CN104013652B - 一种灵芝孢子粉的精制工艺与综合利用方法及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种灵芝孢子粉的精制工艺，在破壁后对破壁的灵芝孢子粉进行去壁精制，用体积分数为20%～95%的乙醇溶液和水浸泡后，分离壁壳，得到去壁灵芝孢子粉滤液和灵芝孢子粉壁壳，去壁灵芝孢子粉滤液经浓缩、干燥制得精制灵芝孢子粉，灵芝孢子粉壁壳经过综合回收利用工艺，制得壁壳醇提物固体粉末、二氯甲烷提取固体粉末、乙酸乙酯提取固体粉末、壁壳水提物固体粉末、正丁醇提取固体粉末、水相粉末或壳聚糖。本发明通过去壁精制实现了孢子粉无效成分（壁壳）的分离和有效成分（多糖及三萜等）的富集，产出的精制灵芝孢子粉有效成分含量显著提高，药效明显增强，并且对壁壳综合利用，提高了经济效益。

Description

一种灵芝孢子粉的精制工艺与综合利用方法及其用途

技术领域

本发明涉及一种灵芝孢子粉的制备工艺，特别是灵芝孢子粉的精制技术与孢子粉壁壳综合利用的方法及其用途。

背景技术

灵芝，别名仙草、神芝或芝草，为担子菌纲多孔菌科真菌赤芝Ganoderma lucidum(Leyss.ex Fr.)Karst或紫芝Ganoderma sinense Zhao,Xu et Zhang的干燥子实体，其性味甘平，具有扶正固本、滋补强壮等功效，药用价值高，在我国、朝鲜半岛、日本及东南亚等国家均有着广泛的应用。灵芝在生长成熟期，会从菌褶中弹射出极其微小的卵形生殖细胞，称为灵芝孢子或灵芝孢子粉。近年来，研究者对其进行了大量研究，发现灵芝孢子粉包含多种活性成分，如多糖、三萜、氨基酸、生物碱、甾醇和无机元素等，并从基因、蛋白或代谢通路等不同层次确证了抗肿瘤、抗癫痫、增强免疫、调节血糖血脂等一系列药理作用。目前，已有相应药品进入市场，并取得了较好的临床疗效。

从细胞结构上看，灵芝孢子具有双层壁结构，由几丁质和葡萄糖构成，质地较为坚韧，占比达50%～70%。几丁质为广泛存在于自然界的一种含氮多糖类生物性高分子，研究表明具有抗肿瘤、抗炎和抗菌等作用，但天然几丁质以蛋白多糖形式存在，常与多肽、钙质、色素等相结合，脱乙酰程度低，活性并不显著。实验表明，灵芝孢子壁阻碍有效成分的溶出，影响体内吸收，因此目前绝大部分产品都采用不同的破壁工艺粉碎孢子壁，以期提高活性成分体内生物利用度，增强治疗效果。但破壁后几丁质仍与壁内有效成分混合在一起，难以去除。孢子中活性成分含量低的问题仍没有得到根本解决。

几丁质在热碱中N端脱乙酰基的产物为壳聚糖，是一种具有调节糖脂代谢、降低自由基所致的过氧化反应、增强机体免疫等多种活性的多糖类成分，其独特的生物学特性已得到广泛研究和认可，是一种极具开发前景的医药原料及生理学材料。灵芝孢子壁中几丁质含量很高，且仍然残余部分灵芝孢子的有效成分，如有适宜的方法对其进行开发，不仅能为壁壳的处理提供一条可行的途径，还能使这些“废物”得到充分的利用，为相关疾病的早期干预和辅助治疗提供丰富的资源。但目前尚未有研究对灵芝孢子壁的作用进行系统评价，其物质基础、生物活性及作用机制均未知。

综上所述，如能实现灵芝孢子粉的去壁精制，同时对生产过程废弃的壁壳进行降解加工和活性评价的研究，不仅可以提高产品疗效，提升其药用价值，也为资源的循环利用提供了方法和依据，有利于产业的转型升级，实现可持续发展并提高经济效益。

发明内容

本发明的目的在于针对现有灵芝孢子粉制备工艺及其综合应用方法的不足，提供一种高效、快速、安全、可控的去壁精制工艺和壁壳的综合利用技术及其用途，以提高灵芝孢子粉产品的品质和附加值，为产业发展提供可行的思路和方法。

为了实现以上目的，本发明采用的技术方案是：

一种灵芝孢子粉的精制工艺，所述工艺包括以下步骤：

（1）原料初筛：称取灵芝孢子原料，过筛除去杂质，得到过筛的灵芝孢子；优选的，所用筛子为80～120目；

（2）水洗离心：将过筛的灵芝孢子加入蒸馏水搅拌10～30分钟后静置10～30分钟；瘪壳孢子较轻会浮于水面，泥沙和其他较重的杂质则沉在水底，而饱满的孢子则处在水层的中央，根据分层情况除去上层瘪壳、下层泥沙与杂质，取中层孢子悬浮液至过滤离心机中，离心甩除水分，得到湿灵芝孢子；所述蒸馏水的质量为过筛的灵芝孢子的质量的4～10倍，优选8倍；

（3）干燥：水洗离心后的湿灵芝孢子干燥至水分含量在7%以下，得到干燥的灵芝孢子；所述干燥的方式包括但不限于常压干燥、真空干燥、冷冻干燥、红外线干燥或微波干燥等，其中微波干燥具有干燥速度快、加热均匀、产品质量好、控制灵敏、操作方便等优点，因此优选微波干燥。微波干燥过程中，湿灵芝孢子需厚薄均匀地摊于烘盘上，控制物料厚度≤4cm，温度≤60℃，既可获得较快的干燥速度，同时对孢子中活性成分的影响也较小；

（4）破壁：对干燥的灵芝孢子进行破壁处理，使破壁率达到80%～100%，得到破壁的灵芝孢子粉；破壁的方法包括但不限于物理、化学和生物法等，如振动磨破壁、超音速气流破壁、流化床式气流粉碎机破壁或酶解法破壁；振动磨法破壁率高，但容易产生高温破坏有效成分，也容易带入重金属污染；超音速气流法低温、无介质污染但破壁率相对较低；酶解法也会引入外源性成分。优选破壁率较高且粒度均匀、易于清洗的流化床式气流粉碎机进行破壁，破壁后孢子粉破壁率可达到98%以上，且重金属（如铅、砷、汞、镉、铜、镍、铬、锰、铁等）与破壁前无明显增加，符合相应标准或规范的要求；

（5）去壁精制：将破壁的灵芝孢子粉置于提取罐中，分别依次用体积分数为20%～95%的乙醇溶液和水在50℃～100℃浸泡2～4次，每次1～3小时，合并所有浸泡液并分离壁壳，得到去壁灵芝孢子粉滤液和灵芝孢子粉壁壳；每次浸泡所用乙醇溶液或水的质量用量为破壁的灵芝孢子粉的质量的6-14倍；浸泡时可采用浸拌、搅拌、回流、超声或乳化分散等手段促使壁壳分离；分离壁壳可采用静置、过滤或离心等方法；

进一步，所述浸泡方式优选按以下步骤进行：破壁的灵芝孢子粉每次加入10-12质量倍的体积分数60%乙醇溶液（即指体积分数60%乙醇溶液的质量为破壁的灵芝孢子粉质量的10-12倍），在80℃浸泡2次，每次2小时，再每次加入7-10质量倍的水（即水的质量为灵芝孢子粉质量的7-10倍），在60℃超声浸泡2次，每次1小时，合并所有浸泡液，过滤分离壁壳，得到去壁灵芝孢子粉滤液和灵芝孢子粉壁壳。

所述过滤分离壁壳方式优选板框过滤机或过滤离心机；所述板框过滤机参数设置为8m3/h、压力≤0.3Mpa，滤膜孔径≤4μm；所诉过滤离心机滤袋孔径≥800目，频率40～60赫兹，转速600～1500转/分钟；

（6）浓缩：在60℃以下将去壁灵芝孢子粉滤液浓缩至缩至无醇味，得到浓缩液；同时回收乙醇。优选的，滤液浓缩至比重1.05～1.3；

（7）干燥：浓缩液干燥成固体粉末即得精制灵芝孢子粉；或浓缩液采用一步制粒法直接制备得到精制灵芝孢子粉制剂或制剂中间体；所述干燥可使用但不仅限于喷雾干燥、冷冻干燥或微波干燥法，优选微波干燥；一步制粒操作简单，生产效率高，又可避免细粉飞扬，防止交叉污染，保证了生产环境符合GMP要求；采用一步制粒法时，可以根据制剂的要求加入淀粉、糊精、乳糖、蔗糖、甘露醇、聚维酮、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、甲基纤维素、聚乙二醇、阿拉伯胶、明胶或浓缩液进一步浓缩得到的的孢子粉流浸膏（比重1.2～1.4）作为粘合剂一步完成混合、干燥、制粒工艺，提高生产效率。

本发明的另一个目的是提供灵芝孢子粉壁壳的综合利用方法，所述方法包括以下步骤：

（A）壁壳醇提物的制备：取灵芝孢子粉的精制工艺的步骤（5）得到的灵芝孢子粉壁壳，加体积分数60%～90%（优选70%）乙醇溶液，于60℃～80℃（优选80℃）下提取1～4小时（优选4小时），提取1～3次；合并所有提取液，过滤得滤液A和滤渣A，取滤液A减压浓缩回收乙醇，剩余物冷冻干燥得到壁壳醇提物固体粉末；所述体积分数60%～90%乙醇溶液的质量用量为灵芝孢子粉壁壳的质量的6～12倍，优选8倍；

（B）（i）取步骤（A）制得的壁壳醇提物固体粉末加3～4质量倍的50℃～80℃（优选70℃）热水浸泡（通常浸泡30～60分钟）并充分搅拌，加入与热水等体积的石油醚萃取2～4次，合并所有石油醚层，浓缩、干燥（优选冷冻干燥）制得石油醚提取浸膏状固体；

（ii）萃取后剩余的水层合并，按照上述（i）的方法，分别依次以与水层等体积的二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，并浓缩、干燥，分别制得二氯甲烷提取固体粉末、乙酸乙酯提取固体粉末和正丁醇提取固体粉末；最后剩余的水相合并后浓缩、干燥制得水相粉末；

（C）壁壳水提物的制备：取步骤（A）中醇提后过滤所得的滤渣A，烘干后加蒸馏水于100℃回流提取0.5～1小时，提取1～3次，合并所有的提取液，过滤，得滤液B和滤渣B，滤液B经浓缩干燥后即得米黄色的壁壳水提物固体粉末；所述蒸馏水的质量用量为滤渣A的质量的8～10倍；

（D）壳聚糖的制备：取步骤（C）中水提后的滤渣B，烘干后加入质量分数30%～60%（优选50%）NaOH水溶液，于100℃水浴下提取2～4小时，离心得沉淀物A；将沉淀物A用蒸馏水洗涤至中性，之后加入3～7倍沉淀物A质量的质量分数10%～20%（优选10%）醋酸水溶液，于95℃水浴提取2～4小时，离心、过滤取滤液C，加入NaOH调pH值=10，有沉淀物析出，离心取沉淀物B，用蒸馏水洗涤至中性，干燥，即制得壳聚糖；所述质量分数30%～60%NaOH水溶液的质量用量为滤渣B的质量的3～7倍。

本发明还提供通过上述工艺制备获得的精制灵芝孢子粉及壁壳不同部位组分在开发抗肿瘤、抗氧化或促消化类等药品或保健品中的用途。通过含量测定、活性评价和药理实验，发现精制灵芝孢子粉、壁壳醇提物固体粉末、乙酸乙酯提取固体粉末、正丁醇提取固体粉末及壳聚糖中的有效成分含量高，且具有较好的提高免疫力、抑制肿瘤生长、抗氧化、清除自由基或促消化作用，具有较好的成药潜力，可继续进行药物的研究开发。

本发明提供的精制灵芝孢子粉可用于制备抗肿瘤药物，特别可用于制备抗肝癌药物。

本发明提供的壁壳醇提物固体粉末、二氯甲烷提取固体粉末、乙酸乙酯提取固体粉末、正丁醇提取固体粉末或水相粉末可用于制备抗肿瘤药物，特别可用于制备抗乳腺癌和抗肺癌药物。特别是壁壳醇提物固体粉末、二氯甲烷提取固体粉末、乙酸乙酯提取固体粉末用于制备抗乳腺癌和抗肺癌药物。

本发明提供的壳聚糖可用于制备治疗胃肠道疾病药物。

本发明提供的精制灵芝孢子粉、壁壳醇提物固体粉末、二氯甲烷提取固体粉末、乙酸乙酯提取固体粉末、壁壳水提物固体粉末和壳聚糖可作为有效部位，加入人体可接受的药用辅料，按照相应的制备方法制成制剂。

所述的制剂包括注射液、滴注液、粉针剂、颗粒剂、片剂、冲剂、散剂、口服液、糖衣片剂、薄膜衣片剂、肠溶衣片剂、胶囊剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、口含剂、颗粒剂、丸剂、膏剂、丹剂、喷雾剂、滴丸剂、崩解剂、口崩片、微丸、微乳、固体分散剂等。

本发明的有益效果：本发明提供的灵芝孢子粉精制技术及其综合应用方法和现有技术相比具有以下优点：

（1）本发明提供的灵芝孢子粉精制技术工艺科学、环保，可操作性强，精制效率高，实现了孢子粉无效成分（壁壳）的分离和有效成分（多糖及三萜等）的富集，产出的精制灵芝孢子粉有效成分含量显著提高，药效明显增强，且不积聚重金属，提高了灵芝孢子粉产品的品质及附加值；

（2）本发明提供的壁壳的综合应用方法对工艺过程中原本废弃的壁壳进行了系统评价和分析，提供了壁壳回收利用的工艺和方法，为其循环利用及后续产品的开发提供了可行的途径和思路，实现了可持续发展并提高了经济效益。

附图说明

图1为精制灵芝孢子粉生产工艺流程图。

图2为壁壳醇提物和水提物的制备工艺流程图。

图3为壁壳醇提物不同极性提取物的制备工艺流程图。

图4为壳聚糖的制备工艺流程图。

图5为壁壳醇提物固体粉末对MDA-MB-231乳腺癌细胞与A549肺癌细胞增殖的抑制作用图。

图6为壁壳醇提物和不同极性部位固体粉末对MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖的抑制作用图。

图7为壁壳醇提物总抗氧化能力曲线图。

图8为壁壳醇提物对DPPH自由基的清除率曲线图。

图9为壁壳醇提物不同极性部位对DPPH自由基清除率比较图。

图10为壁壳醇提物和壁壳水提物对MDA的清除率曲线图。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的料液配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。

实施例1

灵芝孢子粉的精制技术如附图1所示，具体按以下步骤进行：

（1）称取灵芝孢子原料，过80目筛，去除较大的碎石和泥沙；

（2）将过筛孢子2000g放入搅拌罐中，加入16000g蒸馏水，搅拌20分钟后静置15分钟。从投料口捞出瘪壳孢子和其它上浮杂质，从搅拌罐底的排水口排出沉在水底的污泥和碎石。将中层孢子悬浮液溢流至铁罐中，并抽至过滤离心机中，甩除水分；

（3）离心后的湿孢子放入真空微波干燥机中的托盘中，厚薄均匀摊平，进行低温干燥。物料厚度≤4cm，温度≤60℃，干燥至含水量6%，得干燥孢子1400g；

（4）采用流化床式气流粉碎机对干燥孢子破壁，得到破壁的灵芝孢子粉1400g。按NYT1677-2008标准进行检测，其破壁率为98%。破壁的灵芝孢子粉中铬、镍、铅含量分别为0.65mg/kg、0.14mg/kg、0.079mg/kg，较未破壁前0.5mg/kg、0.17mg/kg、0.085mg/kg无明显增加，符合GB2762-2012食品中安全限量的要求；

（5）破壁孢子粉1400g投入提取罐中，加入14000g体积分数60%乙醇溶液，在80℃浸泡2小时，浸泡2次，再以10000g蒸馏水在60℃超声浸泡2次，每次1小时。合并所有浸泡液用过滤离心机过滤，通过滤网的即为去壁灵芝孢子粉滤液，而滤网上的则为孢子粉壁壳；过滤离心机滤袋孔径800目，频率40赫兹，转速1000转/分钟；

（6）在60℃将滤液浓缩至无醇味，浓缩液比重1.05；

（7）采用微波干燥将浓缩液干燥成固体粉末即得精制灵芝孢子粉400g。

实施例2

灵芝孢子粉壁壳的综合利用方法如附图2所示，具体包括以下步骤：

（1）取实施例1中步骤（5）所得孢子粉壁壳1000g，用8000g的体积分数70%乙醇溶液于80℃提取4小时，提取3次。合并提取液，过滤得滤液A和滤渣A，滤液A减压浓缩回收乙醇，采用冷冻干燥的方法得到壁壳醇提物固体粉末60g；

（2）取上述壁壳醇提物固体粉末50g，加150g70℃热水浸泡30分钟并充分搅拌，之后加入150g石油醚萃取3次，萃取后将所有石油醚层合并，减压浓缩，冷冻干燥得石油醚浸膏状固体20g；萃取后剩余的水层按相同的方法，分别依次以二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，分别得到二氯甲烷提取固体粉末3g、乙酸乙酯提取固体粉末2g和正丁醇提取固体粉末4g。最后剩余的水相合并、浓缩干燥后得水相固体粉末7g；

（3）取实施例2步骤（1）中醇提后的滤渣A900g，烘干后加8000g蒸馏水于100℃回流提取2次，每次1小时，合并所有的提取液，过滤，得滤液B和滤渣B，滤液B浓缩干燥后得米黄色的壁壳水提物固体粉末5g；

（4）取实施例2步骤（3）中水提后的滤渣B800g，加入4000g质量分数50%NaOH溶液，100℃水浴提取4小时，离心后去滤液取沉淀物A。将沉淀物A用蒸馏水洗涤至中性，之后加入2800g10%醋酸溶液，于95℃水浴提取3小时，离心过滤取滤液，加入NaOH调pH值=10，有沉淀物析出，离心取沉淀物B，用蒸馏水洗涤至中性并干燥，即得壳聚糖500g。

实施例3

精制灵芝孢子粉与普通灵芝孢子粉有效成分含量检测

取实施例1生产的精制灵芝孢子粉，另取以常规工艺生产的普通灵芝孢子粉，分别采用苯酚-硫酸法，香草醛-冰醋酸-高氯酸法测多糖含量和总三萜含量，以葡萄糖和齐墩果酸为对照，在490nm和550nm下以分光光度法测定样品的吸光度并根据标准曲线计算相应的浓度。结果表明，精制灵芝孢子粉的粗多糖及总三萜含量显著大于普通灵芝孢子粉（P＜0.01），含量提高了近20倍。结果见表1。

普通灵芝孢子粉按照实施例1步骤（1）～（4）操作，得到的破壁的灵芝孢子粉，不经去壁精制，即为常规工艺得到的灵芝孢子粉。

表1精制灵芝孢子粉与普通灵芝孢子粉有效成分含量检测结果

与普通灵芝孢子粉相比，**P＜0.01

实施例4

精制灵芝孢子粉与普通灵芝孢子粉对ICR小鼠H22肝癌的实验

取实施例1生产的精制灵芝孢子粉，另取按实施例3方法制得的普通灵芝孢子粉，配置成低、中、高浓度（0.5、1、2克/千克的小鼠灌胃剂量）。ICR小鼠，雄性，体重16～20克，随机分组，腋下皮下接种0.2毫升H22瘤细胞稀释液（细胞数1×10⁷个/毫升），阴性对照组灌胃给予生理盐水，阳性对照组腹腔注射环磷酰胺20毫克/千克，给药组分别按上述剂量灌胃给予两种孢子粉。连续给药15天，末次给药后尾静脉注射印度墨汁（0.1毫升/10克），在注射后第1分钟和第5分钟眼眶取血，并迅速加入0.1%Na₂CO₃溶液稀释。摇匀后采用酶标仪在650纳米测定OD值，碳廓清指数K=（lgOD₁-lgOD₂）/（T₅-T₁），OD₁和OD₂分别为1分钟和5分钟时的OD值，T₁=1min，T₅=5min。之后处死小鼠，称体重、瘤重以及胸腺、脾脏重量，计算抑瘤率和脏器指数。胸腺系数=胸腺质量（mg）/体质量（g），脾脏系数=脾脏质量（mg）/体质量（g）。

结果表明，除了高剂量组使胸腺系数稍低于阴性对照组外，不同剂量的精制孢子粉对荷瘤小鼠的脏器指数均有提高，其中中剂量组对胸腺系数提高最明显，与阳性对照组相比有显著差异（P＜0.05），与对应剂量的普通孢子粉相比，差异也有统计学意义（P＜0.05）；中、高剂量精致孢子粉还显著提高了脾脏系数（P＜0.05），效果同样比普通孢子粉明显；阳性药环磷酰胺的抑瘤率最高，达到了68%，而精制孢子粉的抑瘤率也普遍比普通孢子粉高，最多提高了近2倍。碳廓清实验也表明，精制孢子粉对小鼠吞噬功能有不同程度的提高，其中以高剂量组最明显，效果也明显优于普通孢子粉（P＜0.05），说明精制孢子粉能比较明显的提高非特异性免疫功能，进而抑制肿瘤的生长。具体结果见表2和表3。

表2小鼠体内抑瘤实验结果

与阴性对照组比，*P＜0.05；与阳性对照组比，#P＜0.05；与相同剂量普通孢子粉比，△P＜0.05

表3小鼠碳廓清指数实验结果

与阴性对照组比，*P＜0.05；与阳性对照组比，#P＜0.05；与相同剂量普通孢子粉比，△P＜0.05

实施例5

壁壳醇提物主要活性成分含量测定实验

取实施例2所得壁壳醇提物固体粉末，对其总黄酮、总糖、还原糖、三萜酸及多酚类成分的含量进行测定。总糖和三萜酸的测定方法与实施例3相同，总黄酮采用NaNO₂法，还原糖采用DNS试剂法，多酚类采用Folin ciocalteu试剂法，分别以芦丁、葡萄糖和没食子酸为对照。结果表明，壁壳醇提物中各类活性成分含量较高，提示其可能拥有较好的活性。结果见表4。

表4壁壳醇提物活性成分含量测定结果

实施例6

壁壳醇提物及不同极性部位抗肿瘤活性分析

取实施例2所得壁壳醇提物粉末及不同极性部位（二氯甲烷提取固体粉末、乙酸乙酯提取固体粉末、正丁醇提取固体粉末及剩余水相固体粉末），石油醚部位由于呈浸膏状，难以溶解，因此未进行实验。将不同浓度的壁壳醇提物作用于体外培养的MDA-MB-231乳腺癌细胞株与A549肺癌细胞株48小时，用SRB法测定其对肿瘤细胞的增殖抑制率；将不同浓度的壁壳醇提物及不同极性部位作用于体外培养的MDA-MB-231肿瘤细胞株48小时后，用SRB法测定其对肿瘤细胞的增殖抑制率。图5为壁壳醇提物不同浓度下对MDA-MB-231乳腺癌细胞和A549肺癌细胞的抑制作用图，图6为壁壳醇提物和不同极性部位固体粉末对MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖的抑制作用图。图中纵坐标细胞活力均指细胞存活率。结果表明，壁壳醇提物各质量浓度对肿瘤细胞均具有抑制作用，随着浓度的增加，这两种肿瘤细胞的存活率逐渐减小。作用48小时，壁壳醇提物对这两株癌细胞的半数抑制浓度均为0.5毫克/毫升；对比壁壳醇提物与不同极性部位的癌细胞抑制活性，壁壳醇提物的抗肿瘤活性最好；对比不同极性部位的癌细胞抑制活性，二氯甲烷提取固体粉末与乙酸乙酯提取固体粉末的抗肿瘤活性较好。

实施例7

壁壳醇提物及不同极性部位抗氧化活性分析

取实施例2所得壁壳醇提物粉末及二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇及剩余水相固体粉末，采用总抗氧化能力（T-AOC）试剂盒测定醇提物总抗氧化能力，采用DPPH自由基方法测定醇提物及不同部位测定对自由基清除能力。图7为壁壳醇提物总抗氧化能力曲线图，结果表明，壁壳醇提物抗氧化活性良好，随着浓度的增加，其总抗氧化能力明显增强。图8为壁壳醇提物对DPPH自由基的清除率曲线图，其中两条曲线为两次重复实验结果，结果表明，壁壳醇提物对DPPH自由基清除能力也随浓度上升而增强，且在极低的浓度下（0.125毫克/毫升）就表现出很强的清除能力。图9为壁壳醇提物不同极性部位对DPPH自由基清除率比较图，在0.2与0.5毫克/毫升时，不同的极性部位均表现出一定的DPPH自由基清除活性，对比发现，乙酸乙酯部位粉末的活性最好：在0.2毫克/毫升时，清除率达到了80%左右。

实施例8

壁壳醇提物及水提物抗脂质过氧化能力实验

取实施例2步骤（1）所得壁壳醇提物和步骤（3）所得壁壳水提物固体粉末，采用H2O2诱导肝脏脂质产生过氧化物MDA，并通过添加不同浓度的提取物溶液，考察醇提物或水提物的保护作用。结果表明，醇提物在浓度为0.1-1毫克/毫升范围内、水提物在0.2-0.5毫克/毫升范围内对MDA生成的抑制作用迅速增强，在1毫克/毫升时，醇提物对MDA生成的抑制率达到80.19%，水提物达到了68.36%，说明两者均能够有效地保护H₂O₂诱导的肝脏脂质过氧化。图10为壁壳醇提物和壁壳水提物对MDA的清除率曲线图。

实施例9

壳聚糖小鼠小肠运动实验

取实施例2步骤（4）所得的壳聚糖，用蒸馏水配置成混悬液，按200、400和800毫克/千克的剂量给小鼠灌胃给药，ICR小鼠，雄性，体重16～20克，对照组给予蒸馏水，连续给药15天，第16天给予含墨汁的含药混悬液，25分钟后立即脱颈椎处死小鼠，打开腹腔分离肠系膜，剪取上端自幽门、下端至回盲部的肠管，置于托盘上，轻轻将小肠拉成直线，测量肠管长度为“小肠总长度”，从幽门至墨汁前沿为“墨汁推进长度”。以墨汁推进长度/小肠总长度计算推进率。结果表明，与对照组相比，中剂量和高剂量壳聚糖组提高了墨汁推进率，其中高剂量组差异有统计学意义（P＜0.05），说明壳聚糖具有提高小鼠胃肠蠕动的能力。

实施例10

精制孢子粉颗粒剂的制备

取实施例1所得的精制灵芝孢子粉50g，加入10g可溶性淀粉，60g甘露醇和30gα-乳糖，混合均匀，过80目筛。加入10g的体积分数90%乙醇作为润湿剂制成软材，过10目筛制粒，于70℃干燥1小时，采用整粒机将结团的颗粒制成均匀颗粒，即得精制孢子粉颗粒制剂。

实施例11

精制孢子粉口服液的制备

取实施例1所得的精制灵芝孢子粉50g，加水煎煮2次，每次1小时，合并煎液，板框过滤机滤过，滤液70℃浓缩至相对密度1.20左右，放冷后加入适量乙醇使含醇量达65%，搅匀，静置24小时后取上清液回收乙醇并得浓缩液300g，加入乙基麦芽酚0.05g，甜菊素1g，15g蜂蜜，搅拌均匀，趁热过滤，精滤，灌装，封口，于115℃灭菌15分钟，即得精制孢子粉口服液。

实施例12

壁壳醇提物冻干粉针剂的制备

取实施例2步骤（1）所得的壁壳醇提物固体粉末10g，加入50g甘露醇和40gL-精氨酸作为赋形剂，用2000g注射用水溶解，加入4g活性炭除热原，0.45微米滤过，滤液分装，共制800份，-50℃预冻10小时，抽真空，最后升温至室温干燥，保持5小时，即得壁壳醇提物冻干粉针剂。

实施例13

壁壳乙酸乙酯部位提取物固体分散剂的制备

取按实施例2步骤（2）所得的乙酸乙酯提取固体粉末5g，泊洛沙姆30g，乳糖50g，于粉碎机中粉碎后置于蒸发皿中水浴80℃熔融，转移至冰水浴冷冻固化，粉碎过80目筛，干燥后即得壁壳乙酸乙酯提取物固体分散剂。

实施例14

壳聚糖胶囊的制备

取实施例2步骤（4）所得的壳聚糖100g，采用胶囊机将其灌装进硬胶囊中，封口，打光即得，得400份壳聚糖胶囊。

以上实施方式只为说明本发明的技术构思及特点，其目的在于让熟悉此项技术的人了解本发明内容并加以实施，并不能以此限制本发明的保护范围，凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (9)

1.一种灵芝孢子粉的精制方法，其特征在于所述工艺包括以下步骤：

(1)原料初筛：称取灵芝孢子原料，过筛除去杂质，得到过筛的灵芝孢子；

(2)水洗离心：将过筛的灵芝孢子加入蒸馏水搅拌10～30分钟后静置10～30分钟；除去上层瘪壳、下层泥沙与杂质，取中层孢子悬浮液，离心甩除水分，得到湿灵芝孢子；

(3)干燥：湿灵芝孢子干燥至水分含量在7％以下，得到干燥的灵芝孢子；

(4)破壁：对干燥的灵芝孢子进行破壁处理，使破壁率达到80％～100％，得到破壁的灵芝孢子粉；

(5)去壁精制：将破壁的灵芝孢子粉置于提取罐中，每次加入10-12质量倍的体积分数60％乙醇溶液，在80℃浸泡2次，每次2小时，再每次加入破壁的灵芝孢子粉的7-10质量倍的水在60℃超声浸泡2次，每次1小时，合并所有浸泡液，过滤分离壁壳，得到去壁灵芝孢子粉滤液和灵芝孢子粉壁壳；

所述过滤分离壁壳，采用板框过滤机或过滤离心机去除壁壳，所述板框过滤机参数设置为8m³/h、压力≤0.3Mpa，滤膜孔径≤4μm，所述过滤离心机滤袋孔径≥800目，频率40～60赫兹，转速600～1500转/分钟；

(6)浓缩：在60℃以下将去壁灵芝孢子粉滤液浓缩至无醇味，得到浓缩液；

(7)干燥：浓缩液干燥成固体粉末即得精制灵芝孢子粉；或浓缩液采用一步制粒法直接制得精制灵芝孢子粉制剂或制剂中间体。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述步骤(4)中，破壁处理采用流化床式气流粉碎机进行破壁。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述一步制粒法是将浓缩液与粘合剂混合、干燥、制粒得到精制灵芝孢子粉制剂；所述粘合剂为部分浓缩液进一步浓缩得到的孢子粉流浸膏。

4.如权利要求1～3之一所述的方法制得的精制灵芝孢子粉或精制灵芝孢子粉制剂。

5.如权利要求4所述的精制灵芝孢子粉或精制灵芝孢子粉制剂在制备抗肝癌药物中的应用。

6.一种灵芝孢子粉壁壳的综合利用方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：

(A)壁壳醇提物的制备：取灵芝孢子粉壁壳，加体积分数60％～90％乙醇溶液，于60℃～80℃下提取1～4小时，提取1～3次；合并所有提取液，过滤得滤液A和滤渣A，取滤液A减压浓缩回收乙醇，剩余物冷冻干燥得到壁壳醇提物固体粉末；所述体积分数60％～90％乙醇溶液的质量用量为灵芝孢子粉壁壳的质量的6～12倍；

(B)(i)取步骤(A)制得的壁壳醇提物固体粉末加3～4质量倍的50℃～80℃热水浸泡并充分搅拌，加入与热水等体积的石油醚萃取2～4次，合并所有石油醚层，浓缩、干燥制得石油醚提取浸膏状固体；

(ii)萃取后剩余的水层合并，按照上述(i)的方法，分别依次以与水层等体积的二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，并浓缩、干燥，分别制得二氯甲烷提取固体粉末、乙酸乙酯提取固体粉末和正丁醇提取固体粉末；

(C)壁壳水提物的制备：取步骤(A)中醇提后过滤所得的滤渣A，烘干后加蒸馏水于100℃回流提取0.5～1小时，提取1～3次，合并所有的提取液，过滤，得滤液B和滤渣B，滤液B经浓缩干燥后即得壁壳水提物固体粉末；所述蒸馏水的质量用量为滤渣A的质量的8～10倍；

(D)壳聚糖的制备：取步骤(C)中水提后的滤渣B，烘干后加入质量分数30％～60％NaOH水溶液，于100℃水浴下提取2～4小时，离心得沉淀物A；将沉淀物A用蒸馏水洗涤至中性，之后加入3～7倍沉淀物A质量的质量分数10％～20％醋酸水溶液，于95℃水浴提取2～4小时，离心、过滤取滤液C，加入NaOH调pH值＝10，有沉淀物析出，离心取沉淀物B，用蒸馏水洗涤至中性、干燥，即制得壳聚糖；所述质量分数30％～60％NaOH水溶液的质量用量为滤渣B的质量的3～7倍；

所述灵芝孢子粉壁壳按以下方法制得：

(1)原料初筛：称取灵芝孢子原料，过筛除去杂质，得到过筛的灵芝孢子；

(2)水洗离心：将过筛的灵芝孢子加入蒸馏水搅拌10～30分钟后静置10～30分钟；除去上层瘪壳、下层泥沙与杂质，抽取中层孢子悬浮液，离心甩除水分，得到湿灵芝孢子；

(3)干燥：湿灵芝孢子干燥至水分含量在7％以下，得到干燥的灵芝孢子；

(4)破壁：对干燥的灵芝孢子进行破壁处理，使破壁率达到80％～100％，得到破壁的灵芝孢子粉；

(5)去壁精制：将破壁的灵芝孢子粉置于提取罐中，每次加入10-12质量倍的体积分数60％乙醇溶液，在80℃浸泡2次，每次2小时，再每次加入破壁的灵芝孢子粉的7-10质量倍的水在60℃超声浸泡2次，每次1小时，合并所有浸泡液，过滤分离壁壳，得到去壁灵芝孢子粉滤液和灵芝孢子粉壁壳；

所述过滤分离壁壳，采用板框过滤机或过滤离心机去除壁壳，所述板框过滤机参数设置为8m³/h、压力≤0.3Mpa，滤膜孔径≤4μm，所述过滤离心机滤袋孔径≥800目，频率40～60赫兹，转速600～1500转/分钟。

7.如权利要求6所述的方法制得的壁壳醇提物固体粉末、二氯甲烷提取固体粉末、乙酸乙酯提取固体粉末、壁壳水提物固体粉末、正丁醇提取固体粉末、水相粉末或壳聚糖。

8.如权利要求7所述的壁壳醇提物固体粉末、二氯甲烷提取固体粉末、乙酸乙酯提取固体粉末、正丁醇提取固体粉末或水相粉末在制备抗乳腺癌药物中的应用。

9.如权利要求7所述的壁壳醇提物固体粉末在制备抗肺癌药物中的应用。