KR102441355B1 - 강글리오사이드 함량이 증대된 녹용 추출물의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 강글리오사이드 함량이 증대된 녹용 추출물의 제조방법에 대한 것이다.
본 발명의 제조방법에 따르면, 강글리오사이드 함량이 현저히 증대된 녹용 추출물을 얻을 수 있다. 상기 강글리오사이드 함량이 증대된 녹용 추출물은 다양한 건강기능식품의 제조에 유용하게 이용될 수 있다.
본 발명의 제조방법에 따르면, 강글리오사이드 함량이 현저히 증대된 녹용 추출물을 얻을 수 있다. 상기 강글리오사이드 함량이 증대된 녹용 추출물은 다양한 건강기능식품의 제조에 유용하게 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 강글리오사이드 함량이 증대된 녹용 추출물의 제조방법에 대한 것이다.
녹용(Cornu cervi pantotrichum, antler)은 사슴과에 속하는 매화록, 마록 및 동속 근연 동물의 털이 밀생되고 골질화되지 않은 어린 뿔로 매년 재생되는 연골조직을 말하며, 각질화되지 않은 것은 녹용이고, 각질화된 것은 녹각이라 하는데, 우리나라를 비롯한 중국 및 일본 등의 동양권 국가들에서는 녹용을 오래전부터 최고의 보혈 강장제로 널리 사용해 왔으며, 그 성상과 효능에 관해서는 본초강목과 동의보감 등의 문헌에 수록되어 있다.
녹용은 그 효능이 우수함에도 불구하고 가격이 비싸기 때문에 적용에 한계가 있고, 녹용에 함유되어 있는 유효성분의 분리 또는 추출이 용이하지 못하여 실제로 인체로 흡수가 잘 이루어지지 않는 문제점이 있다.
녹용 내에는 유효성분으로서 시알산, 헥소스(hexose), 펜토스(pentose), 헥소사민(hexosamine) 및 유로닉산(uronic acid)과 유리 아미노산 및 무기질과 동물조직에 널리 분포되어 있는 특수 지방산의 일종인 프로스타글란딘류와 당지질의 일종인 강글리오사이드(ganglioside)가 존재하는 것으로 보고된 바 있다.
상기 강글리오시드(ganglioside)는 글리코스핑고당지질(glycosphingolipid)의 하나로서 친수성인 당부분과 소수성인 세라마이드(ceramide)로 구성되어 있는 양쪽성 물질로서, 한 개 이상의 시알산(N-acetylneuraminic acid: sialic acid)을 가지고 있는 당지질로서 중추신경 조직 내에 존재하고 있으며 신경 기능과 세포막의 여러 가지 기능에 관여한다. 또한, 암세포를 정상세포로 환원하는 기능과 면역력 향상, 집중력 강화, 기억력 향상, 관절염 개선 등에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
또한, 상기 시알산은 뉴라민산(neuraminic acid)의 아실 유도체의 총칭으로 현재 동물계에 20여 종 이상이 알려져 있으며, 바이러스에 대한 리셉터 작용, 독소의 중화, 세포와 분자의 면역학적 인식 부위, 세포접착 또는 암의 전이 등 중요한 생리작기능에 관여하고 있는 산성당으로 보고되어 있다. 대사과정에서 일시적으로 유리형으로 존재할 뿐, 대부분 당쇄의 비환원 말단에 글리코시드로 결합되어 올리고당의 형태로 존재한다.
본 발명자들은 유효성분, 특히 강글리오사이드의 함량이 높은 녹용 추출물을 얻을 수 있는 방법을 연구하던 중, 녹용을 저농도의 알코올 수용액에 침지 및 건조시키는 전처리를 한 후 추출한 추출물과 상기 추출물의 잔사를 발효시킨 발효물을 혼합하는 경우 강글리오사이드 함량이 현저히 증대된 녹용 추출물을 얻을 수 있음을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 해결하고자 하는 과제는 강글리오사이드 함량이 증대된 녹용 추출물의 제조방법을 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명은 (1) 녹용을 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 수용액에 침지시키는 단계; (2) 상기 침지시킨 녹용을 건조하는 단계; (3) 상기 건조된 녹용을 분쇄하여 녹용 분말을 제조하는 단계; (4) 상기 녹용 분말을 열수 추출하여 녹용 열수 추출물을 제조하는 단계; (5) 상기 녹용을 열수 추출하고 남은 잔사에 물을 첨가하여 현탁시킨 현탁액에 유산균 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 중에서 선택되는 1종 이상의 발효균을 첨가한 후 발효시켜 녹용 발효물을 제조하는 단계; 및 (6) 상기 (4) 단계에서 제조한 녹용 열수 추출물 및 (5) 단계에서 제조한 녹용 발효물을 혼합하는 단계;를 포함하는 강글리오사이드 함량이 증대된 녹용 추출물의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 (1) 단계의 상기 저급 알코올 수용액은 20 내지 50 부피%의 메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 부탄올 수용액일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 (1) 단계의 침지는 실온에서 20 내지 50분 동안 수행되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 (2) 단계의 건조는, ⅰ) 상기 녹용을 실온에서 4 내지 6 시간 동안 1차 건조하는 단계; 및 ⅱ) 1차 건조된 녹용을 수분 함량 2 내지 10 중량%가 되도록 동결건조하는 2차 건조 단계;를 포함하는 방법으로 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 (1) 단계 및 (2) 단계를 2회 내지 5회 반복하여 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 (4) 단계의 열수 추출은 상기 녹용 분말에 5 내지 15배 부피의 물을 첨가하고, 90 내지 120 ℃에서 5 내지 20 시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 (5) 단계의 유산균은 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 파라플란타룸(Lactobacillus paraplantarum) 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 (5) 단계의 발효균은 락토바실러스 파라플란타룸 SST-9961(기탁번호: KCCM 12711P) 및 바실러스 서브틸리스 SST-9960(기탁번호: KCCM 11402P)일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 발효균은 락토바실러스 파라플란타룸 SST-9961(기탁번호: KCCM 12711P) : 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) SST-9960(기탁번호: KCCM 11402P)가 1 : 2-5의 중량비로 혼합되는 것일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 (5) 단계의 발효는 25 내지 35 ℃에서 48 내지 96 시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 상기 (6) 단계의 녹용 열수 추출물 : 녹용 발효물이 1 : 0.1-10의 중량비로 혼합되는 것일 수 있다.
본 발명의 제조방법에 따르면, 강글리오사이드 함량이 현저히 증대된 녹용 추출물을 얻을 수 있다. 상기 강글리오사이드 함량이 증대된 녹용 추출물은 다양한 건강기능식품의 제조에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 녹용 추출물의 제조방법을 간단히 나타내는 순서도이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 녹용 추출물의 제조방법은 (1) 녹용을 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 수용액에 침지시키는 단계; (2) 상기 침지시킨 녹용을 건조하는 단계; (3) 상기 건조된 녹용을 분쇄하여 녹용 분말을 제조하는 단계; (4) 상기 녹용 분말을 열수 추출하여 녹용 열수 추출물을 제조하는 단계; (5) 상기 녹용을 열수 추출하고 남은 잔사에 물을 첨가하여 현탁시킨 현탁액에 유산균 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 중에서 선택되는 1종 이상의 발효균을 첨가한 후 발효시켜 녹용 발효물을 제조하는 단계; 및 (6) 상기 (4) 단계에서 제조한 녹용 열수 추출물 및 (5) 단계에서 제조한 녹용 발효물을 혼합하는 단계;를 포함한다.
먼저, 녹용을 준비한다.
상기 녹용은 생녹용을 준비하거나, 사슴으로부터 채취한 후 각질화되기 전에 급속냉동시킨 녹용을 해동하여 준비하는 것이 바람직하다.
이후, 상기 녹용은 (a) 녹용의 털을 제거하는 거모 단계; (b) 상기 거모된 녹용을 살균 처리하는 단계; (c) 상기 살균 처리한 녹용을 절편하는 단계;를 포함하는 방법으로 준비될 수 있다.
구체적으로, 상기 녹용을 토치를 이용하여 약한 불로 태워 잔털을 제거한 후 와이어 수세미를 이용하여 잔여물을 제거하는 거모 단계를 진행할 수 있다.
또한, 상기 거모된 녹용은 살균 처리를 한다. 상기 살균 처리 방법은 통상적으로 이용되는 방법을 이용하면 되고 특별히 한정되지는 않는다. 구체적인 예로는, 상기 거모된 녹용을 85 내지 95 부피%의 에탄올 수용액에 2 내지 10분 동안 침지시켜 살균 처리하는 것일 수 있다.
이후, 상기 살균 처리한 녹용은 1 내지 10 mm, 바람직하게는 1 내지 5 mm, 더욱 바람직하게는 1 내지 3 mm 두께로 절편할 수 있다.
상기 (1) 단계에서는 녹용을 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 수용액에 침지시킨다.
상기 저급 알코올 수용액은 25 내지 45 부피%, 바람직하게는 30 내지 40 부피%, 더욱 바람직하게는 34 내지 36 부피%의 메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 부탄올 수용액일 수 있다. 상기 저급 알코올 수용액은 30 내지 40 부피%의 에탄올 수용액인 것이 강글리오사이드 함량 증대에 더욱 바람직하게 작용한다.
만약 상기 알코올 수용액의 농도가 상기 하한치 미만인 경우에는 강글리오사이드 함량 증대 효과가 미미해지고, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 녹용으로부터 유효성분이 추출되므로 강글리오사이드 함량 증대 효과가 감소할 수 있다.
상기 침지는 실온에서 20 내지 50분, 바람직하게는 20 내지 40분, 더욱 바람직하게는 20 내지 30분 동안 수행될 수 있다.
상기 침지 시간이 상기 하한치 미만인 경우에는 강글리오사이드 함량 증대 효과가 미미해지고, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 녹용으로부터 유효성분이 추출되므로 강글리오사이드 함량 증대 효과가 감소할 수 있다.
상기 (2) 단계에서는 상기 침지시킨 녹용을 건조한다.
상기 건조는, ⅰ) 상기 녹용을 실온에서 4 내지 6 시간 동안 1차 건조하는 단계; 및 ⅱ) 1차 건조된 녹용을 수분 함량 2 내지 10 중량%가 되도록 동결건조하는 2차 건조 단계;를 포함하는 방법으로 수행될 수 있다.
상기와 같이 2 단계에 걸쳐서 녹용을 건조시키는 경우, ⅰ) 단계에서 녹용 표면 및/또는 녹용에 스며든 알코올 수용액을 충분히 증발시킨 후, ⅱ) 단계에서 녹용을 충분히 건조시킬 수 있게 된다.
상기 건조를 상기 ⅰ) 단계만 수행하는 경우에는 녹용이 충분히 건조시킬 수 없게 되고, 상기 ⅱ) 단계만 수행하는 경우에는 녹용 표면 및/또는 녹용에 스며든 알코올 수용액이 남아 있는 상태에서 동결건조하게 되므로 경제성 및 생산성이 낮아진다.
이후, 상기 (1) 단계 및 (2) 단계를 2회 내지 5회, 바람직하게는 2회 내지 4회 반복하여 수행할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 (1) 단계 및 (2) 단계는 적어도 2회 이상 반복하여 수행하는 것이 강글리오사이드 함량을 더욱 증대시킬 뿐만 아니라 녹용 특유의 쓴맛과 이취를 저감시킬 수 있어 바람직하다.
상기 (3) 단계에서는 상기 건조된 녹용을 분쇄하여 녹용 분말을 제조한다.
상기 녹용 분말은 10 내지 300 메쉬, 바람직하게는 10 내지 100 메쉬 크기일 수 있다.
상기 (4) 단계에서는 상기 녹용 분말을 열수 추출한다.
상기 열수 추출은 상기 녹용 분말에 5 내지 15배 부피, 바람직하게는 8 내지 12배 부피의 물을 첨가하고, 90 내지 120 ℃, 바람직하게는 100 내지 110 ℃에서 5 내지 20 시간, 바람직하게는 5 내지 15 시간, 더욱 바람직하게는 8 내지 12 시간 동안 수행하는 것일 수 있다.
상기 (5) 단계에서는 상기 녹용을 열수 추출하고 남은 잔사에 물을 첨가하여 현탁시킨 현탁액에 유산균 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 중에서 선택되는 1종 이상의 발효균을 첨가한 후 발효시켜 녹용 발효물을 제조한다.
상기 현탁액은 (4) 단계에서 녹용을 열수 추출하고 남은 잔사에 0.5 내지 5 부피배, 바람직하게는 0.5 내지 3 부피배, 더욱 바람직하게는 0.5 내지 2 부피배의 물, 및 0.5 내지 1.5 %(v/v)의 포도당을 첨가하여 제조할 수 있다.
상기 유산균은 특별히 한정되지는 않으나 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 파라플란타룸(Lactobacillus paraplantarum) 중에서 선택되는 1종 이상인 것이 강글리오사이드 함량 증대 측면에서 바람직하다.
상기 발효균은 유산균 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 중에서 선택되는 1종 이상일 수 있고, 바람직하게는 유산균 및 바실러스 서브틸리스 혼합 균주일 수 있고, 더욱 바람직하게는 락토바실러스 파라플란타룸 SST-9961(기탁번호: KCCM 12711P) 및 바실러스 서브틸리스 SST-9960(기탁번호: KCCM 11402P)혼합균주일 수 있다. 상기 유산균과 바실러스 서브틸리스를 혼합하여 사용하는 경우 강글리오사이드 뿐만 아니라 시알산 함량이 증대될 수 있다.
특히, 락토바실러스 파라플란타룸 SST-9961(기탁번호: KCCM 12711P) : 바실러스 서브틸리스 SST-9960(기탁번호: KCCM 11402P)를 1 : 2-5의 중량비, 바람직하게는 1 : 2.5-3.5의 중량비로 혼합하여 사용하는 경우 상기 강글리오사이드 함량 및 시알산 함량이 더욱 증대된 녹용 추출물을 수득할 수 있게 된다.
상기 락토바실러스 파라플란타룸 SST-9961 균주 및 바실러스 서브틸리스 SST-9960 균주의 중량비가 상기 범위를 벗어나는 경우에는 상기 균주들로 혼합 발효시킴으로 인한 상승효과가 미미해지고 강글리오사이드 및 시알산 함량이 기대치에 미치지 못할 수 있다.
상기 발효균은 균주 자체로 첨가되거나 배양액으로 첨가될 수 있다. 상기 배양액은 균주를 액체 배지에서 배양한 배양액 자체, 상기 배양액을 농축한 농축액 등을 포함할 수 있다.
일 구체예에서, 상기 현탁액에 상기 발효균이 1×107 내지 9×109 CFU/mL의 농도, 바람직하게는 1×107 내지 9×108 CFU/mL, 더욱 바람직하게는 5×107 내지 5×108 CFU/mL의 농도로 함유된 배양액을 0.5 내지 3.0 %(v/v), 바람직하게는 0.5 내지 2.0 %(v/v), 더욱 바람직하게는 0.5 내지 1.5 %(v/v) 농도로 접종하는 것일 수 있다.
상기 균주의 첨가량이 상기 하한치 미만인 경우에는 상기 균주를 이용하더라도 발효 속도가 지연될 수 있고, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 이상 발효가 진행될 수 있고 경제적 효용성이 떨어진다.
또한, 상기 발효는 25 내지 35 ℃, 바람직하게는 28 내지 32 ℃에서 48 내지 96 시간, 바람직하게는 60 내지 84 시간, 더욱 바람직하게는 65 내지 80 시간 동안 수행될 수 있다.
상기 발효 온도가 상기 하한치 미만인 경우에는 발효 기간이 길어져 잡균 오염을 초래할 수 있고, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 균주의 생육이 정지될 수 있다. 또한, 상기 발효 시간이 상기 하한치 미만인 경우에는 발효가 충분하지 않아 강글리오사이드 전환율이 저조할 수 있으며, 상기 상한치를 초과하는 경우에는 발효에 의해 생성된 강글리오사이드가 분해되기 시작하여 오히려 함량이 감소할 수 있다.
상기 (6) 단계에서는 상기 (4) 단계에서 제조한 녹용 열수 추출물, 및 (5) 단계에서 제조한 녹용 발효물을 혼합하여 본 발명의 녹용 추출물을 제조한다.
상기 녹용 열수 추출물 : 녹용 발효물이 1 : 0.1-10의 중량비, 바람직하게는 1 : 1 내지 10의 중량비, 더욱 바람직하게는 1 : 2 내지 8 중량비, 더욱 바람직하게는 1 : 3 내지 5의 중량비로 혼합될 수 있다.
상기 녹용 열수 추출물에 대한 녹용 발효물의 중랑비가 상기 범위를 벗어나는 경우에는 상기 녹용 열수 추출물 및 녹용 발효물을 혼합함으로 인한 상승효과가 미미해지고 녹용 추출물에 함유된 강글리오사이드 함량이 기대치에 미치지 못할 수 있다.
상기한 방법으로 제조된 본 발명의 녹용 추출물은 강글리오사이드 함량이 증대된 것이다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명의 녹용 추출물의 강글리오사이드 함량은 10.0 ~ 25.0 mg/g, 바람직하게는 12.0 ~ 25.0 mg/g, 더욱 바람직하게는 15.0 ~ 25.0 mg/g, 더욱 바람직하게는 18.0 ~ 25.0 mg/g, 더욱 바람직하게는 18.0 ~ 20.0 mg/g일 수 있다.
일 실시예에 의하면, 본 발명의 녹용 추출물의 시알산 함량 증가율은 녹용 열수 추출물 대비 120%, 바람직하게는 140%, 더욱 바람직하게는 180%, 더욱 바람직하게는 200%, 더욱 바람직하게는 220%, 더욱 바람직하게는 240% 이상 증가할 수 있다. 구체적으로는, 본 발명의 녹용 추출물의 강글리오사이드 함량은 녹용 열수 추출물에 비하여 120 내지 300%, 바람직하게는 140 내지 300%, 더욱 바람직하게는 180 내지 300%, 더욱 바람직하게는 200 내지 300%, 더욱 바람직하게는 220 내지 300%, 더욱 바람직하게는 240 내지 300% 증가할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에 의하면, 본 발명의 녹용 추출물의 시알산 함량은 0.025 ~ 0.060 mg/g, 바람직하게는 0.030 ~ 0.060 mg/g, 더욱 바람직하게는 0.032 ~ 0.060 mg/g, 더욱 바람직하게는 0.035 ~ 0.060 mg/g, 더욱 바람직하게는 0.040 ~ 0.060 mg/g, 더욱 바람직하게는 0.045 ~ 0.060 mg/g, 더욱 바람직하게는 0.045 ~ 0.050 mg/g일 수 있다.
일 실시예에 의하면, 본 발명의 녹용 추출물의 시알산 함량 증가율은 녹용 열수 추출물 대비 30%, 35%, 50%, 또는 100% 이상일 수 있다. 구체적으로는, 본 발명의 녹용 추출물의 시알산 함량은 녹용 열수 추출물에 비하여 30 내지 150%, 바람직하게는 40 내지 150%, 더욱 바람직하게는 50 내지 150%, 더욱 바람직하게는 100 내지 150%, 더욱 바람직하게는 100 내지 130% 증가할 수 있다.
상기 녹용 추출물은 농축액 또는 건조 분말 상태로 제조될 수도 있다.
구체적으로는 상기 녹용 추출물은 60 내지 70 brix로 농축하여 이용할 수 있다. 또는, 상기의 녹용 추출물은 진공건조, 동결건조 또는 분무건조 등과 같은 추가적인 과정을 거친 분말 상태로 제조될 수도 있다.
본 발명의 녹용 추출물은 강글리오사이드 함량이 증가되어 면역기능을 증강시키는 등의 건강기능 증진 효과가 우수하다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시하나, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범주 및 기술사상 범위 내에서 다양한 변경 및 수정이 가능함은 당업자에게 있어서 명백한 것이며, 이러한 변형 및 수정이 첨부된 특허청구범위에 속하는 것도 당연한 것이다.
<실시예>
실시예 1: 바실러스 서브틸리스 SST-9960 + 락토바실러스 파라플란타룸 SST-9962
(전처리) 먼저, 녹용을 채취한 후 토치를 이용하여 약한 불로 잔털을 태워서 거모한 후 와이어 수세미로 문질러 잔여물을 제거하였다.
이후, 상기 녹용을 95 부피%의 주정에 10분 동안 침지시켜 살균 처리하였다.
그리고, 상기 녹용을 2 mm 두께로 절편하여 녹용을 준비하였다.
(1) 상기 준비된 녹용을 35 부피%의 에탄올 수용액에 25분 동안 침지시켰다.
(2) 그리고, 상기 침지시킨 녹용을 상대습도 50%의 실온에서 5시간 동안 1차 건조시킨 후, 수분함량 5 중량%가 되도록 동결건조하였다.
이후, 상기 (1) 침지 단계 및 (2) 건조 단계를 2회 더 반복하여 수행하였다.
(3) 상기 건조된 녹용을 분쇄하여 16 메쉬 크기의 분말로 제조하였다.
(4) 상기 녹용 분말에 10배 부피의 물을 첨가하고 110 ℃에서 10시간 동안 열수 추출하였다. 이후, 상기 녹용 열수 추출물을 여과한 후 5 bix로 감압농축하였다.
(5) 먼저, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) SST-9960[기탁번호: KCCM 11402P] 균주를 LB 액체배지에 접종한 후, 30 ℃에서 2일간 배양하고, 배양액을 3000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상층액의 배지를 제거하였다. 여기에 0.75% 생리 식염수를 첨가하여 바실러스 균주를 현탁시킨 후, 3000 rpm의 속도로 10분간 원심분리하여 식염수를 제거하였다. 상기 생리식염수를 첨가하는 단계를 3회 반복하여 배지 성분을 완전히 제거하였다.
또한, 락토바실러스 파라플란타룸 SST-9961(기탁번호: KCCM 12711P) 균주를 MRS 브로스 배지에 접종한 후, 37 ℃에서 24시간 동안 정치 배양하고, 배양액을 3000 rpm으로 10분간 원심분리하여 상층액의 배지를 제거하였다. 여기에 0.75% 생리 식염수를 첨가하여 바실러스 균주를 현탁시킨 후, 3000 rpm의 속도로 10분간 원심분리하여 식염수를 제거하였다. 상기 생리식염수를 첨가하는 단계를 3회 반복하여 배지 성분을 완전히 제거하였다.
이후, 상기 락토바실러스 파라플란타룸 SST-9961 균주 및 바실러스 서브틸리스 SST-9960 균주를 1 : 3의 중량비로 혼합한 후, 0.75%의 생리 식염수를 첨가하여 생균수가 5×108 cfu/mL이 되도록 하여 접종균주를 준비하였다.
이후, 상기 (4) 단계에서 얻은 녹용 열수 추출물의 잔사 50 mL에 증류수 50 mL 및 1 %(v/v)의 포도당을 첨가하여 현탁액을 제조하였다.
그리고, 상기 현탁액에 상기 접종균주 1 중량%를 첨가하고, 30 ℃에서 72시간 동안 발효하여 녹용 발효물을 제조하였다. 이후 상기 녹용 발효물을 5 ㎛ 누체필터로 여과하였다.
(6) 상기 (4) 단계에서 제조한 녹용 열수 추출물 및 상기 (5) 단계에서 제조한 녹용 발효물을 1 : 3의 중량비로 혼합하고 감압농축하여 22 brix의 녹용 추출물을 제조하였다.
실시예 2: 락토바실러스 파라플란타룸 SST-9961 only
실시예 1과 동일하게 실시하되, 상기 락토바실러스 파라플란타룸 SST-9961 및 바실러스 서브틸리스 SST-9960의 혼합 균주 대신 락토바실러스 파라플란타룸 SST-9961 균주만을 이용하여 녹용 추출물을 제조하였다.
실시예 3: 바실러스 서브틸리스 SST-9960 only
실시예 1과 동일하게 실시하되, 상기 락토바실러스 파라플란타룸 SST-9961 및 바실러스 서브틸리스 SST-9960의 혼합 균주 대신 바실러스 서브틸리스 SST-9960 균주만을 이용하여 녹용 추출물을 제조하였다.
실시예 4: 바실러스 서브틸리스 J46 only
실시예 1과 동일하게 실시하되, 상기 락토바실러스 파라플란타룸 SST-9961 및 바실러스 서브틸리스 SST-9960의 혼합 균주 대신 바실러스 서브틸리스 J46[기탁번호: KCCM 12388P] 균주만을 이용하여 녹용 추출물을 제조하였다.
실시예 5: 알코올 침지 및 건조 1회만
실시에 1과 동일하게 실시하되, 상기 (1) 침지 단계 및 (2) 건조 단계를 1회만 수행하여 녹용 추출물을 제조하였다.
실시예 6: 70 부피% 알코올 수용액
실시에 1과 동일하게 실시하되, 상기 (1) 단계에서 35 부피%의 에탄올 수용액 대신 70 부피%의 에탄올 수용액에 침지시켜 녹용 추출물을 제조하였다.
대조군: 녹용 열수 추출물
녹용 분말에 10배 부피의 물을 첨가하고 110 ℃에서 10시간 동안 열수 추출하였다. 상기 녹용 열수 추출물을 여과한 후 22 brix로 감압농축하여 녹용 열수 추출물을 제조하였다.
비교예 1: 알코올 침지 및 건조 생략
실시예 1과 동일하게 실시하되, 상기 (1) 침지 단계 및 (2) 건조 단계를 생략하고 녹용 추출물을 제조하였다.
비교예 2: 건조 생략
실시예 5와 동일하게 실시하되, 상기 (2) 건조 단계를 생략하고 녹용 추출물을 제조하였다.
비교예 3: 발효 생략
실시예 1과 동일하게 실시하되, 상기 (5) 단계 및 (6) 단계를 생략하고 22 brix의 녹용 추출물을 제조하였다.
시험예 1: 강글리오사이드 함량 측정
상기 실시예 및 비교예에 따른 녹용 추출물 또는 녹용 추출물에 함유된 강글리오사이드 및 시알산 함량을 측정하여 하기 표 1에 나타내었다.
① 강글리오사이드 함량 분석
실시예 및 비교예에서 제조된 시료를 리노메트(LINOMAT)를 이용하여 10 ㎕씩 키에젤겔(Kieselgel) 60F HPTLC-플레이트(10 x 10 cm)에 스포팅한 후, 전개용매(클로로포름: 메탄올 : 물 = 65 : 25 : 4)로 포화시킨 챔버 내에 상기 스포팅한 플레이트를 넣어 전개시켰다. 용매를 휘발시킨 후 10% 황산으로 발색하였으며, 105 ℃ 오븐에서 HPTLC 스캐너를 이용하여 정량하였다.
구체적으로, 강글리오사이드 표준품(Sigma Co.)에 메탄올을 가하여 용해시키고, HPTLC법에 준하여 실험한 후 zig-zag TLC 스캐너로 파장 550nm에서 스캐닝하여 얻은 Rf 0.42 및 0.44의 피크면적으로부터 표준품의 검량선을 작성하였다.
이후, 상기 실시예 및 비교예에 따른 각각의 시료 1 g에 메탄올을 가하여 용해시키고, HPTLC법에 준하여 실험한 후 zig-zag TLC 스캐너로 파장 550nm에서 스캐닝하여 얻은 Rf 0.42 및 0.44의 피크면적으로부터 시료 중의 강글리오사이드를 정량하였다.
② 우론산 함량 분석
D-글루쿠론산 락톤을 표준품으로 사용하여 카르바졸 반응에 의해 520 nm에서 UV 분광 광도계를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 상기 실시예 및 비교예에 따른 각각의 시료 1 g을 증류수에 녹여 카르바졸 반응에 의해 520 nm에서 UV 분광 광도계를 이용하여 흡광도를 측정하고 D-글루쿠론산 락톤에 대한 함유량으로 계산하여 함량을 결정하였다.
③ 시알산 함량 분석
N-아세틸뉴라민산을 표준품으로 사용하여 Warren 방법에 의해서 550 nm에서 UV 분광 광도계를 이용하여 흡광도를 측정하였다.
상기 실시예 및 비교예에 따른 각각의 시료 1 g을 80 ℃에서 1 시간 동안 0.1 N 황산으로 가수분해한 후에 Warren 방법에 의해서 550 nm에서 UV 분광 광도계를 이용하여 흡광도를 측정하고 N-아세틸뉴라민산에 대한 함유량으로 계산하여 함량을 결정하였다.
| 구분 | 강글리오사이드 함량(mg/g) | 대조군 대비 증감율(%) |
| 대조군 | 5.34 | - |
| 실시예 1 | 18.51 | 246.8 |
| 실시예 2 | 15.26 | 185.8 |
| 실시예 3 | 13.02 | 143.8 |
| 실시예 4 | 11.21 | 109.9 |
| 실시예 5 | 12.28 | 130.0 |
| 실시예 6 | 12.13 | 127.2 |
| 비교예 1 | 10.65 | 99.4 |
| 비교예 2 | 9.34 | 74.9 |
| 비교예 3 | 5.71 | 5.7 |
상기 표 1을 살펴보면, 실시예에 따른 녹용 추출물이 비교예에 비해 강글리오사이드 함량이 현저히 증대된 것을 확인할 수 있다. 특히, 실시예 1 및 실시예 2의 경우에는 강글리오사이드 함량이 대조군 대비 150% 이상 증가하였다.
| 구분 | 우론산(mg/g) | 대조군 대비 증감율(%) |
시알산(mg/g) | 대조군 대비 증감율(%) |
| 대조군 | 0.17 | - | 0.023 | - |
| 실시예 1 | 0.31 | 82.4 | 0.048 | 108.7 |
| 실시예 2 | 0.28 | 64.7 | 0.035 | 52.2 |
| 실시예 3 | 0.26 | 51.2 | 0.033 | 44.2 |
| 실시예 4 | 0.22 | 30.7 | 0.031 | 33.7 |
| 실시예 5 | 0.23 | 35.3 | 0.031 | 34.8 |
| 실시예 6 | 0.24 | 41.2 | 0.032 | 39.1 |
| 비교예 1 | 0.21 | 23.5 | 0.030 | 30.4 |
| 비교예 2 | 0.19 | 11.8 | 0.028 | 21.7 |
| 비교예 3 | 0.19 | 11.8 | 0.024 | 4.3 |
상기 표 2를 살펴보면, 실시예에 따른 녹용 추출물이 비교예에 비해 우론산 및 시알산 함량이 현저히 증대된 것을 확인할 수 있다. 특히, 실시예 1 및 실시예 2의 경우 시알산 함량이 대조군 대비 50% 이상 증가하였다.
비록 본 발명이 상기에 언급된 바람직한 실시예로서 설명되었으나, 발명의 요지와 범위로부터 벗어남이 없이 다양한 수정이나 변형을 하는 것이 가능하다. 또한, 첨부된 특허청구범위는 본 발명의 요지에 속하는 이러한 수정이나 변형을 포함한다.
Claims (11)
- (1) 녹용을 25 내지 45 부피%의 탄소수 1 내지 4의 저급 알코올 수용액에 침지시키는 단계;
(2) 상기 침지시킨 녹용을 건조하는 단계;
(3) 상기 건조된 녹용을 분쇄하여 녹용 분말을 제조하는 단계;
(4) 상기 녹용 분말을 열수 추출하여 녹용 열수 추출물을 제조하는 단계;
(5) 상기 녹용을 열수 추출하고 남은 잔사에 물을 첨가하여 현탁시킨 현탁액에 류코노스톡 메센테로이데스(Leuconostoc mesenteroides), 락토바실러스 플란타룸(Lactobacillus plantarum) 및 락토바실러스 파라플란타룸(Lactobacillus paraplantarum) 중에서 선택되는 1종 이상의 유산균 및 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis)를 혼합한 발효균을 첨가한 후 발효시켜 녹용 발효물을 제조하는 단계; 및
(6) 상기 (4) 단계에서 제조한 녹용 열수 추출물, 및 (5) 단계에서 제조한 녹용 발효물을 혼합하는 단계;를 포함하는 강글리오사이드 함량이 증대된 녹용 추출물의 제조방법. - 제1항에 있어서,
(1) 단계의 상기 저급 알코올 수용액은 25 내지 45 부피%의 메탄올, 에탄올, 프로판올 또는 부탄올 수용액인 것을 특징으로 하는 강글리오사이드 함량이 증대된 녹용 추출물의 제조방법. - 제1항에 있어서,
(1) 단계의 침지는 실온에서 20 내지 50분 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 강글리오사이드 함량이 증대된 녹용 추출물의 제조방법. - 제1항에 있어서,
(2) 단계의 건조는,
ⅰ) 상기 녹용을 실온에서 4 내지 6 시간 동안 1차 건조하는 단계; 및 ⅱ) 1차 건조된 녹용을 수분 함량 2 내지 10 중량%가 되도록 동결건조하는 2차 건조 단계;를 포함하는 방법으로 수행되는 것을 특징으로 하는 강글리오사이드 함량이 증대된 녹용 추출물의 제조방법. - 제1항에 있어서,
상기 (1) 단계 및 (2) 단계를 2회 내지 5회 반복하여 수행하는 것을 특징으로 하는 강글리오사이드 함량이 증대된 녹용 추출물의 제조방법. - 제1항에 있어서,
(4) 단계의 열수 추출은 상기 녹용 분말에 5 내지 15배 부피의 물을 첨가하고, 90 내지 120 ℃에서 5 내지 20 시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 강글리오사이드 함량이 증대된 녹용 추출물의 제조방법. - 삭제
- 제1항에 있어서,
(5) 단계의 발효균은 락토바실러스 파라플란타룸 SST-9961(기탁번호: KCCM 12711P) 및 바실러스 서브틸리스 SST-9960(기탁번호: KCCM 11402P)인 것을 특징으로 하는 강글리오사이드 함량이 증대된 녹용 추출물의 제조방법. - 제8항에 있어서,
상기 발효균은 락토바실러스 파라플란타룸 SST-9961(기탁번호: KCCM 12711P) : 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) SST-9960(기탁번호: KCCM 11402P)가 1 : 2-5의 중량비로 혼합되는 것을 특징으로 하는 강글리오사이드 함량이 증대된 녹용 추출물의 제조방법. - 제1항에 있어서,
(5) 단계의 발효는 25 내지 35 ℃에서 48 내지 96 시간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 강글리오사이드 함량이 증대된 녹용 추출물의 제조방법. - 제1항에 있어서,
(6) 단계의 녹용 열수 추출물 : 녹용 발효물이 1 : 0.1-10의 중량비로 혼합되는 것을 특징으로 하는 강글리오사이드 함량이 증대된 녹용 추출물의 제조방법.
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| KR1020210154727A KR102441355B1 (ko) | 2021-11-11 | 2021-11-11 | 강글리오사이드 함량이 증대된 녹용 추출물의 제조방법 |
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- 2021-11-11 KR KR1020210154727A patent/KR102441355B1/ko active IP Right Grant
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