CN102781926A

CN102781926A - γ-丁内酯的生产方法

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Publication number: CN102781926A
Application number: CN201180009250.6A
Authority: CN
Inventors: J·范瓦尔森; E·安德森; J·利卡塔; K·A·斯帕克斯; W·R·法默; C·米尔利; J·A·比克梅尔; A·达姆布罗索; F·A·斯克拉利; T·M·拉姆塞尔; M·S·希瓦苏布拉玛尼安; Y·沙布泰
Original assignee: Metabolix Inc
Current assignee: CJ CheilJedang Corp; CJ Research Center LLC
Priority date: 2010-02-11
Filing date: 2011-02-11
Publication date: 2012-11-14
Anticipated expiration: 2031-02-11
Also published as: CA2788811A1; EP2534141B1; CA2788596A1; WO2011100601A8; EP2534125B9; BR112012020132A2; CN102781901A; WO2011100608A1; BR112012020299A8; WO2011100601A1; BR112012020132B1; RU2012132908A; US20130046075A1; CN102781901B; EP2534125A1; ES2647611T3; US9084467B2; RU2012133186A; US10786064B2; MX2012009134A

Abstract

本申请涉及用于制备基于生物的γ-丁内酯产物的方法，包括混合含有聚4-羟基-丁酸的遗传工程化的生物质和催化剂并加热该生物质和催化剂以将聚4-羟基-丁酸转化为γ-丁内酯产物。

Description

γ-丁内酯的生产方法

背景技术

随着日益减少的石油资源、日益增加的能量价格和环境问题，开发节省能量的生物精制方法来从可再生的、低成本的、碳资源生产基于生物的化学制品，会提供克服基于石油的化学制品的日益增加的限制的独特解决方案。

可以使用生物精制方法生产的、具有广泛工业和制药用途的一种化学制品是γ-丁内酯(GBL)。据估测，GBL的全球市场需求是8.5亿磅/年，换而言之，每年的总销售额是10亿美元。γ-丁内酯是一种无色的、弱气味的液体，主要用作下述商业上重要的化学制品的生产的中间体：诸如1，4-丁二醇(BDO)、四氢呋喃(THF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N-乙基吡咯烷酮(NEP)、2-吡咯烷酮、N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)诸如此类。这些化学制品可以用于高性能溶剂中，用于电子学、润滑油提取、磁性丝涂层、工程树脂、药物中间体、化妆品、喷发剂和高价值的聚合物。GBL本身具有许多用途，包括作为用于油漆剥离的溶剂、脱脂剂、聚氨酯的粘度调节剂、水溶性墨汁的分散剂、氨基甲酸酯和聚酰胺的固化剂、包被金属的塑料的蚀刻剂、橡胶添加剂和除草剂成分。

通过几种不同的化学方法来生产基于石油的GBL。例如，可以通过γ-羟基丁酸(GHB)的脱水，通过乙炔与甲醛的反应或马来酸酐或琥珀酸酐和它们的酯的汽相氢化合成它。后两种方法分别称作Reppe方法和Davy方法。Reppe方法形成于二十世纪四十年代，在历史上是制备1，4-丁二醇的第一种商业途径。该方法从使乙炔和甲醛一起反应开始，然后进行一系列氢化级，以得到BDO，最后脱氢，以产生GBL。该方法的主要缺点是，起始反应物是非常危险的，通常会带给生产商操作挑战和环境挑战。另外，乙炔是相对昂贵的原料。

Davy方法形成于二十世纪九十年代，该方法使用多级方法，从使熔化的马来酸酐与甲醇反应生成马来酸单甲酯开始。接着，在有酸性树脂催化剂存在下，将马来酸单甲酯从马来酸单甲酯转化成马来酸二甲酯。使用催化的汽相氢化，将马来酸二甲酯转化成琥珀酸二甲酯，最后通过一系列其它的反应，转化成GBL。精制终产物，以得到高纯度的GBL。许多专利描述了用于将马来酸酐或琥珀酸酐转化成GBL的不同类型的氢化催化剂。这些包括：亚铬酸铜(参见美国专利号3,065,243)、含有镍的亚铬酸铜(美国专利号4,006,165)和氧化铜、氧化锌或氧化铝的混合物(美国专利号5,347,021)以及还原的氧化铜和氧化铝混合物(美国专利号6,075,153)。

尽管大量氢化催化剂可用于GBL生产，存在需要克服的催化剂性能的缺陷，诸如产率、选择性、产物回收的容易性和成本。

因此，需要开发新的GBL生产方法，所述方法不仅解决了产率、纯度和生产成本的改进，而且使用对环境具有更积极影响的可持续的原料。

发明内容

本发明一般地涉及集成的生物精制方法，所述方法用于从可再生的碳资源生产高纯度的、高产率的、基于生物的γ-丁内酯(GBL)产物。在一个方面，描述了一种从经遗传工程化的微生物生物质生产γ-丁内酯(GBL)产物的方法，所述微生物生物质代谢葡萄糖或任何其它可再生的原料来在微生物细胞内生成4-羟基丁酸同聚物(P4HB)，随后与催化剂一起受控地加热含有P4HB的生物质，形成γ-丁内酯(GBL)产物。生物质中P4HB的水平应当大于总生物质的10重量％。该生物过程的优点是，它使用可再生的碳源作为原料，所述经遗传工程化的微生物以非常高的产率生产P4HB而对宿主细胞没有不利的毒性效应(这会限制过程效率)，且当与催化剂相混合并加热时，能够以高产率生产高纯度的基于生物的GBL。

在某些方面，来自宿主生物体的重组工程化的P4HB生物质充当可再生源用于将4-羟基丁酸同聚物转化成有用的中间体GBL。在有些实施方案中，可再生原料源选自：葡萄糖、果糖、蔗糖、阿拉伯糖、麦芽糖、乳糖、木糖、脂肪酸、植物油和生物质衍生出的合成气体或这些中的2种或更多种的组合。然后在有催化剂存在下处理生产的P4HB生物质，以生成γ-丁内酯(GBL)。在其它实施方案中，在与催化剂混合之前，干燥所述P4HB生物质。在特定实施方案中，所述方法另外包括：回收γ-丁内酯产物。在某些实施方案中，所述回收是通过浓缩。

在有些实施方案中，进一步加工所述GBL以用于生产其它希望的商品和专门产品，例如1，4-丁二醇(BDO)、四氢呋喃(THF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N-乙基吡咯烷酮(NEP)、2-吡咯烷酮、N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)等。

已经通过如下方式遗传修饰用于生产含有P4HB的生物质的宿主生物体：在野生型或经遗传工程化的P4HB生产生物体中导入基因和/或删除基因，从而建立从廉价的可再生的原料合成P4HB的菌株。在图1中提供了用于产生P4HB的一个示例性的途径，应当理解，也可以导入或抑制构成该途径的其它酶学变化以用于希望的P4HB生产。

在一个方面，本发明提供了一种用于生产基于生物的γ-丁内酯产物的方法。在某些实施方案中，产物中的γ-丁内酯具有100％的基于生物的碳含量(例如，基于¹⁴C同位素分析来测定)。所述方法包括：混合包含聚-4-羟基丁酸的经遗传工程化的生物质和催化剂；将所述生物质与催化剂一起加热，以将4-羟基丁酸转化成γ-丁内酯产物。在某些实施方案中，γ-丁内酯产物的产率是约85重量％或更大，这基于产物中的1克γ-丁内酯/克聚-4-羟基丁酸。所述经遗传工程化的重组宿主生产4-羟基丁酸聚合物。

在另一个方面，用于本发明的方法中的经遗传工程化的生物质来自具有聚-4-羟基丁酸途径的重组宿主，其中所述宿主在它的非CoA依赖的NAD依赖性的琥珀酸半醛脱氢酶基因或它的非CoA依赖的NADP依赖性的琥珀酸半醛脱氢酶基因中具有抑制性突变，或在两个基因中具有抑制性突变，且具有稳定地掺入的编码一种或多种选自下述的酶的一个或多个基因：琥珀酰-CoA:辅酶A转移酶，其中所述琥珀酰-CoA:辅酶A转移酶能够将琥珀酸转化成琥珀酰-CoA；琥珀酸半醛脱氢酶，其中所述琥珀酸半醛脱氢酶能够将琥珀酰-CoA转化成琥珀酸半醛；琥珀酸半醛还原酶，其中所述琥珀酸半醛还原酶能够将琥珀酸半醛转化成4-羟基丁酸；CoA转移酶，其中所述CoA转移酶能够将4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰基-CoA；和聚羟基链烷酸酯合酶，其中所述聚羟基链烷酸酯合酶能够将4-羟基丁酰基-CoA聚合成聚-4-羟基丁酸。在另一个方面，所述宿主具有2个或更多个、3个或更多个、4个或更多个或全部5个稳定掺入的、编码上面列出的酶的基因。

在本发明的另一个方面，用于本发明的方法中的经遗传工程化的生物质来自具有稳定地掺入的编码一种或多种选自下述的酶的一个或多个基因的重组宿主：磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其中所述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶能够将磷酸烯醇丙酮酸转化成草酰乙酸；异柠檬酸裂合酶，其中所述异柠檬酸裂合酶能够将异柠檬酸转化成乙醛酸；苹果酸合酶，其中所述苹果酸合酶能够将乙醛酸转化成苹果酸和琥珀酸；琥珀酸-CoA连接酶(形成ADP的)，其中所述琥珀酸-CoA连接酶(形成ADP的)能够将琥珀酸转化成琥珀酰-CoA；NADP依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶，其中所述NADP依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶能够将甘油醛3-磷酸转化成1，3-二磷酸甘油酸，形成NADPH+H⁺；NAD依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶，其中所述NAD依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶能够将甘油醛3-磷酸转化成1，3-二磷酸甘油酸，形成NADH+H⁺；丁酸激酶，其中所述丁酸激酶能够将4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰基-磷酸；磷酸丁酰基转移酶，其中所述磷酸丁酰基转移酶能够将4-羟基丁酰基-磷酸转化成4-羟基丁酰基-CoA；并任选地在选自下述的一个或多个基因中具有破坏：yneI、gabD、pykF、pykA、maeA和maeB。

在另一个方面，用于本发明的方法中的经遗传工程化的生物质来自这样的重组宿主，所述重组宿主具有聚-4-羟基丁酸途径，并稳定地表达编码2种或更多种酶的2个或更多个基因、编码3种或更多种酶的3个或更多个基因、编码4种或更多种酶的4个或更多个基因或编码5种或更多种酶的5个或更多个基因，所述酶选自：磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其中所述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶能够将磷酸烯醇丙酮酸转化成草酰乙酸；异柠檬酸裂合酶，其中所述异柠檬酸裂合酶能够将异柠檬酸转化成乙醛酸；苹果酸合酶，其中所述苹果酸合酶能够将乙醛酸转化成苹果酸和琥珀酸；NADP依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶，其中所述NADP依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶能够将甘油醛3-磷酸转化成1，3二磷酸甘油酸，形成NADPH+H；NAD依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶，其中所述NAD依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶能够将甘油醛3-磷酸转化成1，3二磷酸甘油酸，形成NADH+H；并任选地在选自下述的1个或多个基因、2个或更多个基因、3个或更多个基因、4个或更多个基因、5个或更多个基因或6个基因中具有破坏：yneI、gabD、pykF、pykA、maeA和maeB。

在另一个实施方案中，用于本发明的方法中的经遗传工程化的生物质来自具有聚-4-羟基丁酸途径的重组宿主，其中所述宿主在它的非CoA依赖的NAD依赖性的琥珀酸半醛脱氢酶基因或它的非CoA依赖的NADP依赖性的琥珀酸半醛脱氢酶基因中具有抑制性突变，或在两个基因中具有抑制性突变，且具有稳定地掺入的编码下述酶的基因：琥珀酰-CoA:辅酶A转移酶，其中所述琥珀酰-CoA:辅酶A转移酶能够将琥珀酸转化成琥珀酰-CoA；琥珀酸半醛脱氢酶，其中所述琥珀酸半醛脱氢酶能够将琥珀酰-CoA转化成琥珀酸半醛；琥珀酸半醛还原酶，其中所述琥珀酸半醛还原酶能够将琥珀酸半醛转化成4-羟基丁酸；CoA转移酶，其中所述CoA转移酶能够将4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰基-CoA；和聚羟基链烷酸酯合酶，其中所述聚羟基链烷酸酯合酶能够将4-羟基丁酰基-CoA聚合成聚-4-羟基丁酸。

在另一个实施方案中，用于本发明的方法中的经遗传工程化的生物质来自具有稳定地掺入的编码下述酶的基因的重组宿主：磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其中所述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶能够将磷酸烯醇丙酮酸转化成草酰乙酸；异柠檬酸裂合酶，其中所述异柠檬酸裂合酶能够将异柠檬酸转化成乙醛酸；苹果酸合酶，其中所述苹果酸合酶能够将乙醛酸转化成苹果酸和琥珀酸；琥珀酸-CoA连接酶(形成ADP的)，其中所述琥珀酸-CoA连接酶(形成ADP的)能够将琥珀酸转化成琥珀酰-CoA；NADP依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶，其中所述NADP依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶能够将甘油醛3-磷酸转化成1，3-二磷酸甘油酸，形成NADPH+H⁺；NAD依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶，其中所述NAD依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶能够将甘油醛3-磷酸转化成1，3-二磷酸甘油酸，形成NADH+H⁺；丁酸激酶，其中所述丁酸激酶能够将4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰基-磷酸；磷酸丁酰基转移酶，其中所述磷酸丁酰基转移酶能够将4-羟基丁酰基-磷酸转化成4-羟基丁酰基-CoA；并任选地在选自下述的一个或多个基因中具有破坏：yneI、gabD、pykF、pykA、maeA和maeB。

在某些实施方案中，其中用于本发明的方法中的经遗传工程化的生物质来自具有聚-4-羟基丁酸途径的重组宿主，其中所述宿主具有稳定地掺入的、编码一种或多种选自下述的酶的一个或多个基因：琥珀酰-CoA:辅酶A转移酶，其中所述琥珀酰-CoA:辅酶A转移酶能够将琥珀酸转化成琥珀酰-CoA；琥珀酸半醛脱氢酶，其中所述琥珀酸半醛脱氢酶能够将琥珀酰-CoA转化成琥珀酸半醛；琥珀酸半醛还原酶，其中所述琥珀酸半醛还原酶能够将琥珀酸半醛转化成4-羟基丁酸；CoA转移酶，其中所述CoA转移酶能够将4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰基-CoA；和聚羟基链烷酸酯合酶，其中所述聚羟基链烷酸酯合酶能够将4-羟基丁酰基-CoA聚合成聚-4-羟基丁酸。

在其它实施方案中，用于本发明的方法中的经遗传工程化的生物质来自具有稳定地掺入的编码一种或多种选自下述的酶的一个或多个基因的重组宿主：磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其中所述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶能够将磷酸烯醇丙酮酸转化成草酰乙酸；异柠檬酸裂合酶，其中所述异柠檬酸裂合酶能够将异柠檬酸转化成乙醛酸；苹果酸合酶，其中所述苹果酸合酶能够将乙醛酸转化成苹果酸和琥珀酸；琥珀酸-CoA连接酶(形成ADP的)，其中所述琥珀酸-CoA连接酶(形成ADP的)能够将琥珀酸转化成琥珀酰-CoA；NADP依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶，其中所述NADP依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶能够将甘油醛3-磷酸转化成1，3-二磷酸甘油酸，形成NADPH+H⁺；NAD依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶，其中所述NAD依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶能够将甘油醛3-磷酸转化成1，3-二磷酸甘油酸，形成NADH+H⁺；丁酸激酶，其中所述丁酸激酶能够将4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰基-磷酸；磷酸丁酰基转移酶，其中所述磷酸丁酰基转移酶能够将4-羟基丁酰基-磷酸转化成4-羟基丁酰基-CoA；并任选地在选自下述的一个或多个基因中具有破坏：yneI、gabD、pykF、pykA、maeA和maeB。

在本发明的一个特定方面，使用可再生的原料培养重组宿主，以生产4-羟基丁酸生物质，然后在有催化剂存在下处理生产的生物质，以生产γ-丁内酯(GBL)产物，其中γ-丁内酯产物的产率是约85重量％。

在某些实施方案中，可再生的原料源是选自：葡萄糖、果糖、蔗糖、阿拉伯糖、麦芽糖、乳糖、木糖、脂肪酸、植物油和生物质衍生出的合成气体或它们的组合。

本发明也涉及通过本文所述的方法生产的基于生物的γ-丁内酯产物。在某些方面，生产的产物中的γ-丁内酯的量是85％或大于85％。在另一个方面，本发明涉及从可再生资源生产的聚-4-羟基丁酸生物质，所述聚-4-羟基丁酸生物质适合作为用于生产γ-丁内酯产物的原料，其中所述生物质中的聚-4-羟基丁酸水平大于生物质的50重量％。

在本发明的某些实施方案中，所述生物质宿主是细菌、酵母、真菌、藻类、蓝细菌或它们中的任意2种或更多种的混合物。所述细菌包括、但不限于：大肠杆菌、真养产碱菌(Alcaligenes eutrophus，重命名为真养产碱杆菌(Ralstonia eutropha))、芽孢杆菌属(Bacillus spp.)、广泛产碱菌(Alcaligenes latus)、固氮菌属(Azotobacter)、气单胞菌属(Aeromonas)、丛毛平胞菌属(Comamonas)、假单胞菌(Pseudomonads)、假单胞菌属(Pseudomonas)、罗尔斯通氏菌属(Ralstonia)、克雷伯菌属(Klebsiella)、聚球藻属(Synechococcus sp.)PCC7002、聚球藻属PCC 7942、集胞藻属(Synechocystis sp.)PCC 6803和嗜热蓝细菌聚球藻(Thermosynechococcus elongatus)BP-I(蓝细菌)、微温绿硫菌(Chlorobium tepidum)(绿硫细菌)、Chloroflexus auranticus(绿非硫细菌)、微温着色菌(Chromatium tepidum)和酒色着色菌(Chromatiumvinosum)(紫色硫细菌)、深红红螺菌(Rhodospirillum rubrum)、荚膜红细菌(Rhodobacter capsulatus)和沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)。在其它实施方案中，所述重组宿主是藻类。所述藻类包括、但不限于：微小小球藻(Chlorella minutissima)、浮水小球藻(Chlorella emersonii)、富油小球藻(Chlorella sorokiniana)、椭圆形小球藻(Chlorella ellipsoidea)、小球藻属(Chlorella sp.)或原始小球藻(Chlorella protothecoides)。

在本发明的某些实施方案中，所述加热是在下述温度下：约100℃至约350℃，或约200℃至约350℃，或约225℃至300℃。在有些实施方案中，所述加热会将生物质的水含量降低至约5重量％或更低。在所述的实施方案中，所述加热持续约30秒至约5分钟的时间段，或是约5分钟至约2小时。在某些实施方案中，所述γ-丁内酯包含小于5％的不希望的副产物。在某些实施方案中，所述催化剂是碳酸钠或氢氧化钙。催化剂的重量百分比是在约4％至约50％的范围内。在具体实施方案中，催化剂的重量百分比是在约4％至约50％的范围内，且所述加热是在约300℃下。在某些实施方案中，进一步回收γ-丁内酯产物。在有些实施方案中，所述催化剂是4重量％的氢氧化钙，且所述加热是在300℃的温度下。

另外，已消费的(残余的)PHA减少的生物质进一步用于能源开发，例如用作燃料，以产生过程蒸汽和/或热。

附图说明

从在附图中图解的本发明的示例实施方案的以下更具体的描述会明白前述内容，在所述附图中，同样的参考符号表示在不同的视图中的相同部分。所述附图不一定按照比例绘制，而是重点在于图解本发明的实施方案。

图1是示例性的大肠杆菌中心代谢途径的示意图，它显示了在实施例中修饰的或导入的或者可以修饰的反应。在图中的编号表示在表1A中的反应编号。用“X”标记通过删除对应的基因而消除的反应。缩写：“GA3P”，D-甘油醛-3-磷酸；“G1，3P”，1，3-二磷酸甘油酸；“PEP”，磷酸烯醇丙酮酸；“PYR”，丙酮酸；“AcCoA”，乙酰辅酶A；“CIT”，柠檬酸；“ICT”，异柠檬酸；“αKG”，α-酮戊二酸；“SUC-CoA”，琥珀酰CoA；“SUC”，琥珀酸；“Fum”，富马酸；“MAL”，L-苹果酸；“OAA”，草酰乙酸；“SSA”，琥珀酸半醛；“4HB”，4-羟基丁酸；“4HB-CoA”，4-羟基丁酰基CoA；“P4HB”，聚-4-羟基丁酸。编号的反应：“1”，甘油醛-3-磷酸脱氢酶；“2”，丙酮酸激酶；“3”，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶；“4”，苹果酸酶；“5”，异柠檬酸裂合酶；“6”，苹果酸脱氢酶；“7”，琥珀酸半醛脱氢酶；“8”，α-酮戊二酸脱羧酶；“9”，琥珀酸半醛还原酶；“10”，CoA转移酶；“11”，聚羟基链烷酸酯合酶；“12”，琥珀酸半醛脱氢酶，NADP+依赖性的。

图2根据不同的实施方案从生物质回收GBL而将残余物转化成固体燃料的示意图。

图3是根据不同的实施方案在不加入石灰(实线)和加入5％石灰(虚线)时干燥的P4HB发酵液在300℃在N₂中的重量减轻相对于时间的曲线。该曲线显示了重量减轻斜率和重量减轻完成的开始时间。

图4(A-C)是根据一个实施方案在300℃热解以后的P4HB纯聚合物、P4HB干燥发酵液和P4HB干燥发酵液+5％石灰(Ca(OH)₂)催化剂的一系列气相色谱图。

图5是根据一个实施方案在6.2min处的GC-MS峰与GBL(γ-丁内酯)的质谱文库匹配。

图6是根据一个实施方案在11.1min处的GC-MS峰与GBL二聚体的质谱文库匹配。

图7是用于P4HB生物质的大规模热解的装置的示意图。

具体实施方式

下面描述了本发明的示例实施方案。

本发明提供了用于从生产聚-4-羟基丁酸聚合物的经遗传工程化的微生物(P4HB生物质)生产基于生物的γ-丁内酯(GBL)的工艺和方法。为了本发明的目的，将P4HB定义为也包括4-羟基丁酸与3-羟基丁酸的共聚物，其中4-羟基丁酸在共聚物中的百分比大于共聚物中单体的80％、85％、90％，优选地大于95％。在某些实施方案中，使用本文所述的重组宿主，通过改良的P4HB生产工艺来生产P4HB生物质。通过操纵(例如，抑制和/或过表达)P4HB途径中的某些基因来增加P4HB在生物质中的产率，已经遗传地构建这些重组宿主，以增加P4HB的产率。在发酵过程中生产P4HB生物质，其中给经遗传工程化的微生物供给可再生底物。可再生底物包括：从植物作物材料生产的发酵原料，诸如糖类、植物油、脂肪酸或合成气体。从糖底物生产的生物质中的P4HB水平是生物质的总干重的大于10％(例如，约20％、约30％、约40％、约50％、约60％、约70％、约80％)。然后将P4HB生物质与催化剂混合，并加热，以将P4HB热分解成基于生物的GBL。

本文描述了一种用于生产GBL的替代方法，所述方法基于使用可再生的碳源来在生物质中生产基于生物的聚-4-羟基丁酸(P4HB)聚合物，然后将其转化成基于生物的γ-丁内酯。

基于生物的、可生物降解的聚合物诸如聚羟基链烷酸酯(PHA)在生物质系统中天然地生成，诸如微生物生物质(例如，包括蓝细菌在内的细菌、酵母、真菌)、植物生物质或藻类生物质。已经开发了遗传修饰的生物质系统，所述系统以高产率生产多种可生物降解的PHA聚合物和共聚物(Lee(1996)，Biotechnology&Bioengineering 49：1-14；Braunegg等人(1998)，J.Biotechnology 65：127-161；Madison，L.L.和Huisman，G.W.(1999)，Metabolic Engineering ofPoly-3-Hydroxyalkanoates；From DNA to Plastic，见：Microbiol.Mol.Biol.Rev.63：21-53)。众所周知PHA聚合物是热不稳定的化合物，当被加热至和超过它们的熔点时会容易地降解(Cornelissen等人，Fuel，87，2523，2008)。当该聚合物加工用于塑料用途时，这通常是一个限制因素，但是，可以对其加以影响以建立从100％可再生资源开始的基于生物的、化学生产方法。

当将纯的聚-4-羟基丁酸(P4HB)(使用石油衍生的1，4-丁二醇生产)加热至250-350℃时，它通过聚合物链的解链而专门地热降解成挥发性的GBL(Kim等人(2006)，Polymer Degradation and Stability，91：2333-2341)。如本文所述，将低成本的催化剂加入具有增加的P4HB产量的经遗传工程化的生物质以加速向γ-丁内酯的降解反应。回收γ-丁内酯，且廉价的催化剂可以遗留在残余的生物质一起或者可以任选地在适当的再生(包括热再生)以后再循环利用到该方法中。将催化剂反应物与特别地遗传修饰的、高产率地生产P4HB的生物质相混合是对于传统的基于石油的方法的经济的且环境友好的替代方法。

具有用于生产P4HB的代谢途径的重组宿主

作为改良的和新材料的生产平台的宿主(例如，细菌、真菌、藻类、植物等)的基因工程提供了用于生产化学制品的高价值的、环境友好的工业应用的可持续解决方案。本文描述了从遗传修饰的重组聚羟基链烷酸酯P4HB生物质生产基于生物的γ-丁内酯的工艺方法。本文所述的方法通过在培养后或收获后生产基于生物的化学制品来避免对宿主生物体的毒性效应，是节省成本的且高效的(例如，使用更少的能量来制备)，减少温室气体排放，使用可再生资源，且可以进一步加工以从GBL高产率地生产高纯度产物。

在本文所述的方法中使用的PHA生物质进行遗传工程化以生产聚-4-羟基丁酸(P4HB)。在图1中提供了用于生产P4HB的一个示例性的途径，在下面提供了所述途径、生产P4HB生物质的重组宿主的更详细描述。所述途径可以工程化以增加来自碳进料源的P4HB产量。

本文使用的“P4HB生物质”意图指来自重组宿主(例如，细菌)的任何经遗传工程化的生物质，所述生物质包括非天然存在量的聚羟基链烷酸聚合物例如聚-4-羟基丁酸(P4HB)。在有些实施方案中，P4HB生物质的来源是细菌、酵母、真菌、藻类、植物作物、蓝细菌或它们中的任意2种或更多种的混合物。在某些实施方案中，与没有过表达或抑制P4HB途径中的一个或多个基因的宿主相比，P4HB的生物质滴度(g/L)已经增加。在某些实施方案中，所述P4HB滴度被报告为干细胞重量百分比(％dcw)或P4HB克数/Kg生物质。

“过表达”表示由导入宿主细胞中的DNA编码的多肽或蛋白的表达，其中所述多肽或蛋白通常不存在于宿主细胞中，或其中所述多肽或蛋白以比编码所述多肽或蛋白的内源基因通常表达的水平更高的水平存在于宿主细胞中。“抑制”或“下调”表示编码多肽或蛋白的基因的抑制或删除。在有些实施方案中，抑制是指灭活产生该途径中的酶的基因。在某些实施方案中，从异源生物体导入所述基因。

已经开发了使用快速生长的宿主(诸如大肠杆菌)的经遗传工程化的微生物PHA生产系统。在某些实施方案中，基因工程也允许修饰野生型微生物以提高P4HB聚合物的生产。在Steinbuchel&Valentin，FEMSMicrobiol.Lett.128：219-28(1995)中描述了PHA产生修饰的实例。PCT公开号WO 98/04713描述了用于控制分子量的方法，其中使用基因工程来控制PHA合酶的水平。在Lee，Biotechnology&Bioengineering，49：1-14(1996)和Braunegg等人，(1998)，J.Biotechnology 65：127-161中，公开了用于生产PHA的、商业上有用的菌株，包括真养产碱菌(重命名为真养产碱杆菌)、广泛产碱菌、维涅兰德固氮菌(Azotobactervinlandii)和假单胞菌。美国专利号6,316,262、7,229,804、6,759,219和6,689,589描述了用于生产含有4-羟酸的PHA聚合物的生物系统，它们通过引用并入本文。

尽管已经报道从可再生资源(诸如糖或氨基酸)生产4-羟基丁酸共聚物，从可度量的可再生底物生产的共聚物中4HB的水平远远小于共聚物中单体的50％，因此不适用于实施所公开的发明。之前尚未实现使用可再生资源、使用工程化的微生物生产P4HB生物质，其中生物质中的P4HB水平足以实施公开的发明(即，大于总生物质干重的40％、50％、60％或65％)。

野生型生物质中的PHA重量百分比随生物质的来源而变化。对于通过发酵过程从基于可再生资源的原料(诸如糖类、植物油或甘油)生产的微生物系统，野生型生物质中的PHA的量可以是生物质总重量的约65重量％或更多。对于植物作物系统、尤其是生物质作物(诸如甘蔗或柳枝稷)，PHA的量可以是生物质总重量的约3％或更多。对于藻类或蓝细菌系统，PHA的量可以是生物质总重量的约40％或更多。

在本发明的某些方面，所述重组宿主已经被遗传工程化，以与野生型宿主相比生产增加的量的P4HB。野生型P4HB生物质是指生物体通常在自然界中生产的P4HB的量。

例如，在某些实施方案中，所述P4HB与野生型相比增加了约20％至约90％，或约50％至约80％。在其它实施方案中，所述重组宿主生产的P4HB与野生型相比增加了至少约20％，与野生型相比增加了至少约30％，与野生型相比增加了至少约40％，与野生型相比增加了至少约50％，与野生型相比增加了至少约60％，与野生型相比增加了至少约70％，与野生型相比增加了至少约75％，与野生型相比增加了至少约80％，或与野生型相比增加了至少约90％。在其它实施方案中，与野生型宿主生产的量相比，所述P4HB增加了约2倍至约400倍。根据在Doi，Microbial Polyesters，John Wiley&Sons，第24页，1990中所述的方法，通过气相色谱法测定宿主或植物中的P4HB的量。在某些实施方案中，实现了100-120g P4HB/Kg生物质的生物质滴度。在其它实施方案中，将P4HB滴度的量表示为干细胞重量百分比(％dcw)。

合适的宿主菌株

在某些实施方案中，宿主菌株是大肠杆菌K-12菌株LS5218(Spratt等人，J.Bacteriol.146(3)：1166-1169(1981)；Jenkins和Nunn，J.Bacteriol.169(1)：42-52(1987))。其它合适的大肠杆菌K-12宿主菌株包括、但不限于：MG1655(Guyer等人，Cold Spr.Harb.Symp.Quant.Biol.45：135-140(1981))、WG1和W3110(Bachmann Bacteriol.Rev.36(4)：525-57(1972))。或者，大肠杆菌菌株W(Archer等人，BMCGenomics 2011，12：9doi：10.1186/1471-2164-12-9)或大肠杆菌菌株B(Delbruck和Luria，Arch.Biochem.1：111-141(1946))和它们的衍生物诸如REL606(Lenski等人，Am.Nat.138：1315-1341(1991))是其它合适的大肠杆菌宿主菌株。

其它示例性的微生物宿主菌株包括、但不限于：真养产碱杆菌、Zoogloea ramigera、Allochromatium vinosum、赤红球菌(Rhodococcusruber)、食酸代尔夫特菌(Delftia acidovorans)、豚鼠气单胞菌(Aeromonas caviae)、集胞藻属PCC 6803、Synechococcus elongatusPCC 7942、普氏荚硫菌(Thiocapsa pfenigii)、巨大芽孢杆菌(Bacillusmegaterium)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumannii)、Acinetobacterbaylyi、克鲁氏梭状芽孢杆菌(Clostridium kluyveri)、甲基营养菌(Methylobacterium extorquens)、Nocardia corralina、橙红诺卡菌(Nocardia salmonicolor)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、食油假单胞菌(Pseudomonas oleovorans)、假单胞菌属6-19、假单胞菌属61-3和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、球形红杆菌(Rhodobacter sphaeroides)、广泛产碱菌、催产克雷白杆菌(催产克雷白杆菌)、产琥珀酸厌氧螺菌(Anaerobiospirillum succiniciproducens)、产琥珀酸放线杆菌(Actinobacillus succinogenes)、Mannheimiasucciniciproducens、Rhizobium etli、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、氧化葡萄糖菌(Gluconobacter oxydans)、运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)、乳乳球菌(Lactococcus lactis)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、天蓝色链霉菌(Streptomyces coelicolor)和丙酮丁醇梭杆菌(Clostridiumacetobutylicum)。示例性的酵母或真菌包括选自下述的物种：酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe)、乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、马克思克鲁维酵母(Kluyveromyces marxianus)、土曲霉(Aspergillus terreus)、黑曲霉(Aspergillus niger)和巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)。

示例性的藻类菌株物种包括、但不限于：小球藻属菌株物种，其选自：微小小球藻(Chlorella minutissima)、浮水小球藻(Chlorellaemersonii)、富油小球藻(Chlorella sorokiniana)、椭圆形小球藻、小球藻属或原始小球藻。

重组基因的来源

P4HB途径酶的编码核酸的来源可以包括，例如，任意物种，其中编码的基因产物能够催化所提及的反应。这样的物种包括：原核和真核生物体，包括、但不限于，细菌，包括古细菌和真细菌，和真核生物，包括酵母、植物、昆虫、动物和哺乳动物，包括人。这种来源的示例性物种包括，例如，大肠杆菌、酿酒酵母、克鲁氏酵母菌、克鲁氏梭状芽孢杆菌、丙酮丁醇梭杆菌、拜氏梭菌、Clostridiumsaccharoperbutylacetonicum、Clostridium perjringens、难辨梭菌、肉毒梭菌、酪丁酸梭菌、破伤风形梭菌(Clostridium tetanomorphum)、破伤风梭菌(Clostridium tetani)、丙酸梭菌、Clostridium aminobutyricum、近端梭菌、斯蒂克兰德梭菌、真养产碱杆菌、牛分枝杆菌、结核分枝杆菌、龈紫单胞菌、拟南芥、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、假单胞菌属物种，包括铜绿假单孢菌、恶臭假单胞菌、施氏假单胞菌、荧光假单胞菌、微小小球藻、浮水小球藻、富油小球藻、椭圆形小球藻、小球藻属、原始小球藻、智人、日本大耳白兔、Rhodobacter spaeroides、Thermoanaerobacter brockii、Metallosphaera sedula、肠膜明串珠菌、ChloroJlexus aurantiacus、Roseiflexus castenholzii、赤杆菌属、好好霸树(Simmondsia chinensis)、不动杆菌属包括醋酸钙不动杆菌和Acinetobacter baylyi、龈紫单胞菌、Sulfolobus tokodaii、Sulfolobussolfataricus、酸热硫化叶菌、枯草芽孢杆菌、蜡状芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、短芽孢杆菌、短小芽胞杆菌、褐家鼠、克雷伯菌肺炎、催产克雷白杆菌、小眼虫(Euglena gracilis)、齿垢密螺旋体(Treponema denticola)、Moorella thermoacetica、喜温海洋杆菌(Thermotoga maritima)、Halobacterium salinarum、嗜热脂肪土芽孢杆菌、Aeropyrum pernix、野猪、漂亮新小杆线虫(Caenorhabditis elegans)、谷氨酸棒杆菌、发酵氨基酸球菌(Acidaminococcus fermentans)、乳乳球菌(Lactococcuslactis)、植物乳杆菌、嗜热链球菌、产气肠杆菌、念珠菌属、土曲霉、Pedicoccus pentosaceus、Zymomonas mobilus、Acetobacter pasteurians、乳酸克鲁维酵母、Eubacterium barkeri、多毛拟杆菌、Anaerotruncuscolihominis、Natranaerobius thermophilusm、空肠弯曲杆菌、流感嗜血杆菌、粘质沙雷菌、丙二酸盐阴性柠檬酸杆菌、黄色粘球菌、Fusobacteriumnuleatum、产黄青霉海洋γ变形杆菌和生产丁酸的细菌。例如，具有P4HB生物合成生产的微生物宿主(例如，生物体)在本文中用大肠杆菌宿主来例证。但是，目前可得到超过550个物种的完整基因组序列(它们中超过半数可在公开的数据库诸如NCBI上得到)，包括395个微生物基因组和多种酵母、真菌、植物和哺乳动物基因组，从相近的或远亲的物种的一个或多个基因中鉴别出编码必需的P4HB生物合成活性的基因(包括，例如，已知基因的同系物、直系同源物、旁系同源物和非直系同源基因置换，以及生物体之间的遗传改变的交换)，是本领域常规的和众所周知的。因此，能够使特定生物体(诸如大肠杆菌)生物合成本文所述的本发明的P4HB和其它化合物的代谢改变，可以容易地应用于其它微生物，包括原核和真核生物体等。鉴于本文提供的教导和指南，本领域技术人员会知道，在一种生物体中例证的代谢改变同样可以应用于其它生物体。

用于生产4HB的转基因宿主的产生

使用本领域已知的常规技术，遗传工程化用于生产P4HB的转基因的(重组的)宿主。在下面的表1A中显示了克隆的基因，和/或评估了生产含有P4HB的PHA和4-碳化学制品的宿主菌株，以及适当的酶委员会编号(EC编号)和索引。为了密码子优化合成了一些基因，而其它基因经由PCR从天然的或野生型宿主的基因组DNA中克隆。本文使用的“异源”是指来自另一个宿主。所述宿主可以是相同的或不同的物种。图1是用于生产P4HB的示例性的途径。

表1A.生产含有P4HB的PHA和4-碳化学制品的微生物宿主菌株中的基因。在基因名称后面的星号(*)表示为了在大肠杆菌中表达对核苷酸序列进行了优化。

通过查阅科学文献、专利，或通过例如针对NCBI的核苷酸或蛋白数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/)进行BLAST检索，可以发现能够催化在表1A中列出的反应的其它蛋白。然后可以制备合成的基因，以提供从序列数据库至物理DNA的容易途径。在上述基础上设计和制备这样的合成的基因，使用密码子来增强异源蛋白表达，优化表达系统和宿主所需的特征。例如DNA 2.0(Menlo Park，CA 94025，USA)等公司会提供这样的常规服务。在表1B-1Z中提供了可以催化在表1A中列出的一些生化反应的蛋白。

表1B.GapA蛋白(甘油醛3-磷酸脱氢酶-A，来自大肠杆菌，EC No.1.2.1.12，其作用于D-甘油醛3-磷酸以生成1，3-二磷酸甘油酸；蛋白登录号NP_416293.1)的合适同系物

表1C.Gdp1蛋白(甘油醛3-磷酸脱氢酶，来自乳酸克鲁维酵母，EC No.1.2.1.12，其作用于D-甘油醛3-磷酸以生成1，3-二磷酸甘油酸；蛋白登录号XP_455496)的合适同系物

表1D.Gap2蛋白(甘油醛-3-磷酸脱氢酶(NADP+)(磷酸化)，来自集胞藻属，EC No.1.2.1.59，其作用于D-甘油醛3-磷酸以生成1，3-二磷酸甘油酸；蛋白登录号CAA58550)的合适的同系物

表1E.GapB蛋白(甘油醛-3-磷酸脱氢酶2，来自枯草芽孢杆菌，ECNo.1.2.1.59，其作用于D-甘油醛3-磷酸以生成1，3-二磷酸甘油酸；蛋白登录号NP_390780)的合适的同系物

表1F.GapN蛋白(假定的NADP依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶，来自酿脓链球菌，EC No.1.2.1.12，其作用于D-甘油醛3-磷酸以生成1，3-二磷酸甘油酸；蛋白登录号NP_664849)的合适的同系物

表1G.Ppc蛋白(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，来自大肠杆菌，EC No.4.1.1.31，其作用于磷酸烯醇丙酮酸和二氧化碳以生成草酰乙酸；蛋白登录号NP_418391)的合适的同系物

表1H.Ppc蛋白(磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，来自紫苜蓿，EC No.4.1.1.31，其作用于磷酸烯醇丙酮酸和二氧化碳以生成草酰乙酸；蛋白登录号Q02909)的合适的同系物

表1I.AceA蛋白(异柠檬酸裂合酶，来自大肠杆菌K-12，EC No.4.1.3.1，其作用于异柠檬酸以生成乙醛酸和琥珀酸；蛋白登录号NP_418439)的合适的同系物

表1J.AceB蛋白(苹果酸合酶A，来自大肠杆菌K-12，EC No.2.3.3.9，其作用于乙醛酸和乙酰辅酶A以生成苹果酸；蛋白登录号NP_418438)的合适的同系物

表1K.SucD蛋白(琥珀酸半醛脱氢酶，来自克鲁氏梭状芽孢杆菌，EC No.1.2.1.76，其作用于琥珀酰-CoA以生成琥珀酸半醛；蛋白登录号YP_001396394)的合适的同系物

表1L.KgdM蛋白(α-酮戊二酸脱羧酶，来自结核分枝杆菌，EC No.4.1.1.71，其作用于α-酮戊二酸以生成琥珀酸半醛和二氧化碳；蛋白登录号NP_335730)的合适的同系物

表1M.SsaR_At蛋白(琥珀酸半醛还原酶，来自拟南芥，EC No.1.1.1.61，其作用于琥珀酸半醛以生成4-羟基丁酸；蛋白登录号AAK94781)的合适的同系物

表1N.4hbD蛋白(琥珀酸半醛还原酶，来自克鲁氏梭状芽孢杆菌，EC No.1.1.1.61，其作用于琥珀酸半醛以生成4-羟基丁酸；蛋白登录号YP_001396393)的合适的同系物

表1O.SsaR_At2蛋白(琥珀酸半醛还原酶，来自土曲霉，EC No.1.1.1.61，其作用于琥珀酸半醛以生成4-羟基丁酸；蛋白登录号XP_001210625)的合适的同系物

表1P.SsaR_Mm蛋白(琥珀酸半醛还原酶，来自小家鼠，EC No.1.1.1.61，其作用于琥珀酸半醛以生成4-羟基丁酸；蛋白登录号AKR7A5)的合适的同系物

表1Q.YqhD蛋白(琥珀酸半醛还原酶，来自大肠杆菌K-12，EC No.1.1.1.61，其作用于琥珀酸半醛以生成4-羟基丁酸；蛋白登录号NP_417484)的合适的同系物

表1R.OrfZ蛋白(CoA转移酶，来自克鲁氏梭状芽孢杆菌DSM 555，EC No.2.8.3.n，其作用于4-羟基丁酸以生成4-羟基丁酰基CoA；蛋白登录号AAA92344)的合适的同系物

表1S.PhaC1蛋白(聚羟基链烷酸酯合酶，来自真养产碱杆菌H16，EC No.2.3.1.n，其作用于(R)-3-羟基丁酰基-CoA或4-羟基丁酰基-CoA+[(R)-3-羟基丁酸-共聚-4-羟基丁酸]_n以生成[(R)-3-羟基丁酸-共聚-4-羟基丁酸]_(n+1)+CoA，且也作用于4-羟基丁酰基-CoA+[4-羟基丁酸]_n以生成[4-羟基丁酸]_(n+1)+CoA；蛋白登录号YP_725940(Peoples和Sinskey，J.Biol.Chem.264：15298-15303(1989)))的合适的同系物

表1T.PhaC3/C1蛋白(聚羟基链烷酸酯合酶融合蛋白，来自恶臭假单胞菌和真养产碱杆菌JMP134，EC No.2.3.1.n，其作用于(R)-3-羟基丁酰基-CoA或4-羟基丁酰基-CoA+[(R)-3-羟基丁酸-共聚-4-羟基丁酸]_n以生成[(R)-3-羟基丁酸-共聚-4-羟基丁酸]_(n+1)+CoA，且也作用于4-羟基丁酰基-CoA+[4-羟基丁酸]_n以生成[4-羟基丁酸]_(n+1)+CoA)的合适的同系物

表1U.Buk1蛋白(丁酸激酶I，来自丙酮丁醇梭杆菌ATCC824，EC No.2.7.2.7，其作用于4-羟基丁酸以生成4-羟基丁酰基磷酸)的合适的同系物

表1V.Buk2蛋白(丁酸激酶II，来自丙酮丁醇梭杆菌ATCC824，EC No.2.7.2.7，其作用于4-羟基丁酸以生成4-羟基丁酰基磷酸)的合适的同系物

表1W.Ptb蛋白(磷酸丁酰基转移酶，来自丙酮丁醇梭杆菌ATCC824，EC No.2.3.1.19，其作用于4-羟基丁酰基磷酸以生成4-羟基丁酰基CoA)的合适的同系物

表1X.SucC蛋白(琥珀酸-CoA连接酶(形成ADP的)，β亚基，来自大肠杆菌K-12，EC No.6.2.1.5，其作用于琥珀酸和CoA以生成琥珀酰-CoA)的合适的同系物

表1Y.SucD蛋白(琥珀酸-CoA连接酶(形成ADP的)，α亚基，来自大肠杆菌K-12，EC No.6.2.1.5，其作用于琥珀酸和CoA以生成琥珀酰-CoA)的合适的同系物

表1Z.Cat1蛋白(琥珀酰-CoA:辅酶A转移酶，来自克鲁氏梭状芽孢杆菌DSM 555，EC No.2.8.3.n，其作用于琥珀酸和乙酰辅酶A以生成琥珀酰-CoA和乙酸)的合适的同系物

合适的染色体外载体和质粒

本文使用的“载体”是染色体外复制子，诸如质粒、噬菌体或粘粒，其中可以插入另一个DNA区段，从而实现插入的区段的复制。载体的拷贝数可以变化，且取决于它们含有的复制起点、它们的大小和插入片段的大小。可以在相同的微生物细胞中繁殖具有不同复制起点的载体，除非它们密切相关，诸如pMB1和ColE1。适用于表达重组蛋白的载体可以构成：具有500-700个拷贝/细胞的、含有pMB1复制起点的pUC载体，具有300-500个拷贝/细胞的、含有ColE1复制起点的pBluescript载体，具有15-20个拷贝/细胞的、含有pMB1复制起点的pBR322和衍生物，具有10-12个拷贝/细胞的、含有p15A复制起点的pACYC和衍生物，和具有约5个拷贝/细胞的、含有pSC101复制起点的pSC101和衍生物，如在QIAGEN

质粒纯化手册(参见万维网：//kirshner.med.harvard.edu/files/protocols/QIAGEN_QIAGENPlasmidPurification_EN.pdf)中所述。

重组基因表达的合适策略和表达控制序列

已经在文献中广泛地描述了用于在大肠杆菌中实现重组基因表达的策略(Gross，Chimica Oggi 7(3)：21-29(1989)；Olins和Lee，Cur.Op.Biotech.4：520-525(1993)；Makrides，Microbiol.Rev.60(3)：512-538(1996)；Hannig和Makrides，Trends in Biotech.16：54-60(1998))。表达控制序列可以包括组成型和诱导型启动子、转录增强子、转录终止子等，它们是本领域众所周知的。合适的启动子包括、但不限于：P_lac、P_tac、P_trc、P_R、P_L、P_trp、P_phoA、P_ara、P_uspA、P_rspU、P_syn(Rosenberg和Court，Ann.Rev.Genet.13：319-353(1979)；Hawley和McClure，Nucl.Acids Res.11(8)：2237-2255(1983)；Harley和Raynolds，Nucl.Acids Res.15：2343-2361(1987)；以及ecocyc.org和partsregistry.org)。

重组宿主的构建

可以使用本领域众所周知的技术构建重组宿主，所述重组宿主含有编码将碳底物转化成P4HB的酶途径的必需基因。

从源生物体(宿主)得到目标基因的方法是分子生物学领域常见的和众所周知的。这样的方法可以参见：例如，Sambrook等人，MolecularCloning：A Laboratory Manual，第3版，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(2001)；Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley and Sons，Baltimore，MD(1999)。例如，如果已知基因的序列，可以使用对目标基因特异性的引物，使用聚合酶链式反应(Mullis，美国专利号4,683.202)，从基因组DNA扩增DNA，以得到适合连接进适当载体中的DNA量。或者，可以从头化学地合成目标基因，以便考虑宿主生物体的密码子偏爱，以增强异源蛋白表达。使用含有这种序列的工程化的引物，经由聚合酶链式反应，可以将表达控制序列(诸如启动子和转录终止子)连接至目标基因上。另一种方法是，通过限制性核酸内切酶消化和连接，将分离的基因以适当的次序导入已经含有必要的控制序列的载体中。该后一种方案的一个实例是BioBrick^TM技术(参见环球网biobricks.org)，其中使用相同的2个限制位点以标准化的方式将多个DNA片段顺序地装配在一起。

除了使用载体以外，可以通过使用靶向的或随机的方案整合进染色体中而将碳底物向P4HB的酶促转化所必需的基因导入宿主生物体中。对于向染色体上的特定位点中的靶向整合，如Datsenko和Wanner(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97，6640-6645)最初描述地，使用通常称作Red/ET重组工程的方法。向染色体中的随机整合包括使用Huisman等人(美国专利号6,316,262和6,593,116)所述的微-Tn5转座子-介导的方案。

培养宿主以生产P4HB生物质

一般而言，通过批式或连续的发酵技术，使用本领域已知的方法，在含有碳源和其它必需营养物的培养基中培养重组宿主，以生成P4HB生物质。也可以包括其它添加剂，例如，消泡剂等，用于实现希望的生长条件。对于大规模生产而言，发酵是特别有用的。一个示例性的方法使用生物反应器来培养和加工发酵液成希望的产物。其它技术(诸如分离技术)可以与发酵组合地用于大规模生产和/或连续生产。

本文使用的术语“原料”表示在工业过程中用作碳原料的物质。当用于表示生物体(诸如微生物或藻类生物体)的培养(诸如含有细胞的发酵过程)时，该术语表示用于给细胞提供碳或其它能源的原料。可用于生产GBL的碳源包括简单的、廉价的碳源，例如，葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、木糖、麦芽糖、阿拉伯糖等，它们是单独的或组合的。在其它实施方案中，所述原料是糖蜜或淀粉、脂肪酸、植物油或木质纤维素材料等。也可能使用生物体来生产P4HB生物质，所述生物体在从可再生的生物质资源生成的合成气体(CO₂、CO和氢)上生长。

P4HB途径基因的导入，允许具有使用可容易地得到的和廉价的原料的灵活性。“可再生的”原料表示可再生的能源，诸如从活生物体或它们的代谢副产物衍生出的物质，包括从生物质衍生出的物质，经常由未充分利用的组分(如谷壳或秸杆)组成。专门栽培用作可再生原料的农业产物包括，例如，谷物、大豆、柳枝稷和树诸如白杨、小麦、亚麻籽和油菜籽、甘蔗和棕榈油。作为可再生的能量和原料源，基于作物的农业原料是日益减少的油储量的最终替代品。植物使用太阳能和二氧化碳固定来产生数千种复杂的且有功能的生物化学品，这超过了当前的现代合成化学的能力。这些包括精细化学品和散装化学品、药物、营养制品、黄酮类化合物、维生素、香料、聚合物、树脂、油、食品添加剂、生物着色剂、粘着剂、溶剂和润滑剂。

将P4HB生物质与催化剂组合

一般而言，在生产(例如，培养)P4HB生物质过程中或以后，在合适的条件下，将生物质与催化剂组合，以帮助将P4HB聚合物转化成高纯度的γ-丁内酯产物。例如，通过混合、絮凝、离心或喷雾干燥或本领域已知的其它合适的方法组合催化剂(处于固体或溶液形式)和生物质，以促进生物质和催化剂的相互作用(其驱动P4HB向γ-丁内酯的有效的且特异性的转化)。在有些实施方案中，初步干燥所述生物质，例如在约100℃至约150℃的温度下，并持续一定时间以减少生物质的水含量。然后将干燥的生物质重新悬浮于水中，再与催化剂混合。针对产物纯度和产率确定干燥的合适的温度和持续时间，且在有些实施方案中，可以包括用于在延长的时间段内除去水的低温(诸如在25℃至150℃)，或在其它实施方案中，可以包括在高温(例如，高于450℃)下干燥短的时间段。“合适的条件”表示促进催化反应的条件。例如，在使产物γ-丁内酯的产生最大化的条件下，诸如在有辅剂(co-agent)或促进反应效率的其它物质存在下。其它合适的条件包括：在没有杂质存在下，所述杂质诸如金属或会妨碍反应进程的其它物质。

本文使用的“催化剂”表示这样的物质：其会启动或加速化学反应，其本身在反应中不受影响或消耗。有用的催化剂的实例包括金属催化剂。在某些实施方案中，所述催化剂会降低开始热分解的温度，并增加在特定热解温度(例如，约200℃至约325℃)时的热分解速率。

在有些实施方案中，所述催化剂是含有金属离子的氯化物、氧化物、氢氧化物、硝酸盐、磷酸盐、磺酸盐、碳酸盐或硬脂酸盐化合物。合适的金属离子的实例包括：铝、锑、钡、铋、镉、钙、铈、铬、钴、铜、镓、铁、镧、铅、锂、镁、钼、镍、钯、钾、银、钠、锶、锡、钨、钒或锌等。在有些实施方案中，所述催化剂是下述的有机催化剂：胺、叠氮化物、烯醇、二醇、季铵盐、酚盐、氰酸盐、硫氰酸盐、二烷基酰胺和烷基硫醇酯。在有些实施方案中，所述催化剂是氢氧化钙。在其它实施方案中，所述催化剂是碳酸钠。也包括2种或更多种催化剂的混合物。

在某些实施方案中，金属催化剂的量基于金属离子的重量是生物质的干固体重量的约0.1％至约15％、或约1％至约25％，或4％至约50％、或约4％至约50％。在有些实施方案中，催化剂的量是在约7.5％至约12％之间。在其它实施方案中，催化剂的量是干细胞重量的约0.5％、约1％、约2％、约3％、约4％、约5、约6％、约7％、约8％、约9％、或约10％、或约11％、或约12％、或约13％、或约14％、或约15％、或约20％、或约30％、或约40％、或约50％或这些量之间的量。

当用于表示反应中的化学试剂时，本文使用的术语“足够的量”意图指可以满足化学反应的需求和希望的产物纯度的所指试剂的量。

P4HB生物质的热降解

本文使用的“加热”、“热解”、“热分解”和“烘干”表示热降解(例如，分解)P4HB生物质以转化成GBL。一般而言，在有催化剂存在下在高温下进行P4HB生物质的热降解。例如，在某些实施方案中，本文所述的方法的加热温度是在约200℃至约400℃之间。在有些实施方案中，所述加热温度是约200℃至约350℃。在其它实施方案中，所述加热温度是约300℃。“热解”通常表示生物质在高温下热化学分解一段时间。持续时间的范围可以是几秒至几小时。在某些条件下，在没有氧存在下，或在有限量的氧存在下，进行热解以避免氧化。P4HB生物质热解过程可以包括直接的热量传递或间接的热量传递。“闪热解”表示在高温下迅速地加热生物质，以实现P4HB生物质的快速分解，例如，生物质中P4HB的解聚。闪热解的另一个实例是RTP^TM快速热裂解。RTP^TM技术和来自Envergent Technologies，Des Plaines，IL的装置会将原料转化成生物油。“烘干”表示焙干的过程，它是本领域公知的术语，表示在高温下干燥生物质，去除水和有机挥发物，以生成具有增强的固体燃料性质的烘干的生物质。与仅去除游离水而干燥的生物质(例如在105℃的常规烘干)相比，烘干的生物质通常具有更高的热值、更大的堆密度、对于粉末化的燃料锅炉而言提高的可磨性、增加的抗霉性和减少的水分敏感性。焙干过程通常包括：在200-350℃的温度范围内加热生物质相对较长的时间段(例如，10-30分钟)，通常在没有氧存在下。所述方法产生，例如，烘干的生物质，其具有小于生物质的7重量％的水含量。然后可以进一步加工烘干的生物质。在有些实施方案中，在大气压或在受控压力下在真空中进行所述加热。在某些实施方案中，不使用或使用减少的石油产生的能量完成所述加热。

在某些实施方案中，在加热之前，干燥所述P4HB生物质。或者，在其它实施方案中，在热降解(例如，加热、热解或焙干)P4HB生物质的过程中进行干燥。干燥会减少生物质的水含量。在某些实施方案中，在约100℃至约350℃之间(例如，在约200℃至约275℃之间)的温度干燥所述生物质。在有些实施方案中，所述干燥的4PHB生物质具有5重量％或更低的水含量。

在某些实施方案中，P4HB生物质/催化剂混合物的加热进行足够的时间，以有效地和特异性地将P4HB生物质转化成GBL。在某些实施方案中，加热的时间段是约30秒至约1分钟、约30秒至约1.5分钟、约1分钟至约10分钟、约1分钟至约5分钟或之间的时间，例如，约1分钟、约2分钟、约1.5分钟、约2.5分钟、约3.5分钟。

在其它实施方案中，所述时间段是约1分钟至约2分钟。在其它实施方案中，所述加热时间段是在约5分钟至约30分钟之间、在约30分钟至约2小时之间、或在约2小时至约10小时之间或大于10小时(例如，24小时)的时间。

在某些实施方案中，所述加热温度是在约200℃至约350℃的温度，包括之间的温度，例如，约205℃、约210℃、约215℃、约220℃、约225℃、约230℃、约235℃、约240℃、约245℃、约250℃、约255℃约260℃、约270℃、约275℃、约280℃、约290℃、约300℃、约310℃、约320℃、约330℃、约340℃，或345℃。在某些实施方案中，所述温度是约250℃。在某些实施方案中，所述温度是约275℃。在其它实施方案中，所述温度是约300℃。

在某些实施方案中，所述方法也包括：闪热解残余的生物质，例如在500℃或更高的温度进行足以将残余生物质的至少一部分分解成热解液体的时间段。在某些实施方案中，在500℃至750℃的温度进行所述闪热解。在有些实施方案中，残余生物质在闪热解中的停留时间是1秒至15秒，或1秒至5秒，或足以热解生物质以产生希望的热解按规格裁切物(precuts)(例如，热解液体)的时间。在有些实施方案中，可以进行闪热解来替代焙干。在其它实施方案中，在烘干过程结束以后，进行所述闪热解。

本文使用的“热解液体”被定义为这样的低粘度流体：其含有多达15-20％的水，通常含有糖类、醛类、呋喃类、酮类、醇类、羧酸类和木素类。也称作生物油，该物质通过生物质在特定温度下的热解(通常闪热解)而生成，所述温度足以将生物质的至少一部分分解成可回收的气体和液体，所述液体可以在静置时固化。在有些实施方案中，所述足以分解生物质的温度是在400℃至800℃之间的温度。

在某些实施方案中，“回收”γ-丁内酯蒸汽包括：冷凝所述蒸汽。当应用于蒸汽时，本文使用的术语“回收”是指，将蒸汽与P4HB生物质材料分离开，例如，包括、但不限于通过下述方法进行回收：冷凝，分离方法，诸如使用膜，气(例如，蒸汽)相分离，诸如蒸馏等。因而，通过冷凝装置可以实现回收，所述冷凝装置捕获单体组分蒸汽，将单体组分蒸汽冷凝成液体形式，并将其转移离开生物质材料。

作为一个非限制性实例，γ-丁内酯蒸汽的冷凝可以如下所述。来自热解/焙干室的进入的气体/蒸汽流进入交换器中，在这里可以预冷却所述气体/蒸汽流。所述气体/蒸汽流然后穿过冷却器，在这里将所述气体/蒸汽流的温度降低至通过与冷却剂的间接接触从气体中冷凝指定的蒸汽所需的温度。所述气体和冷凝的蒸汽从冷却器流入分离器中，在这里将冷凝的蒸汽收集在底部。不含有蒸汽的气体流出分离器，穿过交换器，并离开所述单元。回收的液体从分离器的底部流动至或被泵至贮存器。对于一些产物，冷凝的蒸汽会固化，并收集固体。

在某些实施方案中，在本发明的方法中另外包括催化剂的回收。例如，当使用钙催化剂时，煅烧是有一种有用的回收技术。煅烧是一种热处理过程，其在矿物质、金属或矿石上进行，以通过去羧基化、脱水、有机物的脱除挥发物、相转化或氧化来改变所述物质。该过程通常在诸如坩埚炉、竖炉、回转窑或更近的流化床反应器等反应器中进行。选择的煅烧温度低于所述物质的熔点，但是高于它的分解或相变温度。经常将其取作当反应的吉布斯自由能等于零时的温度。对于CaCO₃分解成CaO，计算出在ΔG＝0时的煅烧温度为约850℃。通常，对于大多数矿物质，煅烧温度是在800-1000℃范围内，但是煅烧也可以表示在200-800℃范围内进行的加热。

为了在回收GBL以后从生物质中回收钙催化剂，可以将用完的生物质残余物从热解或焙干直接转移至煅烧反应器，并在空气中继续加热生物质残余物至825-850℃一段时间，以去除所有痕量的有机生物质。去除有机生物质以后，可以将催化剂原样使用，或通过分离存在的金属氧化物(从发酵培养基和催化剂中)进一步纯化，所述分离是基于密度，使用本领域技术人员已知的装置。

在某些实施方案中，所述方法选择性地用于生产含有相对小量的不希望的副产物(例如，GBL(3-(二氢-2(3H)-呋喃亚基)二氢-2(3H)-呋喃酮)的二聚化产物，GBL的其它寡聚体或其它副产物)的γ-丁内酯产物。例如，在有些实施方案中，足够量的特异性催化剂的使用会减少不希望的副产物的生产，并使γ-丁内酯的产率增加至少约2倍。在有些实施方案中，不希望的副产物的生产会至少减少至约50％、至少约40％、至少约30％、至少约20％至少约10％或至少约5％。在特定实施方案中，不希望的副产物占回收的γ-丁内酯的小于约5％、回收的γ-丁内酯的小于约4％、回收的γ-丁内酯的小于约3％、回收的γ-丁内酯的小于约2％、或回收的γ-丁内酯的小于约1％。

本文所述的方法可以提供表示为百分比产率的GBL产率，例如，当使用葡萄糖作为碳源进行培养时，所述产率是多达95％，这基于在该过程中饲喂的生物质中含有的每克P4HB所回收的GBL克数(报告为百分比)。在其它实施方案中，所述产率的范围是在约40％至约95％之间，例如在约50％至约70％之间，或在约60％至70％之间。在其它实施方案中，所述产率是约75％、约70％、约65％、约60％、约55％、约50％、约45％或约40％。

本文使用的“γ-丁内酯”或GBL表示具有下述化学结构的化合物：

γ-丁内酯

术语“γ-丁内酯产物”表示含有至少约70至100重量％的γ-丁内酯的产物。例如，在特定实施方案中，所述γ-丁内酯产物可以含有95重量％的γ-丁内酯和5重量％的副产物。在有些实施方案中，在γ-丁内酯产物中的γ-丁内酯的量是约71重量％、约72重量％、约73重量％、约74重量％、约75重量％、约76重量％、约77重量％、约78重量％、约79重量％、约80重量％、81重量％、约82重量％、约83重量％、约84重量％、约85重量％、约86重量％、约87重量％、约88重量％、约89重量％、约90重量％、91重量％、约92重量％、约93重量％、约94重量％、约95重量％、约96重量％、约97重量％、约98重量％、约99重量％或约100重量％。在具体实施方案中，通过本文所述的方法生产的γ-丁内酯产物的重量百分比是85％或大于85％。

在其它实施方案中，如果需要的话，通过本领域已知的其它方法可以进一步纯化γ-丁内酯产物，例如，通过蒸馏，通过反应蒸馏(例如，首先酸化γ-丁内酯产物，以氧化某些组分(例如，为了容易分离)，然后蒸馏)，通过用活性炭处理(为了去除颜色和/或气味体)，通过离子交换处理，通过液-液萃取(使用GBL不混溶的溶剂(例如，非极性溶剂，如环戊烷或己烷)来去除脂肪酸等)，对于GBL回收以后的纯化而言，通过真空蒸馏，通过萃取蒸馏或使用会进一步纯化γ-丁内酯产物的类似方法以增加γ-丁内酯产率。也可以使用这些处理的组合。

在某些实施方案中，进一步化学修饰GBL，和/或将GBL置换成其它4碳产物(4C产物)和衍生物，包括、但不限于琥珀酸，1，4-丁二酰胺、琥珀腈、琥珀酰胺、N-乙烯基-2-吡咯烷酮(NVP)、2-吡咯烷酮(2-Py)、N-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)、四氢呋喃(THF)、1，4-丁二醇(BDO)。本领域技术人员可容易地获知用于从γ-丁内酯生产这些衍生物的方法和反应。

本文使用的术语“残余生物质”表示在PHA转化成小分子中间体以后剩余的生物质。然后可以通过焙干，将残余生物质转化成可使用的燃料，从而减少来自PHA生产的废物，并从典型的焙干过程获得额外的有价值的商品化学制品。在足以增稠残余生物质的温度下进行所述焙干。在某些实施方案中，本文所述的方法与焙干过程集成，在所述焙干过程中，残余生物质继续被热处理，在挥发性的化学中间体已经释放以后提供燃料物质。通过该方法生产的燃料物质可用于直接燃烧，或经进一步处理以生成热解液体或合成气。总之，该方法已经增加了下述优点：残余生物质被转化成更高价值的燃料，所述燃料然后可以用于生产电和蒸汽以为该过程提供能量，从而消除废物处理需求。

“碳足迹”是所述方法对环境的影响(尤其是气候变化)的量度。它与产生的温室气体的量有关。

在某些实施方案中，可能希望标记生物质的组分。例如，可能有用的是，有意地用碳同位素(例如，¹³C)进行标记以促进结构测定或用于其它装置。这如下实现：培养经遗传工程化成表达所述组分(例如，聚合物)的微生物，但是不使用普通培养基，而是在包含含有¹³C的碳源(诸如葡萄糖、丙酮酸等)的生长培养基上培养所述细菌。以此方式，可以产生被¹³C均匀地、部分地或在特定位点处标记的聚合物。另外，标记允许经由ASTM D6866(放射碳定年的工业应用)获知来自可再生源(例如，植物衍生物)的生物塑料的精确百分比。ASTM D6866会测量基于生物的物质的碳14含量；并且，由于基于化石的物质不再具有碳14，ASTM D6866可以有效地消除基于生物的内容物的不准确声明。

实施例

下面的实施例进一步例证了本发明的技术，所述实施例不应当以任何方式解释为限制性的。

实验方法

通过热重分析(TGA)来测量热降解行为

使用TAInstruments Q500热重分析仪(TGA)测量生物质样品相对于时间的等温重量减轻。TGA是一种通常用于测量诸如PHA等物质的热降解行为的技术。该仪器由灵敏天平组成，所述天平上悬吊着样品。然后使炉升高至样品周围，并程序化成以指定的速率加热(递增条件)或加热至特定温度并保持(等温条件)。在加热过程中，使吹扫气体扫过样品，所述气体通常是氮气或空气。随着样品被加热，它开始损失重量，这由天平进行记录。在分析结束时，该结果然后可以绘制为相对于温度或时间的样品重量减轻百分比。当绘制为相对于时间的重量减轻时，然后可以从该曲线的斜率确定降解速率。对于下述实施例，将5-10mg干燥的生物质称量进铂盘中，然后加载到TGA天平上。使用的净化气体是氮气，流速为60ml/min。对于等温实验条件，以150-200℃/min的加热速率，将生物质样品从室温预热至程序化的等温温度，并在该等温温度下保持10-30min。然后将数据绘制为样品相对于时间的重量减轻百分比，并从该曲线的初始斜率计算出热降解速率。

通过热解-气相色谱法-质谱法(Py-GC-MS)测量热降解产物。

为了鉴别和半定量在不同温度加热时从干燥的生物质产生的单体化合物，使用配有Frontier Lab PY-2020iD热解器的Agilent 7890A/5975GC-MS。关于该技术，将样品称量进钢杯中，加载进热解器自动采样器中。当启动热解器和GC-MS时，所述钢杯被自动地放入已经设定在特定温度的热解器中。将所述样品在热解器中保持短时间段，同时所述样品释放出挥发物。然后使用氦气，将挥发物扫入GC柱中，在这里它们冷凝在处于室温的柱上。在热解结束后，在特定速率加热GC柱，以便洗脱从样品释放出的挥发物。然后使用氦气将挥发性的化合物扫入电离/质谱检测器(质量范围10-700道尔顿)中，用于鉴别和定量。

对于下述的实施例，使用微量天平将200-400μg干燥的生物质称量进热解器钢杯中。然后将所述杯加载进热解器自动采样器中。将所述热解器程序化成加热至在225-350℃范围内的温度持续0.2-1分钟。在实施例中使用的GC柱是Frontier Lab Ultra Alloy毛细管柱或HP-5MS柱(长度30m，内径0.25μm，膜厚度0.25μm)。然后将GC编程成：在5分钟内从室温加热至70℃，然后以10℃/min加热至240℃保持4min，最后以20℃/min加热至270℃保持1.5min。总GC运行时间是25分钟。通过与来自NIST质谱文库的波谱的最佳可能性匹配，鉴别出在色谱图中显示的峰。如下测量GBL‘纯度’：计算GBL峰的面积，并将它除以GBL二聚体峰的面积。

这些实施例描述了许多用于构建菌株的生物技术工具和方法，所述菌株产生目标产物。描述了合适的宿主菌株、潜在来源和在这些实施例中使用的重组基因的列表、合适的染色体外载体、适用于控制重组基因表达的策略和调控元件以及用于在宿主生物体中过表达基因或灭活来自宿主生物体的基因的构建技术的选择。这些生物技术工具和方法是本领域技术人员众所周知的。

实施例1.在修饰以前的4HB聚合物生产

本实施例显示了尚未优化以掺入由可再生的碳资源产生高摩尔％的4HB的微生物菌株的4HB聚合物生产能力。在该实施例中使用的菌株列出在表2中。菌株1和2如Dennis和Valentin(美国专利号6,117,658)所述。

表2.在实施例1中使用的菌株

菌株3含有yneI和gabD染色体基因(图1和表1A，反应编号12)的缺失，所述基因分别编码非CoA依赖的NAD依赖性的琥珀酸半醛(SSA)脱氢酶和非CoA依赖的NADP依赖性的SSA脱氢酶。为了实现该目的，使用LS5218(Jenkins和Nunn J.Bacteriol.169：42-52(1987))的衍生菌株，其表达phaA、phaB和phaC，如Huisman等人(美国专利号6,316,262)以前所述。如Farmer等人(WO专利号2010/068953)所述，构建单个空的gabD和yneI突变体，并使用Datsenko和Wanner(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.97：6640-6645(2000))所述的Red/ET重组工程方法，该方法是本领域技术人员众所周知的。这会产生菌株3，该菌株3具有从基因组取出的yneI和gabD基因的整个编码序列。应当指出，菌株1、2和3含有相同的基因盒P_lac-orfZ-‘cat1-sucD-4hbD(如Dennis和Valentin所述)，其中sucD没有针对在大肠杆菌中的表达进行密码子优化。

为了检查P3HB-共聚-4HB(聚-3-羟基丁酸-共聚-4-羟基丁酸)的生产，在含有3mL LB和适当的抗生素的无菌试管中培养菌株3过夜。从该培养物中，将50μL一式三份地加入含有450μLLB和抗生素的Duetz深孔板孔中。在摇动下，将该板在30℃培养6小时。然后，将25μL的每种LB重复培养物加入另外3个孔中，所述3个孔含有475μL补充了10g/L葡萄糖、100μM IPTG、100μg/mL氨苄西林和25μg/mL氯霉素的LB培养基，并在摇动下在30℃温育72小时。此后，合并生产孔集合(共1.5mL)，并分析聚合物含量。在实验结束时，以4150rpm离心培养物，用蒸馏水洗涤1次，在-80℃冷冻至少30分钟，并低压冻干过夜。次日，将测量量的低压冻干的细胞沉淀物加入玻璃试管中，随后加入3mL丁醇解试剂，其由99.9％正丁醇和4.0N HCl(在二噁烷中)与2mg/mL二苯基甲烷(作为内部标准品)的等体积混合物组成。在给试管盖上帽以后，将它们短暂地涡旋，并放在设定在93℃的加热块上持续6小时并定期涡旋。此后，将所述试管冷却至室温，然后加入3mL蒸馏水。将所述试管涡旋大约10s，然后在620rpm(Sorvall Legend RT台式离心机)离心2min。将1mL有机相转移进GC瓶中，然后通过气相色谱法-火焰离子化检测(GC-FID)(Hewlett-Packard 5890Series II)进行分析。如下测定细胞沉淀物中的PHA的量：通过相对于4HB的标准曲线进行对比(对于P4HB分析)，或通过相对于3HB和4HB的标准曲线进行对比(对于PHB-共聚-4HB分析)。通过将不同量的10％γ-丁内酯(GBL)在丁醇中的溶液加入单独的丁醇解反应物中，制备4HB标准曲线。通过将不同量的99％3-羟基丁酸乙酯加入单独的丁醇解反应物中，制备3HB标准曲线。

在表3中的结果表明，与在美国专利号6,117,658中所述类似地，菌株3将低摩尔％的4HB掺入共聚物中。

表3.来自微生物菌株的P3HB-共聚-4HB聚合物生产

菌株	摩尔％3HB	摩尔％4HB
			1	98.5	1.5
2	95.0	5.0
			3	97.6±0.9	2.4±0.9

实施例2.经由α-酮戊二酸脱羧酶或琥珀酰-CoA脱氢酶生产P4HB

提出了几种代谢途径来从三羧酸(TCA)循环产生琥珀酸半醛(SSA)(综述参见：Steinbüchel和Lütke-Eversloh，Biochem.Engineering J.16：81-96(2003)和Efe等人，Biotechnology and Bioengineering99：1392-1406(2008))。一种途径是通过由sucD编码的琥珀酰-CoA脱氢酶将琥珀酰-CoA转化成SSA(

和Gottschalk，J.Bacterial.178：871-880(1996)；图1，反应编号7)。第二种途径是通过由kgdM编码的α-酮戊二酸脱羧酶将α-酮戊二酸转化成SSA(Tian等人Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.102：10670-10675(2005)；图1，反应编号8)。第三种途径是通过L-谷氨酸和4-氨基丁酸将α-酮戊二酸转化成SSA，其中使用谷氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.4)、谷氨酸脱羧酶(EC 4.1.1.15)和4-氨基丁酸转氨酶(EC 2.6.1.19)或4-氨基丁酸氨基转移酶(EC 2.6.1.19)。VanDien等人(WO专利公开号2010/141920)证实，sucD和kgdM途径彼此独立地起作用，当组合时，累加地起作用以生成4HB。应当指出，vanDien等人将kgdM称作sucA。

在该实施例中，将通过sucD或kdgM的2个代谢途径相对比以观察哪个可以产生最高的P4HB滴度。因而，使用上面所述的众所周知的生物技术工具和方法构建下述3个菌株，它们都含有yneI和gabD的染色体缺失，并过表达PHA合酶和CoA转移酶，以及α-酮戊二酸脱羧酶和SSA还原酶(菌株5)或者琥珀酰-CoA脱氢酶和SSA还原酶(菌株6)。菌株4用作阴性对照，并只含有空载体而不含有P_trc-kgdM-ssaR_At ^*或P_trc-sucD^*-ssaR_At ^*(参见表4)。

表4.在实施例2中使用的微生物菌株

在24小时的摇动平板试验中培养菌株。生产培养基由1x E2最小限度盐溶液组成，所述溶液含有10g/L葡萄糖、5g/L 4-羟基丁酸钠、2mMMgSO₄、1x痕量盐溶液和100μM IPTG。50x E2储备溶液由1.275MNaNH₄HPO₄·4H₂O、1.643M K₂HPO₄和1.36M KH₂PO₄组成。如下制备1000x储备痕量盐溶液：向每1L 1.5N HCl中加入50g FeSO₄·7H₂O、11g ZnSO₄·7H₂O、2.5g MnSO₄·4H₂O、5g CuSO₄·5H₂O、0.5g(NH₄)₆Mo₇O₂₄·4H₂O、0.1g Na₂B₄O₇和10g CaCl₂·2H₂O。在生长期结束时，如在实施例1中所述，测定生物质和P4HB滴度。

在表5中的结果令人惊讶地表明，仅表达sucD途径的菌株6生产显著量的P4HB。与van Dien等人(WO专利公开号2010/141920)所述的菌株相比，通过kgdM和sucD途径生成类似量的4HB，这里使用的α-酮戊二酸脱羧酶途径仅生成非常低量的P4HB。

表5.生物质和P4HB滴度

菌株	生物质滴度(g/L)	P4HB滴度(％dcw)
			4	2.33±0.02	0.0±0.0
5	2.06±0.03	0.1±0.0
			6	2.59±0.01	6.9±0.1

实施例3.通过过表达特定琥珀酸半醛还原酶基因来提高P(4HB)产生

4hbd对P4HB产生的影响

Dennis和Valentin(美国专利号6,117,658)使用琥珀酸半醛(SSA)还原酶基因4hbD来生成P3HB-共聚-4HB共聚物。为了观察该SSA还原酶的过度产生对于P4HB同聚物产生而言如何地有效，通过IPTG可诱导的P_trc启动子过表达4hbD基因(菌株8)。含有空载体的菌株充当对照(菌株7)。使用的宿主菌株含有基因yneI和gabD的染色体缺失，且也过表达重组基因orfZ、sucD^*和phaC3/C1^*，如表6所示。

表6.在实施例3的该节中使用的微生物菌株

在48小时的摇动平板试验中培养菌株。生产培养基由1x E2最小限度盐溶液组成，所述溶液含有20g/L葡萄糖、1x痕量盐溶液和100μMIPTG。E2培养基和痕量元素如在实施例2中所述。在生长期结束时，如在实施例1中所述，测定生物质和P4HB滴度。

如表7所示，表达4hbD的菌株8将低量的4HB掺入聚合物中，这与在美国专利号6,117,658中所述和在实施例1中证实的菌株类似。但是，非常意外的是，空载体对照菌株7(其不表达4hbd基因)产生显著增加的P4HB滴度。

表7.微生物菌株7和8的生物质和P4HB滴度

菌株	生物质滴度(g/L)	P4HB滴度(％dcw)
			7	2.64±0.04	17.09±0.06
8	4.20±0.09	3.17±0.24

其它SSA还原酶基因对P4HB产生的影响

由于4hbD编码的SSA还原酶意外地不产生比它的亲本菌株更高量的P4HB，在具有更高催化活性的酶的寻找中，从拟南芥克隆出另一种已知的SSA还原酶(Breitkreuz等人，J.Biol.Chem.278：41552-41556(2003))。另外，测试了几个基因，发现所述基因的蛋白序列与拟南芥酶是同源的。这些基因包括来自小家鼠和土曲霉的推定的SSA还原酶基因。此外，为了研究来自大肠杆菌的非特异性的醛脱氢酶(其没有表现出与拟南芥酶的显著同源性)是否可以催化SSA至4HB的反应，也克隆了基因yqhD。以前证实YqhD具有将3-羟基丙醛转化成1，3-丙二醇的催化活性(Emptage等人，美国专利号7,504,250)。得到的菌株列出在表8中。

表8.在实施例3中使用的微生物菌株

如上所述，培养菌株9-13，并测定生物质和P4HB滴度。表9表明，不同于4hbD编码的SSA还原酶，来自拟南芥的SSA还原酶的过度产生显著增加了P4HB产生。这清楚地解释了代谢工程结果是多么不可预测的，尽管已知克鲁氏梭状芽孢杆菌和拟南芥酶的功能。来自M.musculus和土曲霉的推定的SSA还原酶基因也在不同程度上提高了P4HB生产。意外的是，非特异性的大肠杆菌醛脱氢酶YqhD增加P4HB生产至与关于拟南芥SSA还原酶所观察到的结果类似的程度。

表9.微生物菌株9-13的生物质和P4HB滴度

菌株

生物质滴度(g/L)

P4HB滴度(％dcw)

9	2.64±0.04	17.09±0.06
			10	4.80±0.12	28.46±0.65
11	3.96±0.79	23.31±4.32
			12	3.60±0.29	19.74±0.43
13	5.07±0.07	27.99±1.36

实施例4.通过删除丙酮酸激酶来提高P4HB产生

已经证实，去除由pykF编码的丙酮酸激酶I和由pykA编码的丙酮酸激酶II(图1，反应编号2)会减少乙酸的产生，并有利于CO₂的产生(Zhu等人(2001)Biotechnol.Prog.17：624-628)。这些结果指示，pykF和pykA的去除会造成碳流转向TCA循环，所以这些遗传修饰已经被描述为可用于琥珀酸和1，4-丁二醇的微生物生产(Park等人，WO专利公开号2009/031766)。为了测定删除丙酮酸激酶基因pykF和pykA是否会导致提高的P4HB滴度，使用上面所述的众所周知的生物技术工具和方法构建下述2个菌株。这2个菌株都含有yneI和gabD的染色体缺失，并过表达PHA合酶、琥珀酰-CoA脱氢酶、SSA还原酶和CoA-转移酶。菌株14在染色体上保留它的pykF和pykA的天然的未修饰的拷贝，而菌株15已经去除了这2个基因(表10)。

表10.在实施例4中使用的微生物菌株

在48小时的摇动平板试验中培养菌株。生产培养基由1x E2最小限度盐溶液组成，所述溶液含有30g/L葡萄糖和1x痕量盐溶液。E2培养基和痕量元素如在实施例2中所述。在生长期结束时，如在实施例1中所述，测定生物质和P4HB滴度。

在表11中的结果表明，缺少pykF和pykA的菌株15产生比保留这2个基因的菌株14更多的P4HB。

表11.微生物菌株14和15的生物质和P4HB滴度

菌株	生物质滴度(g/L)	P4HB滴度(％dcw)
			14	10.26±0.44	25.6±4.8
15	14.17±0.11	46.3±2.2

实施例5.通过PEP羧化酶的过表达来提高P4HB生产

已经使用PEP羧化酶(图1，反应编号3)的过表达来增强天冬氨酸家族的氨基酸和琥珀酸的生产，这通过增加进入TCA循环的碳流量来实现。但是，由于PEP羧化酶的许多野生型同系物受到L-天冬氨酸或其它TCA循环-衍生的代谢物的反馈调节，关于反馈脱敏的突变体(Sugimoto等人，美国专利号5876983；San等人，美国专利号2005/0170482)或天然地表现出更少变构调节的替代同系物(Rayapati和Crafton，美国专利号2002/0151010)的鉴别已经建立了大量的现有技术。为了确定PEP羧化酶的过表达是否会导致提高的P4HB滴度，使用上面所述的众所周知的生物技术工具和方法构建了下述3个菌株。这些菌株含有yneI和gabD的染色体缺失，并过表达PHA合酶、琥珀酰-CoA脱氢酶、SSA还原酶、CoA-转移酶以及来自大肠杆菌的野生型PEP羧化酶(ppc_Ec)(菌株17)或具有减少的变构调节(Rayapati和Crafton，US20020151010A1)的来自紫苜蓿的野生型PEP羧化酶(ppc_Ms)(菌株18)。菌株16充当阴性对照，并仅含有空载体而不含有P_syn1-ppc_Ec或P_syn1-ppc_Ms(表12)。

表12.在实施例5中使用的微生物菌株

在44小时的摇动平板试验中培养菌株。生产培养基由1x E2最小限度盐溶液组成，所述溶液含有25g/L葡萄糖和1x痕量盐溶液。E2培养基和痕量元素如在实施例2中所述。在生长期结束时，如在实施例1中所述，测定生物质和P4HB滴度。

在表13中的结果表明，菌株17和18(其表达野生型大肠杆菌PEP羧化酶或其更少调节的同系物)生成比对照菌株16明显更高量的P4HB。

表13.微生物菌株16、17和18的生物质和P4HB滴度

菌株	生物质滴度(g/L)	P4HB滴度(％dcw)
			16	2.31±0.01	14.93±0.83
17	2.85±0.29	25.57±1.59
			18	3.02±0.13	24.31±0.65

实施例6.通过删除苹果酸酶来提高P4HB产生

大肠杆菌具有苹果酸酶的2种同种型，它们需要NAD⁺(maeA)或NADP⁺(maeB)作为还原辅因子(Bologna等人，J.Bacteriol.189(16)：5937-5946(2007)，以实现苹果酸向丙酮酸的可逆转化(图1，反应编号4)。已经证实，maeA和maeB二者的缺失会增强大肠杆菌中L-赖氨酸和L-苏氨酸的产生，据推测是通过防止TCA循环的碳流失(vanDien等人，WO专利号2005/010175)。为了确定删除2种苹果酸酶是否也会导致提高的P4HB滴度，使用上面所述的众所周知的生物技术工具和方法构建了下述2个菌株。这2个菌株含有yneI和gabD的染色体缺失，并过表达PHA合酶、琥珀酰-CoA脱氢酶、SSA还原酶和CoA-转移酶。菌株19在染色体上保留它的maeA和maeB的天然的未修饰的拷贝，而菌株20已经去除了这2个基因(表14)。

表14.在实施例6中使用的微生物菌株

在表15中的结果表明，缺少maeA和maeB的菌株20产生比保留这2个基因的菌株19更多的P4HB。

表15.微生物菌株19和20的生物质和P4HB滴度

菌株	生物质滴度(g/L)	P4HB滴度(％dcw)
			19	10.26±0.44	25.6±4.8
20	12.50±1.15	40.0±4.6

实施例7.通过过表达乙醛酸支路来提高P4HB产生

去除乙醛酸支路基因的影响

Noronha等人(Biotechnology and Bioengineering 68(3)：316-327(2000))使用13C-NMR/MS得出的结论是，乙醛酸分路在fadR-阳性的(和iclR-阳性的)大肠杆菌菌株中是无活性的。但是，Maloy等人(J.Bacteriol.143：720-725(1980))描述的fadR-阴性的大肠杆菌突变体具有升高的乙醛酸分路酶(异柠檬酸裂合酶和苹果酸合酶)的水平。由于在这些实施例中使用的LS5218宿主菌株亲本含有在fadR基因中的未知突变，称作fadR601(耶鲁大肠杆菌基因资源(E.coli Genetic Resources atYale)，大肠杆菌基因储备中心(The Coli Genetic Stock Center)，CGSC#：6966；参见万维网：//cgsc.biology.yale.edu/index.php)，令人感兴趣的是，研究碳是否通过乙醛酸分路(图1，反应编号5和6)和/或经由α-酮戊二酸的TCA循环氧化支路而达到琥珀酰-CoA。因而构建了2个菌株，它们二者含有yneI、gabD、pykF、pykA、maeA、maeB的染色体缺失，并过表达PHA合酶、琥珀酰-CoA脱氢酶、SSA还原酶、CoA-转移酶和PEP羧化酶(菌株21)。菌株22含有分别编码异柠檬酸裂合酶和苹果酸合酶的aceA和aceB基因的额外缺失(表16)。

表16.在实施例7的该节中使用的微生物菌株

在24小时的摇动平板试验中培养菌株。生产培养基由1x E2最小限度盐溶液组成，所述溶液含有15g/L葡萄糖、1x痕量盐溶液。E2培养基和痕量元素如在实施例2中所述。在生长期结束时，如在实施例1中所述，测定生物质和P4HB滴度。

在表17中的结果表明，含有无活性的乙醛酸分路的菌株22具有与它的亲本菌株21相比极大降低的P4HB滴度。

表17.微生物菌株21和22的生物质和P4HB滴度

菌株	生物质滴度(g/L)	P4HB滴度(％dcw)
			21	3.5±0.3	20.2±7.0
22	3.0±0.1	7.9±0.3

过表达乙醛酸支路基因的影响

构建了2个菌株，它们二者都含有yneI、gabD、pykF、pykA的染色体缺失，并过表达PHA合酶、琥珀酰-CoA脱氢酶、SSA还原酶、CoA-合成酶和PEP羧化酶(菌株23)。菌株24另外由IPTG可诱导的P_trc启动子过表达aceBA基因，而菌株23含有空载体(表18)。

表18.在实施例7的该节中使用的微生物菌株

在24小时摇动平板试验中培养菌株。生产培养基由1x E2最小限度盐溶液组成，所述溶液含有15g/L葡萄糖、1x痕量盐溶液和100μMIPTG。E2培养基和痕量元素如在实施例2中所述。在生长期结束时，如在实施例1中所述，测定生物质和P4HB滴度。

在表19中的结果表明，与不由P_trc启动子表达aceBA基因的亲本菌株23相比，过表达这2种乙醛酸分路途径酶的菌株24产生更高的P4HB滴度。

表19.微生物菌株23和24的生物质和P4HB滴度

菌株	生物质滴度(g/L)	P4HB滴度(％dcw)
			23	3.12±0.03	21.0±1.2
24	3.27±0.09	27.0±1.0

实施例8.通过甘油醛-3-磷酸脱氢酶来提高P4HB产生

Martinez等人(Metab.Eng.10：352-359(2009))遗传工程化了大肠杆菌菌株，以增加NADPH可用性，从而提高在它的生物合成中需要NADPH的番茄红素和ε-己内酯的生产力。它们的方案包含糖酵解步骤的改变，在所述步骤中，甘油醛-3-磷酸被氧化成1，3二磷酸甘油酸。该反应由NAD依赖性的内源的甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)催化，该酶由gapA基因编码(图1，反应编号1)。他们通过用来自丙酮丁醇梭杆菌的NADP依赖性的GAPDH替换天然的NAD依赖性的gapA基因而构建出重组大肠杆菌菌株，并证明了与亲本菌株相比显著更高的番茄红素和ε-己内酯生产力。

为了确定产生NADPH的GAPDH的过表达是否会导致提高的P4HB滴度，使用前面描述的众所周知的生物技术工具和方法构建了下述6个菌株。所有菌株含有yneI和gabD的染色体缺失，并过表达PHA合酶、琥珀酰-CoA脱氢酶、SSA还原酶、CoA-转移酶。菌株25含有空载体，并充当在其中不表达其它重组基因的阴性对照。菌株26-29由IPTG-诱导型启动子过表达分别编码来自不同生物体的产生NADPH的GAPDH的基因，即来自乳酸克鲁维酵母的gdp1、来自集胞藻属PCC6803的gap2、来自枯草芽孢杆菌的gapB和来自酿脓链球菌的gapN。作为另一个对照，菌株30过表达大肠杆菌gapA基因，该基因编码产生NADH的GAPDH(表20)。

表20.在实施例8中使用的微生物菌株

在24小时的摇动平板试验中培养菌株。生产培养基由1x E2最小限度盐溶液组成，所述溶液含有10g/L葡萄糖和1x痕量盐溶液和100μMIPTG。E2培养基和痕量元素如在实施例2中所述。在生长期结束时，如在实施例1中所述，测定生物质和P4HB滴度。

在表21中的结果表明，菌株26、27和29产生比对照菌株25更高量的P4HB。令人感兴趣地，菌株28产生比菌株25远远更少的P4HB。令人惊奇地，编码产生NADH的GAPDH的内源性gapA基因在菌株30中的过表达胜过所有其它菌株。

表21.微生物菌株25-30的生物质和P4HB滴度

菌株	生物质滴度(g/L)	P4HB滴度(％dcw)
			25	2.52±0.03	14.0±0.3
26	2.84±0.01	25.0±1.0
			27	2.50±0.10	21.5±0.9
28	2.20±0.10	2.3±0.1
			29	2.48±0.01	21.0±1.0
30	3.03±0.08	32.5±0.6

基因ID 001核苷酸序列：紫苜蓿磷酸烯醇丙酮酸羧化酶ppc^*

ATGGCAAACAAAATGGAAAAGATGGCAAGCATTGACGCGCAACT

GCGCCAGTTGGTCCCGGCAAAAGTCAGCGAGGACGACAAATTGA

TTGAATACGATGCTCTGTTGCTGGACCGCTTTCTGGACATTCTGCA

AGATCTGCATGGCGAGGATCTGAAGGATTCGGTTCAGGAAGTTTA

CGAACTGTCTGCGGAGTATGAGCGTAAGCATGACCCGAAGAAGC

TGGAAGAGCTGGGTAACTTGATTACGAGCTTTGACGCGGGCGACA

GCATTGTCGTGGCGAAATCGTTCTCTCATATGCTGAATCTGGCGA

ACCTGGCCGAAGAAGTTCAAATTGCTCACCGCCGTCGTAACAAGC

TGAAGAAGGGTGATTTTCGTGATGAGAGCAATGCGACCACCGAG

TCCGATATTGAGGAGACTCTGAAGAAACTGGTTTTCGACATGAAG

AAGTCTCCGCAAGAAGTGTTTGACGCGTTGAAGAATCAGACCGTG

GACCTGGTGCTGACGGCACATCCTACCCAGAGCGTTCGCCGTTCC

CTGCTGCAAAAGCATGGTCGTGTTCGTAATTGCTTGAGCCAGCTG

TATGCGAAAGACATTACCCCGGATGACAAACAAGAGCTGGACGA

GGCACTGCAGCGTGAAATCCAGGCAGCGTTCCGTACCGATGAAAT

CAAACGTACCCCGCCGACCCCACAAGACGAAATGCGTGCTGGCA

TGAGCTATTTCCACGAAACCATCTGGAAGGGCGTCCCGAAGTTCC

TGCGTCGCGTGGACACCGCGTTGAAGAACATCGGCATTAACGAAC

GCGTGCCGTATAACGCCCCGCTGATTCAATTCAGCAGCTGGATGG

GTGGCGACCGTGACGGCAATCCGCGTGTTACGCCAGAAGTGACCC

GTGATGTTTGTCTGCTGGCGCGTATGATGGCGGCGAATTTGTACT

ATAGCCAGATTGAAGATCTGATGTTTGAGCTGTCTATGTGGCGCT

GTAATGATGAGTTGCGTGTGCGTGCCGAAGAACTGCACCGCAATA

GCAAGAAAGACGAAGTTGCCAAGCACTACATCGAGTTCTGGAAG

AAGATCCCGTTGAACGAGCCGTACCGTGTTGTTCTGGGTGAGGTC

CGCGATAAGCTGTATCGCACCCGTGAGCGCAGCCGTTATCTGCTG

GCACACGGTTATTGCGAAATTCCGGAGGAGGCGACCTTTACCAAC

GTGGATGAATTTCTGGAACCGCTGGAGCTGTGTTATCGTAGCCTG

TGCGCGTGCGGTGACCGCGCGATTGCGGACGGTTCTTTGCTGGAT

TTCCTGCGCCAGGTGAGCACGTTTGGTCTGAGCCTGGTCCGTCTG

GATATCCGTCAGGAATCGGACCGCCATACGGATGTGATGGACGCT

ATTACCAAACACCTGGAAATTGGCAGCTACCAGGAGTGGAGCGA

GGAGAAACGTCAAGAGTGGCTGCTGAGCGAGCTGATCGGTAAGC

GTCCGCTGTTCGGTCCAGATCTGCCGCAAACCGACGAAATCCGCG

ACGTTCTGGACACCTTTCGTGTGATTGCCGAACTGCCGAGCGACA

ACTTCGGCGCGTACATTATCTCCATGGCCACCGCCCCGAGCGATG

TCCTGGCAGTCGAGCTGCTGCAACGCGAATGTAAGGTCCGTAACC

CGTTGCGCGTGGTTCCGCTGTTTGAAAAGCTGGATGACCTGGAGA

GCGCACCGGCCGCACTGGCTCGTCTGTTTAGCATTGACTGGTACA

TTAACCGTATTGATGGTAAACAGGAAGTGATGATTGGTTACTCCG

ACAGCGGTAAAGATGCGGGTCGTTTTAGCGCCGCATGGCAGCTGT

ACAAGGCACAAGAAGATCTGATCAAGGTTGCACAGAAGTTCGGC

GTTAAACTGACCATGTTCCACGGTCGCGGTGGTACGGTTGGCCGT

GGTGGCGGCCCAACCCACCTGGCGATTCTGAGCCAACCGCCGGA

GACTATCCATGGTTCCTTGCGTGTCACCGTCCAGGGCGAAGTGAT

TGAGCAAAGCTTCGGCGAGGAACATCTGTGCTTTCGCACCCTGCA

GCGTTTTACGGCCGCGACTTTGGAACACGGCATGCGTCCGCCATC

CAGCCCAAAGCCAGAATGGCGTGCGCTGATGGACCAAATGGCGG

TTATCGCGACCGAGGAGTATCGCAGCATTGTGTTCAAAGAGCCGC

GTTTTGTGGAGTATTTCCGTTTGGCAACGCCGGAGATGGAGTACG

GCCGCATGAATATCGGCAGCCGTCCGGCAAAACGTCGCCCGTCCG

GCGGCATCGAGACGCTGCGTGCCATCCCGTGGATTTTCGCGTGGA

CGCAGACCCGTTTCCATTTGCCGGTGTGGCTGGGTTTCGGTGCCG

CCTTTCGTCAAGTCGTGCAGAAGGACGTGAAGAATCTGCATATGC

TGCAGGAGATGTACAACCAGTGGCCGTTCTTTCGTGTCACCATTG

ATCTGGTGGAAATGGTCTTTGCGAAAGGTGATCCGGGCATCGCGG

CGTTGAATGACCGTCTGCTGGTTTCCAAAGACCTGTGGCCTTTTGG

TGAACAGCTGCGTAGCAAGTACGAGGAAACCAAGAAACTGCTGT

TGCAAGTTGCGGCGCACAAGGAGGTGCTGGAAGGTGACCCTTATC

TGAAGCAACGCCTGCGTCTGCGTGACTCGTACATCACGACCCTGA

ATGTCTTTCAGGCGTATACCCTGAAGCGTATCCGTGACCCGAATT

ACAAAGTGGAAGTTCGCCCTCCGATCAGCAAGGAGAGCGCGGAG

ACTAGCAAACCAGCGGACGAACTGGTCACCCTGAATCCGACCTCG

GAGTATGCTCCGGGTTTGGAAGATACGCTGATTCTGACGATGAAG

GGTATCGCGGCTGGCATGCAGAACACGGGCTAA(SEQ ID NO.1)

基因ID 001蛋白序列：紫苜蓿磷酸烯醇丙酮酸羧化酶ppc^*

MANKMEKMASIDAQLRQLVPAKVSEDDKLIEYDALLLDRFLDILQD

LHGEDLKDSVQEVYELSAEYERKHDPKKLEELGNLITSFDAGDSIVV

AKSFSHMLNLANLAEEVQIAHRRRNKLKKGDFRDESNATTESDIEET

LKKLVFDMKKSPQEVFDALKNQTVDLVLTAHPTQSVRRSLLQKHGR

VRNCLSQLYAKDITPDDKQELDEALQREIQAAFRTDEIKRTPPTPQDE

MRAGMSYFHETIWKGVPKFLRRVDTALKNIGINERVPYNAPLIQFSS

WMGGDRDGNPRVTPEVTRDVCLLARMMAANLYYSQIEDLMFELSM

WRCNDELRVRAEELHRNSKKDEVAKHYIEFWKKIPLNEPYRVVLGE

VRDKLYRTRERSRYLLAHGYCEIPEEATFTNVDEFLEPLELCYRSLCA

CGDRAIADGSLLDFLRQVSTFGLSLVRLDIRQESDRHTDVMDAITKH

LEIGSYQEWSEEKRQEWLLSELIGKRPLFGPDLPQTDEIRDVLDTFRVI

AELPSDNFGAYIISMATAPSDVLAVELLQRECKVRNPLRVVPLFEKL

DDLESAPAALARLFSIDWYINRIDGKQEVMIGYSDSGKDAGRFSAAW

QLYKAQEDLIKVAQKFGVKLTMFHGRGGTVGRGGGPTHLAILSQPP

ETIHGSLRVTVQGEVIEQSFGEEHLCFRTLQRFTAATLEHGMRPPSSP

KPEWRALMDQMAVIATEEYRSIVFKEPRFVEYFRLATPEMEYGRMN

IGSRPAKRRPSGGIETLRAIPWIFAWTQTRFHLPVWLGFGAAFRQVV

QKDVKNLHMLQEMYNQWPFFRVTIDLVEMVFAKGDPGIAALNDRL

LVSKDLWPFGEQLRSKYEETKKLLLQVAAHKEVLEGDPYLKQRLRL

RDSYITTLNVFQAYTLKRIRDPNYKVEVRPPISKESAETSKPADELVT

LNPTSEYAPGLEDTLILTMKGIAAGMQNTG(SEQ ID NO.2)

基因ID 002核苷酸序列：克鲁氏梭状芽孢杆菌琥珀酸半醛脱氢酶sucD^*

ATGTCCAACGAGGTTAGCATTAAGGAGCTGATTGAGAAGGCGAA

AGTGGCGCAGAAAAAGCTGGAAGCGTATAGCCAAGAGCAAGTTG

ACGTTCTGGTCAAGGCGCTGGGTAAAGTTGTGTACGACAACGCCG

AGATGTTCGCGAAAGAGGCGGTGGAGGAAACCGAGATGGGTGTT

TACGAGGATAAAGTGGCTAAATGTCATCTGAAATCTGGTGCAATC

TGGAATCACATTAAAGATAAGAAAACCGTTGGTATTATCAAGGA

AGAACCGGAGCGTGCGCTGGTGTACGTCGCGAAGCCTAAAGGTG

TTGTGGCGGCGACGACCCCTATCACCAATCCTGTGGTTACCCCGA

TGTGTAACGCGATGGCAGCAATTAAAGGTCGCAACACCATCATTG

TCGCCCCGCATCCGAAGGCGAAGAAGGTGAGCGCGCACACCGTG

GAGCTGATGAATGCAGAACTGAAAAAGTTGGGTGCGCCGGAAAA

CATTATCCAGATCGTTGAAGCCCCAAGCCGTGAAGCAGCCAAGG

AGTTGATGGAGAGCGCAGACGTGGTTATCGCCACGGGTGGCGCA

GGCCGTGTTAAAGCAGCGTACTCCTCCGGCCGTCCGGCATACGGT

GTCGGTCCGGGCAATTCTCAGGTCATTGTCGATAAGGGTTACGAT

TATAACAAAGCTGCCCAGGACATCATTACCGGCCGCAAGTATGAC

AACGGTATCATTTGCAGCTCTGAGCAGAGCGTGATCGCACCGGCG

GAGGACTACGACAAGGTCATCGCGGCTTTCGTCGAGAATGGCGC

GTTCTATGTCGAGGATGAGGAAACTGTGGAGAAATTCCGTAGCAC

GCTGTTCAAGGATGGCAAGATCAATAGCAAAATCATCGGTAAATC

CGTGCAGATCATCGCTGACCTGGCTGGTGTCAAGGTGCCGGAAGG

CACCAAGGTGATCGTGTTGAAGGGCAAGGGTGCCGGTGAAAAGG

ACGTTCTGTGCAAGGAGAAAATGTGCCCGGTCCTGGTTGCCCTGA

AATATGACACCTTTGAGGAGGCGGTCGAGATCGCGATGGCCAACT

ATATGTACGAGGGTGCGGGCCATACCGCCGGTATCCACAGCGATA

ACGACGAGAATATCCGCTACGCGGGTACGGTGCTGCCAATCAGCC

GTCTGGTTGTCAACCAGCCAGCAACTACGGCCGGTGGTAGCTTTA

ACAATGGTTTTAATCCGACCACCACCTTGGGCTGCGGTAGCTGGG

GCCGTAACTCCATTAGCGAGAACCTGACGTATGAGCATCTGATTA

ATGTCAGCCGTATTGGCTATTTCAATAAGGAGGCAAAAGTTCCTA

GCTACGAGGAGATCTGGGGTTAA(SEQ ID NO.3)

基因ID 002蛋白序列：克鲁氏梭状芽孢杆菌琥珀酸半醛脱氢酶sucD^*

MSNEVSIKELIEKAKVAQKKLEAYSQEQVDVLVKALGKVVYDNAE

MFAKEAVEETEMGVYEDKVAKCHLKSGAIWNHIKDKKTVGIIKEEP

ERALVYVAKPKGVVAATTPITNPVVTPMCNAMAAIKGRNTIIVAPHP

KAKKVSAHTVELMNAELKKLGAPENIIQIVEAPSREAAKELMESADV

VIATGGAGRVKAAYSSGRPAYGVGPGNSQVIVDKGYDYNKAAQDII

TGRKYDNGIICSSEQSVIAPAEDYDKVIAAFVENGAFYVEDEETVEKF

RSTLFKDGKINSKIIGKSVQIIADLAGVKVPEGTKVIVLKGKGAGEKD

VLCKEKMCPVLVALKYDTFEEAVEIAMANYMYEGAGHTAGIHSDN

DENIRYAGTVLPISRLVVNQPATTAGGSFNNGFNPTTTLGCGSWGRN

SISENLTYEHLINVSRIGYFNKEAKVPSYEEIWG(SEQ ID NO.4)

基因ID 003核苷酸序列：拟南芥琥珀酸半醛还原酶ssaR_At ^*

ATGGAAGTAGGTTTTCTGGGTCTGGGCATTATGGGTAAAGCTATG

TCCATGAACCTGCTGAAAAACGGTTTCAAAGTTACCGTGTGGAAC

CGCACTCTGTCTAAATGTGATGAACTGGTTGAACACGGTGCAAGC

GTGTGCGAGTCTCCGGCTGAGGTGATCAAGAAATGCAAATACAC

GATCGCGATGCTGAGCGATCCGTGTGCAGCTCTGTCTGTTGTTTTC

GATAAAGGCGGTGTTCTGGAACAGATCTGCGAGGGTAAGGGCTA

CATCGACATGTCTACCGTCGACGCGGAAACTAGCCTGAAAATTAA

CGAAGCGATCACGGGCAAAGGTGGCCGTTTTGTAGAAGGTCCTGT

TAGCGGTTCCAAAAAGCCGGCAGAAGACGGCCAGCTGATCATCC

TGGCAGCAGGCGACAAAGCACTGTTCGAGGAATCCATCCCGGCCT

TTGATGTACTGGGCAAACGTTCCTTTTATCTGGGTCAGGTGGGTA

ACGGTGCGAAAATGAAACTGATTGTTAACATGATCATGGGTTCTA

TGATGAACGCGTTTAGCGAAGGTCTGGTACTGGCAGATAAAAGC

GGTCTGTCTAGCGACACGCTGCTGGATATTCTGGATCTGGGTGCT

ATGACGAATCCGATGTTCAAAGGCAAAGGTCCGTCCATGACTAAA

TCCAGCTACCCACCGGCTTTCCCGCTGAAACACCAGCAGAAAGAC

ATGCGTCTGGCTCTGGCTCTGGGCGACGAAAACGCTGTTAGCATG

CCGGTCGCTGCGGCTGCGAACGAAGCCTTCAAGAAAGCCCGTAG

CCTGGGCCTGGGCGATCTGGACTTTTCTGCTGTTATCGAAGCGGT

AAAATTCTCTCGTGAATAA(SEQ ID NO.5)

基因ID 003蛋白序列：拟南芥琥珀酸半醛还原酶ssaR_At ^*

MEVGFLGLGIMGKAMSMNLLKNGFKVTVWNRTLSKCDELVEHGAS

VCESPAEVIKKCKYTIAMLSDPCAALSVVFDKGGVLEQICEGKGYID

MSTVDAETSLKINEAITGKGGRFVEGPVSGSKKPAEDGQLIILAAGDK

ALFEESIPAFDVLGKRSFYLGQVGNGAKMKLIVNMIMGSMMNAFSE

GLVLADKSGLSSDTLLDILDLGAMTNPMFKGKGPSMTKSSYPPAFPL

KHQQKDMRLALALGDENAVSMPVAAAANEAFKKARSLGLGDLDFS

AVIEAVKFSRE(SEQ ID NO.6)

基因ID 004核苷酸序列：土曲霉琥珀酸半醛还原酶ssaR_At2 ^*

ATGCCACTGGTTGCTCAAAATCCACTGCCACGTGCTATTCTGGGT

CTGATGACTTTCGGTCCGAGCGAAAGCAAAGGTGCGCGTATCACT

TCCCTGGATGAGTTTAACAAGTGCCTGGATTACTTCCAGCAGCAG

GGCTTCCAGGAAATCGATACCGCGCGCATCTACGTCGGCGGTGAA

CAGGAGGCATTCACGGCGCAGGCAAAGTGGAAAGAACGCGGCCT

GACGCTGGCGACTAAGTGGTATCCGCAGTACCCGGGTGCGCACA

AACCGGATGTCCTGCGTCAGAACCTGGAGCTGTCCCTGAAAGAAC

TGGGCACGAACCAGGTCGATATCTTCTATCTGCACGCCGCGGATC

GTTCTGTGCCGTTCGCGGAAACTCTGGAAACTGTTAACGAACTGC

ACAAAGAAGGCAAATTTGTTCAGCTGGGTCTGTCTAACTACACCG

CTTTCGAAGTAGCTGAAATCGTGACCCTGTGTAACGAGCGTGGTT

GGGTTCGTCCGACTATCTACCAGGCGATGTATAACGCTATCACCC

GTAACATCGAAACTGAACTGATCCCGGCGTGCAAGCGTTACGGTA

TTGACATTGTTATCTACAACCCACTGGCGGGTGGCCTGTTCAGCG

GCAAATACAAAGCACAGGACATCCCGGCTGAAGGTCGTTACAGC

GACCAATCTTCCATGGGCCAGATGTACCGCAACCGTTACTTTAAG

GACGCAACCTTTGACGCTCTGCGCCTGATCGAACCGGTTGTTGCG

AAGCACGGCCTGACGATGCCGGAAACCGCGTTCCGCTGGGTCCAC

CACCACTCCGCACTGAACATGGAAGATGGCGGCCGTGACGGCAT

CATTCTGGGTGTAAGCAGCCTGGCTCAGCTGGAAAACAACCTGAA

AGACATTCAGAAAGGTCCGCTGCCGCAGGAGGTTGTAGACGTCCT

GGATCAGGCTTGGCTGGTGGCTAAGCCGACGGCTCCAAACTACTG

GCATCTGGACCTGAAATACACGTACGACACCCAGGAAGCTCTGTT

CAAACCGAAATCTAAGGCGTAA(SEQ ID NO.7)

基因ID 004蛋白序列：土曲霉琥珀酸半醛还原酶ssaR_At2 ^*

MPLVAQNPLPRAILGLMTFGP SESKGARITSLDEFNKCLDYFQQQGF

QEIDTARIYVGGEQEAFTAQAKWKERGLTLATKWYPQYPGAHKPD

VLRQNLELSLKELGTNQVDIFYLHAADRSVPFAETLETVNELHKEGK

FVQLGLSNYTAFEVAEIVTLCNERGWVRPTIYQAMYNAITRNIETELI

PACKRYGIDIVIYNPLAGGLFSGKYKAQDIPAEGRYSDQSSMGQMYR

NRYFKDATFDALRLIEPVVAKHGLTMPETAFRWVHHHSALNMEDG

GRDGIILGVSSLAQLENNLKDIQKGPLPQEVVDVLDQAWLVAKPTAP

NYWHLDLKYTYDTQEALFKPKSKAAVKFSRE(SEQ ID NO.8)

基因ID 005核苷酸序列：小家鼠琥珀酸半醛还原酶ssaR_Mm ^*

ATGCTGCGTGCTGCTTCTCGTGCTGTTGGTCGTGCTGCTGTACGTT

CCGCTCAACGTTCTGGTACTAGCGTTGGCCGTCCGCTGGCGATGT

CCCGTCCACCGCCGCCTCGCGCAGCTAGCGGTGCCCCGCTGCGTC

CGGCAACCGTACTGGGCACTATGGAGATGGGTCGTCGCATGGAC

GCTTCTGCATCCGCGGCAAGCGTTCGTGCGTTCCTGGAACGTGGC

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GAAACGTCTGCAGTGTCCGCGCGTAGACCTGTTCTATCTGCATGC

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TCAGCTGCACCAGGAAGGCAAGTTCGTCGAACTGGGTCTGTCTAA

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CTTCGGCCTGCGCTTTTACGCTTACAACCCGCTGGCGGGTGGTCTG

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TCGCTTCTGGAAAGAGCACCACTTTGAAGCGATCGCACTGGTTGA

AAAAGCGCTGCAGACGACTTATGGCACTAACGCGCCGCGTATGA

CCTCCGCTGCGCTGCGTTGGATGTACCACCATAGCCAGCTGCAGG

GTACTCGCGGCGATGCCGTTATCCTGGGCATGAGCTCCCTGGAAC

AGCTGGAACAGAACCTGGCCGCGACTGAAGAGGGCCCGCTGGAA

CCGGCAGTTGTCGAAGCTTTTGACCAGGCATGGAACATGGTGGCG

CACGAATGTCCAAACTATTTCCGCTAA(SEQ ID NO.9)

基因ID 005蛋白序列：小家鼠琥珀酸半醛还原酶ssaR_Mm ^*

MLRAASRAVGRAAVRSAQRSGTSVGRPLAMSRPPPPRAASGAPLRP

ATVLGTMEMGRRMDASASAASVRAFLERGHSELDTAFMYCDGQSE

NILGGLGLGLGSGDCTVKIATKANPWEGKSLKPDSVRSQLETSLKRL

QCPRVDLFYLHAPDHSTPVEETLRACHQLHQEGKFVELGLSNYASW

EVAEICTLCKSNGWILPTVYQGMYNATTRQVEAELLPCLRHFGLRFY

AYNPLAGGLLTGKYKYEDKDGKQPVGRFFGNNWAETYRNRFWKE

HHFEAIALVEKALQTTYGTNAPRMTSAALRWMYHHSQLQGTRGDA

VILGMSSLEQLEQNLAATEEGPLEPAVVEAFDQAWNMVAHECPNYFR(SEQ ID NO.10)

基因ID 006核苷酸序列：恶臭假单胞菌/真养产碱杆菌JMP134聚羟基链烷酸酯合酶融合蛋白phaC3/C1

ATGACTAGAAGGAGGTTTCATATGAGTAACAAGAACAACGATGA

GCTGGCGACGGGTAAAGGTGCTGCTGCATCTTCTACTGAAGGTAA

ATCTCAGCCGTTTAAATTCCCACCGGGTCCGCTGGACCCGGCCAC

TTGGCTGGAATGGAGCCGTCAGTGGCAAGGTCCGGAGGGCAATG

GCGGTACCGTGCCGGGTGGCTTTCCGGGTTTCGAAGCGTTCGCGG

CGTCCCCGCTGGCGGGCGTGAAAATCGACCCGGCTCAGCTGGCAG

AGATCCAGCAGCGTTATATGCGTGATTTCACCGAGCTGTGGCGTG

GTCTGGCAGGCGGTGACACCGAGAGCGCTGGCAAACTGCATGAC

CGTCGCTTCGCGTCCGAAGCGTGGCACAAAAACGCGCCGTATCGC

TATACTGCGGCATTTTACCTGCTGAACGCACGTGCACTGACGGAA

CTGGCTGATGCAGTAGAAGCGGATCCGAAAACCCGTCAGCGTATC

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TTCCTGGCCACCAACCCGGACGCTCAGAACCGTCTGATCGAGAGC

CGTGGTGAAAGCCTGCGTGCCGGCATGCGCAATATGCTGGAAGAT

CTGACCCGCGGTAAAATTTCCCAAACCGATGAGACTGCCTTCGAA

GTAGGCCGTAACATGGCAGTTACCGAAGGTGCTGTGGTATTCGAA

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GTATACACCCGTCCGCTGCTGCTGGTACCGCCGTGCATTAACAAG

TTCTATATTCTGGACCTGCAGCCGGAAGGTTCTCTGGTCCGTTACG

CAGTCGAACAGGGTCACACTGTATTCCTGGTGAGCTGGCGCAATC

CAGACGCTAGCATGGCTGGCTGTACCTGGGATGACTATATTGAAA

ACGCGGCTATCCGCGCCATCGAGGTTGTGCGTGATATCAGCGGTC

AGGACAAGATCAACACCCTGGGCTTTTGTGTTGGTGGCACGATCA

TCTCCACTGCCCTGGCGGTCCTGGCCGCCCGTGGTGAGCACCCGG

TGGCCTCTCTGACCCTGCTGACTACCCTGCTGGACTTCACCGATAC

TGGTATCCTGGATGTTTTCGTGGACGAGCCACACGTTCAGCTGCG

TGAGGCGACTCTGGGCGGCGCCAGCGGCGGTCTGCTGCGTGGTGT

CGAGCTGGCCAATACCTTTTCCTTCCTGCGCCCGAACGACCTGGTT

TGGAACTACGTTGTTGACAACTATCTGAAAGGCAACACCCCGGTA

CCTTTCGATCTGCTGTTCTGGAACGGTGATGCAACCAACCTGCCT

GGTCCATGGTACTGTTGGTACCTGCGTCATACTTACCTGCAGAAC

GAACTGAAAGAGCCGGGCAAACTGACCGTGTGTAACGAACCTGT

GGACCTGGGCGCGATTAACGTTCCTACTTACATCTACGGTTCCCG

TGAAGATCACATCGTACCGTGGACCGCGGCTTACGCCAGCACCGC

GCTGCTGAAGAACGATCTGCGTTTCGTACTGGGCGCATCCGGCCA

TATCGCAGGTGTGATCAACCCTCCTGCAAAGAAAAAGCGTTCTCA

TTGGACCAACGACGCGCTGCCAGAATCCGCGCAGGATTGGCTGGC

AGGTGCTGAGGAACACCATGGTTCCTGGTGGCCGGATTGGATGAC

CTGGCTGGGTAAACAAGCCGGTGCAAAACGTGCAGCTCCAACTG

AATATGGTAGCAAGCGTTATGCTGCAATCGAGCCAGCGCCAGGCC

GTTACGTTAAAGCGAAAGCATAA(SEQ ID NO.11)

基因ID 006蛋白序列：恶臭假单胞菌/真养产碱杆菌JMP134聚羟基链烷酸酯合酶融合蛋白phaC3/C1

MSNKNNDELATGKGAAASSTEGKSQPFKFPPGPLDPATWLEWSRQ

WQGPEGNGGTVPGGFPGFEAFAASPLAGVKIDPAQLAEIQQRYMRD

FTELWRGLAGGDTESAGKLHDRRFASEAWHKNAPYRYTAAFYLLN

ARALTELADAVEADPKTRQRIRFAVSQWVDAMSPANFLATNPDAQN

RLIESRGESLRAGMRNMLEDLTRGKISQTDETAFEVGRNMAVTEGA

VVFENEFFQLLQYKPLTDKVYTRPLLLVPPCINKFYILDLQPEGSLVR

YAVEQGHTVFLVSWRNPDASMAGCTWDDYIENAAIRAIEVVRDISG

QDKINTLGFCVGGTIISTALAVLAARGEHPVASLTLLTTLLDFTDTGIL

DVFVDEPHVQLREATLGGASGGLLRGVELANTFSFLRPNDLVWNYV

VDNYLKGNTPVPFDLLFWNGDATNLPGPWYCWYLRHTYLQNELKE

PGKLTVCNEPVDLGAINVPTYIYGSREDHIVPWTAAYASTALLKNDL

RFVLGAS GHIAGVINPPAKKKRSHWTNDALPESAQDWLAGAEEHHG

SWWPDWMTWLGKQAGAKRAAPTEYGSKRYAAIEPAPGRYVKAKA

(SEQ ID NO.12)

实施例9：从产生聚-4-羟基丁酸的经遗传工程化的微生物的热解来制备γ-丁内酯

使用遗传修饰的大肠杆菌菌株，在20L New Brunswick Scientific发酵罐(BioFlo 4500)中生产含有聚(4-羟基丁酸)(P4HB)的生物质，所述菌株为从用作碳进料源的葡萄糖浆产生聚-4HB而专门设计的。大肠杆菌菌株、发酵条件、培养基和进料条件的实例参见：美国专利号6,316,262、6,689,589、7,081,357和7,229,804，它们通过引用并入本文。所述大肠杆菌菌株产生的发酵液具有大约100-120g P4HB/kg发酵液的P4HB滴度。在发酵结束后，将100g发酵液(例如P4HB生物质)与含有10重量％石灰的(Ca(OH)₂95+％，Sigma Aldrich)水性料浆相混合。然后使用红外热平衡(MB-45Ohaus水分分析仪)在150℃下在铝称重盘中加热发酵液+石灰混合物的2g部分至恒重。残余水保持＜5重量％。在干燥的发酵液中的最终石灰浓度是50g石灰/kg干固体或5重量％。还制备了仅含有干燥的发酵液(没有加入石灰)的样品。另外，通过如在美国专利号7,252,980和7,713,720中所述的溶剂萃取回收纯的聚-4HB的样品，随后烘干，以去除残余的溶剂。

在N₂气体吹扫下，使用300℃的等温温度，通过TGA来分析干燥的P4HB生物质样品。图3显示了含有石灰(虚线)和不含有石灰(实线)的干燥的发酵液的TGA重量减轻相对于时间的曲线。每个干燥的发酵液样品表现出单个重大的重量减轻事件。在所述图中也显示了重量减轻曲线的斜率(指示热降解速率)和重量减轻结束的开始时间。表22显示了2个干燥的发酵液样品的热降解速率数据。与没有加入石灰的干燥的发酵液相比，当加入5重量％石灰时，干燥的发酵液表现出快34％的重量减轻速率。在加入石灰样品的干燥的发酵液中，热降解结束的开始时间也短了大约30％。这些结果表明，石灰催化剂会显著加速P4HB生物质热降解过程。

然后通过Py-GC-MS分析了干燥的发酵液样品和纯的聚-4HB样品，以便鉴别在惰性气氛下在300℃在热降解过程中产生的化合物。图4显示了热解的纯的聚-4HB、没有加入石灰的干燥的发酵液和加入石灰的干燥的发酵液的色谱图。对于所有样品，从在300℃的热解鉴别出2个主要的热降解组分：GBL(在6.2min的峰)和GBL的二聚体(在11.1min的峰)。GBL的二聚体被鉴别为(3-(二氢-2(3H)-呋喃亚基)二氢-2(3H)-呋喃酮)。图4显示了鉴别这2个峰的质谱文库比对。

下面的表22总结了对于纯的聚-4HB聚合物、没有加入石灰的干燥的聚-4HB发酵液和加入石灰的干燥的聚-4HB发酵液测得的Py-GC-MS数据。观察到在加入石灰催化剂的情况下，来自发酵液的GBL的选择性和产率均增加。如下计算产率：取得GBL峰面积计数，并除以各个样品中P4HB的重量。对于发酵液样品，测得％P4HB为总生物质的约49重量％。发酵液体培养基通常具有存在于其中的钾(4-7重量％)和钠金属盐(＜1重量％)，使得在加入石灰以后GBL的产率的增加仅为10％。但是，在加入石灰以后，GBL的选择性增加了2的因数。从表22可见，更高的石灰浓度抑制了GBL二聚体的形成，同时增加了GBL相对于热解的聚-4HB的重量的产率。

表22.聚-4HB纯的聚合物、干燥的聚-4HB发酵液和加入石灰的干燥的聚-4HB发酵液在300℃的热解-GC-MS和TGA数据的总结

^*由在N₂气氛下在300℃的TGA重量减轻曲线的斜率测得

实施例10.温度、催化剂类型、催化剂浓度和发酵液类型对由产生聚-4-羟基丁酸的经遗传工程化的微生物的热解制备γ-丁内酯的影响

在该实施例中，进行设计的实验(DOE)以测定热解温度、催化剂类型、催化剂浓度和发酵液类型对从含有P4HB的微生物发酵液产生的GBL的纯度的影响。表23显示了DOE参数和测试的条件。共测试了16种不同的实验条件。使用Py-GC-MS来测量GBL纯度。在各种条件下进行2个重复，共运行32个Py-GC-MS。也测量TGA以评估催化剂对P4HB在不同热解温度的热降解速率的影响。对于这些测量，在各个实验条件下进行仅单次运行。为了对比，也制备了没有加入催化剂的干燥的发酵液+P4HB样品(洗涤的和未洗涤的)，并通过TGA和Py-GC-MS进行分析，但是不是总体实验的一部分。

表23.用于测定热解温度、催化剂类型、催化剂浓度和发酵液类型对从微生物发酵液+P4HB产生的GBL纯度的影响的实验参数和条件的设计

^*金属离子相对于发酵液的干燥细胞团的重量％。

使用遗传修饰的大肠杆菌菌株，在20L New Brunswick Scientific发酵罐(BioFlo 4500)中产生含有聚(4-羟基丁酸)(P4HB)的生物质，所述菌株为从用作碳进料源的葡萄糖浆高产率地产生聚-4HB而专门设计的。大肠杆菌菌株、发酵条件、培养基和进料条件的实例参见：美国专利号6,316,262、6,689,589、7,081,357和7,229,804。所述大肠杆菌菌株产生的发酵液具有大约100-120g PHA/kg发酵液的P4HB滴度。在发酵后，将含有微生物生物质和P4HB聚合物的发酵液分成2份。一份不经任何进一步的加工而使用，并被确定为“未洗涤的”发酵液。所述未洗涤的发酵液具有13.7％的干固体含量(使用MB-45Ohaus水分分析仪测得的干固体重量)。另一份如下洗涤：将等体积的蒸馏的去离子水加入发酵液中，将该混合物搅拌2分钟，离心，然后倾析液体，并保留固体生物质+P4HB。重复洗涤步骤第2次，然后在离心和倾析以后，将保留的固体再次重新悬浮于去离子水中，得到12.9重量％的干固体溶液。将该物质命名为“洗涤的”发酵液。表24显示了通过2种发酵液类型的离子色谱法对痕量金属的分析。结果表明，未洗涤的发酵液具有高水平的钾和钠离子存在，这是由于用于培养微生物细胞的培养基组分。在洗涤步骤以后，钾、镁和钠离子显著减少，由此使发酵液+P4HB的总金属含量降低了6的因数。

表24.在用蒸馏的去离子水洗涤之前和之后，发酵液+P4HB的离子色谱法结果的总结

发酵液+P4HB类型	金属离子	金属离子浓度
			未洗涤的	钙	39.8ppm
	镁	811ppm
				钾	6.07％
	钠	0.38％
			洗涤(2次)	钙	40.2ppm
	镁	419ppm
				钾	0.83％
	钠	未检测出

在该实验中使用的热解催化剂包括Ca(OH)₂(95+％SigmaAldrich)、Mg(OH)₂(Sigma Aldrich)、FeSO₄·7H₂O(JT Baker)和Na₂CO₃(99.5+％Sigma Aldrich)。在去离子水中制备Ca(OH)₂、Mg(OH)₂和FeSO₄·7H₂O催化剂的水性料浆(25-30重量％固体)，并加入发酵液样品中，同时将Na₂CO₃固体直接地加入发酵液+P4HB中。如表23所示，实验的目标催化剂浓度是1％、3％、5％和10％，这是基于金属离子重量与发酵液的干固体重量之比。为了制备发酵液+P4HB/催化剂样品，将10g洗涤的或未洗涤的发酵液加入15ml离心试管中。接着，加入适当量的催化剂溶液或固体，并将该混合物涡旋30秒。然后将该混合物离心，倾析，并倒入干燥盘中。最后，将干燥盘放在110℃的烘箱中，并干燥至恒重。也通过离心、倾析和在110℃干燥，制备未洗涤的和洗涤的不含有催化剂的发酵液的干燥样品。

表25显示了对没有加入催化剂的发酵液+P4HB样品的TGA和Py-GC-MS分析的结果。

表25.没有加入催化剂的发酵液+P4HB样品的TGA和Py-GC-MS结果的总结

来自表25的结果表明，在热解之前洗涤发酵液+P4HB对降低在所有热解温度的热分解速率具有显著影响。从表24中的离子色谱法结果可以看出，与未洗涤的发酵液相比，在洗涤的发酵液中存在的金属离子的总浓度降低了6的因数。这表示，在发酵运行以后，在发酵液+P4HB中存在的金属离子自身对热解过程中的P4HB降解速率具有催化作用。Kim等人(2008，Polymer Degradation and Stability，93，第776-785页)已经证实，金属离子Ca、Na、Mg、Zn、Sn和Al都可有效地催化P4HB的热降解。但是，没有证实的是，这些金属离子对通过P4HB的热分解生成的GBL的纯度的影响。表25表明，对于未洗涤的发酵液+P4HB样品，GBL纯度(GBL/GBL二聚体峰面积比)随着热解温度升高而降低。对于洗涤的样品，该纯度随着热解温度的升高边际地提高。在表25中的数据提示，对于通过P4HB和催化剂的热分解来制备基于生物的GBL的任意方法存在反应速度和终产物纯度之间的折衷。下述的数据将表明，使用的催化剂的类型和浓度会以不曾预料的方式显著影响热降解速率和GBL纯度。

表26总结了随着催化剂类型、浓度、热解温度和发酵液类型而变化的发酵液+P4HB热解的TGA和Py-GC-MS实验结果。

表26.随着催化剂类型、催化剂浓度、热解温度和发酵液类型而变化的发酵液+P4HB的TGA和Py-GC-MS结果的总结

^*相对于发酵液的干固体重量的金属离子Wt％。

在表26中的数据的统计分析(使用来自SAS的JMP统计软件)表明，对于最快的热降解速率，要使用的最佳变量参数是未洗涤的发酵液+P4HB、在5％浓度的Na₂CO₃催化剂和300℃的热解温度。催化剂类型是影响降解速率的最重要的变量，所述降解速率的变化范围是-1至-185％重量减轻/min。含有FeSO₄催化剂的样品具有甚至比洗涤的发酵液+P4HB更低的降解速率，这指示，该化合物更多地作为P4HB热稳定剂而不是助催化剂起作用。具有最高降解速率的样品是含有Na₂CO₃或Ca(OH)₂的样品。更高的温度和通常更高的催化剂浓度也有利于更快的降解速率。

GBL纯度数据的统计分析表明，使用在10％浓度的Ca(OH)₂催化剂和250℃的热解温度，发现了最高GBL纯度的最佳变量参数。与其它变量相比，发酵液类型对GBL纯度具有可忽略的影响。其值范围是17-2016的GBL纯度(GBL/GBL二聚体峰面积比)的统计上最显著的变量是催化剂浓度和类型。应当指出，在实验结果中的GBL纯度的范围上限值远远高于在表25中关于未洗涤的发酵液+P4HB样品所观察到的那些值。这指示，保留在发酵液中的金属离子(主要是钾)不会象在实验中使用的那些一样有效地提高GBL纯度。也发现热解温度是GBL纯度的统计上显著的变量(更高的温度产生更多的二聚体)。在表26中，含有FeSO₄催化剂的发酵液+P4HB的缺少Py-GC-MS数据是由于下述事实：在Py-GC-MS条件下，样品的热解需要更久，因此不可定量。这与TGA数据相一致，所述TGA数据表明FeSO₄起热稳定剂而不是助催化剂的作用。

如实施例9所示，在生物质的热解过程中，向微生物生物质+P4HB中加入催化剂Ca(OH)₂会抑制GBL二聚体的形成，产生更纯的GBL液体。上述实验数据证实了该观察结果，并表明在确定通过热解从干燥的发酵液+P4HB生产高纯度GBL的最佳条件时，催化剂浓度和热解温度也是重要的。还证实，催化剂和热解温度的选择会影响P4HB热降解速率。因此，当设计用于生产基于生物的GBL的稳定方法时，需要小心地选择正确的条件来优化这两个变量。

实施例11.从生产聚-4-羟基丁酸的经遗传工程化的微生物的热解更大规模地生产γ-丁内酯

在下述实施例中，将描绘从发酵液+P4HB+催化剂混合物的热解来生产GBL，证实在百克规模下生产高纯度的、高产率的基于生物的GBL的能力。

使用遗传修饰的大肠杆菌菌株，在20L New Brunswick Scientific发酵罐(BioFlo 4500)中生产含有聚-4-羟基丁酸(聚-4HB)的生物质，所述菌株为从用作碳进料源的葡萄糖浆高产率地生产聚-4HB而专门设计的。大肠杆菌菌株、发酵条件、培养基和进料条件的实例参见：美国专利号6,316,262、6,689,589、7,081,357和7,229,804。所述大肠杆菌菌株产生的发酵液具有大约100-120g PHA/kg发酵液的P4HB滴度。在发酵后，如下用去离子水洗涤发酵液：加入等体积的水，混合2分钟，离心，并倾析水。接着，将洗涤的发酵液与石灰混合(Ca(OH)₂标准水合石灰98％，Mississippi Lime)达到4重量％的干固体。然后在滚筒干燥器中在125-130℃下干燥混合物至恒重。在干燥的生物质中的水分水平是大约1-2重量％。通过离子色谱法测得钙离子在干燥的发酵液+P4HB中的最终的重量％是1.9％(3.5重量％的Ca(OH)₂)。

使用悬浮于蛤壳管式炉内的旋转4英寸直径石英玻璃干燥炉进行干燥的发酵液+P4HB+Ca(OH)₂的热解。在该过程开始时，将称量的干燥的发酵液+P4HB+Ca(OH)₂样品放入玻璃干燥炉内，并建立氮吹扫流。然后开始炉旋转和加热。随着炉的温度达到它的设定点值，由发酵液+P4HB+Ca(OH)₂样品产生的气体被氮吹扫气扫出干燥炉，并进入一连串玻璃冷凝器或冷阱。所述冷凝器由垂直的、冷却的玻璃冷凝塔组成，冷凝物收集球位于它的基部。使保持在0℃的乙二醇/水混合物穿过所有玻璃冷凝器进行循环。离开第一个冷凝器的顶部的冷却的气体被引导向下穿过第二个冷凝器，并穿过第二个冷凝物收集球，然后鼓泡穿过装有去离子水的玻璃吸收管。图7显示了热解器和气体收集装置的示意图。

对于更大规模的热解实验，首先将292g干燥的发酵液+P4HB+Ca(OH)₂加载进在室温下的石英干燥炉中。基于Ca(OH)₂载荷，估测P4HB生物质的总重量是281.4g。也基于干固体测得P4HB在混合物中的重量％是66.7％(参见Doi，Microbial Polyesters，John Wiley andSons，第23页，1990)，其使得干燥炉中的P4HB的质量等于195g。然后密封该系统，建立大约1500ml/min的氮气吹扫。给该炉通电，将干燥的发酵液+P4HB+Ca(OH)₂加热至250℃的目标热解温度。在热解过程中，将生物质+P4HB的热降解的产物GBL收集在位于冷却的冷凝器下面的冷凝阱中。可以看到水最初收集在各个收集球中。大部分液化的产物(＞95％)被收集在第一个玻璃收集球中。总热解运行时间大约是60分钟。测得在热解以后保留的生物质的重量是11.9g。

在热解运行结束以后，收集来自冷凝器的冷凝物，并称重。结果证实，合并的冷凝物重量是181g。通过Karl Fisher水分分析和GC-MS对冷凝物的分析表明，所述冷凝物含有6.1％水、0.06％脂肪酸，所述物质的余量为GBL产物。因此计算出GBL产物产率((g GBL产物/g起始P4HB)x100％)为大约87％。GC-MS结果也表明，在GBL产物中的大部分杂质是GBL二聚体，其中计算出峰面积GBL/GBL二聚体之比为2777。这与来自实施例10的实验结果相一致，所述实验结果表明，最高GBL纯度的最佳工艺条件是：在250℃的热解温度，使用Ca(OH)₂催化剂。也通过GC-MS检测出其它杂质(诸如有机硫和酰胺化合物)存在于冷凝物中。计算出P4HB生物质固体向液体的转化率((g干燥的生物质-g残余生物质/g干燥的生物质)x100％)是96％。

在另一个实施方案中，也可以使从本文所述的方法产生的γ-丁内酯直接地经受氢化、酯化或酰胺化条件，以生成对应的二醇、羟基酯和酰胺(例如，当分别进行H₂的氢化、烷基醇的酯化和烷基胺的酰胺化时生成1，4-丁二醇、4-羟基丁酸烷基酯或N-烷基2-吡咯烷酮)。

脂肪和油生成醇的加工在这方面提供了一些指导。油和脂肪是用于多种用途(诸如润滑剂和表面活性剂)中的脂肪醇的重要来源。脂肪通常不会被直接地氢化，因为在氢化过程中，强烈的反应条件倾向于将甘油降解为低级醇诸如丙二醇和丙醇。由于该原因，更常规地首先水解油，然后预纯化脂肪酸，以实现更有效的氢化(参见例如，Lurgi氏氢化方法，见于Bailey’s Industrial Oil and Fat Products，第6版，第6卷集.FereidoonShahidi编，John Wiley&Sons，Inc.2005)。

实施例12.通过热解生产聚-4-羟基丁酸的经遗传工程化的生物质、随后直接氢化来制备基于生物的1，4-丁二醇。

下述实施例描述了从含有聚-4HB(其然后可以通过热解转化成γ-丁内酯，并最后通过直接氢化转化成1，4-丁二醇)的生物质制备基于生物的1，4-丁二醇。氢化可以发生在液相或气相中。下面给出了两种方法的实例。

液相氢化方法：在大气压下在氮下将含有＞40重量％聚-4HB的5g微生物生物质加热至275℃。使用保持在20℃的水冷却的冷凝器，收集产生的由＞90％GBL组成的蒸汽。然后可以回收大约2-3g GBL产物，用于随后的氢化。50mL高压釜装入0.3g在美国专利4,048,196中描绘的Cu/Al/Zn氧化物催化剂。然后用98％/2％的氮/氢气体混合物冲洗高压釜，并加热至150℃以还原催化剂。将回收的GBL产物在去离子水中的10重量％溶液导入反应器中。使用纯的H₂气将该反应器进一步加压至250巴，允许氢化反应进行1-2小时。在反应结束后，冷却反应器，并减压，随后用氮冲洗。卸载高压釜内容物，并通过倾析分离出催化剂。用额外的去离子水洗涤催化剂，并将洗液加入上清液中。过滤上清液的等分试样，并通过HPLC进行分析，以测定GBL的转化率和1，4-丁二醇的百分产率(基于摩尔)。

汽相氢化：使用在实施例11中所述的更大规模热解装置，将从P4HB生物质+Ca(OH)₂的250℃热解产生的汽相GBL产物导入加热的和密封的反应器管中，所述反应器管具有115的高径比。预先已经给所述反应器装载了3.5kg在美国专利4,652,685中描述的还原的Cu/Cr/Ba氧化物催化剂团粒。通过首先在N₂吹扫下将反应器加热至130℃还原所述催化剂。然后将反应器加热至170℃，停止N₂流，并将100％H₂导入反应器中。然后使反应器温度升高至210℃，并将H₂流速设定在约8kg/小时。将通过热解P4HB生物质+Ca(OH)₂产生的蒸汽化的GBL导入反应器中，并穿过还原的催化剂。然后将氢化产物输送至水冷却的维持在20℃的冷凝器中，并收集液体冷凝物。通过HPLC，分析冷凝物的等分试样，以测定GBL的转化率和1，4-丁二醇的百分比产率(基于摩尔)。

实施例13.通过热解生产聚-4-羟基丁酸的经遗传工程化的生物质、随后与单甲胺反应来制备N-甲基吡咯烷酮。

下述实施例描述了从含有聚-4HB的生物质制备N-甲基吡咯烷酮，所述聚-4HB可以通过热解转化成γ-丁内酯，最后通过与单甲胺反应生成N-甲基吡咯烷酮。

在大气压下在氮下将含有＞40重量％聚-4HB的5g微生物生物质加热至275℃。使用保持在20℃的水冷却的冷凝器收集产生的由＞90％GBL组成的蒸汽。然后可以回收大约2-3g GBL产物，用于随后的反应。给50mL高压釜装入3g GBL产物和3.8g 40％单甲胺水溶液。将高压釜加热至290℃的温度，这产生77巴的压力。该反应持续共2小时的时间。通过HPLC分析反应产物的等分试样，以测定GBL产物的转化率和N-甲基吡咯烷酮的％产率(基于摩尔)。如在美国专利6,075,153中所述进行该反应。

实施例14.通过热解生产聚-4-羟基丁酸的经遗传工程化的生物质、随后酰胺化、汽相脱水和聚合来制备聚-乙烯基吡咯烷酮。

在该实施例中，描述了一种从P4HB生物质制备聚-乙烯基吡咯烷酮的方法。

在大气压下在氮下将含有＞40重量％聚-4HB的5g微生物生物质加热至275℃。使用保持在20℃的水冷却的冷凝器收集产生的由＞90％GBL组成的蒸汽。然后可以回收大约2-3g GBL产物，用于随后的反应。给50mL高压釜装入3g GBL产物和2.3g乙醇胺(Sigma Aldrich，目录号398136，＞99％纯度)。将高压釜在氮吹扫下加热至200℃的温度90分钟。反应后，取出混合物，并放入配有水冷却的微型冷凝器的10ml圆底烧瓶中。在105℃的温度蒸馏该混合物，以去除水。然后使用在美国专利7,141,679中描述的在二氧化硅催化剂上的铯，将剩余的液体N(2-羟基乙基)-2-吡咯烷酮(HEP)脱水。给1英寸直径的不锈钢管反应器装入4g催化剂，并密封。然后在氮吹扫下将该反应器加热至375℃。将回收的HEP与足够的去离子水混合，以制备10％溶液。据报道，加入的水会减少在脱氢过程中N-乙基-2-吡咯烷酮副产物的形成。将HEP溶液装入反应器中，并蒸发。使HEP和水蒸汽穿过催化剂，反应器流出物离开反应器，将NVP收集在冷阱中。可以在美国专利4,254,239所述的水性条件下，或在美国专利4,058,655所述的有机溶剂中，进行收集的NVP的聚合。两种方法使用有机过氧化物来引发聚合反应。

实施例15：基于生物的γ-丁内酯向2-吡咯烷酮的非催化转化

在该实施例中，描述了一种用于从P4HB生物质开始制备2-吡咯烷酮的方法。如在美国专利5,393,888中所述，将中间体GBL非催化地转化成2-吡咯烷酮。

在大气压下在氮下将含有＞40重量％聚-4HB的5g微生物生物质加热至275℃。使用保持在20℃的水冷却的冷凝器收集产生的由＞90％GBL组成的蒸汽。然后回收大约2-3g GBL产物，用于随后的反应。将50mL高压釜维持在325℃和1,000psi下。将3g GBL导入反应器中，在达到反应温度以后，在间隔10分钟的2个步骤中导入液氨，以实现0.6mol氨与1.0mol GBL的最终摩尔比。继续反应同时维持温度和压力另外30分钟，然后使反应混合物冷却至室温，然后移除反应混合物和通过双阶段蒸馏纯化以去除低沸点和高沸点杂质。在蒸馏以后，生成纯度超过99％的2-吡咯烷酮。

可以在本文没有明确公开的任意一个或多个要素、一个或多个限制不存在下的情况下适当地实施本文示例性地描述的实施方案。因而，例如，术语“包含”、“包括”、“含有”等应当广阔地且无限制地解读。另外，本文采用的术语和表述已经用作描述性的、而不是限制性的术语，在这样的术语和表述的应用中，无意排除显示的和描述的特征的任何等效物或其部分，但是应当认识到，不同的改进可能是在要求保护的技术的范围内。另外，短语“基本上由……组成”应当理解为包括明确列出的那些要素和不会实质上影响要求保护的技术的基础和新特性的那些额外要素。短语“由……组成”排除没有指出的任何要素。

本公开内容不受在本说明书中描述的具体实施方案的限制。本领域技术人员会明白，可以做出许多修改和变化，而不脱离它的精神和范围。除了本文列出的那些以外，本领域技术人员从前述描述会明白在公开内容的范围内的功能上等效的方法和组合物。这样的修改和变化意图落入所附权利要求书的范围内。本公开内容仅由所附权利要求书以及这些权利要求的等同方案的完整范围进行限制。应当理解，本公开内容不限于具体的方法、试剂、化合物、组合物或生物系统，它们当然可以变化。还应当理解，在本文中使用的术语仅用于描述具体实施方案的目的，无意进行限制。

另外，在以马库什组(Markush group)的方式描述公开内容的特征或方面的情况下，本领域技术人员会认识到，该公开内容由此同样以马库什组的任何单个成员或成员亚组的方式描述。

在本说明书中提及的所有出版物、专利申请、授权的专利和其它文件都通过引用并入本文中，如同具体地且单个地指出每篇出版物、专利申请、授权的专利或其它文件通过引用整体并入。在通过引用并入的内容中含有的定义在下述情况下被排除：如果它们与在本公开内容中的定义相矛盾。

在本文中引用的所有专利、公开的申请和参考文献的教导通过引用整体并入。

尽管已经参照其实施例实施方案具体地显示和描述了本发明，本领域技术人员会理解，在其中可以做出形式和细节的不同变化，而不脱离由所附权利要求书包括的本发明的范围。

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种用于生产基于生物的γ-丁内酯产物的方法，所述方法包括：

a)混合包含聚-4-羟基丁酸的经遗传工程化的生物质和催化剂；和

b)将所述生物质与所述催化剂一起加热，以将所述聚4-羟基丁酸转化成γ-丁内酯产物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述经遗传工程化的生物质来自具有聚-4-羟基丁酸途径的重组宿主，其中所述宿主在它的非CoA依赖的NAD依赖性的琥珀酸半醛脱氢酶基因或它的非CoA依赖的NADP依赖性的琥珀酸半醛脱氢酶基因中具有抑制性突变，或在两个基因中具有所述抑制性突变，且具有稳定地掺入的编码一种或多种选自下述的酶的一个或多个基因：琥珀酰-CoA:辅酶A转移酶，其中所述琥珀酰-CoA:辅酶A转移酶能够将琥珀酸转化成琥珀酰-CoA；琥珀酸半醛脱氢酶，其中所述琥珀酸半醛脱氢酶能够将琥珀酰-CoA转化成琥珀酸半醛；琥珀酸半醛还原酶，其中所述琥珀酸半醛还原酶能够将琥珀酸半醛转化成4-羟基丁酸；CoA转移酶，其中所述CoA转移酶能够将4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰基-CoA；和聚羟基链烷酸酯合酶，其中所述聚羟基链烷酸酯合酶能够将4-羟基丁酰基-CoA聚合成聚-4-羟基丁酸。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述经遗传工程化的生物质来自具有稳定地掺入的编码一种或多种选自下述的酶的一个或多个基因的重组宿主：磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其中所述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶能够将磷酸烯醇丙酮酸转化成草酰乙酸；异柠檬酸裂合酶，其中所述异柠檬酸裂合酶能够将异柠檬酸转化成乙醛酸；苹果酸合酶，其中所述苹果酸合酶能够将乙醛酸转化成苹果酸和琥珀酸；琥珀酸-CoA连接酶(形成ADP的)，其中所述琥珀酸-CoA连接酶(形成ADP的)能够将琥珀酸转化成琥珀酰-CoA；NADP依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶，其中所述NADP依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶能够将甘油醛3-磷酸转化成1，3-二磷酸甘油酸，形成NADPH+H⁺；NAD依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶，其中所述NAD依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶能够将甘油醛3-磷酸转化成1，3-二磷酸甘油酸，形成NADH+H⁺；丁酸激酶，其中所述丁酸激酶能够将4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰基-磷酸；磷酸丁酰基转移酶，其中所述磷酸丁酰基转移酶能够将4-羟基丁酰基-磷酸转化成4-羟基丁酰基-CoA；并任选地在选自下述的一个或多个基因中具有破坏：yneI、gabD、pykF、pykA、maeA和maeB。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述方法另外包括下述初始步骤：用可再生的原料培养重组宿主，以生成聚-4-羟基丁酸生物质。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述可再生的原料的来源选自：葡萄糖、果糖、蔗糖、阿拉伯糖、麦芽糖、乳糖、木糖、脂肪酸、植物油和生物质衍生出的合成气体或它们的组合。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中所述生物质宿主是细菌、酵母、真菌、藻类、蓝细菌或它们中的任意2种或更多种的混合物。

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述生物质宿主是细菌。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述细菌选自：大肠杆菌、真养产碱菌(重命名为真养产碱杆菌)、芽孢杆菌属、广泛产碱菌、固氮菌属、气单胞菌属、丛毛平胞菌属、假单胞菌、假单胞菌属、罗尔斯通氏菌属、克雷伯菌属、聚球藻属PCC7002、聚球藻属PCC 7942、集胞藻属PCC 6803、嗜热蓝细菌聚球藻BP-I、微温绿硫菌、Chloroflexus auranticus、微温着色菌和酒色着色菌、深红红螺菌、荚膜红细菌和沼泽红假单胞菌。

9.根据权利要求6所述的方法，其中所述重组宿主是藻类。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的方法，其中加热是在约100℃至约350℃的温度下。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的方法，其中所述催化剂是碳酸钠或氢氧化钙。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述催化剂的重量百分比是在约4％至约50％的范围内。

13.根据权利要求1-12中任一项所述的方法，其中加热将所述生物质的水含量降低至约5重量％或更低。

14.根据权利要求1-13中任一项所述的方法，其中所述加热温度是约200℃至约350℃。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述加热温度是约225℃至约300℃。

16.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述加热持续约30秒至约5分钟的时间段。

17.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述加热持续约5分钟至约2小时的时间。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的方法，其另外包括：回收所述γ-丁内酯产物。

19.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述γ-丁内酯产物包含小于5重量％的副产物。

20.根据权利要求1-19中任一项所述的方法，其中进一步加工所述γ-丁内酯，以形成下述的一种或多种：1，4-丁二醇(BDO)、四氢呋喃(THF)、N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N-乙基吡咯烷酮(NEP)、2-吡咯烷酮、N-乙烯基吡咯烷酮(NVP)和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。

21.根据权利要求1所述的方法，其中所述经遗传工程化的生物质来自具有聚-4-羟基丁酸途径的重组宿主，其中所述宿主任选地在它的非CoA依赖的NAD依赖性的琥珀酸半醛脱氢酶基因或它的非CoA依赖的NADP依赖性的琥珀酸半醛脱氢酶基因中具有抑制性突变，或在两个基因中具有抑制性突变，且具有稳定地掺入的编码下述酶的基因：琥珀酰-CoA:辅酶A转移酶，其中所述琥珀酰-CoA:辅酶A转移酶能够将琥珀酸转化成琥珀酰-CoA；琥珀酸半醛脱氢酶，其中所述琥珀酸半醛脱氢酶能够将琥珀酰-CoA转化成琥珀酸半醛；琥珀酸半醛还原酶，其中所述琥珀酸半醛还原酶能够将琥珀酸半醛转化成4-羟基丁酸；CoA转移酶，其中所述CoA转移酶能够将4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰基-CoA；和聚羟基链烷酸酯合酶，其中所述聚羟基链烷酸酯合酶能够将4-羟基丁酰基-CoA聚合成聚-4-羟基丁酸。

22.根据权利要求1所述的方法，其中所述经遗传工程化的生物质来自具有稳定地掺入的编码下述酶的基因的重组宿主：磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其中所述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶能够将磷酸烯醇丙酮酸转化成草酰乙酸；异柠檬酸裂合酶，其中所述异柠檬酸裂合酶能够将异柠檬酸转化成乙醛酸；苹果酸合酶，其中所述苹果酸合酶能够将乙醛酸转化成苹果酸和琥珀酸；琥珀酸-CoA连接酶(形成ADP的)，其中所述琥珀酸-CoA连接酶(形成ADP的)能够将琥珀酸转化成琥珀酰-CoA；NADP依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶，其中所述NADP依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶能够将甘油醛3-磷酸转化成1，3-二磷酸甘油酸，形成NADPH+H⁺；NAD依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶，其中所述NAD依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶能够将甘油醛3-磷酸转化成1，3-二磷酸甘油酸，形成NADH+H⁺；丁酸激酶，其中所述丁酸激酶能够将4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰基-磷酸；磷酸丁酰基转移酶，其中所述磷酸丁酰基转移酶能够将4-羟基丁酰基-磷酸转化成4-羟基丁酰基-CoA；并任选地在选自下述的一个或多个基因中具有破坏：yneI、gabD、pykF、pykA、maeA和maeB。

23.根据权利要求所述的方法1，其中所述经遗传工程化的生物质来自具有聚-4-羟基丁酸途径的重组宿主，其中所述宿主具有稳定地掺入的编码一种或多种选自下述的酶的一个或多个基因：琥珀酰-CoA:辅酶A转移酶，其中所述琥珀酰-CoA:辅酶A转移酶能够将琥珀酸转化成琥珀酰-CoA；琥珀酸半醛脱氢酶，其中所述琥珀酸半醛脱氢酶能够将琥珀酰-CoA转化成琥珀酸半醛；琥珀酸半醛还原酶，其中所述琥珀酸半醛还原酶能够将琥珀酸半醛转化成4-羟基丁酸；CoA转移酶，其中所述CoA转移酶能够将4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰基-CoA；和聚羟基链烷酸酯合酶，其中所述聚羟基链烷酸酯合酶能够将4-羟基丁酰基-CoA聚合成聚-4-羟基丁酸。

24.根据权利要求1所述的方法，其中所述经遗传工程化的生物质来自具有稳定地掺入的编码一种或多种选自下述的酶的一个或多个基因的重组宿主：磷酸烯醇丙酮酸羧化酶，其中所述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶能够将磷酸烯醇丙酮酸转化成草酰乙酸；异柠檬酸裂合酶，其中所述异柠檬酸裂合酶能够将异柠檬酸转化成乙醛酸；苹果酸合酶，其中所述苹果酸合酶能够将乙醛酸转化成苹果酸和琥珀酸；琥珀酸-CoA连接酶(形成ADP的)，其中所述琥珀酸-CoA连接酶(形成ADP的)能够将琥珀酸转化成琥珀酰-CoA；NADP依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶，其中所述NADP依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶能够将甘油醛3-磷酸转化成1，3-二磷酸甘油酸，形成NADPH+H⁺；NAD依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶，其中所述NAD依赖性的甘油醛-3-磷酸脱氢酶能够将甘油醛3-磷酸转化成1，3-二磷酸甘油酸，形成NADH+H⁺；丁酸激酶，其中所述丁酸激酶能够将4-羟基丁酸转化成4-羟基丁酰基-磷酸；磷酸丁酰基转移酶，其中所述磷酸丁酰基转移酶能够将4-羟基丁酰基-磷酸转化成4-羟基丁酰基-CoA；并任选地在选自下述的一个或多个基因中具有破坏：yneI、gabD、pykF、pykA、maeA和maeB。

25.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述催化剂的重量％是在约4％至约50％的范围内，且所述加热是在约300℃下。

26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述催化剂是约4重量％的氢氧化钙，且所述加热是在300℃的温度下。

27.通过前述权利要求中任一项所述的方法生产的基于生物的γ-丁内酯产物。

28.根据权利要求27所述的产物，其中所述γ-丁内酯产物包含小于5重量％的副产物。

29.从可再生资源生产的聚-4-羟基丁酸生物质，所述聚-4-羟基丁酸生物质适合作为用于生产γ-丁内酯产物的原料，其中所述生物质中的聚-4-羟基丁酸水平大于所述生物质的50重量％。

30.根据权利要求27所述的基于生物的γ-丁内酯产物，其中所述产物中的所述γ-丁内酯具有100％的基于生物的碳含量。

31.根据权利要求1-26中任一项所述的方法，其中基于所述产物中的1克γ-丁内酯/克聚-4-羟基丁酸，所述产物是约85重量％或更大。

Claims

b)将所述生物质与所述催化剂一起加热，以将所述聚4-羟基丁酸转化成γ-丁内酯产物，其中所述γ-丁内酯的产率

7.根据权利要求6所述的方法，其中所述生物质宿主是细菌。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述细菌选自：大肠杆菌、真养产碱菌(重命名为真养产碱杆菌)、芽孢杆菌属、广泛产碱菌、固氮菌属、气单胞菌属、丛毛平胞菌属、假单胞菌、假单胞菌属、罗尔斯通氏菌属、克雷伯菌属、聚球藻属的种PCC7002、聚球藻属的种PCC 7942、集胞藻属的种PCC 6803、嗜热蓝细菌聚球藻BP-I、微温绿硫菌、Chloroflexusauranticus、微温着色菌和酒色着色菌、深红红螺菌、荚膜红细菌和沼泽红假单胞菌。

9.根据权利要求6所述的方法，其中所述重组宿主是藻类。

17.根据权利要求1-15中任一项所述的方法，其中所述时间段是约5分钟至约2小时。