CN104105492A - 具有抗炎活性的发酵鹿茸提取物的制备方法、由此得到的提取物及该提取物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种具有抗炎活性的发酵鹿茸提取物的制备方法及该提取物的用途，尤其涉及一种包括下列步骤的由鹿茸制造鹿茸发酵提取物的方法、由此得到的提取物及如此得到的提取物的用途：步骤1.在细切的鹿茸添加精制水并进行热水提取及过滤；步骤2.在步骤1中得到的液相成分上添加芽孢杆菌菌株培养液并予以发酵而得到第一发酵提取液；及步骤3.在步骤1中得到的鹿茸渣滓上添加精制水后，添加曲霉菌株培养液并予以发酵而得到第二发酵提取液。本发明利用最接近大自然的发酵方法提取鹿茸，能够减少鹿茸的生理活性物质的破坏、增加有效成分的含量、提高生产性，因此该方法可以有效地作为各种领域中所使用的鹿茸提取物制备方法。尤其是，由于本发明系统性地阐释了抗炎活性而非常适合广泛地应用在食品、化妆品等处。

Description

具有抗炎活性的发酵鹿茸提取物的制备方法、由此得到的提取物及该提取物的用途

技术领域

本发明涉及一种鹿茸提取物的制造方法、由此得到的提取物及该提取物的用途，尤其是，一种利用发酵提取制造鹿茸提取物的制造方法、由此得到的提取物及该提取物的用途。

背景技术

鹿茸(Cervi Parvum Corun)指的是一般鹿角，其具体指称雄鹿的下述角，该角开始生长不到2个月并且没有进行角质化而用手触摸时能稍微感到柔软，组织柔软并且均匀地分布有毛。柔软的角到了秋天会角质化而变硬，这是为了在发情期为占有雌鹿而战斗时使用，经过角质化的角则成为效用低于鹿茸的鹿角。该鹿角错过收获时期而进行钙化后由于硬化而自然掉落的则称为落角。

根据东医宝鉴等文献的记载，鹿茸具有强壮作用、补血作用、强精作用、镇痛作用、造血作用、生长发育促进作用、心功能不全的治疗作用及机能亢进作用等功效，此外，还具有恢复疲劳,增强身体活力及加强肾脏利尿功能等众多效能。

传统中医药所使用的鹿茸服用方法主要包括下列两种：把鹿茸与各类草药剂混合并加以粉碎后，以水为溶剂进行加热提取并服用其滤液的方法；把草药剂加以粉碎制成粉末后，以丸剂方式服用的方法。上述两种方法各有其优缺点，提取后服用的方法虽然较易吸收鹿茸的有效成分，却会浪费掉提取渣滓中所含有的有效成分。提取鹿茸后浓缩使用时，固形粉含量达到20％以上时会出现凝胶化问题而难以应用到产品。丸剂型虽然具有能够摄取鹿茸本身的优点，但很难在体内完全吸收有效成分。

韩国公开专利第10-2003-0073134号揭示的鹿茸提取方法在细切的鹿茸上添加水并加热减压提取后，把滤液加以浓缩、喷雾干燥后予以粉末化，该方法针对传统中医药所使用的热水提取法进行了局部改善并且为了服用便利而将提取液粉末化，却没有解决现有问题，亦即，无法利用提取渣滓中所含大量有效成分而予以废弃。韩国公开专利第10-2005-0090041号揭示的鹿茸提取方法则将鹿茸或鹿角粉碎后进行温水提取、蛋白分解酶处理及盐酸分解处理，该方法为了克服温水提取法的界限而另外进行处理及盐酸分解处理，但其工序包含很多步骤而繁复耗时，由于使用强酸而破坏了对人体有益的生理活性物质。而且，如此得到的现有鹿茸提取物大部分具有令人不快的味道与颜色而较难应用到食品或化妆品，只有很少一部分能够作为原料使用。

解决的技术课题

为了解决现有鹿茸提取方法的问题，本发明的目的是提供一种鹿茸发酵提取物的制造方法，本发明为了避免破坏鹿茸固有的生理活性物质而在低温仅仅使用发酵方法2次却能顺畅地提取，从而得以在短时间内充分地分解而制成有效成分含量高的鹿茸发酵提取物。

而且，本发明的另一个目的是提供一种凭借本发明的制备方法得到的提取物及配合物。

而且，本发明的再一个目的是提供一种功能性健康食品及化妆品，该功能性健康食品及化妆品为了提高如此得到的鹿茸发酵提取物的稳定性而利用分子胶囊化技术设计出对光线、空气、热及酸稳定的剂型而且还能在流通期限内维持抗炎活性。

解决课题的技术方案

为了达到上述目的，本发明提供一种包括下列步骤的由鹿茸制造鹿茸发酵提取物的方法：

步骤1，在细切的鹿茸添加精制水并进行热水提取及过滤；

步骤2，在步骤1中得到的液相成分上添加芽孢杆菌菌株培养液并予以发酵而得到第一发酵提取液；及

步骤3，在步骤1中得到的鹿茸渣滓上添加精制水后，添加曲霉菌株培养液并予以发酵而得到第二发酵提取液。

根据本发明，优选地，还包括下列步骤，在选自上述第一发酵提取液、第二发酵提取液、第一发酵提取液及第二发酵提取液的混合物所构成的群之一个以上添加包合配合物，然后搅拌而予以分子胶囊化。

根据本发明，在上述步骤1中，在细切的鹿茸每100重量份添加200到500重量份的精制水，在80到100℃进行热水提取较佳。

根据本发明，在上述步骤2中，在细切的鹿茸每100重量份添加10到30重量份的芽孢杆菌菌株培养液，在30到40℃的温度发酵2到3天较佳。

根据本发明，芽孢杆菌菌株培养液包含乳酪芽孢杆菌(Bacillus casei)较佳。

根据本发明，在上述步骤3中，在细切的鹿茸每100重量份添加10到30重量份的曲霉菌株培养液，在50到70℃的温度发酵2到3天较佳。

根据本发明，曲霉菌株培养液包含酪曲霉(aspergillus casei)较佳。

根据本发明，在选自第一发酵提取液、第二发酵提取液、第一发酵提取液及第二发酵提取液的混合物所构成的群之一个以上对该混合物每100重量份添加20到30重量份的环糊精(Cyclodextrin)后，在60到70℃搅拌，将其缓缓冷却到常温而实现分子胶囊化较佳。

根据本发明，包合配合物选自环糊精、冠醚、聚氧化烯、prophorine、聚硅氧烷、phophazene及沸石所组成的群较佳。

而且，本发明提供一种配合物，该配合物由对细切鹿茸进行热水提取后得到的液相成分上添加芽孢杆菌菌株培养液并发酵而得到的发酵提取液与包合配合物形成。

而且，本发明提供一种配合物，该配合物由对细切鹿茸进行热水提取后得到的固形鹿茸粉上添加曲霉菌株培养液并发酵而得到的发酵提取液与包合配合物形成。

而且，本发明提供一种配合物，该配合物由对细切鹿茸进行热水提取后得到的液相成分上添加芽孢杆菌菌株培养液并发酵而得到的发酵提取液、对细切鹿茸进行热水提取后得到的固形鹿茸粉上添加曲霉菌株培养液并发酵而得到的发酵提取液的混合物、及包合配合物所形成。

根据本发明，包合配合物选自环糊精、冠醚、聚氧化烯、prophorine、聚硅氧烷、phophazene及沸石所组成的群较佳。

而且，本发明提供通过本发明的制备方法制造的生成物或将本发明的配合物予以高压灭菌而得到的液相型的鹿茸发酵提取物。

而且，本发明提供通过本发明的制备方法制造的生成物或将本发明的配合物予以高压灭菌并冻干后得到的粉末型鹿茸发酵提取物。

而且，本发明提供一种功能性健康食品及功能性化妆品，其把选自通过本发明的制备方法制造的鹿茸发酵提取物、本发明的配合物及液相型及粉末型鹿茸发酵提取物的至少一个作为有效成分而包含。

有益效果

本发明仅仅通过利用芽孢杆菌及曲霉菌株的发酵提取方法就能在短时间内提取足够的鹿茸有效成分，因此能够解决现有热水提取或利用强酸、酶的水解法对生理活性物质的破坏问题，还能凭借分子胶囊化方法实现生理活性物质含量高的鹿茸发酵提取物的高稳定性。

附图说明

图1是示出鹿茸的分子量大小随着发酵时间而变化的照片。

图2是图示了各提取方法的神经节苷脂类热稳定性试验的图形。

图3是图示了各提取方法的神经节苷脂类酸稳定性试验的图形。

图4是图示了LPS同时处理后发酵鹿茸分子胶囊对于在血清生产IL-6所发挥出来的效果的图形。

图5是图示了LPS同时处理后发酵鹿茸分子胶囊对于在血清生产MCP-1所发挥出来的效果的图形。

图6是图示了LPS同时处理后发酵鹿茸分子胶囊对于在血清生产IL-1b所发挥出来的效果的图形。

图7是图示了LPS同时处理后发酵鹿茸分子胶囊对于在血清生产TNF-a所发挥出来的效果的图形。

具体实施方式

本发明的第一形态提供由鹿茸制造鹿茸发酵提取物的方法。尤其是，本发明提供包括下列步骤的由鹿茸制造鹿茸发酵提取物的方法：步骤1，在细切的鹿茸添加精制水并进行热水提取及过滤；步骤2，在步骤1中得到的液相成分上添加芽孢杆菌菌株培养液并予以发酵而得到第一发酵提取液；及步骤3，在步骤1中得到的鹿茸渣滓上添加精制水后，添加曲霉菌株培养液并予以发酵而得到第二发酵提取液。

下面按照各步骤详细说明本发明的鹿茸发酵提取物的制备方法。

热水提取步骤

在步骤1中，在细切的鹿茸添加精制水并进行热水提取及过滤。更具体地说，在被干燥并细切的鹿茸100重量份添加精制水200到500重量份，添加300到40重量份则较佳。在80℃到100℃提取该混合液2到5小时并过滤。精制水的量小于或大于上述所记载的范围时会降低提取效率或导致稀释，从而在后续的发酵步骤中引起经济性问题。

凭此，把得到的生成物区分成液相成分及鹿茸粉。在此，鹿茸粉指的是凭借热水提取得到的物质中液相成分以外的其余固形粉，是含有较多角质而无法溶解在水的固形粉。

第一次发酵提取步骤

步骤2针对上述步骤所得到的液相成分添加芽孢杆菌菌株培养液并发酵而得到第一发酵提取液。尤其是，本步骤在上述步骤所得到的液相成分上对细切的鹿茸每100重量份添加芽孢杆菌菌株培养液10到30重量份，优选地，添加20到25重量份，然后在30℃到40℃，优选地，在35℃到37℃发酵2天到3天。

本发酵提取步骤使用芽孢杆菌菌株培养液，其所含发酵菌株以乳酪芽孢杆菌(Bacillus casei，受托编号KACC91310P)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、纳豆芽孢杆菌(B.natto)、短芽孢杆菌(B.brevis)较适合。

作为一例，本发明的芽孢杆菌菌株培养液是在月示蛋白胨(proteosepeptone)no.3310.0g、牛肉提取物10.0g、酵母提取物5.0g、右旋糖(dextrose)20.0g、吐温801.0g、柠檬酸铵(ammonium Citrate)2.0g、乙酸钠5.0g、硫酸镁0.1g、硫酸锰0.05g、磷酸氢二钾(Dipotassium Phosphate)20g接种干乳酪杆菌(Lactobacillus casei)(KACC91310P)并培养一个晚上后的液体。

在该第一次发酵提取步骤，如果发酵温度小于或大于上述所记载的温度范围则无法进行发酵或者菌株失去活性而无法进行发酵。

经过了第一次发酵提取步骤后，可以进行过滤以清除未反应固形粉。过滤方面，则使用0.1到3μm过滤器过滤1次以上较佳。过滤器的气孔尺寸小于0.1μm时由于过滤器超精密、价格超高(超滤法)而降低了经济性，超过3μm时，则不具备除菌能力而使得真菌或细菌被包含在最终提取物，从而很可能在流通过程中被污染。

凭此，通过本步骤的第一次发酵提取步骤得到第一发酵提取液。

第二次发酵提取步骤

在步骤3中，在上述步骤1中得到的鹿茸渣滓添加精制水后添加曲霉菌株培养液10到30重量份，优选地，添加20到25重量份，在50℃到70℃，优选地，在60℃到65℃发酵2天到3天。鹿茸渣滓的发酵由于角质成分较多而在相对较低的发酵温度条件无法完全发酵，因此在较高温度发酵较适合。

本发酵提取步骤使用曲霉菌株培养液，其所含发酵菌株为酪曲霉(aspergillus casei)、米曲霉(A.oryzae)、黑曲霉(A.niger)、灰绿曲霉(A.glaucus)，其中以黑曲霉(aspergillus niger)较适合。

作为一例，本发明的曲霉菌株培养液可以如下所述地制造：把黑曲霉KK2菌株接种到PDA(potato dextrose agar)斜面培养基并且在28℃培养7天后，添加0.1％Tween80溶液将孢子予以悬浮。把孢子悬液(每1.0mL含3.5×107孢子)10mL接种到含有90mL麦芽提取物(malt extract)的250mL的三角烧瓶后，在28℃的振荡培养器以200rpm进行种菌培养(seed culture)48小时。在121℃、在1.5气压下对含有本培养基47.5Ml的250mL三角烧瓶进行灭菌20分钟，然后进行了种菌。接种2.5mL并且在28℃的振荡培养器以200rpm培养5天。本培养基由2.5％的稻草(rice straw，0.3mm以下的尺寸)、1.25％的麦麸(wheat bran，0.4mm以下的尺寸)、4.5％的玉米浆(corn steepliquor)、0.125％的工业酵母提取液(industrial yeast extract)、0.65％的磷酸二氢钾(potassium phosphate,monobasic)、0.05％的硫酸铜五水化物、0.01％的硫酸钴七水化物构成，以5N氢氧化钠把pH调整成7.0。

经过了第二次发酵提取步骤可以进行过滤以清除未反应固形物质。过滤方面，则使用0.1到3μm过滤器过滤1次以上较佳。过滤器的气孔尺寸小于0.1μm时由于过滤器超精密、价格超高(超滤法)而降低了经济性，超过3μm时则不具备除菌能力而使得真菌或细菌被包含在最终提取物，从而很可能在流通过程中被污染。

分子胶囊化步骤

为了得到本发明的增强了稳定性的鹿茸发酵提取物，本发明的制备方法还包括下列步骤，亦即，在上述第一发酵提取液及/或第二发酵提取液的混合物添加包合配合物，然后搅拌而予以分子胶囊化。尤其是，在上述第一发酵提取液及/或第二发酵提取液的混合液100重量份投入环糊精20到30重量份后并且在60℃到70℃搅拌4小时而把生理活性物质予以分子胶囊化。为了让分子胶囊进一步稳定化而缓缓冷却到常温后制成稳定性高的胶囊。包合配合物以环糊精、冠醚、聚氧化烯、prophorine、聚硅氧烷、phophazene或沸石较佳，环糊精则更佳。凭此，形成了由第一鹿茸发酵提取液及第二鹿茸发酵提取液的混合物与包合配合物所形成的配合物。

如此制造的本发明的提取物或配合物包括了进行高压灭菌后得到的液相及将其冻干的粉末产品。优选地，高压灭菌在121℃进行30分钟。

如此得到的第一发酵提取液及第二发酵提取液混合的鹿茸提取物、及/或将其予以分子胶囊化后得到的配合物、及/或液相型或粉末型鹿茸发酵提取物可以作为有效成分应用于功能性健康食品及化妆品等。

本发明所得到的发酵提取液在低温利用发酵方法2次二提取，不仅不会破坏生理活性物质而且提取液所含鹿茸成分多于利用现有提取方法得到的提取液，而且可以凭籍分子胶囊化提到稳定性而得以设计出对光线、空气、热及酸稳定的剂型，因此可以作为功能性健康食品及化妆品的有效成分使用。

除了本发明鹿茸提取物以外，需要添加的健康食品及化妆品的赋型剂及其它添加剂的种类与量可由本领域的技术人员轻易地选择，本说明书将不对此予以限制。

下面结合具体实施例更详细地说明本发明。但不能利用下述实施例局限本发明的范畴，在本发明所属领域中具有通常知识者可以在本发明的技术思想范畴与权利要求书的均等范围内进行各种变形及修改。

具体实施方式

<实施例1>发酵鹿茸分子胶囊的制备

(1)把干燥并细切的鹿茸10kg添加到精制水35㎏并且在90℃提取4小时后，通过过滤把鹿茸渣滓予以分离后获得滤液。

(2)为了得到第一阶段发酵物，在所获得的滤液添加枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)培养液1kg后在37℃发酵2天。之后，使用1μm过滤器进行过滤而清除了未反应固形粉。

(3)为了得到第二阶段发酵物，把上述(1)项中分离的鹿茸渣滓添加到精制水60kg，在此添加黑曲霉(aspergillus niger)培养液1kg后在60℃发酵2天。之后，使用1μm过滤器进行过滤而清除了未反应固形粉。

(4)把上述发酵及过滤后的第一阶段、第二阶段鹿茸发酵物予以混合，通过琼脂过滤将该混合液过滤。在该滤液添加环糊精25kg并且在60℃搅拌4小时而把生理活性物质予以分子胶囊化。为了让分子胶囊进一步稳定化而缓缓冷却到常温后制成稳定性高的胶囊。

把如此制成的组合物予以冻干并进行粉末化。此时得到的经过冻干的粉末达到了33kg以上。

与此相关地，为了测量所获得的上述上述第一阶段、第二阶段鹿茸发酵物的分子量尺寸而进行了电泳实验。其结果如图1所示。从图1得知，分子量尺寸随着发酵进度而变小，进而变成容易被人体吸收的尺寸。

<比较例1>利用酶制备鹿茸水解物

利用粉碎机粉碎干燥的鹿茸1㎏。在粉碎的鹿茸粉末1㎏添加木瓜蛋白酶(papain)10g及蒸馏水5㎏后，在70℃反应8小时，然后水解鹿茸粉末。把水解后的溶液予以过滤清除未反应固形粉。此时，第一次过滤使用2μm过滤器，第二次过滤使用0.45μm过滤器，第三次过滤则使用0.2μm过滤器。

<比较例2>利用热水提取制备鹿茸提取物

利用粉碎机粉碎干燥的鹿茸1㎏。把粉碎的鹿茸粉末1㎏添加到蒸馏水5L后在100℃提取7小时，然后过滤。此时，第一次过滤使用2μm过滤器，第二次过滤使用0.45μm过滤器，第三次过滤则使用0.2μm过滤器。

<实验例1>生理活性物质的分析

1)氮总量及氨基酸

针对上述实施例1及比较例1、2中最后得到的鹿茸提取物的氮总量进行了分析。结果如下列表1所示。

表1

项目 氨基酸分析结果

实施例1 比较例1 比较例2

氮总量 8.78 0.78 0.15

(氮总量及氨基酸分析)

如上述表1所示，与现有方法得到的鹿茸提取物(比较例1及2)相比，本发明的发酵鹿茸分子胶囊的氮总量与氨基酸含量增加了几倍到几十倍。

2)生理活性物质分析

①蛋白质定量分析

在100ug/ml的标准牛血清白蛋白(BSA)溶液取出20、40、60、80、100ul后混合适当量的蒸馏水(各为780、760、740、720、700ul)及200ul的蛋白质验证染料后制成1ml，在595nm利用UV分光光度计对其测量了吸收度。把试料溶解到蒸馏水并混合蛋白质验证染料制成1ml，在595nm利用UV分光光度计对其测量吸收度并且以对于BSA的含有量计算后决定含量。

②糖羰酸定量分析(Carbazole assay)

把D-葡萄糖醛酸内酯作为标准物使用并且凭借咔唑(carbazole)反应在530nm利用UV分光光度计测量了吸收度。

把试料溶解在蒸馏水并且凭借咔唑反应在530nm利用UV分光光度计测量吸收度，以对于D-葡萄糖醛酸内酯的含有量计算后决定含量。

③葡萄糖胺聚糖(glycosaminoglycan)定量分析(Carbazole assay)

把NZP硫酸软骨素作为标准物使用并且凭借咔唑反应在530nm利用UV分光光度计测量了吸收度。

把试料溶解在蒸馏水并且凭借咔唑反应在530nm利用UV分光光度计测量吸收度，以对于NZP硫酸软骨素的含有量计算后决定含量。

④唾液酸定量分析(Warren assay)

把N-乙酰神经氨酸作为标准物使用并且凭借Warren方法在549nm利用UV分光光度计测量了吸收度。

在80℃以0.1N硫酸水解试料1小时，然后凭借Warren方法在549nm利用UV分光光度计测量吸收度，以对于N-乙酰神经氨酸的含有量计算后决定含量。

⑤利用酶分解硫酸软骨素

把源于普通变形杆菌(Proteus vulgaris)的软骨素酶ABC(chondroitinaseABC)(C2905,Sigma)溶入50mM Tris-HCl60mM乙酸钠缓冲剂(pH8.0)而成为1U/ml。以NZP CS作为标准物使用，把标准物与样品溶解成10mg/ml后与缓冲剂混合，添加酶30mU，在37℃让其反应12小时并分析硫酸软骨素的含有量。

⑥EGF的分析

为了分析EGF，针对鹿茸热水提取物、水解物、发酵提取物进行了人的EGF特异ELISA。为了制作标准曲线而在250pg/ml～0pg/ml浓度区段通过线性回归分析选择具备先线性性的浓度区段，在该区段把3种试料各自适用于试验后进行了吸收度分析。并且凭此分析了基于标准EGF的浓度的试料EGF。

⑦神经节苷脂的定量分析(zig-zag TLC scanner)

把神经节苷脂标准物(Sigma Co.)溶解在甲醇后，通过TLC法展开后利用zig-zag TLC扫描器在波长550nm扫描得到Rf0.39与0.42的最大积分值，凭此制作校正曲线。

之后，按照和标准品方法相同的方法施于各试料并且从Rf0.39与0.42的最大积分值对各试料的神经节苷脂类进行了定量分析。

利用上述分析法针对热水提取、水解、发酵提取分子胶囊进行了生理活性物质的分析并且将其结果列在下述表2。

表2

成分试料 蛋白质唾液酸GAG 糖羰酸硫酸软骨素 EGF(μg/g)神经节苷脂

热水提取 52.2 0.023 5.83 0.245 25.6 0.000245.83

水解 68.4 0.015 2.67 0.171 35.3 - 2.67

发酵鹿茸分子胶囊 75.8 0.032 9.35 0.374 78.6 0.000579.35

(各鹿茸提取物的生理活性物质分析)单位(mg/g)

如上述表2所示，相比于热水提取、水解的鹿茸提取物，通过发酵提取并将其分子胶囊化时含有大量生理活性物质。

<实施例3>神经节苷脂的稳定性试验

针对作为鹿茸的代表性生理活性物质的神经节苷脂进行了热、酸稳定性试验。但，由于上述表2中基于水解的神经节苷脂含量最低而在比较实验中排除在外，在实施例1、比较例2及实施例1中针对以没有进行分子胶囊发酵提取方法制造的鹿茸在80℃保管4星期的温度严酷条件及在pH1保管4星期的酸严酷条件下测量了神经节苷脂的变化量。图2与图3是其结果。

从图2的结果得知，以高温进行热水提取的鹿茸会随着时间经过而大幅减少神经节苷脂含量，提取温度相对较低的发酵则比热水提取具有较高的神经节苷脂含量，但也会减少。然而，分子胶囊化的鹿茸的神经节苷脂含量则即使经过了较长时间其含量依然与初始状态没有多少差异。

从图3的结果得知，以高温进行热水提取的鹿茸在强酸条件下随着时间经过而大幅减少神经节苷脂含量，提取温度相对较低的发酵则比热水提取具有较高的神经节苷脂含量，但也会减少。然而，分子胶囊化的鹿茸的神经节苷脂的含量则即使经过了较长时间其含量依然与初始状态没有多少差异。

<实施例4>发酵鹿茸分子胶囊的抗炎活性试验

1)试料：发酵鹿茸分子胶囊

2)动物

实验动物方面，让采购自大韩实验动物中心的Balb/c系小鼠在实验室环境适应1星期后应用于实验。动物饲育室的条件采取了通常的系统，在22±2℃条件下，在一天中的12小时利用200-300Lux照明，12小时则遮蔽一切光线。为动物供应了足够的固形饲料(粗蛋白质22.1％以上，粗脂肪8.0％以下，粗纤维5.0％以下，粗灰分8.0％以下，钙0.6％以上，磷0.4％以上，三养社，没有添加抗生素)与水。

3)试剂及设备

在本实验所用试剂中，脂多糖类(LPS)使用Sigma(Sigma Co.,USA)产品，生理盐水使用JW制药产品，IL-1β,IL-6,TNF-α,MCP-1ELISA kit使用Millipore公司(USA)产品，其它试剂则使用优级纯。本实验所用设备则使用了离心分离器(Beckman Co.,USA)、滚轮混合器(Gowon scientific technologyCo.,Korea)、涡流混合器(vortex mixer)(Vision scientific Co.,Korea)、Luminex(Millipore,Co.,USA)等。

4)实验方法(in vivo实验)

在源于脂多糖类(LPS)的炎症小鼠模型及细胞因子测量用正常组，每只口服投药盐水200ul，发酵鹿茸分子胶囊剂量组则利用口服用针(oral zonde)按照一天一次的方式对每只小鼠口服投药200mg、100mg/kg共7天。7天后，把脂多糖类(LPS)1㎎/㎏注射到腹腔并且在60分钟后利用乙醚麻醉，以心脏穿刺法采血。采血后分离血清并且以ELISA法测量IL-1β、IL-6、TNF-α、MCP-1的生成量。在各个孔(well)分注小鼠血清100μl(稀释1/100)后，处理抗体-蛋白生物素(Biotin)结合(conjugate)的100μl，在室温放置2小时后，利用清洗缓冲溶液清洗2次后处理抗体抗生物素蛋白-HRP结合(conjugate)的100μl，在室温放置2小时后重新清洗。在这里各自分注TMB底物100μl并且放置于母牛30分钟，然后处理100μl的stop溶液后利用ELISA判读器在450nm测量吸收度(absorbance)。.

5)统计处理

通过各种实验得到的结果则以平均±标准偏差予以记录，显著性验证则利用学生检验(Student'st-test)分析方法决定。

6)结果

6-1)IL-6

在7天内为BALB/c小鼠投入发酵鹿茸分子胶囊，然后从源于LPS的急性炎症模型分离血清后测量IL-6的结果为，正常组为123.2±35.7(pg/ml)，对照组为544.6±37.1(pg/ml)，发酵鹿茸分子胶囊100剂量组为301.6±56.7(pg/ml)，发酵鹿茸分子胶囊200剂量组为212.2±9.8(pg/ml)，对照组相比于正常组显著地增加，在发酵鹿茸分子胶囊剂量组则相比于对照组呈浓度依赖性地显著(**p<0.01，***p<0.001)减少。图4是其结果。

6-2)MCP-1

在7天内为BALB/c小鼠投入发酵鹿茸分子胶囊，然后从源于LPS的急性炎症模型分离血清后测量MCP-1的结果为，正常组为124.1±25.2(pg/ml)，对照组为418.2±88.1(pg/ml)，发酵鹿茸分子胶囊100剂量组为214.8±31.1(pg/ml)，发酵鹿茸分子胶囊200剂量组为198.2±22.6(pg/ml)，对照组相比于正常组显著地增加，在发酵鹿茸分子胶囊剂量组则相比于对照组呈浓度依赖性地显著(*p<0.05，**p<0.01)减少。图5是其结果。

6-3)IL-1b

在7天内为BALB/c小鼠投入发酵鹿茸分子胶囊，然后从源于LPS的急性炎症模型分离血清后测量IL-1b的结果为，正常组为25.6±5.6(pg/ml)，对照组为116.8±8.6(pg/ml)，发酵鹿茸分子胶囊100剂量组为61.2±11.1(pg/ml)，发酵鹿茸分子胶囊200剂量组为51.6±9.2(pg/ml)，对照组相比于正常组显著地增加，在发酵鹿茸分子胶囊剂量组则相比于对照组呈浓度依赖性地显著(**p<0.01，***p<0.001)减少。图6是其结果。

6-4)TNF-a

在7天内为BALB/c小鼠投入发酵鹿茸提取粉末，然后从源于LPS的急性炎症模型分离血清后测量TNF-a的结果为，正常组为131.4±36.0(pg/ml)，对照组为397.0±91.1(pg/ml)，发酵鹿茸分子胶囊100剂量组为311.4±54.5(pg/ml)，发酵鹿茸分子胶囊200剂量组为143.2±32.5(pg/ml)，对照组相比于正常组显著地增加，在发酵鹿茸分子胶囊剂量组则相比于对照组呈浓度依赖性地显著***p<0.001)减少。图7是其结果。

产业上的用途

本发明利用最接近大自然的发酵方法提取鹿茸，能够减少鹿茸的生理活性物质的破坏、增加有效成分的含量、提高生产性，因此该方法可以有效地作为各种领域中所使用的鹿茸提取物制备方法。尤其是，由于本发明系统性地阐释了抗炎活性而非常适合广泛地应用在食品、化妆品等用途。

Claims (17)

1.一种由鹿茸制造鹿茸发酵提取物的方法，其包括下列步骤：

步骤1，在细切的鹿茸添加精制水并进行热水提取及过滤；

步骤2，步骤1中得到的液相成分，对细切的鹿茸每100重量份添加10到30重量份的芽孢杆菌菌株培养液，在30到40℃发酵2到3天后得到第一发酵提取液；及

步骤3，在步骤1中得到的鹿茸渣滓上添加精制水后，对细切的鹿茸每100重量份添加10到30重量份的曲霉菌株培养液，在50到70℃发酵2到3天后得到第二发酵提取液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

还包括下列步骤，在选自上述第一发酵提取液、第二发酵提取液、第一发酵提取液及第二发酵提取液的混合物所构成的群之一个以上添加包合配合物，然后搅拌而予以分子胶囊化。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，

在上述步骤1中，在细切的鹿茸每100重量份添加200到500重量份的精制水，在80到100℃进行热水提取。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

芽孢杆菌菌株培养液包含乳酪芽孢杆菌(Bacillus casei)。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，

曲霉菌株培养液包含酪曲霉(aspergilluscasei)。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，

在选自第一发酵提取液、第二发酵提取液、第一发酵提取液及第二发酵提取液的混合物所构成的群之一个以上，对该混合物每100重量份添加20到30重量份的包合配合物后，在60到70℃搅拌，将其缓缓冷却到常温而实现分子胶囊化。

7.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，包合配合物选自环糊精、冠醚、聚氧化烯、prophorine、聚硅氧烷、phophazene及沸石所组成的群。

8.一种配合物，其特征在于，

由对细切鹿茸进行热水提取后得到的液相成分上添加芽孢杆菌菌株培养液并发酵而得到的发酵提取液与包合配合物形成。

9.一种配合物，其特征在于，

由对细切鹿茸进行热水提取后得到的固形鹿茸粉上添加曲霉菌株培养液并发酵而得到的发酵提取液与包合配合物形成。

10.一种配合物，其特征在于，

由对细切鹿茸进行热水提取后得到的液相成分上添加芽孢杆菌菌株培养液并发酵而得到的发酵提取液、对细切鹿茸进行热水提取后得到的固形鹿茸粉上添加曲霉菌株培养液并发酵而得到的发酵提取液的混合物、及包合配合物所形成。

11.根据权利要求8到权利要求10之任何一项所述的配合物，其特征在于，

包合配合物选自环糊精、冠醚、聚氧化烯、prophorine、聚硅氧烷、phophazene及沸石所组成的群。

12.一种鹿茸发酵提取物，其特征在于，

其为由权利要求2得到的生成物或将权利要求10到权利要求12中任一项所述的配合物予以高压灭菌后得到的液相型的鹿茸发酵提取物。

13.一种鹿茸发酵提取物，其特征在于，

其为由权利要求2得到的生成物或将权利要求10到权利要求12中任一项所述的配合物予以高压灭菌并将其冻干而得到的粉末型鹿茸发酵提取物。

14.根据权利要求8或权利要求10之任何一项所述的配合物，其特征在于，

上述芽孢杆菌菌株培养液所含发酵菌株是选自乳酪芽孢杆菌(Bacilluscasei，受托编号KACC91310P )、枯草芽孢杆菌(B. subtilis)、纳豆芽孢杆菌(B. natto)、短芽孢杆菌(B. brevis)中的某一个。

15.根据权利要求9或权利要求10之任何一项所述的配合物，其特征在于，

上述曲霉菌株培养液所含发酵菌株是选自酪曲霉(aspergilluscasei)、米曲霉(A. oryzae)、黑曲霉(A. niger)、灰绿曲霉(A. glaucus)，尤其是黑曲霉(aspergillusniger)中的某一个。

16.一种功能性健康食品，其特征在于，

把选自

权利要求1或权利要求2所制造的鹿茸发酵提取物、

权利要求8到权利要求10之任一项的配合物、

通过权利要求2得到的生成物、或将权利要求10到权利要求12之任一项的配合物予以高压灭菌而得到的液相型鹿茸发酵提取物、及

通过权利要求2得到的生成物、或将权利要求10到权利要求12之任一项的配合物予以高压灭菌并予以冻干后得到的粉末型鹿茸发酵提取物的一个以上作为有效成分而包含。

17.一种功能性化妆品，其特征在于，

把选自

权利要求1或权利要求2所制造的鹿茸发酵提取物、

权利要求8到权利要求10之任一项的配合物、及

通过权利要求2得到的生成物、或将权利要求10到权利要求12之任一项的配合物予以高压灭菌并予以冻干后得到的粉末型鹿茸发酵提取物的一个以上作为有效成分而包含。