BR112013004662B1 - Composto, composição farmacêutica, usos de um composto, e método para preparar uma composição farmacêutica - Google Patents

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Bionure Farma, S.L.
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Abstract

COMPOSTO, COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, USOS DE UM COMPOSTO, E MÉTODO PARA PREPARAR UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA. A invenção refere-se aos compostos de Fórmula (I) ; e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, em que R1, R2 e R3 são definidos conforme estabelecido no relatório descritivo. Os compostos são agonistas de receptores de neurotrofina (tal como fator de crescimento neural).

Description

[001] Este pedido reivindica o benefício da data de depósito anterior do Pedido de Patente Provisório US 61/378.823, depositado em 31 de agosto de 2010, cuja divulgação é integralmente incorporada ao presente pela referência.
CAMPO DA INVENÇÃO
[002] Esta invenção aplica-se à área da terapêutica para distúrbios psiquiátricos, neurológicos e do envelhecimento. Especificamente, ela está relacionada com o efeito neuroprotetor de pequenas moléculas agonistas de receptores de neurotrofina (fator de crescimento neural (NGF) ou fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF)) e a utilização desses agonistas como medicamentos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
[003] Os distúrbios do envelhecimento, neurológicos e psiquiátricos causam morte e danos às células nervosas. Danos frequentes e relevantes para o sistema nervoso podem resultar da degeneração neuronal, isquemia, inflamação, respostas imunes, traumatismo, câncer entre outras coisas. Como consequência destes danos, as células nervosas podem morrer dentro de minutos ou horas, ou sobreviver este dano inicial em um estado deficiente que ativa a neurodegeneração, terminando da mesma forma na morte celular.
[004] Dada a importância do sistema nervoso que permite habilidades motoras básicas e sensoriais, existe um interesse em encontrar armas terapêuticas para proteger o sistema nervoso.
[005] A neuroproteção é focada na preservação, recuperação, cura, ou regeneração do sistema nervoso, as suas células, estrutura e função (Vajda et al., 2002). A meta da neuroproteção é prevenir ou minimizar os efeitos de uma lesão inicial no sistema nervoso, ou evitar ou minimizar as consequências dos processos endógenos ou exógenos nocivos que causam danos aos axônios, neurônios, sinapses e dendritos.
[006] As estratégias de tratamento, em geral, são frequentemente baseadas na modulação de um único fator de lesão proposto. Embora tais tratamentos possam ser mostrados como sendo benéficos em modelos animais altamente restringidos, eles têm menos probabilidade de se provarem eficazes na doença humana, que é mais complexa e envolve mais graus variáveis de gravidade da lesão em uma população geneticamente diversa (Faden e Stoica, 2007). Um aspecto importante, uma vez que os supostos mecanismos de morte neuronal são complexos e variados, tal como o estresse oxidativo, disfunção mitocondrial, agregação de proteínas, apoptose e inflamação (Youdim et al., 2005), é que são desejáveis compostos isolados possuindo efeitos multipotenciais sobre mecanismos de lesão.
[007] Vários fármacos neuroprotetores estão sob investigação, incluindo as seguintes classes: agentes anti-inflamatórios, antagonistas N- metil-D-aspartato (NMD A), antagonistas ácido α-amino-3-hidroxi-5-metil-4- isoxazol propiônico (AMPA), dexanabinol, bloqueadores de canais de sódio, liberadores de hormônio tirotropina (TRH), fatores de crescimento, glicocorticoides, cafeinol, antagonistas de opióides, inibidores da apoptose, captadores/varredores de radicais livres, eritropoietina, bloqueadores de canal de cálcio, sulfato de magnésio e estatinas.
[008] A capacidade destes agentes farmacológicos de limitar os danos bioquímicos secundários e a morte celular tem sido decepcionante (Faden e Stoica, 2007).
[009] As neurotrofinas são fatores de crescimento que regulam o desenvolvimento e manutenção do sistema nervoso central e periférico (Lewin e Barde, 1996). O Fator de crescimento neural (NGF) é o primeiro membro descoberto e mais bem caracterizado da família das neurotrofinas, que inclui outras proteínas estruturalmente relacionadas, tais como o fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF). O fator de crescimento neural (NGF) é uma proteína homodimérica da família da neurotrofina que desempenha um papel crucial na sobrevivência, diferenciação e crescimento neuronal (Levi-Montalcini, 1987) e se liga a dois receptores celulares distintos: o receptor TrkA tirosina- quinase e o receptor p75 (Chao, 2003). A ligação NGF-TrkA ativa a tirosina quinase intrínseca do receptor, causando a fosforilação da tirosina do TrkA e de parceiros de sinalização associados e, consequentemente, promover a ativação da sobrevivência ou diferenciação celular (Kaplan e Miller, 2000). O receptor p75 é um membro da superfamília de receptores do fator de necrose tumoral. Dependendo do ambiente celular e do tipo de ligante, o p75 pode funcionar como transdutor de sinais de sobrevivência, pró-apoptótico, ou pró- diferenciação (Barker, 1998; Rabizadeh et al, 1999; Zaccaro et al, 2001; Saragovi e Zaccaro, 2002). Consequentemente, dependendo da via metabólica, a ligação tanto ao TrkA como ao p75 pode desencadear sinais, de acordo com o tipo de célula considerado, ligado a, indistintamente, diferenciação e/ou sobrevivência celular. As neurotrofinas atuam através de duas principais vias de sinalização: a via fosfatidilinositol 3-quinase (PI3K)-AKT e a via da proteína quinase ativada por mitógeno (MAPK)-MEK via (ambas as vias estão envolvidas na inibição da apoptose). Os Fatores neurotróficos são conhecidos por agirem também sobre os neurônios maduros e, em particular, sobre células lesionadas e degenerativas (Lindvall et al. 1994; Tuszynski e Gage, 1995; Lykissas et al. 2007; Song et al. 2009).
[010] O potencial do NGF como um agente terapêutico para diversas doenças tem sido indicado por muitos investigadores. Tais doenças incluem doenças neurodegenerativas, inflamação de nervos e certos tipos de cânceres, esclerose múltipla, neuromielite óptica, esclerose lateral amiotrófica (ELA), doença de Parkinson, doença de Alzheimer, ataxia de Friedreich, doença de Huntington, demência com corpos de Lewy, atrofia muscular espinal, transtorno depressivo maior, esquizofrenia, glaucoma ou neuropatias periféricas (neuropatia diabética ou por AIDS) (Longo et al, 2007; Schulte- Herbriiggen, 2007; Shi, 2007; Hellveg, 2008; Shoval, 2005; Apfel, 2002; Anand, 2004). O NGF tem importantes propriedades imunomoduladoras durante a inflamação do SNC e contribui para a manutenção do privilégio do SNC (Villoslada e Genain, 2004). Durante a encefalomielite autoimune experimental (EAE) em saguis, o NGF foi capaz de inibir o desenvolvimento dos sintomas clínicos, quando administrado por infusão intracerebroventricular contínua, aparentemente devido à sua capacidade de induzir um microambiente imunossupressor no SNC que leva a uma diminuição da infiltração no SNC (Villoslada et al., 2000). A constatação de que o NGF induz a imunossupressão durante desmielinização autoimune, além das suas propriedades neuroprotetoras em neurônios e oligodendrócitos, o torna um excelente candidato para o tratamento de doenças inflamatórias do SNC tal como a MS. No entanto, o NGF não é a droga candidata ideal, devido à sua incapacidade de atravessar a barreira hemato-encefálica (BHE) (Poduslo e Curran, 1996), a sua meia-vida curta e os seus efeitos secundários (Apfel, 2002). Muitos esforços têm sido feitos na procura de moléculas pequenas com atividade agonista do NGF com melhor farmacocinética e menores efeitos colaterais. Para atingir este objetivo, diferentes abordagens têm sido tentadas (Poduslo e Curran, 1996; Longo et al, 1997; Maliartchouk et al, 2000a; Maliartchouk et al, 2000b; Peleshok e Saragovi, 2006).
[011] Assim, existe uma necessidade contínua para o fornecimento de medicamentos, particularmente os que mimetizam o NGF, com propriedades neuroprotetoras, que têm preferencialmente efeitos multipotenciais, mas sem os inconvenientes do NGF. Os presentes inventores desenvolveram uma família de compostos distintos daqueles divulgados no estado da técnica. A família de compostos da presente invenção são peptidomiméticos de neurotrofinas (NGF, BDNF), e agonistas para os receptores específicos trkA, trkB e p75. Alguns compostos da presente invenção promovem apenas a titulo de exemplo, a sobrevivência de células de uma forma ainda mais elevada do que o próprio NGF. Os compostos da presente invenção são considerados peptídeomiméticos da neurotrofina e todos eles partilham uma estrutura de trímeros de N-alquilglicina.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO
[012] A presente invenção está relacionada com o uso de compostos peptóides de Fórmulas I-V, abaixo, e de sais farmaceuticamente aceitáveis e pró-drogas dos mesmos, tais como agonistas de receptores de neurotrofinas, e especificamente de receptores de fator de crescimento neural (NGF), e receptores de fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF).
[013] Os compostos úteis na presente invenção não foram descritos até o momento. Assim, um aspecto da presente invenção é direcionado a novos compostos de Fórmulas I-V, bem como os sais farmaceuticamente aceitáveis e pró-drogas dos mesmos.
[014] Outro aspecto da invenção é direcionado ao uso de compostos de qualquer uma das Fórmulas I-V, e os sais farmaceuticamente aceitáveis e pró-drogas dos mesmos, como agonistas de receptores de NGF. Outro aspecto da invenção é direcionado ao uso de compostos de qualquer uma das Fórmulas I-V, e os sais farmaceuticamente aceitáveis e pró-drogas dos mesmos, como agonistas de receptores de BDNF.
[015] Um aspecto adicional da invenção é o de fornecer um composto de qualquer uma das Fórmulas I-V, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou pró-droga do mesmo, para a utilização como um medicamento. Em um aspecto da invenção, o medicamento é para o uso na prevenção ou tratamento da morte ou lesão de células nervosas. Em um aspecto da invenção, o medicamento é para ser utilizado na neuroproteção. Em um aspecto da invenção, o medicamento é para ser usado na regeneração de células nervosas. Em um aspecto da invenção, o medicamento é para ser utilizado como neuroestimulante (neuroenhancing). Em um aspecto, o medicamento é para a utilização na prevenção ou tratamento de uma doença neurológica ou doença psiquiátrica. Em um aspecto da invenção, o medicamento é para o uso na prevenção ou tratamento de uma doença selecionada a partir do grupo que consiste de uma doença neurológica, preferencialmente uma doença neurodegenerativas (tal como a esclerose lateral amiotrófica (ELA), doença de Parkinson, doença de Alzheimer, ataxia de Friedreich, doença de Huntington, demência com corpos de Lewy, atrofia muscular espinal), inflamação de nervos (por exemplo, esclerose múltipla e neuromielite óptica), transtorno depressivo maior, esquizofrenia, glaucoma, neuropatia periférica (por exemplo, neuropatia diabética ou por AIDS), e câncer (tal como glioblastoma, astrocitoma, meduloblastoma, neurinoma, neuroblastoma, meningioma, câncer de cólon, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de próstata, leucemia, leucemia linfocítica aguda, osteossarcoma, carcinoma hepatocelular, carcinoma de ovário, adenocarcinoma do pulmão, e esofágico).
[016] Um aspecto adicional da invenção é o de fornecer um composto de qualquer uma das Fórmulas I-V, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou pró-droga do mesmo, para uso como um medicamento para o tratamento de esclerose múltipla.
[017] Um aspecto adicional da invenção é o de fornecer um composto de qualquer uma das Fórmulas I-V, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou pró-droga do mesmo para o uso como um medicamento, em que o medicamente é uma droga neuroregenerativa.
[018] Um aspecto adicional da invenção é o de fornecer um composto de qualquer uma das Fórmulas I-V, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou pró-droga do mesmo para o uso como um medicamento, em que o medicamente é um imunomodulador.
[019] Um aspecto adicional da invenção é o de fornecer um composto de qualquer uma das Fórmulas I-V, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou pró-droga do mesmo para o uso como um medicamento, em que o medicamente tem uma combinação de efeitos neuroprotetores e imunomoduladores.
[020] Um aspecto adicional da presente invenção é de fornecer uma composição farmacêutica, compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um composto de qualquer das Fórmulas I-V, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou uma pró- droga do mesmo, e um veículo farmaceuticamente aceitável;
[021] Um aspecto adicional da presente invenção é fornecer o uso de um composto de qualquer das Fórmulas de I-V, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou uma pró-droga do mesmo, para a fabricação de um medicamento para prevenir ou tratar a morte ou lesão de células nervosas.
[022] Um aspecto adicional da invenção é o de fornecer o uso de um composto de qualquer uma das Fórmulas I-V, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou pró-droga do mesmo, na fabricação de um medicamento para o fornecimento da neuroproteção.
[023] Um aspecto adicional da invenção é o de fornecer o uso de um composto de qualquer uma das Fórmulas I-V, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou pró-droga do mesmo, na fabricação de um medicamento para a regeneração de células nervosas.
[024] Um aspecto adicional da invenção é o de fornecer o uso de um composto de qualquer uma das Fórmulas I-V, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou pró-droga do mesmo, na fabricação de um medicamento para a prevenção ou tratamento de uma doença neurológica ou doença psiquiátrica.
[025] Em um aspecto adicional da invenção, é fornecido o uso de um composto de qualquer Fórmula de I-V, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou pró-droga do mesmo, na fabricação de um medicamento para a prevenção ou tratamento de uma doença selecionada a partir do grupo que consiste de uma doença neurológica, preferencialmente uma doença neurodegenerativas (tal como a esclerose lateral amiotrófica (ELA), doença de Parkinson, doença de Alzheimer, ataxia de Friedreich, doença de Huntington, demência com corpos de Lewy, atrofia muscular espinal), inflamação de nervos (por exemplo, esclerose múltipla e neuromielite óptica), transtorno depressivo maior, esquizofrenia, glaucoma, neuropatia periférica (por exemplo, neuropatia diabética ou por AIDS), e câncer (tal como glioblastoma, astrocitoma, meduloblastoma, neurinoma, neuroblastoma, meningioma, câncer de cólon, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de próstata, leucemia, leucemia linfocítica aguda, osteossarcoma, carcinoma hepatocelular, carcinoma de ovário, adenocarcinoma do pulmão, e esofágico).
[026] Um aspecto adicional da invenção é o de fornecer o uso de um composto de qualquer uma das Fórmulas I-V, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou pró-droga do mesmo, na fabricação de um medicamento para a prevenção ou o tratamento da esclerose múltipla.
[027] Um aspecto adicional da invenção é o de fornecer o uso de um composto de qualquer uma das Fórmulas I-V, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou pró-droga do mesmo, na fabricação de uma droga neuroregenerativa.
[028] Um aspecto adicional da invenção é o de fornecer o uso de um composto de qualquer uma das Fórmulas I-V, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou pró-droga do mesmo, na fabricação de um imunomodulador.
[029] Um aspecto adicional da invenção é o de fornecer o uso de um composto de qualquer uma das Fórmulas I-V, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou pró-droga do mesmo, na fabricação de um medicamento possuindo uma combinação de efeitos neuroprotetores e imunomoduladores.
[030] Um aspecto adicional da invenção é o de fornecer o uso de um composto de qualquer uma das Fórmulas I-V, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou pró-droga do mesmo, na fabricação de uma droga neuroestimulante (neuroenhancing).
[031] Um aspecto adicional da invenção é o de fornecer um método para prevenir ou tratar a morte ou danos de células nervosas, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz a um sujeito com essa necessidade de um composto de qualquer uma das Fórmulas I-V, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou uma pró-droga do mesmo; ou de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um composto de qualquer das Fórmulas I-V, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou uma pró-droga do mesmo.
[032] Um aspecto adicional da invenção é o de fornecer um método para prover neuroproteção, compreendendo a administração a um sujeito com essa necessidade de uma quantidade eficaz de um composto de qualquer uma das Fórmulas I-V, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou uma pró-droga do mesmo; ou de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um composto de qualquer das Fórmulas I-V, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou uma pró- droga do mesmo.
[033] Um aspecto adicional da invenção é o de fornecer um método para prover a imunomodulação, compreendendo a administração a um sujeito com essa necessidade de uma quantidade eficaz de um composto de qualquer uma das Fórmulas I-V, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou uma pró-droga do mesmo; ou de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um composto de qualquer das Fórmulas I-V, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou uma pró- droga do mesmo.
[034] Um aspecto adicional da invenção é o de fornecer um método para a regeneração de células nervosas, compreendendo a administração a um sujeito com essa necessidade de uma quantidade eficaz de um composto de qualquer uma das Fórmulas I-V, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou uma pró-droga do mesmo; ou de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um composto de qualquer das Fórmulas I-V, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou uma pró-droga do mesmo.
[035] Um aspecto adicional da invenção é o de fornecer um método para a prevenção ou o tratamento de uma doença selecionada a partir do grupo que consiste de uma doença neurológica, preferencialmente uma doença neurodegenerativas (tal como a esclerose lateral amiotrófica (ELA), doença de Parkinson, doença de Alzheimer, ataxia de Friedreich, doença de Huntington, demência com corpos de Lewy, atrofia muscular espinal), inflamação de nervos (por exemplo, esclerose múltipla e neuromielite óptica), transtorno depressivo maior, esquizofrenia, glaucoma, neuropatia periférica (por exemplo, neuropatia diabética ou por AIDS), e câncer (tal como glioblastoma, astrocitoma, meduloblastoma, neurinoma, neuroblastoma, meningioma, câncer de cólon, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de próstata, leucemia, leucemia linfocítica aguda, osteossarcoma, carcinoma hepatocelular, carcinoma de ovário, adenocarcinoma do pulmão, e esofágico), compreendendo a administração a um sujeito com essa necessidade de uma quantidade eficaz de um composto de qualquer uma das Fórmulas I-V, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou uma pró-droga do mesmo; ou de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um composto de qualquer das Fórmulas I-V, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou uma pró-droga do mesmo.
[036] Um aspecto adicional da invenção é o de fornecer um método para a prevenção ou o tratamento da esclerose múltipla, doença de Alzheimer, doença de Parkinson ou glaucoma, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz a um sujeito com essa necessidade de um composto de qualquer uma das Fórmulas I-V, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou uma pró-droga do mesmo; ou de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um composto de qualquer das Fórmulas I-V, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou uma pró-droga do mesmo.
[037] Um aspecto adicional da invenção é o de fornecer um método para o tratamento de uma doença responsiva à estimulação da atividade de neurotrofina, ou um receptor de neurotrofina em um mamífero que sofre da ausência de estimulação do mesmo, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de um composto de qualquer uma das Fórmulas I-V, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou pró-droga do mesmo.
[038] Um aspecto adicional da invenção é o de fornecer um composto de qualquer uma das Fórmulas I-V, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou pró-droga do mesmo para o uso na estimulação da atividade de neurotrofina, ou de um receptor de neurotrofina.
[039] Um aspecto adicional da presente invenção é o de fornecer um método para estimular a atividade de receptor de neurotrofina em um sujeito com essa necessidade, compreendendo a administração de um composto de qualquer das Fórmulas I-V, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou pró-droga do mesmo para o sujeito. Em um exemplo de realização, o receptor de neurotrofina é o receptor TrkA, receptor trkB ou receptor p75.
[040] Um aspecto adicional da invenção é o de fornecer um método para o tratamento de uma doença responsiva à estimulação da atividade de fator de crescimento neural, ou um receptor de fator de crescimento neural em um mamífero que sofre da ausência de estimulação do mesmo, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de um composto de qualquer uma das Fórmulas I-V, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou pró-droga do mesmo.
[041] Um aspecto adicional da invenção é o de fornecer um composto de qualquer uma das Fórmulas I-V, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou pró-droga do mesmo para o uso na estimulação da atividade de fator de crescimento neural, ou um receptor de fator de crescimento neural.
[042] Um aspecto adicional da presente invenção é o de fornecer um método para estimular a atividade de receptor de fator de crescimento neural em um sujeito com essa necessidade, compreendendo a administração de um composto de qualquer das Fórmulas I-V, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou pró-droga do mesmo para o sujeito. Em um exemplo de realização, o receptor de fator de crescimento neural é o receptor TrkA ou o receptor p75.
[043] Um aspecto adicional da invenção é o de fornecer um método para o tratamento de uma doença que responde à estimulação da atividade de fator neurotrófico derivado do cérebro, ou do receptor de fator neurotrófico derivado do cérebro, em um mamífero que sofre da ausência de estimulação do mesmo, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz de um composto de qualquer uma das Fórmulas I-V, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou pró-droga do mesmo.
[044] Um aspecto adicional da invenção é o de fornecer um composto de qualquer uma das Fórmulas I-V, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou pró-droga do mesmo para o uso na estimulação da atividade de fator neurotrófico derivado do cérebro, ou de receptor de fator neurotrófico derivado do cérebro.
[045] Um aspecto adicional da presente invenção é o de fornecer um método para estimular a atividade de receptor de fator neurotrófico derivado do cérebro em um sujeito com essa necessidade, compreendendo a administração de um composto de qualquer das Fórmulas I-V, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou pró-droga do mesmo para o sujeito. Em um exemplo de realização, o receptor do fator neurotrófico derivado do cérebro é o receptor TrkB ou o receptor p75.
[046] Um aspecto adicional da presente invenção é de fornecer um método de preparação e composição farmacêutica, compreendendo a mistura em uma quantidade eficaz de um composto de qualquer das Fórmulas I-V, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo ou uma pró-droga do mesmo, com um veículo farmaceuticamente aceitável.
[047] Exemplos de realização adicionais e vantagens da invenção serão apresentados em parte na descrição a seguir, e decorrerão da descrição, ou podem ser aprendidos pela prática da invenção. Os exemplos de realização e as vantagens da invenção serão realizados e atingidos por meio dos elementos e combinações particularmente apontadas nas reivindicações anexas.
[048] Deve ser compreendido que tanto o resumo exposto acima como a descrição detalhada a seguir são apenas exemplificativos e elucidativos e não restringem ou limitam a invenção conforme reivindicado.
BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS
[049] A Fig. 1 exibe os resultados do Exemplo 2 sobre G79, G80 e G81 no ensaio de diferenciação dose-resposta em linhagem de células PC12. FIG. 1A. ilustra imagens de células PC12 diferenciadas na presença de G79. FIG. 1B. ilustra imagens de células PC12 diferenciadas na presença de G80. FIG. 1C. ilustra imagens de células PC12 diferenciadas na presença de G81. A Fig. 1D mostra o número de células diferenciadas no ensaio de diferenciação dose-resposta. A Fig. 1E mostra a percentagem de células diferenciadas calculada em relação à diferenciação induzida por NGF. Os dados são a média ± EPM de pelo menos três experimentos, cada um em duplicata.
[050] A Fig. 2 mostra os efeitos de G79, G80 e G81 na promoção da sobrevivência de células RN22. Estão representadas as médias ± DP de três experimentos, cada um em duplicatas. * p < 0,05, ** p < 0,01 (ANOVA) em relação ao controle de stress.
[051] A Fig. 3 ilustra os efeitos de G79, G80 e G81 no ensaio de atividade secretagoga (Fig. 3A), no ensaio de atividade sinergística (Fig. 3B), no ensaio de ativação de TrkA (Fig. 3C), no ensaio de inibição da sinalização na presença de LY294002 (Fig. 3D), e no ensaio de inibição da sinalização na presença de PD98059 (Fig. 3E). Fig. 3F-3J exibe os efeitos descritos na Fig. 3A-3E, respectivamente, como percentagens de células diferenciadas calculadas em relação à diferenciação induzida por NGF.
[052] A Fig. 4 ilustra os resultados de G79 em um modelo de glaucoma. Fig. 4A mostra a contagem das células ganglionares da retina para o controle, placebo, 200 μg/mI de NGF, 200 μg/ml de G79, e 400 μg/ml de G79. Fig. 4B mostra cortes de retina após o tratamento com controle, placebo, 200 μg/ml de NGF, 200 μg/mL de G79, e 400 μg/ml de G79. Fig. 4C mostra a contagem das células ganglionares da retina para o controle, placebo, 200 μg/ml de G79, Timolol, e 200 μg/ml de G79 e Timolol.
[053] A Fig. 5 representa os resultados de G79, G80, G81 no modelo da doença de Parkinson (Fig. 5A) e no modelo de stress oxidativo (Fig. 5B).
[054] A Fig. 6 ilustra as imagens fluorofóricas dos resultados da análise de Western blot de células PC12 tratadas com 100 ng/ml de G79.
[055] A Fig. 7 exibe a via intracelular ativada pela fosforilação do receptor tirosina-quinase (RTK).
[056] A Fig. 8 ilustra os efeitos de G79 e BDNF sobre os níveis de ativação das fosfoproteínas ATF-2, HSP-27, NK, e STAT-1 testados pela tecnologia Luminex.
[057] A Fig. 9 exibe os efeitos de G79 no ensaio de ligação por citometria do Exemplo 13. Fig. 9A exibe o canal médio de fluorescência (MCF) no ensaio de competição em PC12 (NGF/G79-FITC). Fig. 9B exibe o MCF no ensaio de competição em PC12 (NGF/G79-FITC) com anticorpo anti-TrkA. Fig. 9C exibe o MCF no ensaio de competição em PC12 (NGF/G79-FITC) com anticorpo anti-p76. Fig. 9D exibe o MCF no ensaio de competição em SH-SY5Y (BDNF/G79-FITC).
[058] A Fig. 10 ilustra os resultados de G79, G80 e G81 em modelo in vitro de esclerose lateral amiotrófica (ELA).
[059] A Fig. 11 exibe os resultados de G79, amida Gambogic e xaliprodeno na aplicação preventiva no modelo in vivo de MS após a administração i.p. de G79 ou amida Gambogic (Fig. 11 A) e após a administração oral de xaliprodeno (Fig. 11B).
[060] A Fig. 12 exibe os resultados de G79, amida Gambogic, e xaliprodeno na aplicação curativa no modelo in vivo de MS após a administração oral.
[061] A Fig. 13 representa os resultados do efeito de G79 na indução da enzima iNOS durante 48 horas.
[062] A Fig. 14 ilustra os resultados de G79 no modelo in vitro para neuroinflamação. A Fig. 14A mostra a produção de TNFα na cultura organotípica cerebelar e a Fig. 14B mostra a produção de IL-1β na cultura organotípica cerebelar.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
[063] Um aspecto da invenção baseia-se na utilização de compostos de Fórmulas I-V, e dos sais farmaceuticamente aceitáveis e pró- drogas destes, tais como agonistas de receptores de neurotrofinas, e especificamente de receptores de fator de crescimento neural (NGF), e receptores de fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF). Tendo em vista esta propriedade, os compostos de Fórmulas I-V, e os sais farmaceuticamente aceitáveis e pró-drogas dos mesmos, são úteis para a prevenção ou para o tratamento de doenças que respondem à estimulação de receptores de neurotrofinas, e especialmente do fator de crescimento neural ou de um receptor de fator de crescimento neural, ou do fator neurotrófico derivado do cérebro ou de um receptor de fator neurotrófico derivado do cérebro.
[064] Os compostos de qualquer uma das Fórmulas I-V apresentam uma boa atividade similar a NGF “in vitro” pela indução da diferenciação de células PC12 e promoção da sobrevivência celular de células RN22 e, consequentemente, têm propriedades neuroprotetoras.
[065] Os compostos úteis neste aspecto da invenção são os compostos representados pela Fórmula I:
Figure img0001
e os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos e pró-drogas dos mesmos, em que; R1 é fenila substituído por halogênio ou trifluorometila, e ainda opcionalmente substituído por um ou dois substituintes selecionados a partir do grupo que consiste em halogênio, alquila C1-C6, alcóxi C1- C6 e haloalquila C1- C6; ou R1 é pirrolidin-1-ila; R2 é 2-oxo-pirrolidin-1-ilmetila ou sulfamoilfenila; e R3 é escolhido dentre propila, 1-metiletila, butila, 2-metilpropila, pentila, 1-metilbutila, 2-metilbutila, hexila, 4-metilpentila, 3-metilpentila, 2- metilpentila e 1-metilpentila.
[066] Em um exemplo de realização, os compostos úteis na presente invenção são compostos de Fórmula I, em que R1 é fluorofenila. Em um exemplo de realização, o grupo fluorofenila é 2-fluorofenila, 3-fluorofenila ou 4-fluorofenila. Preferencialmente, R1 é 2-fluorofenila. Em um exemplo de realização, o grupo fluorofenila é adicionalmente substituído por um ou dois substituintes selecionados a partir do grupo constituído por halogênio, alquila C1-C6, alcóxi C1-C6, e haloalquila C1-C6, e mais preferencialmente por um ou dois substituintes selecionados a partir do grupo constituído por halogênio, alquila C1-C4, alcóxi C1-C4, e haloalquila C1-C4, mais preferencialmente por um ou dois substituintes selecionados a partir do grupo que consiste de halogênio, metila, etila, propila, isopropila, metóxi, etóxi, fiuorometila e trifluorometila.
[067] Em um exemplo de realização, os compostos úteis na presente invenção são compostos de Fórmula I, em que R1 é clorofenila. Em um exemplo de realização, o grupo clorofenila é 2-clorofenila, 3-clorofenila ou 4-clorofenila. Em um exemplo de realização, R1 é 2-clorofenila. Em um exemplo de realização, o grupo clorofenila é adicionalmente substituído por um ou dois substituintes selecionados a partir do grupo constituído por halogênio, alquila C1-C6, alcóxi C1-C6, e haloalquila C1-C6, e mais preferencialmente por um ou dois substituintes selecionados a partir do grupo constituído por halogênio, alquila C1-C4, alcóxi C1-C4, e haloalquila C1-C4, mais preferencialmente por um ou dois substituintes selecionados a partir do grupo que consiste de halogênio, metila, etila, propila, isopropila, metóxi, etóxi, fiuorometila e trifluorometila.
[068] Em um exemplo de realização, os compostos úteis na presente invenção são compostos de Fórmula I, em que R1 é bromofenila. Em um exemplo de realização, o grupo bromofenila é 2-bromofenila, 3-bromofenila ou 4-bromofenila. Em um exemplo de realização, R1 é 2-bromofenila. Em um exemplo de realização, o grupo bromofenila é adicionalmente substituído por um ou dois substituintes selecionados a partir do grupo constituído por halogênio, alquila C1-C6, alcóxi C1-C6, e haloalquila C1-C6, e mais preferencialmente por um ou dois substituintes selecionados a partir do grupo constituído por halogênio, alquila C1-C4, alcóxi C1-C4, e haloalquila C1-C4, mais preferencialmente por um ou dois substituintes selecionados a partir do grupo que consiste de halogênio, metila, etila, propila, isopropila, metóxi, etóxi, fiuorometila e trifluorometila.
[069] Em um exemplo de realização, os compostos úteis na presente invenção são compostos de Fórmula I, em que R1 é iodofenila. Em um exemplo de realização, o grupo iodofenila é 2-iodofenila, 3-iodofenila ou 4- iodofenila. Em um exemplo de realização, R1 é 2-iodofenila. Em um exemplo de realização, o grupo iodofenila é adicionalmente substituído por um ou dois substituintes selecionados a partir do grupo constituído por halogênio, alquila C1-C6, alcóxi C1-C6, e haloalquila C1-C6, e mais preferencialmente por um ou dois substituintes selecionados a partir do grupo constituído por halogênio, alquila C1-C4, alcóxi C1-C4, e haloalquila C1-C4, mais preferencialmente por um ou dois substituintes selecionados a partir do grupo que consiste de halogênio, metila, etila, propila, isopropila, metóxi, etóxi, fiuorometila e trifluorometila.
[070] Em um exemplo de realização, os compostos úteis na presente invenção são compostos de Fórmula I, em que R1 é trifluorometilfenila. Em um exemplo de realização, o grupo trifluorometilfenila é 2-trifluorometilfenila, 3-trifluorometilfenila ou 4-trifluorometilfenila. Compostos úteis incluem aqueles em que R1 é 2-trifluorometilfenila. Em um exemplo de realização, o grupo trifluorometilfenila é adicionalmente substituído por um ou dois substituintes selecionados a partir do grupo constituído por halogênio, alquila C1-C6, alcóxi C1-C6, e haloalquila C1-C6, e mais preferencialmente por um ou dois substituintes selecionados a partir do grupo constituído por halogênio, alquila C1-C4, alcóxi C1-C4, e haloalquila C1-C4, mais preferencialmente por um ou dois substituintes selecionados a partir do grupo que consiste de halogênio, metila, etila, propila, isopropila, metóxi, etóxi, fiuorometila e trifluorometila.
[071] Em um exemplo de realização, os compostos úteis na presente invenção são compostos de Fórmula I, em que R1 é pirrolidin-1-ila.
[072] Em um exemplo de realização, os compostos úteis na presente invenção são compostos de Fórmula I, em que R2 é 2-oxo-pirrolidin-1- il-metila.
[073] Em um exemplo de realização, os compostos úteis na presente invenção são compostos de Fórmula I, em que R2 é sulfamoilfenila. Em um exemplo de realização, o grupo sulfamoilfenila é 2-sulfamoilfenila, 3- sulfamoilfenila ou 4-sulfamoilfenila. Preferencialmente, R2 é 4-sulfamoilfenila.
[074] Em um exemplo de realização, os compostos úteis na presente invenção são compostos de Fórmula I, em que R3 é 2-metilpropila, possuindo a Fórmula II:
Figure img0002
e os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos e pró-drogas dos mesmos, em que R1 é e R2 são conforme definido acima para a Fórmula I.
[075] Em um exemplo de realização, os compostos úteis na presente invenção são os compostos de Fórmulas I-II, e os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos e as pró-drogas dos mesmos, em que R1 é 2-fluorofenila ou pirrolidin-1-ila, e R2 é 2-oxo-pirrolidin-1-ilmetila ou 4- sulfamoilfenil, como a seguir:
Figure img0003
[076] Os compostos preferidos de acordo com a presente invenção são os compostos de Fórmula I, representados por qualquer uma das seguintes Fórmulas III-V, e os sais farmaceuticamente aceitáveis e as pró- drogas dos mesmos:
[077] Fórmula III:
Figure img0004
[N-(2-(2'-Fluorofenil)etil)glicil]-[N-(2-metilpropil)glicil]-N-[3-(2'- oxopirrolidinil)propil]glicinamida (G79);
[078] Fórmula IV:
Figure img0005
VI [N-(2-(2'-Fluorofenil)etil)glicil]-[N-(2-metilpropil)glicil]-N-[2-(4'- sulfamoilfenil)etil]glicinamida (G80); e
[079] Fórmula V:
Figure img0006
[N-(2-(1-Pirrolidinil)etil)glicil]-[N-(2-metilpropil)glicil]-N-[2-(4'- sulfamoilfenil)etil]glicinamida (G81); e sais farmaceuticamente aceitáveis e pró-drogas dos mesmos;
[080] Em um exemplo de realização, o composto de Fórmula I é o composto de Fórmula III, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou uma pró- droga deste.
[081] Em um exemplo de realização, o composto de Fórmula I é o composto de Fórmula IV, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou uma pró- droga deste.
[082] Em um exemplo de realização, o composto de Fórmula I é o composto de Fórmula V, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou uma pró- droga deste.
[083] Grupos halogênio adequados incluem flúor, cloro, bromo e iodo.
[084] Grupos alquila úteis são selecionados a partir de grupos alquila C1-C6 de cadeia linear e ramificada, e mais preferencialmente de grupos alquila C1-C4 de cadeia linear e ramificada. Grupos alquila C1-C6 típicos incluem metila, etila, propila, isopropila, butila, sec-butila, terc-butila, iso-butila, 3-pentila, hexila, entre outros.
[085] Grupos halo alquila C1-C6 úteis incluem qualquer um dos grupos alquila C1-C6 mencionados acima substituídos por um ou mais átomos de flúor, cloro, bromo ou iodo (por exemplo, grupos fluorometila, difluorometila, trifluorometila, pentafluoroetila, 1,1-difluoroetila e triclorometila). Preferencialmente, o grupo halo alquila C1-C6 é trifluorometila.
[086] Grupos alcóxi C1-C6 úteis incluem oxigênio substituído por um dos grupos alquila C1-C6 mencionados acima (por exemplo, metóxi, etóxi, propóxi, iso-propóxi, butóxi, terc-butóxi, iso-butóxi, sec-butóxi, e pentilóxi).
[087] Verificou-se que os compostos de Fórmula III-V induzem a diferenciação de células PC12 e a sobrevivência celular de células R22 após a indução de stress. O mecanismo de ação dos compostos de Fórmulas III-V foi investigado. Consequentemente, o efeito dos compostos de Fórmulas III-V juntamente com NGF em cultura foi testado. Se os compostos funcionam como ligantes ou interferem na via induzida pelo NGF, eles podem inibir a atividade de NGF. Caso contrário, se os compostos produzem um efeito aditivo, eles podem trabalhar por meio de mecanismos paralelos. Como resultado, verificou- se que G79, G80 e G81 não produzem um efeito aditivo em combinação com NGF. Não há grande diferença no número de células diferenciadas no tratamento apenas com o composto em comparação com o tratamento combinado. Isto significa que os compostos de Fórmulas III-V agem na mesma via do NGF. A redução da resposta neurotrófico de NGF corresponde a um perfil de um agonista parcial de NGF.
[088] Para melhor compreender a ligação dos compostos de Fórmulas III-V na superfície celular, as células PC12 foram tratadas com NGF ou com os compostos na presença do anticorpo anti-TrkA que bloqueia o sítio de ligação do TrkA para o NGF no domínio extracelular. Portanto, se os peptidomiméticos exercem a sua atividade por meio da ativação no sítio de ligação, a presença deste anticorpo irá impedir a sua atividade. Caso contrário, se a atividade sobre a via de NGF é mantida, isso indicará que os peptidomiméticos de neurotrofina exercem suas atividades através da ativação de TrkA em outro ponto da molécula que não do sítio de ligação do TrkA. Os resultados demonstram que, embora a atividade neurotrófica do NGF foi reduzida pela adição do anticorpo anti-TrkA na cultura, a percentagem de diferenciação entre o tratamento com os compostos sozinhos ou com os compostos em combinação com o anticorpo não foi muito diferente. Isto pode sugerir que a atividade de compostos não é mediada pela ligação à porção extracelular de receptor TrkA. No entanto, este resultado não exclui que os compostos de Fórmulas III-V se ligam tanto a porção intracelular do TrkA como a outros membros da via de sinalização intracelular. Constatou-se também que o G79 compete com NGF e com BDNF pela ligação aos receptores de neurotrofinas. Este efeito pode ser devido à competição sobre o receptor p75, que é muito mais expresso na superfície celular das linhagens que foram usadas nos experimentos.
[089] A possibilidade de que os compostos de Fórmulas III-V podem atuar como secretagogos, induzindo os seus efeitos através da regulação positiva (up-regulation) da síntese de NGF também foi considerada. Verificou-se que, embora o tratamento do NGF em conjunto com o anticorpo anti-NGF induz uma redução na diferenciação de células PC12, não houve diferença significante na percentagem de diferenciação induzida por G79, G80 e G81, na presença do mesmo anticorpo em comparação com o tratamento com os compostos sozinhos. Por esta razão, G79, G80 e G81 e não agem como secretagogos.
[090] Para estudar o mecanismo de ação dos compostos de Fórmulas III-V, foi investigado se a atividade neurotrófica das moléculas depende da ativação de AKT e ERK, as duas principais vias de sinalização do TrkA. Verificou-se que o tratamento com NGF em combinação com os inibidores LY294002 ou PD98059 reduz a percentagem de diferenciação de células PC12 em comparação com o tratamento apenas com NGF, e também a percentagem de diferenciação com G79, G80 e G81, em combinação com os inibidores é reduzida em comparação com o tratamento com os compostos sozinhos.
[091] Como conclusão, as moléculas pequenas similares a NGF (NGF-like) da presente invenção induzem a diferenciação sem ativar a síntese de NGF. Eles também atuam através da ativação das vias PI3K/Akt e MAPK/ERK TrkA sem se ligarem à porção extracelular de TrkA.
[092] A capacidade de os compostos de Fórmula III-V ativar as vias de neurotrofinas foi testada em ensaios de diferenciação na presença de inibidores das vias PI3K e MAPkinase juntamente com os ensaios Luminex. De acordo com os resultados, os compostos G79, G80 e G81 ativam a via da neurotrofina. Por exemplo, as proteínas de choque térmico, tais como HSP-27, podem ser ativadas por diferentes agentes e fatores neurotróficos (Liu H. et al, J Neurochem, 86, 1553-1563, 2003; Yuan Y. et al, Eur. J. Pharmacol. 586, 100105, 2008; O'Reilly A.M. et al, Mol Neurobiol, 42, 124-132, 2010). Os testes realizados demonstram que a HSP-27 é significativamente ativada após a estimulação in vitro com G79, de forma similar ao NGF.
[093] O efeito dos compostos de Fórmula III-V sobre modelos in vivo e in vitro de doenças neurodegenerativas também foi testado. O efeito neuroprotetor do G79 nos modelos in vitro de PD, ELA e neuroinflamação foi demonstrado. Além disso, o composto G79 mostrou efeito benéfico in vivo nos modelos animais de MS e glaucoma, melhorando a pontuação clínica dos animais afetados pela EAE e reduzindo a morte celular de RGC em olhos glaucomatosos. A penetração através da barreira hemato-encefálica (BHE) dos compostos de Fórmula III-V também foi testada. De acordo com os resultados, o G79 apresenta melhor penetração através da BHE por transporte ativo, explicando o seu melhor perfil em comparação ao G80 e G81. Esta forma de transporte garante uma entrega mais específica da droga e permanência no interior do cérebro, em comparação com o transporte passivo.
[094] Em conclusão, os resultados mostram que as moléculas similares a neurotrofina (neurotrofina-like) podem proporcionar uma boa estratégia terapêutica para ultrapassar os problemas de entrega de neurotrofinas ao cérebro, preservando, e até mesmo melhorando, os efeitos benéficos das próprias neurotrofinas para o tratamento de doenças neurodegenerativas.
[095] O termo “pró-droga”, conforme utilizado no presente, inclui qualquer composto derivado dos compostos de qualquer uma das Fórmulas IV, por exemplo, um éster, amida, fosfato, etc, que, depois de ser administrado a um indivíduo, é capaz de fornecer o compostos de qualquer uma das Fórmulas I-V ou os sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos, de maneira direta ou indireta, ao referido indivíduo. Preferencialmente, o referido derivado é um composto que aumenta a biodisponibilidade dos compostos de qualquer uma das Fórmulas I-V, quando administrado a um indivíduo ou que promove a libertação de compostos de qualquer uma das Fórmulas I-V em um compartimento biológico. A natureza do referido derivado não é crítica, desde que possa ele possa ser administrado a um indivíduo, e que forneça os compostos de qualquer uma das Fórmulas I-V em um compartimento biológico do indivíduo. A preparação da referida pró-droga pode ser realizada por métodos convencionais conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto. Os procedimentos convencionais para a seleção e preparação de derivados de pró-drogas adequados estão descritos, por exemplo, em Design of Prodrugs, H. Bundgaard ed., Elsevier (1985). Um exemplo de pró-droga dos compostos de qualquer uma das Fórmulas I-V pode ser a o encapsulamento destes em lipossomas. Por meio deste procedimento, o peptoide é tratado com o lipossomo precursor apropriado (combinação de uma lecitina similar ao fosfolipídio, colesterol e água), a fim de ser encapsulado. Dependendo da lipofilia do peptóide, o composto será retido na parte lipofílica do lipossomo ou na parte aquosa interna. Com relação ao polímero terapêutico, o peptoide poderia ser acoplado ao polímero por meio de ligações covalentes criadas após a hidrólise regiosseletiva da extremidade carboxamida. Esta hidrólise resulta em um ácido carboxílico livre, que pode ser condensado com um grupo amino ou hidroxila ativado do polímero.
[096] O termo “farmaceuticamente aceitável” significa que um composto ou combinação de compostos é suficientemente compatível com os outros ingredientes da formulação e não é prejudicial para o paciente nos níveis aceitáveis para os padrões da indústria.
[097] Para uso terapêutico, os sais dos compostos de qualquer uma das Fórmulas I-V são aqueles em que o contra-íon é farmaceuticamente aceitável.
[098] O termo “sal” conforme mencionado no presente, destina- se a incluir quaisquer sais estáveis que os compostos de qualquer uma das Fórmulas I-V são capazes de formar. Preferem-se os sais farmaceuticamente aceitáveis. Os sais que não são farmaceuticamente aceitáveis também estão abrangidos pelo escopo da presente invenção, visto que eles se referem a intermediários que podem ser úteis na preparação de compostos com atividade farmacológica.
[099] Os sais podem ser convenientemente obtidos pelo tratamento na forma base dos compostos de qualquer uma das Fórmulas I-V com ácidos apropriados, tais como ácidos inorgânicos, por exemplo, ácido clorídrico ou bromídrico, sulfúrico, nítrico, fosfórico e ácidos similares; ou ácidos orgânicos, por exemplo, ácido acético, propanóico, hidroxiacético, láctico, pirúvico, oxálico (ou seja, etanodióico), malônico, succínico (ou seja, ácido butanodióico), maleico, fumárico, málico (ou seja, ácido hidroxibutanodióico), tartárico, cítrico, metanossulfônico, etanossulfônico, benzenossulfônico, p- toluenossulfônico, ciclâmico, salicílico, p-aminossalicílico, pamóico e ácidos similares.
[0100] Os sais farmaceuticamente aceitáveis podem ser obtidos pelo tratamento na forma de base dos compostos de qualquer uma das Fórmulas I-V com tais ácidos farmaceuticamente aceitáveis adequados como ácidos inorgânicos, por exemplo, incluindo o ácido bromídrico, ácido clorídrico e semelhantes, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico e semelhantes; ou ácidos orgânicos, por exemplo, ácido acético, propanóico, hidroxiacético, 2- hidroxipropanóico, 2-oxopropanoico, oxálico, malônico, succínico, maleico, fumárico, málico, tartárico, 2-hidróxi-1,2,3-propano-tricarboxílico, metanossulfônico, etanossulfônico, benzenossulfônico, 4-metilbenzeno- sulfônico, ciclo-hexanossulfâmico, 2-hidroxibenzóico, 4-amino-2- hidroxibenzóico e ácidos semelhantes.
[0101] Inversamente, a forma sal pode ser convertida pelo tratamento com alcali na forma de base livre.
[0102] O termo “composição farmacêutica” significa para os propósitos da presente invenção, qualquer composição que compreenda como composto ativo, ao qual é atribuído, totalmente ou em parte, o efeito terapêutico (por exemplo, produtos farmacêuticos), pelo menos um dos compostos da invenção ou combinações dos mesmos, e que pode, opcionalmente, compreender ainda pelo menos um ingrediente farmaceuticamente aceitável não ativo, tal como um excipiente, veículo e etc.
[0103] O termo “prevenção” refere-se a evitar a ocorrência, existência, ou alternativamente, retardar o aparecimento ou recorrência de uma doença, distúrbio ou condição para o qual tal termo se aplica, ou de um ou mais sintomas associados com uma doença, distúrbio ou condição. O termo “evitar” refere-se ao ato de prevenir, tal como o termo "prevenção"definido imediatamente acima.
[0104] O termo “tratar”, conforme utilizado no presente, refere-se a reverter, aliviar ou inibir o progresso do distúrbio ou condição ao qual o termo se aplica, ou de um ou mais sintomas desses distúrbios ou condições. O termo “tratamento” refere-se ao ato de tratar, tal como o termo "tratar" definido imediatamente acima.
[0105] O termo “sujeito” significa animais, particularmente mamíferos, tais como cães, gatos, vacas, cavalos, ovelhas, gansos e humanos. Particularmente os sujeitos preferidos são mamíferos, incluindo humanos de ambos os sexos.
[0106] Uma “quantidade eficaz” dos compostos de qualquer uma das Fórmulas I-V e os sais farmaceuticamente aceitáveis ou pró-drogas dos mesmos, podem estar na faixa de 0,01 mg até 50 g por dia, de 0,02 mg a 40 g por dia, de 0,05 mg a 30 g por dia, de 0,1 mg a 20 g por dia, de 0,2 mg a 10 g por dia, de 0,5 mg a 5 g por dia, de 1 mg a 3 g por dia, de 2 mg a 2 g por dia, de 5 mg a 1, 5 g por dia, de 10 mg a 1 g por dia, de 10 mg a 500 mg por dia.
[0107] As células nervosas incluem as células de qualquer região do cérebro, medula espinhal, nervo óptico, retina e gânglios periféricos. Neurônios incluem aqueles embrionários, de tecido neural fetal ou adulto, incluindo o tecido do hipocampo, cerebelo, medula espinal, córtex (por exemplo, córtex motor ou somatossensorial), corpo estriado, prosencéfalo basal (neurônios colinérgicos), mesencéfalo ventral (células da substância nigra), e o locus coeruleus (cerúleo) (células com neuroadrenalina do sistema nervoso central).
[0108] A invenção também diz respeito à utilização dos compostos de qualquer uma das Fórmulas I-V, e os sais farmaceuticamente aceitáveis e pró-drogas dos mesmos, como ingredientes ativos na fabricação de medicamentos para a prevenção ou tratamento da morte ou danos de células nervosas. Em outras palavras, a presente invenção está relacionada com os compostos de qualquer uma das Fórmulas I-V, e os sais farmaceuticamente aceitáveis e pró-drogas dos mesmos, para a utilização na prevenção ou no tratamento da morte ou de danos das células nervosas. Do mesmo modo, a presente invenção refere-se a um método de neuroproteção, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz a um sujeito com tal necessidade de um composto de qualquer das Fórmulas I-V, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou pró-droga do mesmo.
[0109] Em um exemplo de realização da presente invenção, os compostos de qualquer uma das Fórmulas I-V, e os sais farmaceuticamente aceitáveis e pró-drogas dos mesmos, podem ser utilizados para a prevenção ou tratamento de uma ou mais, de preferência duas ou mais, condições patológicas ou nocivas relacionadas com a morte celular ou danos de células nervosas, selecionadas dentre, mas não se limitando a, substâncias químicas, tais como condições de estresse oxidativo, substâncias tóxicas, organismos infecciosos, radiação, lesões traumáticas, hipóxia, isquemia, proteínas anormais enoveladas erroneamente, excitotoxinas, radicais livres, estressores do retículo endoplasmático, estressores da mitocôndria incluindo, mas não se limitando a, inibidores da cadeia de transporte de elétrons, antagonistas do aparelho de Golgi, dano ou perda axonal, desmielinização, inflamação, explosão neuronal patológica (convulsões). Também de preferência, os usos e os métodos da presente invenção são direcionados para prevenir ou tratar a morte ou danos de células nervosas, independentemente da causa.
[0110] Os termos “neuroproteção”, “neuroprotetor”, ou “efeito neuroprotetor” referem-se à capacidade de evitar ou reduzir a morte ou dano de células nervosas, incluindo neurônios e células da glia, ou resgatar, ressuscitar ou revitalização células nervosas, por exemplo, após as condições patológicas ou prejudiciais para o cérebro, sistema nervoso central ou sistema nervoso periférico. Assim, este efeito neuroprotetor compreende a conferencia da capacidade das células neuronais manterem ou recuperarem as funções neuronais. Ele estabiliza a membrana celular de uma célula neuronal ou auxilia na normalização das funções celulares neuronais. Ele impede a perda de viabilidade ou das funções das células neuronais. Ele compreende a inibição da deterioração progressiva dos neurônios, que leva à morte celular. E refere- se a qualquer proteção detectável de neurônios a partir do estresse. A neuroproteção inclui a regeneração de células nervosas, ou seja, a recrescimento de uma população de células nervosas após a doença ou traumatismo.
[0111] Atualmente, a maioria das doenças neurológicas e psiquiátricas carece de tratamentos específicos que visam parar ou a melhorar o curso da doença, que são denominados de “drogas modificadoras da doença”. Isto contrasta com as terapias sintomáticas que são comuns para tais doenças, mas não alteram o curso da doença. Um arraste neuroprotetor é uma droga modificadoras da doença (DMD) para o tratamento de doenças cerebrais,
[0112] Como tal, em um exemplo de realização, a presente invenção está relacionada à utilização dos compostos de qualquer uma das Fórmulas I-V, e os sais farmaceuticamente aceitáveis e pró-drogas dos mesmos, como ingredientes ativos na fabricação de um medicamento para a regeneração das células nervosas. Em outras palavras, a presente invenção está relacionada com os compostos de qualquer uma das Fórmulas I-V, e os sais farmaceuticamente aceitáveis e pró-drogas dos mesmos, para a utilização na regeneração de células nervosas. Do mesmo modo, a presente invenção refere-se a um método de regeneração de células nervosas, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz a um sujeito com tal necessidade de um composto de qualquer das Fórmulas I-V, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou pró-droga do mesmo.
[0113] A neuroproteção pode ser determinada diretamente, por exemplo, mensurando o atraso ou prevenção da morte neuronal, tal como, por exemplo, por uma redução no número de neurônios apoptóticos em culturas cerebrocorticais após estresse. A neuroproteção pode também ser determinada diretamente, por exemplo, mensurando a gravidade ou o grau de dano ou perda funcional por um tecido ou órgão do sistema nervoso após um estresse, tal como, por exemplo, pela medição de uma diminuição no tamanho de infartos cerebrais após a oclusão da artéria cerebral média (OACM), ou lesão de reperfusão. Além disso, a neuroproteção pode ser identificada por ressonância magnética (medição do volume cerebral, tratografia, níveis de N- acetil-aspartato por espectroscopia, tomografia de coerência óptica). Alternativamente, a neuroproteção pode ser determinada indiretamente pela detecção da ativação de um ou mais mecanismos biológicos para proteger neurônios, incluindo, mas não se limitando a, detecção da ativação da via eapl/Nrf2 ou indução de uma ou mais enzimas de fase 2, incluindo mas não se limitando à hemeoxigenase-1 (HO-1). Os métodos de detecção e medição da proteção neuronal são fornecidos nos Exemplos abaixo, e outros métodos para esse fim são conhecidos no estado da técnica.
[0114] Os diversos usos e métodos que empregam os compostos de qualquer uma das Fórmulas I-V, e os sais farmaceuticamente e/ou pró- drogas dos mesmos, compreendem na presente invenção a administração aguda, ou seja, que ocorre dentro de alguns minutos a cerca de várias horas a partir da lesão, ou a administração crônica, adequada para doenças neurológicas ou psiquiátricas crônicas.
[0115] Em um exemplo de realização da presente invenção, os diversos usos e métodos de neuroproteção ou de prevenção ou tratamento da morte ou dano de células nervosas, os compostos de qualquer uma das Fórmulas I-V, e os sais farmaceuticamente aceitáveis e pró-drogas dos mesmos, são administrados a um sujeito com uma doença neurológica ou psiquiátrica.
[0116] As doenças neurológicas são distúrbios do sistema nervoso central e periférico, incluindo distúrbios do cérebro, medula espinal, nervos cranianos, nervos periféricos, raízes nervosas, sistema nervoso autônomo, junção neuromuscular, e músculo.
[0117] Doenças do sistema nervoso central e periférico, que pode ser objeto de prevenção e/ou tratamento de acordo com a presente invenção incluem, mas não estão limitadas a, como conhecimento em manifestações clínicas avançadas, ausência de septo pelúcido, doença da Lipase Ácida, deficiência da Maltase Ácida, afasia epilética adquirida, encefalomielite disseminada aguda, pupila de Adie, síndrome de Adie, adrenoleucodistrofia, agenesia do corpo caloso, Agnosia, síndrome de Aicardi, distúrbio pela síndrome de Aicardi-Goutieres, complicações neurológicas decorrentes da AIDS, doença de Alexander, doença de Alpers, hemiplegia alternada, doença de Alzheimer, Esclerose Lateral Amiotrófica, Anencefalia, Aneurisma, síndrome de Angelman, Angiomatose, anoxia, síndrome antifosfolípide, afasia, apraxia, cistos aracnóides, aracnoidite, malformação de Arnold-Chiari, malformação arteriovenosa, síndrome de Asperger, ataxia, ataxia telangiectasia, ataxia e degeneração cerebelar ou espinocerebelar, fibrilação atrial e AVC, déficit de atenção e distúrbio da hiperatividade (ADHD), autismo, disfunção autonômica, dor nas costas, síndrome de Barth, doença de Batten, miotonia de Becker, doença de Behçet, paralisia de Bell, blefaroespasmo essencial benigno, amiotrofia focal benigna, hipertensão intracraniana benigna, síndrome de Bernhardt-Roth, doença de Binswanger, blefarospasmo, síndrome de Bloch- Sulzberger, Traumatismos do plexo braquial ao nascimento, lesões do plexo braquial, síndrome de Bradbury-Eggleston, tumores cerebrais e da coluna vertebral, aneurisma cerebral, infarto cerebral, isquemia cerebral, lesão cerebral, síndrome de Brown-Sequard, Atrofia Muscular bulboespeinhal, CADASIL, doença de Canavan, síndrome do Túnel do Carpo, causalgia, cavernomas, angioma cavernoso, malformação cavernosa, síndrome cervical medular central, síndrome medular central, síndrome da dor central, mielinólise pontina central, distúrbios cefálicos, deficiência de ceramidase, degeneração cerebelar, hipoplasia cerebelar, aneurisma cerebral, arteriosclerose cerebral, atrofia cerebral, beribéri cerebral, malformação cavernosa cerebral, gigantismo cerebral, hipóxia cerebral, paralisia cerebral, síndrome cérebro-óculo-facio- esquelético, doença de Charcot-Marie-Tooth, malformação de Chiari, doença do armazenamento de éster de colesterol, coréia, coréia-acantocitose, Polineuropatia desmielinizante inflamatória crônica (PDIC), intolerância ortostática crônica, dor crônica, síndrome de Cockayne tipo II, síndrome de Coffin Lowry, COFS, colpocefalia, coma. Síndrome complexa de dor regional, diplegia facial congênita, Miastenia Congênita, miopatia congênita, malformações cavernosas vasculares congênitas, degeneração corticobasal, arterite craniana, craniossinostose, doença de Creutzfeldt-Jakob, distúrbio por traumas cumulativos, Síndrome de Cushing, Doença de corpo de inclusão citomegálica, infecção por citomegalovírus, síndrome dos olhos e pés dançantes, síndrome de Dandy-Walker, doença de Dawson, síndrome de De Morsier, estimulação cerebral profunda para doença de Parkinson, paralisia de Dejerine-Klumpke, demência, demência-multi-infarto, demência semântica, demência subcortical, demência com corpos de Lewy, ataxia cerebelosa denteada, atrofia dentatorubral, dermatomiosite, desenvolvimento de dispraxia, síndrome de Devic, neuropatia diabética, esclerose difusa, síndrome de Dravet, Disautonomia, Disgrafia, Dislexia, disfagia, dispraxia, dissinergia cerebelar miolônica, dissinergia cerebelar progressiva, distonias, encefalopatia epiléptica infantil precoce, síndrome da sela vazia, encefalite, encefalite letárgica, encefaloceles, encefalopatia, encefalopatia infantil familiar, linfocitose no fluido cerebrospinal crônica e com calcificação intracraniana; encefalite de Cree; síndrome de pseudo-Torch, síndrome de pseudotoxoplasmose, angiomatose encefálica, epilepsia, hemiplegia epilética, paralisias de Erb-Duchenne e Dejerine-Klumpke, paralisia de Erb, tremor essencial, mielinólise extrapontina, Doença de Fabry, síndrome de Fahr, desmaios, disautonomia familiar, hemangioma familiar, calcificação de gânglio basal idiopática familiar, paralisia periódica familiar, paralisia espástica familiar, doença de Farber, convulsões febris, displasia fibromuscular, síndrome de Fisher, síndrome da criança hipotônica, pé caído, ataxia de Friedreich, demência frontotemporal, Gangliosidoses, Doença de Gaucher, Síndrome de Gerstmann, doença de Gerstmann-Straussler-Scheinker, neuropatia axonal gigante, arterite de células gigantes, doença de inclusão de células gigantes, leucodistrofia de células globóides, neuralgia do glossofaríngeo, doença do depósito de glicogênio, síndrome de Guillain-Barre, Doença de Hallervorden-Spatz, lesão na cabeça, dor de cabeça, Hemicrania Continua, espasmo hemifacial, hemiplegia alternante, neuropatias hereditárias, paraplegia espástica hereditária, heredopatia polineuritiforme atatica, Herpes Zoster, Herpes Zoster Oticus, síndrome de Hirayama, síndrome de Holmes-Adie, holoprosencefalia, mielopatia associada ao HTLV-1, síndrome de Hughes, doença de Huntington, hidranencefalia, hidrocefalia, hidrocéfalo com pressão normal, hidromielia, hipercortisolismo, hipersonia, hipertonia Hipotonia, hipóxia, encefalomielite imunomediada, miosite de corpos de inclusão, incontinência pigmentar, hipotonia infantil, distrofia neuroaxonal infantil, doença de armazenamento ácido pitânico infantil, doença de Refsum Infantil, espasmos infantis, miopatias inflamatórias, anencefalia, lipodistrofia intestinal, cistos intracranianos, hipertensão intracraniana, síndrome de Isaac, síndrome de Kearns-Sayre, doença de Kennedy, síndrome de Kinsbourne, síndrome de Kleine-Levin, síndrome de Klippel-Feil, síndrome de Klippel-Trenaunay (KTS), síndrome de Kliiver-Bucy, amnésica de Korsakoff, doença de Krabbe, doença de Kugelberg- Welander, Kuru, síndrome miastênica de Lambert-Eaton, síndrome de Landau- Kleffher, compressão do nervo femoral lateral cutâneo, síndrome medular lateral, dificuldades de aprendizagem, doença de Leigh, síndrome de Lennox- Gastaut, síndrome de Lesch-Nyhan, Leucodistrofia, síndrome de Levine- Critchley, demência com corpos de Lewy, doenças de armazenamento de lipídios, lipoidoproteinose, lisencefalia, síndrome do encarceramento, doença de Lou Gehrig, sequelas neurológicas decorrentes do Lúpus, complicações neurológicas decorrentes da doença de Lyme, doença de Machado-Joseph, macroencefalia, megalencefalia, síndrome de Melkersson-Rosenthal, meningite, meningite e encefalite, doença de Menkes, meralgia parestésica, leucodistrofia metacromática, microcefalia, enxaqueca, síndrome de Miller Fisher, comprometimento cognitivo leve, mini-AVC, miopatias mitocondriais, síndrome de Moebius, amiotrofia monomélica, doenças do neurônio motor, doença de Moyamoya, mucolipídeoses, mucopolissacaridoses, neuropatia motora multifocal, demência decorrente de multi-infartos, esclerose múltipla, atrofia de múltiplos sistemas, atrofia de múltiplos sistemas com hipotensão ortostática, distrofia muscular, miastenia congênita, miastenia gravis, esclerose difusa mielinoclástica, encefalopatia mioclônica neonatal, mioclonia, miopatia, miopatia - miopatia congênita - tireotóxica, miotonia, miotonia congênita, narcolepsia, neuroacantocitose, neurodegeneração com acúmulo cerebral de ferro, neurofibromatose, síndrome neuroléptica maligna, complicações neurológicas da AIDS, complicações neurológicas da doença de Lyme, consequências neurológicas da infecção por citomegalovírus, manifestações neurológicas da doença de Pompe, sequela neurológica do lúpus, neuromielite óptica, neuromiotonia, lipofuscinose ceróide neuronal, transtornos da migração neuronal, neuropatia - neurosarcoidoses hereditárias, neurotoxicidade, nervo cavernoso, doença de Niemann-Pick, hidrocefalia de pressão normal, neuralgia occipital, síndrome de Ohtahara, atrofias olivopontocerebelares, opsoclonia- mioclonia, hipotensão ortostática, síndrome de O'Sullivan -McLeod, síndrome do uso excessivo, dor crônica, neurodegeneração associada à pantotenato quinase, síndromes paraneoplásicas, parestesia, doença de Parkinson, coreoatetose paroxística, hemicrania paroxística, doença de Parry-Romberg, doença de Pelizaeus-Merzbacher, síndrome de Pena Shokeir II, cistos perineurais, paralisias periódicas, neuropatia periférica, LPV, estado vegetativo persistente, transtornos invasivos do desenvolvimento, doença de armazenamento do ácido pitânico, doença de Pick, nervo comprimido, síndrome piriforme, tumores hipofisários, polimiosite, doença de Pompe, porencefalia, neuralgia pós-herpética, encefalomielite pós-infecciosa síndrome pós-poliomielite, hipotensão postural, síndrome de taquicardia postural ortostática, síndrome de taquicardia postural, atrofia dentatum primária, esclerose lateral primária, afasia progressiva primária, doenças causadas por príons, atrofia hemifacial progressiva, ataxia locomotora progressiva, leucoencefalopatia multifocal progressiva, poliodistrofia esclerosante progressiva, paralisia supranuclear progressiva, prosopagnosia, pseudotumor cerebral, síndrome de Ramsay Hunt I (anteriormente conhecido como dissinergia cerebellaris mioclônica, dissinergia cerebellaris progressiva, degeneração dentatorubral, ou síndrome cerebelar de Ramsey Hunt), Síndrome de Ramsay Hunt II (anteriormente conhecida como herpes zoster oticus), encefalite de Rasmussen, Síndrome da Distrofia Reflexa Simpática, doença de Refsum, doença de Refsum - Infantil, transtornos do movimento repetitivo, lesões por esforço repetitivo, síndrome das pernas inquietas, mielopatia associada a retrovírus, síndrome de Rett, síndrome de Reye, encefalite reumática, síndrome de Riley-Day, cistos da raiz sacral nervosa, dança-de-são-vito, doença da glândula salivar , doença de Sandhoff, doença de Schilder, esquizencefalia, doença de Seitelberger, transtorno da apreensão, demência semântica, displasia septo-óptica, epilepsia mioclônica grave da infância (SMEI), síndrome do bebê chacoalhado, herpes, síndrome de Shy- Drager, síndrome de Sjogren, apnéia do sono, doença do sono, síndrome de sotos, espasticidade, espinha bífida, infarto medular, lesão medular, tumores da medula espinhal, atrofia muscular espinhal, atrofia espinocerebelar, degeneração espinocerebelar, Steele-Richardson-Olszewski, síndrome de Stiff-Person, síndrome da degeneração estriatonigral, AVC, síndrome de Sturge- Weber, panencefalite esclerosante subaguda, encefalopatia arteriosclerótica subcortical, dor de cabeça SUNCT, distúrbios da deglutição, coréia de Sydenham, Síncope, esclerose espinhal sifilítica, hidrossiringomielia, siringomielia, Lúpus Eritematoso Sistêmico, tabes dorsalis, discinesia tardia, cistos de Tarlov, doença de Tay-Sachs, arterite temporal, síndrome da medula presa, miotonia de Thomsen, síndrome do desfiladeiro torácico, miopatia tireotóxica, tique doloroso, paralisia de Todd, síndrome de Tourette, ataque isquêmico transitório, encefalopatias espongiformes transmissíveis, mielite transversa, lesão cerebral traumática, tremor, neuralgia do trigêmeo, paraparesia espástica tropical, síndrome de Troyer, esclerose tuberosa, tumor eréctil vascular, síndromes de vasculites dos Sistemas nervoso central e periférico, doença de Von Economo, doença de Von Hippel-Lindau (VHL), doença de Von Recklinghausen, síndrome de Wallenberg, doença de Werdnig- Hoffman, doença de Wernicke-Korsakoff, síndrome de West, lesão por golpe de chicote cervical (whiplash), doença de Whipple, síndrome de Williams, doença de Wilson, doença de Wolman, atrofia espinhal e bulbar muscular associada ao X, síndrome de Zellweger, neurite óptica, síndrome da fadiga crônica, fibromialgia, doenças psiquiátricas como transtornos de humor, depressão maior, síndrome bipolar, psicose, esquizofrenia, transtorno obsessivo-compulsivo e etc., doenças causadas pelo abuso de drogas ou tóxicos, tais como alcoolismo e abuso de drogas, encefalopatia como a encefalopatia hepática.
[0118] Transtornos psiquiátricos, que podem ser objetos de prevenção e/ou tratamento de acordo com a invenção incluem aqueles listados pelo Manual Diagnóstico e Estatístico de Transtornos Mentais, quarta edição (DSM-IV), publicado pela Associação Americana de Psiquiatria, e abrange todos os distúrbios da saúde mental para crianças e adultos. Em particular, os transtornos psiquiátricos incluem um distúrbio selecionado a partir do: Transtorno de Estresse Agudo; transtorno de ajustamento não especificado; transtorno de ajustamento com ansiedade, transtorno de ajustamento com humor deprimido; transtorno de ajustamento com distúrbio de conduta; transtorno de ajustamento misto de ansiedade e depressão; transtorno de ajustamento com perturbação mista das emoções e conduta; agorafobia sem história de transtorno do pânico, anorexia nervosa, transtorno da personalidade antissocial; transtorno de ansiedade devido a condição médica; transtorno de ansiedade, SOE; transtorno da personalidade esquiva; transtorno bipolar; transtorno bipolar I, episódio mais recente depressivo, remissão; transtorno bipolar I; episódio mais recente depressivo em remissão parcial; transtorno bipolar I, episódio mais recente depressivo, leve; transtorno bipolar I, episódio mais recente depressivo, moderado; transtorno bipolar I, episódio mais recente depressivo, severo com aspectos psicóticos; transtorno bipolar I, episódio mais recente depressivo, severo sem aspectos psicóticos; transtorno bipolar I, episódio mais recente depressivo, não especificado; transtorno bipolar I, episódio mais recente maníaco, em remissão completa; transtorno bipolar I, episódio mais recente maníaco, em remissão parcial; transtorno bipolar I, episódio mais recente maníaco, leve; transtorno bipolar I, episódio mais recente maníaco, moderado; transtorno bipolar I, episódio mais recente maníaco, severo com aspectos psicóticos; transtorno bipolar I, episódio mais recente maníaco, severo sem psicose característica; transtorno bipolar I, episódio mais recente maníaco, não especificado; transtorno bipolar I, episódio mais recente misto, em remissão completa; transtorno bipolar I, episódio mais recente misto, em remissão parcial; transtorno bipolar I, episódio mais recente misto, leve; transtorno bipolar I, episódio mais recente misto, moderado; transtorno bipolar I, episódio mais recente misto, severo com aspectos psicóticos; transtorno bipolar I, episódio mais recente misto, severo sem aspectos psicóticos; transtorno bipolar I, episódio mais recente misto, não especificado; transtorno bipolar I, episódio mais recente não especificado; transtorno bipolar I, episódio mais recente hipomaníaco; transtorno bipolar I, episódio maníaco único, em remissão completa; transtorno bipolar I, episódio maníaco único, em remissão parcial; transtorno bipolar I, episódio maníaco único, leve; transtorno bipolar I, episódio maníaco único, moderado; transtorno bipolar I, episódio maníaco único, severo com aspectos psicóticos; transtorno bipolar I, episódio maníaco único, severo sem aspectos psicóticos; transtorno bipolar I, episódio maníaco único, não especificado; transtorno bipolar II; amnésia dissociativa; transtorno dismórfico corporal; transtorno de personalidade borderline (ou Transtorno de Personalidade Emocionalmente Instável); transtorno do sono relacionado à respiração; transtorno psicótico breve, bulimia nervosa, transtorno do sono do ritmo circadiano; transtorno de conversão; transtorno ciclotímico; transtorno delirante, transtorno da personalidade dependente; transtorno de despersonalização; transtorno depressivo SOE; amnésia dissociativa; transtorno dissociativo SOE; fuga dissociativa; transtorno dissociativo de identidade; dispareunia; dissonia SOE; dissonia relacionada a outro transtorno; transtorno distímico; transtorno alimentar; exibicionismo; dispareunia feminina devido a condição médica; transtorno de desejo sexual hipoativo feminino devido a condição médica; transtorno orgásmico feminino; transtorno da excitação sexual feminina; fetichismo, frotteurismo; transtorno de identidade de gênero em adolescentes ou adultos; transtorno de identidade de gênero na infância; transtorno de identidade de gênero SOE; transtorno de ansiedade generalizada, transtorno da personalidade histriônica; transtorno de desejo sexual hipoativo; hipocondria; transtorno de impulso-controle; insônia relacionada a outro transtorno; transtorno explosivo intermitente; cleptomania; transtorno depressivo maior, recorrente, em remissão completa, transtorno depressivo maior, recorrente, em remissão parcial; transtorno depressivo maior, recorrente, leve; transtorno depressivo maior, recorrente, moderado; transtorno depressivo maior, recorrente, severo com aspectos psicóticos; transtorno depressivo maior, recorrente, severo sem aspectos psicóticos; transtorno depressivo maior, recorrente, não especificado; transtorno depressivo maior, de episódio único, em remissão completa; transtorno depressivo maior, em episódio único, em remissão parcial; transtorno depressivo maior, em episódio único, leve; transtorno depressivo maior, em episódio único, moderado; transtorno depressivo maior, em episódio único, severo com aspectos psicóticos; transtorno depressivo maior, em episódio único, severo sem aspectos psicóticos; transtorno depressivo maior, em episódio único , não especificado; pesadelo; dispareunia masculina devido a condição médica; transtorno erétil masculino; transtorno erétil masculino devido a condição médica; transtorno de desejo sexual hipoativo masculino devido a condição médica; transtorno orgásmico masculino; transtorno de humor devido a condição médica; transtorno da personalidade narcisista; narcolepsia; transtorno do pânico, transtorno obsessivo compulsivo, transtorno obsessivo- compulsivo da personalidade; outras disfunções sexuais femininas devido a condição médica; outras disfunções sexuais masculinas devido a condição médica; transtorno da dor associada com fatores psicológicos e doenças; transtorno da dor associada com características psicológicas com agorafobia, transtorno de pânico sem agorafobia, transtorno da personalidade paranóide; parafilia, SOE; parasonia SOE; jogo patológico; pedofilia; transtorno de personalidade; transtorno de estresse pós-traumático; ejaculação precoce; hipersonia primária; insônia primária; transtorno psicótico devido a doença, com delírios; transtorno psicótico devido a doença, com alucinações; transtorno psicótico, SOE; piromania; transtorno esquizoafetivo; transtorno de personalidade esquizóide; esquizofrenia, tipo catatônica; esquizofrenia, tipo desorganizada, esquizofrenia tipo paranóide, esquizofrenia tipo residual; esquizofrenia tipo indiferenciada; transtorno esquizofreniforme; transtorno da personalidade esquizotípica, transtorno de aversão sexual; transtorno sexual SOE; disfunção sexual; masoquismo sexual; sadismo sexual; transtorno psicótico compartilhado, transtorno do sono devido a uma condição médica, hipersonia; transtorno do sono devido a uma condição médica do tipo insônia, transtorno do sono devido a uma condição médica, misto; transtorno do sono devido a uma condição médica do tipo parassonia; transtorno do terror noturno; transtorno de sonambulismo, fobia social; transtorno de somatização; transtorno somatoforme SOE; fobia específica; fetichismo transvéstico; tricotilomania; transtorno somatoforme indiferenciado; vaginismo e voyeurismo.
[0119] Preferencialmente, os compostos de qualquer uma das Fórmulas I-V, e os sais farmaceuticamente aceitáveis e pró-drogas, podem ser usados no tratamento de doenças nas quais o NGF ou outras neurotrofinas provaram ser eficazes no estado da técnica, seja in vivo ou in vitro, por melhorarem o efeito destes sobre a diferenciação celular e sobrevivência celular, seja através de quaisquer vias; TrkA, TrkB e/ou p75. Consequentemente, os compostos abrangidos na presente invenção podem ser utilizados no tratamento de doenças neurológicas selecionadas dentre: distúrbios neurodegenerativos, tais como a esclerose lateral amiotrófica (ELA), doença de Parkinson, doença de Alzheimer, ataxia de Friedreich, doença de Huntington, demência com corpos de Lewy, atrofia muscular espinal, inflamação do nervo, como a esclerose múltipla e neuromielite óptica; transtorno depressivo maior, esquizofrenia; glaucoma, neuropatias periféricas, tais como a neuropatia diabética ou AIDS. Além disso, os compostos da presente invenção também podem ser indicados para o tratamento do câncer, pela modulação da atividade de diferenciação celular do NGF e parada da proliferação celular. Dentre os tipos de cânceres que o NGF tem se mostrado eficaz no estado da técnica, in vivo ou in vitro, devido aos efeitos sobre a melhora da diferenciação celular e sobrevivência celular, através das vias TrkA e/ou p75, os seguintes podem ser citados: glioblastoma, astrocitoma, meduloblastoma, neurinoma, neuroblastoma, meningioma, câncer do cólon, câncer pancreático, câncer da mama, câncer da próstata, leucemia, leucemia linfocítica aguda, osteossarcoma, carcinoma hepatocelular, carcinoma de ovário, adenocarcinoma de pulmão ou carcinoma esofágico.
[0120] Em um exemplo de realização da presente invenção, do diversos usos e métodos de neuroproteção ou prevenção ou tratamento da morte ou dano de células nervosas, os compostos de qualquer uma das Fórmulas I-V, e sais farmaceuticamente aceitáveis e as pró-drogas dos mesmos, são administrados a um sujeito saudável, de preferência um sujeito saudável com mais de 18 anos, mais preferencialmente, um sujeito saudável com mais de 45 anos de idade, e ainda mais preferencialmente, um sujeito saudável com mais de 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, ou 100 anos de idade.
[0121] O termo “sujeito saudável” pretende incluir o seu significado comum, bem como aqueles sujeitos que podem sofrer de uma ou mais outras condições patológicas além da doença neurológica ou psiquiátrica.
[0122] As propriedades neuroprotetoras dos compostos de qualquer uma das Fórmulas I-V, e os sais farmaceuticamente e pró-drogas dos mesmos, têm como consequência a prevenção parcial ou completa ou o tratamento dos diversos distúrbios nas funções do sistema nervoso causados pela morte ou danos de células neuronais. Por esse motivo, a presente invenção também está relacionada ao uso dos compostos de qualquer uma das Fórmulas I-V, e os sais farmaceuticamente aceitáveis e pró-drogas dos mesmos, como ingredientes ativos na fabricação de medicamentos para a prevenção ou tratamento de uma doença neurológica ou psiquiátrica. Em outras palavras, a presente invenção também está relacionada com os compostos de qualquer uma das Fórmulas I-V, e os sais farmaceuticamente aceitáveis e pró-drogas dos mesmos, para a utilização na prevenção ou no tratamento de uma doença neurológica ou psiquiátrica. Do mesmo modo, a presente invenção também se refere a um método de prevenção ou tratamento de uma doença neurológica ou psiquiátrica, compreendendo a administração de uma quantidade eficaz a um sujeito com essa necessidade de um composto de qualquer das Fórmulas I-V, ou um sal farmaceuticamente aceitável ou pró- droga do mesmo. A doença neurológica ou psiquiátrica pode ser qualquer uma dentre as citadas acima.
[0123] Preferencialmente, a doença neurológica ou psiquiátrica é selecionada a partir de perturbações neurodegenerativas, inflamação e certos tipos de cânceres, esclerose múltipla, neuromielite óptica, esclerose lateral amiotrófica (ELA), doença de Parkinson, doença de Alzheimer, ataxia de Friedreich, doença de Huntington, demência com corpos de Lewy, atrofia muscular espinhal, transtorno depressivo maior, esquizofrenia, glaucoma ou neuropatia periférica (neuropatia diabética ou decorrente da AIDS).
[0124] Outro objetivo da presente invenção é a utilização dos compostos de qualquer uma das Fórmulas I-V, e os sais farmaceuticamente aceitáveis e pró-drogas dos mesmos, como medicamentos neuroestimulantes (neuroenhancing) ou a utilização para a fabricação de medicamentos neuroestimulantes (neuroenhancing).
[0125] Um medicamento neuroestimulante (neuroenhancing) inclui medicamentos que melhoram a aprendizagem e a memória, a atenção, humor, habilidades comunicativas e o desempenho sexual. Exemplos de medicamentos neuroestimulantes (neuroenhancing) são aqueles direcionados a potenciação sináptica de longo prazo (LTP) ou depressão de longo prazo (LTD), modulação de canais de cálcio ou da Proteína de Ligação ao Elemento de Resposta ao AMP Cíclico (CREB). cAMP é a sigla para monofosfato cíclico de adenosina. Exemplos particulares de medicamentos neuroenhancingsão inibidores da fosfodiesterase, tal como rolipram; donepezil; agonistas do receptor de glutamato NMDA similar a D-ciclo-serina; ampaquinas; modafinil; metilfenidato.
[0126] Uma composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada por qualquer meio que atinja o seu propósito pretendido. Por exemplo, a administração pode ser oral, parenteral, subcutânea, intravenosa, intramuscular, intraperinoneal, transdérmica, intranasal, transmucosal, retal ou bucal. Em um exemplo de realização, a composição farmacêutica é administrada por via oral.
[0127] Os compostos de qualquer uma das Fórmulas I-V, e os sais farmaceuticamente aceitáveis e pró-drogas dos mesmos, podem ser formulados em diversas formas farmacêuticas para os propósitos de administração. Como composições apropriadas podem ser citadas todas as composições usualmente empregadas para a administração de drogas de maneira sistêmica, por exemplo, qualquer composição sólida (por exemplo, comprimidos, cápsulas, grânulos, etc) ou líquida (por exemplo, soluções, suspensões, emulsões, etc.). Para preparar as composições farmacêuticas dos compostos de qualquer uma das Fórmulas I-V, uma quantidade eficaz do composto de qualquer das Fórmulas I-V, opcionalmente na forma de sal ou pró-droga, como ingrediente ativo é combinada em mistura com um veículo farmaceuticamente aceitável, de modo que o veículo pode ser de uma larga variedade de formas dependendo da forma de preparação desejada para a administração. Estas composições farmacêuticas são desejáveis na forma de dosagem unitária adequada, particularmente, para administração oral, retal, percutânea, intratecal, intravenosa ou por injeção parenteral. Por exemplo, ao preparar as composições na forma de dosagem oral, qualquer um dos meios farmacêuticos usuais pode ser empregado, tais como, por exemplo, água, glicóis, óleos, alcoóis e similares no caso de preparações orais líquidas como suspensões, xaropes, elixires, emulsões e soluções, ou veículos sólidos como amidos, açúcares, caulino, lubrificantes, ligantes, agentes de desintegração e semelhantes no caso de pós, pílulas, cápsulas, e comprimidos. Devido à sua facilidade de administração, os comprimidos e cápsulas representam as mais vantajosas formas unitárias de dosagem oral, caso em que os veículos farmacêuticos sólidos são obviamente empregados. Para composições parenterais, o veículo compreende usualmente água esterilizada, pelo menos em grande parte, embora possam ser incluídos outros ingredientes, por exemplo, para auxiliar a solubilidade. As soluções injetáveis, por exemplo, podem ser preparadas de modo que o veículo compreenda de solução salina, solução de glicose ou uma mistura das soluções salina e de glicose. Também podem ser preparadas suspensões injetáveis em que veículos líquidos, agentes de suspensão e similares podem ser empregados. Também estão incluídas preparações na forma sólida, que se destinam a ser convertidas, pouco antes da utilização, em preparações líquidas. Nas composições adequadas para administração percutânea, o veículo compreende opcionalmente um agente de aumento de penetração, ou um agente umectante apropriado, ou ambos, opcionalmente combinado com aditivos adequados de qualquer natureza em proporções menores, aditivos esses que não introduzem um efeito prejudicial significativo na pele. Uma revisão das diferentes formas farmacêuticas para administração de medicamentos e a preparação destas pode ser encontrada no livro “Tratado de Farmácia Galênica”,de C. Fauli i Trillo,10a Edição, 1993, Luzan 5, S.A. de Ediciones.
[0128] É especialmente vantajoso formular as composições farmacêuticas mencionadas acima na forma de dosagens unitárias para a facilidade de administração e uniformidade da dosagem. A forma de dosagem unitária, conforme utilizado no presente, refere-se a unidades fisicamente discretas adequadas como dosagens unitárias, contendo cada unidade uma quantidade predeterminada de ingrediente ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o veículo farmacêutico necessário. Exemplos de tais formas de dosagem unitária são comprimidos (incluindo comprimidos marcados ou revestidos), cápsulas, pílulas, supositórios, saquetas de pó, hóstias, soluções ou suspensões injetáveis e similares e múltiplos segregados dos mesmos.
[0129] As composições de acordo com a presente invenção, incluindo as formas de dosagem unitária, podem conter o ingrediente ativo em uma quantidade que está na faixa de cerca de 0,1% a 70%, ou cerca de 0,5% a 50%, ou cerca de 1% a 25%, ou cerca de 5% a 20%, sendo o restante constituído pelo veículo, de modo que as percentagens citadas são de p/p em relação ao peso total da composição ou forma de dosagem.
[0130] A dose do composto de qualquer uma das Fórmulas I-V, ou o sal farmaceuticamente aceitável ou pró-droga do mesmo a ser administrada depende de cada caso individualmente e, como de costume, deve ser adaptada às condições de cada caso individual para um efeito ótimo. Assim, isto depende, naturalmente, da frequência da administração e da potência e duração da ação do composto utilizado em cada caso para terapia ou profilaxia, e também da natureza e gravidade da doença e dos sintomas, bem como do sexo, idade, peso, comedicação e responsividade do sujeito sendo tratado; e se a terapia é aguda ou profilática. As doses podem ser adaptadas em função do peso e para aplicações pediátricas. A dose diária pode ser administrada diariamente (q.d.) ou em quantidades múltiplas, tais como, b.i.d. (duas vezes ao dia), t.i.d. (três vezes ao dia), ou q.i.d. (quatro vezes ao dia).
SÍNTESE DE COMPOSTOS
[0131] Os compostos da presente invenção podem ser preparados utilizando métodos conhecidos pelos técnicos hábeis no assunto considerando a presente descrição. Por exemplo, os compostos da presente invenção podem ser preparados conforme descrito em Masip, et al, 2005.
ANÁLISE DOS COMPOSTOS
[0132] Além dos testes descritos nos Exemplos, os compostos da presente invenção podem ser testados para a doença de Alzheimer em modelo in vitro da seguinte maneira: A linhagem de células de neuroblastoma humano SH-SY5Y é usada para estudar o efeito neuroprotetor do composto testado na doença de Alzheimer. As células são pré-tratadas durante 3 horas com o composto testado em diferentes concentrações (20 ng/ml, 100 ng/ml, 2 μg/ml, 20 μg/ml e 50 μg/ml) com o composto testado (100 ng/ml). Então as fibrilas beta amiloides (100 μM) são adicionadas e incubadas durante 24 horas. O número de células sobreviventes é determinado no dia seguinte pelo ensaio com brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT).
[0133] Indução da fosforilação em TrkA, e iKBα SAPK/JNK pelos compostos da presente invenção podem ser testados da seguinte forma. A ativação de TrkA é o primeiro evento na cascata de sinalização que conduz a uma diferenciação e sobrevivência de neurônios e células 12 PC que respondem a NGF (Greene e Tischler, 1976; Chao, 2003; Huang e Reichardt, 2003). Para avaliar se a atividade neurotrófica dos peptóides similares a NGF é mediada pela interação com o receptor TrkA, a capacidade destes de induzir a fosforilação de TrkA em células PC12 pode ser analisada. A atividade de peptóides pode ser testada em faixas de concentrações que eram eficazes na diferenciação de células PC12.
[0134] Análise de Western blot. As células subconfluentes são cultivadas durante a noite em meio contendo 2% de SBF e 1% de HS e estimuladas com 100 ng/ml de NGF, ou com químicos NGF-like nos pontos de tempo indicados. As células são lavadas com solução salina tamponada com fosfato (PBS) fria e sonicadas brevemente em tampão de amostra SDS (contendo β-mercaptoetanol e 2 mM de PMSF). Os lisados (200 μg de proteínas totais) são separados em SDS-PAGE e transferidos para a membrana de nitrocelulose (Whatman, Dassel, Alemanha). Após bloqueio com leite desnatado a 5% em tampão TBST (10 mM de Tris pH 7,5; 150 mM de NaCl/0.2% de Tween 20), os blotssão sondados durante a noite a 4 °C com o anticorpo anti-p-TrkA (Tyr 490) (1: 1000), anticorpo anti TrkA (1: 1000), anti-p IKBα (Ser 32/36) (5A5) anticorpo de camundongo (1/1000), anticorpo de camundongo anti-lKBα (L35A5) (1: 1000), anticorpo anti-p-SAPK/JNK (Thrl83/Tyrl85) (1:1000) ou anticorpo anti-SAPK/JNK (1/1000) (todos eles da Cell Signaling), seguido pela incubação com o IgG conjugado com HRP (Jackson ImmunoResearch) durante 1 h em temperatura ambiente (RT). A detecção de espécies fosforiladas é realizada usando o sistema de quimioluminescência aumentada (ECL) (GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ).
[0135] Para investigar se os compostos da presente invenção ativam o p75, a ativação da via do NF-KB (Bonizzi G, Karin M. 2004) e a via SAPK/JNK (morte celular) as linhagens de células PC12 e RN22 podem ser analisadas. As células RN22 expressam níveis elevados da mensagem e proteína do receptor p75, enquanto que a expressão de TrkA não é detectável (Gentry et al, 2000). O NF-kB é funcionalmente ativo como um regulador da transcrição em uma forma dimérica composta de homo- ou heterodímeros, o dímero NF-KB prototípico consiste das subunidades p65 e p50. A ativação do NF-KB ocorre principalmente através da degradação das proteínas IKB, uma família de proteínas inibidoras ligadas aos dímeros de NF-kB. Em resposta a estímulos de ativação, as proteínas inibidoras são fosforiladas, o que faz com que as mesmas sejam direcionadas para a ubiquitinação e subsequente degradação. Um membro da família de inibidores, iKBα, é degradado em resposta à maior parte dos ativadores NF-kB (Ghosh et al., 1998). Para examinar a ativação do NF-kB em resposta ao NGF e aos diferentes peptóides selecionados, Westerns blots de extratos de células totais de células PC12 e RN22 tratadas com NGF e com os diferentes peptóides em diferentes tempos são detectados utilizando um anticorpo anti-fosfo-lKBα.
[0136] Em vários sistemas neuronais, a ativação de JNK foi relacionada com a indução da morte celular programada (Bhakar et al., 2003). Em cultura, a sinalização do NGF através do p75 levou à ativação tanto de NF- kB como da JNK, resultando em última análise na morte celular programada (Yoon et al., 1998). Para examinar a atividade da JNK em células RN22, podem ser feitos Western blots utilizando anticorpos anti-fosfo-SAPK/JNK para avaliar a ativação da via.
[0137] O efeito de peptidomiméticos da neurotrofina (por exemplo, peptóides NGF-miméticos) na encefalomielite auto-imune experimental (EAE) pode ser avaliada da seguinte forma:
[0138] Animais, indução da encefalomielite autoimune experimental e tratamento. Os ensaios são aprovados pelo Comitê de Ética e de Cuidados Animais da Universidade de Barcelona. Camundongos C57BL/6 fêmeas a partir de Harlan (8-12 semanas de idade) foram imunizados por via subcutânea em ambos os panículos traseiros com 300 μg de peptídeo glicoproteína mielínica dos oligodendrócitos (MOG) 35-55 (Spikem, Firenze) emulsionado com 50 μg de Mycobacterium tuberculosis (cepa H37Ra; Difco, Detroit, MI) em adjuvante incompleto de Freund (IF A) tal como descrito anteriormente (Palacios et al. 2007). Os camundongos são injetados intraperitonealmente com toxina pertussis (Sigma) (500 ng) no momento da imunização e dois dias mais tarde. Os animais são pesados e inspecionados quanto a sinais clínicos da doença diariamente por um observador cego. A gravidade da doença EAE é avaliada de acordo com a seguinte escala: 0 = normal; 0,5 = leve cauda flácida; 1 = cauda flácida; 2 = leve paresia dos membros posteriores, andar instável, 3 = paresia moderada, movimentos voluntários ainda possíveis; 4 = paraplegia ou tetraparesia; 5 = estado moribundo. Os dados mostrados para os ensaios clínicos são representativos de dois experimentos independentes realizados com o número indicado de animais (Moreno et al., 2006).
[0139] Os compostos de ensaio são preparados em água com 5% de DMSO. Os animais são tratados com o composto teste (25, 50 e 100 mg/kg) ou placebo (água + DMSO 5%) por injeção intraperitoneal diária de partida após a imunização. No final do estudo, os camundongos são anestesiados e perfundidos intracardialmente com 4% de paraformaldeído em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,6). O cérebro, medula espinhal e baços são dissecados e fixados ou congeladas até serem utilizados. O soro é obtido a partir de todos os animais incluídos no estudo, e os níveis das transaminases são mensurados.
[0140] A fim de avaliar os efeitos de peptideomiméticos de neurotrofinas (por exemplo, peptóides similares a NGF) “in vivo”, o efeito dos peptideomiméticos de neurotrofinas (por exemplo, peptóides NGF-miméticos) em modelo animal de MS pode ser estudado. Camundongos C57BL/6 imunizados com peptídeos MOG35-55 são administrados diariamente por via intraperitoneal com um composto teste a partir do dia 0 até o dia 25 em diferentes concentrações do composto. O efeito dos compostos da presente invenção na inflamação do sistema nervoso central e periférico pode ser avaliado da seguinte forma.
[0141] Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa em Tempo Real. Os cérebros e medulas espinais de camundongos obtidos no momento da morte são homogeneizados em tampão de lise de RNA. O RNA total é extraído utilizando o sistema de isolamento ‘RNeasy Mini Kit’ (Qiagen, Chatwworth, CA), incluindo o tratamento com DNase usando o kit RNase-Free DNase Set (Quiagen). O RNA total (35 μg) é submetido a transcrição reversa usando o Sistema de Transcrição Reversa (High Capacity cDNA Archive Kit; Applied Biosystems, Foster City, CA). A reação em tempo real é realizada a 25 °C durante 10 minutos, seguido de 37 °C durante 2 horas e, finalmente, armazenadas a 4 °C. Os primerse sondas TaqMan alvo-específicas marcadas com fluorescência podem ser adquiridos da Applied Biosystems (TaqMan Gene Expression assays). Por exemplo, o kit TaqMan Universal Master Mix (Applied Biosystems) pode ser utilizado. A amplificação do DNA complementar é realizada em um sistema em tempo real DNA Engine Opticon 2 Real-Time System (MJ Researc h, Watertown, MA) utilizando 0,9 μM para cada primere 0,25 μM para a sonda e 20ng de DNA complementar. As condições de reação são um período inicial de 2 minutos a 50 °C, seguido por 10 minutos a 95 °C e 40 ciclos de 15 segundos a 95 °C e 1 minuto a 60 °C. Cada amostra é executada em triplicata, e em cada placa o alvo e controle endógeno são amplificados em poços diferentes. A expressão do gene testado é quantificada em relação ao nível do gene constitutivo para controle interno (housekeeping) 18rRNA (Palacios et al., 2008).
[0142] Imuno-histoquímica. A avaliação histológica é feita em cortes de cérebro e medula espinhal fixados em paraformaldeído, e emblocados em parafina. Os cortes (de 10 μm de espessura) são corados com hematoxilina e Luxol Fast Blue para avaliar a inflamação e a desmielinização. Uma avaliação histológica semiquantitativa para a inflamação e desmielinização é conduzida e pontuada cegamente utilizando a seguinte escala: 0 = normal, 1 = 1 a 3/do corte com manguitos perivasculares com desmielinização mínima, 2 = 3 a 10 manguitos perivasculares/corte acompanhados por desmielinização moderada; 3 = infiltrados perivasculares generalizados, extensa desmielinização com grandes lesões confluentes (Villoslada et al., 2001).
[0143] Os procedimentos imuno-histoquímicos são realizados em cortes de tecidos emblocados em parafina de 10 μm de espessura da medula espinhal e do cérebro, tal como descrito anteriormente (Villoslada et al., 2001). Os anticorpos primários são adicionados em concentrações de 1/1000 para o MCA500 (rato anti-CD3 de camundongo da Serotec) e 1/500 para o MCA1107 (rato anti-CD4 de camundongo da Serotec). A especificidade da imunorreação é determinada pela incubação dos cortes sem os anticorpos primários ou utilizando os controles isotípicos correspondentes que não produziram imunorreatividade.
[0144] Ensaio de proliferação: Os esplenócitos a partir de camundongos C57BL/6 machos ingênuos, não imunizados, foram obtidos para a avaliação in vitro do efeito do composto teste sobre a proliferação celular. O ensaio de proliferação de esplenócitos é realizado conforme descrito previamente (Martinez-Forero et al., 2008).
[0145] Para avaliar o efeito do composto teste na resposta imunológica periférica, a resposta proliferativa contra o antígeno imunizante (MOG) em esplenócitos de animais naives e o perfil de citocinas em células do baço a partir de animais tratados e placebo são avaliados. A expressão do gene da interleucina-2 (IL2), Interferon-Y (IFNy), fator de necrose tumoral α (TNFα), sintase de óxido nítrico induzível (iNOS) e interleucina-10 (IL10) pode ser investigada por PCR de transcriptase reversa quantitativa no final do experimento nos esplenócitos dos animais tratados e tratados com placebo.
[0146] Análise estatística.A análise estatística pode ser realizada com o teste de Mann-Whitney bicaudal para a comparação dos escores de EAE, o teste do qui2para comparar a incidência de doenças e as curvas de Kaplan-Meier para diferenças no dia do surgimento da EAE. Os valores de p inferiores a 0,05 são considerados para indicar uma diferença significativa. A avaliação estatística é conduzida utilizando o programa estatístico SPSS 16.0 (SPSS, Chicago, IL).
[0147] Os seguintes exemplos são ilustrativos, mas não limitativos, dos compostos, composições e métodos da presente invenção. Modificações e adaptações adequadas de diversas condições e parâmetros normalmente encontrados na terapia clínica, e que são óbvias para os técnicos do assunto diante da presente divulgação estão dentro do espírito e escopo da invenção.
EXEMPLOS EXEMPLO1 CONCEPÇÃO DE AGONISTAS DE NGF POR QUÍMICA COMBINATÓRIA
[0148] Geral. Os solventes, aminas e outros reagentes foram adquiridos de fornecedores comerciais e utilizados sem purificação adicional. As reações realizadas sob irradiação de micro-ondas foram realizadas em um balão de 100 mL de fundo redondo equipado com um condensador Dimroth. O balão foi introduzido na cavidade monomodo de um dispositivo CEM, Model Discover. Os espectros de RMN foram registrados em um aparelho Varian Inova 500 (RMN 1H, 500 MHz, RMN 13C, 125 MHz) e em um aparelho Unity 300 (RMN 1H, 300 MHz, RMN 13C, 75 MHz). Quando apropriado, a atribuição dos picos de RMN 1H e 13C para os compostos foi confirmada por experimentos gDQCOSY e gHSQC. A ocorrência de conformeros diferentes levou a espectros de grande complexidade, as absorções dadas abaixo se referem ao principal confôrmero presente na amostra. As análises de RP-HPLC foram realizadas com um dispositivo Hewlett Packard Series 1100 (detector UV 1315A) utilizando um sistema modular de fase reversa com coluna Kromasil 100 C8 (25 x 0,46 cm, 5 μm), com misturas de tampão formato de amônia CH3CN (20 mM, pH = 5.0) em 1 ml/min como a fase móvel e monitoramento a 220 ran. A RP-HPLC semipreparativa foi realizada com um sistema Waters (Milford, MA, EUA). Os espectros de massa de alta resolução (HRMS-FAB) foram realizados no IQAC - Instituto de Química Avançada da Cataluna - (Espanha).
[0149] Síntese de peptóides individuais. A síntese de peptóides individuais G79, G80 e G81 para os ensaios in vitro e in vivo, foi realizada seguindo o procedimento de subestrutura relatado pelo grupo de Zuckermann com algumas modificações (Zuckermann et al, 1992).
[0150] A síntese foi realizada em um resina de poliestireno 1% reticulada carregando o ligante amida Rink AM RAM protegido por fluorenilmetoxicarbonila(Fmoc) (0,79 mmol/g, Rapp Polymer; Alemanha). Uma suspensão de 4 g de resina em 50 mL de DMF foi colocada em um balão de 100 mL de fundo redondo equipado com um agitador magnético. A suspensão foi agitada durante 5 min a 20 °C, o solvente foi removido por filtração através de uma seringa de polipropileno de 60 ml equipada com uma placa de polietileno poroso. Em seguida, a resina foi novamente transferida para o balão de reação.
[0151] 1. A desproteção do Fmoc. Uma solução de 60 mL de piperidina 20% em DMF foi adicionada ao balão de fundo redondo contendo a resina. A mistura foi deixada a reagir sob ativação de micro-ondas durante 5 min a 60 °C e 150 W. A resina foi drenada em uma seringa de 60 ml e lavada com 40 mL de DMF. O tratamento foi realizado em duplicata. Em seguida, a resina foi filtrada e lavada com DMF (3 x 40 mL), iPrOH (3 x 40 mL), e CH2Cl2 (3 x 40 mL). Finalmente, foi drenada durante 2 min e transferida para o balão de reação. A desproteção foi monitorada utilizando o teste TNBS (cor vermelha como positivo).
[0152] 2. Primeira acilação. A resina foi tratada com uma solução de 5 equivalentes de ácido bromoacético (2,2 g, 15,8 mmol) e 5 equivalentes de N, N-diisopropilcarbodiimida (2,5 mL, 15,8 mmol) em 50 mL de DMF. A acilação foi realizada sob irradiação de micro-ondas (5 min, 60 °C, 150 W). Em seguida, a resina foi filtrada utilizando a seringa, e foi lavada com 40 mL de DMF. A reação foi realizada em duplicatas. Em seguida, a resina foi filtrada e lavada com DMF (3 x 40 mL), iPrOH (3 x 40 mL), e CH2Cl2 (4 x 10 mL). Depois, ela foi drenada durante 2 min e a ausência da amina primária foi avaliada pelo teste TNBS.
[0153] 3. Primeira Acoplamento por aminação. Uma suspensão da resina acilada em 50 mL de DMF foi tratada com a amina primária apropriada de acordo com composto final: 5 equivalentes (2,2 mL, 15,8 mmol) em 2,2 mL de l-(3-aminopropil)-2-pirrolidinona, ou 5 equivalentes (3,2 g, 15,8 mmol) de 4- (2-aminoetil)-benzenossulfonamida. A reação foi realizada sob irradiação de micro-ondas (7 min, 60 °C, 150 W). A reação foi realizada em duplicatas, e a resina lavada e drenada utilizando uma seringa entre os tratamentos. Finalmente, a resina foi drenada durante 2 min e transferida para o balão. A incorporação da amina foi confirmada pelo teste de cloranil (cor verde para as aminas secundárias).
[0154] 4. Segunda e terceira etapas de acilação. Elas foram realizadas da mesma forma para a primeira etapa de acilação. Neste caso, dois tratamentos de acilação foram suficientes para completar a reação.
[0155] 5. Segunda e terceira etapas de acoplamento por aminação. Elas foram realizadas de forma semelhante a primeira etapa de aminação, porém utilizando as aminas primárias corespondentes. Assim, 5 equivalentes (1,8 ml, 15,8 mmol) de 2-metil-1-propanamina foram utilizados para o segundo acoplamento por animação. Para a terceira aminação, 5 equivalentes (2,0 mL, 15,8 mmol) de 2-(2-fluorofenil)-etanamina ou 5 equivalentes (2,0 mL, 15,8 mmol) de 2-(1-pirrolidinil)etanamina foram usados de acordo com a composição do peptóide correspondente.
[0156] 6. Clivagem. Após a drenagem a resina foi dividida em 4 alíquotas e cada uma foi tratada com 20 ml de coquetel de clivagem (60:40:2 (v/v/v) TFA/CH2CI2/H2O). As misturas foram agitadas durante 30 min a 20 °C e filtradas através de uma seringa de 10 ml de polipropileno equipada com uma placa de polietileno poroso. Os filtrados foram coletados em um balão de 250 mL e os solventes foram removidos sob pressão reduzida. Finalmente, o resíduo na forma de um óleo amarelo que foi obtido para cada peptóide foi redissolvido em uma mistura de H2O/ACN e liofilizado para resultar em 1,251,80 g do peptóide bruto em uma pureza esperada superior a 85% por HPLC.
[0157] 7. Purificação e caracterização química. Os compostos foram purificados por HPLC semipreparativos utilizando uma coluna Prepack Waters®C-18 (47 x 300 mm, 15-20 μm), eluindo com misturas de CH3CN/H2O contendo TFA a 0,1% como fase móvel, e uma velocidade de fluxo de pelo menos 60 mL/min. Os compostos finais foram obtidos em purezas superiores a 98% por HPLC. As quantidades obtidas foram: 10,64 mg de G79 (pureza 99%; HPLC), 7,55 mg de G80 (pureza 99%; HPLC), e 12,68 mg de G81 (pureza 99%; HPLC).
[0158] [N-(2-(2'-Fluorofenil)etil)glicil]-[N-(2-metilpropil)glicil]-N-[3- (2'-oxopirrolidinil)propil]glicinamida (G79). Fórmula química: C25H38FN5O4; PM 491,5987.
[0159] [N-(2-(2'-Fluorofenil)etil)glicil]-[N-(2-metilpropil)glicil]-N-[2- (4'-sulfamoilfenil)etil] glicinamida (G80). Fórmula química: C26H36FN5O4S; PM 549.658.
[0160] [N-(2-(l-Pirrolidinil)etil)glicil]-[N-(2-metilpropil)glicil]-N-[2-(4'- sulfamoilfenil)etil] glicinamida (G81). Fórmula química: C24H40N6O5S; PM 524.6766.
EXEMPLO 2 ENSAIOS DE DIFERENCIAÇÃO DOSE RESPOSTA EM LINHAGEM DE CÉLULAS PC12
[0161] Cultura de Células: Um estoque de culturas PC12 foram mantidas em meio F12 de Ham suplementado com 2,5% de soro bovino fetal (SBF), 15% de soro de cavalo (HS) e 1% de penicilina/estreptomicina. A cultura de células foi mantida a 5% de CO2 a 37 °C.
[0162] A diferenciação celular das células PC12 foi avaliada pelo tratamento das células com todos os compostos de teste (G79, G80 e G81) em diferentes concentrações (2-20-100 ng/ml e 2-20-50 μg/ml). As células foram inicialmente semeadas em placas de 24 poços revestidas com colágeno com 2,5% de SBF no meio para serem desdiferenciadas. Após 72 horas, os compostos de teste foram adicionados e NGF (Sigma Aldrich, 100 ng/ml) foi usado como controle positivo da diferenciação. O número de células diferenciadas, com processos de neurite maiores do que dois corpos celulares de comprimento, é contado após 3 dias de tratamento. A contagem de células é realizada em três campos selecionados aleatoriamente, com 100 células.
[0163] Os compostos G79, G80 e G81 induzem a diferenciação de células PC12 (Fig. 1A-1D). O controle positivo NGF induz a diferenciação de 16,1 ± 1,9 células em um campo de 100 células. O G79 induz a diferenciação significativa, em comparação com o controle com células PC12 não tratadas, de uma forma dose-dependente (2-20-100 ng/ml e 2-20 μg/mL). A melhor concentração de trabalho é de 20 μg/mL (número de células: 11,3 ± 2,68). A 50 μg/ml, o número de células diferenciadas diminui.
[0164] O G80 induz boa diferenciação com neurites muito longas em células PC12. A melhor concentração de trabalho é de 20 ng/ml. O G81 induz uma significativa diferenciação em comparação com o controle usado com células PC12 não tratadas, de uma forma dose-dependente até a concentração de 100 ng/ml, ou seja, a melhor concentração de trabalho (número de células: 9,2 ± 3,9). Para concentrações maiores, o número de células diferenciadas diminui. A percentagem de células diferenciadas é calculada em relação à diferenciação induzida por NGF (Figura 1E).
EXEMPLO 3 ENSAIOS DE SOBREVIDA
[0165] Os peptidomiméticos de neurotrofina G79, G80 e G81 promovem a sobrevivência celular.
[0166] Cultura de Células: A linhagem de células RN22 de schwannoma de rato foi cultivada em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com SBF 10% e 1% de penicilina/estreptomicina. A cultura de células foi mantida a 5% de CO2 a 37 °C.
[0167] As células RN22 foram plaqueadas em placas de 24 poços a uma concentração de 30.000 células/poço em meio sem soro. Após 24 horas, os compostos-teste G79, G80 e G81 foram adicionados em diferentes concentrações (1-10-50 ng/ml e 1-10 μg/ml) e o NGF foi utilizado como controle positivo da sobrevivência. As células foram então incubadas durante 2 horas. O estresse oxidativo foi induzido com sulfato de cobre (CuSO4) na concentração final de 150 μg/ml. Após um dia de incubação, a viabilidade celular foi determinada pela leitura da absorbância após a adição de MTT (Sigma Aldrich).
[0168] A percentagem de células que sobreviveram é calculada em relação à diferenciação induzida por NGF (Fig. 2). O G79 aumentou a viabilidade celular em todas as concentrações testadas (1-10 - 50 ng/ml e 1-10 μg/mL), com a melhor concentração de trabalho em 10 ng/ml (98,11% de viabilidade celular, como uma % em relação ao controle sem estresse). O G80 aumentou a viabilidade celular em todas as concentrações testadas (1-10 - 50 ng/ml e 1-10 μg/mL), com a melhor concentração de trabalho em 50 ng/mL (99,86% de viabilidade celular, como uma % em relação ao controle sem estresse). O G81 aumentou a viabilidade celular em todas as concentrações testadas (1-10 - 50 ng/ml e 1-10 μg/mL), com a melhor concentração de trabalho em 50 ng/mL (101,86% de viabilidade celular, como uma % em relação ao controle sem estresse).
EXEMPLO 4 ENSAIO DE ATIVIDADE SECRETAGOGA
[0169] G79, G80 e G81 não induzem a secreção de NGF.
[0170] Para avaliar se os compostos testados, G79, G80 e G81, atuam como secretagogos, induzindo atividade neurotrófica através da síntese de NGF, as células PC12 foram cultivadas em placas de 24 poços revestidas com colágeno com apenas 2,5% de SBF e após 72 horas as células foram tratadas com os compostos testados (cada um em uma concentração de 100 ng/ml) juntamente com o anticorpo anti-NGF (1 μg/ml, Abcam). Após três dias de tratamento, a diferenciação foi avaliada. A contagem de células foi realizada em três campos aleatoriamente selecionados com 100 células.
[0171] O tratamento com G79, G80 ou G81 em conjunto com o anticorpo anti-NGF induzem a diferenciação de células PC12 de maneira similar à diferenciação induzida pelos compostos testados sozinhos (Fig. 3A). Embora o número de células diferenciadas pelo NGF é reduzido pela adição de anticorpo anti-NGF (12,8 ± 6,3 vs 20,7 ± 7,1), o número de células diferenciadas é bastante semelhante quando comparamos o tratamento com compostos testados sozinhos com o tratamento com os mesmos compostos mais anticorpo anti-NGF. O tratamento com G79/anti-NGF obteve um número de células diferenciadas para cada campo de 18,8 ± 4,9 vs 11,5 ± 2,8 para o tratamento apenas com G79, para o tratamento com G80/anti-NGF o número de 14,1 ± 1,8 vs 15,1 ± 6,3 para o tratamento apenas com G80; e para o tratamento com G81/anti-NGF, o número é de 15,5 ± 4,1 vs. 14,1 ± 3,3. A percentagem de células diferenciadas é calculada em relação à diferenciação induzida pelo NGF (Figura 3F).
EXEMPLO 5 ENSAIO DE ATIVIDADE SINÉRGICA
[0172] G79, G80 e G81 não tem uma atividade sinérgica com NGF.
[0173] Para avaliar se as moléculas pequenas G79, G80, G81 interferem com a atividade máxima de NGF ou levam a efeitos aditivos, células PC12 foram plaqueadas em placas de 24 poços revestidas com colágeno com 2,5% de SBF e depois tratadas com os químicos tipo pequenas moléculas por 72hs (cada um a 100 ng/ml) em combinação com NGF, na concentração de 100 ng/ml. No mesmo experimento, as células PC12 foram tratadas com as pequenas moléculas ou apenas com NGF, como controle. O número de células diferenciadas foi avaliado após três dias de tratamento. A contagem de células foi realizada em três campos aleatoriamente selecionados com 100 células.
[0174] Os resultados são exibidos na Fig. 3B. O tratamento com as moléculas G79, G80 ou G81 em conjunto com o NGF diminui a atividade de NGF, o que resulta em uma diminuição do número de células diferenciadas no tratamento combinado NGF/G79-G80-G81. Embora o número de células diferenciadas com NGF neste experimento resulte em 20 ± 7,1, o número de células diferenciadas obtido com o tratamento NGF/G79 é de 11,3 ± 2,6. Com o tratamento NGF/G80 o número de células diferenciadas obtidas é de 13 ± 5,9. Com o tratamento NGF/G81 o número de células diferenciadas obtidas é de 13,3 ± 3,8. No geral, estes resultados descartam que G79, G80 ou G81 podem ter um efeito aditivo, sinérgico ou antagonista com o NGF. A percentagem de células diferenciadas é calculada em relação à diferenciação induzida por NGF (Figura 3G).
EXEMPLO 6 ENSAIO DE ATIVAÇÃO DE RECEPTOR
[0175] A hipótese de que G79, G80 e G81 podem atuar através da ligação à porção extracelular do TrkA (sítio de ligação) e ativar a tirosina quinase do receptor foi testada pelo tratamento das células PC12 com os produtos de pequenas moléculas da presente invenção em combinação com o anticorpo anti-TrkA ou K252a, um inibidor da tirosina quinase. Para esta finalidade células PC12 foram semeadas em placas de 24 poços revestidas com colágeno com 2,5% de SBF e após 72 horas foram incubadas com as moléculas pequenas, isoladamente ou em combinação com o anticorpo anti- TrkA (Abcam, 1: 2000) ou K252α. O NGF (100 ng/ml) foi utilizado como controle e adicionado isoladamente ou em combinação com o anticorpo anti- TrkA ou K252α. O número de células diferenciadas foi avaliado após três dias de tratamento. A contagem de células foi realizada em três campos aleatoriamente selecionados com 100 células. Os resultados são exibidos na Fig. 3C.
[0176] O tratamento com as moléculas G79, G80 e G81 em conjunto com o anticorpo anti-TrkA não inibiu a diferenciação das células PC12. Embora o número de células diferenciadas pelo NGF seja reduzido pela adição de anticorpo antiTrkA (12,8 ± 6,3 vs 20,7 ± 7,1), o número de células diferenciadas resultante é similar. O tratamento com G79/anti-TrkA induziu a diferenciação de células PC12: 19,6 ± 8,1 vs 11,5 ± 2,8 para o tratamento apenas com G79, o tratamento com G80/anti-TrkA induziu a diferenciação de 14,6 ± 4,1 vs 15,1 ± 6,3 para o tratamento apenas com G80, e o tratamento com G81/anti-TrkA induziu a diferenciação de 16,5 ± 5,9 vs 14,1 ± 3,3. A percentagem de células diferenciadas é calculada em relação à diferenciação induzida por NGF (Figura 3H).
EXEMPLO 7 ENSAIOS DE INIBIÇÃO DA SINALIZAÇÃO
[0177] G79, G80 e G81 ativam a via de diferenciação do NGF.
[0178] Para avaliar se a via de transdução induzida por G79, G80 e G81 envolve a ativação de AKT e ERK, células PC12 foram tratadas com os compostos teste na presença de LY294002, um inibidor da PI3K (um ativador a montante da AKT) e PD98059, um inibidor da MAPK quinase (um ativador a montante de ERK). Para este objetivo, as células PC12 foram semeadas em placas de 24 poços revestidos com colágeno com 2,5% de SBF e, após 72 horas as células foram tratadas com as pequenas moléculas em combinação com LY294002 (Sigma Aldrich, 10 μM) ou PD98059 (Sigma Aldrich, 50 μM). O NGF (100 ng/ml) foi utilizado como controle e adicionado sozinho ou em combinação com os inibidores.
[0179] A fim de avaliar se G79, G80 ou G81 modulam a via de sinalização do TrkA, foram utilizados inibidores da via AKT e via ERK. O tratamento com NGF mais LY294002 (Fig. 3D) reduziu o número de células diferenciadas em comparação com NGF sozinho (6,8 ± 2,7 vs 20,7 ± 7,1). Da mesma forma, o tratamento com G79 mais LY294002 diminuiu o número de células diferenciadas em comparação com G79 sozinho (5,28 ± 2,54 vs 11,5 ± 2,8). O tratamento com G80 mais LY294002 diminuiu o número de células diferenciadas em comparação com G80 sozinho (8,5 ± 2,6 vs 15,1 ± 6,3). O tratamento com G81 mais LY294002 diminuiu o número de células diferenciadas em comparação com G81 sozinho (6,6 ± 4,02 vs 14,1 ± 3,3). A percentagem de células diferenciadas é calculada em relação à diferenciação induzida pelo NGF (Figura 3I).
[0180] O tratamento com NGF mais PD98059 (Fig. 3E) reduziu o número de células diferenciadas em comparação com NGF sozinho (2,1 ± 1,9 vs 20,7 ± 7,1). Da mesma forma, o tratamento com G79 mais PD98059 diminuiu o número de células diferenciadas em comparação com G79 sozinho (3,1 ± 1,06 vs 11,5 ± 2,8). O tratamento com G80 mais PD98059 diminuiu o número de células diferenciadas em comparação com G80 sozinho (4 ± 2,3 vs 15,1 ± 6,3). O tratamento com G81 mais PD98059 diminuiu o número de células diferenciadas em comparação com G81 sozinho (1,6 ± 1,1 vs 14,1 ± 3,3). A percentagem de células diferenciadas é calculada em relação à diferenciação induzida pelo NGF (Figura 3J).
EXEMPLO 8 ENSAIO DE LIGAÇÃO
[0181] A ligação dos compostos testados G79, G80 e G81, aos receptores TrkA ou p75 pode ser testada utilizando um ensaio ELISA baseado em células competitivo. Primeiro, as células PC12 são semeadas em placas de 96 poços (Fisher Scientific) e incubadas até uma confluência de 85%-90%. Para testar a ligação dos compostos testes ao receptor trkA, o receptor p75 expresso na superfície das células PC12 é inibido pela ligação de um anticorpo de bloqueio anti-p75 (Abcam) que se liga ao domínio extracelular do receptor. As células são incubadas durante 45' com NGF em diferentes concentrações crescentes (0,01-0,1-1 nM) com ou sem a cada uma das moléculas pequenas como competidores em concentração constante. Após uma lavagem em PBS frio, as células são fixadas durante 15' com PFA a 4%. Em seguida, as células são lavadas com PBS e incubadas com anticorpo anti-NGF (1 μg/ml) durante 1h a temperatura ambiente. As células são lavadas duas vezes com PBS e incubadas com um anticorpo secundário anti-NGF por 1h em temperatura ambiente, (1:500; anticorpo conjugado com DyLight 488, Jackson ImmunoResearch). As células são lavadas e a fluorescência é lida por um espectrofluorímetro a 488nm.
EXEMPLO 9 MODELO DE GLAUCOMA
[0182] O G79 evita a morte neuronal em um modelo animal para glaucoma.
[0183] 12 ratos Sprague Dawley (4 meses de idade) foram anestesiados com isobutano e submetidos a uma injeção de solução salina hipertônica na veia episcleral do olho direito. A pressão intraocular (IOP) foi determinada antes da operação e foi monitorada uma vez por semana utilizando um TonoLab durante 7 semanas. O tratamento com G79 foi iniciado uma semana após a indução do glaucoma, por aplicação tópica na conjuntiva. Dois experimentos diferentes foram realizados.
[0184] No primeiro experimento, o G79 foi dissolvido em solução fisiológica e foi usado em duas concentrações diferentes (200 μg/ml e 400 μg/ml). O NGF foi utilizado como controle positivo (200 μg/ml) e a solução fisiológica utilizada para dissolver todas as moléculas foi subadministrada como placebo. Os animais foram divididos em 4 grupos (3 animais em cada grupo): G79-glaucoma; 200μg/ml; glaucoma-G79; 400μg/ml; glaucoma-NGF; glaucoma placebo. O olho esquerdo foi usado como controle sem glaucoma. Em ambos os experimentos, sete semanas após a indução do glaucoma os animais foram sacrificados por overdose de anestesia e os seus olhos foram retirados e fixados em PFA 4%. Os olhos foram emblocados em parafina e cortados em secções 20 μm para serem utilizados em estudos histológicos (coloração com hematoxilina-eosina). A contagem do número de células ganglionares da retina (RGC) foi realizada de forma aleatória em dez campos diferentes para cada olho.
[0185] Os ratos receberam injeções com uma solução hipertônica no olho que induziu a elevação da pressão intraocular por cinco semanas. Os animais foram tratados com gotas oculares de NGF (200 μM/ml), G79 (200-400 μM/ml) ou placebo, diariamente, durante cinco semanas. Os animais com glaucoma e tratados com placebo (soro fisiológico) tiveram uma diminuição significativa do número de células ganglionares da retina em comparação com o controle. Em contraste, os animais tratados com gotas de NGF assim como os animais tratados com G79 tiveram uma proteção significativa das células ganglionares (Fig. 4A). Os resultados sugerem que o tratamento com G79 exerce neuroproteção em células ganglionares da retina (RGC).
[0186] No segundo experimento, foi utilizado o G79 na concentração de 200 μg/ml. O objetivo deste segundo experimento foi comparar a eficácia do G79 ao timolol, o tratamento mais comum para glaucoma que funciona pela diminuição da pressão intraocular. Neste experimento, o tratamento combinatório de G79 e timolol também foi realizado. Os animais foram divididos em 4 grupos com 4 animais em cada grupo: glaucoma-G79 (200 μg/ml) (n = 4); glaucoma-Timolol (n = 4); glaucoma- G79/Timolol (n = 4); glaucoma-placebo (n = 4). O olho esquerdo foi usado como controle sem glaucoma. Os resultados são mostrados na Fig. 4C, onde o G79 foi comparado com a terapia atual para IOP no glaucoma, ou seja, timolol. A indução da IOP reduziu significativamente o número de RGC e essa redução foi significativa em comparação com os olhos controle (C) (p <0,0001) e com todo o tipo de tratamento testado (p < 0,0001). O tratamento combinado não exerceu efeito aditivo na proteção de RGCs (** GL/Timolol + G79 vs Ctrl p = 0,02; § GL/Timolol vs GL/Timolol + G79 p = 0,003).
EXEMPLO 10 DOENÇA DE PARKINSON EM MODELO IN VITRO(ESTRESSE MPP)
[0187] G79, G80 e G81 previnem a morte neuronal em um modelo in vitro da doença de Parkinson.
[0188] Cultura de Células: A linhagem de células humanas de neuroblastoma SH-SY5Y foram mantidas em cultura com meio de Ham a 50% de F12 e 50% de meio EMEM, suplementado com 10% de SBF, 2 nM de L- glutamina e 1% de penicilina/estreptomicina. A cultura de células foi mantida em uma atmosfera umidificada a 95% e CO2, 37 °C.
[0189] A linhagem de células de neuroblastoma humano SH-SY5Y foi usada para estudar o efeito neuroprotetor de pequenas moléculas na doença de Parkinson. As células SH-SY5Y, após a diferenciação para o fenótipo neuronal com ácido retinóico, foram pré-tratadas durante 3 horas com os compostos de teste em diferentes concentrações (20 ng/ml, 100 ng/ml, 2 μg/ml, 20 μg/ml e 50 μg/ml) ou BDNF (20 ng/ml) como controle positivo. Em seguida, 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridina (MPTP) (100 μM) foi adicionado e incubado durante 24 horas. O número de células sobreviventes foi determinado no dia seguinte pelo ensaio com brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2- il)-2,5-difeniltetrazólio (MTT).
[0190] A linhagem de células de neuroblastoma humano SH-SY5Y foram expostas ao MPTP, que danificam os neurônios através do estresse oxidativo. As células foram tratadas com BDNF, G79, G80, G81 ou placebo diariamente durante cinco semanas. As células tratadas com placebo (soro fisiológico) têm uma perda significativa de células em comparação com o controle. Em contraste, as células pré-tratadas com BDNF, bem como com G79 têm uma proteção significativa das células neuronais (Fig. 5A).
EXEMPLO 11 ESTRESSE OXIDATIVO NA LINHAGEM DE CÉLULAS HUMANAS SH-SY5Y
[0191] A linhagem de células de neuroblastoma humano SH-SY5Y é usada para estudar o efeito neuroprotetor dos compostos testes G79, G80, e G81 no estresse oxidativo. As células foram pré-tratadas durante 3 horas com os compostos testes em diferentes concentrações (20 ng/ml, 100 ng/ml, 2 μg/ml, 20 μg/ml e 50 μg/ml) ou BDNF (20 ng/ml) como um controle positivo. Em seguida H2O2 (100 μM) foi adicionado e incubado durante 24 horas. O número de células sobreviventes foi determinado pelo ensaio MTT. Um efeito protetor foi encontrado para o tratamento com G79, G80 e G81 quando usando H2O2 para a indução do estresse oxidativo na linhagem de células SH-SY5Y neuronal, com um efeito mais forte do G79 em relação ao antioxidante BDNF (Fig. 5B). Na Fig. 5B, a viabilidade celular do BDNF foi considerada como 100%. O estresse pelo H2O2 induziu uma diminuição na percentagem de viabilidade celular (controle sem estresse vs H2O2 = 100 ± 2% vs 95,9 ± 0,5%). O G79, em comparação com G80 e G81, é aquele que exerceu uma maior proteção na concentração de 20 ng/ml (BDNF vs G79 = 100 ± 2,6 vs 107,4 ± 5,8).
EXEMPLO 12 ANÁLISE DE WESTERN BLOTE ENSAIO DE SINALIZAÇÃO LUMINEX
[0192] G79 ativa a via da neurotrofina.
[0193] Análises de Western blot. A ativação (fosforilação) dos receptores de neurotrofina TrkA e TrkB foi avaliada por Western-blot da seguinte forma: Células PC12 cultivadas sobre placas de 24 poços foram tratadas com meio com baixo teor de soro (0,5% de SBF) para reduzir o nível basal de fosforilação. Após 24h, as células PC12 foram tratadas com G79 (100 ng/ml), em seguida, recuperadas e lisadas em 300 μL de tampão de lise resfriado em gelo (Sigma Aldrich) em 5-15-30-60 min. Após a sonicação, os detritos celulares foram removidos por centrifugação (14000 rpm durante 10 min) e uma quantidade igual de sobrenadante (30-35 μg/poço) foi carregada e separada por eletroforese em gel de poliacrilamida a 10% (PAGE) e em seguida submetidas a eletroblot para membranas de PVDF. As membranas foram bloqueadas em leite desnatado 5% e depois sequencialmente incubadas com os anticorpos primários [fosfo-TrkA, Tyr490 (Cell Signaling) ou fosfo-TrkB, Tyr515 (NovusBiological)] 1:1000 durante a noite e os anticorpos secundários 1:2000, por 1h em temperatura ambiente. As membranas foram processadas para visualização pelo sistema de quimioluminescência (Amersham) e expostas a filme Kodak para visualizar a imagem fluorografica. Como mostrado na Fig. 6, ambos os receptores foram fosforilados logo depois de 5 min.
[0194] Ensaio de sinalização Luminex: A linhagem celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y foi utilizada para realizar os ensaios utilizando o ensaio de sinalização Luminex usando o kit 10-Plex MAPK/SAPK Signaling Kit-Phosphoprotein (Millipore). Esta linhagem de células expressa o receptor TrkB e a via de sinalização MAPK/SAPK é tipicamente ativada pelos receptores tirosinoquinases. Os anticorpos fosfoproteína incluídos no kit são os seguintes: ERK/MAP quinase (Tre185/Tir187); STAT-1 (Tir701); JNK (Tre183/Tir185); MEK-1 (Ser212); ATF-2 (Tre69/71); p53 (Ser15); HSP27 (Ser78); c-Jun (Ser73); p38 (Tre180/Tir182), p70 S6 quinase (Tre412); IkBa (Ser32) (adquiridos da Millipore).
[0195] As células foram propagadas e depois semeadas em placas de 24 poços (30.000 células/poço). Após 24 horas, as células foram tratadas com diferentes concentrações de NGF-G79 agonista de receptor: 100 ng/ml e 20 μg/ml. Após a adição de G79 no meio, as células foram coletadas em tampão de lise do kit nos seguintes momentos: 30 min, 1h, 2h e 6h. O ensaio foi realizado deste modo para avaliar os efeitos da dose e do tempo, comparando as amostras tratadas com as células não tratadas utilizadas como controles negativos (células SH-SY5Y não estimuladas). O BDNF foi utilizado como controle positivo na concentração de 20 ng/ml, que é a melhor concentração de trabalho conhecida na literatura. Na placa Luminex, cada amostra foi adicionada a um poço em duplicatas. Após a adição de todas as amostras, os controles positivos e negativos específicos de fosforilação incluídos no kit Luminex foram adicionados. O tampão de ensaio também foi adicionado em duplicatas, como um controle de fundo.
[0196] A Fig. 7 exibe a via intracelular ativada pela fosforilação do receptor tirosina-quinase (RTK). Os círculos são os fatores ativados, ao passo que os círculos cinzentos são os fatores testados. Os seus efeitos da linhagem celular SY-SY5Y na fosforilação de diversas vias foram avaliados utilizando o ensaio xMAP da Luminex. A Fig. 8 mostra os níveis de ativação das fosfoproteínas testadas pela tecnologia Luminex. Os níveis de ativação são expressos como intensidade de fluorescência mediana (MFI). Como testado pela tecnologia Luminex, ATF-2, HSP-27, JNK e STAT-1 estavam significativamente moduladas e fosfoativadas em comparação com o controle não estimulado.
[0197] A ATF-2 foi significativamente ativada em 6 hrs após o tratamento com G79 (20 μg/ml) em comparação com o controle não estimulado (* p<0,05). O controle BDNF mostra ativação ATF-2 significativa 2h depois do tratamento (§ p <0,05). HSP-27 foi significativamente ativada 1h após o tratamento com G79 (em 20 μg/ml e 100 ng/ml) em comparação com o controle não estimulado (* p<0,05). O BDNF não ativa HSP-27. A JNK foi significativamente ativada 6h após o tratamento com G79 (em 20 μg/ml e 100 ng/ml) em comparação com o controle não estimulado (* e § p<0,05). O controle BDNF mostra significativa ativação de JNK 2h após o tratamento (+ p <0,05). A STAT-1 foi significativamente ativada em 6 hrs após o tratamento com G79 (20 μg/ml) em comparação com o controle não estimulado (* p<0,05). O BDNF não ativou STAT-1.
EXEMPLO 13 ENSAIO DE LIGAÇÃO POR CITOMETRIA
[0198] G79 compete com NGF e BDNF para a ligação aos receptores de neurotrofina.
[0199] Com o intuito de avaliar a ligação do G79 aos receptores TrkA (PC12) e TrkB (SH-SY5Y), foram realizados ensaios de ligação competitiva por citometria de fluxo. De modo a avaliar a competição pela ligação entre p75 e TrkA, as células PC12 que expressam ambos os receptores, TrkA e p75, foram cultivadas em meio de crescimento normal. Depois soltar as células das placas usando uma solução de tripsina, 200.000 células/poço foram adicionadas a tubos para as seguintes incubações. Um tubo contendo células controle não tratadas. Nos outros tubos as células foram pré- incubadas durante 45 minutos com diferentes concentrações de NGF (0-10-2050-100 ng/ml), que pode ligar diretamente tanto a TrkA como a p75, bloqueando a possível ligação do G79 se este compete para os mesmos receptores. Em seguida, sem lavagem das células, o G79 conjugado com FITC fluorescente (100 ng/ml) foi adicionado e incubado com as células durante 1 hora. As amostras foram lidas em um citômetro (FACScan).
[0200] Para detectar a ligação separadamente de ambos os receptores, a incubação prévia das células (antes da incubação do NGF) com anticorpos de bloqueio foi realizada. As células foram pré-incubadas durante 1 hora com anticorpo bloqueador anti-p75 (1:100; Int Chemicon), para detectar a ligação ao TrkA, ou com o anticorpo bloqueador anti-TrkA (1:200; Abcam) para detectar a ligação ao p75. O mesmo protocolo experimental foi repetido com a linhagem de células SH-SY5Y para detectar a ligação com TrkB e p75 sobre essas células. Neste caso, o BDNF foi utilizado como um competidor para a ligação ao TrkB e p75. Todos os resultados são expressos como canal médio de fluorescência (MCF), que é uma medida da fluorescência na superfície celular produzida pela ligação do G79-FITC.
[0201] A Fig. 9A mostra que o sinal (MCF) diminui na presença de concentrações crescentes de NGF, o que significa que o G79 compete pela ligação aos mesmos receptores do NGF. A fim de avaliar a ligação sobre o p75, as células foram pré-incubadas com o anticorpo anti-TrkA, e constatou-se que o sinal (MCF) diminui o que indica que o G79 poderia se ligar ao p75 (Fig. 9B). A fim de avaliar a ligação do TrkA, a pré-incubação com o anticorpo antip75 não alterou o sinal (MCF), o que significa que G79 aparentemente não compete com o NGF pela ligação ao TrkA (Fig. 9C). No entanto, este resultado pode ser afetado pela presença de quantidades muito pequenas de TrkA na superfície da célula, em comparação com a presença muito maior de p75 (~75000 receptores por célula). Da mesma forma, a ligação do G79 ao TrkB foi avaliada utilizando a linhagem celular SH-SY5Y (Fig. 9D). Neste caso, o sinal (MCF) diminuiu na presença de concentrações crescentes de BDNF, o que indica que o G79 compete com o BDNF para um dos seus receptores.
EXEMPLO 14 MODELO IN VITRO DA ESCLEROSE LATERAL AMIOTRÓFICA (ELA)
[0202] G79, G80 e G81 são neuroprotetores no modelo in vitro de ELA.
[0203] Cultura de Células: Células similares a motoneurônios de camundongos NCS-34 foram cultivadas em DMEM (Gibco) suplementado com 10% de SBF inativado pelo calor e 1% de penicilina/estreptomicina. A cultura de células foi mantida em uma atmosfera umidificada a 95% e CO2, 37 °C.
[0204] O estresse por privação nutricional em neurônios motores foi realizado conforme descrito anteriormente por Masahito T. et al, J. Neuropathol. Exp. Neurol. 65 (8): 816-825 (2006). Para avaliar o efeito da condição de estresse trófico na ELA, a presença de apoptose foi estudada utilizando a privação de soro. As células NSC-34 foram semeadas em placas de 24 poços tratadas com polilisina a uma densidade de 30.000 células/poço e pré-incubadas durante 24 horas em DMEM mais SBF a 10%, com várias doses de G79, G80 e G81 (20 ng/ml, 100 ng/ml, 2 μg/ml, 20 μg/ml e 50 μg/ml), e G- CSF (2 μg/ml) ou BDNF (20 ng/mL) que foram utilizadas como controles positivos (Masahito T. et al, ibid; Elliot J.L., Neurobiology of Disease 5:310-320 (1999)). Em seguida, o meio foi removido e substituído por DMEM fresco sem SBF. Após 48 h, a viabilidade celular foi determinada pelo ensaio MTT conforme descrito anteriormente.
[0205] Conforme mostrado na Fig. 10, G79, G80 e G81 exerceram neuroproteção sobre neurônios motores desafiados com a privação de soro. A viabilidade das células é expressa como a percentagem em relação ao controle sem estresse. G79 exibiu o melhor efeito neuroprotetor na concentração de 100 ng/ml, com um aumento significativo na viabilidade celular em comparação com controle (98,11 ± 6,14% vs 69,64 ± 10,12%, p = 0,02). O G79 também demonstrou aumento da viabilidade celular em comparação com ambos os controles positivos, G-CSF e BDNF, mesmo sem significância (viabilidade celular de G-CSF: 76,50 ± 8,3%; viabilidade celular de BDNF: 80,62 ± 5,2).
EXEMPLO 15 MODELO DE ENCEFALOMIELITE AUTOIMUNE EXPERIMENTAL (EAE)
[0206] G79 melhora o modelo animal de esclerose múltipla (MS).
[0207] O efeito do G79 foi testado no modelo animal de EM, a encefalomielite autoimune experimental (EAE), através da realização de um ensaio preventivo (em que a terapia se inicia no momento da indução da doença) e um ensaio de cura (em que a terapia começa quando os animais já estão sofrendo com a doença). Camundongos C57BL/6 fêmeas da Harlan (8- 12 semanas de idade) foram imunizados por via subcutânea em ambos os panículos traseiros com 300 μg de peptídeo glicoproteína mielínica dos oligodendrócitos (MOG) 35-55 (Spikem, Firenze) emulsionado com 50 μg de Mycobacterium tuberculosis (cepa H37Ra; Difco, Detroit, MI) em adjuvante incompleto de Freund (IF A) tal como descrito anteriormente (Palacios et al. 2007). Os camundongos foram injetados intraperitonealmente com toxina pertussis (Sigma) (500 ng) no momento da imunização e 2 dias mais tarde. Os animais foram pesados e inspecionados quanto a sinais clínicos da doença diariamente por um observador cego. A gravidade da doença EAE foi avaliada por 30 dias de acordo com a seguinte escala: 0 = normal; 0 = leve cauda flácida; 1 = cauda flácida; 2 = paresia mediana dos membros posteriores, andar instável, 3 = paresia moderada, movimentos voluntários ainda possíveis; 4 = paraplegia ou tetraparesia; 5 = estado moribundo. No final do estudo, os camundongos foram anestesiados e perfundidos intracardialmente com 4% de paraformaldeído em tampão fosfato 0,1 M (pH 7,6). Os cérebros, medulas espinhais e baços são dissecados e fixados ou congelados até serem utilizados. Além disso, foi obtido o soro de todos os animais incluídos no estudo. Este procedimento foi aprovado pelo Comitê de Ética e de Cuidados Animais da Universidade de Barcelona.
[0208] Dois experimentos diferentes foram realizados para avaliar tanto o efeito preventivo quanto o efeito curativo do G79, em comparação com outras drogas direcionadas para a via da neurotrofina (amida Gambogic e xaliprodeno) ou uma das terapias de primeira linha para o tratamento da esclerose múltipla, ou seja, o acetato de glatirâmer.
[0209] Para o ensaio preventivo, 10 animais foram tratados com uma injeção intraperitoneal de G79, na concentração de 40 mg/kg, 10 animais foram tratados com uma injeção intraperitoneal de G79, na concentração de 100 mg/kg, 10 animais foram tratados com uma injeção intraperitoneal de amida Gambogic, na concentração de 2 mg/kg, 10 animais foram tratados com administração oral de xaliprodeno na concentração de 10 mg/kg. Como a amida Gambogic e o xaliprodeno foram diluídos com diferentes percentagens de DMSO, 5 animais foram tratados com uma injeção intraperitoneal de placebo (solução fisiológica mais DMSO 1%) e outros cinco animais foram tratados com placebo oral (solução fisiológica mais DMSO 2,5%), respectivamente. Os tratamentos foram realizados diariamente, começando no dia após a imunização.
[0210] Para o teste curativo, para reduzir a discrepância entre a administração oral e injeções intraperitoneais, como o estresse pode afetar profundamente o desenvolvimento das pontuações clínicas em animais, todos os tratamentos foram realizados por injeções intraperitoneais. Para este estudo, 8 animais foram tratados com G79, na concentração de 40 mg/kg, 8 animais foram tratados com G79 na concentração de 100 mg/kg, 8 animais foram tratados com amida Gambogic na concentração de 2 mg/kg, 8 animais foram tratados com xaliprodeno na concentração de 10 mg/kg, 8 animais foram tratados com acetato de glatirâmer na concentração de 5 mg/kg, 8 animais foram tratados com placebo (solução fisiológica mais DMSO 2,5%). Os tratamentos foram realizados diariamente iniciando após o aumento do escore clínico em escore 2 (após o segundo dia neste escore).
[0211] A Fig. 11A e Fig. 11B exibem os resultados da aplicação preventiva do G79 in vivo no modelo de MS (terapia iniciando no mesmo dia da indução da doença). Os gráficos mostram as pontuações (escores) clínicas dos camundongos afetados pela EAE e tratados com diferentes drogas, desde o dia da imunização. Na Fig. 11 A, os animais tratados com G79 exibem um atraso na presença da doença, embora não significativa. Em particular, a concentração de 100 mg/kg foi mais eficaz em retardar a doença. Além disso, o escore clínico final, no 30° dia, os animais tratados com G79 a 100 mg/kg foi mais baixo em comparação com os animais tratados com placebo.
[0212] Fig. 12 mostra os resultados do ensaio curativo. G79 na dose de 100 mg/Kg exibe o melhor efeito terapêutico na atenuação do escore clínico. Especialmente G79 comparado com placebo, diminuiu o escore clínico de forma significativa, entre os dias 16 e 23 (16° dia: escore G79 de 2,8 ± 1,2 vs escore do placebo de 4 ± 0,7, p = 0,01; 19° dia: escore G79 de 1,75 ± 1 vs escore do placebo de 3,3 ± 0,5, p = 0,003; escore do G79 de 1,6 ± 0,8 vs escore do placebo de 2,8 ± 0,8, p = 0,02). Também G79 a 100 mg/kg teve um efeito terapêutico melhor em comparação com os outros tratamentos testados (amida Gambogic, xaliprodeno, acetato de glatirâmer).
EXEMPLO 16 MODELO IN VITRO DE NEUROINFLAMAÇÃO
[0213] G79 reduz a neuroinflamação em um modelo in vitro de neuroinflamação.
[0214] A inflamação do cérebro é um processo comum de muitas doenças neurológicas e é importante no caso da MS. A fim de avaliar o efeito do G79 na inflamação cerebral, o seu efeito foi testado em um modelo in vitro de neuroinflamação utilizando culturas cerebelares organotípicas desafiadas com endotoxina. Em primeiro lugar, o efeito do G79 foi testado na indução da enzima iNOS, que produz óxido nítrico e promove inflamação. Conforme mostrado na Fig. 13, o G79 diminuiu a expressão de iNOS. As amostras pré- tratadas com G79 demonstraram uma diminuição na expressão de iNOS 24h após o desafio com LPS, em comparação com as amostras placebo pré- tratadas.
[0215] Em relação ao efeito do G79 a libertação de citocinas pro- inflamatórias, os níveis de TNFα e IL-1β foram testados nos sobrenadantes das culturas cerebelares organotípicas desafiadas com LPS. A Fig. 14A mostra a produção de TNFα na cultura cerebelar organotípica. A produção de TNFα foi reduzida em 6 e 12 horas em cultura organotípica pré-tratada com G79 em comparação com o placebo. A Fig. 14B exibe a produção de IL-1β na cultura cerebelar organotípica. O pré-tratamento com G79 não afetou a liberação de IL-1β.
[0216] Modelo in vitro de neuroinflamação em cultura de fatia organotípica cerebelar.Camundongos recém-nascidos (8° dia após o nascimento (P8)) foram decapitados após injeção do anestésico IP e os cérebros inteiros foram removidos assepticamente. O cerebelo foi separado do resto do cérebro e colocado sobre uma placa vibratome de metal. Uma vez que o cerebelo foi ligado à superfície da placa, cortes sagitais de 400 μm foram cortados com o vibratome. As fatias foram então transferidas com uma pipeta de Pasteur plástica para uma placa de cultura de células contendo meio de cultura organotípico (5% de CO2 em 50% de meio basal com sal de Earle, 25% de solução salina de Hank tamponada, 25% de soro de cavalo inativado a 5 mg/ml de glicose, 0,25 mM de L-glutamina e 25 μg/ml de penicilina/estreptomicina). Depois de separar e isolar cada fatia, as fatias de cerebelo foram então transferidas para placas de 6 poços (3 fatias para cada poço) contendo uma placa de cultura de 30 milímetros inserida com 0,4 μm de poros (Millipore) e 1 ml de meio de cultura completo, pré-condicionado para incubação durante pelo menos 2 horas a 37 °C, e 5% de CO2 foi adicionado a cada poço abaixo da inserção. As placas de seis poços foram mantidas a 37 °C e sob 5% de CO2 e metade do meio foi substituído a cada 2 dias. Todos os experimentos foram realizadas após 1 semana de cultura nestas condições.
[0217] Após uma semana de cultura organotípica de cerebelo, o meio de cada poço foi substituído por meio fresco e G79 (100 ng/ml) ou placebo (solução fisiológica) foi adicionado aos poços e que foram mantidos em incubação durante 1 hora. Então lipopolissacarídeo (LPS) (15 μg/ml) foi adicionado e mantido em incubação. As fatias e o meio de cultura organotípico foram recuperados em diferentes pontos de tempo: 0h, 1h, 3h, 6h, 12h, 24h e 48h. Para cada ponto de tempo, foram obtidas fatias não tratadas de controle, fatias tratadas com LPS/placebo e fatias tratadas com LPS/G79. As fatias foram coletadas em três experimentos diferentes para extração de RNA. Para isto, as fatias foram recuperadas diretamente em tampão RNA Lysis Buffer (Qiagen) e congeladas a -20 °C no mesmo tampão. Nos outros três experimentos diferentes, as fatias foram recuperadas para imunofluorescência e fixadas em paraformaldeído 4% (PFA), durante 45 minutos em temperatura ambiente. Em todos os experimentos, o meio de cultura organotípico foi coletado e armazenado a -20 °C para o ensaio de ELISA.
[0218] Reação em Cadeia da Polimerase Quantitativa em Tempo Real. As fatias organotípicas coletadas a partir do experimento de estimulação por LPS foram homogeneizadas em tampão de lise de RNA. O RNA total foi extraído utilizando o sistema de isolamento ‘RNeasy Mini Kit’ (Qiagen, Chatwworth, CA), incluindo o tratamento com DNase usando o kit RNase-Free DNase Set (Quiagen). O RNA total (35 μg) foi submetido a transcrição reversa usando o Sistema de Transcrição Reversa (High Capacity cDNA Archive Kit; Applied Biosystems, Foster City, CA). A reação em tempo real foi realizada a 25 °C durante 10 minutos, seguido de 37 °C durante 2 horas e, finalmente, armazenadas a 4 °C. Os primers e sondas TaqMan alvo-específicas marcadas com fluorescência foram adquiridos da Applied Biosystems (TaqMan Gene Expression assays). O primer para o gene de iNOS foi usado. O mix para a reação TaqMan Universal Master Mix (Applied Biosystems) foi utilizado. A amplificação do DNA complementar foi realizada em um sistema em tempo real DNA Engine Opticon 2 Real-Time System (MJ Researc h, Watertown, MA) utilizando 0,9 μM para cada primer e 0,25μM para a sonda e 20 ng de DNA complementar. As condições de reação foram as seguintes: um período inicial de 2 minutos a 50 °C, seguido por 10 minutos a 95 °C e 40 ciclos de 15 segundos a 95 °C e 1 minuto a 60 °C. Cada amostra foi executada em triplicata, e em cada placa o alvo e controle endógeno foram amplificados no mesmo poço. A expressão do gene testado foi quantificada em relação ao nível do gene constitutivo para controle interno (housekeeping) GAPDH.
[0219] Ensaio ELISA: Os sobrenadantes do meio de cultura cerebelar organotípica foram utilizados para avaliar a produção de citocinas, tais como IL-1β e TNF-α, pelo método de ELISA. Para a IL-1β-, foi utilizado o kit de imunoensaio “Quantikine Immunoassay IL-1β Kit” (R&D System), e para o TNF-α foi utilizado o Kit de Desenvolvimento de ELISA para TNF-α de camundongo (Peprotec). Todos os ensaios de ELISA foram realizados de acordo com as instruções do fabricante.
EXEMPLO 17 TRANSPORTE ATRAVÉS DA BARREIRA HEMATO-ENCEFÁLICA (BHE)
[0220] A capacidade dos compostos G79, G80 e G81 atravessarem a barreira hemato-encefálica foi testada usando dois modelos in vitro. O transporte passivo foi testado utilizando o modelo PAMPA (Ensaio de Permeabilidade De Membrana Artificial Paralelo) e o transporte ativo foi testado utilizando um modelo in vitro de BHE por cocultura de BBEC e astrócitos. Como resultado, verificou-se que o G79 foi incapaz de atravessar a BHE no modelo PAMPA em comparação com outras drogas com boa capacidade de atravessar a BHE no modelo PAMPA, tais como propanolol e carbamazepina (permeabilidade efetiva (pe) do propanolol = 11,5; pe da carbamazepina = 10,3; pe do G79 = 0 x 10-6cm/s). Em contraste, no modelo in vitro de células da BHE, todas as três moléculas exibiram uma capacidade média a elevada de atravessar a BHE por transporte ativo (pe do G79 = 4,1; pe do G80 = 2,8; pe do G81 = 2,1 x 10-6cm/s).
[0221] Ensaio da Permeabilidade da Membrana Artificial Paralela (PAMPA): O ensaio PAMPA é usado como um modelo in vitro da permeabilidade passiva da BHE. Uma membrana artificial imobilizada em um filtro é colocada entre um compartimento doador e aceptor. No início do ensaio, um medicamento é introduzido no compartimento doador. Após o período de permeação, as concentrações da droga nos compartimentos doadores e aceitadores são mensuradas usando a espectroscopia UV. Consequentemente, a perme0abilidade de um composto com um cromóforo de UV pode ser determinada por este método.
[0222] As soluções estoques dos compostos testados foram diluídas 200 vezes em tampão universal, pH 7,4 e adicionadas aos poços doadores. A membrana do filtro foi revestida com PBL em dodecano e o poço aceptor foi preenchido com tampão pH 7,4. A placa de filtro aceptora foi cuidadosamente colocada sobre a placa doadora para formar um “sanduíche” (consistindo do doador com o composto de teste na parte de baixo, uma membrana lipídica artificial no meio, e o aceptor na parte superior). O composto de ensaio difunde a partir do compartimento doador através da membrana lipídica para o compartimento aceptor. O “sanduíche” foi deixado em repouso durante 18 horas, enquanto a permeação ocorreu. A concentração do composto teste no compartimento aceptor, doador, e dos poços de referência foi determinada utilizando o leitor de placas UV. A permeabilidade efetiva (Pe) de cada composto foi calculada utilizando o software pION PSR4p. As amostras foram analisadas em triplicatas e a média dos três ensaios foi relatada. Os padrões de controle de qualidade foram executados com cada amostra definida para monitorar a consistência do conjunto de análise.
[0223] Modelo in vitro celular de transporte através da barreira hemato-encefálica (BHE): O modelo celular in vitro foi determinado por meio de uma cocultura de células endoteliais hemato-encefálica (BBECs) e astrócitos de ratos recém-nascidos. Resumidamente, antes da cocultura de células (em placas de 24 transpoços de policarbonato com uma área de superfície de 0,33 cm2e poros de tamanho de 0,4 μm, (Corning Costar), a superfície superior das placas inseridas foi revestida com colágeno tipo IV e fibronectina. Em seguida, as inserções foram colocadas de cabeça para baixo em uma placa de petri grandee 40 μL de uma suspensão (contendo aproximadamente 45.000 astrócitos) foi colocada no fundo de cada filtro. A placa de Petri foi colocada em uma incubadora durante 1 hora e 40 μL de meio DMEM+S fresco foram adicionados no final de cada um dos filtros a cada 15 minutos. As inserções foram então transferidas de volta para a placa e incubadas a 37 °C, 5% de CO2 por três dias. Após este tempo, 2 horas antes de semear as BBECs, o meio foi substituído por DMEM+S suplementado com 125 μg/mL de heparina. Duas horas mais tarde, as células foram semeadas em inserções (45.000 células por filtro). A placa foi mantida na incubadora a 37 °C, 5% CO2 por mais três dias. Depois de três dias de cocultura, o meio foi substituído por DMEM+S suplementado com cAMP e RO-20-1724, e mantido a 37 °C e 5% de CO2. No dia 8 da cocultura, as medições da resistência elétrica transendotelial (TEER) mostraram que o sistema estava pronto para os estudos de transporte. Para validar a maturidade do modelo, no mesmo dia do experimento os ensaios de permeabilidade foram feitos paralelamente com luciferina amarela (LY) como um marcador de integridade da barreira in vitro. Durante o ensaio de permeabilidade, as amostras foram coincubadas com LY a uma concentração de 20 μM para avaliar a integridade da monocamada celular durante o ensaio.
[0224] O TEER foi determinado usando um ohmímetro Millicell ERS System (MERS 000 01, Millipore). As medições TEER confirmaram a formação de uma BHE in vitro funcionalmente intacta no dia 8 da cocultura. Os valores TEER representam a tensão ou integridade da BHE in vitro. O valor TEER (média ± DP) para todos os poços foi de 141 ± 5,7 ohms/cm2.
Figure img0007
[0225] Na equação (1) acima, (dQ/dt) é a quantidade de composto presente no compartimento aceptor em função do tempo (nmol/s), Aé a área do inserto (cm) e Coé a concentração inicial do composto aplicado ao compartimento doador (nmol/ml).
[0226] Durante os estudos de transporte, os compostos foram coincubados com LY (20 μM), a fim de assegurar a integridade da membrana celular durante o ensaio de transporte.
[0227] Tendo agora descrito completamente esta invenção, será compreendido por pessoas competentes na área que a mesma pode ser realizada dentro de uma ampla faixa de condições, formulações e outros parâmetros equivalentes sem afetar o escopo da presente invenção ou de qualquer exemplo de realização da mesma.
[0228] Outras formas de realização da invenção serão evidentes para os peritos no assunto a partir da consideração do relatório descritivo e da prática da invenção revelada no presente. Pretende-se que o relatório descritivo e os exemplos sejam considerados apenas como exemplares, sendo o verdadeiro escopo e espírito da invenção indicado pelas reivindicações a seguir.
[0229] Todas as patentes e publicações citadas no presente são totalmente incorporadas pela referência de maneira integral.
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Claims (18)

1. COMPOSTO, caracterizado por possuir a Fórmula II:
Figure img0008
ou um sal farmaceuticamente aceitável, em que: R1 é fenila substituída por halogênio ou trifluorometila, e ainda opcionalmente substituída com um ou dois substituintes selecionados a partir do grupo que consiste em halogênio, alquila C1-C6, alcóxi C1-C6 e haloalquila C1-C6; e R2 é 2-oxo-pirrolidin-1-ilmetila ou sulfamoilfenila.
2. COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por R1 ser fluorofenila, e R2 ser conforme definido na reivindicação 1, preferencialmente em que R1 é 2-fluorofenila.
3. COMPOSTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado por R2 ser 4-sulfamoilfenila.
4. COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por possuir a Fórmula iii:
Figure img0009
ou Fórmula iV:
Figure img0010
ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo.
5. COMPOSTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, ou um sal farmaceuticamente aceitável, caracterizado por ser para uso como um medicamento.
6. COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizada por compreender uma quantidade terapeuticamente eficaz de pelo menos um composto, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e um veículo farmaceuticamente aceitável.
7. COMPOSTO, de acordo com a reivindicação 5, ou uma composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 6, caracterizados por serem para o uso como um medicamento útil na prevenção ou tratamento da morte ou danos de células nervosas; na regeneração de células nervosas ou na prevenção ou tratamento de uma doença neurológica ou psiquiátrica.
8. COMPOSTO, para uso, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo medicamento ser uma droga neuroprotetora ou uma droga neuroestimulante (neuroenhancing); ou uma droga neuroprotetora ou um imunomodulador.
9. COMPOSTO, para uso, de acordo com a reivindicação 5, ou uma composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 6, caracterizados pelo medicamento ou composição farmacêutica serem úteis na prevenção ou tratamento de uma doença selecionada a partir de: doenças neurológicas, preferencialmente distúrbios neurodegenerativos, tais como a esclerose lateral amiotrófica (ELA), doença de Parkinson, doença de Alzheimer, ataxia de Friedreich, doença de Huntington, demência com corpos de Lewy, atrofia muscular espinhal, inflamação de nervo, tais como a esclerose múltipla ou neuromielite óptica; transtorno depressivo maior; esquizofrenia; glaucoma, neuropatia periférica, tais como neuropatia diabética ou AIDS; e câncer, tais como o glioblastoma, astrocitoma, meduloblastoma, neurinoma, neuroblastoma, meningioma, câncer do cólon, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de próstata, leucemia, leucemia linfocítica aguda, osteossarcoma, carcinoma hepatocelular, carcinoma de ovário, adenocarcinoma de pulmão e carcinoma esofágico.
10. COMPOSTO, para uso, de acordo com a reivindicação 5, ou uma composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 6, caracterizados pelo medicamento ou composição farmacêutica possuírem uma combinação de efeitos neuroprotetores e imunomoduladores.
11. USO DE UM COMPOSTO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por ser como um ingrediente ativo na fabricação de um medicamento para a prevenção ou tratamento da morte ou danos de células nervosas; ou um medicamento neuroprotetor; ou um medicamento para a regeneração de células nervosas; ou um medicamento para a prevenção ou tratamento de uma doença neurológica ou psiquiátrica; ou uma droga neuroregenerativa; ou um imunomodulador; ou um medicamento que tem uma combinação de efeitos neuroprotetor e imunomodulador; ou uma droga neuroestimulante.
12. USO DE UM COMPOSTO, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por ser como um ingrediente ativo na fabricação de um medicamento para a prevenção ou tratamento de uma doença selecionada a partir de: doenças neurológicas, preferencialmente distúrbios neurodegenerativos, tais como a esclerose lateral amiotrófica (ELA), doença de Parkinson, doença de Alzheimer, ataxia de Friedreich, doença de Huntington, demência com corpos de Lewy, e atrofia muscular espinhal; inflamação de nervo, tais como a esclerose múltipla ou neuromielite óptica; transtorno depressivo maior; esquizofrenia; glaucoma, neuropatia periférica, tais como neuropatia diabética ou AIDS; e câncer, tais como o glioblastoma, astrocitoma, meduloblastoma, neurinoma, neuroblastoma, meningioma, câncer de cólon, câncer pancreático, câncer de mama, câncer de próstata, leucemia, leucemia linfocítica aguda, osteossarcoma, carcinoma hepatocelular, carcinoma de ovário, adenocarcinoma de pulmão e carcinoma esofágico.
13. COMPOSTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado por ser para o uso em um método de estimulação da atividade de fator de crescimento neural, ou um receptor de fator de crescimento neural, ou em um método de tratamento de uma doença que responde a estimulação da atividade de fator de crescimento neural, ou um receptor de fator de crescimento neural, em um mamífero que sofre de ausência de estimulação do mesmo.
14. COMPOSTO, para uso, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo receptor de fator de crescimento neural ser o receptor TrkA ou receptor p75.
15. COMPOSTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado por ser para o uso em um método de estimulação da atividade de fator de neurotrofina, ou um receptor de fator de neurotrofina, ou em um método de tratamento de uma doença que responde a estimulação da atividade de fator neurotrofina, ou um receptor de fator de neurotrofina, em um mamífero que sofre de ausência de estimulação do mesmo.
16. COMPOSTO, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, caracterizado por ser para o uso em um método de estimulação da atividade de fator neurotrófico derivado do cérebro, ou um receptor de fator neurotrófico derivado do cérebro, ou em um método de tratamento de uma doença que responde a estimulação da atividade de fator neurotrófico derivado do cérebro, ou um receptor de fator neurotrófico derivado do cérebro, em um mamífero que sofre de ausência de estimulação do mesmo.
17. COMPOSTO, para uso, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo receptor de fator neurotrófico derivado do cérebro ser o receptor TrkB ou receptor p75.
18. MÉTODO PARA PREPARAR UMA COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA, caracterizado por compreender misturar uma quantidade eficaz de um composto, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, ou um sal farmaceuticamente aceitável do mesmo, com um veículo farmaceuticamente aceitável.
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