E，X025F，X025G，X025K，X025L，X025M，X025Q，X025R，X025S，X025T，X025V，X025W，X026C，X026F，X026G，X026M，X026N，X026R，X026S，X026T，X026V，X027A，X027C，X027D，X027F，X027G，X027K，X027L，X027M，X027N，X027P，X027R，X027S，X027T，X027W，X028A，X028I，X028L，X028M，X028V，X029A，X029C，X029G，X029S，X029V，X030A，X030C，X030L，X030M，X030T，X030V，X031A，X031F，X031I，X031L，X031M，X031S，X031V，X033C，X033M，X033S，X033T，X035I，X035L，X035M，X035P，X036A，X036E，X036S，X036T，X036V，X038C，X038F，X038H，X038I，X038K，X038L，X038M，X038N，X038Q，X038R，X038T，X038V，X038Y，X040A，X040D，X040E，X040I，X040L，X040P，X040V，X043A，X043C，X043D，X043E，X043F，X043G，X043I，X043L，X043M，X043N，X043R，X043S，X043T，X043W，X043Y，X044A，X044C，X044D，X044F，X044G，X044I，X044K，X044L，X044M，X044N，X044Q，X044R，X044S，X044T，X044V，X044Y，X045A，X045D，X045F，X045G，X045H，X045I，X045K，X045L，X045M，X045N，X045P，X045Q，X045R，X045S，X045T，X045V，X045W，X045Y，X046C，X046D，X046E，X046G，X046H，X046I，X046K，X046L，X046M，X046N，X046P，X0460，X046R，X046S，X046T，X046V，X047G，X047R，X048A，X048C，X048E，X048F，X048H，X048I，X048K，X048L，X048M，X048N，X048P，X048Q，X048R，X048S，X048T，X048V，X048Y，X049A，X049G，X049H，X049S，X049T，X050F，X050H，X050I，X050L，X050T，X050V，X050Y，X051F，X051H，X051K，X051L，X051R，X051S，X051T，X051V，X051W，X052A，X052C，X052E，X052F，X052G，X052H，X052I，X052L，X052M，X052N，X052P，X052Q，X052R，X052T，X052V，X052W，X052Y，X053A，X053C，X053D，X053E，X053G，X053H，X053K，X053L，X053M，X053Q，X053R，X053S，X053T，X053W，X053Y，X054A，X054C，X054D，X054E，X054F，X054H，X054M，X054N，X054Q，X054S，X055C，X055E，X055G，X055H，X055K，X055L，X055P，X055Q，X055S，X055T，X055W，X056A，X056C，X056D，X056E，X056H，X056L，X056M，X056N，X056P，X056Q，X056S，X056T，X057C，X057E，X057F，X057G，X057H，X057I，X057L，X057M，X057N，X057P，X057Q，X057R，X057S，X057T，X057V，X057W，X057Y，X059A，X059D，X059G，X059I，X059L，X059M，X059N，X059Q，X059R，X059S，X059T，X059V，X059W，X061A，X061C，X061D，X061F，X061G，X061H，X061I，X061L，X061M，X061N，X061P，X061R，X061S，X061T，X061V，X061Y，X062C，X062E，X062F，X062H，X062I，X062K，X062L，X062M，X062N，X062Q，X062R，X062S，X062T，X062V，X068I，X068L，X068V，X069A，X069G，X069S，X069T，X072I，X072L，X072T，X072V，X073A，X073C，X073S，X076D，X076N，X078A，X078C，X078E，X078H，X078L，X078M，X078N，X0780，X078S，X078T，X084C，X084G，X084I，X084M，X084V，X086C，X086P，X087A，X087C，X087D，X087E，X087G，X087K，X087L，X087N，X087S，X087V，X088A，X088C，X088G，X088S，X089A，X089D，X089E，X089G，X089H，X089I，X089N，X089Q，X089R，X089S，X089T，X089W，X090C，X090I，X090L，X090M，X090Q，X090T，X090V，X091D，X091F，X091I，X091N，X091S，X091V，X091W，X091Y，X092A，X092G，X092P，X092R，X092V，X093A，X093C，X093G，X093L，X093M，X093T，X093V，X094K，X094R，X095A，X095C，X095I，X095S，X095V，X096F，X096I，X096L，X096M，X097A，X097D，X097E，X097F，X097G，X097H，X097K，X097L，X097M，X097N，X097P，X097Q，X097R，X097S，X097T，X097V，X097W，X097Y，X098A，X098C，X098D，X098E，X098F，X098G，X098K，X098L，X098N，X098P，X098Q，X098R，X098S，X098T，X098V，X098Y，X099A，X099C，X099F，X099G，X099K，X099M，X099P，X099Q，X099R，X099S，X099T，X099V，X099Y，X100D，X100E，X100G，X100I，X100K，X100N，X100R，X100S，X100T，X100V，X100Y，X101A，X101C，X101D，X101E，X101F，X101G，X101H，X101I，X101K，X101N，X101P，X101Q，X101R，X101S，X101T，X101V，X101Y，X102A，X102G，X102T，X103A，X103C，X103D，X103F，X103G，X103I，X103L，X103N，X103P，X103Q，X103R，X103S，X103T，X103V，X103W，X104C，X104F，X104H，X104I，X104L，X104R，X104S，X104T，X104V，X104W，X104Y，X105A，X105C，X105D，X105E，X105F，X105G，X105K，X105L，X105N，X105Q，X105R，X105S，X105T，X105V，X106A，X106D，X106E，X106G，X106I，X106L，X106R，X106S，X106T，X106V，X106W，X107A，X107C，X107F，X107I，X107L，X107M，X107Q，X107S，X107T，X107V，X108A，X108C，X108I，X108S，X108T，X108V，X109A，X109E，X109F，X109G，X109H，X109I，X109K，X109L，X109M，X109N，X109Q，X109R，X109S，X109T，X109W，X109Y，X110A，X110G，X111F，X111I，X111L，X111M，X112D，X112E，X112I，X112Q，X112V，X114A，X114C，X115C，X115E，X115G，X115L，X115M，X115P，X115Q，X115S，X115T，X115W，X115Y，X116A，X116C，X116D，X116F，X116G，X116I，X116K，X116L，X116M，X116N，X116Q，X116S，X116T，X116V，X116W，X117A，X117C，X117N，X117Q，X117R，X117T，X117Y，X118A，X118C，X118D，X118E，X118F，X118G，X118K，X118M，X118N，X118R，X118S，X118V，X118W，X119A，X119F，X119M，X119T，X120A，X120C，X120E，X120F，X120G，X120H，X120I，X120L，X120M，X120N，X120R，X120S，X120T，X120W，X121A，X121C，X121F，X121I，X121L，X121M，X121S，X121T，X121V，X122A，X122G，X122S，X122V，X124G，X124L，X124T，X126A，X126F，X126I，X126L，X126M，X126V，X128A，X128F，X128G，X128I，X128K，X128L，X128M，X128N，X128Q，X128R，X128S，X128T，X128W，X129A，X129E，X129F，X129G，X129M，X129N，X129P，X129R，X129S，X129Y，X130C，X130K，X130L，X130N，X130Q，X130R，X130S，X130V，X130W，X130Y，X131A，X131D，X131E，X131F，X131G，X131K，X131P，X131Q，X132A，X132H，X132I，X132N，X132Q，X132R，X132S，X132T，X133A，X133F，X133K，X133N，X133P，X133S，X133T，X133V，X133Y，X134A，X134S，X134T，X134V，X135L，X135M，X135W，X136E，X136Q，X137A，X137C，X137E，X137H，X137K，X137L，X137M，X137Q，X137R，X137S，X137W，X139C，X139I，X139V，X140D，X140E，X140N，X141D，X141E，X141G，X141H，X141I，X141K，X141L，X141N，X141Q，X141R，X141S，X141V，X141Y，X142A，X142C，X142V，X143C，X143D，X143F，X143H，X143N，X143T，X144A，X144C，X144D，X144G，X144H，X144I，X144L，X144M，X144N，X144R，X144S，X144T，X144V，X144Y，X145A，X145C，X145D，X145F，X145K，X145L，X145N，X145Q，X145R，X146D，X146G，X147I，X147L，X147T，X147V，X148C，X148I，X148L，X148M，X148N，X148V，X149C，X149I，X149L，X149V，X150A，X150L，X150T，X150V，X151A，X151S，X152A，X152S，X156D，X156E，X156L，X156N，X156S，X156T，X158A，X158C，X158E，X158F，X158H，X158K，X158L，X158M，X158Q，X158R，X158S，X158T，X158V，X159A，X159C，X159E，X159G，X159H，X159M，X159P，X159S，X160A，X160C，X160D，X160F，X160I，X160L，X160M，X160N，X160Q，X160S，X160T，X160V，X160Y，X165I，X165L，X165V，X166A，X166C，X166D，X166E，X166H，X166M，X166S，X166T，X167F，X167Y，X170A，X170D，X170E，X170G，X170H，X170K，X170Q，X170R，X170S，X170V，X170Y，X171C，X171Y，X172A，X172C，X172D，X172G，X172I，X172K，X172L，X172M，X172P，X172Q，X172R，X172S，X172V，X172Y，X173A，X173C，X173D，X173H，X173M，X173N，X173Q，X173T，X174A，X174S，X174T，X174V，X175L，X175M，X175V，X176A，X176S，X177C，X177V，X180T，X180V，X182A，X182D，X182E，X182Q，X183A，X183D，X183N，X183Q，X183S，X184D，X184N，X185A，X185C，X185E，X185H，X185K，X185M，X185N，X185Q，X185T，X185V，X186I，X186K，X186L，X186R，X187A，X187C，X188A，X188D，X188E，X188F，X188H，X188I，X188K，X188L，X188P，X188Q，X188S，X188T，X191A，X191D，X191Q，X191S，X194A，X194C，X194D，X194E，X194F，X194H，X194I，X194L，X194M，X194P，X194Q，X194R，X194S，X194T，X194W，X194Y，X195C，X195D，X195E，X195G，X195Q，X198I，X198L，X199C，X199M，X199S，X199V，X203C，X203E，X203T，X203V，X204A，X204C，X204E，X204G，X204N，X204S，X206D，X206E，X206H，X206L，X206N，X206Q，X206S，X209F，X209M，X209W，X209Y，X210A，X210C，X210I，X210L，X210M，X210N，X210P，X211A，X211C，X211E，X211G，X211H，X2111，X211M，X211P，X211Q，X211T，X211V，X212C，X212F，X212G，X212H，X212M，X212N，X212R，X212S，X212Y，X213A，X213D，X213E，X213N，X213Q，X213S，X213T，X215A，X215C，X215D，X215E，X215H，X215I，X215K，X215M，X215N，X215S，X215T，X215V，X215Y，X216A，X216C，X216D，X216E，X216F，X216H，X216I，X216L，X216M，X216N，X216Q，X216S，X216V，X216W，X216Y，X217A，X217C，X217D，X217E，X217F，X217K，X217L，X217M，X217Q，X218C，X218D，X218E，X218N，X218Q，X222C，X222M，X222S，X223A，X223S，X224A，X224N，X224S，X224T，X227A，X227C，X227V，X228A，X228G，X228S，X228V，X230A，X230G，X230N，X230S，X230T，X230V，X231A，X231C，X231F，X231G，X231S，X232A，X232L，X232M，X233A，X233C，X233E，X233G，X233I，X233L，X233N，X233Q，X233S，X233T，X233V，X234L，X234M，X234N，X234Q，X234S，X234T，X234V，X235C，X235F，X235G，X235H，X235I，X235K，X235L，X235M，X235N，X235Q，X235R，X235S，X235V，X235W，X235Y，X236A，X236C，X236E，X236F，X236H，X236N，X236Q，X236S，X236T，X236Y，X237A，X237C，X237F，X237G，X237H，X237I，X237K，X237L，X237M，X237Q，X237R，X237S，X237T，X237V，X237W，X237Y，X238C，X238D，X238E，X238F，X238G，X238H，X238I，X238K，X238L，X238M，X238N，X238Q，X238R，X238S，X238T，X238V，X238Y，X239C，X239D，X239F，X239G，X239H，X239K，X239L，X239M，X239N，X239P，X239Q，X239R，X239S，X239T，X239V，X239W，X239Y，X240A，X240C，X240E，X240F，X240I，X240K，X240M，X240N，X240Q，X240R，X240S，X240T，X240W，X240Y，X241A，X241C，X241D，X241E，X241F，X241G，X241H，X241I，X241K，X241L，X241M，X241N，X241Q，X241R，X241S，X241T，X241V，X241W，X241Y，X242A，X242C，X242D，X242G，X242H，X242I，X242L，X242M，X242P，X242Q，X242S，X242T，X242V，X243C，X243D，X243E，X243F，X243G，X243H，X243I，X243L，X243M，X243N，X243P，X243Q，X243S，X243T，X243V，X243W，X244D，X244E，X244F，X244H，X244I，X244L，X244M，X244N，X244Q，X244S，X244T，X244V，X244W，X245A，X245C，X245E，X245G，X245H，X245K，X245L，X245P，X245Q，X245S，X245V，X245W，X245Y，X246A，X246C，X246I，X246L，X246M，X246T，X246V，X247A，X247C，X247F，X247G，X247H，X247K，X247L，X247M，X247N，X247R，X247S，X247T，X247V，X247W，X247Y，X248C，X248D，X248E，X248G，X248H，X248I，X248L，X248N，X248P，X248R，X248S，X248T，X248V，X248Y，X249A，X249D，X249E，X249F，X249G，X249H，X249I，X249K，X249L，X249M，X249N，X249Q，X249S，X249T，X249W，X249Y，X250C，X250I，X250L，X250M，X250V，X251A，X251D，X251E，X251F，X251G，X251K，X251L，X251M，X251Q，X251R，X251T，X251V，X251Y，X252A，X252C，X252D，X252F，X252G，X252H，X252I，X252K，X252L，X252M，X252N，X252R，X252S，X252V，X252W，X253A，X253E，X253H，X253M，X253S，X253T，X253W，X255A，X255C，X255D，X255E，X255I，X255L，X255N，X255Q，X255T，X255V，X255Y，X256A，X256C，X256D，X256E，X256G，X256H，X256I，X256K，X256L，X256M，X256N，X256P，X256S，X256V，X256W，X256Y，X258D，X258G，X259A，X259C，X259E，X259P，X259Q，X259S，X260A，X260D，X260E，X260H，X260I，X260N，X260P，X260S，X260T，X260V，X261A，X261C，X261E，X261F，X261I，X261K，X261L，X261N，X261P，X261Q，X261S，X261T，X261V，X261W，X261Y，X262A，X262C，X262D，X262F，X262H，X262I，X262L，X262M，X262Q，X262T，X262V，X262Y，X265A，X265D，X265S，X267I，X267L，X268A，X268L，X268V，X269D，X269H，X269N，X269Q，X269S，X270A，X270C，X270G，X270I，X270L，X270N，X270S，X270T，X270V，X271C，X271E，X272A，X272C，X272D，X272E，X272F，X272G，X272H，X272L，X272M，X272N，X272P，X272S，X272T，X272W，X272Y，X273A，X273C，X273G，X273S，X274A，X274C，X274G，X274L，X274M，X274N，X274S，X274T，X275D，X275E，X275F，X275H，X275K，X275L，X275M，X275P，X275Q，X275R.
实施例6
变体蛋白酶数据的比较性评估
在该实施例中，比较了这样的实验的结果，所述实验的进行确定了BPN，、GCI-P036和变体蛋白酶的清洁性能、LAS/EDTA稳定性、AAPF活性和蛋白质含量(目标特性的测试)。实施例1中提供了所使用的去垢剂和所使用的条件。在下表中，“EGG”结果指在如表1-1所述的(WE ADW)中的CS-38微样品测定结果。如全文所述，变体蛋白酶的功能定量为性能指数(PI)，这是变体与参照蛋白酶的性能比例。本文使用的PI分类包括：上突变(PI＞1.0)；中性突变(PI＞0.5)；无害突变(PI＞0.05)；和有害突变(PI≤0.05)。如PCT/09/046066和PCT/US09/046156中所述，生产和测定BPN’变体，所述文献通过引用全文整合到本文中。
“生产性位点”指对任何特性而言具有至少一个上突变的位置。“生产性、非限制性位点”是对任何所测试的特性(除蛋白质表达外)而言，具有≥20％中性突变(PI＞0.5)和至少一个上突变(PI＞1.0)的位点。在下表6-1中，就含有满足生产性、非限制性位点定义的位点的变体而言，其结果显示为满足上突变(PI＞1)定义的待测试变体的百分比(％)。
“高生产性位点”是那些对除蛋白质表达以外的至少一种特性(例如，TCA测定中所指出的)，具有≥20％上突变(PI＞1)的位点。在下表6-2中，就含有满足高生产性位点定义的位点的变体而言，其结果显示为满足上突变(PI＞1)定义的待测试变体的百分比(％)。
“限制性”位点是那些对活性和稳定性而言，具有少于20％中性突变的位点。在下表6-3中，就含有满足限制性位点定义的位点的变体而言，其结果显示为满足中性突变(PI＞0.5)定义的待测试变体的百分比(％)。
简而言之，如本发明的开发过程中确定的，在两种参照枯草杆菌蛋白酶成熟区中的10个位置是对活性和稳定性而言的限制性位置。因而，两条参照枯草杆菌蛋白酶的成熟区中剩余的265个位置是对活性和稳定性而言的非限制性位置(≥20％，中性突变)。
实施例7
评估GCI P036组合文库变体的污渍去除
在该实施例中，提供了关于GCI-P036变体的这样的结果，在自动化洗碗和液体洗衣去垢剂应用中测试所述GCI-P036变体污渍去除的性能。由Sloning BioTechnology使用Slonomax Technology进行组合文库的克隆。变体蛋白酶样品的制备如上所述进行。简而言之，在血、奶、墨水(BMI)微样品和CS-38微样品测定中，测试在代表多种市场地理(例如，不同的pH、温度和/或水硬度)的去垢剂中，在洗衣和自动化洗碗(ADW)应用中的组合文库变体。如全文所述，将蛋白酶变体的功能性定量化为性能指数(PI)，这是变体与参照蛋白酶的性能比例。相对于GCI-P036参照蛋白酶，使用BPN’编号列举所述取代，而相对于GCI-P036参照确定pI。数据显示在表7-1至7-5中。
评估GCI-P036的多重突变文库(MML)变体的污渍去除
测试GCI-P036变体在清洁应用中的污渍去除性能。由SloningBioTechnology使用Slonomax Technology进行所述组合文库的克隆。如前所述，实施变体蛋白酶样品的制备。简而言之，使用实施例1的方法，在血、奶、墨水(BMI)微样品和CS-38微样品测定中测试MML变体。如全文所述，将蛋白酶变体的功能性定量为性能指数(PI)，这是变体的性能与参照蛋白酶性能的比例。使用BPN’编号相对于GCI-P036参照蛋白酶列举取代，并且相对于GCI-P036参照的关系确定PI。表7-6和7-7中显示了结果。
评估GCI-P036的多重突变文库(MML)变体的LAS/EDTA稳定性
在含有LAS和EDTA稳定剂(stability)的组合物中孵育后，测试GCI-P036变体的稳定性。由Sloning BioTechnology使用SlonomaxTechnology进行所述组合文库的克隆。如前所述，实施变体蛋白酶样品的制备。简而言之，使用实施例1的方法，在LAS/EDTA稳定性测定中测试MML变体。如全文所述，将蛋白酶变体的功能性定量为性能指数(PI)，这是变体的性能与参照蛋白酶性能的比例。使用BPN’编号相对于GCI-P036参照蛋白酶列举取代，并且相对于GCI-P036参照的关系确定PI。表7-8中显示了结果。
评估表达GCI-P036的多重突变文库(MML)变体培养物的蛋白质含量
通过在实施例1的TCA测定中评估培养物的蛋白质含量，来测量GCI-P036变体的重组表达。由Sloning BioTechnology使用SlonomaxTechnology进行所述组合文库的克隆。如前所述，实施变体蛋白酶样品的制备。简而言之，使用实施例1的方法，在TCA测定中测试MML变体。如全文所述，将蛋白酶变体的功能性定量为性能指数(PI)，这是变体的性能与参照蛋白酶性能的比例。使用BPN’编号相对于GCI-P036参照蛋白酶列举取代，并且相对于GCI-P036参照的关系确定PI。表7-9中显示了结果。
实施例8
评估GCI-P036的多重突变文库(MML)变体的污渍去除
表8-1中显示了GCI-P036变体的实验结果，所述实验是确定污渍去除活性(使用CS-38微样品，确定在自动洗碗去垢剂中清洁性能)、LAS/EDTA稳定性、热稳定性和TCA测定的蛋白质确定(目标特性的测试)。使用实施例1描述的方法获得结果，但对污渍去除性能测定进行下列修改。将测试去垢剂热失活(5合1，以及Complete)，用附着锡箔密封MTP并置于IEMS孵育箱中，在指示的温度下搅拌30分钟。
为了测试变体克隆1-44的污渍去除性能测定和稳定性，使用稀释的已过滤培养上清。对于克隆100-105，使用不同浓度的纯化样品。表8-1中显示了在4ppm和6ppm剂量下计算的克隆100-105的PI值的平均值。对于克隆47-50和克隆106，使用配制的超滤样品浓缩液(UFC)。将表达克隆47-50的枯草芽孢杆菌细胞的培养液以9000xg离心30分钟，并将上清通过布氏漏斗中的Seitz-EKS Depth滤纸(Pall)过滤，然后在压力下通过无菌的Seitz-EKS Depth滤纸过滤并储藏在4℃。用PALL UF-过滤单位浓缩所获得的无细胞上清，使用截留为10kDa的滤纸。通过加入51％(W/W)丙二醇和1.2％(W/W)甲酸钠，配制所获得的超滤浓缩液。甲酸钠用于降低pH至6.0。
如全文所述，将GCI-P036变体的功能性定量为性能指数(pi)，这是变体的性能与亲本GCI-P036蛋白性能的比例。ND表示“未确定”。
实施例9
在洗衣应用研究中评估多重突变文库(MML)变体的污渍去除
表9-1中显示了GCI-P036变体(如实施例8所述的克隆8、47、49)的实验结果，所述实验是进行污渍去除活性的确定(在洗衣应用中确定清洁性能的微样品测定)。使用实施例1描述的方法获得结果。所使用的测试的去垢剂是热失活的P&G2X(NA HDL)和P&G(NAHDG)。使用0.2ppm的变体在25℃下测试BMI污渍微样品的清洁性能30分钟，伴随在200uL体积中的1400转/分钟振荡。如全文所述，将GCI-P036变体的功能性定量为性能指数(pi)，这是变体的性能与亲本GCI-P036蛋白性能的比例。还测试了枯草杆菌蛋白酶FNA(BPN'-Y217L)和GCI-P036-S87N-G118V-S128L-P129Q-S130A蛋白。
实施例10
具有增加的生产滴度的蛋白酶变体
基于蛋白质滴度的有益收获和在微滴度平板中进行的超级筛选过程中观察到的微样品洗涤性能，来选择GCI-P036成熟区内的突变。使用复制质粒表达系统，获得在之前实施例中测试的蛋白酶样品。对于该实施例中描述的45种变体的表达，使用标记为GCI-P036ci、编码野生型GCI-P036蛋白的基因。该“ci”合成基因包括基于FNA密码子用法(非常高水平表达的蛋白质)的密码子改良版。将编码这些变体的核酸导入如下所述的GCI-P036ci基因模板中，在p2JH骨架中产生一系列质粒(p2JH-GCI-P036ci，图3)，整合的载体系统能够大规模的进行蛋白质生产。该整合的芽孢杆菌表达系统用于评估表9-1中列举的变体，使用来自摇瓶培养的培养液。再次评估蛋白质表达和微样品性能。由于某些变体相比野生型时，对suc-AAPF-pNA底物表现出减弱的蛋白酶活性，故使用eglin c滴度测定来确定蛋白酶浓度。图4和图5中分别显示了eglin c和BMI测定所获得的结果。
整合质粒
使用GCI-P036密码子改良的合成基因(GCI-P036ci)装配整合质粒p2JH-GCI-P036ci，将所述合成基因与AprE信号序列的第八个密码子融合，置于AprE启动子和FNB酶终止子的控制下(Wells等，Nucleic AcidsRes，11：7911-25，1983)。在下文提供的p2JH-GCI-P036ci的GCI-P036ci序列中，粗体和斜体字体表示AprE启动子，标准字体表示信号序列区，下划线字体表示GCI-P036原序列区，粗体字体表示编码GCI-P036成熟蛋白酶区的DNA，而下划线的斜体字体表示FNB酶终止子。
AATTCTCCATTTTCTTCTGCTATCAAAATAACAGACTCGTGATTTTCCAAACGAGCTTTCAAAAAAGCCTCTGCCCCTTGCAAATCGGATGCCTGTCTATAAAATTCCCGATATTGGTTAAACAGCGGCGCAATGGCGGCCGCATCTGATGTCTTTGCTTGGCGAATGTTCATCTTATTTCTTCCTCCCTCTCAATAATTTTTTCATTCTATCCCTTTTCTGTAAAGTTTATTTTTCAGAATACTTTTATCATCATGCTTTGAAAAAATATCACGATAATATCCATTGTTCTCACGGAAGCACACGCAGGTCATTTGAACGAATTTTTTCGACAGGAATTTGCCGGGACTCAGGAGCATTTAACCTAAAAAAGCATGACATTTCAGCATAATGAACATTTACTCATGTCTATTTTCGTTCTTTTCTGTATGAAAATAGTTATTTCGAGTCTCTACGGAAATAGCGAGAGATGATATACCTAAATAGAGATAAAATCATCTCAAAAAAATGGGTCTACTAAAATATTATTCCATCTATTACAATAAATTCACAGAATAGTCTTTTAAGTAAGTCTACTCTGAATTTTTTTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAGAAGCAAAAAATTGTGGATCGTCGCGTCGACCGCATTGCTGATTTCTGTTGCTTTTAGCTCATCCATCGCATCCGCTGCTGAAGAAGCAAA AGAAAAATATTTAATTGGCTTTAATGAGCAGGAAGCTGTCAGTGAGTTTGTAGAACAAGTT GAGGCAAATGACGAGGTAGCCATTCTCTCTGAGGAAGAGGAAGTCGAAATTGAATTGCTTC ATGAATTTGAAACGATTCCTGTTCTGTCCGTTGAGTTAAGCCCAGAAGATGTGGACGCGTTA GAGCTCGATCCAGCTATTTCTTATATTGAAGAGGATGCAGAAGTAACTACAATGGCGCAATCGGTACCATGGGGAATTAGCAGAGTACAAGCCCCAGCTGCACATAACCGTGGATTGACAGGTTCTGGTGTAAAAGTTGCTGTCCTTGATACCGGTATTTCCACTCATCCAGACTTAAATATTCGTGGTGGAGCTAGCTTTGTACCAGGGGAACCATCCACTCAAGATGGCAATGGACATGGCACTCATGTTGCCGGCACAATCGCGGCTCTTAACAATTCAATTGGTGTTCTTGGCGTAGCGCCAAGCGCAGAACTATACGCTGTTAAAGTATTAGGAGCAAGCGGTTCAGGCTCTGTCAGCTCTATTGCCCAAGGATTGGAATGGGCAGGGAACAATGGCATGCACGTTGCTAATCTTAGTTTAGGATCTCCTTCGCCAAGTGCCACACTTGAGCAAGCTGTTAATAGCGCGACTTCTAGAGGCGTTCTTGTTGTAGCGGCCTCTGGAAATTCAGGTGCAGGCTCAATCAGCTATCCGGCCCGTTATGCGAACGCTATGGCAGTCGGAGCTACTGACCAAAACAACAACCGCGCCAGCTTTTCACAGTATGGCGCAGGGCTTGACATTGTCGCACCAGGTGTAAACGTGCAGAGCACTTACCCAGGTTCAACATATGCCAGCTTAAACGGTACATCAATGGCTACTCCTCATGTTGCAGGTGCGGCTGCACTTGTTAAACAAAAGAACCCATCTTGGTCCAATGTACAAATCCGCAATCATCTTAAGAATACGGCAACTAGCTTAGGAAGCACAAACTTGTATGGAAGCGGACTTGTCAATGCAGAAGCTGCAACTCGTTAAAAGCTTAACTCGAGATAAAAAACCGGCCTTGGCCCCGCCGGTTTTTT(SEQ ID NO:8).
p2JH-GCI-P036ci的特征包括：CAT＝pC194的氯霉素抗性基因、pMB1origin＝pBR322的复制起点、bla＝pBR322的β内酰胺酶、aprE启动子＝转录启动子、信号肽＝信号肽、原肽＝GCI-P036原区域、GCI-P036ci成熟肽＝成熟的GCI-P036、FNB酶Term＝FNB酶终止子。上文提供的GCI-P036前体和GCI-P036成熟蛋白酶的氨基酸序列分别是SEQ ID NOS：6和SEQ ID NO：2。
产生其他GCI-P036变体
使用p2JH-GCI-P036ci质粒作为模板和位点特异性引物组——具有表9-2所示序列的正向(F)和反向(R)，使用Multi-site QuickChange试剂盒(Stratagene)进行+。将5微升的突变产物用于转化化学感受态Top10大肠杆菌(Ecoli)细胞(Invitrogen)，并放在LA+50ppm羧苄青霉素上进行生长选择。37℃下将平板孵育过夜。
每个突变选择5株转化子，使用PCR珠(GE/Amersham)按生产商的说明筛选存在的插入片段。插入PCR引物的序列如下：正向引物＝ISH-PCR-GCI-P036-5832F 5'-acaaataggg gttccgcgca-3’(SEQ ID NO：97)；和反向引物＝ISH-PCR-GCI-P036-1902R 5’-cgcaagaattg attggctcc-3’(SEQ ID NO：98)。循环条件如下：95℃下热启动2min，进行40个如下的循环，即95℃下变性1min，53℃下引物退火1min，72℃下延伸1min；然后保持在4℃。通过琼脂糖凝胶电泳分析5微升的PCR产物。纯化并测序预计片段大小为～2Kb的PCR产物。使用QiaPrep Spin Miniprep试剂盒(Qiagen)，为质粒制备扩增具有验证的突变的克隆。
将纯化的质粒测序，并将5μl质粒转化到感受态的枯草芽孢杆菌细胞(表型：ΔaprE、ΔnprE、oppA、ΔspoIIE、degUHy32、ΔamyE：：[xylR，pxylA-comK])中，在37℃摇床(250转/分钟)上孵育1小时，然后接种在LA+1.6脱脂奶+5ppm氯霉素平板上，在37℃孵育过夜。挑取表现出空洞的2株转化子(每个突变)，并亚克隆到LA+1.6脱脂奶+25ppm氯霉素上，选择额外的基因扩增。
从新鲜平板(扩增后)上挑取单克隆，并转移到5ml的LB培养液+25ppm氯霉素中，在37℃摇床(250转/分钟)上孵育6-7小时，产生预克隆。通过将800μl预培养的等份试样与400μl的50％(v/v)无菌甘油混合，来制备冰冻的储藏物。用1ml预培养物接种含25ml半定义培养基(基于磷酸盐缓冲的豆餐和尿素的培养基，含盐类)的摇瓶，在37℃摇床(250转/分钟)上孵育48小时。在18、24、42和48小时采集样品，如上文实施例1所述进行SDS-PAGE、AAPF、EglinC抑制测定和BMI洗涤性能测定的分析。
蛋白质分析
通过SDS-PAGE实施蛋白质在摇瓶中表达的分析，滴度是基于已知蛋白质浓度的纯化GCI-P036的标准曲线的。对于SDS-PAGE，向45μl培养上清中加入10μL的2M HCl，并在冰上孵育10min。然后，将50μL的2X甘氨酸样品缓冲液加入到每个样品中，将10μL的每种样品混合物上样到10Bis-Tris凝胶上，并在200V下MES缓冲液中运行30min。在去离子水中洗涤凝胶3次，然后用SimplyBlue Safe染料(Invitrogen)染色1小时，用去离子水脱色过夜。
还通过eglin c抑制测定监控蛋白质表达。在某些突变的情况下，当通过SDS PAGE估计的变体的量与suc-AAPF-pNA底物上的变体的活性比可比较时，提示突变导致蛋白酶对合成底物suc-AAPF-pNA的活性降低。出于该原因，还测量eglin c结合以排除AAPF测定可能的偏见。
通过将变体的比活除以野生型对照的比活，计算变体的相对比活。通过将AAPF活性测定的滴度除以eglin c抑制测定所获得的变体的相对比活，获得校正(归一化)的蛋白酶滴度。图4显示了多个变体蛋白酶的归一化蛋白酶滴度。
除了每孔使用一个微样品和变体蛋白酶剂量为0.5ppm并在室温下孵育外，如实施例1所述通过BMI洗涤测定进行变体性能的分析。EMPA 116BMI微样品用作污渍源，而ECE无磷参照去垢剂粉末用于测试碱性条件下的清洁性能。在pH 10.5的2mM碳酸钠(Na2CO3，MW＝105.99g/mol，无水)中制备缓冲溶液。缓冲组分的终浓度如下：6gPg水硬度，6.16g/LECE-2无磷粉末去垢剂，1.6g/L四水合过硼酸钠(PB4)，和0.24g/L四乙酰乙二胺(TAED)。在10mM NaCl+0.00580缓冲液中实施基于EglinC抑制分析校正滴度的酶稀释。BMI测定的结果显示在图5中。若干变体蛋白酶(G95P、S126M、Q和R、S9L和A106C具有GCI-P036编号＝G97P、S128M、Q和R、S9L和A108C具有BPN'编号)在液体培养中表现出增加的产量，同时保持了与GCI-P036参照蛋白酶相当的洗涤性能。
实施例11
产生GCI-P036的电荷梯度变体
该实施例描述了GCI-P036电荷梯度和组合电荷文库的产生。在与参照蛋白酶的比较下，进行本发明变体蛋白酶的测试，以确定变体蛋白酶的性能指数(PI)。
电荷梯度
从现有文库中选取覆盖多种目标物理特性的多个蛋白质变体，或者通过本领域已知的位点定向诱变技术产生(见例如，美国申请/系列申请号10/576,331、11/581,102和11/583,334)。然后在目标测试中测定该已定义的探针蛋白质的组合。下表中显示了示例性的蛋白酶电荷梯度变体，并如本文所述进行测定。在这些表格中，电荷改变是相对于参照蛋白质而言的，所述参照蛋白质在该实施例中是野生型蛋白酶。
产生GCI-P036组合电荷文库(CCL)
含有密码子改良的基因的pAC-GG36ci质粒用于通过DNA 2.0产生CCL。使用枯草芽孢杆菌菌株(基因型：ΔaprE、ΔnprE、ΔspoIIE、amyE：：xylRPxylAcomK-phleo)进行转化。此外，产生了显示在表10-2中的GCI-P036蛋白酶中四个位点的每一个上的位置文库。变体作为甘油储藏物提供在96-孔板中。
通过鉴别活性位点外的四个分布良好、表面暴露、且不带电荷的极性氨基酸残基，来设计GCI-P036CCL。这些残基是Ser-85、Gln-107、Ser-182和Asn-242(BPN'编号中的残基87、109、188和248)。通过制备每个位点三种可能性——野生型、精氨酸或天冬氨酸——的所有组合，产生81个成员的组合文库(G-1至G-81)。
实施例12
GCI-P036电荷变体的污渍去除性能
在该实施例中，提供了在以下测试中的GCI-P036变体的结果，所述测试是在血、奶、墨水(BMI)微样品和烤干的蛋黄微样品测定中，对代表多种市场地理(例如，不同的pH、温度和/或水硬度)的去垢剂，在洗衣和自动化洗碗(ADW)应用中的测试。该实施例的表中提出的市场地理包括NA(北美)、WE(西欧)和WE(ADW)，如表1-1所述。在表12-1中，关于餐具的结果(即，“PI餐具”)是关于在(Reckitt-Benckiser)中使用烤干的蛋黄微滴度测定进行的测定，如实施例1所述，在40℃12gpg，pH 10下。
实施例13
液体洗衣去垢剂组合物
在该实施例中，提供了用于液体洗衣去垢剂组合物的多种配方。如下所示制备本发明的下列液体洗衣去垢剂组合物。在每一个这类配方中，包括了至少一种本文提供的蛋白酶变体，浓度为从约0.0001至约10重量百分比。在一些备选实施方案中，可使用其他浓度，基于其需要根据制剂师确定。
#1：加入1N HCl aq.Soln，调节配方的净pH在从约3至约5的范围内。
上文实施例13(I)-(II)的pH是约5至约7，而13(III)-(V)的pH是约7.5至约8.5。
实施例14
手洗餐具液体去垢剂组合物
在该实施例中，提供了多种手洗餐具液体去垢剂配方。下文提供了本发明的下列手洗餐具液体去垢剂组合物。在每一个这类配方中，包括了至少一种本文提供的蛋白酶变体，浓度为从约0.0001至约10重量百分比。在一些备选实施方案中，可使用其他浓度，基于其需要根据制剂师确定。
实施例14(I)-(VI)的pH是约8至约11。
实施例15
液体自动化洗碗去垢剂组合物
在该实施例中，提供了多种液体自动化洗碗去垢剂配方。下文提供了本发明的下列手洗餐具去垢剂组合物。在每一个这类配方中，包括了至少一种本文提供的蛋白酶变体，浓度为从约0.0001至约10重量百分比。在一些备选实施方案中，可使用其他浓度，基于其需要根据制剂师确定。
实施例16
颗粒状和/或片剂的洗衣组合物
该实施例提供了多种颗粒状和/或片剂的洗衣组合物的配方。下文提供了以下本发明的洗衣组合物，其可以是颗粒状或片剂的形式。在每一个这类配方中，包括了至少一种本文提供的蛋白酶变体，浓度为从约0.0001至约10重量百分比。在一些备选实施方案中，可使用其他浓度，基于其需要根据制剂师确定。
*香料、染料、增白剂/SRP1/羧甲基纤维素Na/光漂白剂/MgSO4/PVPVI/抑泡剂/高分子PEG/粘土。
实施例17
液体洗衣去垢剂
该实施例提供了液体洗衣去垢剂的多种配方。下文提供了以下本发明的液体洗衣去垢剂。在每一个这类配方中，包括了至少一种本文提供的蛋白酶变体，浓度为从约0.0001至约10重量百分比。在一些备选实施方案中，可使用其他浓度，基于其需要根据制剂师确定。
实施例18
高密度洗碗去垢剂
该实施例提供了高密度洗碗去垢剂的多种配方。下文提供了以下本发明的致密型高密度洗碗去垢剂。在每一个这类配方中，包括了至少一种本文提供的蛋白酶变体，浓度为从约0.0001至约10重量百分比。在一些备选实施方案中，可使用其他浓度，基于其需要根据制剂师确定。
*增白剂/染料/SRP1/羧甲基纤维素Na/光漂白剂/MgSO4/PVPVI/抑泡剂/高分子PEG/粘土。
实施例18(I)-(VI)的pH是约9.6至约11.3。
实施例19
片剂去垢剂组合物
该实施例提供了多种片剂去垢剂配方。通过使用标准的12头旋转压缩机，在13KN/cm2的压力下压缩颗粒状的洗碗去垢剂组合物，来制备以下本发明的片剂去垢剂组合物。在每一个这类配方中，包括了至少一种本文提供的蛋白酶变体，浓度为从约0.0001至约10重量百分比。在一些备选实施方案中，可使用其他浓度，基于其需要根据制剂师确定。
*增白剂//SRP1/羧甲基纤维素Na/光漂白剂/MgSO4/PVPVI/抑泡剂/高分子PEG/粘土。
实施例19(I)至19(VII)的pH是约10至约11.5；19(VIII)的pH是8-10。实施例19(I)至19(VIII)的片剂重量是从约20克至约30克。
实施例20
液体手洗表面清洁去垢剂
该实施例提供了多种液体手洗表面清洁去垢剂。下文提供了以下本发明的液体手洗表面清洁去垢剂组合物。在每一个这类配方中，包括了至少一种本文提供的蛋白酶变体，浓度为从约0.0001至约10重量百分比。在一些备选实施方案中，可使用其他浓度，基于其需要根据制剂师确定。
实施例20(I)至(VII)的pH是约7.4至约9.5。
Claims (33)
1.芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形态，并且在3个或多个位置上包含取代，所述位置选自：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30，31，32，33，34，35，36，37，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，58，59，60，61，62，63，64，65，66，67，68，69，71，72，73，74，75，76，77，78，79，80，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，113，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，154，155，156，157，158，159，160，161，162，163，164，165，166，167，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，189，190，191，192，193，194，195，196，197，198，199，200，201，202，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，219，220，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274和275，其中所述位置对照SEQ ID NO：1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。
2.权利要求1的芽孢杆菌属枯草杆菌蛋白酶的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形态，并且在3个或多个位置上包含取代，所述位置选自：1、3、4、8、9、10、11、12、13、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29，30，31，33，35，36，38，40，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，59，61，62，68，69，72，73，76，78，84，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，114，115，116，117，118，119，120，121，122，124，126，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，156，158，159，160，165，166，167，170，171，172，173，174，175，176，177，180，182，183，184，185，186，187，188，191，194，195，198，199，203，204，206，209，210，211，212，213，215，216，217，218，222，223，224，227，228，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249、250、251、252、253、255、256、258、259、260、261、262、265、267、268、269、270、271、272、273、274和275，其中所述位置对照SEQID NO：1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。
3.权利要求1的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是具有蛋白水解活性的成熟形态，并且在3个或多个位置上包含取代，所述位置选自：1、2、3、4，5，7，8，9，10，11，12，13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，33，35，36，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，59，60，61，62，63，66，68，69，71，72，73，74，75，76，77，78，79，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，156，158，159，160，165，166，167，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，191，192，194，195，196，197，198，199，200，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，220，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263、264、265、267、268、269、270、271、272、273、274和275，其中所述位置对照SEQ ID NO：1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。
4.权利要求1的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述在3个或多个位置上的取代选自：X001A、X001C、X001E、X001F、X001G、X001H、X001I、X001K、X001L、X001N，X001P，X001Q，X001R，X001S，X001T，X001V，X001Y，X002A，X002C，X002E，X002G，X002K，X002L，X002M，X002N，X002P，X002Q，X002R，X002S，X002T，X002V，X002W，X002Y，X003D，X003E，X003F，X003G，X003H，X003I，X003L，X003M，X003N，X003P，X003R，X003S，X003T，X003V，X003W，X003Y，X004A，X004C，X004D，X004E，X004F，X004G，X004H，X004K，X004L，X004N，X004P，X004R，X004S，X004T，X004V，X004W，X005A，X005C，X005D，X005E，X005G，X005I，X005M，X005P，X005Q，X005S，X005T，X005W，X005Y，X006A，X006D，X006E，X006M，X006W，X007A，X007C，X007D，X007G，X007H，X007N，X007P，X007Q，X007S，X007T，X008A，X008F，X008G，X008I，X008L，X008M，X008Q，X008T，X008V，X008W，X008Y，X009A，X009C，X009D，X009E，X009F，X009G，X009H，X009L，X009N，X009P，X009Q，X009R，X009S，X009T，X009V，X009W，X009Y，X010A，X010C，X010F，X010G，X010H，X010I，X010K，X010L，X010M，X010N，X010Q，X010R，X010S，X010T，X010V，X010W，X010Y，X011A，X011C，X011D，X011G，X011I，X011M，X011R，X011S，X011T，X011V，X011Y，X012D，X012F，X012G，X012H，X012I，X012K，X012L，X012M，X012N，X012P，X012Q，X012R，X012S，X012T，X012V，X012W，X012Y，X013A，X013G，X013I，X013M，X0130，X013T，X013V，X014A，X014C，X014D，X014E，X014F，X014G，X014H，X014I，X014K，X014L，X014P，X014Q，X014S，X014T，X014V，X014Y，X015A，X015D，X015F，X015G，X015I，X015K，X015L，X015M，X015P，X015Q，X015R，X015S，X015V，X015W，X016A，X016D，X016E，X016G，X016L，X016N，X016P，X016Q，X016R，X016S，X016T，X016V，X017A，X017D，X017E，X017F，X017G，X017H，X017I，X017K，X017M，X017N，X017R，X017S，X017T，X017V，X017W，X017Y，X018A，X018C，X018D，X018E，X018F，X018G，X018H，X018I，X018K，X018L，X018M，X018N，X018P，X018Q，X018R，X018S，X018T，X018V，X018W，X018Y，X019A，X019C，X019D，X019E，X019F，X019G，X019H，X019K，X019L，X019M，X019N，X019P，X019R，X019S，X019T，X019V，X019W，X019Y，X020A，X020C，X020D，X020F，X020G，X020I，X020K，X020L，X020M，X020P，X020Q，X020R，X020S，X020T，X020V，X020W，X020Y，X021A，X021C，X021D，X021E，X021G，X021H，X021I，X021K，X021L，X021M，X021N，X021P，X021Q，X021R，X021S，X021T，X021V，X021W，X022A，X022C，X022G，X022I，X022K，X022L，X022M，X022N，X022P，X022Q，X022R，X022S，X022T，X022V，X022W，X022Y，X023A，X023G，X023S，X024A，X024C，X024D，X024F，X024G，X024H，X024L，X024M，X024N，X024P，X024Q，X024R，X024S，X024T，X024V，X024W，X025C，X025D，X025E，X025F，X025G，X025H，X025K，X025L，X025M，X025N，X025Q，X025R，X025S，X025T，X025V，X025W，X026C，X026F，X026G，X026I，X026L，X026M，X026N，X026P，X026R，X026S，X026T，X026V，X027A，X027C，X027D，X027F，X027G，X027I，X027K，X027L，X027M，X027N，X027P，X027R，X027S，X027T，X027V，X027W，X027Y，X028A，X028E，X028G，X028H，X028I，X028L，X028M，X028N，X028P，X028S，X028V，X028Y，X029A，X029C，X029G，X029I，X029K，X029S，X029T，X029V，X030A，X030C，X030D，X030E，X030F，X030G，X030L，X030M，X030Q，X030S，X030T，X030V，X031A，X031F，X031I，X031L，X031M，X031S，X031T，X031V，X032A，X032C，X032D，X032E，X032G，X032V，X032W，X033A，X033C，X033D，X033E，X033G，X033H，X033I，X033L，X033M，X033N，X033Q，X033R，X033S，X033T，X033V，X033Y，X034E，X034G，X034H，X034L，X034Q，X034S，X035A，X035F，X035H，X035I，X035K，X035L，X035M，X035P，X035Q，X035R，X035S，X035A，X035C，X035E，X035F，X035G，X035H，X035I，X035L，X035M，X035N，X035P，X035Q，X035R，X035T，X035V，X035W，X035Y，X038C，X038F，X038G，X038H，X038I，X038K，X038L，X038M，X038N，X038Q，X038R，X038T，X038V，X038W，X038Y，X039A，X039E，X039G，X039H，X039L，X039M，X039N，X039Q，X039S，X039T，X039V，X039Y，X040A，X040C，X040D，X040E，X040G，X040H，X040I，X040K，X040L，X040M，X040N，X040P，X040R，X040S，X040T，X040V，X040W，X040Y，X041C，X041D，X041E，X041N，X041P，X041Q，X041S，X042A，X042C，X042F，X042G，X042H，X042I，X042L，X042M，X042N，X042Q，X042S，X042T，X042V，X042Y，X043A，X043C，X043D，X043E，X043F，X043G，X043I，X043L，X043M，X043N，X043P，X043R，X043S，X043T，X043V，X043W，X043Y，X044A，X044C，X044D，X044F，X044G，X044I，X044K，X044L，X044M，X044N，X044P，X044Q，X044R，X044S，X044T，X044V，X044W，X044Y，X045A，X045D，X045F，X045G，X045H，X045I，X045K，X045L，X045M，X045N，X045P，X045Q，X045R，X045S，X045T，X045V，X045W，X045Y，X046C，X046D，X046E，X046F，X046G，X046H，X046I，X046K，X046L，X046M，X046N，X046P，X046Q，X046R，X046S，X046T，X046V，X046W，X047A，X047C，X047E，X047F，X047G，X047H，X047K，X047L，X047M，X047N，X047P，X047Q，X047R，X047S，X047T，X047W，X048A，X048C，X048E，X048F，X048G，X048H，X048I，X048K，X048L，X048M，X048N，X048P，X048Q，X048R，X048S，X048T，X048V，X048Y，X049A，X049E，X049F，X049G，X049H，X049K，X049L，X049M，X049P，X049Q，X049R，X049S，X049T，X050C，X050F，X050G，X050H，X050I，X050L，X050N，X050T，X050V，X050Y，X051F，X051G，X051H，X051K，X051L，X051N，X051P，X051R，X051S，X051T，X051V，X051W，X052A，X052C，X052E，X052F，X052G，X052H，X052I，X052L，X052M，X052N，X052P，X052Q，X052R，X052T，X052V，X052W，X052Y，X053A，X053C，X053D，X053E，X053G，X053H，X053I，X053K，X053L，X053M，X053P，X053Q，X053R，X053S，X053T，X053V，X053W，X053Y，X054A，X054C，X054D，X054E，X054F，X054G，X054H，X054I，X054K，X054L，X054M，X054N，X054P，X054Q，X054R，X054S，X054V，X054W，X054Y，X055A，X055C，X055E，X055F，X055G，X055H，X055I，X055K，X055L，X055M，X055N，X055P，X055Q，X055R，X055S，X055T，X055W，X055Y，X056A，X056C，X056D，X056E，X056H，X056L，X056M，X056N，X056P，X056Q，X056R，X056S，X056T，X056V，X057A，X057C，X057E，X057F，X057G，X057H，X057I，X057K，X057L，X057M，X057N，X057P，X057Q，X057R，X057S，X057T，X057V，X057W，X057Y，X059A，X059C，X059D，X059E，X059F，X059G，X059I，X059K，X059L，X059M，X059N，X059P，X059Q，X059R，X059S，X059T，X059V，X059W，X059Y，X060A，X060C，X060D，X060F，X060G，X060K，X060L，X060M，X060N，X060P，X060Q，X060S，X060T，X060V，X060W，X060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ID NO：1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。
5.分离的枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体在选自BMI测定、蛋黄微样品测定和/或AAPF活性测定的至少一种测定中具有大于1的性能指数，以及在LAS稳定性或TCA测定中具有大于0.8的性能指数，其中所述变体在1个或多个位置上包含至少一个取代，所述位置选自：1、2、3、4、5、7、8、9、10、11、12、13，14，15，16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，33，35，36，38，39，40，41，42，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，59，60，61，62，63，66，68，69，71，72，73，74，75，76，77，78，79，81，82，83，84，85，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，114，115，116，117，118，119，120，121，122，123，124，125，126，127，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，138，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，153，156，158，159，160，165，166，167，169，170，171，172，173，174，175，176，177，178，179，180，181，182，183，184，185，186，187，188，191，192，194，195，196，197，198，199，200，203，204，205，206，207，208，209，210，211，212，213，214，215，216，217，218，220，222，223，224，225，226，227，228，229，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，254，255，256，257，258，259，260，261，262，263，264，265，267，268、269、270、271、272、273、274和275，其中所述位置对照SEQ IDNO：1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。
6.分离的枯草杆菌蛋白酶变体，所述变体在选自BMI测定、蛋黄微样品测定和/或AAPF活性测定的至少一种测定中具有大于0.8的性能指数，以及在LAS稳定性或TCA测定中具有大于0.8的性能指数，其中所述变体在1个或多个位置上包含至少一个取代，所述位置选自：1、3、4、8、9、10、11、12、13、15、16，17，18，19，20，21，22，23，24，25，26，27，28，29，30，31，33，35，36，38，40，43，44，45，46，47，48，49，50，51，52，53，54，55，56，57，59，61，62，68，69，72，73，76，78，84，86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，105，106，107，108，109，110，111，112，114，115，116，117，118，119，120，121，122，124，126，128，129，130，131，132，133，134，135，136，137，139，140，141，142，143，144，145，146，147，148，149，150，151，152，156，158，159，160，165，166，167，170，171，172，173，174，175，176，177，180，182，183，184，185，186，187，188，191，194，195，198，199，203，204，206，209，210，211，212，213，215，216，217，218，222，223，224，227，228，230，231，232，233，234，235，236，237，238，239，240，241，242，243，244，245，246，247，248，249，250，251，252，253，255，256，258，259，260，261，262、265、267、268、269、270、271、272、273、274和275，其中所述位置对照SEQ ID NO：1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。
7.权利要求5的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述分离的变体在选自BMI测定、蛋黄微样品测定和/或AAPF活性测定的至少一种测定中具有大于1的性能指数，以及在LAS/EDTA稳定性或TCA测定中具有大于0.8的性能指数，其中所述变体包含至少3个取代，所述取代选自：X001A、X001C，X001E，X001F，X001G，X001H，X001I，X001K，X001L，X001N，X001Q，X001R，X001S，X001T，X001V，X001Y，X002A，X002C，X002E，X002G，X002K，X002L，X002M，X002N，X002P，X002Q，X002R，X002S，X002T，X002V，X002W，X002Y，X003D，X003E，X003F，X003G，X003H，X003I，X003L，X003M，X003N，X003P，X003R，X003S，X003T，X003V，X003W，X003Y，X004A，X004C，X004D，X004E，X004F，X004H，X004K，X004L，X004N，X004P，X004R，X004S，X004T，X004V，X004W，X005A，X005C，X005D，X005E，X005G，X005P，X005Q，X005S，X005T，X007A，X007C，X007D，X007G，X007H，X007N，X007S，X007T，X008A，X008F，X008I，X008L，X008M，X008T，X008V，X009D，X009E，X009F，X009G，X009H，X009L，X009N，X009P，X009Q，X009R，X009S，X009T，X009V，X009W，X009Y，X010A，X010C，X010G，X010H，X010K，X010M，X010N，X010Q，X010R，X010S，X010T，X010W，X011A，X011I，X011M，X011S，X011V，X012D，X012F，X012G，X012H，X012I，X012K，X012L，X012M，X012N，X012Q，X012R，X012S，X012T，X012V，X012W，X013A，X013G，X013I，X013T，X013V，X014A，X014D，X014E，X014F，X014H，X014I，X014K，X014L，X014P，X014Q，X014S，X014T，X014V，X014Y，X015A，X015D，X015F，X015G，X015I，X015K，X015L，X015M，X015P，X015Q，X015R，X015S，X015V，X015W，X016A，X016G，X016L，X016N，X016P，X016Q，X016S，X016T，X016V，X017A，X017F，X017H，X017I，X017K，X017M，X017N，X017R，X017S，X017V，X017W，X017Y，X018A，X018C，X018D，X018E，X018F，X018G，X018H，X018K，X018L，X018M，X018N，X018P，X018Q，X018R，X018S，X018T，X018V，X018W，X018Y，X019A，X019C，X019D，X019E，X019F，X019G，X019H，X019K，X019L，X019M，X019N，X019R，X019S，X019T，X019V，X019W，X019Y，X020A，X020C，X020D，X020F，X020G，X020I，X020K，X020L，X020M，X020P，X020Q，X020R，X020S，X020T，X020V，X020W，X020Y，X021A，X021C，X021D，X021E，X021G，X021H，X021I，X021K，X021L，X021M，X021N，X021P，X021Q，X021R，X021S，X021T，X021V，X021W，X022A，X022C，X022G，X022I，X022K，X022L，X022M，X022N，X022P，X022Q，X022R，X022S，X022T，X022V，X022W，X022Y，X023A，X023G，X023S，X024A，X024C，X024D，X024F，X024G，X024H，X024L，X024M，X024N，X024P，X024Q，X024R，X024S，X024T，X024V，X024W，X025C，X025D，X025E，X025F，X025G，X025H，X025K，X025L，X025M，X025N，X025Q，X025R，X025S，X025T，X025V，X025W，X026C，X026F，X026G，X026I，X026L，X026M，X026N，X026P，X026R，X026S，X026T，X026V，X027A，X027C，X027D，X027F，X027G，X027I，X027K，X027L，X027M，X027N，X027P，X027R，X027S，X027T，X027V，X027W，X027Y，X028A，X028E，X028H，X028I，X028L，X028M，X028N，X028S，X028V，X029A，X029C，X029G，X029S，X029V，X030C，X030E，X030L，X030S，X030T，X030V，X031A，X031F，X031I，X031L，X031M，X031S，X031T，X031V，X033A，X033D，X033E，X033G，X033H，X033M，X033N，X033Q，X033S，X033T，X033Y，X035A，X035F，X035I，X035L，X035M，X035P，X036A，X036C，X036E，X036F，X036G，X036H，X036I，X036L，X036M，X036N，X036Q，X036R，X036S，X036T，X036V，X038C，X038F，X038G，X038H，X038I，X038K，X038L，X038M，X038N，X038Q，X038R，X038T，X038V，X038W，X038Y，X039H，X039V，X040A，X040C，X040D，X040E，X040G，X040H，X040I，X040K，X040L，X040M，X040N，X040P，X040R，X040S，X040T，X040V，X040W，X040Y，X041D，X041E，X042C，X042H，X042I，X042L，X042M，X042N，X042T，X042V，X043A，X043C，X043D，X043E，X043F，X043G，X043I，X043L，X043M，X043N，X043P，X043R，X043S，X043T，X043V，X043W，X043Y，X044A，X044C，X044D，X044G，X044I，X044K，X044L，X044M，X044N，X044P，X044Q，X044R，X044S，X044T，X044V，X044W，X044Y，X045A，X045D，X045F，X045G，X045H，X045I，X045K，X045L，X045M，X045N，X045P，X045Q，X045R，X045S，X045T，X045V，X045W，X045Y，X046C，X046D，X046E，X046F，X046G，X046H，X046I，X046K，X046L，X046M，X046N，X046P，X046Q，X046R，X046S，X046T，X046V，X046W，X047A，X047F，X047G，X047N，X047R，X047S，X047T，X047W，X048A，X048C，X048E，X048F，X048G，X048H，X048I，X048K，X048L，X048M，X048N，X048P，X048Q，X048R，X048S，X048T，X048V，X048Y，X049A，X049F，X049G，X049L，X049M，X049P，X049S，X049T，X050C，X050F，X050H，X050I，X050L，X050N，X050T，X050V，X050Y，X051F，X051G，X051H，X051K，X051L，X051N，X051P，X051R，X051S，X051T，X051V，X051W，X052A，X052C，X052E，X052F，X052G，X052H，X052I，X052L，X052M，X052N，X052P，X052Q，X052R，X052T，X052V，X052W，X052Y，X053A，X053C，X053D，X053E，X053G，X053H，X053K，X053L，X053M，X053P，X053Q，X053R，X053S，X053T，X053V，X053W，X053Y，X054A，X054C，X054D，X054E，X054F，X054I，X054M，X054N，X054Q，X054S，X054V，X055A，X055C，X055E，X055F，X055G，X055H，X055I，X055K，X055L，X055M，X055N，X055P，X055Q，X055S，X055T，X055W，X055Y，X056A，X056C，X056D，X056E，X056H，X056L，X056M，X056N，X056P，X056Q，X056S，X056T，X057A，X057C，X057E，X057F，X057G，X057H，X057I，X057K，X057L，X057M，X057N，X057P，X057Q，X057R，X057S，X057T，X057V，X057W，X057Y，X059A，X059C，X059D，X059E，X059F，X059G，X059I，X059L，X059M，X059N，X059P，X059Q，X059R，X059S，X059T，X059V，X059W，X059Y，X060D，X060S，X060V，X061A，X061C，X061D，X061F，X061G，X061H，X061I，X061L，X061M，X061N，X061P，X061R，X061S，X061T，X061V，X061Y，X062C，X062E，X062F，X062G，X062H，X062I，X062K，X062L，X062M，X062N，X062P，X062Q，X062R，X062S，X062T，X062V，X062Y，X063A，X063C，X063D，X063E，X063F，X063G，X063H，X063K，X063M，X063Q，X063R，X063S，X063W，X066K，X066S，X066T，X068I，X068T，X068V，X069A，X069E，X069G，X069N，X069S，X069T，X071A，X071I，X071N，X071T，X071V，X072C，X072F，X072I，X072L，X072M，X072T，X072V，X073A，X073C，X073D，X073E，X073H，X073K，X073L，X073N，X073S，X073T，X073V，X074A，X074C，X074S，X075A，X075H，X075I，X075L，X075M，X075N，X075P，X075Q，X075R，X075S，X075V，X076D，X076E，X076F，X076G，X076H，X076K，X076M，X076N，X076Q，X076R，X076S，X076T，X076W，X076Y，X077D，X077N，X078A，X078C，X078E，X078F，X078G，X078H，X078I，X078K，X078L，X078M，X078N，X078P，X078Q，X078R，X078S，X078T，X078V，X078Y，X079C，X079D，X079E，X079F，X079G，X079I，X079K，X079L，X079N，X079Q，X079R，X079S，X079T，X079V，X079W，X079Y，X081C，X081G，X081H，X081I，X081L，X081M，X081Q，X081S，X081T，X081V，X082A，X082E，X082F，X082K，X082L，X082M，X082Q，X082R，X082T，X082V，X082Y，X083G，X083S，X084C，X084E，X084G，X084I，X084L，X084M，X084N，X084T，X084V，X085A，X085C，X085I，X086A，X086C，X086D，X086E，X086G，X086P，X086S，X086W，X086Y，X087A，X087C，X087D，X087E，X087F，X087G，X087I，X087K，X087L，X087N，X087S，X087T，X087V，X087Y，X088A，X088C，X088D，X088G，X088Q，X088S，X088W，X089A，X089C，X089D，X089E，X089F，X089G，X089H，X089I，X089L，X089N，X089P，X089Q，X089R，X089S，X089T，X089V，X089W，X090A，X090C，X090F，X090G，X090I，X090K，X090L，X090M，X090Q，X090T，X090V，X091C，X091D，X091F，X091I，X091K，X091L，X091M，X091N，X091Q，X091R，X091S，X091T，X091V，X091W，X091Y，X092A，X092D，X092G，X092N，X092P，X092R，X092T，X092V，X093A，X093C，X093G，X093L，X093M，X093S，X093T，X093V，X093Y，X094K，X094N，X094Q，X094R，X095A，X095C，X095G，X095I，X095K，X095R，X095S，X095T，X095V，X095W，X096E，X096I，X096L，X096M，X096T，X097A，X097D，X097E，X097G，X097H，X097I，X097K，X097L，X097M，X097N，X097P，X097Q，X097R，X097S，X097T，X097V，X097Y，X098A，X098C，X098D，X098E，X098F，X098G，X098K，X098L，X098N，X098P，X098Q，X098R，X098S，X098T，X098V，X098Y，X099A，X099C，X099F，X099G，X099K，X099M，X099P，X099Q，X099R，X099S，X099T，X099V，X099Y，X100D，X100E，X100G，X100I，X100P，X100S，X100V，X100Y，X101A，X101D，X101E，X101F，X101G，X101H，X101I，X101K，X101N，X101P，X101Q，X101R，X101S，X101T，X101V，X101Y，X102A，X102C，X102D，X102G，X102N，X102T，X103A，X103D，X103E，X103F，X103G，X103I，X103L，X103N，X103P，X103Q，X103R，X103S，X103T，X103V，X103Y，X104A，X104C，X104D，X104E，X104F，X104H，X104I，X104L，X104P，X104R，X104S，X104T，X104V，X104W，X104Y，X105A，X105C，X105D，X105E，X105F，X105G，X105H，X105I，X105K，X105L，X105N，X105Q，X105R，X105S，X105T，X105V，X105W，X105Y，X106A，X106D，X106E，X106F，X106G，X106I，X106L，X106M，X106P，X106R，X106S，X106V，X106W，X107A，X107F，X107I，X107L，X107M，X107Q，X107S，X107T，X107V，X108A，X108G，X108I，X108L，X108S，X108T，X108V，X109A，X109C，X109E，X109F，X109G，X109H，X109I，X109K，X109L，X109M，X109N，X109Q，X109R，X109S，X109T，X109W，X109Y，X110A，X110G，X110S，X111C，X111E，X111F，X111I，X111L，X111M，X111V，X111Y，X112A，X112C，X112D，X112E，X112F，X112G，X112I，X112L，X112N，X112Q，X112S，X112T，X112V，X112W，X112Y，X114A，X114C，X114G，X114T，X115C，X115E，X115F，X115G，X115H，X115I，X115K，X115L，X115M，X115N，X115P，X115Q，X115R，X115S，X115T，X115V，X115W，X115Y，X116A，X116C，X116D，X116F，X116G，X116I，X116K，X116L，X116M，X116N，X116Q，X116S，X116T，X116V，X116W，X117A，X117C，X117D，X117F，X117G，X117I，X117N，X117Q，X117R，X117T，X117Y，X118A，X118C，X118D，X118E，X118F，X118G，X118I，X118K，X118L，X118M，X118N，X118P，X118R，X118S，X118T，X118V，X118W，X119A，X119C，X119F，X119H，X119M，X119N，X119Q，X119T，X119W，X120A，X120C，X120E，X120F，X120G，X120H，X120I，X120L，X120M，X120N，X120R，X120S，X120T，X120W，X121A，X121C，X121E，X121F，X121G，X121I，X121L，X121M，X121Q，X121S，X121T，X121V，X121Y，X122A，X122C，X122G，X122I，X122L，X122S，X122T，X122V，X123G，X123N，X123S，X124G，X124L，X124S，X124T，X125A，X125S，X126A，X126F，X126L，X127F，X127G，X127I，X127R，X127S，X127T，X128A，X128F，X128G，X128I，X128K，X128L，X128M，X128N，X128Q，X128R，X128S，X128T，X128W，X129A，X129E，X129F，X129G，X129I，X129L，X129M，X129N，X129P，X129R，X129S，X129T，X129V，X129W，X129Y，X130C，X130K，X130L，X130N，X130Q，X130R，X130S，X130V，X130W，X130Y，X131A，X131D，X131E，X131F，X131G，X131I，X131K，X131L，X131P，X131Q，X131R，X131V，X132A，X132E，X132F，X132H，X132I，X132L，X132M，X132N，X132Q，X132S，X132T，X132W，X133A，X133F，X133K，X133L，X133N，X133P，X133Q，X133S，X133T，X133V，X133Y，X134A，X134F，X134I，X134L，X134M，X134P，X134S，X134T，X134V，X135C，X135E，X135L，X135M，X135W，X136A，X136E，X136F，X136K，X136Q，X136R，X136S，X136V，X136W，X136Y，X137A，X137C，X137E，X137G，X137H，X137K，X137L，X137M，X137Q，X137R，X137S，X137V，X137W，X138A，X138G，X138M，X138R，X138V，X139A，X139C，X139I，X139M，X139T，X139V，X140A，X140C，X140D，X140E，X140F，X140G，X140I，X140L，X140M，X140N，X140Q，X140R，X140S，X140T，X140V，X140Y，X141D，X141E，X141G，X141H，X141I，X141K，X141L，X141N，X141Q，X141R，X141S，X141V，X141Y，X142A，X142C，X142L，X142T，X142V，X142Y，X143C，X143D，X143F，X143G，X143H，X143I，X143K，X143L，X143M，X143N，X143S，X143T，X143V，X143W，X143Y，X144A，X144C，X144D，X144G，X144H，X144I，X144L，X144M，X144N，X144Q，X144R，X144S，X144T，X144V，X144W，X144Y，X145A，X145C，X145D，X145E，X145F，X145G，X145K，X145L，X145M，X145N，X145Q，X145R，X145S，X145T，X145W，X145Y，X146A，X146C，X146D，X146E，X146G，X146K，X146Q，X147I，X147L，X147M，X147T，X147V，X148A，X148C，X148E，X148F，X148H，X148I，X148L，X148M，X148N，X148S，X148T，X148V，X148Y，X149A，X149C，X149I，X149L，X149M，X149P，X149S，X149T，X149V，X150A，X150F，X150L，X150T，X150V，X151A，X151G，X151S，X152A，X152S，X153A，X153G，X153S，X153V，X156A，X156C，X156D，X156E，X156F，X156L，X156M，X156N，X156S，X156T，X158A，X158C，X158E，X158F，X158H，X158K，X158L，X158M，X158Q，X158R，X158S，X158T，X158V，X158W，X159A，X159C，X159E，X159G，X159H，X159M，X159P，X159Q，X159R，X159S，X159W，X160A，X160C，X160D，X160F，X160G，X160I，X160L，X160M，X160N，X160Q，X160R，X160S，X160T，X160V，X160Y，X165I，X165L，X165T，X165V，X166A，X166C，X166D，X166E，X166H，X166M，X166N，X166S，X167C，X167D，X167E，X167F，X167P，X167V，X167W，X167Y，X169A，X169G，X169S，X170A，X170D，X170E，X170G，X170H，X170K，X170L，X170P，X170Q，X170R，X170S，X170V，X170W，X170Y，X171C，X171F，X171L，X171N，X171Y，X172A，X172C，X172D，X172F，X172G，X172I，X172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X256V，X256W，X256Y，X257C，X257F，X257I，X257K，X257L，X257M，X257V，X258A，X258C，X258D，X258E，X258F，X258G，X258H，X258I，X258L，X258M，X258P，X258Q，X258R，X258S，X258T，X258V，X258W，X258Y，X259A，X259C，X259E，X259G，X259I，X259L，X259M，X259P，X259Q，X259R，X259S，X259T，X259V，X260A，X260D，X260E，X260F，X260H，X260I，X260L，X260M，X260N，X260P，X260R，X260S，X260T，X260V，X260Y，X261A，X261C，X261E，X261F，X261G，X261I，X261K，X261L，X261N，X261P，X261Q，X261R，X261S，X261T，X261V，X261W，X261Y，X262A，X262C，X262D，X262F，X262G，X262H，X262I，X262K，X262L，X262M，X262Q，X262R，X262S，X262T，X262V，X262W，X262Y，X263C，X263F，X263L，X263Y，X264A，X264G，X265A，X265C，X265D，X265F，X265G，X265H，X265K，X265M，X265Q，X265R，X265S，X265T，X265W，X265Y，X267G，X267I，X267L，X267M，X267N，X267V，X268A，X268G，X268H，X268L，X268M，X268N，X268P，X268Q，X268S，X268V，X269C，X269D，X269F，X269G，X269H，X269I，X269L，X269M，X269N，X269Q，X269R，X269S，X269T，X269V，X270A，X270C，X270D，X270G，X270I，X270L，X270M，X270N，X270S，X270T，X270V，X271A，X271C，X271E，X271F，X271G，X271H，X271I，X271K，X271L，X271M，X271N，X271P，X271T，X271V，X271Y，X272A，X272C，X272D，X272E，X272F，X272G，X272H，X272K，X272L，X272M，X272N，X272P，X272R，X272S，X272T，X272W，X272Y，X273A，X273C，X273D，X273E，X273F，X273G，X273H，X273I，X273L，X273S，X273T，X273V，X274A，X274C，X274D，X274E，X274G，X274H，X274L，X274M，X274N，X274P，X274Q，X274R，X274S，X274T，X274W，X275A，X275C，X275D，X275E，X275F，X275G，X275H，X275K，X275L，X275M，X275P，X275Q，X275R，X275V和X275W，其中所述位置对照SEQ ID NO：1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。
8.权利要求6的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体在选自BMI测定、蛋黄微样品测定和/或AAPF活性测定的至少一种测定中具有大于1的性能指数，以及在LAS稳定性和TCA测定中具有大于0.8的性能指数，其中所述变体包含至少3个取代，所述取代选自：X001A、X001E、X001G、X001H，X001Q，X001V，X003E，X003H，X003I，X003M，X003S，X003T，X003V，X004T，X004V，X008I，X008V，X009E，X009H，X009N，X009Q，X009S，X009T，X010A，X010C，X010G，X010H，X010K，X010M，X010N，X010R，X010S，X010T，X011I，X011V，X012G，X012I，X012N，X012Q，X012S，X012T，X012V，X013A，X013G，X015A，X015D，X015F，X015G，X015I，X015L，X015M，X015P，X015Q，X015S，X015V，X015W，X016A，X016G，X016N，X016P，X016S，X016T，X016V，X017H，X017I，X017M，X017N，X018A，X018C，X018D，X018E，X018G，X018H，X018L，X018M，X018N，X018P，X018Q，X018S，X018T，X018V，X018Y，X019A，X019C，X019D，X019E，X019F，X019G，X019H，X019K，X019L，X019M，X019N，X019R，X019S，X019V，X019W，X019Y，X020A，X020C，X020D，X020F，X020G，X020I，X020K，X020L，X020M，X020P，X020Q，X020R，X020S，X020T，X020V，X020W，X020Y，X021A，X021C，X021E，X021G，X021H，X021I，X021K，X021L，X021M，X021N，X021P，X021Q，X021S，X021T，X021V，X021W，X022A，X022C，X022G，X022I，X022L，X022M，X022N，X022P，X022Q，X022T，X022V，X022W，X023A，X023G，X023S，X024A，X024C，X024D，X024F，X024G，X024H，X024L，X024M，X024N，X024P，X024Q，X024R，X024S，X024T，X024V，X024W，X025C，X025D，X025E，X025F，X025G，X025K，X025L，X025M，X025Q，X025R，X025S，X025T，X025V，X025W，X026C，X026F，X026G，X026M，X026N，X026R，X026S，X026T，X026V，X027A，X027C，X027D，X027F，X027G，X027K，X027L，X027M，X027N，X027P，X027R，X027S，X027T，X027W，X028A，X028I，X028L，X028M，X028V，X029A，X029C，X029G，X029S，X029V，X030A，X030C，X030L，X030M，X030T，X030V，X031A，X031F，X031I，X031L，X031M，X031S，X031V，X033C，X033M，X033S，X033T，X035I，X035L，X035M，X035P，X036A，X036E，X036S，X036T，X036V，X038C，X038F，X038H，X038I，X038K，X038L，X038M，X038N，X038Q，X038R，X038T，X038V，X038Y，X040A，X040D，X040E，X040I，X040L，X040P，X040V，X043A，X043C，X043D，X043E，X043F，X043G，X043I，X043L，X043M，X043N，X043R，X043S，X043T，X043W，X043Y，X044A，X044C，X044D，X044F，X044G，X044I，X044K，X044L，X044M，X044N，X044Q，X044R，X044S，X044T，X044V，X044Y，X045A，X045D，X045F，X045G，X045H，X045I，X045K，X045L，X045M，X045N，X045P，X045Q，X045R，X045S，X045T，X045V，X045W，X045Y，X046C，X046D，X046E，X046G，X046H，X046I，X046K，X046L，X046M，X046N，X046P，X046Q，X046R，X046S，X046T，X046V，X047G，X047R，X048A，X048C，X048E，X048F，X048H，X048I，X048K，X048L，X048M，X048N，X048P，X048Q，X048R，X048S，X048T，X048V，X048Y，X049A，X049G，X049H，X049S，X049T，X050F，X050H，X050I，X050L，X050T，X050V，X050Y，X051F，X051H，X051K，X051L，X051R，X051S，X051T，X051V，X051W，X052A，X052C，X052E，X052F，X052G，X052H，X052I，X052L，X052M，X052N，X052P，X052Q，X052R，X052T，X052V，X052W，X052Y，X053A，X053C，X053D，X053E，X053G，X053H，X053K，X053L，X053M，X053Q，X053R，X053S，X053T，X053W，X053Y，X054A，X054C，X054D，X054E，X054F，X054H，X054M，X054N，X054Q，X054S，X055C，X055E，X055G，X055H，X055K，X055L，X055P，X055Q，X055S，X055T，X055W，X056A，X056C，X056D，X056E，X056H，X056L，X056M，X056N，X056P，X056Q，X056S，X056T，X057C，X057E，X057F，X057G，X057H，X057I，X057L，X057M，X057N，X057P，X057Q，X057R，X057S，X057T，X057V，X057W，X057Y，X059A，X059D，X059G，X059I，X059L，X059M，X059N，X059Q，X059R，X059S，X059T，X059V，X059W，X061A，X061C，X061D，X061F，X061G，X061H，X061I，X061L，X061M，X061N，X061P，X061R，X061S，X061T，X061V，X061Y，X062C，X062E，X062F，X062H，X062I，X062K，X062L，X062M，X062N，X062Q，X062R，X062S，X062T，X062V，X068I，X068L，X068V，X069A，X069G，X069S，X069T，X072I，X072L，X072T，X072V，X073A，X073C，X073S，X076D，X076N，X078A，X078C，X078E，X078H，X078L，X078M，X078N，X078Q，X078S，X078T，X084C，X084G，X084I，X084M，X084V，X086C，X086P，X087A，X087C，X087D，X087E，X087G，X087K，X087L，X087N，X087S，X087V，X088A，X088C，X088G，X088S，X089A，X089D，X089E，X089G，X089H，X089I，X089N，X089Q，X089R，X089S，X089T，X089W，X090C，X090I，X090L，X090M，X090Q，X090T，X090V，X091D，X091F，X091I，X091N，X091S，X091V，X091W，X091Y，X092A，X092G，X092P，X092R，X092V，X093A，X093C，X093G，X093L，X093M，X093T，X093V，X094K，X094R，X095A，X095C，X095I，X095S，X095V，X096F，X096I，X096L，X096M，X097A，X097D，X097E，X097F，X097G，X097H，X097K，X097L，X097M，X097N，X097P，X097Q，X097R，X097S，X097T，X097V，X097W，X097Y，X098A，X098C，X098D，X098E，X098F，X098G，X098K，X098L，X098N，X098P，X098Q，X098R，X098S，X098T，X098V，X098Y，X099A，X099C，X099F，X099G，X099K，X099M，X099P，X099Q，X099R，X099S，X099T，X099V，X099Y，X100D，X100E，X100G，X100I，X100K，X100N，X100R，X100S，X100T，X100V，X100Y，X101A，X101C，X101D，X101E，X101F，X101G，X101H，X101I，X101K，X101N，X101P，X101Q，X101R，X101S，X101T，X101V，X101Y，X102A，X102G，X102T，X103A，X103C，X103D，X103F，X103G，X103I，X103L，X103N，X103P，X103Q，X103R，X103S，X103T，X103V，X103W，X104C，X104F，X104H，X104I，X104L，X104R，X104S，X104T，X104V，X104W，X104Y，X105A，X105C，X105D，X105E，X105F，X105G，X105K，X105L，X105N，X105Q，X105R，X105S，X105T，X105V，X106A，X106D，X106E，X106G，X106I，X106L，X106R，X106S，X106T，X106V，X106W，X107A，X107C，X107F，X107I，X107L，X107M，X107Q，X107S，X107T，X107V，X108A，X108C，X108I，X108S，X108T，X108V，X109A，X109E，X109F，X109G，X109H，X109I，X109K，X109L，X109M，X109N，X109Q，X109R，X109S，X109T，X109W，X109Y，X110A，X110G，X111F，X111I，X111L，X111M，X112D，X112E，X112I，X112Q，X112V，X114A，X114C，X115C，X115E，X115G，X115L，X115M，X115P，X115Q，X115S，X115T，X115W，X115Y，X116A，X116C，X116D，X116F，X116G，X116I，X116K，X116L，X116M，X116N，X116Q，X116S，X116T，X116V，X116W，X117A，X117C，X117N，X117Q，X117R，X117T，X117Y，X118A，X118C，X118D，X118E，X118F，X118G，X118K，X118M，X118N，X118R，X118S，X118V，X118W，X119A，X119F，X119M，X119T，X120A，X120C，X120E，X120F，X120G，X120H，X120I，X120L，X120M，X120N，X120R，X120S，X120T，X120W，X121A，X121C，X121F，X121I，X121L，X121M，X121S，X121T，X121V，X122A，X122G，X122S，X122V，X124G，X124L，X124T，X126A，X126F，X126I，X126L，X126M，X126V，X128A，X128F，X128G，X128I，X128K，X128L，X128M，X128N，X128Q，X128R，X128S，X128T，X128W，X129A，X129E，X129F，X129G，X129M，X129N，X129P，X129R，X129S，X129Y，X130C，X130K，X130L，X130N，X130Q，X130R，X130S，X130V，X130W，X130Y，X131A，X131D，X131E，X131F，X131G，X131K，X131P，X131Q，X132A，X132H，X132I，X132N，X132Q，X132R，X132S，X132T，X133A，X133F，X133K，X133N，X133P，X133S，X133T，X133V，X133Y，X134A，X134S，X134T，X134V，X135L，X135M，X135W，X136E，X136Q，X137A，X137C，X137E，X137H，X137K，X137L，X137M，X137Q，X137R，X137S，X137W，X139C，X139I，X139V，X140D，X140E，X140N，X141D，X141E，X141G，X141H，X141I，X141K，X141L，X141N，X141Q，X141R，X141S，X141V，X141Y，X142A，X142C，X142V，X143C，X143D，X143F，X143H，X143N，X143T，X144A，X144C，X144D，X144G，X144H，X144I，X144L，X144M，X144N，X144R，X144S，X144T，X144V，X144Y，X145A，X145C，X145D，X145F，X145K，X145L，X145N，X145Q，X145R，X146D，X146G，X147I，X147L，X147T，X147V，X148C，X148I，X148L，X148M，X148N，X148V，X149C，X149I，X149L，X149V，X150A，X150L，X150T，X150V，X151A，X151S，X152A，X152S，X156D，X156E，X156L，X156N，X156S，X156T，X158A，X158C，X158E，X158F，X158H，X158K，X158L，X158M，X158Q，X158R，X158S，X158T，X158V，X159A，X159C，X159E，X159G，X159H，X159M，X159P，X159S，X160A，X160C，X160D，X160F，X160I，X160L，X160M，X160N，X160Q，X160S，X160T，X160V，X160Y，X165I，X165L，X165V，X166A，X166C，X166D，X166E，X166H，X166M，X166S，X166T，X167F，X167Y，X170A，X170D，X170E，X170G，X170H，X170K，X170Q，X170R，X170S，X170V，X170Y，X171C，X171Y，X172A，X172C，X172D，X172G，X172I，X172K，X172L，X172M，X172P，X172Q，X172R，X172S，X172V，X172Y，X173A，X173C，X173D，X173H，X173M，X173N，X173Q，X173T，X174A，X174S，X174T，X174V，X175L，X175M，X175V，X176A，X176S，X177C，X177V，X180T，X180V，X182A，X182D，X182E，X182Q，X183A，X183D，X183N，X183Q，X183S，X184D，X184N，X185A，X185C，X185E，X185H，X185K，X185M，X185N，X185Q，X185T，X185V，X186I，X186K，X186L，X186R，X187A，X187C，X188A，X188D，X188E，X188F，X188H，X188I，X188K，X188L，X188P，X188Q，X188S，X188T，X191A，X191D，X191Q，X191S，X194A，X194C，X194D，X194E，X194F，X194H，X194I，X194L，X194M，X194P，X194Q，X194R，X194S，X194T，X194W，X194Y，X195C，X195D，X195E，X195G，X195Q，X198I，X198L，X199C，X199M，X199S，X199V，X203C，X203E，X203T，X203V，X204A，X204C，X204E，X204G，X204N，X204S，X206D，X206E，X206H，X206L，X206N，X206Q，X206S，X209F，X209M，X209W，X209Y，X210A，X210C，X210I，X210L，X210M，X210N，X210P，X211A，X211C，X211E，X211G，X211H，X211I，X211M，X211P，X211Q，X211T，X211V，X212C，X212F，X212G，X212H，X212M，X212N，X212R，X212S，X212Y，X213A，X213D，X213E，X213N，X213Q，X213S，X213T，X215A，X215C，X215D，X215E，X215H，X215I，X215K，X215M，X215N，X215S，X215T，X215V，X215Y，X216A，X216C，X216D，X216E，X216F，X216H，X216I，X216L，X216M，X216N，X216Q，X216S，X216V，X216W，X216Y，X217A，X217C，X217D，X217E，X217F，X217K，X217L，X217M，X217Q，X218C，X218D，X218E，X218N，X218Q，X222C，X222M，X222S，X223A，X223S，X224A，X224N，X224S，X224T，X227A，X227C，X227V，X228A，X228G，X228S，X228V，X230A，X230G，X230N，X230S，X230T，X230V，X231A，X231C，X231F，X231G，X231S，X232A，X232L，X232M，X233A，X233C，X233E，X233G，X233I，X233L，X233N，X233Q，X233S，X233T，X233V，X234L，X234M，X234N，X234Q，X234S，X234T，X234V，X235C，X235F，X235G，X235H，X235I，X235K，X235L，X235M，X235N，X235Q，X235R，X235S，X235V，X235W，X235Y，X236A，X236C，X236E，X236F，X236H，X236N，X236Q，X236S，X236T，X236Y，X237A，X237C，X237F，X237G，X237H，X237I，X237K，X237L，X237M，X237Q，X237R，X237S，X237T，X237V，X237W，X237Y，X238C，X238D，X238E，X238F，X238G，X238H，X238I，X238K，X238L，X238M，X238N，X238Q，X238R，X238S，X238T，X238V，X238Y，X239C，X239D，X239F，X239G，X239H，X239K，X239L，X239M，X239N，X239P，X239Q，X239R，X239S，X239T，X239V，X239W，X239Y，X240A，X240C，X240E，X240F，X240I，X240K，X240M，X240N，X240Q，X240R，X240S，X240T，X240W，X240Y，X241A，X241C，X241D，X241E，X241F，X241G，X241H，X241I，X241K，X241L，X241M，X241N，X241Q，X241R，X241S，X241T，X241V，X241W，X241Y，X242A，X242C，X242D，X242G，X242H，X242I，X242L，X242M，X242P，X242Q，X242S，X242T，X242V，X243C，X243D，X243E，X243F，X243G，X243H，X243I，X243L，X243M，X243N，X243P，X243Q，X243S，X243T，X243V，X243W，X244D，X244E，X244F，X244H，X244I，X244L，X244M，X244N，X244Q，X244S，X244T，X244V，X244W，X245A，X245C，X245E，X245G，X245H，X245K，X245L，X245P，X245Q，X245S，X245V，X245W，X245Y，X246A，X246C，X246I，X246L，X246M，X246T，X246V，X247A，X247C，X247F，X247G，X247H，X247K，X247L，X247M，X247N，X247R，X247S，X247T，X247V，X247W，X247Y，X248C，X248D，X248E，X248G，X248H，X248I，X248L，X248N，X248P，X248R，X248S，X248T，X248V，X248Y，X249A，X249D，X249E，X249F，X249G，X249H，X249I，X249K，X249L，X249M，X249N，X249Q，X249S，X249T，X249W，X249Y，X250C，X250I，X250L，X250M，X250V，X251A，X251D，X251E，X251F，X251G，X251K，X251L，X251M，X251Q，X251R，X251T，X251V，X251Y，X252A，X252C，X252D，X252F，X252G，X252H，X252I，X252K，X252L，X252M，X252N，X252R，X252S，X252V，X252W，X253A，X253E，X253H，X253M，X253S，X253T，X253W，X255A，X255C，X255D，X255E，X255I，X255L，X255N，X255Q，X255T，X255V，X255Y，X256A，X256C，X256D，X256E，X256G，X256H，X256I，X256K，X256L，X256M，X256N，X256P，X256S，X256V，X256W，X256Y，X258D，X258G，X259A，X259C，X259E，X259P，X259Q，X259S，X260A，X260D，X260E，X260H，X260I，X260N，X260P，X260S，X260T，X260V，X261A，X261C，X261E，X261F，X261I，X261K，X261L，X261N，X261P，X261Q，X261S，X261T，X261V，X261W，X261Y，X262A，X262C，X262D，X262F，X262H，X262I，X262L，X262M，X262Q，X262T，X262V，X262Y，X265A，X265D，X265S，X267I，X267L，X268A，X268L，X268V，X269D，X269H，X269N，X269Q，X269S，X270A，X270C，X270G，X270I，X270L，X270N，X270S，X270T，X270V，X271C，X271E，X272A，X272C，X272D，X272E，X272F，X272G，X272H，X272L，X272M，X272N，X272P，X272S，X272T，X272W，X272Y，X273A，X273C，X273G，X273S，X274A，X274C，X274G，X274L，X274M，X274N，X274S，X274T，X275D，X275E，X275F，X275H，X275K，X275L，X275M、X275P、X275Q和X275R，其中所述位置对照SEQ ID NO：1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。
9.权利要求1的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体在选自18、52、72、117、119、127、144、185、209和213的一个或多个位置上包含进一步的取代，并且其中所述位置对照SEQ ID NO：1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。
10.权利要求1-9的任一项的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述枯草杆菌蛋白酶变体是GG3变体。
11.权利要求1的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述分离的枯草杆菌蛋白酶变体包含选自以下的取代的组合：S87N/Q109Q/G118D/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248D，S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248N，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248N，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248R，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248R，S87R/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R，S87R/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248R，S87R/Q109R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248R，S87N/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248R，S87R/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248N，S87R/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R，S87D/Q109D/G118D/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248R，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213T/N248R，S87R/Q109R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R，S87R/Q109Q/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248N，S87N/Q109R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248N，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248R，S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248N，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248D，S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248R，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248R，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248N，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248D，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248N，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248N，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213T/N248D，S87R/Q109D/G118D/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R，S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248R，S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248N，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248N，S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248N，S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248N，S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248R，S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248R，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248N，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213T/N248N，S87R/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R，S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R，S87N/Q109D/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248N，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248D，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248D，S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213R/N248D，S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248N，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248D，S87R/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248N，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248R，S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248N，S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213T/N248R，S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248D，和S87N/Q109Q/G118V/S128LP129Q/S130A/S188R/T213E/N248R，其中所述位置对照SEQ ID NO：1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。
12.权利要求1的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体包含选自以下的取代的组合：S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213T/N248D，S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248N，S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213R/N248D，S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248D，S87R/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248R，S87R/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R，S87N/Q109D/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248D，和S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248D，其中所述位置对照SEQ ID NO：1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。
13.权利要求1的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体包含选自以下的取代的组合：S87D/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213E/N248D，S87N/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R，S87D/Q109Q/G118D/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248D，S87N/Q109R/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213E/N248D，S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248D，S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188R/T213T/N248D，S87R/Q109D/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213E/N248R，S87N/Q109Q/G118V/S128L/P129Q/S130A/S188S/T213R/N248D，和S87R/Q109D/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/T213T/N248R，其中所述位置对照SEQ ID NO：1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。
14.权利要求1的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体包含选自以下的取代的组合：A001C/S024V/1107L、A0011/R045T/1107R/A172T、A001K/A172L、A001K/A172W，A001K/I072C/L126F，A001K/I072C/L126F/S164Q，A001K/I072C/V104I/L126F，A001K/I072C/V104I/L126F/S164Q，A001K/I072V，A001K/I072V/L126F，A001K/I072V/L126F/S164F，A001K/I072V/V104I，A001K/I072V/V104I/L126F/S164I，A001K/I072V/V104I/S164F，A001K/I072V/V104I/S164Q，A001K/I107T/A172Q，A001K/I107V/G127Q，A001K/I107V/G127Q/A172Q，A001K/I107V/G127R/A172Q，A001K/L126F，A001K/L126F/S164F，A001K/L126F/S164I，A001K/L126F/S164Q，A001K/R045F/I072C，A001K/R045F/I072C/L126F，A001K/R045F/I072C/V104I/S164F，A001K/R045F/I072V/L126F/S164I，A001K/R045F/I072V/L126F/S164Q，A001K/R045F/I072V/S164F，A001K/R045F/I072V/V104G/S164T，A001K/R045F/I107L/A172N，A001K/R045F/I107T，A001K/R045F/I107V/G127Q，A001K/R045F/L126F/S164F，A001K/R045F/L126F/S164I，A001K/R045F/S164F，A001K/R045F/V104I/L126F/S164Q，A001K/R045K/I072C/L126F/S164Q，A001K/R045K/I072V/L126F，A001K/R045K/I072V/L126F/S164F，A001K/R045K/I072V/L126F/S164Q，A001K/R045K/I072V/S164F，A001K/R045K/I072V/S164Q，A001K/R045K/I072V/V104I/L126F/S164F，A001K/R045K/I072V/V104I/L126F/S164I，A001K/R045K/I072V/V104I/L126F/S164Q，A001K/R045K/I107A/A172T，A001K/R045K/I107R/G127A/A172N，A001K/R045K/I107T/G127R，A001K/R045K/I107T/G127R/A172Q，A001K/R045K/L126F，A001K/R045K/L126F/S164I，A001K/R045K/L126F/S164P，A001K/R045K/L126F/S164Q，A001K/R045K/S164F，A001K/R045K/V104I/S164Q，A001K/R045K/V104L/S164A，A001K/R045N/I107T/G127Q，A001K/R045S/V104C/L126Y/S164F，A001K/S024H/I107T/G127Q，A001K/S024H/I107T/G127R，A001K/S024H/I107V，A001K/S024H/R045N/I107T，A001K/S024H/R045N/I107T/G127Q/A172Q，A001K/S024L/R045A，A001K/S024N/I107V/G127T，A001K/S024N/R045K/A172Y，A001K/S024R/I107T，A001K/S024R/R045N/A172C，A001K/S024R/R045N/I107T，A001K/S024R/R045N/I107T/G127R，A001K/S024T/I107T/G127Q/A172Q，A001K/S024T/R045N/G127Q/A172Q，A001K/S024W/I107T/G127R，A001K/S024W/I107V/G127T/A172Q，A001K/S164Q，A001K/V104E，A001K/V104I/L126F，A001K/V104I/L126F/S164I，A001K/V104I/L126F/S164Q，A001L/I072C，A001L/R045Q/G127H/A172R，A001L/S024D/R045Y/I107Y，A001M/R045S/I107E/A172D，A001P/A172V，A001Q/R045K/I107T，A001R/A172G，A001R/A172Q，A001R/I107T，A001R/I107T/A172Q，A001R/I107T/G127Q/A172Q，A001R/I107V/A172Q，A001R/R045F，A001R/R045K/A172Q，A001R/R045K/G127R，A001R/R045K/I107T/G127Q，A001R/R045K/I107V/G127R，A001R/R045N/A172K，A001R/R045N/A172Q，A001R/R045N/I107T，A001R/R045N/I107T/G127Q，A001R/R045N/I107V/A172V，A001R/R045N/I107V/G127Q/A172Q，A001R/R045N/I107V/G127R，A001R/S024H/I107T，A001R/S024H/R045K/I107T，A001R/S024H/R045K/I107T/A172Q，A001R/S024H/R045N/I107T/A172Q，A001R/S024N，A001R/S024R，A001R/S024R/A172H，A001R/S024R/A172Q，A001R/S024R/I107V/A172L，A001R/S024R/I107V/G127R，A001R/S024R/R045F/I107T/G127Q，A001R/S024R/R045F/I107T/G127R，A001R/S024R/R045K/I107T/G127Q，A001R/S024T/I107T/A172Q，A001R/S024T/R045K/A172Q，A001R/S024T/R045K/I107L/G127P/A172P，A001R/S024T/R045N/I107T/A172Q，A001R/S024W/I107V/A172S，A001R/S024W/R045F/I107V/G127Q，A001R/S024W/R045F/I107V/G127R，A001R/S024W/R045K，A001R/S024W/R045K/I107T/A172Q，A001R/S024W/R045N/I107T，A001S/A172V，A001S/S024L/I107Y/A172S，A001T/S024H/I107L/A172Y，A001V/I107L/A172I，G097P/N185Q/A215I，G097P/Y209W/A215V/S256W，G118L/G127R/S132L，G118T/G127Q，I107A/G127K/A172G，I107C/A172S，I107P/A172S，I107Q/A172D，L126A/S164N，L126F/S164V，M119F/N185R，M119F/N185R/Y209W/S256T，M119F/N185V/Y209W，M119F/S144T/N185V/S256I，M119F/S144W/N185R/S256L，M119F/Y209W，M119F/Y209W/S256I，N018K/A215I，N018K/A215R，N018K/A215V，N018K/G097P/A215I/S256W，N018K/G097P/N185K/S256W，N018K/G097P/N185K/Y209W/A215I/S256W，N018K/G097P/N185Q/Y209W/A215V/S256W，N018K/G097P/N185R/A215R/S256W，N018K/G097P/N185R/A215V/S256W，N018K/G097P/N185R/S256W，N018K/G097P/N185R/Y209W，N018K/G097P/N185R/Y209W/S256W，N018K/G097P/Y209W/A215V/S256W，N018K/N185K，N018K/N185K/A215V/S256W，N018K/N185K/S256W，N018K/N185K/Y209W/A215R，N018K/N185Q/A215R/S256W，N018K/N185Q/A215V/S256W，N018K/N185Q/S256W，N018K/N185Q/Y209W/S256W，N018K/N185R/A215I/S256W，N018K/N185R/A215R/S256W，N018K/N185R/A215V，N018K/N185R/Y209W/A215V/S256W，N018K/S256W，N018Q/G097P/N185K/A215V，N018Q/G097P/N185K/Y209W，N018Q/N185K，N018Q/N185K/S256W，N018Q/N185K/Y209W/A215I/S256W，N018Q/N185K/Y209W/A215V，N018Q/N185K/Y209W/A215V/S256W，N018Q/N185Q/A215V，N018Q/N185Q/S256W，N018Q/N185Q/Y209W/S256W，N018Q/N185R/A215R，N018Q/N185R/S256W，N018R/G097P/N185Q/A215I，N018R/G097P/Y209W/A215V，N018R/G097P/Y209W/S256W，N018R/N185K/A215V/S256W，N018R/N185K/S256W，N018R/N185Q/A215V/S256W，N018R/N185Q/Y209W/S256W，N018R/N185R/A215R，N018R/N185R/S256W，N018R/N185R/Y209W/S256W，N018R/Y209W/A215V/S256W，N018R/Y209W/S256W，N043E/S101E，N043E/S101E/N248K，N043E/S101F，N043E/S101N/N117Y，N043E/S101V，N043E/S101Y/N117I/N248K，N043E/S101Y/N117Y/N248K，N043F/N117I，N043F/S101E/N117I/N248K，N043F/S101R，N043I/N117Y，N043I/S101E/N248I，N043I/S101F/N117Y/N248K，N043I/S101N/N117Y/N248K，N043I/S101R/N248K，N043I/S101Y/N117I/N248I，N043I/S101Y/N117Y/N248K，N043S/N117Y/N248K，N043S/N248I，N043S/S101E，N043S/S101E/N117I/N248I，N043S/S101E/N117Y/N248K，N043S/S101E/N248K，N043S/S101F，N043S/S101F/N248K，N043S/S101N/N117I，N043S/S101R/N117I/N248K，N043S/S101V/N117I/N248I，N043S/S101Y，N043S/S101Y/N117I，N043S/S10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ID NO：1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。
15.权利要求1的分离的枯草杆菌蛋白酶变体，其中所述变体包含选自以下的取代的组合：TS87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S24W/S101L/Q109K、S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101L/Q109R/N185R/A215R，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/Q109R/S164I，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/Q109R/S188D/N248R，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101Y/Q109L/N185R/A215R，S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101K/S188D/N248R，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S24W/S101L/Q109L，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101Y/Q109R/N185R/A215R，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101L/Q109R/S164I，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/Q109R/S188D/T213E/N248R，S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/I72V/S164I/S188D/N248R，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N76D，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S24W/S101Y/Q109K，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N43S/P52V/S101R/Q109R，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101Y/Q109R/S164I，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101L/Q109L/S188D/N248R，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/Q109R/S164I/S188D/N248R，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N76D/S101L，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S24W/S101Y/Q109L，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N76D/S164I，S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/N76D/S188D/N248R，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/Q109L/S188D/N248R，S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/V118R/S188D/N248R，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N76D/S101M，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/N76D/G97P/N185R/A215R，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101L/S164I，S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101L/S188D/N248R，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/Q109L/S188D/T213E/N248R，S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/Q109L/S188D/N248R，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101L/N185R/A215R，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101Y/S164I，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101Y/T213E/N248R，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101L/Q109L/S164I，S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101V/S188D/N248R，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101Y/N185R/A215R，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101V/S164I，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101L/T213E/N248R，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101Y/Q109L/S164I，S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101H/S188D/N248R，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/Q109R/N185R/A215R，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/I72V/S101H/S164I，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/S101L/Q109R/S188D/N248R，S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A/N18K/G97P/S101L/Q109L/N185R/A215R，S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S101M/S188D/N248R，N76D/S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D，N76D/S87R/G118R/S128L/P129Q/S130A/S188D/N248K，S87N/G118V/G127S/S128L/P129Q/S130A，S87N/S101H/G118V/S128L/P129Q/S130A，S87N/S101K/G118V/S128L/P129Q/S130A，S87N/S101V/G118V/S128L/P129Q/S130A，S87N/S101Y/G118V/S128L/P129Q/S130A，S87N/S101L/G118V/S128L/P129Q/S130A、I72V/S87N/G118V/S128L/P129Q/S130A//S164I，其中所述位置对照SEQID NO：1所示的解淀粉芽孢杆菌的枯草杆菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列编号。
16.编码权利要求1-15的任一项提出的枯草杆菌蛋白酶变体的分离的核酸。
17.包含权利要求16的核酸的表达载体。
18.包含权利要求17的表达载体的宿主细胞。
19.包含权利要求1-15的任一项提出的枯草杆菌蛋白酶变体的清洁组合物。
20.权利要求19的清洁组合物，其中所述组合物包含液体的、凝胶的、片剂的、粉末的和/或颗粒状的去垢剂。
21.权利要求19和/或20的清洁组合物，其中所述清洁组合物选自洗衣去垢剂和餐具去垢剂。
22.权利要求21的清洁组合物，其包含洗衣去垢剂。
23.权利要求22的清洁组合物，其中所述洗衣去垢剂是重垢型去垢剂。
24.权利要求21的清洁组合物，其包含选自手洗餐具去垢剂和自动化餐具洗涤去垢剂的餐具去垢剂。
25.权利要求19-24的任一项的清洁组合物，进一步包含至少一种漂白剂。
26.权利要求19-25的任一项的清洁组合物，其中所述清洁组合物是无磷的或含磷的去垢剂。
27.权利要求19-26的任一项的清洁组合物，其中所述清洁组合物是冷水型去垢剂。
28.权利要求19-27的任一项的清洁组合物，进一步包含至少一种其他的酶。
29.权利要求28的清洁组合物，其中所述至少一种其他的酶选自半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、金属蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过水解酶、角质酶、果胶酶、果胶裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂加氧酶、木质酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanases、β-葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和淀粉酶，或其混合物。
30.清洁方法，包括提供待清洁的物品和包含权利要求19-29的任一项提出的清洁组合物的组合物，以及在有效提供所述物品的清洁的条件下，将所述物品与所述组合物接触。
31.权利要求30的方法，还包括在将所述物品与所述清洁组合物接触后，清洗所述物品的步骤。
32.权利要求30和/或31的方法，其中所述待清洁的物品包括餐具。
33.权利要求30和/或31的方法，其中所述待清洁的的物品包括织物。
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Legal Events
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Granted publication date: 20181127 |
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