JP2003505069A - 立体的に保護されたエピトープ領域を有するプロテアーゼ抱合体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本開示は、プロテアーゼ部分及び１又はそれより多くの付加部分を含むサブチリシンプロテアーゼ抱合体に関する。各付加部分は、プロテアーゼ部分のエピトープ保護位置に共有結合する。プロテアーゼ抱合体は、親型プロテアーゼに比して低下した免疫原性を有する。本開示は更に、プロテアーゼ抱合体を含む洗浄用組成物及びパーソナルケア組成物に関する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】

本発明は、例えば、パーソナルケア組成物、洗濯組成物、硬質面洗浄組成物、
及び軽質洗浄用組成物のような組成物に有用である化学的に修飾したサブチリシ
ンプロテアーゼに関する。

【０００２】

【従来の技術】

酵素は、天然由来のタンパク質の最も広範なクラスを構成する。酵素のクラス
の１つには、他のタンパク質の加水分解を触媒するプロテアーゼが挙げられる。
タンパク質を加水分解するこの能力は、典型的には、天然由来の、及び遺伝子操
作したプロテアーゼを、洗浄用組成物、特に洗濯用途に適切なものに組み入れる
ことによって利用されている。

【０００３】 洗浄用分野において、最も広範に利用されているこれらのプロテアーゼは、セ
リンプロテアーゼである。これらのセリンプロテアーゼのほとんどは、細菌類に
より作られるが、いくつかは真菌類のような他の生物によって作られることもあ
る。シーゼン（Siezen）らの「サブチラーゼの相同性モデルとタンパク質工学戦
略、サブチリシン様のセリンプロテアーゼファミリー（Homology Modelling and
Protein Engineering Strategy of Subtilases、the Family of Subtilisin−L
ike Serine Proteases）」、プロテイン・エンジニアリング（Protein Engineer
ing）の第４巻、７号（１９９１年）の７１９〜７３７ページを参照のこと。残
念なことに、天然環境における野生型プロテアーゼの効力は、洗浄用組成物の人
為環境には最適化されないことが多い。具体的には、例えば、熱安定性、ｐＨ安
定性、酸化安定性及び基質特異性のようなプロテアーゼの特徴は、プロテアーゼ
の天然環境以外での利用には必ずしも最適化されない。

【０００４】 非天然洗浄環境においてプロテアーゼの効力を高めるという目的で、セリンプ
ロテアーゼの野生型アミノ酸配列を変える幾つかのアプローチが用いられてきた
。これらのアプローチには、極めて多様な条件下における熱安定性を高め、酸化
安定性を改善するためのプロテアーゼの遺伝子再設計及び／又は化学的修飾が挙
げられる。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】

しかしながら、そのように修飾されたプロテアーゼは哺乳類にとって外来物で
あるために、それらは潜在的な抗原である。抗原として、これらのプロテアーゼ
は、哺乳類において免疫原性反応及び／又はアレルギー反応（本明細書ではまと
めて免疫原性反応として記載する）を引き起こす。

【０００６】 その上、プロテアーゼの遺伝子再設計及び化学的修飾は、洗濯用途のためによ
り高い有効性プロテアーゼを継続して探している点で顕著であるが、かかるプロ
テアーゼは、パーソナルケア組成物及び軽質洗剤では商業的には利用されていな
い。例えば、石鹸、ジェル、ボディソープ、シャンプー、軽質食器洗剤のような
製品にこのようなプロテアーゼが不在であることの主な理由は、望ましくない免
疫原性反応を招くヒトへの感作の問題があるためである。従って、免疫原性反応
を誘発しないでプロテアーゼの洗浄性能を与えるパーソナルケア組成物又は軽質
洗剤を提供することは高い利点があるはずである。

【０００７】 現在、化学的に修飾されたプロテアーゼが空中に浮遊して、運ばれることを避
けるために、それらの化学的に修飾されたプロテアーゼを固相化する、顆粒化す
る、被覆する、又は溶解することによって、プロテアーゼに対する免疫原性反応
を最小限にとどめることができる。これらの方法は、空中に浮遊するプロテアー
ゼに消費者が暴露されることを対処するとはいえ、最終組成物と皮膚組織とが長
く接触するリスク及び製造中、労働者がプロテアーゼを含有する塵又はエアロゾ
ルに暴露されるリスクを未だに生じている。

【０００８】 プロテアーゼにポリマーを結合することによってプロテアーゼの免疫原性の低
下が達成され得ることが提案されている。例えば、米国特許第４，１７９，３３
７号（デービス（Davis）ら、１９７９年１２月１８日発行）；米国特許第５，
８５６，４５１号（オルセン（Olsen）ら、１９９９年１月５日に発行され、ノ
ボノルディスクに譲渡された）；ＷＯ第９９／００４８９号（オルセンら、１９
９９年１月７日に公開され、ノボノルディスクに譲渡された）；ＷＯ第９８／３
０６８２号（オルセンら、１９９８年７月１６日に公開され、ノボノルディスク
に譲渡された）；及びＷＯ第９８／３５０２６号（フォン・デル・オステン（Vo
n Der Osten）ら、１９９８年８月１３日公開）を参照のこと。しかしながら、
そのような提案は、免疫応答に関与するプロテアーゼのアミノ酸領域（すなわち
、エピトープ）にポリマーを結合する重要性を示唆してはいない。

【０００９】 最近、サブチリシンプロテアーゼが、３つのエピトープ領域を含むこと、及び
プロテアーゼの免疫原性において有意な低下を達成するには、１又はそれより多
くのポリマー、ポリペプチド、又はその他の基の抱合を、１又はそれより多くの
このような領域に結合すべきであることが見い出されている。例えば、米国特許
出願出願番号第０９／０８８，９１２号（ウエイスガーバー（Weisgerber）ら、
１９９８年６月２日に提出され、プロクター＆ギャンブル社に譲渡された）を参
照のこと。

【００１０】 本発明者らは、プロテアーゼの１又はそれより多くのエピトープ領域近傍の立
体的保護が、エピトープの提示を妨げ、又は妨害し、プロテアーゼの免疫原性を
低下させる代替的なメカニズムであることを見い出した。従って、本発明者らは
本明細書にて、修飾が１又はそれより多くのエピトープ領域の立体的近傍にある
修飾されたサブチリシンを提供する。従って、本発明者らは、低下した免疫原性
反応をもたらし、効果的且つ活性のあるプロテアーゼとしてそれらの活性をなお
維持しているサブチリシンプロテアーゼを見い出した。従って、本発明のプロテ
アーゼ抱合体は、洗濯用、食器用、硬質面用、スキンケア用、ヘアケア用、美容
ケア用、口内ケア用、及びコンタクトレンズ用組成物を含むが、これに限定され
ない数種の組成物における使用に好適である。

【００１１】

【課題を解決するための手段】

本発明は、プロテアーゼ部分及び１又はそれより多くの付加部分を含むプロテ
アーゼ抱合体に関するものであって、各付加部分は、プロテアーゼ部分の下記（
ａ）〜（ｃ）のエピトープ保護位置に共有結合し：

【００１２】 （ａ）第１のエピトープ領域に対するエピトープ保護位置が、サブチリシンＢ
ＰＮ’に相当する１、２、３、４、５、６、７、１２、１７、３６、４０、４１
、４３、４４、４５、６７、８６、８７、８９、２０６、２０９、２１０、２１
２、２１３、２１４、２１５、及び２１６位置から選択され；

【００１３】 （ｂ）第２のエピトープ領域に対するエピトープ保護位置が、サブチリシンＢ
ＰＮ’に相当する２５、２６、２７、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５
２、５３、５４、９１、９９、１００、１０１、１０２、１２７、１２８、１２
９、１３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３６、１３７、１３８、１４
０、１４１、１４４、及び１４５位置から選択され；及び

【００１４】 （ｃ）第３のエピトープ領域に対するエピトープ保護位置が、サブチリシンＢ
ＰＮ’に相当する９、１０、２２、２３、２４、６２、６３、１４３、１４６、
１５４、１５５、１５６、１５７、１７２、１７３、１８７、１８９、１９５、
１９７、２０３、２０４、２５３、２５４、２５６、２６５、２６７、２６９、
２７１、２７２、及び２７５位置から選択され；

【００１５】 且つ、付加部分はそれぞれ独立して、以下の構造を有する：

【００１６】

【化２】

【００１７】 （式中、Ｘは、不在及び連結部分から選択され；Ｒ₁は、不在、第１のポリペプ
チド、及び第１のポリマーから選択され；及びＲ₂は、不在、第２のポリペプチ
ド、及び第２のポリマーから選択され；少なくともＸ、Ｒ₁、及びＲ₂の１つは不
在ではない）。

【００１８】 本発明のプロテアーゼ抱合体は、親型プロテアーゼに比して、免疫原性を低下
させる。従って、かかるプロテアーゼ抱合体は、洗濯用、食器用、硬質面用、ス
キンケア用、ヘアケア用、美容ケア用、口内ケア用、及びコンタクトレンズ用組
成物を含むが、これに限定されない数種の組成物における使用に好適である。

【００１９】

【発明の実施の形態】

本発明の必須構成成分は、本明細書で以下に記載する。本発明の実施態様に有
用な種々の任意の構成成分や、好ましい構成成分に関する非限定的な説明も含ま
れる。

【００２０】 本発明は、本明細書に記載した必要な又は任意の構成成分及び／又は限定のう
ちのいずれかを含んでいるか、いずれかからなるか、又はいずれかから本質的に
なることができる。

【００２１】 パーセント及び比率は全て、他に指示しない限り、重量で計算されている。パ
ーセントは全て、他に指示しない限り、総組成物に基づいて計算されている。

【００２２】 構成成分又は組成物の値は全て、その構成成分又は組成物の活性値を参照して
おり、そして不純物、例えば、商業的に入手可能な供給物中に存在している可能
性がある残存溶媒又は副生成物は除外されている。

【００２３】 全ての特許、特許出願、及び出版物を含めて、本明細書中で参考として引用さ
れる全ての文書は、その全てを本明細書に組み入れる。

【００２４】 酵素を含むがこれに限定されない材料に関する商標名は、本明細書に引用する
。本発明者は本明細書では、或る商品名の材料に限定されるようには意図してい
ない。商標名により引用されているものと等価の材料（例えば、異なる名称又は
カタログ（参照）番号で異なる供給元から得られるもの）は、本明細書のプロテ
アーゼ抱合体及び組成物において置き換えてもよく、利用してもよい。

【００２５】 本明細書で使用されるとき、略語はアミノ酸を記載するのに用いられる。表１
は本明細書で使用された略語の一覧を提供する：

【００２６】

【表１】

【００２７】 定義 本明細書で使用されるとき、用語「変異」は、それらの遺伝子配列によって生
じる遺伝子配列及び／又はアミノ酸配列の変化をいう。変異には、野生型タンパ
ク質配列に対するアミノ酸残基の欠失、置換及び付加が挙げられる。

【００２８】 本明細書で使用されるとき、用語「親型」は、本明細書のプロテアーゼ抱合体
を形成するために更なる修飾に利用されるタンパク質（野生型又は変異型）をい
う。

【００２９】 本明細書で使用されるとき、用語「野生型」は、タンパク質、例えば、変異し
ていない生物によって生成されるプロテアーゼ又はその他の酵素をいう。

【００３０】 本明細書で使用されるとき、用語「変異型」は、相当する野生型タンパク質の
アミノ酸配列とは異なるアミノ酸配列を有するタンパク質を意味する。

【００３１】 本明細書で使用されるとき、ポリマーの分子量は全て、質量平均分子量として
表現される。

【００３２】 本明細書で引用されるように、本発明の抱合体はサブチリシンＢＰＮ’を含む
もの及びその変異型に限定されないが、アミノ酸番号は全て配列番号１番（ＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：１）で表されるサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列に関する。
サブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列は、ウエルズ（Wells）らによってNucleic
Acids Researchの第II巻、７９１１〜７９２５頁（１９８３年）で更に記載さ
れている。

【００３３】 本発明のプロテアーゼ抱合体 本発明のプロテアーゼ抱合体は、プロテアーゼ部分及び１又はそれより多くの
付加部分を含み、該プロテアーゼ部分及び付加部分は、共有連結（すなわち、共
有結合）を介して接続される化合物である。

【００３４】プロテアーゼ部分 本明細書のプロテアーゼ部分は、サブチリシン様のプロテアーゼであり、野生
型又はその変異型のいずれかである。本明細書で使用されるとき、用語「サブチ
リシン様のプロテアーゼ」は、少なくとも５０％、及び好ましくは８０％、サブ
チリシンＢＰＮ’の配列とのアミノ酸配列の同一性を有するプロテアーゼを意味
する。野生型サブチリシン様のプロテアーゼは、例えば、Bacillus alcalophilu
s、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus amylossaccharicus、Bacillus lich
eniformis、Bacillus lentus 及び Bacillus subtilisの微生物によって産生さ
れる。サブチリシン様のセリンプロテアーゼ及びその類縁体に関する議論は、シ
ーゼンら（Siezen）の「サブチラーゼの相同性モデル及びタンパク質工学戦略、
サブチリシン様セリンプロテアーゼファミリー」、Protein Engineeringの第４
巻、７号の７１９〜７３７頁（１９９１年）によって見い出されてもよい。

【００３５】 本明細書で使用するのに好ましいプロテアーゼ部分には、例えば、Bacillus a
myloliquefaciens、Bacillus licheniformis 及び Bacillus subtilisから得ら
れるもの、サブチリシンＢＰＮ、サブチリシンＢＰＮ’、サブチリシンカールス
バーグ、サブチリシンＤＹ、サブチリシン３０９、プロテイナーゼＫ、及びサー
ミターゼが挙げられ、Ａ／Ｓ アルカラーゼ（Alcalase）（登録商標）（デンマ
ークのコペンハーゲン、ノボ・インダストリーズ社から商業的に入手可能）、エ
スペラーゼ（Esperase）（登録商標）（ノボ・インダストリーズ社）、サビナー
ゼ（Savinase）（登録商標）（ノボ・インダストリーズ社）、マクサターゼ（Ma
xatase）（登録商標）（ジェネンコア・インターナショナル社から商業的に入手
可能）、マクサカール（Maxacal）（登録商標）（ジェネンコア・インターナシ
ョナル社）、マクサペム（Maxapem）１５（登録商標）（ジェネンコア・インタ
ーナショナル社）、及び前述の変異型も含まれる。本明細書での使用に特に好ま
しいプロテアーゼ部分には、Bacillus amyloliquefaciensから得られるもの及び
その変異型が挙げられる。本明細書の最も好ましいプロテアーゼ部分は、サブチ
リシンＢＰＮ’及びその変異型である。

【００３６】 本明細書の親型アミノ酸配列として使用するのに特に好ましいサブチリシンＢ
ＰＮ’の変異型は、以後「プロテアーゼＡ」と呼ぶが、米国特許第５，０３０，
３７８号（ベネガス（Venegas）、１９９１年７月９日発行）に開示されており
、以下の変異を伴うサブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列を特徴としている：

【００３７】 （ａ）１６６位置におけるＧｌｙが、Ａｓｎ、Ｓｅｒ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ、Ｈｉ
ｓ、Ｇｌｎ、Ａｌａ及びＧｌｕから選択されるアミノ酸残基で置換されており；
１６９位置のＧｌｙが、Ｓｅｒで置換されており；及び２２２位置のＭｅｔが、
Ｇｌｎ、Ｐｈｅ、Ｈｉｓ、Ａｓｎ、Ｇｌｕ、Ａｌａ及びＴｈｒから選択されるア
ミノ酸残基で置換されている；又は

【００３８】 （ｂ）１６０位置のＧｌｙが、Ａｌａで置換されており、且つ、２２２位置の
Ｍｅｔが、Ａｌａで置換されている。

【００３９】 本明細書の親型アミノ酸配列として使用するのに更に好ましいサブチリシンＢ
ＰＮ’の変異型は、以後「プロテアーゼＢ」と呼ぶが、ジェネンコア・インター
ナショナル社に譲渡された欧州特許第２５１，４４６号（１９８８年１月７日公
開）に開示されており、以下の位置で１又はそれより多くの変異を伴う野生型サ
ブチリシンＢＰＮ’のアミノ酸配列を特徴としている：Ｔｙｒ２１、Ｔｈｒ２２
、Ｓｅｒ２４、Ａｓｐ３６、Ａｌａ４５、Ａｌａ４８、Ｓｅｒ４９、Ｍｅｔ５０
、Ｈｉｓ６７、Ｓｅｒ８７、Ｌｙｓ９４、Ｖａｌ９５、Ｇｌｙ９７、Ｓｅｒ１０
１、Ｇｌｙ１０２、Ｇｌｙ１０３、Ｉｌｅ１０７、Ｇｌｙ１１０、Ｍｅｔ１２４
、Ｇｌｙ１２７、Ｇｌｙ１２８、Ｐｒｏ１２９、Ｌｅｕ１３５、Ｌｙｓ１７０、
Ｔｙｒ１７１、Ｐｒｏ１７２、Ａｓｐ１９７、Ｍｅｔ１９９、Ｓｅｒ２０４、Ｌ
ｙｓ２１３、Ｔｙｒ２１４、Ｇｌｙ２１５、及びＳｅｒ２２１；又はＡｓｐ３２
、Ｓｅｒ３３、Ｔｙｒ１０４、Ａｌａ１５２、Ａｓｎ１５５、Ｇｌｕ１５６、Ｇ
ｌｙ１６６、Ｇｌｙ１６９、Ｐｈｅ１８９、Ｔｙｒ２１７、及びＭｅｔ２２２か
ら選択される位置における１又はそれより多くの変異と組み合わせられた上記に
一覧された２又はそれより多くの位置。

【００４０】 本明細書で使用するのに好ましいその他のサブチリシンのＢＰＮ’変異型は、
以後「プロテアーゼＣ」と呼ぶが、ジェネンコア・インターナショナル社に譲渡
されたＷＯ第９５／１０６１５号（１９９５年４月２０日公開）に記載されてお
り、Ａｓｐ９９、Ｓｅｒ１０１、Ｇｌｎ１０３、Ｔｙｒ１０４、Ｓｅｒ１０５、
Ｉｌｅ１０７、Ａｓｎ１０９、Ａｓｎ１２３、Ｌｅｕ１２６、Ｇｌｙ１２７、Ｇ
ｌｙ１２８、Ｌｅｕ１３５、Ｇｌｕ１５６、Ｇｌｙ１６６、Ｇｌｕ１９５、Ａｓ
ｐ１９７、Ｓｅｒ２０４、Ｇｌｎ２０６、Ｐｒｏ２１０、Ａｌａ２１６、Ｔｙｒ
２１７、Ａｓｎ２１８、Ｍｅｔ２２２、Ｓｅｒ２６０、Ｌｙｓ２６５、及びＡｌ
ａ２７４から選択される１又はそれより多くのその他の位置における変異と組み
合わせたＡｓｎ７６位置に対する変異を伴った野生型サブチリシンＢＰＮ’アミ
ノ酸配列を特徴とする。

【００４１】 本明細書で使用するのに好ましいその他のサブチリシンＢＰＮ’の変異型は、
以後「プロテアーゼＤ」と呼ぶが、米国特許第４，７６０，０２５号（エステル
（Estell）ら、１９８８年７月２６日発行）に記載されており、Ａｓｐ３２、Ｓ
ｅｒ３３、Ｈｉｓ６４、Ｔｙｒ１０４、Ａｓｎ１５５、Ｇｌｕ１５６、Ｇｌｙ１
６６、Ｇｌｙ１６９、Ｐｈｅ１８９、Ｔｙｒ２１７、及びＭｅｔ２２２から成る
群から選択される１又はそれより多くのアミノ酸位置に対する変異を伴う野生型
サブチリシンＢＰＮ’アミノ酸配列を特徴とする。

【００４２】 本明細書の更に好ましいプロテアーゼ部分は、サブチリシンＢＰＮ’、プロテ
アーゼＡ、プロテアーゼＢ、プロテアーゼＣ、及びプロテアーゼＤから成る群か
ら選択され、プロテアーゼＤが最も好ましい。

【００４３】 理論に限定されることを意図しないが、本明細書のプロテアーゼ部分は３つの
エピトープ領域：第１のエピトープ領域、第２のエピトープ領域、及び第３のエ
ピトープ領域を有する。第１のエピトープ領域は、サブチリシンＢＰＮ’に相当
する７０〜８４位置に存在し；第２のエピトープ領域は、サブチリシンＢＰＮ’
に相当する１０３〜１２６位置に存在し；及び第３のエピトープ領域は、サブチ
リシンＢＰＮ’に相当する２２０〜２４６位置に存在する。例えば、米国特許出
願出願番号第０９／０８８、９１２号（ウエイスガーバー（Weisgerber）ら、１
９９８年６月２日提出、プロクター＆ギャンブル社に譲渡）；米国特許同時係属
仮出願、出願番号第６０／１４４，９９１号、（ラビン（Rubingh）ら、「エピ
トープ領域においてアミノ酸置換及び欠失を有するセリンプロテアーゼ変異型」
、１９９９年７月２２日提出）；及び米国特許同時係属仮出願、出願番号第６０
／１４４，９８０号、（シロルスキー（Sikorski）ら、「エピトープ領域におい
てアミノ酸置換を有するセリンプロテアーゼ変異型」１９９９年７月２２日提出
）を参照のこと。

【００４４】 驚くべきことに、本発明者らは、少なくとも前述のエピトープ領域の１つに立
体的な近傍であるエピトープ保護位置を発見した。更に、エピトープ保護位置に
おけるプロテアーゼ部分のアミノ酸に１又はそれより多くの付加部分を共有結合
することにより、このようなエピトープが、加水分解、従ってエピトープの暴露
から保護されることが見い出された。

【００４５】 付加部分による共有結合修飾に適しているエピトープ保護位置は、どのエピト
ープを保護することが望ましいかに依存する。最も好ましくは、少なくとも１つ
の付加部分が、第１のエピトープ領域に対するエピトープ保護位置に共有結合す
る。

【００４６】 第１のエピトープ領域に対するエピトープ保護位置は、サブチリシンＢＰＮ’
に相当する１、２、３、４、５、６、７、１２、１７、３６、４０、４１、４３
、４４、４５、６７、８６、８７、８９、２０６、２０９、２１０、２１２、２
１３、２１４、２１５、及び２１６位置であることが見い出されている。好まし
くは、第１のエピトープ領域に対するエピトープ保護位置は、サブチリシンＢＰ
Ｎ’に相当する１、２、３、４、５、６、７、１２、１７、４０、４１、４３、
６７、８６、８７、８９、２０６、２０９、２１４、及び２１５位置である。最
も好ましくは、第１のエピトープ領域に対するエピトープ保護位置は、サブチリ
シンＢＰＮ’に相当する１、２、３、４、５、１７、４０、４１、４３、６７、
８６、８７、及び２１４位置である。

【００４７】 第２のエピトープ領域に対するエピトープ保護位置は、サブチリシンＢＰＮ’
に相当する２５、２６、２７、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５
３、５４、９１、９９、１００、１０１、１０２、１２７、１２８、１２９、１
３０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３６、１３７、１３８、１４０、１
４１、１４４、及び１４５位置であることが更に見い出されている。好ましくは
、第２のエピトープ領域に対するエピトープ保護位置は、サブチリシンＢＰＮ’
に相当する２７、４７、４８、５０、５２、１０２、１２７、１２８、１３０、
１３１、１３２、１３４、１３８、及び１４１位置である。

【００４８】 第３のエピトープ領域に対するエピトープ保護位置は、サブチリシンＢＰＮ’
に相当する９、１０、２２、２３、２４、６２、６３、１４３、１４６、１５４
、１５５、１５６、１５７、１７２、１７３、１８７、１８９、１９５、１９７
、２０３、２０４、２５３、２５４、２５６、２６５、２６７、２６９、２７１
、２７２、及び２７５位置から成る群から選択されることが見い出されている。
好ましくは、第２のエピトープ領域に対するエピトープ保護位置は、サブチリシ
ンＢＰＮ’に相当する２２、２３、２４、１４３、１４６、１５５、１７３、１
８９、１９７、２０３、２０４、２５３、２５４、２６５、及び２７５位置であ
る。

【００４９】 本発明の好ましい実施態様では、プロテアーゼ部分は親型アミノ酸配列の修飾
された配列を含む。親型アミノ酸配列は、上述した上記プロテアーゼのいずれで
もよく、上述したような同じ好ましい限定を伴う。本実施態様では、親型アミノ
酸配列は置換アミノ酸により１又はそれより多くの親型アミノ酸残基にて置換さ
れて、１又はそれより多くの本付加部分と結合するのに好適なプロテアーゼ部分
を生じる。本発明に基づいて、置換は１又はそれより多くのエピトープ保護位置
にて行われるべきである。エピトープ保護位置、及び好ましいその限定は上記で
記載されている。

【００５０】 １又はそれより多くの付加部分の１又はそれより多くのエピトープ保護位置の
プロテアーゼ部分への選択的な結合を達成するために、置換は親型アミノ酸配列
では存在しない（稀な）置換アミノ酸を用いるべきである。この点で、親型アミ
ノ酸配列に稀であるいかなる置換アミノ酸を利用してもよい。例えば、システイ
ン残基は、サブチリシンＢＰＮ’の野生型アミノ酸配列には存在しないので、１
又はそれより多くのエピトープ保護位置における１又はそれより多くのシステイ
ン残基によるサブチリシンＢＰＮ’の置換は、本発明に好適である。システイン
残基が親型アミノ酸配列のエピトープ保護位置以外の位置に存在する場合、エピ
トープ保護位置において１又はそれより多くの付加部分を選択的に結合可能にす
るために、それらの位置のそれぞれにおいて他のアミノ酸残基に置換することが
好ましい。システインは、１又はそれより多くのエピトープ保護位置での置換に
最も好ましい置換アミノ酸である。

【００５１】 他の好ましい置換アミノ酸にはリジンが挙げられる。置換アミノ酸がリジンで
ある場合、エピトープ保護位置における１又はそれより多くのリジン残基の機能
化が選択的であるように、親型アミノ酸配列のエピトープ保護位置以外に存在す
るリジン残基を他のアミノ酸残基に変異誘発することが好ましい。例えば、リジ
ン残基は、本明細書で定義するようなエピトープ保護位置であるサブチリシンＢ
ＰＮ’の４３位置に存在する。サブチリシンＢＰＮ’配列で存在するその他全て
のリジン残基の部位選択的変異誘発を行い、付加部分を伴った４３位置において
リジン残基の選択的機能化をおこなってもよい。別の方法として、幾つかのエピ
トープ保護位置におけるアミノ酸残基をリジン（例えば）に変異誘発し、付加部
分によるこれらの位置での選択的機能化をおこなってもよい。

【００５２】付加部分 本発明のプロテアーゼ抱合体は、１又はそれより多くの付加部分を含み、該付
加部分はそれぞれ、本明細書で記載されるようなエピトープ保護位置にてアミノ
酸残基の１つと共有結合する。付加部分はいかなる化学構造であってもよい。好
ましくは、付加部分は、結合されたエピトープ保護位置又は本明細書で定義され
るそのほかのいかなるエピトープ保護位置を立体的に妨害する。付加部分の非限
定例には、約１６００未満、好ましくは約８００未満、更に好ましくは約４００
未満、及び最も好ましくは約３００未満の分子量を有する分子；ポリペプチド；
及びポリマーを含む有機分子が挙げられるが、これに限定されない。本明細書で
使用されるとき、用語「ポリペプチド」は、２以上のアミノ酸残基を含む分子を
意味する。本明細書で使用されるとき、用語「ポリマー」は、２以上の同一の（
好ましくは５以上の同一の）モノマー単位を含むいかなる分子も意味する。 好ましくは、付加部分は以下の構造を有する：

【００５３】

【化３】

【００５４】 （式中、Ｘは不在及び連結部分から選択され；Ｒ₁は、不在、第１のポリペプチ
ド、及び第１のポリマーから成る群から選択され；及びＲ₂は、不在、第２のポ
リペプチド、及び第２のポリマーから成る群から選択され、少なくともＸ、Ｒ₁
、及びＲ₂の１つは不在ではない）。

【００５５】 好ましくは、プロテアーゼ抱合体は、１〜約１５、更に好ましくは約２〜約１
０、及び最も好ましくは約１〜約５の付加部分を含む。

【００５６】 Ｒ₁及びＲ₂がそれぞれ独立してポリペプチド部分又はポリマー部分である場合
、Ｒ₁及びＲ₂は同一であっても異なっていてもよい。好ましくは、Ｒ₁がポリペ
プチド部分である場合、Ｒ₂は不在及びポリペプチド部分から選択され、最も好
ましくは不在である。最も好ましくは、Ｒ₁がポリペプチド部分である場合、Ｒ₂ は不在及び同一ポリペプチド部分から選択され、最も好ましくは不在である。好
ましくは、Ｒ₁がポリマー部分である場合、Ｒ₂は不在及びポリマー部分から選択
される。最も好ましくは、Ｒ₁がポリマー部分である場合、Ｒ₂は不在及び同一ポ
リマー部分から選択される。少なくともＲ₁及びＲ₂の１つがそれぞれ、第１のポ
リマー及び第２のポリマーである場合、その時Ｘは好ましくは不在ではない。

【００５７】ポリペプチド部分 本明細書で記載されるポリペプチド部分には、２以上のアミノ酸残基を含むよ
うなものが挙げられる。好ましいポリペプチド部分は、酵素を含むタンパク質か
ら選択される。好ましい酵素には、プロテアーゼ、セルラーゼ、リパーゼ、アミ
ラーゼ、ペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼ、ヘミセルラーゼ、キシラ
ナーゼ、ホスホリパーゼ、エステラーゼ、クチナーゼ、ペクチナーゼ、ケラチナ
ーゼ、レダクターゼ（例えば、ＮＡＤＨレダクターゼを含む）、オキシダーゼ、
フェノールオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、リグニナーゼ、プルラナーゼ、タ
ンナーゼ、ペントサナーゼ、マラナーゼ、β−グルカナーゼ、アラビノシダーゼ
、ヒアルロニダーゼ、コンドロイチナーゼ、ラッカーゼ、トランスフェラーゼ、
イソメラーゼ（例えば、グルコースイソメラーゼ及びキシロースイソメラーゼを
含む）、リアーゼ、リガーゼ、シンセターゼ、及び果実系酵素（例えば、パパイ
ンを含む）が挙げられる。ポリペプチド部分として使用するのに更に好ましい酵
素には、プロテアーゼ、セルラーゼ、アミラーゼ、リパーゼ、及び果実系酵素が
挙げられ、プロテアーゼが一層更に好ましい。

【００５８】 ポリペプチド部分として使用するためのリパーゼの例には、以下の微生物： Humicola、Pseudonomas、Fusarium、Mucor、Chromobacterium、Aspergillus、Ca
ndida、Geotricum、Penicillium、Rhizopus及びBacillusに由来するものが挙げ
られる。

【００５９】 市販のリパーゼの例には、リポラーゼ(Lipolase)（登録商標）、リポラーゼ・
ウルトラ(Lipolase Ultra)（登録商標）、リポザイム(Lipozyme)（登録商標）、
パラターゼ(Palatase)（登録商標）、ノボザイム(Novozym)４３５（登録商標）
、及びレシターゼ(Lecitase)（登録商標）（全てデンマーク・コペンハーゲンの
ノボノルディスク(Novo Nordisk)から商業的に入手可能である）、ルマファスト
(Lumafast)（登録商標）（ニューヨーク州、ロチェスターのジェネンコア社(Gen
encor、Int.)から商業的に入手可能）、及びリポマックス(Lipomax)（登録商標
）（ジェネンコア社）が挙げられる。

【００６０】 ポリペプチド部分として使用するためのプロテアーゼの例には、セリンプロテ
アーゼ、キモトリプシン、及びエラスターゼ型酵素が挙げられる。ポリペプチド
部分として使用するための最も好ましいプロテアーゼには、「プロテアーゼ部分
」の議論にて本明細書上記で定義されたようなセリンプロテアーゼが挙げられる
。

【００６１】 最も好ましくは、ポリペプチド部分がセリンプロテアーゼである場合、ポリペ
プチド部分は、独立して本明細書上記で記載されたようなプロテアーゼ部分の定
義を持つ。好ましくは上記で記載されたように、ポリペプチド部分は親型アミノ
酸配列の修飾されたアミノ酸配列を有し、修飾は、本明細書上記で記載したよう
に（親型アミノ酸配列が「第２の」親型アミノ酸配列と呼ばれてもよい）１又は
それより多くのエピトープ保護位置にある。この例では、連結部分の１つ（その
際、連結部分は不在ではない）又はプロテアーゼ部分（その際、連結部分は不在
である）が、ポリペプチド部分のエピトープ保護位置の１つに存在する置換アミ
ノ酸の一つを介して、ポリペプチド部分に共有結合する。ポリペプチド部分がセ
リンプロテアーゼである場合、本明細書上記で記載したように同一の好ましいエ
ピトープ保護位置の群が、プロテアーゼ部分及びその相当する親型アミノ酸配列
に適用される。

【００６２】 最も好ましくは、ポリペプチド部分がセリンプロテアーゼである場合、ポリペ
プチド部分及びプロテアーゼ部分は、同等の部分である。この例では、ポリペプ
チド部分及びプロテアーゼ部分は、最も好ましくはジスルフィド結合を介して結
合し、その際、Ｘは不在であり、最も好ましくはＲ₂が不在である。

【００６３】ポリマー部分 本明細書の付加部分は、ポリマー部分を含んでもよい。本明細書で使用される
とき、用語、ポリマー部分は、２以上の同一の（好ましくは５以上の同一の）モ
ノマー単位を含む何れかの分子を意味する。好適なポリマー部分の例には、ポリ
アルキレンオキシド、ポリアルコール、ポリビニルアルコール、ポリカルボキシ
レート、ポリビニルピロリドン、セルロース、デキストラン、スターチ、グリコ
ーゲン、アガロース、グアーガム、プルラン、イヌリン、キサンタンガム、カラ
ゲーナン、ペクチン、アルギン酸ヒドロシレート、及びキトサンのヒドロシレー
トが挙げられる。好ましいポリアルキレンオキシドには、ポリエチレングリコー
ル、メトキシポリエチレングリコール、及びポリプロピレングリコールが挙げら
れる。好ましいデキストランにはカルボキシメチルデキストランが挙げられる。
好ましいセルロースには、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、エ
チルセルロース、ヒドロキシエチルセルロース、カルボキシエチルセルロース、
及びヒドロキシプロピルセルロースが挙げられる。好ましいスターチにはヒドロ
キシエチルスターチ及びヒドロキシプロピルスターチが挙げられる。更に好まし
いポリマーは、ポリアルキレンオキシドである。最も好ましいポリマー部分は、
ポリエチレングリコールである。

【００６４】 式中Ｒ₁及びＲ₂がそれぞれ独立して、ポリマー部分である場合、Ｒ₁及びＲ₂は
好ましくは、約０．２ｋＤ（キロダルトン）〜約４０ｋＤ、更に好ましくは約０
．５ｋＤ〜約４０ｋＤ、一層更に好ましくは約０．５ｋＤ〜約２０ｋＤ、及び最
も好ましくは約１ｋＤ〜約１０ｋＤの全体的な分子量（すなわち、Ｒ₁の分子量
とＲ₂の分子量とを足す）を有する。

【００６５】 式中Ｒ₁及びＲ₂がそれぞれポリマー部分である場合、Ｒ₁及びＲ₂はそれぞれ独
立して好ましくは、約０．１ｋＤ〜約２０ｋＤ、更に好ましくは約０．２５ｋＤ
〜約２０ｋＤ、一層更に好ましくは約０．５ｋＤ〜約１０ｋＤ、及び最も好まし
くは約０．５ｋＤ〜約５ｋＤの分子量を有する。

【００６６】 式中Ｒ₁及びＲ₂がそれぞれポリマー部分である場合、Ｒ₁対Ｒ₂の分子量の比は
好ましくは、約１：１０〜約１０：１、更に好ましくは約１：５〜約５：１、及
び最も好ましくは約１：３〜約３：１の範囲である。

【００６７】 式中Ｒ₁がポリマー部分であり、且つＲ₂が不在である場合、Ｒ₁は、好ましく
は、約０．１ｋＤ〜約４０ｋＤ、更に好ましくは約０．５ｋＤ〜約４０ｋＤ、一
層更に好ましくは約０．５ｋＤ〜約２０ｋＤ、及び最も好ましくは約１ｋＤ〜約
１０ｋＤの分子量を有する。

【００６８】連結部分 本明細書で使用されるとき、Ｘは、不在又は連結部分であってもよく、連結部
分は任意で、１又はそれより多くのポリペプチド部分又は１又はそれより多くの
ポリマー部分、又は双方と共有結合し、また、プロテアーゼ部分のエピトープ保
護位置の１つにてアミノ酸残基に共有結合する。連結部分は一般にいかなる小型
分子、すなわち、約１６００未満、好ましくは約８００未満、更に好ましくは約
４００未満、及び最も好ましくは約３００未満の分子量を有する分子であっても
よい。最も好ましい連結部分には、システイン残基又はリジン残基、最も好まし
くはシステイン残基に共有結合することができるようなものが挙げられる。

【００６９】 連結部分及び関連する化学反応は、米国特許第５，４４６，０９０号（ハリス
（Harris）ら、１９９５年８月２９日発行）；米国特許第５，１７１，２６４号
（メリル（Merrill）、１９９２年１２月１５日発行）；米国特許第５，１６２
，４３０号（リー（Rhee）ら、１９９２年１１月１０日発行）；米国特許第５，
１５３，２６５号（シャドル（Shadle）ら、１９９２年１０月６日発行）；米国
特許第５，１２２，６１４号（ザリプスキー（Zalipsky）、１９９２年６月１６
日発行）；グッドソン（Goodson）らの「グリコシル化部位における組換えイン
ターロイキン−２の部位特異的ペグ化」（Biotechnology、第８巻、４号の３４
３〜３４６ページ（１９９０年））；コーガン（Kogan）の「選択的タンパク質
修飾に好適な置換メトキシ−ポリ（エチレングリコール）誘導体の合成」（Synt
hetic Communications、第２２巻の２４１７〜２４２４ページ（１９９２年）；
及びイシイ（Ishii）らの「スクシンイミド環の状態の蛍光に対する影響及びピ
レンマレイミド標識αα−トロポミオシンの構造特性」（Biophysical Journal
、第５０巻の７５〜８０ページ（１９８６年））に開示されている。最も好まし
い連結部分は、置換（例えば、アルキル）又は非置換のスクシンイミドである。

【００７０】 更なる例として、以下の非限定的試薬を利用して連結部分を形成してもよい：
Ｎ−［アルファ−マレイミドアセトキシ］スクシンイミドエステル；Ｎ−５−ア
ジド−２−ニトロベンゾイルオキシスクシンイミド；ビスマレイミドヘキサン；
Ｎ−［ベータ−マレイミドプロピルオキシ］スクシンイミドエステル；ビス［２
−（スクシンイミジルオキシカルボニルオキシ）−エチル］スルホン；ビス［ス
ルホスクシンイミジル］スベレート；１，５−ジフルオロ−２，４−ジニトロベ
ンゼン；ジメチルアジピメート・２ ＨＣｌ；ジメチルピメリミデート・２ ＨＣ
ｌ；ジメチルスベリミデート・２ ＨＣｌ；ジスクシンイミジルグルタレート；
ジスクシンイミジルスベレート；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシス
クシンイミドエステル；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル−４−アジドサリチル
酸；Ｎ−スクシンイミジル−６−［４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ
］ヘキサノエート；Ｎ−ヒドロキシスクシンイミジル２，３−ジブロモプロピオ
ネート；スクシンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−
カルボキシレート；スクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレ
ート；スクシンイミジル−６−［（ベータ−マレイミドプロピオンアミド）ヘキ
サノエート］；ビス［２−（スルホスクシンイミジルオキシカルボニロキシ）−
エチル］スルホン；Ｎ−［ガンマ−マレイミドブチリロキシ］スルホスクシンイ
ミドエステル；Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミジル−４−アジドベンゾエー
ト；Ｎ−［カッパ−マレイミドウンデカノイロキシ］スルホスクシンイミドエス
テル；ｍ−マレイミドベンゾイル−Ｎ−ヒドロキシスルホスクシンイミドエステ
ル；スルホスクシンイミジル［４−アジドサリチルアミド］ヘキサノエート；ス
ルホスクシンイミジル７−アジド−４−メチルクマリン−３−アセテート；スル
ホスクシンイミジル６−［４’−アジド−２’−ニトロフェニルアミノ］ヘキサ
ノエート；スルホスクシンイミジル４−［ｐ−アジドフェニル］ブチレート；ス
ルホスクシンイミジル［４−ヨードアセチル］アミノベンゾエート；スルホスク
シンイミジル４−［Ｎ−マレイミドメチル］シクロヘキサン−１−カルボキシレ
ート；及びスルホスクシンイミジル４−（ｐ−マレイミドフェニル）−ブチレー
ト。このような試薬はそれぞれ、イリノイ州ロックフォードのピアースケミカル
社(Pierce Chemical Co.)から商業的に入手可能である。

【００７１】任意の部分 プロテアーゼ抱合体は更に、本明細書では例示されていないか、それと同等の
プロテアーゼの他の残基に、付加部分とは関係のないエピトープ保護位置で結合
する（例えば）１又はそれより多くの小型分子、ポリペプチド、及び／又はポリ
マーを含む１又はそれより多くのその他の化学構造を含んでもよい（本明細書で
は「補足部分」という）。補足部分には、本明細書の上記で記載されたようなポ
リペプチド部分、ポリマー部分、及び連結部分が挙げられてもよい。更に、例え
ば、約１００ Ｄａ〜約５０００ Ｄａ、好ましくは約１００ Ｄａ〜約２０００
Ｄａ、更に好ましくは約１００ Ｄａ〜約１０００ Ｄａ、一層更に好ましくは約
１００ Ｄａ〜約７５０ Ｄａ、及び最も好ましくは約３００ Ｄａの分子量を有
する１又はそれより多くのポリマー（最も好ましくはポリエチレングリコール）
が、本明細書で例示されるもの以外の残基にて本明細書のプロテアーゼ部分に共
有結合されてもよい。かかるポリマー部分は、本明細書で記載されるような技術
及び当業界で公知の技術を用いて（本明細書で記載されるような連結部分を介す
ることを含めて）プロテアーゼ部分のいずれかの位置にて本明細書のプロテアー
ゼ部分に直接結合してもよい。この任意型のポリマーの抱合の非限定例はＷＯ第
９９／００８４９号（オルセン（Olsen）ら、１９９９年１月７日公開、ノボノ
ルディスクＡ／Ｓ）に述べられている。

【００７２】 製造方法 エピトープ保護位置（又は該部分のいかなる他の位置）の１又はそれより多く
で置換を有するプロテアーゼ部分は、親型アミノ酸配列をコードするヌクレオチ
ド配列に変異することによって調製される。かかる方法は当業者に周知であり；
かかる方法の１つの非限定例を以下に述べる：

【００７３】 野生型サブチリシンＢＰＮ’遺伝子を含有するファージミド（プラスミドベク
ター）（ｐＳＳ−５）（Mitchison、C. and J.A.Wellsの「サブチリシンＢＰＮ
’におけるジスルフィド結合のタンパク質工学」（Biochemistry、第２８巻の４
８０７〜４８１５ページ（１９８９年）））を、大腸菌ｄｕｔ−ｕｎｇ株ＣＪ２
３６において形質転換させ、ＶＣＳＭヘルパーファージを用いて１本鎖ウラシル
含有ＤＮＡ鋳型を作成する（Kunkel らの「迅速且つ有効な表現型選択なしでの
部位特異的変異誘発」（Methods in Enzymology、第１５４巻の３６７〜３８２
ページ（１９８７年）で、Yuckenberg らにより「ウラシル含有ＤＮＡとファー
ジミドベクターを用いた部位特異的in vitro変異誘発」（部位特異的変異誘発−
実践的アプローチ（Directed Mutagenesis−A Practical Approach）「McPherso
n、M.J.編」の２７〜４８ページ（１９９１年））で改変された）。Zoller, M.J
.及びM.Smithの「オリゴヌクレオチド−Ｍ１３由来のベクターを用いた部位特異
的変異誘発：いかなるＤＮＡ断片においても点変異を誘発する有効且つ一般的な
方法）」（Nucleic Acids Researchの第１０巻の６４８７〜６５００ページ（１
９８２年））に開示された方法から改変されたプライマーによる部位特異的変異
誘発を用いて、（本質的には上記Yuckenberg らにより提示されたように）全て
の変異体を作る。

【００７４】 ３８０Ｂ ＤＮＡシンセサイザー（アプライドバイオシステムズ社（Applied B
iosystems Inc.））を用いてオリゴヌクレオチドを作る。変異誘発反応産物を、
大腸菌株ＭＭ２９４（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Americ
an Type Culture Collection）大腸菌３３６２５）中に形質転換させる。変異の
全てをＤＮＡ配列決定により確認し、単離したＤＮＡを、バチルス サブチリス
（Bacillus subtilis）の発現株ＰＧ６３２に形質転換させる（Saunders らの「
ヒト副甲状腺ホルモンの３４アミノ酸断片のバチルス サブチリス（Bacillus s
ubtilis）からの分泌のためのシグナル配列開裂部位の最適化）」（Gene、第１
０２巻の２７７〜２８２ページ（１９９１年））及びYang らの、「バチルス
サブチリス（Bacillus subtilis）のニュートラルプロテアーゼ遺伝子のクロー
ニング及びin vitroで誘導欠失変異を創るためのクローニングした遺伝子の使用
」（Journal of Bacteriologyの第１６０巻の１５〜２１ページ（１９８４年）
）。

【００７５】 発酵培養は以下のとおりである。対象のプロテアーゼを含有するバチルス サ
ブチリス（Bacillus subtilis）細胞（ＰＧ６３２）を、１０ｇ／Ｌのグルコー
スを含有するＬＢブロス培地１リットル中で、中期対数増殖期まで増殖させ、総
容量９リットルのバイオスタットＣ発酵培養槽（ペンシルベニア州、アレンタウ
ンのブラウンバイオテック社（Braun Biotech、Inc.））に接種する。発酵培地
は、酵母抽出物、カゼイン加水分解物、可溶性−部分加水分解スターチ（マーチ
ン(Maltrin)Ｍ−２５０）、抗発泡剤、緩衝液、及び微量ミネラル（「桿菌の生
物学：産業への応用（Biology of Bacilli：Applications to Industry）」（Do
i,R.H. 及び M.McGloughlin編（１９９２年））を参照のこと）を含有する。発
酵培養が行われている間、ブロス培地はｐＨ７．５を一定に保つ。変異誘発した
プラスミドの抗生物質選抜のためにカナマイシン（５０μｇ／ｍＬ）を加える。
３７℃にてＡ₆₀₀が約６０になるまで１８時間、細胞を増殖させ、生成物を回収
する。

【００７６】 以下の工程を介して発酵培養ブロスを回収し、純粋なプロテアーゼを得る。ブ
ロスは、０．１６μｍ膜に対する接線フロー（tangential flow）によってバチ
ルス サブチリス細胞を除く。８，０００の分子量を除く膜による限外ろ過によ
って細胞のないブロスを濃縮する。濃縮ＭＥＳ緩衝液（２−（Ｎ−モルフォリノ
）エタンスルホン酸）によってｐＨを５．５に調整する。Ｓセファロースによる
ＮａＣｌ勾配溶出の陽イオン交換クロマトグラフィーによってプロテアーゼを更
に精製する。Scopes，R.K.の「タンパク質精製の原理と実践（Protein Purifica
tion Principles and Practice）」（Springer−Verlag、ニューヨーク（１９８
４年））を参照のこと。

【００７７】 ｐＮＡアッセイ（DelMar ら.によるAnalytical Biochemistryの第９９巻、３
１６〜３２０ページ（１９７９年））を用いて、勾配溶出の間に回収された分画
について活性のあるプロテアーゼ濃度を測定する。このアッセイは、プロテアー
ゼが可溶性合成基質である、スクシニル−アラニン−アラニン−プロリン−フェ
ニルアラニン−ｐ−ニトロアニリン（ｓＡＡＰＦ−ｐＮＡ）を加水分解するとき
、ｐ−ニトロアニリンが放出される率を測定する。加水分解反応による黄色の生
成物の率を分光光度計４１０ｎｍで測定し、活性のあるプロテアーゼ部分の濃度
に比例させる。更に、２８０ｎｍの吸光度測定を用いて、総タンパク質濃度を決
定する。活性のあるプロテアーゼ／総タンパク質の比によってプロテアーゼの純
度が判り、それを用いて分画を同定してストック溶液のためにプールする。

【００７８】 保存中のプロテアーゼの自己融解を避けるために、クロマトグラフィーカラム
から得たプールした分画に等質量のプロピレングリコールを加える。精製手順の
終了時に、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル
電気泳動）によってストックのプロテアーゼ溶液の純度をチェックし、トリプシ
ン阻害剤II型−Ｔ（七面鳥の卵白（ミズーリ州、セントルイスのシグマケミカル
社））を用いて活性部位滴定法により純粋酵素濃度を測定する。

【００７９】 使用のための調製では、セファデックス−Ｇ２５（ニュージャージー州、ピス
カタウエイのファルマシア）サイズ除外カラムからプロテアーゼストック溶液を
溶出してプロピレングリコールを除き、緩衝液を交換する。酵素ストック溶液中
のＭＥＳ緩衝液を０．０１ＭのＫＨ₂ＰＯ₄溶液（ｐＨ５．５）に交換する。

【００８０】 プロテアーゼ抱合体を製造するために、調製されたプロテアーゼとともに、１
又はそれより多くの付加部分による機能化にそれを利用してもよい。付加部分に
対する前駆体（付加部分に対する前駆体は、プロテアーゼ部分に対する前駆体と
反応して、付加部分及びプロテアーゼ部分を含むプロテアーゼ抱合体を形成する
）は好ましくは、活性化されてプロテアーゼ部分に対する前駆体との反応性を高
める。かかる活性化は、当業界で周知である。プロテアーゼ抱合体の調製方法の
非限定例を以下に提供する。

【００８１】

【実施例】

実施例１

【００８２】

【化４】

【００８３】 エピトープ保護位置の１つにてシステイン残基を含むプロテアーゼは、以下の
方法を用いて上記の図に従ってポリマー部分に結合される（その際、「Ｐ」は、
システイン置換から生じるチオール基を失ったプロテアーゼ部分を表し、ｎは、
ポリエチレングリコールの繰返しモノマー単位の数（例えば、ｎ＝７７）である
）。

【００８４】 ２１７位置のチロシンに対するロイシンの置換及び３位置のセリンに対するシ
ステインの置換を持つサブチリシンＢＰＮ’の変異型を調製する。リン酸緩衝液
（ｐＨ５．５）中で変異型の約２ｍｇ／ｍＬの濃度を達成する。次いで、希水酸
化ナトリウムにてｐＨを７．５に上げる。活性化ポリマーを変異型に対して２５
：１の過剰量で、変異型をモノメチルポリエチレングリコールマレイミドと混合
する。室温にて１時間混合した後、混合物のｐＨを希リン酸で５．５に合わせ、
分子量カットオフ限外ろ過を介して、ろ過して過剰のポリマーを除く。濃縮物は
精製されたプロテアーゼ抱合体を含有する。

【００８５】 実施例２

【００８６】

【化５】

【００８７】 エピトープ保護位置の１つにてシステイン残基を含むプロテアーゼ部分は、以
下の方法を用いて上記の図に従ってポリマー部分に結合される（その際、「Ｐ」
は、システイン置換から生じるチオール基を失ったプロテアーゼ部分を表し、ｎ
は、各ポリエチレングリコールの繰返しモノマー単位の数（例えば、ｎ＝７７）
である）。

【００８８】 ２１７位置のチロシンに対するロイシンの置換及び１７位置のフェニルアラニ
ンに対するシステインの置換を持つサブチリシンＢＰＮ’の変異型を調製する。
リン酸緩衝液（ｐＨ５．５）中で変異型の約２ｍｇ／ｍＬの濃度を達成する。次
いで、希水酸化ナトリウムにてｐＨを７．５に上げる。活性化ポリマーを変異型
に対して２５：１の過剰量で、変異型をジメチルポリエチレングリコールマレイ
ミドと混合する。室温にて１時間混合した後、混合物のｐＨを希リン酸で５．５
に合わせ、分子量カットオフ限外ろ過を介して、ろ過して過剰のポリマーを除く
。濃縮物は精製されたプロテアーゼ抱合体を含有する。

【００８９】 実施例３ スクシンイミドで保護されたポリマーを１又はそれより多くのエピトープ保護
位置において選択的にリジンに結合させる（その際、「ＭＰＥＧ」及び「ＰＥＧ
Ｍ」は同等であり、モノメチルポリエチレングリコールを表し、「Ｐ」は、示さ
れるリジンアミン基を失ったプロテアーゼ部分を表す）：

【００９０】

【化６】

【００９１】 実施例４ カルボジイミドで保護されたポリマーを１又はそれより多くのエピトープ保護
位置において選択的にリジンに結合させる（その際、「ＭＰＥＧ」及び「ＰＥＧ
Ｍ」は同等であり、モノメチルポリエチレングリコールを表し、「Ｐ」は、示さ
れるリジンアミン基を失ったプロテアーゼ部分を表し、及びＸ並びにＸ’は、カ
ルボジイミド部分、例えばアルキルを含む側鎖である）：

【００９２】

【化７】

【００９３】 実施例５

【００９４】

【化８】

【００９５】 エピトープ保護位置の１つにてシステイン残基を含むプロテアーゼ部分を以下
の方法を用いてアルキルマレイミドと結合させる（その際、「Ｐ」は、システイ
ン置換から生じるチオール基を失ったプロテアーゼ部分を表し、「Ｒ」はアルキ
ル基である）。この実施例では、Ｒ₁及びＲ₂はそれぞれ不在であり、連結部分は
アルキルマレイミドに由来する。

【００９６】 ２１７位置のチロシンに対するロイシンの置換及び８６位置のセリンに対する
システインの置換を持つサブチリシンＢＰＮ’の変異型を調製する。２０ｍＬの
変異型溶液を０．０１ＭのＫＨ₂ＰＯ₄緩衝液（ｐＨ７）中で約１ｍｇ／ｍＬの濃
度にて調製する。この溶液に対して、１．５当量のアルキルマレイミド（例えば
、メチルマレイミド）を溶液に加える。室温にて約１時間、溶液を穏かに混合す
る。生じたプロテアーゼ抱合体を常法にて溶液から得る。

【００９７】 実施例６

【００９８】

【化９】

【００９９】 エピトープ保護位置の１つにてシステイン残基を含むプロテアーゼ部分が以下
の方法を用いてダイマーを形成する（その際、「Ｐ」は、システイン置換から生
じるチオール基を失ったプロテアーゼ部分を表す）。この実施例では、プロテア
ーゼ部分及びポリペプチド部分は同等である（及びＸは不在である）。

【０１００】 ２１７位置のチロシンに対するロイシンの置換及び２１４位置のセリンに対す
るシステインの置換を持つサブチリシンＢＰＮ’の変異型を調製する。２０ｍＬ
の変異型溶液を０．０１ＭのＫＨ₂ＰＯ₄緩衝液（ｐＨ８．６）中で約１ｍｇ／ｍ
Ｌの濃度にて調製する。室温にて約１時間、溶液中に酸素を穏かに泡立てて通気
し、所望のプロテアーゼ抱合体ダイマーを形成する。生じたプロテアーゼ抱合体
を常法にて溶液から得る。

【０１０１】 分析方法 酵素活性並びに免疫原性反応について、双方とも当業者には既知の以下の方法
を用いて本プロテアーゼ抱合体を調べてもよい。別の方法として当業界でよく知
られているその他の方法を用いてもよい。

【０１０２】 プロテアーゼ抱合体の活性 当業界でよく知られた方法によって本発明のプロテアーゼ抱合体のプロテアー
ゼ活性をアッセイしてもよい。本明細書では２つのかかる方法を以下に述べる：

【０１０３】皮膚薄片活性法 スコッチ（登録商標）＃３７５０Ｇテープを用いて、被験者の脚からヒトの皮
膚薄片を、テープが薄片で実質的に不透明になるまで剥ぎ取る。次いで１インチ
と１インチの四角にテープを切断し、取りのけておく。１０ｍｍ×３５ｍｍのペ
トリ皿にて、２ｍＬの０．７５ｍｇ／ｍＬの対照酵素（例えば、サブチリシンＢ
ＰＮ’）又は調べられるべきプロテアーゼ抱合体を０．０１ＭのＫＨ₂ＰＯ₄緩衝
液（ｐＨ５．５）に加える。１ｍＬの２．５％ラウリン酸ナトリウム（ｐＨ８．
６）をこの溶液に加える。平板振盪器上にて溶液を緩やかに混合する。緩やかに
混合しながら１０分間、予め調製した四角のテープを溶液中に浸す（薄片面を上
）。次いで水道水にて１５秒間、四角のテープを緩やかにすすぐ。ステベネル（
Stevenel）・ブルー染色（３ｍＬ、シグマケミカル社（ミズーリ州セントルイス
）から商業的に入手可能）をきれいなペトリ皿にピペットで載せる。緩やかに混
合しながら、すすいだ四角のテープを染色液中に３分間置く（薄片面を上）。四
角のテープを染色液から出し、３００ｍＬの蒸留水の２つのビーカーにて、すす
ぎ当り１５秒間連続ですすぐ。四角のテープを風乾させる。対照酵素から得られ
た四角のテープとプロテアーゼ抱合体から得られた四角のテープとの間の色強度
を肉眼又は色度計で比較する。対照酵素の四角テープに比して、低い色強度を示
すプロテアーゼ抱合体の四角テープが、より高い活性を有するプロテアーゼ抱合
体であることを示す。

【０１０４】染色コラーゲン活性法 ｐＨを８．６にするために０．０１ＭのＣａＣｌ₂を含有する５０ｍＬの０．
１Ｍトリス緩衝液（トリス−ヒドロキシメチル−アミノメタン）と、０．５ｇの
アゾコール（アゾ染料を含浸したコラーゲン、ミズーリ州、セントルイスのシグ
マケミカル社から商業的に入手可能）とを混合する。平板振盪器で緩やかに混合
しながら２５℃にてこの混合物をインキュベートする。０．２ミクロンのシリン
ジ型フィルターで２ｍＬの混合物をろ過し、分光光度計の５２０ｎｍ〜０にて混
合物の吸収を読み取る。１ｐｐｍの対照酵素（例えば、サブチリシンＢＰＮ’）
又は調べられるべきプロテアーゼ抱合体を、残りの４８ｍＬのトリス／アゾコー
ル混合物に加える。２分ごとに１０分間、対照／プロテアーゼ抱合体を含有する
２ｍＬの溶液を０．２ミクロンのシリンジ型フィルターでろ過する。各ろ過され
た試料について、５２０ｎｍでの吸収を即座に読み取る。結果を時間に対してプ
ロットする。対照及び試験抱合体の傾きが、試料の相対的活性を示す。傾きが高
ければ高い活性を示す。試験プロテアーゼ抱合体の活性（傾き）を対照活性（傾
き）のパーセントとして表してもよい。

【０１０５】 免疫原性に関するマウスの鼻内試験 当業界で公知の方法又は本明細書の以下で示す免疫原性に関するマウスの鼻内
試験を用いて、本発明のプロテアーゼ抱合体の免疫原性の可能性を測定してもよ
い。この試験は Robinson らの「マウスにおけるサブチリシン・カールスバーグ
（アルカラーゼ）に対する特異的抗体反応：鼻内暴露モデルの開発」（Fundamen
tal and Applied Toxicologyの第３４巻の１５〜２４ページ（１９９６年））及
び Robinson らの「界面活性酵素に対するアレルギーの可能性を測定するための
マウス鼻内試験（ＭＩＮＴ）の使用：モルモットの気管内試験（ＧＰＩＴ）との
比較」（Toxicological Scienceの第４３巻の３９〜４６ページ（１９９８年）
）で記載されたアッセイに類似しており、双方のアッセイとも本明細書で以下に
述べる試験に代えて利用されてもよい。

【０１０６】 体重約１８〜約２０グラムのメスＢＤＦ１マウス（ミシガン州、ポーテージの
、チャールズリバーラボラトリーズ）を試験に利用する。投与の１週間前にマウ
スを検疫する。湿度（３０〜７０％）、温度（６７〜７７^oＦ（１９．４〜２５
．０℃））及び１２時間の明暗サイクルを制御した飼育室で木製チップを入れた
ケージにてマウスを飼育する。マウスにはプリナ（Purina）（登録商標）マウス
用餌（インディアナ州、リッチモンド、プリナミル）及び水を自由摂取させる。

【０１０７】 調べるべき可能性のある抗原（陽性対照としてのサブチリシンＢＰＮ’又は本
発明のプロテアーゼ抱合体のいずれか）を、５匹１群のマウスに投与する。投与
に先だって、ケタセット(Ketaset)（８８．８ｍｇ／ｋｇ）及びロンプン(Rompun
)（６．６７ｍｇ／ｋｇ）の混合物を腹腔内（i.p.）注射することによりマウス
を麻酔する。麻酔した動物を手のひらで保持し、裏返して、緩衝液（０．０１Ｍ
のＫＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ５．５）中の５ｍＬのプロテアーゼを鼻内に投与する。各群
は同一投与量を与えられるが、種々の投与量を試してもよい。投与溶液は、各鼻
孔の外に穏かに置きマウスに（自発的に）吸入させる。３、１０、１７、及び２
４日目に投与を繰り返す。

【０１０８】 ２９日目に血清試料を採取する。抗原捕捉ＥＬＩＳＡ法によってマウスの血清
における酵素特異的ＩｇＧ１を測定する。標準ＥＤ₅₀値を用いて、プロテアーゼ
抱合体の免疫原性をサブチリシンＢＰＮ’のそれと比較する。

【０１０９】 本発明の組成物 本明細書のプロテアーゼ抱合体は、それぞれの親型プロテアーゼに好適ないか
なる適用においても用いることができる。かかる例の１つには洗浄用組成物が挙
げられる。本プロテアーゼ抱合体は免疫原性特性が望ましく低下したために、プ
ロテアーゼを使用することで、今まで最低限の恩恵しか受けていなかった適用に
おいて使用してもよい。かかる適用の例には、プロテアーゼ抱合体が必然的に哺
乳類の皮膚（特にヒトの皮膚）に接触するようになるもの、例えば、パーソナル
ケア組成物の使用によるものが挙げられる。

【０１１０】 洗浄用組成物 プロテアーゼ抱合体は、洗濯用組成物、硬質面洗浄用組成物、食器洗浄用組成
物を含む軽質洗浄用組成物、及び自動食器洗浄洗剤組成物を含むが、これに限定
されない洗浄用組成物で利用されてもよい。

【０１１１】 本明細書の洗浄用組成物は、本発明の１又はそれより多くのプロテアーゼ抱合
体の有効量及び洗浄用組成物用キャリアを含む。

【０１１２】 本明細書で使用されるとき、「プロテアーゼ抱合体の有効量」などは、具体的
な洗浄用組成物で必要なタンパク質分解活性を達成するのに必要なプロテアーゼ
抱合体の量をいう。かかる有効量は、当業者によって容易に突き止められ、使用
される特定のプロテアーゼ抱合体、洗浄用適用、洗浄用組成物の具体的な組成、
及び液状又は乾燥した（例えば、顆粒、棒状）組成物が必要かどうかなどのよう
な多数の要因に基づく。好ましくは、洗浄用組成物は、約０．０００１％〜約１
０％、更に好ましくは約０．００１％〜約１％、及び最も好ましくは約０．０１
％〜約０．１％の本発明の１又はそれより多くのプロテアーゼ抱合体を含む。プ
ロテアーゼ抱合体が用いられてもよい種々の洗浄用組成物の数例を以下で更に詳
細に説明する。

【０１１３】 本プロテアーゼ抱合体に加えて、本洗浄用組成物は更に、プロテアーゼ抱合体
に適合する１又はそれより多くの洗浄用組成物材料を含む洗浄用組成物用キャリ
アを含む。用語「洗浄用組成物材料」は、本明細書で使用されるとき、所望の洗
浄用組成物の特定の型及び製品の形状（例えば、液状、顆粒、棒状、スプレー、
スティック、ペースト、ジェル）に対して選択されるいかなる材料も意味し、材
料は組成物で使用されるプロテアーゼ抱合体にも適合する。洗浄用組成物材料の
具体的な選択は、洗浄されるべき表面素材、使用中の洗浄条件（例えば、洗浄洗
剤の使用を介して）に対する組成物の所望の形態を考慮して、容易に行われる。
用語「適合する」は、本明細書で使用されるとき、洗浄用組成物材料が、通常の
使用状況でプロテアーゼが所望の効果がない程度までプロテアーゼ抱合体のタン
パク質分解活性を低下させないことを意味する。具体的な洗浄用組成物材料は、
以下に詳細に例示する。

【０１１４】 本発明のプロテアーゼ抱合体は、高い泡立ち及び良好な洗浄活性が所望である
種々の洗剤組成物で使用されてもよい。従って、プロテアーゼ抱合体は種々の従
来の成分と共に使用されて、完全に処方された硬質面クリーナー、食器洗浄組成
物、織物洗濯用組成物などを提供することができる。かかる組成物は、液状、顆
粒状、棒状などの形態であってもよい。約３０重量％〜約６０重量％もの界面活
性剤を含有する「濃縮」洗剤としてもかかる組成物を処方することができる。

【０１１５】 本明細書の洗浄用組成物は、任意で、及び好ましくは種々の界面活性剤（例え
ば、アニオン系、非イオン系、又は双極性イオン系界面活性剤）を含有してもよ
い。かかる界面活性剤は、典型的には組成物の約５％〜約３５％のレベルで存在
する。

【０１１６】 本明細書で有用な界面活性剤の非限定例には、従来のＣ₁₁〜Ｃ₁₈のアルキルベ
ンゼンスルホネート及び第１級並びに無作為アルキルサルフェート、Ｃ₁₀〜Ｃ₁₈ の第２級（２,３）アルキルサルフェートで式が、ＣＨ₃(ＣＨ₂)_x(ＣＨＯＳＯ₃)^- Ｍ⁺)ＣＨ₃及びＣＨ₃(ＣＨ₂)_y(ＣＨＯＳＯ₃ ^-Ｍ⁺)ＣＨ₂ＣＨ₃のもので、その際ｘ
及び（ｙ＋１）が少なくとも約７、好ましくは少なくとも約９の整数であり、且
つＭが水溶性カチオン、特にはナトリウムであるもの、Ｃ₁₀〜Ｃ₁₈のアルキルア
ルコキシサルフェート（特にＥＯ１〜５のエトキシサルフェート）、Ｃ₁₀〜Ｃ₁₈ のアルキルアルコキシカルボキシレート（特にＥＯ１〜５のエトキシカルボキシ
レート）、Ｃ₁₀〜Ｃ₁₈アルキルポリグリコシド類、及びそれに相当する硫酸化ポ
リグリコシド類、Ｃ₁₂〜Ｃ₁₈のα−スルホン化脂肪酸エステル、Ｃ₁₂〜Ｃ₁₈のア
ルキル及びアルキルフェノールアルコキシレート（特にエトキシレート及び混合
エトキシ／プロポキシ）、Ｃ₁₂〜Ｃ₁₈のベタイン及びスルホベタイン類（「スル
タイン類」）、Ｃ₁₀〜Ｃ₁₈アミンオキシドなどが挙げられる。アルキルアルコキ
シサルフェート（ＡＥＳ）及びアルキルアルコキシカルボキシレート（ＡＥＣ）
が本明細書で好ましい。処方者の好みによって、アミンオキシド及び／又はベタ
イン又はスルタイン界面活性剤との組合せでかかる界面活性剤を使用することも
好ましい。その他の従来の有用な界面活性剤は標準テキストに一覧されている。
特に有用な界面活性剤には、米国特許第５，１９４，６３９号（１９９３年３月
１６日発行、コナー（Connor）らで開示されているＣ₁₀〜Ｃ₁₈Ｎ−メチルグルカ
ミドが挙げられる。

【０１１７】 洗剤洗浄用組成物で有用な多種多様なその他の成分は、例えば、その他の有効
成分、キャリア、屈水性誘発物質（hydrotrope）、加工助剤、染料又は色素、及
び液状処方のための溶媒が挙げられ、それらを本発明組成物中に含むことができ
る。泡立ちにおける追加的増加が所望の場合は、Ｃ₁₀〜Ｃ₁₆のアルコルアミドの
ような泡立ち促進剤を、典型的には約１％〜約１０％のレベルで組成物に組み入
れることができる。Ｃ₁₀〜Ｃ₁₄のモノエタノール及びジエタノールアミドはかか
る泡立ち促進剤の典型的な部類を例示する。上述のようなアミンオキシド類、ベ
タイン類及びスルタイン類のような高い泡立ち添加界面活性剤と共にかかる泡立
ち促進剤を使用することも有利である。所望であれば、ＭｇＣｌ₂、ＭｇＳＯ₄な
どのような可溶性マグネシウム塩も、典型的には約０．１％〜約２％のレベルで
加えて、追加の泡立ちを提供することができる。

【０１１８】 本明細書における液状洗剤組成物は、キャリアとして水及びその他の溶媒を含
有してもよい。メタノール、エタノール、プロパノール、及びイソプロパノール
で例示される低分子量の第１級又は第２級アルコールは好適である。界面活性剤
を可溶化するには一価アルコール類が好ましいが、約２〜約６の炭素原子及び約
２〜約６のヒドロキシ基を含むもののような（例えば、１，３−プロパンジオー
ル、エチレングリコール、グリセリン、及び１，２−プロパンジオール）ポリオ
ールを使用することもできる。組成物は、約５％〜約９０％、典型的には約１０
％〜約５０％のかかるキャリアを含有してもよい。

【０１１９】 本明細書における洗剤組成物は、好ましくは水性洗浄操作で使用中、洗浄水が
約６．８と約１１の間のｐＨを有するように処方される。従って最終製品は典型
的にはこの範囲で処方される。推奨される使用レベルでｐＨを制御する技法には
、例えば、緩衝液、アルカリ、及び酸の使用が挙げられる。かかる技法は当業者
によく知られている。

【０１２０】 本発明の硬質面洗浄用組成物及び織物洗浄用組成物を処方する場合、処方者は
、約５重量％〜約５０重量％のレベルで種々のビルダーを使用することを望んで
もよい。典型的には、ビルダーには、１〜１０ミクロンのゼオライト、クエン酸
塩及びオキシジコハク酸塩のようなポリカルボキシレート、層状珪酸塩、リン酸
塩などが挙げられる。その他の従来のビルダーは標準処方に一覧される。

【０１２１】 同様に、処方者は、かかる組成物の中でセルラーゼ、リパーゼ、アミラーゼ、
及びプロテアーゼのような追加の種々の酵素を典型的には約０．００１重量％〜
約１重量％のレベルで使用することを望んでもよい。洗濯洗剤技術分野では、種
々の洗剤用酵素及び織物を扱う酵素がよく知られている。

【０１２２】 過炭酸塩、過ホウ酸塩等のような種々の漂白化合物を典型的には、約１重量％
〜約１５重量％のレベルでかかる組成物の中で使用してもよい。所望であれば、
かかる組成物は、公知のテトラアセチルエチレンジアミン、ノナノイルオキシベ
ンゼンスルホネート等のような漂白活性化剤も含有することができる。使用レベ
ルは典型的には約１重量％〜約１０重量％の範囲である。

【０１２３】 特に、アニオン系オリゴエステル型の汚れ放出剤、キレート化剤、特に、アミ
ノホスホネート及びエチレンジアミンジスクシネート、粘土質汚れ除去剤、特に
、エトキシル化テトラエチレンペンタミン、分散剤、特にポリアクリレート及び
ポリアスパラテート、光沢剤、特にアニオン系光沢剤、泡立ち抑制剤、特に、シ
リコーン及び第２級アルコール、織物柔軟剤、特に、スメクタイト粘土などは全
て、約１重量％〜約３５重量％の範囲のレベルにてかかる組成物で使用すること
ができる。標準処方及び公開された特許は、かかる従来の材料の複数の詳細な記
載を含有する。

【０１２４】 酵素安定化剤も洗浄用組成物で使用してもよい。かかる酵素安定化剤には、プ
ロピレングリコール（好ましくは約１％〜約１０％）、ギ酸ナトリウム（好まし
くは約０．１％〜約１％）及びギ酸カルシウム（好ましくは約０．１％〜約１％
）が挙げられる。

【０１２５】 本変異型は、硬質面洗浄用組成物で有用である。本明細書で使用されるとき「
硬質面洗浄用組成物」は、床、壁、浴室のタイルなどのような硬質面を洗浄する
ための液状及び顆粒状洗剤組成物をいう。本発明の硬質面洗浄用組成物は、１又
はそれより多くの本発明のプロテアーゼ抱合体の有効量、好ましくは、組成物の
約０．００１重量％〜約１０重量％、更に好ましくは約０．０１重量％〜約５重
量％、及び更に好ましくは尚約０．０５重量％〜約１重量％のプロテアーゼ抱合
体を含む。１又はそれより多くのプロテアーゼ抱合体を含むことに加えて、硬質
面洗浄用組成物は典型的には、界面活性剤及び水溶性の金属イオン封鎖ビルダー
を含む。しかしながら、スプレー式窓クリーナのようなある種の特別な製品では
、界面活性剤は、ガラス表面に膜状及び／又はムラのある残分を作る可能性があ
るので、使用されないこともある。

【０１２６】 界面活性剤成分は存在する場合、本明細書における組成物の０．１％くらい少
なく含まれてもよいが、典型的には組成物は、約０．２５％〜約１０％、更に好
ましくは約１％〜約５％の界面活性剤を含有する。

【０１２７】 典型的には、組成物は、約０．５％〜約５０％の洗浄用ビルダー、好ましくは
約１％〜約１０％を含有する。

【０１２８】 好ましくは、ｐＨは約７〜１２の範囲にあるべきである。調整が必要である場
合、水酸化ナトリウム、炭酸ナトリウム又は塩酸のような従来のｐＨ調整剤を使
用することができる。

【０１２９】 組成物に溶媒が包含されてもよい。有用な溶媒には、ジエチレングリコールモ
ノヘキシルエーテル、ジエチレングリコールモノブチルエーテル、エチレングリ
コールモノブチルエーテル、エチレングリコールモノヘキシルエーテル、プロピ
レングリコールモノブチルエーテル、ジプロピレングリコールモノブチルエーテ
ルのようなグリコールエーテル、及び２，２，４−トリメチル−１，３−ペンタ
ンジオール並びに２−エチル−１，３−ヘキサンジオールのようなジオールが挙
げられるが、これに限定されない。使用する場合、かかる溶媒は典型的には約０
．５％〜約１５％、更に好ましくは約３％〜約１１％のレベルで存在する。

【０１３０】 表面への組成物の「力いっぱい」の適用の後、表面をすすがない場合、組成物
の表面からの更に早い蒸発を促進するために更に、イソプロパノール又はエタノ
ールのような揮発性の高い溶媒を本組成物で使用することができる。使用する場
合、揮発性溶媒は典型的には、組成物中に約２％〜約１２％のレベルで存在する
。

【０１３１】

【表２】

【０１３２】 本発明のもう１つの実施態様では、食器洗浄用組成物は、本発明の１又はそれ
より多くの変異型を含む。本明細書で使用されるとき、「食器洗浄用組成物」は
、顆粒状及び液状形態を含むが、これに限定されないあらゆる形態の食器洗浄用
の組成物をいう。

【０１３３】

【表３】

【０１３４】

【表４】

【０１３５】パーソナルケア組成物 本発明のプロテアーゼ抱合体は特に、例えば、リーブオンの及びリンスオフの
ヘアコンディショナー、シャンプー、リーブオンの及びリンスオフのニキビ用組
成物、顔面乳液及びコンディショナー、シャワージェル、石鹸、泡立ち及び泡な
し顔面洗剤、化粧品、手、顔面並びに身体用ローション、保湿剤、貼付剤並びに
被覆剤、リーブオン顔面保湿剤、化粧用並びに洗浄用拭き取り組成物、口内ケア
組成物、生理用品及びコンタクトレンズケア組成物のようなパーソナルケア組成
物での使用に好適である。本パーソナルケア組成物は、１又はそれより多くの本
発明のプロテアーゼ抱合体及びパーソナルケア用キャリアを含む。

【０１３６】 例示すると、本発明プロテアーゼ抱合体は、以下の参考文献で記載される組成
物への包含に好適である：米国特許第５，６４１，４７９号（１９９７年６月２
４日発行、リナレス（Linares）ら、皮膚洗浄剤）；米国特許第５，５９９，５
４９号（１９９７年２月４日発行、ウイベル（Wivell）ら、皮膚洗浄剤）；米国
特許第５，５８５，１０４号（１９９６年１２月１７日発行、ハー（Ha）ら、皮
膚洗浄剤）；米国特許第５，５４０，８５２号（１９９６年７月３０日発行、ケ
ファバー（Kefauver）ら、皮膚洗浄剤）；米国特許第５，５１０，０５０号（１
９９６年４月２３日、ダンバー（Dunbar）ら、皮膚洗浄剤）；米国特許第５，６
１２，３２４（１９９７年３月１８日発行、ガング リン（Guang Lin）ら、抗ニ
キビ調製物）；米国特許第５，５８７，１７６号（１９９６年１２月２４日発行
、ワレン（Warren）ら、抗ニキビ調製物）；米国特許第５，５４９，８８８号（
１９９６年８月２７日発行、ベンカテスワラン（Venkateswaran）、抗ニキビ調
製物）；米国特許第５，４７０，８８４号（１９９５年１１月２８日発行、コー
レス（Corless）ら、抗ニキビ調製物）；米国特許第５，６５０，３８４号（１
９９７年７月２２日発行、ゴードン（Gordon）ら、シャワージェル）；米国特許
第５，６０７，６７８号（１９９７年３月４日発行、モーア（Moore）ら、シャ
ワージェル）；米国特許第５，６２４，６６６号（１９９７年４月２９日発行、
コフィンダファー（Coffindaffer）ら、ヘアコンディショナー及び／又はシャン
プー）；米国特許第５，６１８，５２４号（１９９７年４月８日発行、ボリック
（Bolich）ら、ヘアコンディショナー及び／又はシャンプー）；米国特許第５，
６１２，３０１号（１９９７年３月１８日発行、インマン（Inman）ら、ヘアコ
ンディショナー及び／又はシャンプー）；米国特許第５，５７３，７０９号（１
９９６年１１月１２日発行、ウエルズ（Wells）ら、ヘアコンディショナー及び
／又はシャンプー）；米国特許第５，４８２，７０３号（１９９６年１月９日発
行、ピングズ（Pings）ら、へアコンディショナー及び／又はシャンプー）；米
国特許第Ｒｅ.３４，５８４号（１９９４年４月１２日再発行、グロート（Grote
）ら、へアコンディショナー及び／又はシャンプー）；米国特許第５，６４１，
４９３号（１９９７年６月２４日発行、デイト（Date）ら、化粧品）；米国特許
第５，６０５，８９４号（１９９７年２月２５日発行、ブランク（Blank）ら、
化粧品）；米国特許第５，５８５，０９０号（１９９６年１２月１７日発行、ヨ
シオカ（Yoshioka）ら、化粧品）；米国特許第４，９３９，１７９号（１９９０
年７月３日発行、チェニー（Cheney）ら、手、顔面、及び／又は身体用ローショ
ン）；米国特許第５，６０７，９８０号（１９９７年３月４日発行、マッカティ
（McAtee）ら、手、顔面、及び／又は身体用ローション）；米国特許第４，０４
５，３６４号（１９７７年８月３０日発行、リクター（Richter）ら、化粧用及
び洗浄用拭き取り用品）；欧州特許出願ＥＰ第０６１９０７４号（１９９４年１
０月１２日公開、トウシェット（Touchet）ら、化粧用及び洗浄用拭き取り用品
）；米国特許第４，９７５，２１７号（１９９０年１２月４日発行、ブラウン−
スクロボット（Brown−Skrobot）ら、化粧用及び洗浄用拭き取り用品）；米国特
許第５，０９６，７００号（１９９２年３月１７日発行、セイベル（Seibel）、
口内洗浄用組成物）；米国特許第５，０２８，４１４号（１９９１年７月２日発
行、サンパスクマール（Sampathkumar）、口内洗浄用組成物）；米国特許第５，
０２８，４１５号（１９９１年７月２日発行、ベネディクト（Benedict）ら、口
内洗浄用組成物）；米国特許第５，０２８，４１５号（１９９１年７月２日発行
、ベネディクト（Benedict）ら、口内洗浄用組成物）；米国特許第４，８６３，
６２７号（１９８９年９月５日発行、デービス（Davies）ら、コンタクトレンズ
洗浄用液）；米国特許第Ｒｅ.３２，６７２号（１９８８年５月２４日再発行、
フート（Huth）、コンタクトレンズ洗浄用液）；及び米国特許第４，６０９，４
９３号（１９８６年９月２日発行、シェーファー（Schafer）、コンタクトレン
ズ洗浄用液）。

【０１３７】 本発明の口内洗浄用組成物を更に例示すると、薬学上許容可能な量の本発明の
１又はそれより多くのプロテアーゼ抱合体が、歯又は入れ歯からタンパク質様の
汚れを除くのに有用な組成物に包含される。本明細書で使用されるとき、「口内
洗浄用組成物」は、歯みがき、練り歯みがき、歯みがき用ジェル、歯みがき粉、
口内洗浄液、口内スプレー、口内ジェル、チューインガム、トローチ剤、サッシ
ェ（小袋）、錠剤、バイオジェル、予防用ペースト、歯の治療液などをいう。好
ましくは、口内洗浄用組成物は、組成物の約０．０００１重量％〜約２０重量％
、更に好ましくは約０．００１重量％〜約１０重量％、更に好ましくは尚、約０
．０１重量％〜約５重量％の１又はそれより多くの本発明のプロテアーゼ抱合体
、及び薬学上許容可能なキャリアを含む。本明細書で使用されるとき、「薬学上
許容可能な」は、用語が説明する薬剤、医薬品又は不活性成分が、過度の毒性、
不適合性、不安定性、刺激、アレルギー反応などを伴わずに、ヒト及び動物の組
織と接触して使用するのに好適であり、合理的な利益／リスク比と釣り合ってい
ることを意味する。

【０１３８】 典型的には、口内洗浄用組成物の口内洗浄用成分の薬学上許容可能な口内洗浄
用キャリア成分は一般に、組成物の約５０重量％〜約９９．９９重量％、好まし
くは約６５重量％〜約９９．９９重量％、更に好ましくは約６５重量％〜約９９
重量％含まれる。

【０１３９】 本発明の口内洗浄用組成物に包含される薬学上許容可能なキャリア成分及び任
意成分は当業者に周知である。口内洗浄用組成物で有用な多種多様な組成物型、
キャリア成分及び任意成分が、本明細書上記で引用された文献で開示されている
。

【０１４０】 本発明のもう１つの実施態様では、口腔の入れ歯の外側を洗浄するための入れ
歯洗浄用組成物は、本発明の１又はそれより多くのプロテアーゼ抱合体を含む。
かかる入れ歯洗浄用組成物は、好ましくは組成物の約０．０００１重量％〜約５
０重量％、更に好ましくは約０．００１重量％〜約３５重量％、更に好ましくは
尚約０．０１重量％〜約２０重量％の１又はそれより多くのプロテアーゼ抱合体
の有効量、及び入れ歯洗浄用キャリアを含む。発泡性錠剤などのような種々の入
れ歯洗浄用組成物の形式が当業者に周知であり（例えば、米国特許第５，０５５
，３０５号、ヤング（Young）を参照のこと）、入れ歯からタンパク質様の汚れ
を除くには、一般に１又はそれより多くのプロテアーゼ抱合体を組み入れるのに
適している。

【０１４１】 本発明のもう１つの実施態様では、コンタクトレンズ洗浄用組成物は、１又は
それより多くの本発明のプロテアーゼ抱合体を含む。かかるコンタクトレンズ洗
浄用組成物は、１又はそれより多くのプロテアーゼ抱合体の有効量、好ましくは
組成物の約０．０１重量％〜約５０重量％、更に好ましくは約０．０１重量％〜
約２０重量％、更に好ましくは尚、約１重量％〜約５重量％の１又はそれより多
くのプロテアーゼ抱合体、及びコンタクトレンズ洗浄用キャリアを含む。錠剤、
液体などのような種々のコンタクトレンズ洗浄用組成物の形式が当業者に周知で
あり、コンタクトレンズからタンパク質様の汚れを除くには、一般に１又はそれ
より多くの本発明のプロテアーゼ抱合体を組み入れるのに適している。

【０１４２】

【表５】

【０１４３】

【表６】

【０１４４】

【表７】

【０１４５】

【表８】

【０１４６】

【表９】

【０１４７】 上記組成物は、セルロース及び／又はポリエステルから構成される織物吸収シ
ートに織物吸収シートの約２５０重量％で含浸される。

【配列表】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ， ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ， ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＢＺ，Ｃ Ａ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ， ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，Ｋ Ｅ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ， ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ， ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ルビング，ドン ネルトン アメリカ合衆国オハイオ州、シンシナチ、 シード、ロード 8224 (72)発明者 ワイスガーバー，デイヴィッド ジョン アメリカ合衆国オハイオ州、シンシナチ、 フェアヒル 2632 (72)発明者 コリア，ポール エリオット アメリカ合衆国オハイオ州、シンシナチ、 ドライ、リッジ、ロード 5755 Ｆターム(参考） 4B050 CC08 DD02 GG08 LL04 4C083 AA122 AB362 AC012 AC072 AC112 AC122 AC182 AC242 AC292 AC302 AC352 AC392 AC422 AC482 AC532 AC542 AC562 AC642 AC712 AC782 AC812 AC852 AC902 AD092 AD132 AD222 AD472 BB41 CC04 CC05 CC07 CC23 CC24 CC33 CC38 CC41 CC42 DD08 DD15 DD16 DD17 DD21 DD22 DD23 DD28 DD31 DD41 EE07 EE10 FF01 4H003 AB19 AB27 AB31 AC14 DA01 DA02 DA05 DA16 DA17 EB08 EB16 EB22 EC02 ED02 ED29 FA47

Claims (14)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 プロテアーゼ部分及び１又はそれより多くの付加部分を含む
   プロテアーゼ抱合体であって、プロテアーゼ部分は、第１のエピトープ領域、第
   ２のエピトープ領域、及び第３のエピトープ領域を含み、各付加部分はプロテア
   ーゼ部分の下記（ａ）〜（ｃ）のエピトープ保護位置に共有結合することを特徴
   とするプロテアーゼ抱合体： （ａ）第１のエピトープ領域に対するエピトープ保護位置が、サブチリシンＢ
   ＰＮ’の１、２、３、４、５、６、７、１２、１７、３６、４０、４１、４３、
   ４４、４５、６７、８６、８７、８９、２０６、２０９、２１０、２１２、２１
   ３、２１４、２１５、及び２１６位置から成る群から選択され； （ｂ）第２のエピトープ領域に対するエピトープ保護位置が、サブチリシンＢ
   ＰＮ’の２５、２６、２７、４６、４７、４８、４９、５０、５１、５２、５３
   、５４、９１、９９、１００、１０１、１０２、１２７、１２８、１２９、１３
   ０、１３１、１３２、１３３、１３４、１３６、１３７、１３８、１４０、１４
   １、１４４、及び１４５位置から成る群から選択され；且つ （ｃ）第３のエピトープ領域に対するエピトープ保護位置が、サブチリシンＢ
   ＰＮ’の９、１０、２２、２３、２４、６２、６３、１４３、１４６、１５４、
   １５５、１５６、１５７、１７２、１７３、１８７、１８９、１９５、１９７、
   ２０３、２０４、２５３、２５４、２５６、２６５、２６７、２６９、２７１、
   ２７２、及び２７５位置から成る群から選択される。
2. 【請求項２】 各付加部分が独立して以下の構造を有する請求項１に記載の
   プロテアーゼ抱合体： 【化１】 （式中、Ｘは不在及び連結部分から成る群から選択され；Ｒ₁は、不在、第１の
   ポリペプチド、及び第１のポリマーから成る群から選択され；及びＲ₂は、不在
   、第２のポリペプチド、及び第２のポリマーから成る群から選択され；少なくと
   もＸ、Ｒ₁、及びＲ₂の１つは不在ではない）。
3. 【請求項３】 プロテアーゼ部分が、親型アミノ酸配列の修飾されたアミノ
   酸配列を有し、該修飾されたアミノ酸配列は、１又はそれより多くのエピトープ
   保護位置における置換アミノ酸による置換を含み、各付加部分は置換アミノ酸の
   １つに共有結合する請求項２に記載のプロテアーゼ抱合体。
4. 【請求項４】 置換アミノ酸がシステインである請求項３に記載のプロテア
   ーゼ抱合体。
5. 【請求項５】 親型アミノ酸配列が、サブチリシンＢＰＮ’、サブチリシン
   カールスバーグ、サブチリシンＤＹ、サブチリシン３０９、プロテイナーゼＫ、
   サーミターゼ、プロテアーゼＡ、プロテアーゼＢ、プロテアーゼＣ、及びプロテ
   アーゼＤ、及びその変異型から成る群から選択される請求項４に記載のプロテア
   ーゼ抱合体。
6. 【請求項６】 請求項５に記載のプロテアーゼ抱合体であって： （ａ）第１のエピトープ領域に対するエピトープ保護位置が、サブチリシンＢ
   ＰＮ’の１、２、３、４、５、６、７、１２、１７、４０、４１、４３、６７、
   ８６、８７、８９、２０６、２０９、２１４、及び２１５位置から成る群から選
   択され； （ｂ）第２のエピトープ領域に対するエピトープ保護位置が、サブチリシンＢ
   ＰＮ’の２７、４７、４８、５０、５２、１０２、１２７、１２８、１３０、１
   ３１、１３２、１３４、１３８、及び１４１位置から成る群から選択され；及び （ｃ）第３のエピトープ領域に対するエピトープ保護位置が、サブチリシンＢ
   ＰＮ’の２２、２３、２４、１４３、１４６、１５５、１７３、１８９、１９７
   、２０３、２０４、２５３、２５４、２６５、及び２７５位置から成る群から選
   択されるプロテアーゼ抱合体。
7. 【請求項７】 Ｒ₁及びＲ₂がそれぞれ不在である請求項６に記載のプロテア
   ーゼ抱合体。
8. 【請求項８】 Ｒ₁が、サブチリシンＢＰＮ’、サブチリシンカールスバー
   グ、サブチリシンＤＹ、サブチリシン３０９、プロテイナーゼＫ、サーミターゼ
   、プロテアーゼＡ、プロテアーゼＢ、プロテアーゼＣ、及びプロテアーゼＤ、及
   びその変異型から成る群から選択される第１のポリペプチドである請求項６に記
   載のプロテアーゼ抱合体。
9. 【請求項９】 第１のポリペプチドが、サブチリシンＢＰＮ’の１、２、３
   、４、５、６、７、９、１０、１２、１７、２２、２３、２４、２５、２６、２
   ７、３６、４０、４１、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、５０、５
   １、５２、５３、５４、６２、６３、６７、８６、８７、８９、９１、９９、１
   ００、１０１、１０２、１２７、１２８、１２９、１３０、１３１、１３２、１
   ３３、１３４、１３６、１３７、１３８、１４０、１４１、１４３、１４４、１
   ４５、１４６、１５４、１５５、１５６、１５７、１７２、１７３、１８７、１
   ８９、１９５、１９７、２０３、２０４、２０６、２０９、２１０、２１２、２
   １３、２１４、２１５、２１６、２５３、２５４、２５６、２６５、２６７、２
   ６９、２７１、２７２、及び２７５位置から成る群から選択される第１のポリペ
   プチドの位置で連結部分又はプロテアーゼ部分に共有結合する請求項８に記載の
   プロテアーゼ抱合体。
10. 【請求項１０】 Ｘが不在であり、プロテアーゼ部分と第１のポリペプチド
    が、ジスルフィド結合を介して共有結合する請求項９に記載のプロテアーゼ抱合
    体。
11. 【請求項１１】 Ｒ₂が不在であり、且つ第１のポリマーがポリエチレング
    リコールである請求項６に記載のプロテアーゼ抱合体。
12. 【請求項１２】 少なくとも１つの付加部分が、第１のエピトープ領域、第
    ２のエピトープ領域、及び第３のエピトープ領域から成る群から選択されるエピ
    トープ領域に対するエピトープ保護位置に共有結合する請求項１１に記載のプロ
    テアーゼ抱合体。
13. 【請求項１３】 請求項１に記載のプロテアーゼ抱合体及び洗浄用組成物用
    キャリアを含む洗浄用組成物。
14. 【請求項１４】 請求項１に記載のプロテアーゼ抱合体及びパーソナルケア
    組成物用キャリアを含むパーソナルケア組成物。