CN103399115B - 一种基于液相色谱仪检测莫西克汀含量的方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于液相色谱仪检测莫西克汀含量的方法，本发明所涉及色谱方法的优化与改进如下：(a)洗脱方式由原来的等度改为梯度洗脱，可明显缩短运行时间，达到快速检测目的，尤其对低纯度杂质较多莫西克汀含量检测意义更为重大；(b)流速比原来降低1-1.5mL/min，明显降低柱压，减少对色谱仪及色谱柱的损耗，同时节省流动相，节约试剂，减少开支；(c)柱温比原来降低5-10℃，减少对色谱柱的损伤，延长液相色谱柱的使用寿命。
Description
技术领域
本发明属于高效液相检测方法，具体涉及一种莫西克汀成品含量检测的液相色谱方法，尤其适用于85%以下纯度的低纯度莫西克汀的含量检测。
背景技术
莫西克汀是一种新型抗寄生虫药，是由链霉菌发酵的单一成分的大环内酯类抗生素。抗寄生虫药普遍应用于畜牧业、养殖业等基础农业中，国际抗寄生虫药的需求一直保持持续增长。因此，一种更为快速、高效的含量检测液相色谱方法就显得尤为重要。
EP7.0 莫西克汀含量检测液相色谱方法流速为2.5mLmin，高流速必然引起高压力，其结果是造成色谱柱及仪器寿命缩短，同时，高流速造成流动相用量大，试剂浪费；EP7.0 莫西克汀含量检测液相色谱方法柱温为50℃，而柱子一般温度为35℃，温度过高会加快键合相的水解和硅胶的溶解，从而使填料性质改变,柱床塌陷,降低柱效,改变峰形。
发明内容
本发明的目的在于提供一种提高化验室的工作效率，减少对液相色谱仪及色谱柱损伤的莫西克汀成品含量检测液相色谱方法。
本发明采用的技术方案是，一种基于液相色谱仪检测莫西克汀含量的方法，所述的方法具体步骤包括：
a、对照品溶液：将莫西克汀对照品置于第一容量瓶中，加乙腈溶解、定容，备用；
b、供试品溶液：将与莫西克汀同等质量的供试品置于第二容量瓶中，加乙腈溶解、定容，备用；
c、设定液相色谱仪的参数条件：流动相A为0.25M醋酸铵溶液与乙腈的混合溶液，体积比是7:（2.5~3.5），流动相B为乙腈，色谱柱的柱温控制在40~45℃，流速控制在1.0~1.5mL/min；
d、量取同体积的对照品溶液及供试品溶液注入液相色谱仪中进行洗脱，洗脱方式为：前十分钟流动相B为55%，中间十几分钟流动相B增加为65%，最后十分钟流动相B又降为55%；
e、按外标法计算得出莫西克汀的含量。
所述的检测方法应用在纯度≤85%的莫西克汀含量检测。
所述的流动相A中0.25M醋酸铵溶液与乙腈的最佳体积比为7:3。
本发明的关键是洗脱方式原由来的等度改为梯度洗脱，度程序：前十分钟流动相B为55%，中间十几分钟流动相B增加为65%，最后十分钟流动相B又降为55%，运行时间总共为30min；流速比原来降低1~1.5mL/min；柱温比原来降低5~10℃。
现有技术中因低纯度莫西克汀杂质较多，这样运行时间较长。本发明尤其适合低浓度莫西克汀含量检测，可明显缩短运行时间，提高工作效率。
附图说明
图1是本发明中对照品色谱图。
图2是本发明中供试品色谱图。
图3是本发明中EP7.0检测方法对照品色谱图。
图4是本发明中EP7.0检测方法供试品色谱图。
图5是本发明中EP7.0检测方法优化过程方法一色谱图。
图6是本发明中EP7.0检测方法优化过程方法二对照品色谱图。
图7是本发明中EP7.0检测方法优化过程方法二供试品色谱图。
图8是本发明中EP7.0检测方法优化过程方法三供试品色谱图。
图9是本发明中EP7.0检测方法优化过程方法四对照品色谱图。
图10是本发明中EP7.0检测方法优化过程方法四供试品色谱图。
图11是EP7.0检测方法优化过程方法五与方法三对照品对比色谱图。
图12是EP7.0检测方法优化过程方法五对照品与供试品对比色谱图。
图13是EP7.0检测方法优化过程方法六与方法五对照品对比色谱图。
图14是EP7.0检测方法优化过程方法七与方法六对照品对比色谱图。
图15是本发明中EP7.0检测方法优化过程方法八对照品色谱图。
图16是本发明中EP7.0检测方法优化过程方法八供试品色谱图。
具体实施方式
一种基于液相色谱仪检测莫西克汀含量的方法，所述的方法具体步骤包括：
a、对照品溶液：将莫西克汀对照品置于第一容量瓶中，加乙腈溶解、定容，备用；
b、供试品溶液：将与莫西克汀同等质量的供试品置于第二容量瓶中，加乙腈溶解、定容，备用；
c、设定液相色谱仪的参数条件：流动相A为0.25M醋酸铵溶液与乙腈的混合溶液，体积比是7:（2.5~3.5），流动相B为乙腈，色谱柱的柱温控制在40~45℃，流速控制在1.0~1.5mL/min；
d、量取同体积的对照品溶液及供试品溶液注入液相色谱仪中进行洗脱，洗脱方式为：前十分钟流动相B为55%，中间十几分钟流动相B增加为65%，最后十分钟流动相B又降为55%；
e、按外标法计算得出莫西克汀的含量。
所述的检测方法应用在纯度≤85%的莫西克汀含量检测。
所述的流动相A中0.25M醋酸铵溶液与乙腈的最佳体积比为7:3。
本发明在具体实施时，对照品溶液：精密称取25.0mg莫西克汀对照品于25.0mL容量瓶中，加乙腈溶解并定容至刻度。
供试品溶液：精密称取25.0mg供试品于25.0mL容量瓶中，加乙腈溶解并定容至刻度。
精密量取对照品溶液及供试品溶液各10ul，自动进样，注入液相色谱仪，对照品溶液连续进样三针，样品溶液连续进样两针，记录色谱图。按外标法计算莫西克汀含量。
实验结果如下表：
| 样品批号 | 样品来源 | 运行柱压（psi） | 运行时间（min） | 含量 |
| MX130601精制吸附液 | 研发提取室 | 2600 | 30 | 48.65% |
色谱图参看图1和图2，由图一、二可以看出，供试品溶液主峰与对照品出峰保留时间一致；供试品溶液连续进样两针，图谱重合性良好，说明主峰后杂质全部能分离出来，且主峰峰型比较理想，保留时间比较合适。
实验数据分析：
1. EP7.0检测方法
1.1 色谱条件
色谱柱：C18 4um 3.9*150mm 检测波长：242nm
进样量：10μl 流速：2.5mL/min
柱温：50℃
流动相：溶解7.7g醋酸铵于400mL水中，用冰醋酸将pH调节至4.8，并加入600mL乙腈。
备注：因本实验室无EP7.0型号色谱柱，本试验所用色谱柱型号为C18 3.5um 4.6*150mm。其余色谱条件相同。虽然色谱柱填充粒径和柱内径不同，柱保留时间会略有不同，但因流速都为2.5mL/min，柱温都为50℃，上述反应不足之处例：柱压高，柱温高，对仪器及色谱柱有一定损耗，浪费流动相等仍成立。
1.2 试验过程
对照品溶液：精密称取25.0mg莫西克汀对照品于25.0mL容量瓶中，加乙腈溶解并定容至刻度。
供试品溶液：精密称取25.0mg供试品于25.0mL容量瓶中，加乙腈溶解并定容至刻度。
精密量取对照品溶液及供试品溶液各10μl，自动进样，注入液相色谱仪，对照品溶液连续进样三针，记录色谱图。按外标法计算莫西克汀含量。
1.3 试验结果
| 样品批号 | 样品来源 | 运行柱压（psi） | 运行时间（min） | 含量 |
| tq-0514-1 | 研发提取室 | 3800 | 60 | 29.36% |
色谱图见图3和图4。
此方法不足之处：柱温50℃，超过一般色谱柱的耐温上限（45℃）；柱压力约为3800psi，柱压较高，一般色谱柱的压力上限为3000psi；因在50.7min有一个杂质，运行时间为60min，运行时间较长，降低工作效率；流速为2.5mL/min，流速较大，浪费流动相，造成资金损耗。
检测方法优化过程
2.1 方法优化过程
2.1.1 方法一
色谱条件:
柱温：40-45℃ 流速：1.0-1.5mL/min
流动相A：溶解7.7g醋酸铵于400mL水中，用冰醋酸将pH调节至4.8。
流动相B：乙腈
梯度程序：
时间min 流动相B%
0 50
10 50
20 80
30 50
其余条件同上，取对照品溶液10ul注入液相色谱仪，色谱图如图5。
结论：主峰及其后杂质都未能跑出。
2.1.2 方法二
梯度程序：
时间min 流动相B%
0 60
10 60
20 80
30 60
其余同上，取对照品溶液10ul注入液相色谱仪，色谱图如图6和图7。
结论：主峰出峰时间为21.907min，运行时间偏长，最好能控制在15min左右。
2.1.3 方法三
梯度程序：
时间min 流动相B%
0 70
10 70
20 80
30 70
其余同上，取对照品溶液10ul注入液相色谱仪，色谱图如图8。
结论：由图8可以看出，主峰保留时间已控制在15min左右，但基线不稳，波动大。
2.1.4 方法四
梯度程序：
时间min 流动相B%
0 55
5 55
25 80
30 55
其余同上，分别取对照品溶液和供试品溶液各10ul注入液相色谱仪，色谱图如图9和图10。
结论：由图10可以看出，虽然15min前基线平直，但其后基线波动仍然比较大。
2.1.5 方法五
0.25M醋酸铵溶液：溶解7.7g醋酸铵于400mL水中，用冰醋酸将pH调节至4.8。
流动相A：0.25M醋酸铵溶液：乙腈=7:3
流动相B：乙腈
梯度程序：
时间min 流动相B%
0 55
10 55
20 65
30 55
其余同上，分别取对照品溶液和供试品溶液各10ul注入液相色谱仪，色谱图如图11和图12。
结论：由图11可以看出，本色谱方法与方法三比较，基线波动明显减小，基线较为稳定；但由图二可以看出，蓝色图谱样品主峰峰型后拖。
2.1.6 方法六
0.25M醋酸铵溶液：溶解7.7g醋酸铵于400mL水中，用冰醋酸将pH调节至5.5。
其余条件同方法五，取供试品溶液10ul注入液相色谱仪，色谱图如图13。结论：主峰仍为后拖。
2.1.7 方法七
0.25M醋酸铵溶液：溶解7.7g醋酸铵于400mL水中，用冰醋酸将pH调节至4.2。
其余条件同方法六，取供试品溶液10ul注入液相色谱仪，色谱图如图14。结论：主峰理论塔板数明显低于方法六，且主峰后杂质未能跑出来。
2.1.8 方法八
0.25M醋酸铵溶液：溶解7.7g醋酸铵于400mL水中（pH约为6.5）。其余条件同方法六，分别取对照品溶液及供试品溶液各10ul，注入液相色谱仪，供试品溶液连续进样2针，色谱图如图15和图16。
结论：由图15和图16可以看出，供试品溶液主峰与对照品出峰保留时间一致；供试品溶液连续进样两针，图谱重合性良好，说明主峰后杂质全部能分离出来，且主峰峰型比较理想，保留时间比较合适。
2.2 方法优化结论
（1）从方法一到方法三，主要是通过调节有机相的比例，从而来控制比较合适的主峰保留时间。
（2）从方法四到方法五，主要是在保证主峰保留时间合适的前提下，通过向无机相加入一定比例的有机溶剂，从而来改变基线波动不稳的状况。
（3）从方法六到方法八，主要是在保证主峰保留时间合适，基线平稳前提下，通过改变流动相pH值，从而达到控制主峰峰型的目的。
最终优化方法定为方法八。
优化后方法与原方法结果对比
3.1 试验结果
取5批样品，分别用原来方法与优化后方法对其进行检测，检测结果如下：
3.2 试验结论
由3.1试验结果部分可以看出，两种方法检测结果一致，说明本优化后方法可行；由对照品对比图谱可以看出，本优化后方法具有理论塔板数高，运行时间短，检测更快速的优点。同时，本发明所涉及色谱方法的优化与改进如下：(a)洗脱方式由原来的等度改为梯度洗脱，可明显缩短运行时间，达到快速检测目的，尤其对低纯度杂质较多莫西克汀含量检测意义更为重大；(b)流速比原来降低1-1.5mL/min，明显降低柱压，减少对色谱仪及色谱柱的损耗，同时节省流动相，节约试剂，减少开支；(c)柱温比原来降低5-10℃，减少对色谱柱的损伤，延长液相色谱柱的使用寿命。本发明可以明显提高化验室的工作效率，减轻化验员的劳动强度。
Claims (2)
1.一种基于液相色谱仪检测莫西克汀含量的方法，其特征在于：所述的检测方法应用在纯度≤85％的莫西克汀含量检测，所述的方法具体步骤包括：
a、对照品溶液：将莫西克汀对照品置于第一容量瓶中，加乙腈溶解、定容，备用；
b、供试品溶液：将与莫西克汀同等质量的供试品置于第二容量瓶中，加乙腈溶解、定容，备用；
c、设定液相色谱仪的参数条件：流动相A为0.25M醋酸铵溶液与乙腈的混合溶液，体积比是7:(2.5～3.5)，流动相B为乙腈，色谱柱的柱温控制在40～45℃，流速控制在1.0～1.5mL/min；
d、量取同体积的对照品溶液及供试品溶液注入液相色谱仪中进行洗脱，洗脱方式为：前十分钟流动相B为55％，中间十几分钟流动相B增加为65％，最后十分钟流动相B又降为55％；
e、按外标法计算得出莫西克汀的含量。
2.根据权利要求1所述的一种基于液相色谱仪检测莫西克汀含量的方法，其特征在于：所述的流动相A中0.25M醋酸铵溶液与乙腈的最佳体积比为7:3。
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