CN102365294A - 神经营养因子ngf和bdnf的二肽模拟物 - Google Patents

神经营养因子ngf和bdnf的二肽模拟物 Download PDF

Info

Publication number
CN102365294A
CN102365294A CN2010800142356A CN201080014235A CN102365294A CN 102365294 A CN102365294 A CN 102365294A CN 2010800142356 A CN2010800142356 A CN 2010800142356A CN 201080014235 A CN201080014235 A CN 201080014235A CN 102365294 A CN102365294 A CN 102365294A
Authority
CN
China
Prior art keywords
lys
compound
glu
ser
solution
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN2010800142356A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102365294B (zh
Inventor
S·B·谢列坚金
T·A·古达舍瓦
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Uchrezhdenie Rossiiskoi Akademii Meditsynskikh Nauknauchno Issledovatelsky Institut Farmakologii Imeni VVZakusova Ramn
Original Assignee
Uchrezhdenie Rossiiskoi Akademii Meditsynskikh Nauknauchno Issledovatelsky Institut Farmakologii Imeni VVZakusova Ramn
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Uchrezhdenie Rossiiskoi Akademii Meditsynskikh Nauknauchno Issledovatelsky Institut Farmakologii Imeni VVZakusova Ramn filed Critical Uchrezhdenie Rossiiskoi Akademii Meditsynskikh Nauknauchno Issledovatelsky Institut Farmakologii Imeni VVZakusova Ramn
Publication of CN102365294A publication Critical patent/CN102365294A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102365294B publication Critical patent/CN102365294B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06104—Dipeptides with the first amino acid being acidic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06026—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atom, i.e. Gly or Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0606—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing heteroatoms not provided for by C07K5/06086 - C07K5/06139, e.g. Ser, Met, Cys, Thr
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0606—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing heteroatoms not provided for by C07K5/06086 - C07K5/06139, e.g. Ser, Met, Cys, Thr
    • C07K5/06069—Ser-amino acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06078—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06086—Dipeptides with the first amino acid being basic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06104—Dipeptides with the first amino acid being acidic
    • C07K5/06113—Asp- or Asn-amino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

发明涉及化合物，其具有神经营养素NGF和BDNF的或者激动剂或拮抗剂活性且呈现为是接近或在相应环的β-转角的这些神经营养素的环1或环4区的暴露的部分的类似物的单体或二聚体取代的二肽。这些二肽的N-酰化的取代基是神经营养素一级结构中这些二肽序列之前的氨基酸残基的生物立体异构体。二聚体结构通过使用有二肽经它们的羧基附接的六亚甲基二胺有利地产生。要求保护的化合物在细胞模型中显示神经保护和分化-诱导活性，且以10-9～10-5M的浓度范围增强了磷酸化的酪氨酸激酶A和热休克蛋白Hsp32和Hsp70的量。它们也在动物模型中显示了神经保护，抗-帕金森，抗-中风，抗-缺血，抗-抑郁和抗-遗忘活性，且在阿尔茨海默病的实验模型中活跃。当腹膜内施用时，以0.01～10mg/kg的剂量范围显示这些要求保护的化合物的体内效应。

Description

神经营养因子NGF和BDNF的二肽模拟物
【技术领域】
发明涉及生物有机化学领域，即涉及新的是神经营养因子的模拟物的取代的二肽，其可作为用于调节生长，分化，存活及编程性神经元细胞死亡的药物制剂有用。更特别是，本发明涉及NGF和BDNF环区的单体和二聚体二肽模拟物，其可对于治疗神经退行性疾病包括帕金森病和阿尔茨海默病，亨廷顿舞蹈症，中风，脑缺血，脑创伤，抑郁症等有用。
【背景技术】
神经生长因子(NGF)和脑-来源的神经营养因子(BDNF)是神经营养素家族的成员，其可改善由疾病或创伤所致的神经元存活和阻止神经退行。感觉，交感神经及胆碱能神经元敏感于NGF。使用NGF的治疗推定为阻止阿尔茨海默病的发展，阻止在中风中脑功能损失及改善患者的外周糖尿病性神经病变中的生活质量。此外，NGF推荐为对于治疗神经元损伤及作为用于神经外胚层肿瘤的靶向制剂有用。对于NGF在治疗中的用途的综述，见Saragovi H.U.and Burgess K.，Expert Opinion in Therapeutic Patents 1999，9：737-751；Schulte-Herbruggen O.et al.，Curr.Med.Chem.2007，14(22)：2318-2329。
在CNS中，BDNF作为用于在肌萎缩性侧索硬化症中变质的脑和脊柱运动神经元(Thoenen H.et al.，C.R.Acad.Sci.III，1993，316(9)：1158-63)，及用于在帕金森病中损失的黑质的多巴胺能神经元(SpinaM.B.et al.，J.Neurochem.1992，59(1)：99-106)的有力的营养因子发挥作用。在周边，BDNF具有用于小的纤维状神经元涉及许多感觉神经病的神经营养活性(Lindsay R.M.，Neurobiol.Aging.1994，15(2)：249-251)。
NGF，BDNF和其他神经营养素的生物学效应由与2类细胞受体的结合介导：酪氨酸激酶家族的高亲和性(10-11的Kd)受体和低亲和性(10-9的Kd)p75受体。p75受体是具有75kDa的分子量的糖蛋白。其无固有的催化性活性，但相关于可溶性激酶的ERK家族(Volonte C.et al.，Mol.Biol.Cell 1993，4(1)：71-78)，且在对抗凋亡的神经元保护中具有作用。全部神经营养素可结合此受体。
个体神经营养素的特异性通过它们与p140trk(特定类型的酪氨酸激酶(Trk)受体)的结合来确定，NGF和NT-3结合TrkA，而BDNF和NT-4/5结合TrkB。结合之后是受体二聚化，通过激酶的内部结构域导致受体的细胞内酪氨酸残基的自磷酸化。此进而起始介导神经营养素的生物学效应的酶促反应级联，包括神经元的增加的存活(Barbacid M.，J.Neurobiol.1994，25(11)：1386-1403)。
神经营养素是由各具有约120个氨基酸残基和通过疏水相互作用结合的2个相同的亚基组成的同源二聚体。对NGF同源二聚体(McDonald N.Q.et al.，J.Mol.Biol.1991，219(4)：595-601)及对于BDNF/NT-3异源二聚体(Robinson R.C.et al.，Biochemistry 1995，34(13)：4139-46)进行X射线结构分析展示神经营养素的共同的3D结构。它们全部含是发卡结构的称为环1，2，3和4的暴露的结构单元，其中3个在它们的端具有β-转角截面(所谓的截面A-A”，A”’-B和C-D，环1，2，4)及1个具有3连续回折的截面(称为截面B-C，环3)。这些发卡结构被认为负责与特定类型的神经营养素受体特异性结合。
使用定点诱变(通过将环2从BDNF移植到NGF)，通过环2确定显示BDNF与TrkB受体的特异性结合。此嵌合神经营养素可结合TrkB，而非TrkA，并显示BDNF-样活性(Ibanez C.F.et al.，EMBOJ.1993，12(6)：2281-93)。此外，环3(Gln84)和4(Lys96和Arg97)的额外的残基对于TrkB活化重要，但不被认为涉及其结合。全部这些残基位于分子表面。
对于NGF，显示，对应环2的氨基酸从29到35的延伸负责与TrkA的特异性结合。对应NGF序列29～35的合成的肽被发现是NGF拮抗剂。环1负责结合p75受体(McDonald and Chao.Structuraldeterminants of neurotrophin action.JBC 270，19669-19672，1995；Longo et al.Synthetic NGF peptides prevent neuronal death via p75receptor-dependent mechanism.J.Neurosci.Res.，1997)。
在神经退行性疾病的实验模型中神经营养素保护神经元的能力导致有关它们的潜在治疗剂应用的乐观。但是，实际上，神经营养素是不成功的药物，因为，作为蛋白，它们无法口服，不能穿过血-脑屏障和其他生物学屏障，且在血流中快速降解。而且，神经营养素具有多效作用和可诱导致癌作用。神经营养素与p75受体的相互作用诱导神经元通过凋亡死亡。神经营养素的显著缺点是在它们使用之后发展疼痛综合征。此与神经营养素涉及疼痛的内源性调节相关。神经营养素的临床应用是不成功的(Penn R.D.et al.，Neurosurgery 1997，40(1)：94-99；discussion 99-100，1997)。此导致尝试产生它们的低分子量类似物，在血流中稳定的和能穿过胃肠道和血-脑屏障的。提示神经营养素的低分子量类似物将产生仅部分生物学效应，由于它们的与神经营养素受体亚群上的结合位点之一些的大概选择性相互作用，且由此将仅活化期望的单位的信号转导级联。有几个针对神经营养素的低分子量肽类似物的专利。具有对应发卡结构的相应序列的序列的线性肽呈现拮抗剂活性(Longo F.M.et al.，Cell Regul.1990，1(2)：189-195)。从能维持类似于神经营养素环的β-转角构象的构象的环状肽之中获得神经营养素的肽激动剂。激动剂活性的提供需要创建模拟神经营养素的同源二聚体结构的二价类似物。由此，Longo等人(F.M.Longo et al.，1999，美国专利5,958,875)已专利保护了具有对应NGF的氨基酸43～47和92～97(环2和4)的序列的环状单体和二聚体肽。使用在导入所述肽的附属的半胱氨酸或青霉胺残基的二硫键形成环。当体外测试时，双环的类似物展示了激动剂活性。
Saragovi等人专利保护了类似化合物(H.U.Saragovi et al.，2002，美国专利6,017,878)。环状肽类似物使用具有完全或部分对应NGF中环1的氨基酸28～36，环2的氨基酸42～49，环3和4的氨基酸59～67和氨基酸91～99的序列的线性肽之间的二硫键或其他(离子，金属螯合物等)键形成。具有激动剂活性的环状肽的最小的分子量是1500Da，包括16个氨基酸的肽。肽在体外活跃。
Richard Hughes(R.A.hughes等人，2000，PCT WO 00/75176 A1)提交了针对具有激动剂和拮抗剂活性的BDNF中环2和4的单-，双-及三环的肽类似物的专利申请。使用二硫桥环化，及将环经二硫桥和通过侧链氨基酸的羧基和胺基连接。间隔物长度影响活性，由环状肽片段之间具有相同的距离的二价类似物显示最大活性，如在BDNF中。激动剂活性是也显示由单体环状肽，在BDNF的环4的p75受体结合位点的类似物。
由此，在全部情况中，由通常对应五肽的延展的位点的存在提供结合神经营养素受体(除了在与p75受体相互作用的BDNF的环4的三肽位点之外)，及活跃的β-转角构象的形成要求此位点环化。在Trk受体结合的存在下，通过将这些环中的2个组合成二价实体实现激动剂活性。
参照以上参考文献描述了化合物，但是，不公开或提示要求保护的化合物的任何新结构变异。
【发明概述】
本发明是旨在产生具有或者激动剂或拮抗剂活性的神经营养素NGF和BDNF的低分子量类似物。此目标通过使用神经营养素的最小的二肽序列作为神经营养素受体的配体来实现。我们推定，神经营养素环和酪氨酸激酶受体之间的必要的相互作用在是最暴露的及与β-转角环区的中心部分重合或至少位于其附近的超小区发生。此对应N-酰化的二肽配体，其可无需共价环化维持所需的构象相对长久。在NGF和BDNF环4模拟物的情况中，由于能结合Trk受体但不能将其二聚化，这些二肽具有拮抗剂活性。为了产生具有激动剂活性的二价结构，可将2个二肽用由内部亚甲基和末端活性基团组成的常规接头(可选择任何长度)组合。在环1模拟物的情况中，激动剂活性也通过单体二肽显示，可能由于它们的经p75受体的间接效应。为了阻断二肽的末端带电的基团，必需导入取代基。便利地，选定取代基，以模拟之前的和随后的氨基酸残基。全部此使产生具有或者激动剂或拮抗剂活性的具有小于1000Da的最小的分子量的神经营养素类似物成为可能。结果，我们发现，本发明的目标可通过通式的化合物I实现：
(R-CH2-CO-A-B-NH-R’)n(I)
其中：
A和B是二肽序列AB的氨基酸残基；
R是神经营养素序列中二肽片段AB之前的氨基酸残基的侧链基或H或二价基-R-，尤其是-(CH2)m-；
R’是神经营养素序列中二肽片段AB之后的氨基酸残基的侧链基或H或二价基-R’-，尤其是-(CH2)m-。
在二价基-R’-或-R-的存在下，n＝2，且化合物是具有通过C-端间隔物-R-R-或N-端间隔物-R’R’-连接的单体二肽的二聚体。在其他情况中，n＝1，且化合物被单体二肽取代。
本发明的例示实施方式是通过以下化合物表示：
NGF环4类似物：
NGF环1类似物：
Figure BPA00001444239500071
BDNF环4类似物：
Figure BPA00001444239500072
BDNF环1类似物：
Figure BPA00001444239500073
要求保护的化合物的生物学性质的检查显示，依赖于它们的结构，它们可显示神经保护或神经退行性活性，且依赖于它们模拟哪个环，可主要显示神经营养或分化-诱导活性。
具有神经保护活性的化合物可增加酪氨酸激酶的磷酸化和热休克蛋白Hsp32和/或Hsp70的量。
最活跃的要求保护的化合物GK-2，环4模拟物的药理学性质的检查显示，其具有抗-帕金森，抗-缺血，抗-遗忘，神经保护，抗-中风活性及，且在阿尔茨海默病的实验模型中有效。对于抗抑郁药活性的经典测试(Porolt测试)中BDNF模拟物的评估显示，BDNF环1和4的二聚体模拟物具有抗抑郁药活性，然而单体模拟物显示促抑郁活性。
【附图说明】
图1.1.不同的摩尔浓度的肽GK-2c对HT22细胞的存活的效应。
*根据Student氏t检验，p＜0.05对比对照。
图1.2.在氧化应激条件下肽GK-6的神经保护效应。MTT测试。GK-6在添加H2O2之前24h时添加。
*p＜0.05对比对照，^p＜0.05对比H2O2，根据Student氏t检验。
图1.3.在氧化应激条件下肽GK-2b的神经保护效应。
*p＜0.05对比对照，^p＜0.05对比H2O2，根据Student氏t检验。
图1.4.在氧化应激条件下肽GK-2d的神经保护效应。
*p＜0.05对比对照，^p＜0.05对比H2O2，根据Student氏t检验。
图1.5.在氧化应激条件下肽GK-2e的神经保护效应。
*p＜0.05对比对照，^p＜0.05对比H2O2。
图1.6.当在添加H2O2之前24h时添加时，在氧化应激条件下肽GSB-104对HT22细胞的存活的效应。MTT测试。
*p＜0.05对比对照，^p＜0.05对比H2O2，根据Student氏t检验。
图1.7.在氧化应激条件下肽GSB-106对HT22细胞的存活的效应。
*p＜0.05对比对照，^p＜0.05对比H2O2，根据Student氏t检验。
图1.8.当在添加H2O2之前24h时添加时，在氧化应激条件下肽GBK-108对HT22细胞的存活的效应。
*p＜0.05对比对照，^p＜0.05对比H2O2，根据Student氏t检验。
图1.9.当在与MPTP相同的时间添加时，10-5M和10-8M GK-2对PC12细胞系的存活的效应。
*p＜0.05对比对照，^p＜0.05对比MPTP，根据Student氏t检验。
图1.10.当在添加MPTP之前24h时添加时，10-5M和10-8M GK-2对PC12细胞系的存活的效应。
*p＜0.05对比对照，^p＜0.05对比MPTP，根据Student氏t检验。
图1.11.当在MPTP之前24h时添加时，在帕金森病模型中GK-2a，GK-3，GK-4和GK-5对PC12细胞系的存活的效应。
*p＜0.05对比对照，^p＜0.05对比MPTP，根据Student氏t检验。
图1.12.在谷氨酸神经毒性的条件下肽GSB-106的神经保护效应。
*p＜0.05对比对照，^p＜0.05对比谷氨酸盐，根据Student氏t检验。
图1.13.不同的浓度的肽GK-1和GK-2对培养的海马神经元细胞系HT22中Hsp70的量的效应。
泳道1：热休克(42℃，1h)；泳道2：NGF(100ng/ml)；泳道3：对照；泳道4：GK-1(10-5M)；泳道5：GK-1(10-8M)；泳道6：GK-2(10-5M)；泳道7：GK-2(10-8M)；泳道8：GK-1+GK-2(10-5M)。
图1.14.不同的浓度的肽GK-1和GK-2对培养的海马神经元细胞系HT22中Hsp32的量的效应。
泳道1：热休克(42℃，1h)；泳道2：NGF(100ng/ml)；泳道3：对照；泳道4：GK-1(10-5M)；泳道5：GK-1(10-8M)；泳道6：GK-2(10-5M)；泳道7：GK-2(10-8M)；泳道8：GK-1+GK-2(10-5M)。
图1.15.肽GK-3，GK-4和GK-5对培养的海马神经元细胞系HT22中Hsp70的量的效应。
泳道1和2：对照；泳道3和4：NGF(100ng/ml)；泳道5和6：GK-5(10-6M)；泳道7：GK-3(10-6M)；泳道8：GK-4(10-7M)；泳道9：热休克(42℃，1h)。
图1.16.肽GK-3，GK-4和GK-5对培养的海马神经元细胞系HT22中Hsp32的量的效应。
泳道1和2：对照；泳道3和4：NGF(100ng/ml)；泳道5和6：GK-5(10-6M)；泳道7：GK-3(10-6M)；泳道8：GK-4(10-7M)；泳道9：热休克(42℃，1h)。
图1.17.GK-2和GK-3对培养的海马神经元细胞系HT22中酪氨酸激酶A的磷酸化的效应。暴露1min。原蛋白印迹的光密度测定法结果。
图1.18.GK-4和GK-5对培养的海马神经元细胞系HT22中酪氨酸激酶A的磷酸化的效应。暴露1min。原蛋白印迹的光密度测定法结果。
图1.19.GK-1(10-5M)对培养的海马神经元细胞系HT22中酪氨酸激酶A的磷酸化的效应。暴露1min。原蛋白印迹的光密度测定法结果。*根据Student氏t检验，p＜0.05对比对照。
图1.20.GK-2和NGF对培养的海马神经元细胞系HT22中酪氨酸激酶A的磷酸化的效应。暴露2min。原蛋白印迹的光密度测定法结果。
图2.1.GK-2(1mg/kg i.p.)对大鼠脑中损伤体积的效应。
图2.2.用GK-2(1mg/kg i.p.)处理的缺血后大鼠中神经性缺陷的减少。(A)：缺血后4天；(B)：缺血后7天，肢-放置测试。
图2.3.用GK-2(1mg/kg i.p.)处理的缺血后大鼠中神经性缺陷的减少。(A)：缺血后4天；(B)：缺血后7天，圆柱体测试。
*p＜0.05对比对照，根据Mann-Whitney U-测试。
图2.4.大鼠脑前额皮质的血栓形成造影中GK-2(1mg/kg i.p.)的保护效应。*p＜0.05对比NaCl。
图2.5.GK-2(1mg/kg i.p.)对旷场测试中操作的大鼠的水平运动活性的效应。
*p＝0.01对比假-操作的大鼠，根据Mann-Whitney U-测试；
*p＝0.05对比仅操作的大鼠，根据Mann-Whitney U-测试。
图2.6.GK-2(1mg/kg i.p.)对旷场测试中操作的大鼠的垂直运动活性的效应。
*p＝0.03对比假-操作的大鼠，根据Mann-Whitney U-测试；
*p＝0.04对比仅操作的大鼠，根据Mann-Whitney U-测试。
图2.7.GK-2(1mg/kg i.p.)对由对象探查测试中操作的大鼠的对象嗅时间的效应。*p＝0.048对比假-操作的大鼠，根据Mann-Whitney U-测试。
图2.8.GK-2(1mg/kg i.p.)对由对象探查测试中操作的大鼠的对象嗅动力学的效应。*p＝0.02对比假-操作的大鼠，根据精确的Fisher测试。
图2.9.GK-2(1mg/kg i.p.)对颈动脉双向结扎后大鼠脑皮质细胞的存活的效应(MTT测试)。
*p＝0.02对比假-操作的大鼠，根据Mann-Whitney U-测试；
*p＝0.04对比仅操作的大鼠，根据Mann-Whitney U-测试。
图2.10.GK-2(1mg/kg i.p.)对大鼠中阿扑吗啡-诱导的定型强度的效应。*p＝0.02对比阿扑吗啡。
图2.11.GK-2(1mg/kg i.p.)对由东莨菪碱-处理的大鼠的T-迷宫中自发臂交替的效应。
*p＝0.0015对比对照；#p＝0.02对比主动对照。
图2.12.GSB-106(1mg/kg i.p.，第2次着陆之前24hr时)对小鼠中行为绝望的效应。*p＜0.05对比对照，根据Mann-Whitney U-测试。
图2.13.不同的一剂量的GBK-108和GBK-201(第2次着陆之前24hr时)对小鼠中行为绝望的效应。*p＜0.05对比对照，根据Mann-Whitney U-测试。
【发明详述】
通过本领域良好-已知的肽合成方法制备以上式I的化合物。靶化合物的通用的制备方法包括通常，均相混合和偶联期望的氨基酸。
可以下列方式实现均相偶联：
(a)在偶联剂的存在下将具有游离的羧基和保护的另一反应性基团的氨基酸与具有游离的胺基和保护的其他反应性基团的氨基酸偶联；
(b)将具有活化的羧基和保护的另一反应性基团的氨基酸与具有游离的胺基和保护的其他反应性基团的氨基酸偶联；
(c)将具有游离的羧基和保护的另一反应性基团的氨基酸与具有活化的胺基和保护的其他反应性基团的氨基酸偶联。
羧基可通过将其转变成酰氯，叠氮基，酐基或活化的酯例如N-羟基琥珀酰亚胺，N-羟基苯并三唑，五氯苯基或p-硝基苯基酯来活化。胺基可通过将其转变成亚磷酰胺或通过“磷酸酶”方法活化。
用于偶联反应的最常用的方法是羧基二酰亚胺方法，叠氮化方法，混合的酐方法和活化的酯方法。这些方法描述于“The Peptides”，vol.1，1965(Academic Press)，E.Schroeder，K.Lubke；或“The Peptides”，vol.1，1979(Academic Press)，E.Gross，J.Meienhofer。
制备式I的肽的优选的偶联方法是活化的酯方法，其通过使用胺-保护的氨基酸的琥珀酰亚胺，五氯苯基或p-硝基苯基酯有利地进行。优选的溶剂是二甲基甲酰胺。
在安徒生条件下也采用混合的酐方法：G.W.Anderson et al.，J.Am.Chem.Soc.，89，5012-5017(1967)。
应阻止免于参与偶联反应的反应性基团可通过容易可除去的基团保护，例如通过水解或还原。例如，羧基可通过用乙醇，甲醇，t-丁醇或苄基醇酯化来保护。
胺基一般通过酸性基团，例如通过脂肪族，芳族酸，杂环羧酸残基，例如乙酰，苯甲酰，吡啶羧基，或通过源于碳酸的酸性基团例如乙氧基羰基，苄氧基羰基，t-丁氧基羰基；或通过源于磺酸的酸性基团例如p-甲苯磺酰基来保护。
使用可商购的保护的氨基酸，基本上以相应胺基的苄氧羰基衍生物和t-丁氧基羰基衍生物的形式合成要求保护的化合物。羧基通过苄基和t-丁基酯保护。丝氨酸的羟基通过苄基酯保护。
通过使用相应酐，尤其是琥珀酸或乙酸酐制备N-酰化的衍生物。
式I的肽的酰胺通过相应二肽的烷基酯的氨解(即与NH3反应)或通过与期望的酰胺形式的氨基酸反应来制备。二肽的酰胺也可通过任何适宜方法例如通过在偶联剂的存在下胺处理来制备。
二胺用于间隔物，尤其六亚甲基二胺，将其在如上所述的肽合成条件下导入与羧基成分的反应。
根据特定基团的性质去除保护基，即，通过将氢通入碳上的10％钯上的甲醇的氢解来去除苄氧羰基和苄基，通过二噁烷中的HCl或通过无水三氟乙酸在酸性介质中去除t-丁氧基羰基和t-丁基。
【实施例】
本文中使用下列缩写：
Ad：己二酰
Asp：天冬氨酰
Boe：叔-丁氧基羰基
Bzl：苄基
DCCD：二环己基碳二亚胺
DEAE：二乙基氨基乙基
DETMDA：N，N-二乙基三亚甲基二胺
DIEA：二异丙基乙胺
DMFA：二甲基甲酰胺
DMPDA：甲基丙基二胺
DMSO：二甲基亚砜
Glu：谷氨酰
Gly：甘氨酰
HPLC：高效液相层析
IDEA：异丙基二乙基胺
Lys：赖氨酰
Met：蛋氨酰
Np：硝基苯基
OSU：氧基琥珀酰
Pfp：五氟苯基
PMR：质子磁共振
PyBOP：苯并三唑基氧基三(吡咯烷基)鏻六氟磷酸盐
Sat.：饱和的
Ser：丝氨酰
SP：磺丙基
t-Bu：叔-丁基
TEA：三乙基胺
TFA：三氟乙酸
THF：四氢呋喃
TLC：薄层层析
Ts：p-甲苯磺酸
Z：苄氧羰基
在实施例中：
在开放端毛细管中无需任何校正而测定熔解温度；
使用自动化的Perkin-Elmer 241偏振计测定特定旋光度值；
质子磁共振(PMR)谱使用Bruker AC-250分光计获取，化学位移以相对于四甲基硅烷的ppm表达，及使用下列缩写表示共振信号：s，单峰；d，双峰；dd，双双峰；t，三峰；q，四峰；m，多峰；
在硅胶60板(Merck，德国)上进行薄层层析，用茚三酮，碘蒸汽或通过UV辐射显影；
TLC在下列溶剂系统中进行：氯仿-甲醇-乙酸-水，15∶10∶2∶3(A)；n-丁醇-吡啶-乙酸-水，15∶10∶3∶6(B)；氯仿-甲醇，9∶1(C)；氯仿-乙醇，9∶1(D)；n-丁醇-乙酸-水，4∶1∶1(E)；己烷-乙基乙酸酯，2∶1(F)；己烷-乙基乙酸酯，4∶1(G)；乙酸乙酯(H)；二噁烷-水，10∶1(I)，氯仿-甲醇-水，80∶10∶1(J)；吡啶-水-乙酸-乙基乙酸酯，20∶11∶6∶120(K)；氯仿-甲醇-水-乙酸，60∶45∶6.4∶13.6(L)。
Rf值分别标识Rf(X)，意指系统X(A，B，C等)中的Rf值。
以C，H和N的相对百分率的化合物的元素分析数据可偏离理论值不多于0.4％。
【实施例1：N-单琥珀酰-谷氨酰-赖氨酸酰胺，HOOC(CH2)2CO-Glu-Lys-NH2(GK-1)的合成】
(a)N-苄氧基羰基-γ-t-丁基-谷氨酰-Nε-t-丁氧基羰基-赖氨酸酰胺，Z-Glu(OBut)-Lys(Boc)-NH2的制备
将在20ml DMFA中4.0g(8.4mmol)N-苄氧基羰基-Nε-叔-丁氧基羰基-赖氨酸N-氧基琥珀酰亚胺酯(Z-Lys(Boc)-OSu)的溶液用2ml浓缩氨处理5min，然后用水稀释，及过滤出沉淀的N-苄氧基羰基-Nε-叔-丁氧基羰基-赖氨酸酰胺(Z-Lys(Boc)-NH2)。得到的产物溶解于甲醇，然后添加3.0g的10％Pd/C，并于室温氢化。将催化剂过滤出，真空去除溶剂，并取残留物于20ml DMFA。向此溶液3.9g(9.0mmol)添加N-苄氧基羰基-γ-t-丁基-谷氨酸N-氧基琥珀酰亚胺酯(Z-Glu(OBut)-OSu)。将反应混合物于室温搅拌6h(TLC控制)，然后添加2ml DMPDA并使静置30min。反应混合物用200ml乙酸乙酯稀释并用100ml水，100ml 2％H2SO4，及100ml 3％Na2CO3连续洗涤，然后蒸发。将残留物从80ml甲醇和30ml水再结晶。其不经干燥而使用。
(b)N-单琥珀酰-γ-t-丁基-谷氨酰-Nε-t-丁氧基羰基-赖氨酸酰胺，HOOC(CH2)2CO-Glu(OBut)-Lys(Boc)-NH2的制备
将在(a)中制备的Z-Glu(OBut)-Lys(Boc)-NH2于室温在10％Pd/C上的甲醇中氢化。当起始化合物消失(TLC控制)时，将催化剂过滤出，并真空去除溶剂。残留物取到20ml DMFA中并添加1.2g(12.0mmol)琥珀酸酐。将反应混合物于室温搅拌直到反应完全(TLC控制)，然后添加2ml DMPDA并使静置30min。反应混合物用200ml乙酸乙酯稀释并用100ml水，100ml 2％H2SO4，及100ml 3％Na2CO3连续洗涤。在乙酸乙酯溶液蒸发后将产物结晶化。其不经干燥而使用。
(c)N-单琥珀酰-谷氨酰-赖氨酸酰胺，HOOC(CH2)2CO-Glu-Lys-NH2(GK-1)的制备
将在(b)中制备的HOOC(CH2)2CO-Glu(OBut)-Lys(Boc)-NH2用30ml二噁烷中的HCl处理，其中在反应过程中化合物溶解和形成粘性沉淀。静置30min后，除去溶剂，并将残留物用二乙基醚洗涤并取到50ml水中，然后添加100ml乙酸。将得到的乙酸盐形式的含糊剂产物施加于DEAE-Sephadex柱，5×15cm。将柱用0.1M乙酸吡啶缓冲液洗脱。收集相关级分(TLC控制)，蒸发和真空干燥以产生1.3g(总收率36％)的白色晶体产物。Rf0.50(A)，Rf0.22(B)；熔点216℃(分解)；[α]25 D-37.0°(c＝0.1；水)。C15H26N4O7。
1H NMR(DMSO-d6-CF3COOD)：1.33(2H，m，CγH2 Lys)，1.54(2H，m，CδH2 Lys)，1.50和1.72(2H，2m，CβH2 Lys)，1.74和1.92(2H，2m，CβH2 Glu)，2.29(2H，t，CγH2 Glu)，2.44(4H，m，HOOCCH 2CH 2CO-)，2.78(2H，m，CεH2 Lys)，4,18(1H，m，CαH Lys)，4.23(1H，m，CαH Glu)，7.08和7.30(2H，2s，NH2酰胺)，7.72(3H，m，NH3 +Lys)，7.88(1H，d，NH Lys)，8.17(1H，d，NH Glu)。HOOC(CH2)2CO-及-COOH Glu可与HDO交换。
【实施例2：双-(N-单琥珀酰-谷氨酰-赖氨酸)六亚甲基二酰胺，(HOOC(CH2)2CO-Glu-Lys-NH)2-(CH2)6(GK-2)的合成】
(a)双-(N-苄氧基羰基-Nε-t-丁氧基羰基-赖氨酸)六亚甲基二酰胺，(Z-Lys(Boc)-NH)2-(CH2)6的制备
将在20ml DMFA中4.3g(9.0mmol)N-苄氧基羰基-Nε-t-丁氧基羰基-赖氨酸N-氧基琥珀酰亚胺酯(Z-Lys(Boc)-OSu)和0.5g(4.3mmol)六亚甲基二胺的溶液于室温搅拌4h，形成混浊溶液。将反应混合物用80ml水稀释并使静置几小时。将固化的沉淀过滤出，并用水洗涤。其不经干燥而使用。
(b)双-(N-苄氧基羰基-γ-t-丁基-谷氨酰-Nε-t-丁氧基羰基-赖氨酸)六亚甲基二酰胺，(Z-Glu(OBut)-Lys(Boc)-NH)2-(CH2)6的制备
将在(a)中制备的(Z-Lys(Boc)-NH)2-(CH2)6于室温在10％Pd/C上的甲醇中氢化。当起始化合物消失(TLC控制)时，将催化剂过滤出，并真空去除溶剂。残留物取到20ml DMFA中，并添加3.9g(9.0mmol)N-苄氧基羰基-γ-t-丁基-谷氨酸N-氧基琥珀酰亚胺酯(Z-Glu(OBut)-OSu)。将溶液于室温搅拌过夜，然后添加2ml DMPDA并使静置30min。将反应混合物用200ml乙酸乙酯稀释并用100ml水，100ml 2％H2SO4，及100ml 3％Na2CO3连续洗涤。蒸发乙酸乙酯级分，并将残留物从80ml甲醇和30ml水再结晶。其不经干燥而使用。
(c)双-(N-单琥珀酰-γ-t-丁基-谷氨酰-Nε-t-丁氧基羰基-赖氨酸)六亚甲基二酰胺，(HOOC(CH2)2CO-Glu(OBut)-Lys(Boc)-NH)2-(CH2)6的制备
将在(b)中制备的(Z-Glu(OBut)-Lys(Boc)-NH)2-(CH2)6于室温在10％Pd/C上的甲醇中氢化。当起始化合物消失(TLC控制)时，将催化剂过滤出，并真空去除溶剂。残留物取到20ml DMFA中并添加1.2g(12.0mmol)琥珀酸酐。将反应混合物于室温搅拌直到反应完全(TLC控制)，然后添加2ml DMPDA并使静置30min。将反应混合物用200ml乙酸乙酯稀释并用100ml水，100ml 2％H2SO4，及100ml3％Na2CO3连续洗涤。蒸发乙酸乙酯溶液后，将产物再结晶。其不经干燥而使用。
(d)双-(N-单琥珀酰-谷氨酰-赖氨酸)六亚甲基二酰胺，(HOOC(CH2)2CO-Glu-Lys-NH)2-(CH2)6(GK-2)的制备将在(c)中制备的(HOOC(CH2)2CO-Glu(OBut)-Lys(Boc)-NH)2-(CH2)6溶解于乙酸，并用30ml 4M二噁烷中的HCl处理。静置40min后，除去溶剂，并将残留物用二乙基醚洗涤并取到50ml水中，然后用Amberlite IRA-410树脂在搅拌下处理直到pH稳定于pH～2。纯化通过C8逆相HPLC用0.1M乙酸中的0～15％异丙醇梯度进行。收集相关级分(TLC控制)，蒸发和真空干燥以产生1.3g(总收率32％)的白色固体产物。Rf0.41(A)，Rf0.20(B)；熔点120～128℃(无固定的m.p.，高度吸湿)；[α]25 D-47.0°(c＝0.1；水)。
1H NMR(DMSO-d6-CF3COOD)：1.24和1.40(8H，m，NHCH2CH 2CH 2CH 2CH 2CH2NH-)，1.38(4H，m，2CγH2 Lys)，1.53(4H，m，2CδCH2 Lys)，1.50和1.67(4H，各m，2CβH2 Lys)，1.78和1.90(4H，各m，2CβH2 Glu)，2.29(4H，t，2CγH2 Glu)，2.44(8H，m，2HOOCCH 2CH 2CO-)，2.77(4H，m，2CεH2 Lys)，3.04(4H，m，-NHCH 2CH2CH2CH2CH2CH 2NH-)，4.14(2H，m，2CαH Lys)，4.23(2H，m，2CαH Glu)，7.70(6H，m，2NH3 +Lys)，7.72(2H，t，-NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-)，7.90(2H，d，2NH Lys)，8.18(2H，d，2NH Glu)。2HOOC(CH2)2CO-及_2-COOH Glu可与HDO交换。
【实施例3：N-乙酰-赖氨酰-谷氨酸酰胺，CH3CO-Lys-Glu-NH2(GK-3)的合成】
(a)γ-苄基-谷氨酸酰胺，H-Glu(OBzl)-NH2的制备
将8.0g(17.4mmol)的N-t-丁氧基羰基-γ-苄基-谷氨酸p-硝基苯基酯(Boc-Glu(OBzl)-ONp)溶解于30ml DMFA，添加3.5ml氨水，并使静置5min。然后向反应混合物添加100ml水，50ml二乙基醚和100ml的己烷并使于+5℃静置几小时。将沉淀过滤出，并将固体残留物用水和己烷洗涤。将得到的产物溶解于80ml TFA，并将溶液于室温保持1h。真空去除溶剂，并将残留物用醚结晶化。将结晶化的残留物逐渐过滤出并用醚洗涤以产生5.8g(96％)的产物。熔点68～70℃，[α]6 D+10.0°(c＝0.3；水-乙醇，1∶2)。
(b)N-t-丁氧基羰基-Nε-苄氧基羰基-赖氨酰-γ-苄基-谷氨酸酰胺，Boc-Lys(Z)-Glu(OBzl)-NH2的制备
将2.5ml(18.0mmol)TEA在搅拌下添加于在30ml DMFA中5.8g(16.7mmol)γ-苄基-谷氨酸酰胺(H-Glu(OBzl)-NH2)三氟乙酸盐及9.0g(18.0mmol)N-t-丁氧基羰基-Nε-苄氧基羰基-赖氨酸p-硝基苯基酯(Boc-Lys(Z)-ONp)的溶液，并于室温保持过夜。当反应完全(TLC控制)时，添加2ml DMPDA并使静置1h。然后将200ml水和200ml二乙基醚添加于溶液。将沉淀过滤出并用水和醚洗涤以产生9.3g(93％)的产物。熔点122℃，[α]27 D-10.7°(c＝0.3；DMFA)。
(c)Nε-苄氧基羰基-赖氨酰-γ-苄基-谷氨酸酰胺，H-Lys(Z)-Glu(OBzl)-NH2的制备
使在70ml TFA中9.3g(15.5mmol)Boc-Lys(Z)-Glu(OBzl)-NH2的溶液静置1h。真空去除溶剂，，并将残留物用二乙基醚研磨。将结晶化沉淀过滤出以产生9.1g(96％)的三氟乙酸盐形式的产物。熔点145～146℃，[α]26 D+13.3°(c＝0.3；水-乙醇，1∶2)。
(d)N-乙酰-赖氨酰-谷氨酸酰胺，CH3CO-Lys-Glu-NH2(GK-3)的制备
将9.1g(14.9mmol)H-Lys(Z)-Glu(OBzl)-NH2三氟乙酸盐及3.0g(16.6mmol)乙酸p-硝基苯基酯(AcONp)溶解于30ml DMFA，及在搅拌下添加2.3ml(16.6mmol)TEA。将反应混合物于室温搅拌3h(TLC控制)，然后添加200ml醚和200ml水。将沉淀过滤出并真空干燥。将得到的产物溶解于150ml甲醇，然后添加3.0g 10％Pd/C并于40℃使用3ml(59.9mmol)按比例添加的浓甲酸铵在搅拌下氢化。搅拌4h后，将催化剂过滤出并用甲醇洗涤，并将滤出液蒸发。将得到的产物溶解于500ml水并使用0.1～0.2M乙酸吡啶缓冲液梯度在100ml SP-Sephadex柱上纯化。收集相关级分(TLC控制)，蒸发并用异丙醇再蒸发。将残留物用甲醇研磨，并将结晶化固体沉淀过滤出并真空干燥以产生2.2g(40％；总收率34％)的白色晶体产物。Rf0.43(A)，Rf0.27(B)；熔点198～199℃；[α]26 D-32.3°(c＝1；水)。C13H24N4O5。
1H NMR(DMSO-d6-CF3COOD)：1.32(2H，m，CγH2 Lys)，1.52(2H，m，CδH2 Lys)，1.65和1.80(2H，2m，CβH2 Lys)，1.85(3H，s，CH3CO-)，2.00和1.82(2H，2m，CβH2 Glu)，2.21(2H，t，CβH2 Glu)，2.75(2H，m，CεH2 Lys)，4.17(2H，m，CαH2 Lys，CαH2 Glu)，7.07和7.81(2H，2s，NH2酰胺)，7.68(3H，m，NεH3 +Lys)，7.91(1H，d，NH Glu)，8.08(1H，d，NH Lys)。COOH Glu信号可与HDO交换。
【实施例4：双-(N-乙酰-赖氨酰-谷氨酸)六亚甲基二酰胺，(CH3CO-Lys-Glu-NH)2-(CH2)6(GK-4)的合成】
(a)双-(γ-苄基-谷氨酸)六亚甲基二酰胺，(H-Glu(OBzl)-NH)2-(CH2)6的制备
将6.0g(13.1mmol)N-t-丁氧基羰基-γ-苄基-谷氨酸(Boc-Lys(Z)-ONp)p-硝基苯基酯(Boc-Glu(OBzl)～ONp)和0.76g(6.5mmol)六亚甲基二胺溶解于30ml DMPDA并于室温搅拌过夜。当反应完全(TLC控制)时，添加1ml DMPDA并使于室温静置1h。然后将150ml乙酸乙酯和200ml水添加于溶液并用150ml 3％H2SO4和100ml水洗涤。蒸发乙酸乙酯级分，并将得到的固体残留物溶解于80ml TFA并使于室温静置1h。然后将溶剂蒸馏出，，并将残留物用二乙基醚研磨。于+5℃静置几小时后，除去醚，并将固体残留物真空干燥以产生4.9g(96％)的产物。
(b)双-(N-t-丁氧基羰基-Nε-苄氧基羰基-赖氨酰-γ-苄基-谷氨酸)六亚甲基二酰胺，(Boc-Lys(Z)-Glu(OBzl)-NH)2-(CH2)6的制备
将4.9g(6.2mmol)(H-Glu(OBzl)-NH)2-(CH2)6和6.6g(13.2mmol)N-t-丁氧基羰基-Nε-苄氧基羰基-赖氨酸p-硝基苯基酯(Boc-Lys(Z)-ONp)溶解于30ml DMPDA，并在搅拌下添加1.8ml(13.2mmol)TEA。将反应混合物于室温搅拌过夜。当反应完全(TLC控制)时，添加2ml DMPDA并使静置1h。然后将200ml水和200ml二乙基醚添加于溶液。将沉淀过滤出并用水和醚洗涤以产生6.3g(80％)的产物。熔点137～138℃，[α]21 D-15.2°(c＝1；DMFA)。
(c)双-(Nε-苄氧基羰基-赖氨酰-γ-苄基-谷氨酸)六亚甲基二酰胺，(H-Lys(Z)-Glu(OBzl)-NH)2-(CH2)6的制备
使在70ml TFA中6.3g(5.0mmol)(Boc-Lys(Z)-Glu(OBzl)-NH)2-(CH2)6的溶液静置1h。真空去除溶剂，，并将残留物用二乙基醚研磨。将结晶化沉淀过滤出以产生6.2g(95％)的产物。M.p.172～174℃，[α]27 D+3.6°(c＝1；DMFA)。
(d)双-(N-乙酰-Nε-苄氧基羰基-赖氨酰-γ-苄基-谷氨酸)六亚甲基二酰胺，(CH3CO-Lys(Z)-Glu(OBzl)-NH)2-(CH2)6的制备
将1.8ml(12.7mmol)TEA在搅拌下添加于在30ml DMFA中6.2g(4.8mmol)(H-Lys(Z)-Glu(OBzl)-NH)2-(CH2)6和2.3g(12.7mmol)乙酸p-硝基苯基酯(AcONp)的溶液。将反应混合物于室温搅拌3h。产物在反应过程中形成沉淀(TLC控制)。然后将200ml二乙基醚和200ml水添加于反应混合物。将沉淀过滤出并真空干燥以产生5.1g(92％)的产物。熔点220～222℃，[α]21 D-11.2°(c＝1；DMFA)。
(e)双-(N-乙酰-赖氨酰-谷氨酸)六亚甲基二酰胺，(CH3CO-Lys-Glu-NH)2-(CH2)6(GK-4)的制备
将5.1g(4.4mmol)(CH3CO-Lys(Z)-Glu(OBzl)-NH)2-(CH2)6溶解于150ml甲醇，然后将3.0g 10％Pd/C添加于悬浮液并于40℃使用3ml(59.9mmol)按比例添加的浓甲酸铵溶液在搅拌下氢化。搅拌4h后，将催化剂过滤出并用甲醇洗涤，并将滤出液蒸发。将得到的产物溶解于500ml水并使用0.1～0.2M乙酸吡啶缓冲液梯度在100mlSP-Sephadex柱上纯化。收集相关级分(TLC控制)并蒸发，然后用异丙醇再蒸发。将残留物用甲醇研磨，并将结晶化固体沉淀过滤出并真空干燥以产生3.4g(93％；总收率63％)的白色晶体产物。Rf0.30(A)，Rf0.20(B)；熔点205～206℃；[α]27 D-39.3°(c＝1；水)。C32H58N8O10。
1H NMR(DMSO-d6-CF3COOD)：1.21(4H，m，-NHCH2CH2CH 2CH 2CH2CH2NH-)，1.33(8H，m，-NHCH 2CH2CH2CH2CH2CH 2NH-，2CγH2 Lys)，1.52(4H，m，2CδH2Lys)，1.90和1.75(4H，各m，2CβH2 Glu)，1.85(6H，s，2CH3CO-)，2.25(4H，t，2CγH2 Glu)，2.74(4H，m，2CεH2 Lys)，3.02(4H，m，-NHCH 2CH2CH2CH2CH2CH 2NH-)，4.17(4H，m，2CαH Lys，2CαHGlu)，7.81(2H，t，-NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-)，7.70(6H，m，2NH3 +Lys)，7.94(2H，d，2NH Glu)，8.11(2H，d，2NH Lys)。2COOHGlu信号可与HDO交换。
【实施例5：N-(6-氨基己酰)-甘氨酰-赖氨酸酰胺，H2N(CH2)5CO-Gly-Lys-NH2(GK-5)的合成】
(a)N-苄氧基羰基-甘氨酰-Nε-t-丁氧基羰基-赖氨酸酰胺，Z-Gly-Lys(Boc)-NH2的制备
将在20ml DMFA中7.0g(14.6mmol)N-苄氧基羰基-Nε-t-丁氧基羰基-赖氨酸N-氧基琥珀酰亚胺酯(Z-Lys(Boc)-OSu)的溶液用5ml氨处理10min。然后100ml含冰水添加于反应混合物。将沉淀过滤出，并用水洗涤。由此得到5.3g(96％)的N-苄氧基羰基-Nε-t-丁氧基羰基-赖氨酸酰胺(Z-Lys(Boc)-NH2)。将产物溶解于甲醇，及将3.0g的10％Pd/C添加到悬浮液并使用3ml(59.9mmol)补充了小量的乙酸的浓甲酸铵在于室温搅拌下氢化。当起始化合物消失(TLC控制)时，将催化剂过滤出并用甲醇洗涤，并将滤出液蒸发。残留物取到DMFA中，并添加4.8g(14.6mmol)N-苄氧基羰基-甘氨酸p-硝基苯基酯(Z-Gly-ONp)。将反应混合物于室温搅拌过夜。当反应完全(TLC控制)时，添加1ml DMPDA，并使静置30min。然后将300ml乙酸乙酯添加于溶液并用200ml水，50ml饱和NaCl，及3％K2CO3(3×150ml)连续洗涤。蒸发乙酸乙酯级分，，并将残留物从二乙基醚再结晶以产生4.3g(71％)的产物。
(b)N-t-丁氧基羰基-6-氨基己酸N-氧基琥珀酰亚胺酯，Boc-NH(CH2)5CO-OSu的制备
将13.1g(60.0mmol)二-叔-丁基焦碳酸酯添加于在80ml DMFA中7.0g(53.4mmol)6-氨基己酸的溶液。将反应混合物于室温搅拌2h。真空去除DMFA，将残留物溶解于乙酸乙酯并添加6.9g(60.0mmol)N-羟基琥珀酰亚胺和12.4g(60.0mmol)DCCD。将反应混合物于室温搅拌过夜。在次日过滤出沉淀的二环己脲，将溶液蒸发，并将残留物从异丙醇-己烷1∶1混合物再结晶以产生16.0g(96％)的产物。
(c)N-(N-t-丁氧基羰基-6-氨基己酰)甘氨酰-Nε-t-丁氧基羰基-赖氨酸，Boc-NH(CH2)5CO-Gly-Lys(Boc)-NH2的制备
将4.3g(10.0mmol)Z-Gly-Lys(Boc)-NH2使用3ml(59.9mmol)补充了乙酸的浓甲酸铵溶液在甲醇中氢化。当起始化合物消失(TLC控制)时，将催化剂过滤出并用甲醇洗涤，并将滤出液蒸发。残留物取到DMFA中并添加3.9g(12.4mmol)Boc-NH(CH2)5CO-OSu。将反应混合物于室温搅拌过夜。当反应完全(TLC控制)时，添加1mlDMPDA，并使静置30min。将反应混合物用200ml乙酸乙酯和150ml水稀释，并将水层在200ml乙酸乙酯中提取。将乙酸乙酯级分用100ml水洗涤，将溶剂蒸发，并将200ml二乙基醚添加于残留物并使在冷状态下结晶化。将沉淀过滤出及用醚洗涤以产生3.1g(60％)的产物。
(d)N-(6-氨基己酰)甘氨酰-赖氨酸酰胺，H2N(CH2)5CO-Gly-Lys-NH2的制备
将3.1g(6.0mmol)Boc-NH(CH2)5CO-Gly-Lys(Boc)-NH2用100mlTFA处理1h。然后将反应混合物蒸发，并将残留物用200ml二乙基醚研磨。除去醚，并将得到的产物溶解于500ml水并用0.1～0.6M乙酸吡啶缓冲液梯度在100ml SP-Sephadex柱上纯化使。收集相关级分(TLC控制)，蒸发并用异丙醇再蒸发。将残留物真空干燥以产生2.5g(96％；总收率39％)的吸湿白色固体产物。Rf0.65(A)，Rf0.51(B)；熔点50～52℃；[α]25 D-7.8°(c＝0.17；水)。
1H NMR(DMSO-d6-CF3COOD)：1.27和1.47(12H，m，-Cβ H 2Cγ H 2Cδ H 2-Lys，NH2CH2CH 2CH 2CH 2CH2CO-)，2.12(2H，t，NH2CH2CH2CH2CH2CH 2CO-)，2.64(4H，m，NH2CH 2CH2CH2CH2CH2CO-，CεH2 Lys)，3.65和3.72(2，2dd，CH2Gly)，4.13(1H，m，CαH Lys)，7.08和7.52(2H，2s，NH2酰胺)，8.11(1H，d，NH Lys)，8.46(1H，t，NH Gly)。NεH2 Lys和NH 2CH2CH2CH2CH2CH2CO-可与HDO交换。
【实施例6：双-(N-(6-氨基己酰)甘氨酰-赖氨酸)六亚甲基二酰胺，(H2N(CH2)5CO-Gly-Lys-NH)2-(CH2)6(GK-6)的合成】
(a)双-(N-苄氧基羰基-甘氨酰-Nε-t-丁氧基羰基-赖氨酸)六亚甲基二酰胺，(Z-Gly-Lys(Boc)-NH)2-(CH2)6的制备
将在20ml DMFA中7.2g(15.0mmol)N-苄氧基羰基-Nε-t-丁氧基羰基-赖氨酸N-氧基琥珀酰亚胺酯(Z-Lys(Boc)-OSu)和0.85g(7.3mmol)六亚甲基二胺的溶液于室温搅拌过夜。当反应完全(TLC控制)时，添加1ml DMPDA，并使静置30min，然后添加10ml乙酸。然后通过添加150ml水将产物于+5℃沉淀过夜，其中得到的油逐渐变硬。将沉淀过滤出，并用水洗涤。将产物溶解于甲醇，并将3.0g的10％Pd/C添加到悬浮液并使用3ml(59.9mmol)补充了小量的乙酸的浓甲酸铵溶液在于室温搅拌下氢化。当起始化合物消失(TLC控制)时，将催化剂过滤出并用甲醇洗涤，并将滤出液蒸发。将残留物取到DMFA中，并添加5.0g(15.0mmol)N-苄氧基羰基-甘氨酸p-硝基苯基酯(Z-Gly-ONp)。将反应混合物于室温搅拌过夜。当反应完全(TLC控制)时，添加1ml DMPDA，并使静置30min。将反应混合物用300ml乙酸乙酯稀释并用200ml水，50ml饱和NaCl，200ml 2％H2SO4，及3％K2CO3连续洗涤(3×150ml)。蒸发乙酸乙酯级分，并将残留物从二乙基醚再结晶以产生5.6g(80％)的产物。
(b)双-(N-(N-t-丁氧基羰基-6-氨基己酰)甘氨酰-Nε-t-丁氧基羰基-赖氨酸)六亚甲基二酰胺，Boc-NH(CH2)5CO-Gly-Lys(Boc)-NH)2-(CH2)6的制备
将5.6g(5.9mmol)(Z-Gly-Lys(Boc)-NH)2-(CH2)6使用3ml(59.9mmol)补充了3.0g的10％Pd/C和小量的乙酸的浓甲酸铵溶液在于室温搅拌下在甲醇中氢化。当起始化合物消失(TLC控制)时，将催化剂过滤出并用甲醇洗涤，并将滤出液蒸发。将残留物取到DMFA中并添加4.3g(13.8mmol)N-t-丁氧基羰基-6-氨基己酸N-氧基琥珀酰亚胺酯(Boc-NH(CH2)5CO-OSu，其合成描述于实施例5，部分b)。将反应混合物于室温搅拌过夜。当反应完全(TLC控制)时，添加1ml DMPDA，并使静置30min。将反应混合物用200ml乙酸乙酯和150ml水稀释，并将水层在200ml乙酸乙酯中提取。将乙酸乙酯级分用100ml水洗涤，并将溶剂蒸发。将200ml二乙基醚添加于残留物并使在冷状态下结晶化过夜。将沉淀过滤出及用醚洗涤以产生6.2g(95％)的产物。
(c)双-(N-(6-氨基己酰)甘氨酰-赖氨酸)六亚甲基二酰胺，(H2N(CH2)5CO-Gly-Lys-NH)2-(CH2)6(GK-6)的制备
将6.2g(5.6mmol)Boc-NH(CH2)5CO-Gly-Lys(Boc)-NH)2-(CH2)6用100ml TFA处理1h。然后将反应混合物蒸发，并将残留物用200ml二乙基醚研磨。除去醚，并将得到的产物溶解于500ml水并使用0.1～0.6M乙酸吡啶缓冲液梯度在100ml SP-Sephadex柱上纯化。收集相关级分(TLC控制)，蒸发并用异丙醇再蒸发。将得到的残留物真空干燥并使用0.1M乙酸中的0～20％异丙醇梯度在C8反相HPLC柱上纯化。将对应产物的级分蒸发并真空干燥以产生3.8g(95％；总收率72％)的油状态的最终产物。Rf0.50(A)，Rf0.08(B)；熔点50～52℃；[α]27 D-129.6°(c＝0.17；水)。
1H NMR(DMSO-d6)：1.10-1.70(32H，m，2-Cβ H 2Cγ H 2Cδ H 2-Lys，2NH2CH2CH 2CH 2CH 2CH2CO-，NHCH2CH 2CH 2CH 2CH 2CH2NH-)，2.12(4H，t，2NH2CH2CH2CH2CH2CH 2CO-)，2.65(8H，m，2NHCH 2CH2CH2CH2CH2CO-，2CεH2 Lys)，3.01(4H，m，-NHCH 2CH2CH2CH2CH2CH 2NH)，3.66和3.69(4H，各dd，2CH2Gly)，4.14(2H，m，2CαH，Lys)，8.09(2H，t，NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-)，8.19(2H，d，2NH Lys)，8.45(2H，t，2NH Gly)。2NεH2 Lys和2NH 2CH2CH2CH2CH2CH2CO-可与HDO交换。
【实施例7：双-(N-单琥珀酰-谷氨酰-赖氨酰-6-氨基己酸)三亚甲基二酰胺，(HOOC(CH2)2CO-Glu-Lys-NH(CH2)5CO-NH)2-(CH2)3(GK-2a)的合成】
(a)琥珀酸单苄基酯，HOOC(CH2)2CO-OBzl的制备
将10.00g(100.00mmol)琥珀酸酐和11ml(101.70mmol)苄基醇的混合物加热至回流6h。使反应混合物至室温并用二乙基醚洗涤。将醚溶液从不溶性琥珀酸沉淀过滤并用饱和NaHCO3溶液洗涤(3×40ml)。将含HOOC(CH2)2CO-OBzl钠盐的水层从含反应副产物(琥珀酸二苄基酯，其在弱碱性的水介质中不溶)的醚层分离。将水溶液用2N HCl酸化，由此沉淀白色晶体质。将沉淀过滤出，用冷水洗涤并真空干燥以产生10.00g(48％)的白色晶体产物。熔点58～59℃。来自文献：熔点58～59℃(J.Chem.Soc.，1955，1097)。
(b)单苄基琥珀酸琥珀酰亚胺酯，BzlO-OC(CH2)2CO-OSu的制备
将7.50g(36.02mmol)HOOC(CH2)2CO-OBzl和4.17g(36.20mmol)N-羟基琥珀酰亚胺于室温溶解于70ml THF。将得到的溶液冷却至0℃。在剧烈搅拌下将冷却至0℃的在30ml THF中7.47g(36.20mmol)DCCD的溶液添加于其中。将反应混合物于0℃搅拌6h。过滤出二环己脲的白色沉淀。真空去除溶剂。将得到的粘油质溶解于50ml二氯甲烷，并使溶液于0℃静置24h。将得到的沉淀过滤出。将滤出液真空蒸发以产生10.78g(98％)的油性，可结晶化的产物。
(c)谷氨酸γ-苄基酯，H-Glu(OBzl)-OH的制备
将29.40g(0.20mol)谷氨酸，82ml(0.80mol)苄基醇和41.85g(0.22mol)p-甲苯磺酸一水合物的混合物在剧烈搅拌下于100～105℃加热25min直到其均质及澄清。将反应混合物冷却，然后添加300ml苯。将得到的溶液用水洗涤(5×200ml)，及含p-甲苯磺酸的H-Glu(OBzl)-OH盐和未反应的谷氨酸的水相从有机相分离。向得到的水溶液在搅拌下以小比例添加晶体NaHCO3以使pH至6。此导致白色晶体沉淀的形成。使含沉淀的溶液于+5℃静置几小时。然后将沉淀过滤出，用冷水洗涤几次并真空干燥以产生12.00g(30％)的产物。熔点169～170℃。来自文献：熔点169～170℃(J.Chem.Soc.，1950，3239)。
(d)N-苄基琥珀酰-γ-苄基-谷氨酸，BzlO-OC(CH2)2CO-Glu(OBzl)-OH的制备
将7.12g(30.00mmol)谷氨酸γ-苄基酯(H-Glu(OBzl)-OH)悬浮于50ml DMFA。将得到的悬浮液冷却至0℃，然后在剧烈搅拌下添加在10ml DMFA中5.19ml(30.00mmol)DIEA的溶液，然后是在50mlDMFA中9.16g(30.00mmol)BzlO-OC(CH2)2CO-OSu的溶液。得到的反应混合物变得均质后停止冷却。将反应混合物于室温搅拌18h。然后在剧烈搅拌下将400ml的冷5％柠檬酸溶液添加于反应混合物，导致白色精细分散的晶体沉淀形成。将得到的悬浮液用乙酸乙酯洗涤(3×200ml)。将有机相组合，用200ml饱和NaCl洗涤并在无水Na2SO4上干燥。真空去除溶剂以产生11.94g(93％)的浅黄色油性产物。
(e)N-苄基琥珀酰-γ-苄基-谷氨酸N-氧基琥珀酰亚胺酯，BzlO-OC(CH2)2CO-Glu(OBzl)-OSu的制备
将11.81g(27.63mmol)BzlO-OC(CH2)2CO-Glu(OBzl)-OH和3.44g(29.93mmol)N-羟基琥珀酰亚胺于室温溶解于60ml THF。溶液冷却至0℃。向此溶液在剧烈搅拌下添加冷却至0℃的在20ml THF中6.18g(29.93mmol)DCCD的溶液。将反应混合物于0℃搅拌24h。过滤出二环己脲的白色沉淀。真空去除溶剂。将得到的粘油质溶解于35ml二氯甲烷。使溶液于0℃静置24h。将得到的沉淀过滤出，并将滤出液真空蒸发以产生14.06g(97％)的油性产物。
(f)N-t-丁氧基羰基-Nε-(2-氯苄氧羰基)赖氨酸N-氧基琥珀酰亚胺酯，Boc-Lys(2-Cl-Z)-OSu的制备
将6.00g(14.46mmol)N-t-丁氧基羰基-Nε-(2-氯苄氧羰基)赖氨酸(Boc-Lys(2-Cl-Z)-OSu)和1.83g(15.91mmol)N-羟基琥珀酰亚胺于室温溶解于35ml THF。溶液冷却至0℃。向此溶液在剧烈搅拌下添加冷却至0℃的在10ml THF中3.28g(15.91mmol)DCCD的溶液。将反应混合物于0℃搅拌24h。过滤出二环己脲的白色沉淀。真空去除溶剂。将得到的粘油质溶解于20ml二氯甲烷。使溶液于0℃静置24h。将得到的沉淀过滤出，并将滤出液真空蒸发以产生6.90g(93％)的油性产物。
(g)N-t-丁氧基羰基-Nε-(2-氯苄氧羰基)赖氨酰-6-氨基己酸，Boc-Lys(2-Cl-Z)-NH(CH2)5COOH的制备
将1.58g(12.05mmol)6-氨基己酸悬浮于10ml水。于室温在搅拌下向悬浮液添加4.8ml 2N NaOH，1.01g(12.05mmol)NaHCO3和12ml DMFA。将得到的悬浮液冷却至0℃并在剧烈搅拌下添加在12mlDMFA中6.17g(12.05mmol)Boc-Lys(2-Cl-Z)-OSu的溶液。将反应混合物于0℃搅拌1h，然后添加24ml DMFA-H2O 1∶1混合物。使反应混合物逐渐至室温，然后搅拌24h。然后在剧烈搅拌下添加150ml的冷5％柠檬酸溶液。将反应混合物用乙酸乙酯洗涤(3×50ml)。将组合的乙酸乙酯相用饱和NaCl洗涤(3×50ml)并在无水Na2SO4上干燥。真空去除溶剂以产生5.97g(94％)的浅黄色油性产物。
(g)Nε-(2-氯苄氧羰基)赖氨酰-6-氨基己酸，Lys(2-Cl-Z)-NH(CH2)5COOH的制备
将5.96g(11.29mmol)Boc-Lys(2-Cl-Z)-NH(CH2)5COOH于室温在搅拌下添加于50ml 4M HCl/二噁烷。将反应混合物于室温搅拌2h。然后将溶剂于25～30℃真空去除。将油性残留物用二氯甲烷洗涤。不溶性油质逐渐经历导致过滤出的白色晶体沉淀的形成的结晶，用二氯甲烷洗涤几次，并真空干燥以产生3.72g(71％)的白色晶体产物。
(h)N-苄基琥珀酰-γ-苄基-谷氨酰-Nε-(2-氯苄氧羰基)赖氨酰-6-氨基己酸，BzlO-OC(CH2)2CO-Glu(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-NH(CH2)5COOH的制备
将3.70g(7.97mmol)Lys(2-Cl-Z)-NH(CH2)5COOH溶解于15mlDMFA。将溶液冷却至5℃。将在5ml DMFA中1.8ml(15.94mmol)N-甲基吗啉的溶液和在15ml DMFA中4.18g(7.97mmol)BzlO-OC(CH2)2CO-Glu(OBzl)-OSu的溶液添加于其中。将反应混合物于室温搅拌2天。将沉淀过滤出，并于25～30℃真空去除溶剂。向残留物添加50ml的冷10％柠檬酸溶液和100ml乙酸乙酯。将乙酸乙酯层从用乙酸乙酯额外地洗涤的水层分离(3×50ml)。将组合的有机相用饱和NaCl洗涤(2×50ml)并在无水Na2SO4上干燥。真空去除溶剂。将残留物用二乙基醚于室温研磨导致产物结晶。将得到的晶体用醚洗涤并真空干燥以产生4.81g(72％)的晶体产物。
(i)N-苄基琥珀酰-γ-苄基-谷氨酰-Nε-(2-氯苄氧羰基)赖氨酰-6-氨基己酸N-氧基琥珀酰亚胺酯，BzlO-OC(CH2)2CO-Glu(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-NH(CH2)5CO-OSu的制备
将4.80g(5.73mmol)BzlO-OC(CH2)2CO-Glu(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-NH(CH2)5COOH和0.73g(6.30mmol)N-羟基琥珀酰亚胺于室温溶解于35ml THF。向此溶液在剧烈搅拌下添加在5ml THF中1.30g(6.30mmol)DCCD的溶液。将反应混合物于室温搅拌36h。过滤出二环己脲的白色沉淀。真空去除溶剂。将得到的粘晶体质溶解于30ml二氯甲烷。使溶液于0℃静置24h。将得到的沉淀过滤出，并将滤出液真空干燥以产生5.35g(100％)的粘晶体质的产物。
(j)双-(N-苄基琥珀酰-γ-苄基-谷氨酰-Nε-(2-氯苄氧羰基)赖氨酰-6-氨基己酸)三亚甲基二酰胺，(BzlO-OC(CH2)2CO-Glu(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-NH(CH2)5CO-NH)2-(CH2)3的制备
向在氮下冷却至0℃的在15ml DMFA中0.2ml(2.85mmol)亚丙基二胺的溶液首先在搅拌下添加在5ml DMFA中1ml(5.70mmol)DIEA的溶液，然后在搅拌下添加30ml DMFA中5.33g(5.70mmol)BzlO-OC(CH2)2CO-Glu(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-NH(CH2)5CO-OSu的冷溶液。将反应混合物于0℃搅拌1h再于室温搅拌24h。于25～30℃真空去除溶剂。向油性残留物在剧烈搅拌下添加50ml的冷10％柠檬酸溶液。将晶体沉淀过滤出并用50ml 5％NaHCO3，水(2×50ml)，丙酮(2×50ml)，乙酸乙酯(2×50ml)，及二乙基醚连续洗涤，然后真空干燥以产生3.08g(63％)的白色晶体产物。
(k)双-(N-单琥珀酰-谷氨酰-赖氨酰-6-氨基己酸)三亚甲基二酰胺，(HOOC(CH2)2CO-Glu-Lys-NH(CH2)5CO-NH)2-(CH2)3(GK-2a)的制备
将2.50g(1.46mmol)(BzlO-OC(CH2)2CO-Glu(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-NH(CH2)5CO-NH)2-(CH2)3于室温溶解于30ml乙醇，然后添加5ml环己烯，然后在搅拌下小心添加1.0g 10％Pd/C。将得到的悬浮液在搅拌下加热至回流并持续5h。将反应混合物冷却至室温，并将催化剂过滤出。将溶剂蒸发，并将残留物用己烷和二乙基醚洗涤，然后真空干燥以产生1.38g(93％；总收率42％)的最终白色晶体产物。Rf0.41(A)，Rf0.20(B)；熔点118～121℃；[α]25 D-30.0°(c＝1；水)。
1H NMR(DMSO-d6)：1.09-1.96(26H，m，2-Cβ H 2Cγ H 2Cδ H 2-Lys，2NHCH2CH 2CH 2CH 2CH2CO-，NHCH2CH 2CH2NH-)，1.74和1.89(4H，各m，CβH2 Glu)，2.03(4H，t，2NHCH2CH2CH2CH2CH 2CO-)，2.26(4H，m，2CγH2 Glu)，2.39(8H，m，2HOOCCH 2CH 2CO-)，2.74(4H，m，2CεH2 Lys)，3.00(8H，m，2-NHCH 2CH2CH2CH2CH2CO-，-NHCH 2CH2CH 2CO-)，4.10(2H，m，2CαH Lys)，4.16(2H，m，2CαHGlu)，7.74(2H，t，-NHCH2CH2CH2NH-)，7.84(2H，t，2-NHCH2CH2CH2CH2CH2CO-)，7.94(2H，d，2NH Lys)，8.22(2H，d，2NH Glu)。2HOOC(CH2)2CO-，2-COOH Glu和2-NεH2 Lys可与HDO交换。
【实施例8：双-(N-单琥珀酰-谷氨酰-赖氨酸)五亚甲基二酰胺(GK-2b)，双-(N-单琥珀酰-谷氨酰-赖氨酸)四亚甲基二酰胺(GK-2c)，双-(N-单琥珀酰-谷氨酰-赖氨酸)三亚甲基二酰胺(GK-2d)，及双-(N-单琥珀酰-谷氨酰-赖氨酸)亚乙基二酰胺(GK-2e)，(HOOC(CH2)2CO-Glu-Lys-NH)2-(CH2)n，其中n＝2，3，4，5的合成】
(a)N-单苄基琥珀酰-γ-苄基-谷氨酰-Nε-(2-氯苄氧羰基)赖氨酸，BzlO-OC(CH2)2CO-Glu(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-OH的制备
向在35ml DMFA中6.55g(18.65mmol)Nε-(2-氯苄氧羰基)赖氨酸盐酸盐(H-Lys(2-Cl-Z)-OH·HCl)的溶液于+5℃添加在10ml DMF中4.1ml(37.30mmol)N-甲基吗啉A的溶液和在35ml DMFA中9.78g(18.65mmol)BzlO-OC(CH2)2CO-Glu(OBzl)-OSu(其合成描述于实施例7，部分e)的溶液。将反应混合物于室温搅拌2天。将沉淀过滤出，并真空去除溶剂。向残留物添加100ml的冷10％柠檬酸溶液和200ml乙酸乙酯。将乙酸乙酯层从用乙酸乙酯额外地洗涤的水层分离(3×100ml)。将组合的有机相用饱和NaCl洗涤(2×50ml)，在无水Na2SO4上干燥并蒸发。将残留物用二乙基醚于室温研磨导致产物结晶。将得到的晶体用醚洗涤并真空干燥以产生12.43g(92％)的浅黄色晶体产物。熔点80～82℃。
(b)N-单苄基琥珀酰-γ-苄基-谷氨酰-Nε-(2-氯苄氧羰基)赖氨酸琥珀酰亚胺酯，BzlO-OC(CH2)2CO-Glu(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-OSu的制备
向冷却至0℃的在100ml THF中11.30g(15.60mmol)BzlO-OC(CH2)2CO-Glu(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-OH和1.98g(17.16mmol)N-羟基琥珀酰亚胺的溶液在剧烈搅拌下添加也冷却至0℃的在20mlTHF中3.54g(17.16mmol)DCCD的溶液。将反应混合物于0℃搅拌36h。过滤出二环己脲的白色沉淀。真空去除溶剂。将得到的粘晶体质溶解于30ml二氯甲烷，并使溶液于0℃静置24h。将得到的沉淀过滤出。将溶剂蒸发，并将残留物真空干燥以产生12.80g(100％)的粘晶体质的产物。
(c)双-(N-苄基琥珀酰-γ-苄基-谷氨酰-Nε-(2-氯苄氧羰基)赖氨酸)五亚甲基二酰胺，(BzlO-OC(CH2)2CO-Glu(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-NH)2-(CH2)5的制备
向在氮下冷却至0℃的在10ml DMFA中228mg(1.95mmol)五亚甲基二胺的溶液首先在搅拌下添加在5ml DMFA中429μl(3.90mmol)N-甲基吗啉的溶液，然后在搅拌下添加在15ml DMFA中3.20g(3.90mmol)BzlO-OC(CH2)2CO-Glu(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-OSu的冷溶液。将反应混合物于0℃搅拌1h再于室温搅拌24h。于25～30℃真空去除溶剂。向油性残留物在剧烈搅拌下添加50ml的冷10％柠檬酸溶液。将沉淀的晶体过滤出并用50ml 5％NaHCO3，水(2×50ml)，丙酮(2×50ml)，乙酸乙酯(2×50ml)，及二乙基醚连续洗涤，然后真空干燥以产生1.71g(51％)的白色晶体产物。
1H NMR(DMSO-d6)：1.10-1.46(14H，m，2CγH2CδH2 Lys，NHCH2CH 2CH 2CH 2CH2NH)，1.48和1.60(4H，2m，2CβH2 Lys)，1.76和1.92(4H，2m，2CβH2 Glu)，2.38(4H，m，2CγH2 Glu)，2.49和2.54(8H，2m，2COCH 2CH 2CO)，2.96(8H，m，2CεH Lys，NHCH 2CH2CH2CH2CH 2NH)，4.12(2H，m，2CαH2 Lys)，4.26(2H，m，2CαH Glu)，5.04(4H，s，2OCH2C6H5 Lys)，5.07(8H，s，2OCH2C6H5Glu，2C6H5CH2OOCCH2CH2CO)，7.25-7.48(28H，m，4C6H5，2C6H4Cl)，7.43(2H，t，2NεH Lys)，7.74(2H，t，NHCH2CH2CH2CH2CH2NH)，7.83(2H，d，2NH Lys)，8.15(2H，d，2NH Glu)。
(d)双-(N-单琥珀酰-谷氨酰-赖氨酸)五亚甲基二酰胺，(HOOC(CH2)2CO-Glu-Lys-NH)2-(CH2)5(GK-2b)的制备
将1.65g(0.97mmol)(HOOC(CH2)2CO-Glu(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-NH)2-(CH2)6于室温溶解于30ml乙醇，然后添加5ml环己烯，然后在搅拌下小心添加1.0g 10％Pd/C。将得到的悬浮液在搅拌下加热至回流并持续5h。将反应混合物冷却至室温，并将催化剂过滤出。将溶剂蒸发，，并将残留物用己烷和二乙基醚洗涤，然后真空干燥以产生777mg(98％；总收率40％)的绿色风化性固体.Rf0.41(A)，Rf0.20(B)；[α]25 D-35.2°(c＝0.5；水-甲醇1∶1)。
1H NMR(DMSO-d6)：1.10-1.70(18H，m，2Cβ H 2Cγ H 2Cδ H 2 Lys，-NHCH2CH 2CH 2CH 2CH2NH-)，1.73和1.88(2H，各m，2CβH2 Glu)，2.26(4H，m，2CγH2 Glu)，2.40(8H，m，2HOOCCH2CH2CO-)，2.74(4H，m，2CεH2 Lys)，3.00(4H，m，-NHCH 2CH2CH2CH2CH 2NH-)，4.08(2H，m，2CαH Lys)，4.18(2H，m，2CαH Glu)，7.73(4H，t，-NHCH2CH2CH2CH2CH2NH-)，7.95(2H，d，2NH Lys)，8.26(2H，d，2NH Glu)。2HOOC(CH2)2CO-及2-COOH Glu可与HDO交换。
对于GK-2c，GK-2d和GK-2e的合成而言，每个合成分别各使用3.20g(3.90mmol)BzlO-OC(CH2)2CO-Glu(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-OSu和1.95mmol四亚甲基二胺，亚丙基二胺和乙二胺。全部化合物根据对于GK-2b公开的流程合成。
【双-(N-单琥珀酰-谷氨酰-赖氨酸)四亚甲基二酰胺(HOOC(CH2)2CO-Glu-Lys-NH)2-(CH2)4(GK-2c)】
白色风化性固体。Rf0.41(A)，Rf0.20(B)；[α]25 D-33.3°(c＝1.0；水)。
1H NMR(DMSO-d6)：1.10-1.70(16H，m，-2-Cβ H 2Cγ H 2Cδ H 2-Lys，-NHCH2CH 2CH 2CH2NH-)，1.73和1.89(4H，各m，2CβH2 Glu)，2.26(4H，m 2CγH2 Glu)，2.40(8H，m，2HOOCCH 2CH 2CO-)，2.74(4H，m，2CεH2 Lys)，3.02(4H，m，-NHCH 2CH2CH2CH 2NH)，4.09(2H，m，2CαH Lys)，4.18(2H，m，2CαH Glu)，7.80(2H，t，-NHCH2CH2CH2CH2NH-)，7.93(2H，d，2NH Lys)，8.21(2H，d，2NHGlu)。2HOOC(CH2)2CO-，2-COOH和2-NεH2 Lys可与HDO交换。
【双-(N-单琥珀酰-谷氨酰-赖氨酸)三亚甲基二酰胺(HOOC(CH2)2CO-Glu-Lys-NH)2-(CH2)3(GK-2d)】
白色风化性固体。Rf0.41(A)，Rf0.20(B)；[α]25 D-35.2°(c＝0.5；水-甲醇1∶1)。
1H NMR(DMSO-d6)：1.11-1.70(14H，m，2-CβH2CγH2CδH2-Lys，-NHCH2CH 2CH2NH-)，1.75和1.88(4H，各m，2CβH2 Glu)，2.26(4H，m，2CγH2 Glu)，2.39(8H，m，2HOOCCH 2CH 2CO-)，2.75(4H，m，2CεH2 Lys)，3.02(4H，m，-NHCH 2CH2CH 2NH-)，4.11(2H，m，2CαH Lys)，4.15(2H，m，2CαH Glu)，7.84(2H，t，-NHCH2CH2CH2NH-)，7.96(2H，d，2NH Lys)，8.25(2H，d，2NH Glu)。2HOOC(CH2)2CO-，2-COOH和2NεH2 Lys可与HDO交换。
【双-(N-单琥珀酰-谷氨酰-赖氨酸)亚乙基二酰胺(HOOC(CH2)2CO-Glu-Lys-NH)2-(CH2)2(GK-2e)】
灰色风化性固体。Rf0.41(A)，Rf0.20(B)；[α]25 D-31.6°(c＝0.5；水-甲醇1∶1)。
1H NMR(DMSO-d6)：1.10-1.70(12H，m，2-Cβ H 2Cγ H 2Cδ H 2-Lys)，1.73和1.88(4H，各m，2CβH2 Glu)，2.26(4H，m，CγH2 Glu)，2.39(8H，m，2HOOCCH 2CH 2CO-)，2.75(4H，m，2CεH2 Lys)，3.10(4H，m，-NHCH 2CH 2NH-)，4.11(2H，m，CαH Lys)，4.18(2H，m，2CαHGlu)，7.84(2H，t，-NHCH2CH2NH-)，7.96(2H，d，2NH Lys)，8.24(2H，d，2NH Glu)。2HOOCCH2CH2CO-，2-COOH和2-NεH2 Lys可与HDO交换。
【实施例9：N-乙酰-甘氨酰-赖氨酰-γ-氨基丁酸，CH3CO-Gly-Lys-NH(CH2)3COOH(GK-7)的合成】
(a)γ-氨基丁酸苄基酯甲苯磺酸盐，H-NH(CH2)3CO-OBz·TsOH的制备
将在100ml苯中10.32g(0.10mol)γ-氨基丁酸，20.93g(0.11mol)p-甲苯磺酸一水合物和50ml(0.48mol)苄基醇的溶液在搅拌下加热至回流5h直到无其他水释放，总水释放是～4ml(使用Dean-Stark喷嘴)。将溶液冷却并添加200ml二乙基醚导致沉淀形成。使混合物于+5℃静置过夜。将沉淀的晶体从浓储物溶液过滤出并用二乙基醚洗涤(2×200ml)。将沉淀溶解于500ml沸腾乙酸乙酯。将得到的热溶液于室温冷却4h并于+5℃静置过夜。将沉淀的晶体过滤出并用200ml冷乙酸乙酯和200ml二乙基醚洗涤。于40℃真空干燥产生35.85g(98％)的晶体形式的产物。熔点105℃。
1H NMR(DMSO-d6)：1.80(2H，m，-NHCH2CH 2CH2CO-)，2.28(3H，s，-CH3TsOH)，2.48(2H，t，-NHCH2CH2CH 2CO-)，2.82(2H，m，-NHCH 2CH2CH2CO-)，5.10(2H，s，-OCH 2C6H5)，7.12和7.49(4H，m，C6H4-TsOH)，7.36(5H，m，-OCH2C6 H 5)，7.67(3H，br.s，NH3 +)。
(b)N-t-丁氧基羰基-甘氨酸五氟苯基酯，Boc-Gly-OPfp的制备
向冷却至0℃的在250ml THF中17.52g(0.10mol)Boc-Gly-OH和20.25g(0.11mol)五氟苯酚的溶液在10min之内在搅拌下滴加在50ml THF中21.70g(0.11mol)DCCD的溶液。将溶液在冰浴中搅拌过夜。过滤出二环己脲的白色沉淀并用THF洗涤(2×100ml)。将组合的滤出液蒸发，并将残留物溶解于150ml二乙基醚。使溶液于+4℃静置4h并再次过滤去除痕量的二环己脲沉淀，然后蒸发成流体油状态。将残留物溶解于300ml沸腾己烷，并使得到的溶液于室温静置2h和再于+5℃过夜。将沉淀的晶体过滤出，用冷己烷洗涤(2×150ml)并于50℃真空干燥4h以产生35.53g(92％)的产物。
1H NMR(DMSO-d6)：1.37和1.40(9H，2s，(CH3)3CO-)，4.12和4.15(2H，2d，CH2Gly)，7.17和7.56(1H，2t，NH Gly)。
(c)N-t-丁氧基羰基-Nε-苄氧基羰基-赖氨酸五氟苯基酯，Boc-Lys(Z)-OPfp的制备
类似于Boc-Gly-OPfp(实施例9，部分b)制备。38.04g(0.10mol)Boc-Lys(Z)-OH和20.25g(0.11mol)五氟苯酚产生51.92g(95％)的产物。熔点76～77℃。
(d)N-t-丁氧基羰基-Nε-苄氧基羰基-赖氨酰-γ-氨基丁酸苄基酯，Boc-Lys(Z)-NH(CH2)3CO-OBzl的制备
向在70ml DMFA中8.75g(16.02mmol)Boc-Lys(Z)-OPfp和6.29g(17.20mmol)H-NH(CH2)3CO-OBz·TsOH的溶液在5min之内在搅拌下滴加2.5ml(14.30mmol)DIEA。将反应混合物于室温搅拌3h。然后将溶液转移到分离漏斗并添加300ml水，100ml乙酸乙酯和50ml二乙基醚。提取后分离有机层，用5％H2SO4，饱和Na2SO4，5％NaHCO3，及饱和Na2SO4洗涤，在无水Na2SO4上干燥并蒸发。将得到的油在2天之内结晶化。将晶体用己烷洗涤(2×100ml)并真空干燥以产生8.10g(91％)的产物。熔点77℃。
1H NMR(DMSO-d6)：1.10-1.57(6H，m，-Cβ H 2Cγ H 2Cδ H 2-Lys)，1.66(2H，m，-NHCH2CH 2CH2CO-)，2.35(2H，t，-NHCH2CH2CH 2CO-)，2.96(2H，m，CεH2 Lys)，3.07(2H，m，-NHCH 2CH2CH2CO-)，3.78(1H，m，CαH Lys)，4.99(2H，s，-CO-OCH2C6H5 Lys(Z))，5.07(2H，s，-OCH2C6H5)，6.76(1H，d，NHLys)，7.21(1H，t，NεH Lys)，7.34(10H，m，-CO-OCH2C6H5 Lys(Z)，-OCH2C6 H 5)，7.80(1H，t，-NHCH2CH2CH2CO-)。
(e)Nε-苄氧基羰基-赖氨酰-γ-氨基丁酸苄基酯盐酸盐，Lys(Z)-NH(CH2)3CO-OBzl·HCl的制备
将20ml 4M HCl/二噁烷添加于在5ml二噁烷中3.23g(5.80mmol)Boc-Lys(Z)-NH(CH2)3CO-OBzl的溶液。在30min时将反应混合物真空蒸发，并将残留物用70ml二乙基醚研磨。使得到的混合物于+4℃静置4h，并将晶体沉淀过滤出，用冷二乙基醚洗涤(2×50ml)并于50℃真空干燥3h以产生2.84g(99％)的产物。熔点113～114℃。
1H NMR(DMSO-d6)：1.25(2H，m，CγH2 Lys)，1.39(2H，m，CδH2Lys)，1.70(4H，m，CβH2 Lys，-NHCH2CH 2CH2CO-)，2.40(2H，t，-NHCH2CH2CH 2CO-)，2.96(2H，m，CεH2 Lys)，3.13(2H，m，-NHCH 2CH2CH2CO-)，3.66(1H，m，CαH Lys)，5.00和5.08(4H，2s，-CH 2C6H5)，7.23(1H，t，NεH Lys)，7.35(10H，m，-CO-OCH2C6 H 5Lys(Z)，-OCH2C6 H 5)，8.17(3H，m，NH3 +Lys)，8.55(1H，t，NHCH2CH2CH2CO-)。
(f)甘氨酰-Nε-苄氧基羰基-赖氨酰-γ-氨基丁酸苄基酯三氟乙酸盐，H-Gly-Lys(Z)-NH(CH2)3CO-OBzl·TFA的制备
将1.48ml(8.00mmol)DIEA添加于在30ml THF和15ml DMFA中2.05g(6.00mmol)Boc-Gly-OPfp和2.73g(5.55mmol)Lys(Z)-NH(CH2)3CO-OBzl·HCl的溶液。将反应混合物于室温搅拌4h。向此溶液添加0.2ml(2.00mmol)N，N-二甲基亚乙基二胺，再搅拌20min并浓缩减半。将反应混合物转移到分离漏斗并添加100ml水和100ml乙酸乙酯。当提取完全时，分离有机层并用5％H2SO4，饱和Na2SO4，5％NaHCO3，及饱和Na2SO4连续洗涤，然后其在无水Na2SO4上干燥并蒸发。固化的无定形质取到50ml TFA中。在30min时将溶液蒸发，并将残留物用50ml二乙基醚研磨。使得到的混合物于+5℃静置4h，并将晶体沉淀过滤出，用冷二乙基醚洗涤(2×50ml)并于50℃真空干燥3h以产生3.24g(93％)的产物。
(g)N-乙酰-甘氨酰-Nε-苄氧基羰基-赖氨酰-γ-氨基丁酸苄基酯，CH3CO-Gly-Lys(Z)-NH(CH2)3CO-OBzl的制备
将0.4ml(4.00mmol)乙酸酐添加于在10ml THF中0.50g(4.34mmol)N-羟基琥珀酰亚胺的溶液然后是搅拌2h。向此溶液添加10ml DMFA，然后是1.68g(2.68mmol)H-Gly-Lys(Z)-NH(CH2)3CO-OBzl·TFA和1ml(5.70mmol)DIEA。将反应混合物搅拌2h，然后转移到分离漏斗并添加100ml水和100ml乙酸乙酯。当提取完全时，分离有机层并用5％H2SO4，饱和Na2SO4，5％NaHCO3，及饱和Na2SO4连续洗涤，然后在无水Na2SO4上干燥并蒸发。将残留物取到5ml乙酸乙酯和0.5ml甲醇的混合物，并在填充有100g氧化硅凝胶60，230-400网ASTM的柱上层析。将产物通过乙酸乙酯/甲醇9∶1混合物洗脱。将组合的级分蒸发，并将固体残留物用40ml二乙基醚研磨并过滤出，用冷醚洗涤(2×50ml)并于50℃真空干燥3h以产生1.40g(92％)的白色晶体产物。熔点139～140℃。
1H NMR(DMSO-d6)：1.22-1.66(6H，m，-Cβ H 2Cγ H 2Cδ H 2-Lys)，1.66(2H，m，-NHCH2CH 2CH2CO-)，2.35(2H，m，-NHCH2CH2CH 2CO-)，2.94(2H，m，CεH2Lys)，3.06(2H，m，-NHCH 2CH2CH2CO-)，3.68(2H，d，CH2 Gly)，4.13(1H，m，CαH Lys)，4.99(2H，s，-CO-OCH2C6 H 5 Lys(Z))，5.07(2H，s，-OCH 2C6H5)，7.20(1H，d，NεH Lys)，7.33(10H，m，-CO-OCH2C6 H 5 Lys(Z)，-OCH2C6 H 5)，7.88(1H，t，NHCH2CH2CH2CO-)，7.94(1H，d，NHLys)，8.10(1H，t，NH Gly)。
(h)N-乙酰-甘氨酰-赖氨酰-γ-氨基丁酸，CH3CO-Gly-Lys-NH(CH2)3COOH(GK-7)的制备
将1.27g(2.40mmol)CH3CO-Gly-Lys(Z)-NH(CH2)3CO-OBzl溶解于15ml甲醇，1ml水和2ml乙酸的混合物。向此溶液添加悬浮于5ml甲醇和4ml(39.49mmol)环己烯的1g 10％Pd/C。将反应混合物在搅拌下加热至回流30min然后是冷却。将催化剂过滤出并用甲醇洗涤(2×10ml)。将组合的滤出液蒸发，并将得到的油取到50ml水中。水溶液用50ml乙酸乙酯洗涤，然后将水层浓缩，并取残留物于25ml乙酸中并蒸发。将得到的油真空干燥以产生882mg(94％，总收率71％)的白色固体。熔点198～202℃。C14H26N4O5。
1H NMR(DMSO-d6)：1.26(2H，m，CγH2 Lys)，1.48(2H，m，CδH2Lys)，1.62(2H，m，-NHCH2CH 2CH2COOH)，1.78(2H，m，CβH2 Lys)，1.85(3H，s，CH 3CO-)，2.08(2H，m，-NHCH2CH2CH 2COOH)，2.69(2H，m，CεH2 Lys)，2.91和3.10(2H，m，-NHCH 2CH2CH2COOH)，3.70(2H，d，CH2 Gly)，4.13(1H，m，CαH Lys)，8.10(1H，d，NH Lys)，8.31(1H，t，-NHCH2CH2CH2COOH)，8.40(1H，t，NH Gly)。
【实施例10：N，N’-己二酰-双-(甘氨酰-赖氨酰-γ-氨基丁酸)，Ad-(Gly-Lys-NH(CH2)3COOH)2(GK-8)的合成】
(a)己二酸二-N-氧基琥珀酰亚胺酯，(CH2)4(COOSu)2的制备
向在200ml THF中7.31g(50.00mmol)己二酸和13.81g(120.00mmol)N-羟基琥珀酰亚胺的溶液在冷却至0℃下添加在50ml二氯甲烷中22.70g(110.00mmol)DCCD的溶液。反应混合物在冰浴中搅拌过夜。然后将反应混合物过滤去除二环己脲沉淀，并将滤出液蒸发成产生晶体质。由于过滤之后沉淀的重量大于二环己脲的计算的重量，将沉淀用200ml DMFA搅拌并过滤入含晶体残留物的瓶，以进一步从其余二环己脲分离产物。由此将基本上全部晶体残留物溶解于二甲基甲酰胺滤出液。将得到的二甲基甲酰胺溶液再次过滤以去除小量的二环己脲并蒸发。将得到的晶体质用200ml乙酸乙酯和100mlTHF的混合物研磨，以允许痕量的N-羟基琥珀酰亚胺经过溶液。将晶体产物过滤出，用150ml乙酸乙酯然后是二乙基醚洗涤(2×150ml)并于50℃真空干燥4h以产生12.92g(76％)的产物。
(b)N-己二酰-双-(甘氨酰-Nε-苄氧基羰基-赖氨酰-γ-氨基丁酸苄基酯)，Ad-(Gly-Lys(Z)-NH(CH2)3CO-OBzl)2的制备
将3ml(2.73mmol)N-甲基吗啉添加于375mg(1.10mmol)(CH2)4(COOSu)2和1.50g(2.39mmol)H-Gly-Lys(Z)-NH(CH2)3CO-OBzl·TFA(其制备描述于实施例9，部分f)的溶液。然后将溶液过滤，蒸发成流体油状态(～以2/3)，并将100ml1N HCl添加于残留物。将得到的沉淀用50ml 1N HCl，水(2×50ml)，乙酸乙酯(2×50ml)，及二乙基醚(2×50ml)连续洗涤，然后于50℃真空干燥4h。将残留物取到15ml氯仿和2ml甲醇的混合物中，并添加到在100ml过滤器上的氧化硅凝胶层(氧化硅凝胶60，230-400网ASTM)使用氯仿-甲醇-乙酸20∶2∶1混合物作为洗脱液。将适当的级分(500ml)蒸发，并将固体残留物用50ml二乙基醚研磨并过滤出，然后用醚洗涤(2×50ml)以产生1.20g(94％)的产物。熔点186～187℃。
1H NMR(DMSO-d6)：1.15-1.45(12H，m，2-Cβ H 2Cγ H 2Cδ H 2-Lys)，1.45(8H，m，(CH2)4Ad)，1.65(4H，m，2-NHCH2CH 2CH2CO-)，2.10(4H，m，2CεH2 Lys)，(4H，t，2-NHCH2CH2CH 2CO-)，3.06(4H，m，-NHCH 2CH2CH2CO-)，3.68(4H，各d，2CH2 Gly)，4.12(2H，m，2CαH Lys)，4.98(4H，各s，2-CO-OCH 2C6H5 Lys(Z))，5.07(4H，各s，2-CH 2C6H5)，7.21(2H，各t，2NεH Lys)，7.27-7.37(20H，m，2-CO-OCH2C6 H 5 Lys(Z)，2-CH2C6 H 5)，7.91(2H，各t，2-NHCH2CH2CH2CO-)，7.94(2H，各d，2NH Lys)，8.05(2H，各t，2NH Gly)。
(c)N-己二酰-双-(甘氨酰-赖氨酰-γ-氨基丁酸)，Ad-(Gly-Lys-NH(CH2)3COOH)2(GK-8)的制备
将1.16g(1.00mmol)Ad-(Gly-Lys(Z)-NH(CH2)3CO-OBzl)2溶解于20ml甲醇，1ml水和5ml乙酸的混合物。向此溶液添加悬浮于5ml甲醇和4ml(39.49mmol)环己烯的1g 10％Pd/C。将反应混合物在搅拌下加热至回流30min然后是冷却。将催化剂过滤出并用甲醇(3×10ml)和水-乙酸1∶1混合物(3×10ml)洗涤。将组合的滤出液蒸发，并将得到的油取到50ml水和5ml乙酸的混合物中。将得到的溶液用50ml乙酸乙酯洗涤并浓缩，并取残留物于25ml乙酸并再次蒸发。将得到的油真空干燥以产生0.76g(94％，总收率67％)的二乙酸盐形式的油性产物。
1H NMR(DMSO-d6)：1.16-1.77(20H，m，2-Cβ H 2Cγ H 2Cδ H 2-Lys，-COCH2CH 2CH 2CH2CO-，2-NHCH2CH 2CH2CO-)，1.83(6H，s，2CH 3COOH)，2.13(8H，m，2-NHCH2CH2CH 2CO-，-COCH 2CH2CH2CH 2CO-)，2.72(4H，m，2CεH2 Lys)，3.00(4H，m，2-NHCH 2CH2CH2CO-)，3.70(4H，d，2CH2 Gly)，4.32(2H，m，2CαHLys)，8.10(2H，t，2-NHCH2CH2CH2CO-)，8.11(2H，d，2NH Lys)，8.33(2H，t，2NH Gly)。
【实施例11：N-单琥珀酰-丝氨酰-赖氨酸酰胺，HOOC(CH2)2CO-Ser-Lys-NH2(GSB-104)的合成】
(a)N-t-丁氧基羰基-Nε-(2-氯苄氧羰基)-赖氨酸酰胺，Boc-Lys(2-Cl-Z)-NH2的制备
向在10ml DMFA中1.5g(3.62mmol)Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH的溶液于-10℃连续添加0.34ml(3.62mmol)N-甲基吗啉和0.52ml(3.62mmol)异丁基甲酸盐各时间维持温度在-5℃以下。然后添加10ml用氨饱和的DMFA(pH8)。将反应混合物于-10℃搅拌1h并于室温搅拌另一小时。真空去除溶剂，并取残留物于30ml氯仿中，并用水，5％NaHCO3，1N HCl连续洗涤并再次用水洗涤。将得到的将溶液蒸发并真空干燥以产生1.3g(87％)的白色粉末。Rf0.49(C)；熔点105～106℃；[α]20 D-8.5°(c＝0.4；氯仿)。
1H NMR(DMSO-d6)：1.36(9H，s，-CO-OC(CH3)3)，1.17-1.65(6H，m，-Cβ H 2Cγ H 2Cδ H 2-Lys)，2.97(2H，m，CεH2 Lys)，3.80(1H，m，CαH Lys)，5.07(2H，s，-CO-OCH 2C6H4Cl)，6.73(1H，d，NH Lys)，6.96和7.25(2H，2s，NH2酰胺)，7.37(1H，t，NεH Lys)，7.30-7.50(4H，m，-CO-OCH2C6 H 4Cl)。
(b)Nε-(2-氯苄氧羰基)-赖氨酸酰胺三氟乙酸盐，H-Lys(2-Cl-Z)-NH2·TFA的制备
将在3ml TFA和3ml二氯甲烷中400mg Boc-Lys(2-Cl-Z)-NH2的溶液于室温搅拌30min。然后真空去除溶剂，并将残留物用10ml醚蒸发两次并真空干燥以产生410mg(99％)的三氟乙酸盐形式的产物。熔点67～71℃。
1H NMR(DMSO-d6)：1.31(2H，m，CγH2Lys)，1.40(2H，m，CδH2Lys)，1.70(2H，m，CβH2 Lys)，2.99(2H，m，CεH2 Lys)，3.68(1H，m，CαH Lys)，5.08(2H，s，-CO-OCH 2C6H4Cl)，7.31-7.52(4H，m，-CO-OCH2C6 H 4Cl)，7.57和7.88(2H，2s，NH2酰胺)，8.09(3H，s，NH3 +Lys)。
(c)N-t-丁氧基羰基-O-苄基-丝氨酰-Nε-(2-氯苄氧羰基)-赖氨酸酰胺，Boc-Ser(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-NH2的制备
将0.43ml(2.46mmol)DIEA添加于在10ml DMFA中240mg(0.82mmol)Boc-Ser(OBzl)-OH和532.2mg(0.90mmol)PyBOP的溶液。将得到的溶液添加于在10ml DMFA中350mg(0.82mmol)H-Lys(2-Cl-Z)-NH2·TFA的溶液。使溶液静置过夜。然后将0.5mlDETMDA添加于反应混合物并搅拌30min。将反应质用200ml乙酸乙酯稀释，并用水，2％H2SO4，3％K2CO3，及饱和NaCl连续洗涤然后是在无水MgSO4上干燥。然后真空去除溶剂，并将残留物真空干燥以产生0.51g的白色粉末。通过HPLC发现粉末包括Rf0.35和Rf0.40的2种成分(D)。通过HPLC分离产生330mg(68.2％)的白色粉末的最终产物。Rf0.35(D)；熔点127～129℃；[α]20 D-2.5°(c＝0.4；DMFA)。
1H NMR(DMSO-d6)：1.15-1.85(6H，m，-Cβ H 2Cγ H 2Cδ H 2-Lys)，1.37(9H，s，-CO-OC(CH3)3)，2.93(2H，m，CεH2 Lys)，3.58(2H，m，CβH2 Ser)，4.17(1H，m，CαH Lys)，4.21(1H，m，CαH Ser)，4.46(2H，s，-CH 2C6H5Ser(OBzl))，5.06(1H，s，-CO-OCH 2C6H4Cl)，7.05(1H，d，NH Ser)，7.09和7.25(2H，2s，NH2酰胺)，7.2-7.5(9H，m，-CH2C6 H 5Ser(OBzl)，-CO-OCH2C6 H 4Cl)，7.45(2H，t，NεH Lys)，7.87(1H，d，NH Ser)。
(d)O-苄基-丝氨酰-Nε-(2-氯苄氧羰基)-赖氨酸酰胺三氟乙酸盐，H-Ser(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-NH2·TFA的制备
将在2ml TFA中287mg(0.5mmol)Boc-Ser(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-NH2的溶液搅拌30min，然后蒸发。将残留物用醚结晶化以产生265mg(90％)的白色晶体产物。Rf0.03(D)；熔点153～155℃；[α]20 D+6.25°(c＝0.4；DMFA)。
1H NMR(DMSO-d6)：1.27(2H，m，CγH2Lys)，1.39(2H，m，CδH2Lys)，1.54和1.65(2H，m，CβH2Lys)，2.97(2H，m，CεH2 Lys)，3.67和3.74(2H，2d，CβH2 Ser)，4.11(1H，m，CαH Ser)，4.24(1H，m，CαH Lys)，4.54(2H，s，-CH 2C6H5 Ser(OBzl))，5.07(2H，s，-CO-OCH 2C6H4Cl)，7.14和7.45(9H，m，-CH2C6 H 5 Ser(OBzl)，-CO-OCH2C6 H 4Cl)，7.35(1H，t，NεH Lys)，8.25(3H，br.s，NH3 +Ser)，8.57(1H，d，NH Lys)。
(e)N-单琥珀酰-O-苄基-丝氨酰-Nε-(2-氯苄氧羰基)-赖氨酸酰胺，HOOC(CH2)2CO-Ser(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-NH2的制备
将0.06ml(0.44mmol)TEA添加于在4ml DMFA中240mg(0.40mmol)H-Ser(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-NH2·TFA的溶液。将溶液搅拌15min并添加60mg(1.2mmol)琥珀酸酐。将反应混合物搅拌过夜，且当起始化合物消失(TLC控制)时，添加25ml水。将得到的白色沉淀过滤出，用水洗涤并干燥以产生207mg(88％)的产物。Rf0.28(C)；熔点158～166℃。
1H NMR(DMSO-d6)：1.25(2H，m，CγH2Lys)，1.35(2H，m，CδH2Lys)，1.52和1.68(2H，2m，CβH2 Lys)，2.41(4H，m，HOOCCH 2CH 2CO-)，2.94(2H，m，CεH2 Lys)，3.58和3.60(2H，2d，CβH2 Ser)，4.13(1H，m，CαH Lys)，4.47(1H，m，CαH Ser)，4.48(2H，s-CH 2C6H5 Ser(OBzl))，5.07(2H，s，-CO-OCH 2C6H4Cl)，7.06和7.14(2H，2s，NH2酰胺)，7.20-7.50(9H，m，-CH2C6 H 5 Ser(OBzl)，-CO-OCH2C6 H 4Cl)，7.34(1H，t，NεH Lys)，7.92(1H，d，NH Lys)，8.25(1H d，NH Ser)。
(f)N-单琥珀酰-丝氨酰-赖氨酸酰胺，HOOC(CH2)2CO-Ser-Lys-NH2(GSB-104)的制备
将180mg(0.30mmol)10％Pd/C添加于在10ml DMFA中180mg(0.30mmol)HOOC(CH2)2CO-Ser(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-NH2的溶液并在氢下搅拌2天直到起始化合物消失(TLC控制)。然后将催化剂过滤出，并将滤出液蒸发以产生95mg(100％，总收率51.7％)的吸湿粉末的产物。Rf0(C)，Rf0.35(E)；[α]20 D-15.75°(c＝0.4；DMFA)。
1H NMR(DMSO-d6)：1.29(2H，m，CγH2 Lys)，1.79(2H，m，CβH2Lys)，2.03(2H，m，CδH2 Lys)，2.51(2H，2d，HOOCCH2CH 2CO-)，2.68(2H，2d，HOOCCH 2CH2CO-)，3.91和4.16(2H，2d，CβH2 Ser)，4.53(1H，m，CαH Lys)，4.62(1H，m，CαH Ser)，4.78(1H，s，-COOHSer)，7.21(2H，s，NH2酰胺)，8.31-8.35(5H，m，NεH3 +Lys，NH Ser，NH Lys)。
【实施例12：双-(N-单琥珀酰-丝氨酰-赖氨酸)六亚甲基二酰胺，(HOOC(CH2)2CO-Ser-Lys-NH)2-(CH2)6(GSB-106)的合成】
(a)N-t-丁氧基羰基-Nε-(2-氯苄氧羰基)-赖氨酸五氟苯基酯，Boc-Lys(2-Cl-Z)-OPfp的制备
将3.33g(18mmol)五氟苯酚添加于在80ml THF中7.6g(17mmol)Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH的溶液。将溶液冷却至-5℃，然后将在20ml THF中3.50g(17mmol)DCCD的溶液逐渐添加到其中而保持温度在0℃以下。将反应混合物于-5℃搅拌3h并使于+4℃静置过夜。过滤出二环己脲的白色沉淀，将滤出液蒸发，并将油性残留物从乙酸乙酯-己烷混合物(15ml/80ml)结晶化。将得到的晶体过滤出，用己烷洗涤并真空干燥以产生7.18g的产物。将母液也蒸发并从乙酸乙酯-己烷混合物(5ml/50ml)再结晶以产生额外的1.05g的产物。总产量是8.23g(89％)。Rf0.42(F)，Rf0.13(G)；熔点134～135℃；[α]20 D-25.75°(c＝0.4；DMFA)。
1H NMR(DMSO-d6)：1.29(2H，m，CγH2 Lys)，1.42(9H，s，-CO-OC(CH3)3)，1.55(2H，m，CδH2 Lys)，1.78(2H，m，CβH2 Lys)，4.42(1H，m，CαH Lys)，5.34(2H，s，-CO-OCH 2C6H4Cl)，6.76(1H，d，NH Lys)，7.05-7.20(4H，m，-CO-OCH2C6 H 4Cl)，7.39(1H，t，NεHLys)。
(b)双-(N-t-丁氧基羰基-Nε-(2-氯苄氧羰基)-赖氨酸)六亚甲基二酰胺，(Boc-Lys(2-Cl-Z)-NH)2-(CH2)6的制备
将200mg(1.72mmol)六亚甲基二胺添加于在20ml乙酸乙酯中2g(3.66mmol)Boc-Lys(2-Cl-Z)-OPfp的溶液。将反应混合物搅拌1h，在其上将其蒸发，取到100ml乙酸乙酯中，并用1N H2SO4，饱和NaCl，3％K2CO3连续洗涤，并再次用饱和NaCl洗涤，然后将其在无水Na2SO4上干燥，并蒸发。将得到的晶体固体用己烷洗涤并真空干燥以产生1.45g(96％)的产物。Rf0.56(H)；熔点109～114℃；[α]20 D-12.0°(c＝0.4；DMFA)。
1H NMR(DMSO-d6)：1.29(8H，m，2CγH2 Lys，-NHCH2CH2CH 2CH 2CH2CH2NH-)，1.42(18H，s，2-CO-OC(CH3)3)，1.55(8H，m，2CδH2 Lys，-NHCH2CH 2CH2CH2CH 2CH2NH-)，1.79(4H，m，2CβH2 Lys)，2.96(4H，m，2CεH2 Lys)，3.20(4H，m，-NHCH 2 CH2CH2CH 2CH2 CH 2 NH-)，4.53(2H，m，CαH Lys)，5.34(4H，s，2-CO-OCH 2 C6H4Cl)，6.76(2H，d，2NH Lys)，7.39(2H，t，NεH Lys)，8.01(2H，t，-NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-)。
(c)双-(Nε-(2-氯苄氧羰基)-赖氨酸)六亚甲基二酰胺二盐酸盐，(H-Lys(2-Cl-Z)-NH)2-(CH2)6·2HCl的制备
将10ml二噁烷中的4N HCl添加于在10ml二噁烷中1.42g(1.71mmol)(Boc-Lys(2-Cl-Z)-NH)2-(CH2)6的溶液。当反应完全(TLC控制)时，将溶液蒸发干以产生作为泡沫的产物(固化的油)。不经任何进一步处理而将其用于下一步骤。
1H NMR(DMSO-d6)：0.95-1.75(20H，m，2-CH 2 βCH 2 γCH 2 δ-Lys，-NHCH2CH 2CH 2CH 2CH 2CH2NH-)，2.98(4H，m，-NHCH 2CH2CH2CH2CH2CH 2NH-)，3.09(4H，m，2CεH2 Lys)，3.70(2H，m，2CαH Lys)，5.07(4H，s，2-CO-OCH 2 C6H4Cl)，7.37(2H，t，-NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-)，7.45(8H，m，2-CO-OCH2C6 H 4Cl)，8.23(6H，m，2N+H3 Lys)，8.59(2H，t，2NεHLys)。
(d)双-(N-t-丁氧基羰基-O-苄基-丝氨酰-Nε-(2-氯苄氧羰基)-赖氨酸)六亚甲基二酰胺，(Boc-Ser(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-NH)2-(CH2)6的制备
向在10ml DMFA中(H-Lys(2-Cl-Z)-NH)2-(CH2)6·2HCl(1.32mmol)的溶液首先添加0.46ml(2.64mmol)DIEA(pH8)，然后是2.44g(2.64mmol)Boc-Ser(OBzl)-OPfp。将反应混合物于室温搅拌1h并使静置过夜。在次日，将0.5ml DETMDA添加于反应混合物并搅拌15min。然后将其用150ml乙酸乙酯稀释，用水，3％H2SO4，2％K2CO3，及饱和NaCl连续洗涤，在无水Na2SO4上干燥并蒸发。将残留物从甲醇再结晶以产生0.75g(45％)的作为白色粉末的产物。Rf0.44(C)；熔点143～151℃；[α]20 D-2.5°(c＝0.4；DMFA)。
1H NMR(DMSO-d6)：0.93-1.83(38H，m，2-CO-OC(CH3)3，2-CH 2 βCH 2 γCH 2 δ-Lys，-NHCH2CH 2CH 2CH 2CH 2CH2NH-)，2.93(8H，m，2CεH2 Lys，-NHCH 2CH2CH2CH2CH2CH 2NH-)，3.59(4H，m，2CβH2 Ser)，4.20(4H，m，2CαH Lys，2CαH Ser)，4.47(4H，s，2-CH 2C6H5Ser(OBzl))，5.07(4H，s，2-CO-OCH 2 C6H4Cl)，7.00(2H，d，NH Ser)，7.19-7.50(20H，m，2-CH2C6 H 5 Ser(OBzl)，2-CO-OCH2C6 H 4Cl，-NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-)，7.77(2H，t，NεH Lys)，7.91(2H，d，NH Lys)。
(e)双-(O-苄基-丝氨酰-Nε-(2-氯苄氧羰基)-赖氨酸)六亚甲基二酰胺二三氟乙酸盐，(H-Ser(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-NH)2-(CH2)6·2TFA的制备
将0.34g(Boc-Ser(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-NH)2-(CH2)6溶解于32mlTFA并搅拌40min，然后将反应混合物蒸发。将15ml苯添加两次到残留物并再次蒸发以产生0.42g的米色粉末。将粉末从醚再结晶以产生0.25g(72％)的以层析方式均质的作为白色粉末的产物。Rf0.33(C)，Rf0.67(E)；熔点117～122℃；[α]20 D+4.75°(c＝0.4；DMFA)。
(f)双-(N-单琥珀酰-O-苄基-丝氨酰-Nε-(2-氯苄氧羰基)-赖氨酸)六亚甲基二酰胺，(HOOC(CH2)2CO-Ser(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-NH)2-(CH2)6的制备
将0.23g(0.178mmol)(H-Ser(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-NH)2-(CH2)6·2TFA悬浮于5ml DMFA。将0.055ml(0.40mmol)TEA添加于悬浮液并搅拌30min，然后添加0.108g(1.078mmol)琥珀酸酐。将反应混合物搅拌1h，使悬浮液澄清，并使静置过夜。当起始化合物消失(TLC控制)时，反应混合物用水稀释。将得到的白色沉淀过滤出，用醚洗涤并真空干燥以产生0.18g(91％)的产物。Rf0.12(C)；熔点178～180℃；[α]20 D-11.25°(c＝0.4；DMFA)。
1H NMR(DMSO-d6)：0.95-1.78(20H，m，2-CH 2 βCH 2 γCH 2 δ-Lys，-NHCH2CH 2CH 2CH 2CH 2CH2NH-)，2.42(8H，m，2HOOCCH 2CH 2CO)，2.97(8H，m，2CεH2Lys，-NHCH 2CH2CH2CH2CH2CH 2NH-)，3.60(4H，m，2CβH2 Ser)，4.14(4H，m，2CαH Lys)，4.44(2H，m，2CαH Ser)，4.45(4H，s，2-CH 2C6H5Ser(OBzl))，5.07(4H，s，2-CO-OCH 2 C6H4Cl)，7.20-7.49(20H，m，2-CH 2C6H5 Ser(OBzl)，2-CO-OCH2C6 H 4Cl，-NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-)，7.53(2H，t，2NεH Lys)，7.89(2H，d，2NH Lys)，8.24(2H，d，2NH Ser)。
(f)双-(N-单琥珀酰-丝氨酰-赖氨酸)六亚甲基二酰胺，(HOOC(CH2)2CO-Ser-Lys-NH)2-(CH2)6(GSB-106的制备
将200mg 10％Pd/C添加于在30ml甲醇中96mg(0.076mmol)(HOOC(CH2)2CO-Ser(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-NH)2-(CH2)6的溶液并在氢下搅拌11h。当氢化反应完全(TLC控制)时，将催化剂过滤出。将滤出液蒸发，并将残留物真空干燥以产生65mg(定量)的产物。Rf0(C)，Rf0.04(E)。C32H58N8O12。
1H NMR(DMSO-d6)：1.00-1.75(20H，m，2-CH 2 βCH 2 γCH 2 δ-Lys，-NHCH2CH 2CH 2CH 2CH 2CH2NH-)，2.42(8H，m，2HOOCCH 2CH 2CO)，2.74(4H，m，2CεH2 Lys)，3.00(4H，m，-NHCH 2CH2CH2CH2CH2CH 2NH-)，3.52和3.63(4H，2d，2CβH2 Ser)，4.14(2H，m，CαH Lys)，4.27(2H，m，2CαH Ser)，7.68(2H，t，-NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-)，7.72(br.s，NεH3 +Lys)，7.95(2H，d，NH Lys)，8.10(2H，d，NH Ser)，7.43(br.s，-OH)。
【实施例13：双-(N-(γ-氧基丁酰)-赖氨酰-赖氨酸)六亚甲基二酰胺，(HO(CH2)3CO-Lys-Lys-NH)2-(CH2)6(GSB-120)的合成】
(a)N-t-丁氧基羰基-Nε-苄氧基羰基-赖氨酸五氟苯基酯，Boc-Lys(Z)-OPfp的制备
将在40ml THF中的4.84g(26.285mmol)五氟苯酚添加于在100mlTHF中10g(26.285mmol)Boc-Lys(Z)-OH的溶液。将溶液冷却至-3℃，然后添加在40ml THF中5.42g(26.285mmol)DCCD的溶液。将反应混合物于-5℃～0℃搅拌1h 15min并使于+5℃静置过夜。在次日过滤出二环己脲的白色沉淀，并将滤出液蒸发。将残留物从乙酸乙酯-己烷混合物再结晶以产生12.55g(87.5％)的产物。Rf0.56(F)。
(b)双-(N-t-丁氧基羰基-Nε-苄氧基羰基)-赖氨酸)六亚甲基二酰胺，(Boc-Lys(Z)-NH)2-(CH2)6的制备
将在50ml DMFA中的0.50g(4.31mmol)六亚甲基二胺添加于在50ml DMFA中4.91g(9.00mmol)Boc-Lys(Z)-OPfp的溶液。将反应混合物搅拌1h，然后于室温静置过夜。在次日将0.5ml DETMDA添加于反应混合物并搅拌30min。然后将反应混合物蒸发一半并用100ml乙酸乙酯稀释。将有机相用饱和Na2SO4(4×25ml)洗涤，并将水相组合并用50ml乙酸乙酯洗涤。将乙酸乙酯层组合并用3％H2SO4(2×50ml)，3％K2CO3(2×50ml)，及饱和Na2SO4(2×50ml)连续洗涤，然后在无水Na2SO4上干燥并蒸发以产生3.59g(99.16％)的产物。Rf0.91(E)；熔点97～99℃；[α]20 D-7.25°(c＝0.4；DMFA)。
(c)双-(Nε-苄氧基羰基)-赖氨酸)六亚甲基二酰胺二三氟乙酸盐，(H-Lys(Z)-NH)2-(CH2)6·2TFA的制备
将3.59g(4.27mmol)(Boc-Lys(Z)-NH)2-(CH2)6溶解于8ml TFA，搅拌30min并蒸发。将残留物用二乙基醚再蒸发6次以产生3.71g的作为油的产物。不经任何进一步处理而将其用于下一步骤.Rf0.29(E)。
(d)双-(N-t-丁氧基羰基-Nε-苄氧基羰基-赖氨酰-Nε-苄氧基羰基-赖氨酸)六亚甲基二酰胺，(Boc-Lys(Z)-Lys(Z)-NH)2-(CH2)6的制备
将2ml N-甲基吗啉(pH8)和5.129g(9.39mmol)Boc-Lys(Z)-OPfp添加于在30ml DMFA中3.71g(4.27mmol)(H-Lys(Z)-NH)2-(CH2)6·2TFA的溶液。将反应混合物搅拌45min并使静置过夜，然后添加0.5ml DETMDA和搅拌30min。然后反应混合物用氯仿稀释至300ml。将有机相用100ml水和3％H2SO4(2×100ml)洗涤。组合的含水级分提取到氯仿中(2×50ml)。将有机级分组合并用3％K2CO3(2×100ml)洗涤。将得到的含水级分用氯仿(2×50ml)洗涤。将全部有机级分组合并在无水Na2SO4上干燥。如上通过TLC证明，得到的氯仿溶液除了靶产物之外含杂质。为了纯化产物，真空去除氯仿，并将残留物摄取到乙酸乙酯中。立即开始形成仍含杂质的白色无定形沉淀。真空去除溶剂，并将残留物通过层析纯化(洗脱液：二噁烷/水，10∶1；固定相：硅胶70-230网，60
Figure BPA00001444239500481
(Aldrich)；柱21cm×15mm)以产生2.4g(41％)的产物。Rf0.90(E)，Rf0.91(I)；熔点179～182℃；[α]20 D-10.25°(c＝0.4；DMFA)。
1H NMR(DMSO-d6)：1.12-1.72(32H，m，4-CH 2 βCH 2 γCH 2 δ-Lys1，2，-NHCH2CH 2CH 2CH 2CH 2CH2NH-)，1.36(18H，s，-CO-OC(CH3)3)，2.95(12H，m，4CεH2 Lys1，2，-NHCH 2CH2CH2CH2CH2CH 2NH-)，3.84(2H，m，CαH Lys1)，4.17(2H，m，2CαH Lys2)，4.99(8H，s，4-CO-OCH 2C6H5)，6.92(2H，d，2NH Lys1，2)，7.20和7.23(4H，2t，4NεH Lys1，2)，7.33(20H，m，4-CO-OCH2C6 H 5)，7.68(2H，d，2NHLys2)，7.83(2H，t，NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-)。
(e)双-(Nε-苄氧基羰基-赖氨酰-Nε-苄氧基羰基-赖氨酸)六亚甲基二酰胺二三氟乙酸盐，(H-Lys(Z)-Lys(Z)-NH)2-(CH2)6·2TFA的制备
将0.639g(0.47mmol)(Boc-Lys(Z)-Lys(Z)-NH)2-(CH2)6用3mlTFA稀释，搅拌30min并蒸发。将残留物再用醚蒸发3次。将得到的油从醚再结晶以产生0.597g(91.25％)的作为白色粉末的产物.Rf0.71(E)；m.p.143～148℃；[α]20 D+10.5°(c＝0.4；DMFA)。
1H NMR(DMSO-d6)：1.07-1.78(32H，m，4-CH 2 βCH 2 γCH 2 δ-Lys1，2，-NHCH2CH 2CH 2CH 2CH 2CH2NH-)，2.96(12H，m，4CεH Lys1，2，-NHCH 2CH2CH2CH2CH2CH 2NH-)，3.78(2H，m，2CαH Lys1)，4.22(2H，m，2CαH Lys2)，4.99(8H，s，4-CO-OCH 2C6H5)，7.21和7.23(4H，2t，4NεH Lys1，2)，7.33(20H，m，4-CO-OCH2C6 H 5)，8.00(2H，t，NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-)，8.07(6H，m，2NH3 +Lys1)，8.49(2H，d，2NH Lys2)。
(f)双-(N-(O-苄基-γ-氧基丁酰)-Nε-苄氧基羰基-赖氨酰-Nε苄氧基羰基-赖氨酸)六亚甲基二酰胺，(BzlO(CH2)3CO-Lys(Z)-Lys(Z)-NH)2-(CH2)6的制备
将0.370ml N-乙基吗啉(pH7.5)和0.140ml(0.790mmol)BzlO(CH2)3COOH添加于在10ml DMFA中0.50g(0.359mmol)(H-Lys(Z)-Lys(Z)-NH)2-(CH2)6·2TFA和0.35g(0.790mmol)BOP的溶液。将反应混合物搅拌2天(缺乏TLC控制，由于起始化合物和DMFA具有相同的Rf值)。将反应混合物用100ml氯仿然后是40ml水稀释。将得到的无定形沉淀过滤出并真空干燥以产生0.29g(53.35％)的产物。Rf0.06(E)，Rf0.23(K)；熔点204～208℃；[α]20 D-12.0°(c＝0.4；DMFA)。
1H NMR(DMSO-d6)：1.11-1.68(32H，m，4-CH 2 βCH 2 γCH 2 δ-Lys1，2，-NHCH2CH 2CH 2CH 2CH 2CH2NH-)，1.75m，2.20t，3.35t(12H，2BzlO-CH 2 γCH 2 βCH 2 αCO-)，2.95(12H，m，4CεH2Lys1，2，-NHCH 2CH2CH2CH2CH2CH 2NH-)，4.14(4H，m，4CαH Lys1，2)，4.42(4H，s，2-C6H5CH 2O)，4.98(8H，s，4-CO-OCH 2C6H5)，7.19(2H，t，4NH Lys1，2)，7.31(30H，m，2-C6H5CH 2O-，4-CO-OCH2C6 H 5)，7.74(4H，m，2NH Lys1，-NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-)，7.95(2H，d，2NH Lys2)。
(g)双-(N-(γ-氧基丁酰)-赖氨酰-赖氨酸)六亚甲基二酰胺，(HO(CH2)3CO-Lys-Lys-NH)2-(CH2)6(GSB-120)的制备
将30ml甲醇添加于0.165g(0.109mmol)磨碎的(BzlO(CH2)3CO-Lys(Z)-Lys(Z)-NH)2-(CH2)6和0.450g Pd/C。将混合物在氢下搅拌伴随加热(在48℃浴中)～15h。当氢化反应完全(TLC控制)时，将催化剂过滤出。将滤出液蒸发，并将残留物真空干燥以给出定量产量的产物。Rf0.0(E，K，L，M)。C38H76N10O8。
1H NMR(DMSO-d6)：1.20-1.60(36H，m，4-CH 2 βCH 2 γCH 2 δ-Lys1，2，-NHCH2CH 2CH 2CH 2CH 2CH2NH-，2BzlO-CH2 γCH 2 βCH2 αCO-)，2.17(4H，t，2BzlO-CH2 γCH2 βCH 2 αCO-)，2.74(4H，m，-NHCH 2CH2CH2CH2CH2CH 2NH-)，3.01(8H，m，4CεH2Lys1，2)，3.37(4H，t，2BzlO-CH 2 γCH2 βCH2 αCO-)，4.16和4.32(4H，2m，4CαHLys1，2)，7.80(2H，br.t，NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-)，7.87和8.03(4H，2d，4NH Lys1，2)。4NεH2 Lys可与HDO交换。
【实施例14：N-单琥珀酰-蛋氨酰-丝氨酸酰胺，HOOC(CH2)2CO-Met-Ser-NH2(GSB-207)的合成】
(a)N-t-丁氧基羰基-蛋氨酰-丝氨酸甲基酯，Boc-Met-Ser-OMe的制备
将5.7ml(41mmol)TEA在搅拌下添加于在50ml DMFA中的6.38g(41mmol)H-Ser-OMe盐酸盐和15.8g(41mmol)Boc-Met-ONp。使反应混合物于室温静置过夜。当反应完全(TLC控制)时，添加2mlDMPDA，搅拌30min并蒸发。向残留物添加150ml乙酸乙酯和100ml水。有机相用3％K2CO3(3×60ml)和100ml 2％HCl连续洗涤，在无水Na2SO4上干燥并蒸发。残留物取至50ml醚中，并添加庚烷直到混浊。将得到的晶体过滤出，用庚烷洗涤并干燥以产生11.6g(80.7％)的产物。Rf0.67(L)，Rf0.80(M)；熔点65～68℃；[α]20 D-20.75°(c＝0.4；甲醇)。
1H NMR(DMSO-d6)：1.36(9H，s，-CO-O(CH3)3)，1.81(2H，m，CβH2 Met)，2.45(2H，t，CγH2 Met)，3.62(3H，s，-OCH3)，3.70(2H，m，CβH2 Ser)，4.08(1H，m，CαH Met)，4.33(1H，m，CαH Ser)，5.08(1H，t，-OH Ser)，6.98(1H，d，NH Met)，8.07(1H，d，NH Ser)。
(b)N-t-丁氧基羰基-蛋氨酰-丝氨酸酰胺，Boc-Met-Ser-NH2的制备
将在10ml甲醇中4g(11.4mmol)Boc-Met-Ser-OMe的溶液于0℃用氨饱和，并使于室温在密封的瓶中静置3天。然后将其蒸发，并将残留物用30ml醚和5ml乙醇的混合物结晶化。将得到的晶体过滤出并干燥以产生3.19g(83.4％)的产物。Rf0.57(L)，Rf0.71(M)；熔点120～121℃；[α]20 D-12.25°(c＝0.4；甲醇)。
1H NMR(DMSO-d6)：1.38(9H，s，-CO-O(CH3)3)，1.82(2H，m，CβH2Met)，2.03(3H，s，-SCH3 Met)，2.46(2H，t，CγH2 Met)，3.56(2H，m，CβH2 Ser)，4.0(1H，m，CαH Met)，4.17(1H，m，CαHSer)，4.90(1H，t，-OH Ser)，7.12和7.23(2H，2s，NH2酰胺)，7.14(1H，d，NH Met)，7.65(1H，d，NH Ser)。
(c)N-单琥珀酰-蛋氨酰-丝氨酸酰胺，HOOC(CH2)2CO-Met-Ser-NH2(GSB-207)的制备
将2.99g(8.9mmol)Boc-Met-Ser-NH2溶解于15ml TFA，搅拌1h并蒸发。将残留物从醚结晶化，并将得到的晶体过滤出及用醚洗涤。然后其溶解于20ml 50％乙醇，用Amberlite IRA-900树脂(-OH形式)处理至pH～10，过滤并蒸发。添加DMFA后再蒸发一次。将残留物溶解于10ml DMFA并添加1g(10mmol)琥珀酸酐。将反应混合物搅拌过夜，且当起始化合物消失(TLC控制)时，将25ml水添加于其中。将得到的白色沉淀过滤出，用水洗涤并干燥。将反应混合物搅拌2h，且当起始化合物消失(TLC控制)时，将其蒸发。通过使于-20℃静置将残留物从醚-乙醇混合物(4∶1)再结晶。将得到的晶体过滤出，用冷醚-乙醇混合物(4∶1)洗涤并干燥以产生0.96g(32％，总收率21.5％)的产物。Rf0.11(L)，Rf0.45(M)；熔点101～105℃；[α]20 D-14.25°(c＝0.4；甲醇)。C12H21N3O6S。
1H NMR(DMSO-d6)：1.75和1.90(2H，2m，CβH2 Met)，2.03(3H，s，-SCH3 Met)，2.41(4H，m，HOOCCH 2CH 2CO-)，2.44(2H，m，CγH2Met)，3.58(2H，m，CβH2 Ser)，4.16(1H，m，CαH Ser)，4.31(1H，m，CαH Met)，7.08和7.17(2H，2s，NH2酰胺)，7.75(1H，d，NH Ser)，8.16(1H，d，NH Met)。
【实施例15：双-(N-单琥珀酰-蛋氨酰-丝氨酸)七亚甲基二酰胺，(HOOC(CH2)2CO-Met-Ser-NH)2-(CH2)7(GSB-214)的合成】
(a)N-t-丁氧基羰基-蛋氨酰-丝氨酸酰肼，Boc-Met-Ser-N2H3的制备
将3ml肼水合物添加于在10ml甲醇中6.31g(18mol)Boc-Met-Ser-OMe(其制备公开于实施例14，部分a)的溶液并使静置过夜。当起始化合物消失(TLC控制)时，将10ml水添加于其中并使于-20℃静置。将得到的沉淀过滤出，用冷含水甲醇洗涤并干燥以产生6.31g(100％)的产物。Rf0.47(L)，Rf0.66(M)；熔点160～162℃；[α]20 D-21.75°(c＝0.4；甲醇)。
1H NMR(DMSO-d6)：1.37(9H，s，-CO-O(CH3)3)，1.80(2H，m，CβH2 Met)，2.02(3H，s，-SCH3 Met)，2.43(2H，t，CγH2 Met)，3.54(2H，m，CβH2 Ser)，4.0(1H，m，CαH Met)，4.19(1H，m，CαHSer)，4.19(2H，d，-NH-NH 2)，4.88(1H，t，-OH Ser)，7.07(1H，d，NH Met)，7.69(1H，d，NH Ser)，9.02(1H，t，-NH-NH2)。
(b)双-(N-t-丁氧基羰基-蛋氨酰-丝氨酸)七亚甲基二酰胺，(Boc-Met-Ser-NH)2-(CH2)7的制备
向冷却至-20℃的在25ml DMFA中的5.23g(14.9mmol)Boc-Met-Ser-N2H3首先添加50ml二噁烷中的HCl(～4M)然后是1.75ml(15mmol)n-丁基亚硝酸而保持温度在-20℃和-30℃之间。将反应混合物温育3min，然后添加7.7ml(45mmol)IDEA，然后是在3ml DMFA中0.91g(7mmol)七亚甲基二胺的溶液。使反应混合物于室温静置过夜，然后添加250ml乙酸乙酯和200ml水。将有机相用2％HCl(2×100ml)和100ml 3％NaHCO3洗涤并蒸发至～60ml。观察沉淀逐渐形成，当溶液冷却至-20℃时增加。将沉淀于室温过滤出，用乙酸乙酯洗涤并干燥以产生3.3g(29％)的产物。Rf0.59(L)，Rf0.77(M)；熔点160～162℃；[α]20 D-28.75°(c＝0.4；甲醇)。
1H NMR(DMSO-d6)：1.18-1.40(10H，m，-NHCH2CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2CH2NH-)，1.37(18H，s，2-CO-O(CH3)3)，1.80(4H，m，2CβH2 Met)，2.02(6H，s，2-SCH3 Met)，2.44(4H，t，2CγH2 Met)，3.02(4H，m，-NHCH 2CH2CH2CH2CH2CH2CH 2NH-)，3.53(4H，m，2CβH2 Ser)，3.99(2H，m，2CαH Met)，4.17(2H，m，2CαH Ser)，7.12(2H，d，2NH Met)，7.68(2H，d，2NH Ser)，7.71(2H，t，-NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-)。
(c)双-(N-单琥珀酰-蛋氨酰-丝氨酸)七亚甲基二酰胺，(HOOC(CH2)2CO-Met-Ser-NH)2-(CH2)7(GSB-214)的制备
将3.14g(4.1mmol)(Boc-Met-Ser-NH)2-(CH2)7溶解于20ml TFA并搅拌30min，然后蒸发。将残留物用二乙基醚研磨，滗析并取至50ml50％乙醇中。将溶液用Amberlite IRA-900树脂(OH-型)处理至pH～10并蒸发。添加DMFA后再蒸发一次。将残留物溶解于10ml DMFA并添加1g(10mmol)琥珀酸酐。将反应混合物搅拌2h并蒸发。将残留物用丙酮研磨，过滤出，用30ml乙醇煮沸(不经干燥)(不完全的溶解)并使静置于-20℃。将沉淀过滤出，用冷乙醇，醚和己烷连续洗涤并干燥以产生1.75g(100％，总收率23.4％)的产物。Rf0.0(L)，Rf0.57(M)；熔点162～163℃；[α]20 D-9.00°(c＝0.4；DMFA)。C31H54N6O12S2。
1H NMR(DMSO-d6)：1.20-1.40(10H，m，-NHCH2CH 2CH 2CH 2CH 2CH 2CH2NH-)，1.76和1.89(4H，2m，2CβHMet)，2.02(6H，s，2-SCH3 Met)，2.40(8H，m，2HOOCCH 2CH2CO-)，2.42(4H，m，2CγH2 Met)，3.01(4H，m，-NHCH 2CH2CH2CH2CH2CH2CH 2NH-)，3.55(4H，m，2CβH2 Ser)，4.17(2H，m，2CαH Ser)，4.30(2H.m，2CαH Met)，7.61(2H，t，NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-)，7.76(2H，d，2NH Ser)，8.16(2H，d，2NH Met)。
【实施例16：N-乙酰-天冬氨酰-丝氨酸酰胺，CH3CO-Asp-Ser-NH2(GBK-108)的合成】
(a)天冬氨酸β-苄基酯，H-Asp(OBzl)-OH的制备
将于室温制备的167ml苄基醇，167ml二乙基醚和16.7ml浓H2SO4的溶液通过去除二乙基醚不经加热蒸发。向此溶液于室温在剧烈搅拌下以小比例添加22.2g(166.8mmol)H-Asp-OH。将得到的悬浮液于20℃剧烈搅拌直到得到完全均质澄清的溶液，使其于室温静置2天。然后在剧烈搅拌下添加335ml乙基醇和85ml吡啶。将反应混合物于20℃搅拌1h。发生白色精细分散的沉淀的逐渐形成。使含沉淀的溶液于0℃静置1天。然后将沉淀过滤出，并用水洗涤。将得到的晶体质从335ml补充了335μl吡啶的水中再结晶。从热溶液(80～85℃)通过使其冷却至室温及静置1天进行再结晶。将得到的晶体过滤出，用丙酮洗涤并干燥以产生10.5g(28％)的白色晶体产物。Rf0.28(E)，Rf0.15(I)；熔点214～215℃。
1H NMR(DMSO-d6-CF3COOD)：2.95和2.99(2H，2d，CH2Asp)，4.24(1H，m，CH Asp)，5.14(2H，s，-CH 2C6H5)，7.35(5H，m，-CH2C6 H 5)，8.42(av.s，NH2酰胺，OH)。
(b)N-t-丁氧基羰基-天冬氨酸β-苄基酯，Boc-Asp(OBzl)-OH的制备
将25ml 1N NaOH在剧烈搅拌下添加于在75ml的二噁烷-水2∶1混合物中5.58g(25.0mmol)H-Asp(OBzl)-OH的溶液。然后将反应混合物冷却至0℃并添加6.0g(27.5mmol)Boc2O。将溶液于20℃搅拌2h，然后是在减压下去除二噁烷。向其余水溶液添加等体积的乙酸乙酯。将混合物用10％柠檬酸酸化至pH3。将水相从有机相分离并用乙酸乙酯洗涤(3×50ml)。将组合的有机层用饱和NaCl洗涤并在无水Na2SO4上干燥。将溶剂蒸发，并将得到的晶体用石油醚洗涤并干燥以产生6.84g(85％)的白色晶体产物。Rf0.88(E)，Rf0.85(I)；熔点97～98℃；[α]20 D+3.71°(c＝0.01；甲醇)。
(c)N-t-丁氧基羰基-β-苄基-天冬氨酸N-氧基琥珀酰亚胺酯，Boc-L-Asp(OBzl)-OSu的制备
将冷却至0℃的在20ml THF中的5.67g(27.5mmol)DCCD在剧烈搅拌下添加于在60ml的冷THF中8.08g(25.0mmol)Boc-Asp(OBzl)-OH和3.165g(27.5mmol)N-羟基琥珀酰亚胺的溶液。将反应混合物于0℃搅拌18h。过滤出二环己脲的白色沉淀，并真空去除溶剂。将油性残留物溶解于40ml CH2Cl2并使于0℃静置24h。将得到的晶体过滤出，并将滤出液蒸发以给出晶体(无定形-晶体)几乎定量产量的产物。Rf0.33(C)，Rf0.53(E)，Rf0.93(I)；熔点93～94℃；[α]20 D+9.29°(c＝0.01；甲醇)。
1H NMR(DMSO-d6)：1.37(9H，s，-CO-O(CH3)3)，2.79(4H，br.s，-CH 2CH 2--OSu)，2.88和3.01(2H，2d，CH2 Asp)，4.77(1H，m，CH Asp)，5.12(2H，s，-CH 2C6H5)，7.36(5H，m，-CH2C6 H 5)，7.73(1H，d，NH Asp)。
(d)N-t-丁氧基羰基-O-苄基-丝氨酸N-氧基琥珀酰亚胺酯，Boc-L-Ser(OBzl)-OSu的制备
此化合物以与Boc-L-Asp(OBzl)-OSu相同的方式制备。
(e)N-t-丁氧基羰基-O-苄基-丝氨酸酰胺，Boc-Ser(OBzl)-NH2的制备
将7.0ml浓NH4OH在剧烈搅拌下添加到冷却至0℃的在125mlDMFA中9.81g(25mmol)Boc-Ser(OBzl)-OSu的溶液。将反应混合物于0℃剧烈搅拌24h。将沉淀过滤出，并将滤出液冷却至0℃并用50～55ml 10％柠檬酸在搅拌下酸化至pH～7。将溶液在减压下蒸发至初始体积的1/5。将残留物用100ml CH2Cl2稀释并用10％NaHCO3(3×50ml)及饱和NaCl(3×50ml)洗涤。有机相在无水Na2SO4上干燥，并将溶剂蒸发。将得到的晶体质用二乙基醚和石油醚连续洗涤，并真空干燥以产生5.81g(79％)的产物。Rf0.23(C)，Rf0.91(E)，Rf0.85(I)；熔点98～99℃；[α]20 D+25.17°(c＝0.01；甲醇)。
(f)O-苄基-丝氨酸酰胺盐酸盐，H-Ser(OBzl)-NH2·HCl的制备
将二噁烷中气体HCl的溶液(～4M，50ml)添加于5.5g(18.8mmol)Boc-Ser(OBzl)-NH2。将悬浮液于20℃剧烈搅拌1.5h。将得到的晶体质过滤出并用二乙基醚，CH2Cl2和石油醚连续洗涤并真空干燥以产生3.7g(85％)的白色晶体产物。Rf0.0(C)，Rf0.46(E)，Rf0.44(I)；熔点185～186℃；[α]20 D+22.94°(c＝0.01；甲醇)。
1H NMR(DMSO-d6)：3.79(2H，d，CH2 Ser)，3.98(1H，m，CHSer)，4.48和4.55(2H，2d，-CH 2C6H5)，7.34(5H，m，-CH2C6 H 5)，7.30和7.60(2H，2s，NH2酰胺)，8.03(1H，s，HCl)，8.30(2H，s，NH2酰胺)。
(g)N-t-丁氧基羰基-β-苄基-天冬氨酰-O-苄基-丝氨酸酰胺，Boc-Asp(OBzl)-Ser(OBzl)-NH2的制备
将在10ml DMFA中的2.2ml(20.0mmol)N-甲基吗啉和在20mlDMFA中的4.2g(10.0mmol)Boc-Asp(OBzl)-OSu在冷却至5℃下添加于在30ml DMFA中1.85g(10mmol)H-Ser(OBzl)-NH2·HCl的溶液。将反应混合物于20℃搅拌48h。在减压下将溶剂蒸馏出至初始体积的1/5。将残留物用100ml乙酸乙酯稀释并在搅拌下用50ml冷10％柠檬酸酸化。将混合物剧烈搅拌15min，然后将水相从有机相分离并用50ml乙酸乙酯洗涤。将乙酸乙酯层组合，用饱和NaCl洗涤，在无水Na2SO4上干燥并蒸发。将得到的晶体取到CH2Cl2中，并用5％NaHCO3(3×50ml)及饱和NaCl连续洗涤，在无水Na2SO4上干燥，并蒸发以产生3.92g(78％)的晶体形式的产物。Rf0.09(C)，Rf0.96(E)，Rf0.93(I)；熔点114～117℃；[α]20 D+17.64°(c＝0.01；甲醇)。
1H NMR(DMSO-d6)：1.35(9H，s，-CO-O(CH3)3)，2.61和2.81(2H，2d，CH 2 Asp)，3.55和3.65(2H，2d，CH2 Ser)，4.40(4H，br.s，CH Ser，CH Asp)，4.46(2H，s，-CH 2C6H5 Ser(OBzl))，5.08(2H，s，-CH 2C6H5 Asp(OBzl))，7.27和7.43(2H，2s，NH2酰胺)，7.34和7.81(2H，各d，NH Asp，NH Ser)。
(h)β-苄基-天冬氨酰-O-苄基-丝氨酸酰胺盐酸盐，H-Asp(OBzl)-Ser(OBzl)-NH2·HCl的制备
将二噁烷中气体HCl的溶液(～4M，50ml)于20℃添加于3.5g(7.0mmol)Boc-Asp(OBzl)-Ser(OBzL)-NH2。将悬浮液于20℃剧烈搅拌1.5h，并真空去除溶剂。将无定形-晶体残留物用乙酸乙酯和石油醚连续洗涤，然后真空干燥以产生3.0g(98％)的白色晶体产物。Rf0.04(C)，Rf0.68(E)，Rf0.78(I)；熔点147～150℃；[α]20 D+17.91°(c＝0.01；甲醇)。
1H NMR(DMSO-d6)：2.91和3.07(2H，2d，CH2 Asp)，3.60和3.70(2H，2d，CH2 Ser)，4.25(1H，m，CH Asp)，4.45(1H，m，CH Ser)，7.30和7.55(2H，2s，NH2酰胺)，8.46(3H，br.s，NH3 +Asp)，8.83(1H，d，NH Ser)。
(i)乙酸N-氧基琥珀酰亚胺酯，CH3CO-OSu的制备
将2.2ml(25mmol)DCCD于5℃添加于在50ml二噁烷中1.43ml(25mmol)乙酸和2.2ml(0.25mmol)N-羟基琥珀酰亚胺的溶液。将反应混合物于20℃搅拌20h。将得到的沉淀过滤出并用干二噁烷洗涤。将滤出液组合并蒸发以产生3.65g(93％)的白色晶体产物。Rf0.41(C)，Rf0.75(I)；熔点103～105℃。
1H NMR(DMSO-d6)：2.34(3H，s，-CH3CO-)，2.80(4H，m，-CH 2CH 2-OSu)。
(j)N-乙酰-β-苄基-天冬氨酰-O-苄基-丝氨酸酰胺，CH3CO-Asp(OBzl)-Ser(OBzl)-NH2的制备
将在5ml DMFA中的1.43ml(13.0mmol)N-甲基吗啉和在15mlDMFA中的1.02g(6.5mmol)CH3CO-OSu在冷却至5℃下添加于在25ml DMFA中2.83g(6.5mmol)H-Asp(OBzl)-Ser(OBzl)-NH2·HCl的溶液。将反应混合物于20℃搅拌18h。在减压下将溶剂蒸馏出至初始体积的1/5。将残留物用100ml乙酸乙酯稀释并在搅拌下用50ml冷10％柠檬酸酸化。将混合物剧烈搅拌15min，然后将水相从有机相分离并用50ml乙酸乙酯洗涤。将乙酸乙酯层组合，用饱和NaCl洗涤，在无水Na2SO4上干燥并蒸发。将得到的晶体质用二乙基醚和石油醚连续洗涤并真空干燥以产生1.9g(66％)的产物。Rf0.0(C)，Rf0.79(E)，Rf0.81(I)；熔点158～160℃；[α]20 D-7.26°(c＝0.01；甲醇)。
1H NMR(DMSO-d6)：1.82(3H，s，CH3CO-)，2.61和2.84(2H，2d，CH2Asp)，3.58和3.66(2H，2d，CH2 Ser)，4.38(1H，m，CH Ser)，4.47(2H，s，-CH 2C6H5 Ser(OBzl))，4.73(1H，m，CH Asp)，5.09(2H，s，-CH 2C6H5 Asp(OBzl))，7.24和7.40(2H，2s，NH2酰胺)，7.26和7.47(10H，m，2-CH2C6 H 5)，8.0(1H，d，NH Ser)，8.33(1H，d，NHAsp)。
(k)N-乙酰-天冬氨酰-丝氨酸酰胺，CH3CO-Asp-Ser-NH2(GBK-108)的制备
将5ml环己烯添加于在25ml乙醇中1.77g(4.0mmol)CH3CO-Asp(OBzl)-Ser(OBzl)-NH2的溶液，然后于20℃在剧烈搅拌下添加1.0g 10％Pd/C。反应混合物加热至回流2h，然后冷却至20℃。将催化剂过滤出，并真空去除溶剂。将残留物用石油醚洗涤并真空干燥以产生993mg(95％，总收率11.4％)的产物。Rf0.0(C)，Rf0.57(E)，Rf0.24(I)；熔点168～169℃；[α]20 D-46.36°(c＝0.01；甲醇)。C9H15N3O6。
1H NMR(DMSO-d6)：1.84(3H，s，CH3CO-)，2.47和2.68(2H，2d，CH2 Asp)，3.54和3.62(2H，2d，CH2 Ser)，4.11(1H，m，CH Ser)，4.52(1H，m，CH Asp)，7.15和7.19(2H，2s，NH2酰胺)，7.82(1H，d，NH Ser)，8.25(1H，d，NH Asp)。
【实施例17：N-乙酰-天冬氨酰-甲硫氨酸酰胺，CH3CO-Asp-Met-NH2(GBK-201)的合成】
(a)N-t-丁氧基羰基-甲硫氨酸，Boc-Met-OH的制备
将在25ml水中的2.5g HaHCO3和50ml异丙醇中的14.25g(65.3mmol)Boc2O添加于在50ml 1N NaOH中7.46g(50.0mmol)H-Met-OH的溶液。将反应混合物于20℃剧烈搅拌2h，用水稀释至250ml并用石油醚洗涤。将水相用柠檬酸酸化至pH3～3.5并用乙酸乙酯洗涤(3×100ml)。将组合的有机层用饱和NaCl洗涤，在无水Na2SO4上干燥并蒸发以产生10.85g(87％)的产物。熔点135～137℃。
(b)N-t-丁氧基羰基-甲硫氨酸N-氧基琥珀酰亚胺酯，Boc-Met-OSu的制备
将冷却至0℃的在20ml THF中的5.67g(27.5mmol)DCCD在剧烈搅拌下添加于在60ml的冷THF中5.88g(25.0mmol)Boc-Met-OH和3.165g(27.5mmol)N-羟基琥珀酰亚胺的溶液。将反应混合物于0℃搅拌18h。将沉淀过滤出，并将滤出液蒸发。将油性残留物溶解于40mlCH2Cl2并使于0℃静置24h。将得到的晶体过滤出，并将滤出液蒸发以给出定量产量的晶体产物。
(c)N-t-丁氧基羰基-甲硫氨酸酰胺，Boc-Met-NH2的制备
将7.0ml浓NH4OH在剧烈搅拌下添加到冷却至0℃的在125mlDMFA中8.31g(25mmol)Boc-Met-OSu的溶液。将得到的悬浮液于0℃剧烈搅拌24h。将沉淀过滤出，并将滤出液冷却至0℃并在搅拌下用50～55ml 10％柠檬酸酸化至pH～7。将溶液在减压下蒸发至初始体积的1/5。残留物用100ml CH2Cl2稀释并用10％NaHCO3(3×50ml)及饱和NaCl(3×50ml)连续洗涤。将有机相在无水Na2SO4上干燥并蒸发。将得到的晶体质用二乙基醚和石油醚连续洗涤并真空干燥以产生4.53g(73％)的产物。Rf0.17(C)，Rf0.88(E)，Rf0.85(I)；熔点120～121℃；[α]20 D+20.16°(c＝0.01；甲醇)。
(d)甲硫氨酸酰胺盐酸盐，H-Met-NH2·HCl的制备
将二噁烷中气体HCl的溶液(～4M，50ml)添加于4.4g(17.7mmol)Boc-Met-NH2。将溶液于20℃剧烈搅拌1.5h，并真空去除溶剂。将得到的晶体残留物用二乙基醚，CH2Cl2和石油醚连续洗涤并真空干燥以产生3.2g(98％)的白色晶体产物。Rf0.0(C)，Rf0.43(E)，Rf0.22(I)；熔点193～198℃；[α]20 D+89.93°(c＝0.01；甲醇)。
(e)N-t-丁氧基羰基-β-苄基-天冬氨酰-甲硫氨酸酰胺，Boc-Asp(OBzl)-Met-NH2的制备
将在10ml DMFA中的2.2ml(20.0mmol)N-甲基吗啉和在30mlDMFA中的4.2g(10.0mmol)Boc-Asp(OBzl)-OSu添加于冷却至5℃的在30ml DMFA中1.85g(10mmol)H-Met-NH2·HCl的溶液。将反应混合物于20℃搅拌48h。将溶液在减压下浓缩至初始体积的1/5。将残留物用100ml乙酸乙酯稀释并在搅拌下用50ml冷10％柠檬酸酸化。将混合物剧烈搅拌15min，然后将水相从有机相分离并用50ml乙酸乙酯洗涤。将乙酸乙酯层组合，用饱和NaCl洗涤，在无水Na2SO4上干燥并蒸发。将得到的晶体取到CH2Cl2中，并用5％NaHCO3(3×50ml)及饱和NaCl连续洗涤，在无水Na2SO4上干燥，并蒸发以产生3.32g(73％)的产物。Rf0.17(C)，Rf0.94(E)，Rf0.87(I)；熔点132～134℃；[α]20 D-28.26°(c＝0.01；甲醇)。
(f)β-苄基-天冬氨酰-甲硫氨酸酰胺盐酸盐，H-Asp(OBzl)-Met-NH2·HCl的制备
将二噁烷中气体HCl的溶液(～4M，50ml)于20℃添加于3.15g(7.0mmol)Boc-Asp(OBzl)-Met-NH2。将反应混合物于20℃剧烈搅拌1.5h并蒸发。将无定形-晶体残留物用乙酸乙酯和石油醚连续洗涤并真空干燥以产生2.65g(97％)的白色晶体产物。Rf0.04(C)，Rf0.68(E)，Rf0.74(I)；[α]20 D+4.8°(c＝0.01；甲醇)。
(g)N-乙酰-β-苄基-天冬氨酰-甲硫氨酸酰胺，CH3CO-Asp(OBzl)-Met-NH2的制备
将在5ml DMFA中的1.43ml(13.0mmol)N-甲基吗啉和在15mlDMFA中的1.02g(6.5mmol)CH3CO-OSu(其合成描述于实施例16，部分i)添加于冷却至5℃的在25ml DMFA中2.54g(6.5mmol)H-Asp(OBzl)-Ser(OBzl)-NH2·HCl的溶液。将反应混合物于20℃搅拌18h。将溶液在减压下浓缩至初始体积的1/5。将残留物用100ml乙酸乙酯稀释并用50ml冷10％柠檬酸酸化。将混合物剧烈搅拌15min，然后将水相从有机相分离并用50ml乙酸乙酯洗涤。将有机层组合，用饱和NaCl洗涤，在无水Na2SO4上干燥并蒸发。将得到的晶体质用二乙基醚和石油醚连续洗涤并真空干燥以产生1.25g(49％)的产物。Rf0.02(C)，Rf0.80(E)，Rf0.86(I)；熔点142～144℃；[α]20 D-16.39°(c＝0.01；甲醇)。
(h)N-乙酰-天冬氨酰-甲硫氨酸酰胺，CH3CO-Asp-Met-NH2(GBK-201)的制备
30mg 10％Pd/C添加于在30ml甲醇中30mg(0.0759mmol)CH3CO-Asp(OBzl)-Met-NH2的溶液并在氢下恒定添加新部分的催化剂(每天各3～4次10～30mg)搅拌7天。当反应完全(TLC控制)时，将催化剂过滤出，并将溶剂蒸发以产生24mg(87％，总收率18.8％)的作为晶体固体的产物。Rf0.53(E)。C11H19N3O5S。
1H NMR(DMSO-d6)：1.52和1.67(2H，2m，CβH2 Met)，1.83(3H，s，CH3CO-)，1.83(3H，s，-SCH3 Met)，2.33(2H，m，CγH2 Met)，2.58和2.76(2H，2m，CH2 Asp)，4.06(1H，m，CαH Met)，4.8(1H，m，CH Asp)，7.08和7.29(2H，2s，NH2酰胺)，7.80(1H，d，NH Met)，8.29(1H，d，NH Asp)。
【实施例18：双-(N-单琥珀酰-甘氨酰-赖氨酸)六亚甲基二酰胺，(HOOC(CH2)2CO-Gly-Lys-NH)2-(CH2)6(GK-2w)的合成】
(a)N-苄氧基羰基-Nε-t-丁氧基羰基-赖氨酸二环己基铵盐，Z-Lys(Boc)-OH·DCHA的制备
向在1000ml水中182.6g(1mol)赖氨酸盐酸盐的溶液在搅拌下首先添加溶解于600ml热水的137.3g(0.55mol)CuSO4·5H2O，然后是浓NaOH至pH～9，然后添加溶解于小体积的异丙醇的229g(1.05mol)Boc2O。将反应混合物于33～35℃搅拌12h而用NaOH保持pH在～9。当起始化合物消失(TLC控制)时，于40～50℃添加206g EDTA作为用NaOH调至pH～10的含水悬浮液。将反应混合物冷却至室温，并滴加溶解于小体积的水的133g(0.7mol)Z-Cl。当H-Lys(Boc)-OH消失(TLC控制)时，将1500ml乙酸乙酯添加于反应混合物并用浓HCl酸化至pH～3，及过滤出CuSO4。将有机层用水洗涤并蒸发。残留物取至1800ml二乙基醚中并添加0.9mol DCHA而以二环己基铵盐形式结晶化产物以产生294.5g(0.525mol，52.5％)的白色晶体产物。产物不经表征而用于下一步骤。
(b)N-苄氧基羰基-Nε-t-丁氧基羰基-赖氨酸N-氧基琥珀酰亚胺酯，Z-Lys(Boc)-OSu的制备
将在500ml乙酸乙酯中294g(0.525mol)Z-Lys(Boc)-OH·DCHA的溶液与0.6mol H2SO4(5％溶液)搅拌30min，然后分离有机层并将乙酸乙酯蒸发。将残留物溶解于1000ml乙酸乙酯并添加65.5g(0.57mol)HOSu和185g(0.9mol)DCCD。将反应混合物于室温搅拌12h。当起始化合物消失(TLC控制)时，过滤出沉淀的二环己脲，并真空去除溶剂。将得到的油从150ml异丙醇和1.5l二乙基醚(1∶10)的混合物再结晶以产生225.7g(0.473mol，90％)的白色晶体固体的产物。Rf0.90(A)，Rf0.83(B)；熔点118～122℃；[α]25 D-20.66°(c＝0.41；乙醇)。
1H NMR(DMSO-d6)：1.18-1.92(6H，m，CβH2CγH2CδH2 Lys)，1.35(9H，s，-C(CH 3)3Boc)，2.79(4H，m，-CH2-CH2-Su)，2.85-3.04(2H，m，CεH2 Lys)，4.39(1H，m，CαH Lys)，5.05(2H，s，OCH2 Z)，6.78(1H，t，NεH Lys)，7.34(5H，m，C6H5 Z)，7.97-8.12(1H，d，NαHLys)。
(c)双-(N-苄氧基羰基-Nε-t-丁氧基羰基-赖氨酰)六亚甲基二酰胺，(Z-Lys(Boc)-NH)2-(CH2)6的制备
将在14ml二甲基甲酰胺中2.575g(5.4mmol)Z-Lys(Boc)-OSu和0.299g(2.6mmol)六亚甲基二胺的溶液于室温搅拌4h，形成混浊溶液。反应混合物用56ml水稀释并使静置几小时。将固化的沉淀过滤出，用水洗涤和在P2O5上干燥以产生2.085g(96％)的白色晶体产物。Rf0.90(A)，Rf0.93(B)；熔点138～147℃；[α]25 D-9.31°(c＝0.29；乙醇)。
1H NMR(DMSO-d6)：1.05-1.69(12H，m，2CβH2，2CγH2，2CδH2Lys；8H，m，-NHCH2CH 2CH 2CH 2CH 2CH2NH-)，1.35(18H，s，2-C(CH 3)3Boc)，2.87(4H，m，2CεH2 Lys)，3.01(4H，m，-NHCH 2CH2CH2CH2CH2CH 2NH-)，3.89(2H，m，2CαH Lys)，5.01(4H，s，2OCH2 Z)，6.74(2H，t，NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-)，7.13-7.39(10H，m，2C6H5 Z；2H，d，2NαH Lys)，7.81(2H，t，2NεHLys)。
(d)双-(Nε-t-丁氧基羰基-赖氨酰)六亚甲基二酰胺，(H-Lys(Boc)-NH)2-(CH2)6的制备
将在25ml甲醇中的1.86g(2.2mmol)(Z-Lys(Boc)-NH)2-(CH2)6使用10％Pd/C(0.37g)于室温氢化1h 25min。当起始化合物消失(TLC控制)时，将催化剂过滤出，并真空去除溶剂。将得到的油在CaCl2和石蜡上干燥。将其用石油醚和二乙基醚的混合物(3∶1)沉淀并过滤出以产生0.99g(78％)的作为白色粉末的产物。Rf0.48(A)，Rf0.68(B)；熔点70～75℃；[α]25 D+5.1°(c＝1；乙醇)。
1H NMR(DMSO-d6)：1.11-1.65(12H，m，2CβH2，2CγH2，2CδH2Lys；8H，m，-NHCH2CH 2CH 2CH 2CH 2CH2NH-；18H，s，2-C(CH 3)3Boc)，2.86(4H，m，2CεH2 Lys)，3.04(4H，m，-NHCH 2CH2CH2CH2CH2CH 2NH-)，3.40(2H，m，2CαH Lys)，6.73(2H，t，2NεH Lys)，7.78(2H，t，-NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-)。
(e)N-苄氧基羰基-甘氨酸N-氧基琥珀酰亚胺酯，Z-Gly-OSu的制备
将3.22g(28mmol)HOSu和6.36g(28mmol)DCCD添加于在80ml乙酸乙酯中5.28g(28mmol)Z-Gly-OH的溶液。将反应混合物于10℃搅拌2h。当起始化合物消失(TLC控制)时，过滤出沉淀的二环己脲，并真空去除溶剂。将得到的油从3ml石油醚和8ml氯仿的混合物再结晶以产生5.87g(80％)的白色晶体固体的产物。
(f)双-(N-苄氧基羰基-甘氨酰-Nε-t-丁氧基羰基-赖氨酸六亚甲基二酰胺，(Z-Gly-Lys(Boc)-NH)2-(CH2)6的制备
将溶解于4ml DMFA的1.103g(3.8mmol)Z-Gly-OSu滴加到在6ml DMFA中0.90g(1.6mmol)(H-Lys(Boc)-NH)2-(CH2)6的溶液及于室温搅拌2h 10min(TLC控制)。将1.5ml二乙基丙基二胺添加于反应混合物，并再搅拌30min然后用70ml水稀释。将含有机杂质的产物提取到氯仿中(3∶1)并用25ml水，25ml 2％H2SO4，及25ml 3％Na2CO3连续洗涤。将溶液在MgSO4上干燥并过滤。将氯仿蒸发产生具有白色晶体的黄色油混合物。将其从二乙基醚再结晶(20ml)以产生1.26g(84％)的作为白色粉末的产物。Rf0.89(A)，Rf0.95(B)；熔点120～126℃；[α]25 D-11.0°(c＝0.1；乙醇)。
1H NMR(DMSO-d6)：1.05-1.70(12H，m，2CβH2，2CγH2，2CδH2Lys；8H，m，-NHCH2CH 2CH 2CH 2CH 2CH2NH-)，1.35(18H，s，2-C(CH 3)3 Boc)，2.85(4H，m，2CεH2 Lys)，3.00(4H，m，-NHCH 2CH2CH2CH2CH2CH 2NH-)，3.65(4H，d，2CH2 Gly)，4.15(2H，m，2CαH Lys)，5.03(4H，s，2OCH2 Z)，7.25(2H，t，-NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-)，7.14-7.37(10H，m，2C6H5 Z；2NαH Lys)，7.81(2H，t，2NεH Lys)。
(g)双-(甘氨酰-Nε-t-丁氧基羰基-赖氨酸)六亚甲基二酰胺，(H-Gly-Lys(Boc)-NH)2-(CH2)6的制备
将在20ml甲醇中的1.17g(1.2mmol)(Z-Gly-Lys(Boc)-NH)2-(CH2)6使用10％Pd/C(0.23g)于室温氢化20min。当起始化合物消失(TLC控制)时，将催化剂过滤出，并真空去除溶剂。将得到的油用二乙基醚(20ml)沉淀并过滤出。将作为白色粉末的产物不经进一步纯化而用于下一步骤。
(h)双-(N-单琥珀酰-甘氨酰-Nε-t-丁氧基羰基-赖氨酸)六亚甲基二酰胺，(HOOC(CH2)2CO-Gly-Lys(Boc)-NH)2-(CH2)6的制备
将0.24g(2.4mmol)琥珀酸酐添加于在5ml DMFA中(H-Gly-Lys(Boc)-NH)2-(CH2)6的溶液。将反应混合物于室温搅拌4h直到反应完全(TLC控制)。然后反应混合物用20ml乙酸乙酯和15ml水稀释。将5ml 3％Na2CO3添加于DMFA/水级分和用1.5g Na2SO4饱和，然后添加15ml丁醇和10％H2SO4至pH～3。将溶液用10％Na2SO4洗涤，并将溶剂蒸发完全。将残留物用二乙基醚研磨并过滤出以产生0.872g(82％)的作为白色粉末的产物.Rf0.80(A)，Rf0.67(B)；熔点86～92℃；[α]25 D-10.4°(c＝1；乙醇)。
1H NMR(DMSO-d6)：1.11-1.75(12H，m，2CβH2，2CγH2，2CδH2Lys；8H，m，-NHCH2CH 2CH 2CH 2CH 2CH2NH-；1.35(18H，s，2-C(CH 3)3Boc)，2.36(4H，m，2CH2 Suc)，2.72(4H，m，2CεH2 Lys)，2.96(4H，m，-NHCH 2CH2CH2CH2CH2CH 2NH-)，3.65(4H，s，2CH2 Gly)，4.10(2H，m，2CαH Lys)，6.71(2H，t，-NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-)，7.83(2H，t，2NεH Lys)，8.13(2H，d，2NαH Lys)，8.87(2H，t，2NH Gly)。2HOOC(CH2)2CO-可与HDO交换。
(i)双-(N-单琥珀酰-甘氨酰-赖氨酸)六亚甲基二酰胺，(HOOC(CH2)2CO-Gly-Lys-NH)2-(CH2)6的制备
将全部(HOOC(CH2)2CO-Gly-Lys(Boc)-NH)2-(CH2)6溶解于乙酸，并用3ml 4M HCl/二噁烷处理40min。然后将溶剂滗析，并将残留物通过倾析用二乙基醚洗涤，溶解于5ml水，并用AmberliteIRA-410树脂在搅拌下处理直到pH是～5。通过C8逆相HPLC使用0.1M乙酸中的0～13％异丙醇梯度进行纯化。收集相关级分(TLC控制)，蒸发并真空干燥。将残留物在液氮中冷冻干燥，并从乙酸乙酯-乙醇3∶1混合物再结晶以产生0.515g(总收率29％)的白色粉末的最终产物.Rf0.14(A)，Rf0.38(B)；熔点97～100℃；[α]25 D-15.7°(c＝1；水)。
1H NMR(DMSO-d6)：1.06-1.85(12H，m，2CβH2，2CγH2，2CδH2Lys；8H，m，-NHCH2CH 2CH 2CH 2CH 2CH2NH-；1.35(18H，s，2-C(CH 3)3Boc)，2.26(4H，m，2CH2 Suc)，2.84(4H，m，2CεH2 Lys)，3.05(4H，m，-NHCH 2CH2CH2CH2CH2CH 2NH-)，3.69(4H，s，2CH2 Gly)，4.10(2H，m，2CαH Lys)，7.65(2H，t，-NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-)，8.34(2H，d，2NαH Lys)，8.64(2H，t，2NεH Gly)。2HOOC(CH2)2CO-可与HDO交换。
【I.要求保护的化合物的体外生物学表征】
【材料和方法】
【材料】
培养瓶，管，微平板来自或者Corning或Costar。DMEM生长培养基，汉克斯培养基，胚胎小牛血清(FBS)，磷酸缓冲盐水(PBS)，聚-L-赖氨酸，3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-四唑鎓氢溴酸盐(MTT)，二甲基亚砜(DMSO)来自ICN。来自小鼠下颌下腺的130kDa神经生长因子(NGF-7s)来自Sigma。Tris-HCl来自Serva，而二硫苏糖醇，十二烷基硫酸钠(SDS)，Tween-20，TEMED，丙烯酰胺，亚甲基双-丙烯酰胺全部来自BioRad。蛋白酶抑制剂混合物来自Biomol，Folin试剂来自Merck，1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(MPTP)来自Sigma，电化学发光试剂ECL来自Santa Cruz生物技术。
第一山羊多克隆抗-大鼠Hsp32(血加氧酶-1)抗体M-19和小鼠单克隆抗-HeLa细胞-来源的Hsp70抗体W27来自Stressgen。第一小鼠单克隆抗-大鼠磷酸化的酪氨酸激酶A(pTrkA)抗体E6，第二辣根过氧化物酶缀合的山羊单克隆抗-小鼠抗体，及第二辣根过氧化物酶缀合的山羊多克隆抗-兔抗体全部来自Santa Cruz生物技术。电泳Mini-Protean 2细胞设备和半-干蛋白转移到PVDF膜设备来自BioRad。
【方法】
【培养的细胞】
【PC12和HT-22细胞培养】
大鼠肾上腺皮质嗜铬细胞瘤细胞系PC12从Cell Culture Museum，RAN Institute of Molecular Genetics获得。永生化的小鼠海马细胞系HT-22由Prof.F.Viegant，Utrecht University，the Netherlands捐赠。
细胞在含5％FBS和2mM L-谷氨酰胺的DMEM培养基中生长。细胞于37℃和5％CO2温育。生长培养基在接种后24小时时更换，然后每3天更换。细胞每周再平铺到有75cm2总面积的培养瓶中。
【来自大鼠胚胎的中脑及海马神经元的分离和生长】
将来自MR(Maudsley反应性)大鼠的18日龄胚胎用于实验。脑的解剖和中脑及海马神经元的切除是在汉克斯培养基中进行。然后将分离的神经元转移到含DMEM/F-12培养基的离心管，重悬浮和于1500rpm离心10min。倒出上清，添加2ml DMEM/F-12及使用相同的条件再离心。再重复一次培养基更换的过程，将细胞重悬浮，计数及以350～400千细胞每孔的密度再平铺于48-孔培养板。
【培养板的制备】
实验采用96-，48-及6-孔培养板。将孔用无菌去离子水(μQ，Millipore)中的聚-L-赖氨酸(0.1mg/ml)处理30min，然后是用无菌水(3×)洗涤并于室温在层流盒中干燥。
【用于实验的细胞平铺】
将PC12和HT-22细胞以3.5×103每孔的密度接种于96-孔板，且以500×103每孔的密度接种于6-孔板。将中脑及海马神经元以350×103细胞每孔的密度接种于48-孔培养板。全部类型的细胞平铺于DMEM培养基。对于PC12和HT-22细胞系，添加5％FBS，及对于胚胎神经元培养物，添加10％FBS。实验采用了在传代后3天的细胞系和在传代后6天的胚胎神经元细胞。使细胞生长至汇合，以形成单层细胞。
【用于实验的分化的PC12细胞的产生】
将细胞以3.5×103每孔的密度平铺于含5％FBS的DMEM中。在平铺时和此后每48小时添加NGF(100ng/ml)。使用分化的PC12细胞的全部实验在生长的第6天进行。
【NGF的低分子量肽模拟物诱导PC12细胞分化的能力的研究】
将未分化的PC12细胞以3.5×103每孔的密度平铺于含1％FBS的DMEM。在平铺时，将或者NGF(100ng/ml，阳性对照)或测试化合物添加到生长培养基中至终浓度10-5～10-9M。然后，将测试肽和NGF在一系列实验中每24小时添加于培养基和在另一系列中每48小时添加于培养基，总6天。基于细胞的形状和尺寸和过程的数和长度估计细胞分化的程度。
【氧化应激模型】
为了诱导氧化应激，将细胞放入含5％FBS的生长培养基，然后添加新鲜制备的H2O2溶液至1.5mM的终浓度并于37℃和5％CO2温育30min。然后，用新培养基更换培养基，及在相同的条件下将细胞培养4h。
【使用PC12细胞系的帕金森病模型】
为了产生帕金森病的模型，以1mM的终浓度使用MPTP(Shimoke K.，Chiba H.Nerve growth factor prevents1-methyl-1，4-phenyl-1，2，3，6-tetrahydropyridine-induced cell death viathe Akt pathway by suppressing caspase-3-like activity using PC12cells：relevance to therapeutic application for Parkinson′s disease.J.Neurosci.Res.2001，63，402-409)。在传代后24小时将MPTP添加于含1％FBS的细胞生长培养基。将肽与MPTP同时或在MPTP之前24h添加于细胞生长培养基。在使用MTT测试24h时测定细胞活力。
【培养的细胞活力的确定】
细胞活力的确定通过MTT测试进行。MTT是容易渗透细胞的黄色水溶性四唑鎓盐。在活的细胞中，MTT转变为紫色的水不溶性甲
Figure BPA00001444239500681
晶体。在实验末，将生长培养基用MTT溶液(0.5mg/ml)取代，并于37℃和5％CO2温育30min。然后将MTT溶液从孔去除并添加DMSO，以溶解甲
Figure BPA00001444239500682
沉淀。然后使用Multiscan(Thermo)分光光度计在600nm波长处测量光密度。
【蛋白印迹过程】
在HT-22神经元细胞的细胞质级分中测定Hsp70，Hsp32和pTrkA的量。对于热休克蛋白，将测试化合物在测试之前24小时添加于培养物中，之后用PBS将细胞洗涤出培养液体。对于pTrkA，细胞裂解1或2min之前立即将测试化合物添加于培养物中，之后用PBS将细胞洗涤出培养液体。然后将细胞于4℃与裂解缓冲液(50mMTris-HCl，5mM EDTA，1mM DTT，1％Triton X-100，pH7.5)混合和裂解5min，然后刮下，转移到1.5ml离心管和以13000rpm和4℃离心10min。通过电泳及免疫印迹测定含细胞溶质蛋白的上清。将蛋白在10％聚丙烯酰胺凝胶(PAAG)上分离和通过电洗脱45min从PAAG转移到PVDF膜。将蛋白印迹在含1％Tween-20和补充了5％(w/v)脱脂乳的TBST溶液中预温育1h。然后将蛋白印迹与1∶1000稀释的第一多克隆抗-Hsp32抗体或1∶1000稀释的第一单克隆抗-Hsp70抗体或1∶1000稀释的第一单克隆抗-磷酸化的酪氨酸激酶A抗体温育1小时。然后洗涤印迹并与缀合到辣根过氧化物酶的第二抗体(1∶2000稀释的)温育1小时。Hsp70，Hsp32和pTrkA的检测通过ECL反应在Kodak膜上进行。
根据Student氏t检验进行统计学数据处理。
【结果】
【1.分化-诱导活性】
【1.1.NGF模拟物GK-1～GK-5对PC12细胞系的分化的效应】
当补充了神经生长因子时，PC-12细胞能分化成神经元类型，这是它们用于设计为评估各药物的分化-诱导活性的研究的背后的原因。
添加肽GK-1～GK-5至在生长培养基中10-8～10-5M的终浓度。以100ng/ml的终浓度使用NGF作为阳性对照。
肽NGF-模拟物GK-1～GK-4发现以任何浓度测试不诱导PC-12细胞的分化。但是，10-5M的GK-1降低了NGF的分化-促进效应50％(通过计数分化的和未分化的细胞数得到此结果)。GK-5以10-6M和10-5M显示分化-促进效应。
为了研究肽GK-3，GK-4和GK-5对NGF的效应的调节潜力，将肽以10-6M GK-3，10-7M GK-4，及10-6M GK-5的终浓度应用。这些研究的浓度的肽通过NGF对分化诱导产生调节作用。通过测量GK-3和NGF组合之后的最长过程和它们的分支点，发现这些值是不显著不同于用NGF单独发现的那些。但是，这些处理的分支点位于相比仅含NGF的样品更远离细胞体得多(分别25μm和14μm)，提示增加的神经元再生能力。实验开始后4天时观察GK-3的效应。
在GK-3和NGF存在下源于PC12的细胞群形态提示，此肽可对外周神经系统的神经元，尤其是，对副交感神经及交感神经神经节以及对脊髓感觉神经节具有有益效应。因此，此肽可在内脏神经支配损伤的情况中有效。
通过测量GK-4和NGF的组合之后最长过程和它们的分支点，发现过程相比在NGF单独存在下更长(分别65μm和36μm)。这些过程的分支点相比NGF单独更近定位于细胞体(分别20μm和31μm)。GK-4和NGF组合之后，可在分化的细胞群中挑出主要3种形态学组神经元：单极(三叉神经感觉核)，假-单极(集中于椎间神经节中脊髓)(10％)，及中间(90％)。中枢神经系统是90％由在处理和传输神经冲动中发挥作用的中间神经元组成。一个或多个中间神经元可存在于传入(从感觉器官到神经系统的中心部分)及传出神经元(冲动到器官，例如运动神经元)之间。它们的数在中脑及后脑网状形成和基础神经节中尤其大。因此，此肽可在神经退行性过程(例如在缺血性和出血性中风)的过程中运动功能损伤的情况中有用。而且，仍有一些未分化的细胞。发现GK-4的效应出现相比GK-3晚得多。此是在所谓的“胚性补偿模型”中中间神经元发育的特征。
通过测量GK-5和NGF组合之后的最长过程和它们的分支点，发现分支点并非不同于见于NGF单独存在的那些，但过程的最大长度更大(分别55μm和37μm)。因此，此肽可在内脏神经支配损伤的情况中有效。
【表1.1.GK-4和GK-5对PC12细胞中NGF的分化-诱导活性的效应】
Figure BPA00001444239500711
*根据Student氏t检验，p＜0.05对比对照
【2.神经保护活性】
【2.1.神经营养素模拟物对HT-22神经元细胞系的活力的效应】
在平铺时和此后每24小时添加从10-8到10-5M的浓度的GK-2以及100ng/ml的浓度的NGF总10天发现，在任何损伤因素缺失下改善神经元的活力(表1.2)。
【表1.2】
  组(n＝12)   光学密度
  对照   0.283±0.039
  NGF，100ng/ml   0.345±0.023*
  GK-2，10-5M   0.357±0.051*
  GK-2，10-8M   0.375±0.063*
*根据Student氏t检验，p＜0.05对比对照
NGF模拟物GK-2c降低了HT-22细胞的活力(图1.1)。
【2.2.在氧化应激条件下使用培养的HT-22细胞系的NGF和BDNF模拟物的神经保护效应的表征】
要求保护的化合物在氧化应激条件下影响海马细胞的活力(表1.3～1.8，图1～5)。由此，当在应激暴露之前24小时以10-8M～10-5M的浓度范围添加时，肽GK-1和GSB-104损伤神经元存活，然而肽GK-2，GK-2a，GK-2b，GK-2e，GK-2f，GK-3，GK-4，GK-5，GK-6，GSB-106，GSB-104，GBK-108改善神经元存活。
【表1.3】
  组(n＝12)   光学密度
  对照   0.615±0.073
  H2O2，1.5mM   0.448±0.038*
  GK-2，10-5M   0.346±0.029^
  GK-2，10-8M   0.429±0.060
  NGF，100ng/ml   0.449±0.064
*p＜0.05对比对照，^p＜0.05对比H2O2
【表1.4】
  组(n＝12)   光学密度
  对照   0.427±0.071
  H2O2，1.5mM   0.350±0.052
  GK-2，10-5M   0.422±0.063^
  GK-2，10-8M   0.501±0.109^
  GK-2，10-9M   0.516±0.068^
^p＜0.05对比H2O2
【表1.5】
  组(n＝12)   光学密度
  对照   0.1275±0.021
  H2O2，1.5mM   0.087±0.006*
  GK-2a，10-5M   0.108±0.019^
  GK-2a，10-6M   0.429±0.02
  GK-2a，10-7M   0.449±0.024
  GK-2a，10-8M   0.106±0.028
*p＜0.05对比对照，^p＜0.05对比H2O2
【表1.6】
  组(n＝12)   光学密度
  对照   0.111±0.009
  H2O2，1.5mM   0.093±0.004*
  NGF，100ng/ml   0.103±0.018
  GK-3，10-5M   0.109±0.019
  GK-3，10-6M   0.110±0.014^
  GK-3，10-7M   0.099±0.014
  GK-3，10-8M   0.091±0.014
*p＜0.05对比对照，^p＜0.05对比H2O2
【表1.7】
  组(n＝12)   光学密度
  对照   0.123±0.013
  H2O2，1.5mM   0.097±0.017*
  NGF，100ng/ml   0.103±0.018
  GK-4，10-5M   0.104±0.015
  GK-4，10-6M   0.101±0.009
  GK-4，10-7M   0.109±0.014^
  GK-4，10-8M   0.104±0.016
*p＜0.05对比对照，^p＜0.05对比H2O2
【表1.8】
  组(n＝12)   光学密度
  对照   0.097±0.009
  H2O2，1.5mM   0.056±0.009*
  NGF，100ng/ml   0.071±0.009^
  GK-5，10-5M   0.065±0.008
  GK-5，10-6M   0.066±0.008^
  GK-5，10-7M   0.062±0.009
  GK-5，10-8M   0.058±0.007
*p＜0.05对比对照，^p＜0.05对比H2O2
在氧化应激暴露后立即添加肽GK-2时进行实验(表1.9)。GK-2以10-8M和10-5M之间的浓度展示了治疗效果。
【表1.9.不同的浓度的氧化应激后添加的GK-2对培养的HT-22细胞的存活的效应】
  组(n＝12)   光学密度
  对照   0.344±0.104
  H2O2，1.5mM   0.247±0.015*
  GK-2，10-5M   0.324±0.070^
  GK-2，10-8M   0.345±0.065^
*p＜0.05对比对照，^p＜0.05对比H2O2
当GK-2，GK-1(10-5M)之前30分钟时添加时消除了GK-2的神经保护效应。
【2.3.在氧化应激条件下使用培养的来自18日龄的大鼠胚胎的中脑及海马神经元的GK-2的神经保护效应的评估】
当应激暴露之前24小时时添加时，在氧化应激模型中，以10-5M的浓度，GK-2在来自18日龄的大鼠胚胎的中脑及海马神经元的原代培养中活跃(表1.10，1.11)。
【表1.10.氧化应激后肽GK-2对来自18日龄的大鼠胚胎的培养的中脑神经元的存活的效应】
  组(n＝12)   光学密度
  对照   0.497±0.006
  H2O2，1.5mM   0.475±0.007*
  GK-2，10-5M   0.493±0.005^
  GK-2，10-8M   0.498±0.014
*p＜0.05对比对照，^p＜0.05对比H2O2
【表1.11.氧化应激后肽GK-2对来自18日龄的大鼠胚胎的培养的海马神经元的存活的效应】
  组(n＝12)   光学密度
  对照   0.490±0.004
  H2O2，1.5mM   0.480±0.007
  GK-2，10-5M   0.515±0.006^
  GK-2，10-8M   0.503±0.005
^p＜0.05对比H2O2
得到的结果显示，肽GK-2具有关于胚胎海马及中脑神经元的神经保护效应。
【2.4.在帕金森病的细胞模型中GK-2，GK-2a，GK-3，GK-4和GK-5的活性】
GK-2在帕金森病的细胞模型中具有显著的保护效应。此效应仅当GK-2与MPTP同时添加时以10-5M显示，但是，当在MPTP之前24小时时添加时，其以10-5M和10-8M活跃(图1.9，1.10)。肽GK-2a，GK-3和GK-4，当MPTP之前24小时时添加时，也在此帕金森病模型中具有保护效应(图1.11)。肽GK-5在此测试中无活性。
【2.5.要求保护的化合物针对培养的HT-22细胞中的谷氨酸盐细胞毒性的保护效应】
当谷氨酸盐之前24小时时添加时，肽GK-2，GK-4和GSB-106展示了针对培养的HT-22细胞中的谷氨酸盐细胞毒性的保护效应(图1.12，表1.12)。BDNF模拟物GSB-106在10-8M～10-5M的浓度范围活跃，随着降低浓度，其效应增加。
【表1.2】
 组(n＝12)   光学密度
 对照   0.178±0.010
 谷氨酸盐   0.145±0.013*
 GK-2，10-8M   0.179±0.007^
 GK-4，10-7M   0.163±0.008^
*p＜0.05对比对照，^p＜0.05对比谷氨酸盐
【3.GK-1，GK-2，GK-3，GK-4和GK-5对培养的HT-22细胞中热休克蛋白的效应】
熟知NGF可活化热休克蛋白Hsp32和Hsp70的合成(Liu，H.，Nowak，R.，Cao，W.，Bloch，K.D.Nerve growth factor inducesanti-apoptotic heme oxygenase-1in rat pheochromocytoma PC 12cells.J.Neurochem.2003，86，1553-1563；Pollack，S.J.and Harper，S.J.Small molecule Trk receptor agonists and other neurotrophic factormimetics：Current drug targets.CNS and Neurological Disorders2002，1，59-80)，其显示神经保护效应。
如对将肽添加于HT-22海马神经元细胞的培养物后24小时获取的样品的蛋白印迹分析所示，GK-1以10-8M和10-5M的浓度对这些蛋白的量无效应。GK-2以10-8M和10-5M的浓度诱导Hsp70和Hsp32蛋白水平的增加(图1.13，1.14)。当GK-2之前30分钟时添加GK-1(10-5M)时，未观察到Hsp32和Hsp70的量的增加(图1.13，1.14)。10-6M的GK-3导致Hsp32的小的增加，但对Hsp70无效应(图1.15，1.16)。GK-4(10-7M)的应用导致Hsp70的合成的显著的增加及对Hsp32无效应(图1.15，1.16)。相反，GK-5(10-6M)导致Hsp32的合成的增加及对Hsp70无效应(图1.15，1.16)。
由此，呈现要求保护的化合物的保护效应与热休克蛋白的合成相关。
【4.所述肽对培养的HT-22细胞中酪氨酸激酶A磷酸化的效应】
相对于NGF的GK-1，GK-2，GK-3，GK-4和GK-5对酪氨酸激酶A磷酸化的效应的蛋白印迹分析结果提示，NGF单独在暴露于HT-22细胞第1分钟期间不显著影响酪氨酸激酶A磷酸化。在相同的时间，二肽GK-2，GK-3，GK-4和GK-5完全在第1分钟期间增加了磷酸化的酪氨酸激酶A水平(图1.17，1.18，1.19)。相反，肽GK-1在第1分钟期间降低了TrkA磷酸化(图1.19)。此在体外测试中与其对比NGF的拮抗剂活性一致(降低细胞活力和抑制NGF的分化-诱导活性)。其他肽显示激动剂活性。
在暴露的第2分钟期间，NGF展示了酪氨酸激酶A磷酸化的增加。而且GK-2的效应甚至相比第1分钟更显著(图1.20)。
由此，肽GK-1～GK-5呈现为是TrkA受体的配体。
对要求保护的化合物的体外活性的实验发现的分析使得出以下结论：
NGF和BDNF的环4和环1模拟物可影响神经元的存活。由此，单体环4模拟物被发现降低在有害条件(例如氧化应激，谷氨酸盐兴奋性中毒及MPTP的神经毒性作用)下的神经元活力和存活。但是，此环的二聚体类似物显示神经保护活性。此活性依赖于模拟物的二肽段之间的间隔物长度。
在NGF环1模拟物的情况中，单体和二聚体类似物二者展示神经保护活性。除了神经保护活性之外，这些模拟物显示分化-诱导活性或是调节NGF的分化-诱导活性。具有神经退行性作用的单体环4模拟物能抑制NGF的分化-诱导效应。
具有神经保护活性的全部神经营养素模拟物以及NGF本身可依赖于它们的结构增加热休克蛋白Hsp32和/或Hsp70的合成，且也增加TrkA的磷酸化的形式的量。这表明要求保护的化合物的确是经酪氨酸激酶受体作用的神经营养素模拟物。
【II.要求保护的化合物的体内生物学表征】
具有在体外实验中鉴定的神经保护活性的要求保护的化合物也在神经退行性疾病(例如中风，脑缺血，帕金森病，阿尔茨海默病)的动物模型中表征。对于使用动物模型的实验，关于其神经保护效应选择最活跃的化合物，即GK-2，二聚体NGF环4模拟。
在用于鉴定抗抑郁药活性的典型动物模型中表征BDNF模拟物。
【1.抗-中风活性】
【1.1.在通过中脑动脉分支单侧血管内阻塞诱导的缺血性损伤模型中的GK-2活性】
将具有270g的平均重量的雄性远亲杂交种大鼠用于此研究。
将实验动物分入以下组：SO，假-操作的；IS，具有缺血性脑梗塞的大鼠；及IST，在缺血后1h，24h和48h用生理盐水中的GK-2腹膜内以1mg药物/1kg体重处理的动物(总3次注射)。其他组在相同的时间点用相当的体积的无药物盐水处理。
手术之前，用氯醛水合物麻醉动物(300mg/kg i.p.)。通过插入硅-包被的(Shimamura N，Matchett G，Tsubokawa T，Ohkuma H，Zhang J.Comparison of silicon-coated nylon suture to plain nylonsuture in the rat middle cerebral artery occlusion model.J.Neurosci.Meth.2006，156(1-2)：161-5)尼龙缝线如之前描述(Zea Longa E，Weinstein PR，Carlson S & Cummins R.(1989)Reversible middlecerebral artery occlusion without craniectomy in rats.Stroke 20：84-91)在大鼠中诱导脑缺血。阻塞持续60min，然后是去除缝线以恢复中脑动脉盆中的血流。操作期间和后，动物的体温保持在37.5℃。假-操作的动物除了血管横断及缝线插入之外经历相同的过程。
手术之前一天进行行为测试，其设为基线。后手术，在第4和7天使用肢-放置测试及在第7天使用圆柱体测试评定神经性缺陷(Schallert T，Fleming SM，Leasure JL，Tillerson JL，Bland ST.CNSplasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome inunilateral rat models of stroke，cortical ablation，parkinsonism andspinal cord injury.Neuropharmacology，2000，39(5)：777-87)。使用双盲流程分析动物行为。在圆柱体测试中，圆筒壁自发探查期间评定动物的前肢使用中的不对称。
为了评定大鼠肢的感觉运动恢复，使用肢-放置测试的改良(DeRyck M，Van Reempts J，Borgers M，Wauquier A，Janssen PA.Photochemical stroke model：flunarizine prevents sensorimotordeficits after neocortical infarcts in rats.Stroke，1989，20(10)：1383-90)。测试采用针对触觉和本体感受性刺激的前肢和后肢应答。测试包括对于身体左和右侧的7个不同的测试。使用以下评分系统来评定肢功能异常：2，完全履行测试的大鼠；1，履行测试延缓多于2s和/或不完全的大鼠；0，不响应肢刺激的大鼠。
在手术后7天时通过核磁共振层析成像(NMRT)研究实验动物的脑。使用具有7T的磁场感应和105mT/m的梯度系统的Biospec70/30仪器(Bruker，德国)进行NMRT实验。
射频(RF)信号通过具有72mm的内径的线性发射器传播，和通过用于大鼠脑的表面接收器线圈检测。使用基于自旋回声的脉冲波形，RARE(用松弛增强快速获取)，用下列设置：TE，6000ms；TE，63.9ms；切片厚度，0.5mm；场，4.2×3.1cv；矩阵尺寸，256×384；分辨率，0.164×0.164mm/像素获取T2加权像。总扫描时间是4min 48s。将动物用氯醛水合物麻醉，并放入配备定位器及体温调节系统的定位装置。NMR检查期间，使用活性控制单元(小动物监控和选通系统(SA Instruments Inc.，美国))测量ECG，呼吸速度和直肠温度。使用ImageJ 1.38×软件分析NMR图像(National Institutes of Health，USA)。
使用图像分析软件，对于各切片，包括皮质及皮质下结构测量梗塞面积。根据以下式测定梗塞体积(V)：
V＝d×∑Ai，
其中∑Ai是全部切片中损伤面积之和；及d是切片厚度。
对在缺血后7天获取的T2-加权NMR图像，测定梗塞体积及％脑膨胀(Barone FC，Clark RK，Feuerstein G，Lenkinski RE，SarkarSK.Quantitative comparison of magnetic resonance imaging(MRI)and histological analyses of focal ischemic damage in the rat.BrainRes.Bull.1991，26(2)：285-91)。使用Statistica 6.0计算机软件(StatSoft，美国)进行统计学数据处理。使用Shapiro-Wilk W-测试评估样品中特性的正常分布。使用Mann-Whitney U-测试评估行为测试中的差异的统计学意义。数据是表示为平均值±SE。
【结果】
缺血之前一天(第-1天)，对于全部动物使用肢-放置测试和圆柱体测试评定基线神经性状态。然后将GK-2在生理盐水中以1mg药物/1kg体重在缺血后1h，24h和48h腹膜内施用(总3次注射)。其他组在相同的时间点用相当的体积的无药物的生理盐水处理。在第4天，使用肢-放置测试评估动物，而在第4和7天使用肢-放置测试和圆柱体测试二者以及通过脑的NMRT评估动物。当大鼠脑在缺血后7天通过NMRT研究时，损伤区定义为相对于未受损的白质，由于细胞毒性膨胀的发展在T2加权像上增加的信号(高强度)。结果显示，在该时间，相对于对侧半球，受影响的半球的膨胀小且仅显示3％。在对照组中，影响的半球的膨胀在46％的动物中观察到，而在GK-2处理组，仅在9％的动物中观察到。IS和IST组之间的具有膨胀的动物数中的差异是统计学显著的(根据对于2个比率之间的差异的双尾测试，p＝0.019)。死亡率是在对照和处理组中各3个动物。根据NMRT图像的形态测定分析，用盐水处理的对照动物中缺血性损伤的尺寸是266±20mm3(n＝12个动物)。在GK-2处理组中，有向损伤尺寸降低的趋势，其体积是222±16mm3(n＝12)(图2.1)。平均起来，损伤体积减小16.5％。
定量数据表明，在用GK-2注射的大鼠中减小的损伤体积与行为测试中得到的这些动物中感觉运动肢缺陷的数据完全相关。肢-放置测试显示，缺血后时期GK-2处理导致缺血性动物中神经性缺陷的显著降低。而在肢-放置测试中完整的大鼠评分为14，分别在缺血后第4天和第7天缺血性大鼠评分为3.00±0.38和4.46±0.40。3次药物施用分别导致分值显著改善为在缺血后第4天的5.90±0.62和在缺血后第7天的达7.67±0.75。行为测试的结果显示于图2.2。
在圆柱体测试中，缺血之前对侧及同侧前肢的独立性使用在IS和IST组中是大致类似的。在手术后7天时，影响的肢(损伤的脑半球的对侧)的使用和2个前肢的同时使用显著减少。所述减少在缺血后用GK-2处理的大鼠中少显著得多(图2.3)。
由此，GK-2明显展示由缺血后时期用药物处理的动物中脑损伤体积减小和神经性缺陷的显著降低显示的明显的抗-缺血性活性。
【1.2.通过大鼠脑前额皮质中血管的双向血栓形成造影诱导的缺血性损伤模型中的GK-2活性】
使用重180～200g的雄性远亲杂交种大鼠。
实验阶段：用于血栓形成造影的手术，运动活性的评估(血栓形成造影之前及之后9天)；血栓形成造影后9天时的PAR条件反射和保留测试；动物处死，脑的切除和固定；形态学检查和缺血性区域体积计算。
以1mg/kg的剂量使用以下方案腹膜内施用测试物质：在手术后1h，在首次施用后24h，在首次施用后4天和6天。
根据以下流程进行PAR条件反射：等待时间(LT)定义为测试开始和穿过分开亮及暗隔室的洞的时刻之间的时间。在第1天大鼠位置于亮隔室(100W灯泡)，并使其探索一定时间(学习的LT)，穿入暗隔室。然后将引入此隔室的门闭合，及使大鼠呆在那里5min。1小时后，通过使大鼠出暗隔室重复该过程。在次日以1h间隔重复此过程两次。大鼠第2次访问暗隔室期间，将门闭合及电流经过地板中的金属条(1.3mA，50Hz，5s)。当LT至少是300s时，PAR条件反射被认为建立。从实验排除具有更低LT值的动物。
通过光诱导的血栓形成方法(Watson等人，1985)产生大鼠脑的前额皮质的双向病灶缺血性梗塞(根据Paxinos和Watson的图表集的Fr1和Fr2场，1986)。动物用氯醛水合物麻醉(300mg/kg i.p.)。将光敏染料孟加拉红(Sigma Chemical Co.)注射进颈静脉(3％溶液，40mg/kg)。动物的头是固支在定位器装置中，及纵向切开皮肤后去除骨膜。
将光导管(输出光束直径3mm)使用以下坐标放置在从头颅表面1mm的距离：前囟点的2.00mm嘴和矢状缝的2.00mm侧。在任意侧进行冷光照射(氙灯光源，25V，250W)15min。假-操作的动物除了孟加拉红注射之外经历相同的过程。为了评定它们的功能状态，在RODEO-1自动单元中以5min的观察时间评估动物的运动活性(MA)。在前额皮质的血栓形成造影之前及之后9天分析MA。
对于缺血性面积和损伤体积的形态测定测量而言，通过浸没到2∶7∶1甲醛-醇-乙酸混合物中固定实验动物的脑。将固定的物质转移到70°乙醇24h和在蒸馏水中使用系列1000切片系统振动切片机(Technical Product International Inc.，USA)切片成100μm厚度。每隔一个系列切片连续安装到明胶-包被的载玻片上并用0.2％亚甲蓝染色。然后根据标准组织学过程处理载玻片：在递升的浓度的酒精中脱水，在二甲苯中澄清和包埋入石蜡。将载玻片使用Epson PerfectionV100光扫描仪的载玻片附接扫描。此方法致使产生精致的蓝色的脑切片图像文件，其上明显见到边缘深-染色的及中部浅-染色的缺血性损伤区。有时坏死组织解离，因此损伤由丢失组织区表示。缺血性损伤面积使用用于图像分析的计算机软件以相对单元计算及与扫描的具有10mm边的矩形关联，以给出以mm2的面积。
光诱导的血栓形成损伤的体积根据式：V＝∑Sn×d测定，其中d是2个切片的厚度(200μm)；Sn是以mm2的系列切片的缺血性损伤的计算的面积；∑指全部n个切片的缺血性损伤体积之和。
保护有效性率(PER)根据以下式计算：
PER＝(V0-Vs)/V0×100％，其中V0是用盐水处理的动物中损伤的平均体积；Vs是用测试物质处理的动物中损伤的平均体积。此参数使比较不同的缺血模型中不同的物质的有效性成为可能。
【结果】
实验动物分为3组：
1.训练的+假-操作的
2.训练的+前额皮质的血栓形成造影
3.训练的+前额皮质的血栓形成造影+GK-2
手术之前，使实验动物对被动回避反射(PAR)形成条件反射达300s的等待时间(LT)。
【表2.1.前额皮质的血栓形成造影后8天时PAR的等待时间(秒钟)】
  假-操作的  血栓形成造影+盐水  血栓形成造影+GK-2
  300  20  300
  300  30  300
  300  103  300
  300  38  300
  300  105  300
 300
 300
 300
 300
  300 n＝5   59.2 n＝5  300 n＝9
后血栓形成造影，穿过暗隔室的等待时间从300s减少到59.2s。在GK-2处理的大鼠中，条件反射完全恢复，即等待时间是至少300s(表2.1)。
由此，病理生理评估中得到的数据明显表明局部脑缺血条件下药物GK-2的显著的抗-遗忘效应。
左和右半球中的损伤体积以及损伤尺寸/大鼠和平均损伤体积在处理的动物中减小(图2.4)。
除了通过前额皮质的光诱导的血栓形成之前建立的PAR的100％保留展示的抗-遗忘效应之外，GK-2也具有显著的神经保护活性，即保护有效性率(PER)计算是61％。
【1.3.出血性中风模型中的GK-2活性】
【方法】
对重220～250g的雄性白色远亲杂交种大鼠进行实验。将动物在标准动物设备中笼养，并使自由获取水和食物。作为出血性中风(HS)模型的局部脑出血(创伤后脑内出血)通过Makarenko的方法(Makarenko A.N.et al.，Zh.V.N.D.2002，52(6)，765-768)产生。
为了产生中风，大鼠用氯醛水合物(400mg/kg i.m.)麻醉，然后是颅骨切开术。内囊区中的脑组织毁坏(以2～3min)然后注射从动物的舌下获取的血(0.02～0.03ml)。以此方式，不对叠压脑结构及新皮质造成显著的损伤而将内囊区中局部自出血双向中风建模。
在手术后24h记录神经性缺陷，大鼠的运动，肌张力，取向及探查行为的协调变化。
手术后14天监控大鼠。在1，3，7和14天记录动物的身体条件和行为特征。
动物分为3组。组1包括假-操作的(SO)仅颅骨切开术的大鼠，组2包括具有HS的动物，及组3包括具有用GK-2处理的HS的大鼠(1mg/kg，在手术后3h和此后每48小时，总6次施用)。将组1和组2动物用以相当的体积的生理盐水处理。
通过常规方法评估动物的身体条件和行为中的变化。如下评定神经性状态：通过根据如通过I.V.Gannushkina改良的MacGrow的中风评分系统评分神经性缺陷；通过肌张力和运动协调监控方法；通过被动回避条件反射(PAR)评定认知功能；及通过使用旷场测试评定取向及探查行为。也监控药物对大鼠存活的效应。
通过计算平均值和p＜0.05的置信区间进行统计学数据处理。根据Student氏t检验和χ2-测试评定统计学意义。
【结果】
当将GK-2手术后立即和此后每隔一天以1mg/kg的剂量施用14天时完全防止损失动物，而对照组中的死亡率是40％(表2.2)。具有损伤的运动协调的动物数是相比在HS组，在GK-2处理组中2倍更低，及是类似于假-操作的组(表2.3)。在GK-2处理组中具有减弱的肌张力的动物数不是显著不同于假-操作的组，且平均起来是2倍低于HS组(表2.4)。
HS产生用GK-2处理的动物中未观察到的掘洞反射的损伤(表2.5)。被动回避条件反射也在HS组中损伤：100％大鼠遗忘电流休克而进入的暗隔室。将大鼠用GK-2处理的情况中，在1～7天进入的暗隔室的动物数不是不同于假-操作的组。而且处理组中至第1访问的等待时间不是不同于假-操作的组。但是，在第3天，处理组和HS组之间的等待时间有显著差异(表2.6)。由此，GK-2可恢复被HS损伤的学习能力。
在第1，3，7天，如移动缓慢和肢虚弱所示，及在第3天如1～4肢轻瘫所示，GK-2降低了神经性缺陷的程度至假-操作的大鼠的水平(表2.7)。
在手术后1天和7天，GK-2恢复了运动活性的通用的指标及被HS损伤的探查行为至假-操作的大鼠中观察到的水平(表2.8)。
如十字形迷宫测试所示，HS在大鼠中诱导增加的焦虑，其被起始于第1天至整个观察时期的长度的GK-2显著减轻(表2.9)。
由此，GK-2在患出血性中风的大鼠中具有显著的抗-中风活性。
【表2.2.HS后GK-2对动物存活的效应】
Figure BPA00001444239500841
*p≤0.05对比假-操作的，#p≤0.05对比中风(确切的Fisher测试)
【表2.3.HS后旋转杆测试中GK-2对移动协调的效应】
Figure BPA00001444239500842
【表2.4.HS后水平条测试中GK-2对肌张力的效应】
Figure BPA00001444239500843
【表2.5.GK-2对学习能力的效应】
*p＜0.05对比假-操作的(Student氏t检验)
【表2.6.在具有创伤后脑内出血的大鼠中GK-2对PAR条件反射的效应】
Figure BPA00001444239500851
*p＜0.05对比假-操作的，#p＜0.05对比中风(Student氏t检验)
【表2.7.GK-2对使用MacGrow规模HS后大鼠中神经性缺陷的效应】
Figure BPA00001444239500852
【表2.8.GK-2对HS后旷场测试中大鼠的探查行为和运动活性的效应】
*p＜0.05对比假-操作的，#p＜0.05对比中风(Student氏t检验)
【表2.9.HS后GK-2对十字形迷宫测试中的动物行为的效应】
Figure BPA00001444239500862
*p＜0.05对比假-操作的，#p＜0.05对比中风(Student氏t检验)
得到的结果显示，测试化合物GK-2可在治疗缺血性和出血性损伤二者中有用。由此其使甚至在差异诊断之前，即在疾病的最重要的第1阶段实施中风患者的治疗成为可能。
【2.抗-缺血性活性】
衰老及进行性神经退行性及神经血管疾病伴随减少的脑血流。向脑组织不足的血供给可导致神经元死亡和作为结果的各认知功能的神经性缺陷和损伤。由此，例如，其显示一些认知功能在患颈动脉疾病的患者中损伤(Bakker F.C.，Klijn C.J.，Jennekens-Schinkel A.，Kapelle L.J.Cognitive disorders in patients with occlusive disease ofthe carotid artery：a systematic review of the literature.Neurology，2000，247(9)，669-676)。使用大鼠颈动脉的双向结扎作为永久性脑低氧和相关的神经元死亡和认知缺陷的模型(Bennett S.A.L.，Tenniswood M.，Chen Jia-Hua，Davidson C.M.，Keyes M.T.，Fortin T.，Pappas B.A.Chronic cerebral hypoperfusion elicits neuronalapoptosis and behavioral impairment.NeuroReport，1998，9，161-166)。因此，根据Sarti等人，2002的建议选择行为测试，其可显示由缺血诱导的认知病理学(旷场测试和对象识别测试)(Sarti C.，Pantoni L.，Bartolini L.，Inzitari D.Cognitive impairment and chroniccerebral hypoperfusion：what can be learned from experimentalmodels.J.Neurol.Sci.2002，203-204，263-266)。
【2.1.通过颈动脉的双向结扎诱导的缺血模型中的GK-2活性】
对重350～420g的雄性远亲杂交种大鼠进行实验。以1mg/kg的剂量腹膜内施用测试化合物。在第1天，给动物测试化合物的第1次注射。24小时后(第2天)它们经历颈动脉双向结扎手术。另一24h后(第3天)给动物测试化合物的第2次注射。96小时后(第7天)给它们测试化合物的第3次注射。另一24h后(第8天)，在旷场测试中测试动物(Jackson H.F.，Broadhurst P.L.The effects ofparachlorophenylalanine and stimulus intensity on open-field testmeasures in rats.Neuropharmacology，1982，21，1279-1282)。在次日(第9天)使它们探索新对象(描述于Ennaceur A.，Delacour J.A newone-trial test for neurobiological studies of memory in rats.1：Behavioral data.Behavioral Brain Research，1988，31，47-59的测试的改良)。在第11天给动物测试化合物的第4次注射。在测试化合物的最后一次注射后120小时时将动物通过断头处死(第16天)。
大鼠随机分为3组(各组n≥8)。组1(假-操作的)包括根据实验设置麻醉然后是假操作和随后接受生理盐水的4次注射的动物；组2(结扎)包括根据实验设置麻醉然后颈动脉双向结扎手术和随后接受的盐水的4次注射的动物；组3(结扎+测试化合物)包括根据实验设置麻醉然后颈动脉双向结扎手术和随后接受测试化合物的4次注射的动物。
断头后，快速移出动物的脑并放入冰-冷的生理盐水(0.9％NaCl)2min。然后将脑取出盐水和放置在用用于各区分离的过滤纸覆盖的冰上。将海马，纹状体及皮质切下并转移到冰-冷血清中。对于皮质及海马，血清体积是4ml，对于纹状体，血清体积是2ml。然后使在它们的相应血清中的脑区经过40μm尼龙过滤器(Millipore)以产生均质。将得到的细胞悬浮液在Thermo Jouan离心机中以1500rpm于室温离心5min。倒出上清，并将细胞是悬浮于10ml含10％FBS的DMEM。然后在Goryaev室中对细胞计数。
为活力测定，使用2×106细胞/ml。将96-孔板的各孔用100μl样品填充并添加10μl MTT。将板在设于37℃的恒温器中温育30min直到显蓝-紫色。为了溶解甲
Figure BPA00001444239500881
晶体，将100μl DMSO添加于各孔。在Multiscan分光光度计(Thermo)中测量在600nm处的吸光度。对其缺少MTT的自身的空白测量各样品。使用Statistica 6.0软件包，根据Mann-Whitney U-测试，用于独立性样品的确切的Fisher测试，及用于依赖性样品的Wilcoxon配对测试进行实验结果的统计学处理。数据表示为中值±四分位间隔(图2.5～2.9)。
通过颈动脉双向结扎诱导的永久性脑缺血/低氧影响了旷场测试中大鼠的探查行为。最敏感于此干扰的探查行为的成分是水平运动活性和垂直运动活性。
图2.5显示结扎导致旷场测试中降低的水平运动活性。GK-2将其恢复到见于假-操作的大鼠的水平。结扎也导致旷场测试中降低的垂直运动活性，及GK-2将其恢复到见于假-操作的大鼠的水平。
在对象探查测试中，结扎导致降低的总对象嗅时间(图2.7)。结扎组中此指标的更低水平是由于测试第1分钟期间对象探查的减少(图2.8)。图2.7和2.8也显示用GK-2处理的结扎组不是不同于假-操作的大鼠，即GK-2防止这些通过结扎诱导的测量值的降低。由此，GK-2能改善大鼠回忆和它们感知新事物的能力。
实验结果展示，假-操作的组和结扎组之间的海马及纹状体细胞的活力不是不同。在相同的时间，发现结扎产生对皮质细胞更大的不利效果(图2.9)。但是，结扎组中皮质细胞的活力通过GK-2处理增强(图2.9)。
总之，得到的结果表明，GK-2具有抗-缺血性质且其可在低氧病情中有用。
【3.GK-2的抗-帕金森活性】
目前，最常见的神经退行性疾病之一是在脑中发挥作用的多巴胺能神经元的衰退所致的帕金森病(Hirsch EC，Herrero MT.Neurochemical correlates of parkinsonism.Role of dopaminergiclesions.Adv.Neurol.1997，74，119-126)。所述疾病不仅在老年人中自发发展，而且可被神经松弛药例如氟哌啶醇引发(Hardie R.J.，LeesA.J.Neuroleptic-induced Parkinson′s syndrome：clinical features andresults of treatment with levodopa.Journal of Neurology，Neurosurgery and Psychiatry，1988，51，850-854)。
有2方法体内模拟DA神经传递的抑制。第1方法涉及所述模拟僵住及由多巴胺能物质诱导的其他锥体外束病症的测试。僵住通常由用各神经松弛药，多数为氟哌啶醇处理引起(Sanberg P.R.Haloperidol-induced catalepsy is mediated by postsynaptic dopaminereceptors.Nature，1980，284(5755)，472-473)。第2方法涉及可被神经毒素例如MPTP诱导的对DA神经元的选择性损伤(Snyder S.，D′Amato R.J.MPTP：a neurotoxin relevant to the pathophysiology ofParkinson′s disease.The 1985 George C.Cotzias lecture.Neurology，1986，36(2)，250-258)。
【3.1.大鼠中氟哌啶醇-诱导的僵住的防止】
对重250～280g的白色雄性远亲杂交种大鼠进行实验。使用氟哌啶醇(1.0mg/kg i.p.)，D1/D2多巴胺受体阻断剂，来诱导僵住。通过测量动物维持推定的体位的时间来评定僵住强度。氟哌啶醇注射后60分钟时进行测量。在氟哌啶醇之前24小时时以选定的剂量(0.01，0.1，1.0和5.0mg/kg)腹膜内施用测试化合物。将对照动物用相当的体积的蒸馏水处理。使用确切的Fisher测试进行统计学数据处理。结果显示于以下表2.10。
【表2.10.GK-2对氟哌啶醇-诱导的僵住的强度的效应】
  GK-2剂量(mg/kg)  大鼠数(n)   僵住强度(对照的％)
  对照(生理盐水)  15   100
  0.01  10   14*
  0.1  10   98
  1.0  10   25*
  5.0  10   13*
*p＜0.05对比对照
此研究中发现GK-2以0.01，1.0和5.0mg/kg的剂量显著衰减氟哌啶醇-诱导的僵住。这些结果提示，测试化合物具有多巴胺-阳性(抗帕金森)性质。
【3.2.小鼠中MPTP-诱导的运动不能的防止】
将测试化合物在MPTP注射之前24小时时以预选择的1.0mg/kg的剂量(30mg/kg i.p.)腹膜内施用给重22～25g的雄性C57B1/6小鼠。将动物在MPTP注射后60min时放入旷场装置。监控动物的水平和垂直运动活性2分钟。被动对照组由用蒸馏水代替MPTP处理的动物代表。主动对照组由用蒸馏水代替GK-2然后是MPTP处理的动物代表。处理组用GK-2然后是MPTP处理。使用Mann-Whitney U-测试进行统计学数据处理。结果显示于以下表2.11。
【表2.11.GK-2预处理对旷场测试中小鼠的MPTP-诱导的运动不能的效应】
 实验组   所跨扇区数(被动对照的％)
 被动对照(n＝10)   100
 主动对照(n＝10)   8*
 处理组(n＝10)   38*+
*p＜0.05对比被动对照，+p＜0.05对比主动对照
实验显示，可在预处理条件下有效阻止MPTP-诱导的行为异常的测试化合物导致测试化合物的潜在抗帕金森活性的提示。
【3.3.大鼠中阿扑吗啡-诱导的刻板症的增强】
神经刺激剂(尤其是阿扑吗啡)可在啮齿动物中诱导刻板的行为(Lal S.，Sourkes T.L.Ontogeny of stereotyped behaviour induced byapomorphine and amphetamine in the rat.Arch.Int.Parmacodyn.Ther.1973，202(1)，171-182)。阿扑吗啡效应的增强表明测试化合物可对DA神经传递引起刺激性影响(Khabriev R.U.A Manual onExperimental(Preclinical)Studies of New PharmacologicalSubstances.Moscow，2000，p.147-152)。
对重250～300g的雄性远亲杂交种大鼠进行实验。在阿扑吗啡注射之前24小时或与阿扑吗啡并行以预选择的1.0mg/kg的剂量腹膜内施用测试化合物。对照组用蒸馏水根据相同的方案处理。阿扑吗啡以1mg/ml溶解在补充了0.01％抗坏血酸的蒸馏水中，及在颈区经皮下施用。阿扑吗啡注射后立即，将动物放入观察室，并在5分钟后开始观察。根据手册中的指南进行观察(Khabriev R.U.A Manual onExperimental(Preclinical)Studies of New PharmacologicalSubstances.Moscow，2000，p.149)。使用以下评分系统记录口部刻板症(嗅，舔，叮咬)：1，分离的刻板的移动；2，短暂的(发作性)刻板症；3，连续的刻板症。为了记录连续的，深及非常密集刻板症，将额外的分值4导入既有的标尺(深的刻板症的特征在于，动物不响应外部刺激)。在60min时期之内刻板症一次记录5min。实验末对于整个测试时期计算各动物的累积分值。根据Mann-Whitney U-测试评定实验组之间的差异。数据表示为中值±四分位间隔(图2.10)。
实验显示，测试化合物在下预处理条件增强阿扑吗啡-诱导的口部刻板症的强度，由此确认其多巴胺-阳性性质。
【4.阿尔茨海默病的实验模型中GK-2的效应】
除了帕金森病之外，神经退行性疾病还包括阿尔茨海默病(AD)。根据‘胆碱能假说’，AD患者中认知缺陷的进行性发展是由于胆碱能系统的降低的功能性参数的及前脑核基底中胆碱能神经元的变性(Bartus R.T.，Dean R.L.，Pontecorvo M.J.，Flicker C.Thecholinergic hypothesis：a historical overview，current perspective，andfuture directions.Ann.New York Acad.Sci.1985，44，332-358)。在其病理形态学模式的缺失下刺激AD的行为和胆碱能缺陷的基本的动物模型包括海马去传入模型(Krugel U.，Bigl V.，Eschrich K.，Bigl M.Deafferentation of the septo-hippocampal pathway in rats as a modelof the metabolic events in Alzheimer′s disease.Int.J.Devl.Neuroscience，2001，19，263-277)。使用此模型来评定化合物GK-2的功效。也使用东莨菪碱-诱导的遗忘模型刺激胆碱能缺陷。
【4.1.通过横断隔-海马通路(伞-穹窿)诱导的大鼠中的探查行为损伤的防止】
对重280～400g的雄性Wistar大鼠进行实验。将动物麻醉及去除透皮，然后使其位置于定位器装置。在头颅中制造1mm宽的倾斜的切口：切口的起点在前囟点(AP＝0.0)和其2mm侧(L＝±2)水平；切口端点是前囟点的2mm尾和其1mm侧(AP＝2.0，L＝±1)。锯头颅骨后，在锯切割区中小心地切割硬膜。将无菌弯针插入切口至从骨表面6.2mm深度(DV＝-6.2)。通过同时使用定位器装置中的2个螺钉，将针缓慢移动到几乎倾斜的切口的端点。然后将针从切口缓慢拔出。对各半球将此过程重复两次。除了将针插入从骨表面3mm深度(DV＝-3.0)之外，假操作类似于横断过程。横断后2小时时进行处理组中测试化合物(1mg/kg i.p.)或对照组中蒸馏水的第1次注射。每48小时进行进一步注射。在实验过程中，各动物接受测试化合物的7次注射。
为了检测通过隔-海马通路的横断诱导的行为异常，使用旷场测试。此测试的选择基于以下研究：(1)Lamprea M.R.，Cardenas F.P.，Silveira R.，Walsh T.J.，Morato S.Effects of septal cholinergic lesionon rat exploratory behavior in an open-field.Braz.J.Med.Biol.Res.2003，36(2)，233-238；(2)Cassel J.S.，Kelche C.，Peterson G.M.，Ballough G.P.，Goepp I.，Will B.Graft-induced behavioral recoveryfrom subcallosal septohippocampal damage in rats depends onmaturity stage of donor tissue.Neuroscience，1991，45(3)，571-586。在测试化合物的最后一次注射后48小时时(在手术后14天)在旷场装置中测试动物。根据Wilcoxon配对测试评定实验组之间的差异。实验结果显示于表2.12。数据表示为相应样品的中值。
【表2.12.慢性GK-2处理对旷场测试中大鼠的水平运动活性的效应】
  组  第1分钟  第2分钟  第3分钟  第4分钟
  对照  15  11.5  11*  2*
  假-操作的  21  14  9.5*  9*
  横断  11.5  12  19  11.5
  横断+GK-2  12.5  11.5  15.5  6.5*
*p＜0.05对比第1分钟
表显示，如整个测试时期期间水平运动活性的几乎未变化的水平所示，在横断组中对旷场装置条件的习惯化被损伤。在以上引用的研究中得到类似结果。在横断+GK-2处理组中，观察到习惯化能力的恢复。这些结果提示，测试化合物具有向胆碱能系统的神经保护活性。
为了确认此建议，我们使用东莨菪碱(其为蕈毒碱乙酰胆碱受体的拮抗剂)作为病理学制剂进行了额外的研究。
【4.2.大鼠中东莨菪碱-诱导的工作记忆损伤的防止】
将重190～220g的雄性Wistar大鼠用于此实验。在东莨菪碱注射(1.0mg/kg皮下)之前24小时时以1.0mg/kg的剂量腹膜内施用测试化合物。将对照组用蒸馏水根据相同的方案处理。将动物放入T-形迷宫之前60min时注射东莨菪碱。再120min后，使动物根据原流程经历测试(Deacon R.M.J.，Rawlins J.N.P.T-maze alternation in therodent.Nature Protocols，2006，1(1)，7-12)。
根据精确的Fisher测试评定实验组之间的差异。实验结果显示于图2.11。
实验展示，测试化合物可在预处理条件下下阻止东莨菪碱-诱导的工作记忆损伤。
由此，基于药理学评定的常规方法的可用的数据的综合分析使得得出，GK-2，低分子量二聚体NGF(神经生长因子)模拟物的生物学效应谱，包括抗-中风，抗-帕金森，抗-缺血，抗-遗忘和神经保护活性。
【5.抗抑郁药活性】
【5.1.根据Porsolt的行为绝望测试中BDNF模拟物的效应】
为了检测肽BDNF模拟物的潜在抗抑郁药活性，使用原版的行为绝望测试(Porsolt R.D.，Anton G.，Blavet N.，Jalfre M.Behavioraldespair in rats：a new model sensitive to antidepressants.EuropeanJournal of Pharmacology，1978，47，379-391)。
对于这些实验，使用重20～22g的雄性Balb/c小鼠。在第1天，将动物放入填充有22℃的水的窄容器10min。60min后，腹膜内施用测试化合物(GSB-106以1mg/kg，GBK-108和GBK-201以0.01，0.1，1.0，10.0mg/kg)。24小时后，将动物再次放入相同的条件，以记录特征性固定体位的保持时间(丢弃任何主动防御性及探查行为)5min测试时期。在5min测试时期(在第2天)之前施用丙米嗪60min。对照组用蒸馏水处理。各实验组包括至少6个小鼠。根据Mann-Whitney U-测试和确切的Fisher测试评定实验组之间的差异。数据表示为中值±四分位间隔。
实验结果显示于图2.12和2.13。
图2.13显示丙米嗪和GSB-106通过减少测试中的不动时间显示抗抑郁性质。相反，GBK-201(以0.01和0.1mg/kg i.p.)和GBK-108(以10mg/kg i.p.)增加了测试中的不动时间。根据Porsolt的行为绝望测试中增加的不动时间对于具有神经松弛活性的物质是固有的。
由此，具有神经保护活性的二聚体BDNF模拟物在Porsolt测试中呈现抗抑郁活性。降低神经元的活力的单体BDNF模拟物呈现促抑郁活性。

Claims (23)

1.通式(R-CH2-CO-A-B-NH-R’)n(I)的化合物，其被具有对应于神经营养因子的环1或环4区的暴露于溶剂的部分的序列的序列的线性二肽取代，其中至少一个氨基酸残基或其生物立体异构体形成相应环的部分β-转角，其具有全或部分激动剂或拮抗剂活性。
2.根据权利要求1的化合物，其中所述神经营养因子是神经生长因子(NGF)或脑-来源的神经营养因子(BDNF)。
3.根据权利要求1的化合物，其中在式I中：
A和B是二肽序列AB的氨基酸残基；
R是神经营养素序列中二肽片段AB之前的氨基酸残基的侧链基或H或二价基-R-，尤其是-(CH2)m-；
R’是神经营养素序列中二肽片段AB之后的氨基酸残基的侧链基或H或二价基-R’-，尤其是-(CH2)m-；
n＝1或2。
在二价基-R’-或-R-的存在下，n＝2，且化合物是具有通过C-端间隔物-R-R-或N-端间隔物-R’-R’-连接的单体二肽的二聚体。在其他情况中，n＝1，且化合物被单体二肽取代。
4.根据权利要求3的化合物，其中R是HO(O)C-CH2-；A是Glu；B是Lys；R’是H；且n＝1。
5.根据权利要求3的化合物，其中R是HO(O)C-CH2-；A是Glu；B是Lys；R’是-(CH2)m-；m＝1或1.5或2或2.5或3；且n＝2。
6.根据权利要求3的化合物，其中R是HO(O)C-CH2-；A是Glu；B是Lys；R’是-(CH2)5-NH-C(O)-(CH2)3/2-；且n＝2。
7.根据权利要求3的化合物，其中R是H；A是Lys；B是Glu；R’是H；且n＝1。
8.根据权利要求3的化合物，其中R是H；A是Lys；B是Glu；R’是-(CH2)3-；且n＝2。
9.根据权利要求3的化合物，其中R是NH2-(CH2)4-；A是Lys；B是Glu；R’是H；且n＝1。
10.根据权利要求3的化合物，其中R是NH2-(CH2)4-；A是Lys；B是Glu；R’是-(CH2)3-；且n＝2。
11.根据权利要求3的化合物，其中R是H；A是Gly；B是Lys；R’是-(CH2)3-COOH；且n＝1。
12.根据权利要求3的化合物，其中R是-(CH2)2-；A是Gly；B是Lys；R’是-(CH2)3-COOH；且n＝2。
13.根据权利要求3的化合物，其中R是HO(O)C-CH2-；A是Ser；B是Lys；R’是H；且n＝1。
14.根据权利要求3的化合物，其中R是HO(O)C-CH2-；A是Ser；B是Lys；R’是-(CH2)3-；且n＝2。
15.根据权利要求3的化合物，其中R是HO(O)C-CH2-；A是Lys；B是Lys；R’是-(CH2)3-；且n＝2。
16.根据权利要求3的化合物，其中R是H；A是Asp；B是Ser；R’是H；且n＝1。
17.根据权利要求3的化合物，其中R是HO(O)C-CH2-；A是Met；B是Ser；R’是H；且n＝1。
18.根据权利要求3的化合物，其中R是HO(O)C-CH2-；A是Met；B是Ser；R’是-(CH2)7/2-；且n＝2。
19.通过施用有效量的根据权利要求5的化合物治疗缺血性和出血性中风的方法，其中m＝3。
20.通过施用有效量的根据权利要求5的化合物治疗帕金森病的方法，其中m＝3。
21.通过施用有效量的根据权利要求5的化合物治疗阿尔茨海默病的方法，其中m＝3。
22.通过施用有效量的根据权利要求14的化合物治疗抑郁症的方法。
23.药物组合物，其包括治疗有效量的根据权利要求3的化合物作为活性成分。
CN201080014235.6A 2009-02-16 2010-02-15 神经营养因子ngf和bdnf的二肽模拟物 Active CN102365294B (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2009105176A RU2410392C2 (ru) 2009-02-16 2009-02-16 Дипептидные миметики нейротрофинов ngf и bdnf
RU2009105176 2009-02-16
PCT/RU2010/000067 WO2010093284A1 (ru) 2009-02-16 2010-02-15 Дипептидные миметики нейротрофинов ngf и bdnf

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102365294A true CN102365294A (zh) 2012-02-29
CN102365294B CN102365294B (zh) 2016-02-17

Family

ID=42561958

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201080014235.6A Active CN102365294B (zh) 2009-02-16 2010-02-15 神经营养因子ngf和bdnf的二肽模拟物

Country Status (5)

Country Link
US (2) US20110312895A1 (zh)
EP (1) EP2397488B1 (zh)
CN (1) CN102365294B (zh)
RU (1) RU2410392C2 (zh)
WO (1) WO2010093284A1 (zh)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2289555A1 (en) * 2009-08-24 2011-03-02 OrgaNext Research B.V. Method of treating frailty
WO2012028959A1 (en) * 2010-08-31 2012-03-08 Pablo Villoslada Agonists of neurotrophin receptors and their use as medicaments
RU2613184C2 (ru) * 2013-05-17 2017-03-15 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова" (ФГБНУ "НИИ фармакологии имени В.В. Закусова") Вещества, обладающие ангиогенной активностью
RU2613314C2 (ru) * 2013-06-28 2017-03-15 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова" Малые молекулы с NGF-подобной активностью, обладающие антидиабетическими свойствами
RU2625752C2 (ru) * 2013-11-19 2017-07-18 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова" Вещество, обладающее антиангиогенной активностью
RU2559880C1 (ru) * 2014-06-18 2015-08-20 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова" Замещенный бисдипептид с нейропротективным и антидепрессивным эффектом
RU2678203C2 (ru) * 2017-05-30 2019-01-24 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова" Фармацевтическая композиция нейропротекторного действия для парентерального применения на основе гексаметилендиамида бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) в лиофилизированной лекарственной форме
RU2693479C2 (ru) * 2017-11-20 2019-07-03 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова" Средство, обладающее антидиабетической активностью
RU2697254C1 (ru) * 2018-02-28 2019-08-13 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова" Фармацевтическая композиция на основе гексаметилендиамида бис-(N-моносукцинил-L-серил-L-лизина) (ГСБ-106)
RU2740754C1 (ru) * 2018-11-13 2021-01-20 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова" Фармацевтическая композиция нейропротекторного действия для перорального применения на основе гексаметиленамид бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) (варианты), выполненная в виде таблетки, диспергируемой в полости рта
RU2707301C1 (ru) * 2019-05-17 2019-11-26 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова" Низкомолекулярный миметик BDNF как средство для лечения опиоидной зависимости
CN111647003B (zh) * 2020-06-08 2022-06-21 中国科学院昆明植物研究所 三环氧六氢色酮a及其药物组合物和其应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0335637A2 (en) * 1988-03-28 1989-10-04 The Regents Of The University Of California Nerve growth factor peptides
US5958875A (en) * 1996-03-29 1999-09-28 The Regents Of The University Of California Synthetic peptides derivatives with nerve growth factor-like neurotrophic activity
CN1272873A (zh) * 1997-08-08 2000-11-08 普罗格特-甘布尔公司 具有用于提供所洗织物外观和完整性益处的基于氨基酸的聚合物的洗衣用洗涤剂组合物
CN1452492A (zh) * 2000-05-26 2003-10-29 奥索-麦克尼尔药品公司 神经保护肽

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB9402331D0 (en) 1994-02-07 1994-03-30 Univ Mcgill Nerve growth factor structural analogs and their uses
AUPQ084899A0 (en) 1999-06-08 1999-07-01 University Of Melbourne, The Neurotrophin agonists
US7259146B2 (en) 2000-05-26 2007-08-21 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Neuroprotective peptides
AU2003291071A1 (en) * 2002-11-18 2004-06-15 Samuel R. Denmeade Activation of peptide prodrugs by hk2
UY28952A1 (es) * 2004-06-09 2006-01-31 Avanir Pharmaceuticals Mediadores del transporte inverso de colesterol para el tratamiento de la hipercolesterolemia

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0335637A2 (en) * 1988-03-28 1989-10-04 The Regents Of The University Of California Nerve growth factor peptides
US5958875A (en) * 1996-03-29 1999-09-28 The Regents Of The University Of California Synthetic peptides derivatives with nerve growth factor-like neurotrophic activity
CN1272873A (zh) * 1997-08-08 2000-11-08 普罗格特-甘布尔公司 具有用于提供所洗织物外观和完整性益处的基于氨基酸的聚合物的洗衣用洗涤剂组合物
CN1452492A (zh) * 2000-05-26 2003-10-29 奥索-麦克尼尔药品公司 神经保护肽

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
SIGMA: "Product No.G5136", 《SIGMA BIOCHEMICALS AND REAGENTS CATALOG》, 31 December 2002 (2002-12-31) *

Also Published As

Publication number Publication date
EP2397488B1 (en) 2019-03-27
RU2410392C2 (ru) 2011-01-27
US20110312895A1 (en) 2011-12-22
US9683014B2 (en) 2017-06-20
CN102365294B (zh) 2016-02-17
EP2397488A1 (en) 2011-12-21
WO2010093284A1 (ru) 2010-08-19
EP2397488A4 (en) 2014-03-19
US20150111828A1 (en) 2015-04-23
RU2009105176A (ru) 2010-08-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102365294A (zh) 神经营养因子ngf和bdnf的二肽模拟物
DK2707014T3 (en) Dimeric high affinity inhibitors of PSD-95 and their use in the treatment of ischemic brain injury and pain
BRPI0617751A2 (pt) compostos de ligação do domìnio iap bir
CN107427491A (zh) 作为免疫调节剂的治疗性环状化合物
CN101535300A (zh) Iap bir域结合化合物
CN109232713A (zh) Nmda受体调节剂及其用途
JP2003526622A (ja) 老化防御効果を示すテトラペプチド、これを基にした薬理学的物質、及びその利用法
CN103113264B (zh) 厚朴酚衍生物以及和厚朴酚衍生物及其制备方法和应用
BR112013004662B1 (pt) Composto, composição farmacêutica, usos de um composto, e método para preparar uma composição farmacêutica
BRPI0715407A2 (pt) peptÍdeos e seus derivados funcionalmente equivalentes, composiÇÕes farmacÊuticas e usos dos mesmos
CN110177581A (zh) 髓过氧化物酶显像剂
WO2007038172A2 (en) Guanidinium carriers
KR20180050755A (ko) 사이클릭 폴리펩타이드, 그것의 제조 방법 및 치료학적 용도
JP3668950B2 (ja) ペプチドと、その合成方法と、それをベースにした医薬品
JP2018531284A6 (ja) 環状ポリペプチド、それらを得る方法、及びその治療的使用
RU2559880C1 (ru) Замещенный бисдипептид с нейропротективным и антидепрессивным эффектом
BR112021009341A2 (pt) peptídeos e composições farmacêuticas para o tratamento de doenças oculares
ES2305096T3 (es) Composicion farmaceutico que comprende un peptido analgesico.
CN103946232B (zh) 抗淀粉样蛋白的ɑ‑螺旋阻断超小肽疗法
JP6851965B2 (ja) 疾患及び障害の治療のためのｎｆカッパｂ活性の阻害剤
RU2362579C1 (ru) Фармацевтическая композиция на основе пептида, обладающего противоопухолевым действием
EA011092B1 (ru) Пептид, обладающий стресс-протекторным действием, фармацевтическая композиция на его основе и способ ее применения
CN108137694B (zh) 整合素αvβ6的配体及其合成和应用
KR101046425B1 (ko) 신경교란　진정용 펩타이드 및 이를 포함하는 피부자극 완화용 조성물
EP0929570A1 (de) Modifizierte cytostatika

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant