KR20130106384A - 뉴로트로핀 수용체의 효현제 및 약제로서의 이의 용도 - Google Patents

뉴로트로핀 수용체의 효현제 및 약제로서의 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 화학식 Ⅰ의 화합물 및 이의 약학적으로 허용되는 염 및 프로드럭에 관한 것이다:
Figure pct00017

[식 중, R1, R2 및 R3은 명세서에서 기재된 바대로 정의된다].
상기 화합물은 뉴로트로핀(예컨대, 신경 성장 인자) 수용체의 효현제이다.

Description

뉴로트로핀 수용체의 효현제 및 약제로서의 이의 용도{AGONISTS OF NEUROTROPHIN RECEPTORS AND THEIR USE AS MEDICAMENTS}
본원은 2010년 8월 31일자에 출원된 미국 가출원 제61/378,823호의 조기 출원일의 이익을 주장하고, 그 전문이 본원에 참조문헌으로 포함된다.
기술분야
본 발명은 신경학적, 정신 질병 및 노화에 대한 치료 분야에 적용된다. 특히, 본 발명은 뉴로트로핀(신경 성장 인자(NGF; Nerve Growth Factor) 또는 뇌 유래 뉴로트로핀 인자(BDNF; Brain-Derived Neurotrophic Factor)) 수용체의 소분자 효현제의 신경보호성 효과 및 약제로서의 이 효현제의 용도에 관한 것이다.
신경 및 정신 질병인 노화는 신경 세포에 죽음 및 손상을 야기한다. 빈번한 관련 신경계 손상은, 무엇보다도, 뉴런 퇴행, 허혈, 염증, 면역 반응, 외상 및 암으로부터 생길 수 있다. 이러한 결과로서, 신경 세포는 분 또는 시간 내에 죽을 수 있거나, 신경퇴행을 활성화하는 손상된 상태에서 이 초기 손상에 살아남지만, 똑같이 세포사로 끝난다.
기본적인 운동 기능 및 감지를 가능하게 하는 데 신경계의 중요성을 고려하면, 신경계를 보호하기 위한 치료학적 무기를 발견하는 데 있어서 관심이 존재한다.
신경보호는 신경계의 보존, 회복, 치유 또는 재생, 이의 세포, 구조 및 기능에 중점을 둔다(Vajda et al., 2002). 신경보호의 목표는 신경계에 대한 원래 손상의 효과를 예방하거나 최소화하는 것, 또는 액손, 뉴런, 시냅스 및 수상 돌기에 손상을 야기하는 내인성 또는 외인성 유해 과정의 결과를 예방하거나 최소화하는 것이다.
일반적으로 치료 전략은 흔히 단일 제안된 손상 인자의 조정에 기초한다. 이러한 치료가 매우 구속된 동물 모델에서 유리한 것으로 보일 수 있지만, 이것은 유전학적으로 다양한 집단에서 더 다양한 손상 중증도 정도를 포함하는 더 복잡한 인간 질병에서 효과적인 것으로 덜 입증될 것이다(Faden and Stoica, 2007). 중요하게는, 산화 스트레스, 미토콘드리아 기능장애, 단백질 응집, 아폽토시스 및 염증과 같은 추정되는 뉴런 죽음의 기전이 복잡하면서 변하므로(Youdim et al., 2005), 다수의 손상 기전에 다능성 효과를 갖는 단일 화합물이 바람직하다.
소염제, N-메틸 D-아스파르테이트(NMDA) 길항제, α-아미노-3-히드록시-5-메틸-4-이속사졸 프로피온산(AMPA) 길항제, 덱사나비놀, 나트륨 채널 차단제, 티로트로핀 방출 호르몬(TRH), 성장 인자, 글루코코리트코이드, 카페이놀, 마약 길항제, 아폽토시스 억제제, 자유 라디칼 포획제/소거제, 에리쓰로포이에틴, 칼슘 채널 차단제, 황산마그네슘 및 전분의 부류를 비롯하여 여러 신경보호 약물이 조사 중에 있다.
이차성 생화학적 손상 및 세포사를 제한하는 이러한 약리학적 물질의 능력이 실망스럽다(Faden and Stoica, 2007).
뉴로트로핀은 말초 신경계 및 중추 신경계의 발생 및 유지를 조절하는 성장 인자이다(Lewin and Barde, 1996). 신경 성장 인자(NGF)는 뇌 유래 뉴로트로핀 인자(BDNF)와 같은 다른 구조적으로 관련된 단백질을 포함하는 뉴로트로핀 패밀리의 처음 개발되고 최고의 특성을 지닌 구성원이다. 신경 성장 인자(NGF)는 뉴런 생존, 분화 및 성장에서 중요한 역할을 하고(Levi-Montalcini, 1987), 티로신 키나제 수용체 TrkA 및 p75 수용체(Chao, 2003)의 2개의 명확한 세포 수용체에 결합하는 뉴로트로핀 패밀리로부터의 동형이합체 단백질이다. NGF-TrkA 결합은 수용체의 고유 티로신 키나제를 활성화하여, TrkA 및 연관 신호전달 파트너의 티로신 인산화를 발생시키고 따라서 세포 생존 또는 분화의 촉진을 활성화한다(Kaplan and Miller, 2000). p75 수용체는 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리의 구성원이다. 세포 환경 및 리간드의 유형에 따라, p75는 생존 촉진(pro-survival), 아폽토시스 촉진(pro-apoptotic) 또는 분화 촉진(pro-differentiation) 신호의 트랜스듀서로서 작용할 수 있다(Barker, 1998; Rabizadeh et al., 1999; Zaccaro et al., 2001; Saragovi and Zaccaro, 2002). 따라서, 대사 경로에 따라, TrkA 또는 p75 수용체에 대한 결합은, 고려되는 세포 유형에 따라, 불명료하게, 분화 및/또는 세포 생존과 연결되는, 신호를 촉발할 수 있다. 뉴로트로핀은 포스파티딜이노시톨 3-키나제(PI3K)-AKT 경로 및 미토젠 활성화 단백질 키나제(MAPK)-MEK 경로의 2개의 주요 신호전달 경로를 통해 작용한다(경로 둘 다 아폽토시스의 억제와 관련된다). 뉴로트로핀 인자는 또한 성숙 뉴런, 특히 손상 및 퇴행성 세포에 작용하는 것으로 공지되어 있다(Lindvall et al. 1994; Tuszynski and Gage 1995; Lykissa et al. 2007; Song et al. 2009).
여러 질환에 대한 치료제로서의 NGF의 가능성이 여러 조사원에 의해 제시되었다. 이러한 질환으로는 신경퇴행성 질병, 신경 염증 및 특정한 유형의 암, 다발성 경화증, 시신경 척수염, 근위축성 축삭 경화증(ALS), 파킨슨병, 알츠하이머병, 프레드라이히 운동실조, 헌팅턴병, 루이소체 치매, 척수성 근위축증, 주요 우울 장애, 정신분열증, 녹내장 또는 말초 신경병증(당뇨병 또는 AIDS 신경병증)(Longo et al, 2007; Schulte-Herbruggen, 2007; Shi, 2007; Hellveg, 2008; Shoval, 2005; Apfel, 2002; Anand, 2004)을 들 수 있다. NGF는 CNS 회피의 유지에 기여하는 CNS 염증 동안 상당한 면역조절 특성을 갖는다(Villoslada and Genain, 2004). 마모셋에서의 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 동안, NGF는 명확히 CNS 침윤을 감소시키는 CNS에서의 면역억제 미세환경을 유도하는 능력으로 인해 연속 점적주사에 의해 뇌실주입으로 투여될 때 임상 증상의 발생을 억제할 수 있다(Villoslada et al., 2000). NGF가 뉴런 및 희돌기교세포에서의 이의 신경보호 특성 이외에 자가면역 탈수초화 동안 면역억제를 유도한다는 사실은 MS와 같은 CNS 염증성 질환의 치료에 이를 매우 우수한 후보물질로 만든다. 그러나, NGF는 혈액-뇌 장벽(BBB)을 횡단할 수 없는 이의 무능력(Poduslo and Curran, 1996), 이의 짧은 반감기 및 이의 부작용(Apfel, 2002)으로 인해 이상적인 약물 후보물질이 아니다. NGF 효현제 활성을 가지면서, 더 우수한 약동학 및 더 적은 부작용을 갖는 소분자의 연구에 많은 노력이 있어 왔다. 이 목표를 성취하기 위해, 상이한 접근법이 시도되었다(Poduslo and Curran, 1996; Longo et al., 1997; Maliartchouk et al., 2000a; Maliartchouk et al., 2000b; Peleshok 및 Saragovi, 2006).
그러므로, 바람직하게는 다능성 효과를 갖는 신경보호 특성을 갖지만, NGF의 단점을 갖지 않는 약물, 특히 NGF 유사체를 제공하기 위한 계속적인 수요가 존재한다. 본 발명자들은 당해 분야에 개시된 것과 구별되는 화합물의 패밀리를 개발하였다. 본 발명의 화합물의 패밀리는 뉴로트로핀(NGF, BDNF)의 펩티도유사체 및 TrkA, TrkB 및 p75 특이적 수용체에 대한 효현제이다. 본 발명의 여러 화합물은, 예의 방식으로, 심지어 NGF 그 자체보다 더 높은 정도로 세포 생존을 촉진한다. 본 발명의 화합물은 뉴로트로핀의 펩티드 유사체로 고려되고 이것은 모두 N-알킬글리신 삼합체의 구조를 공유한다.
본 발명은 뉴로트로핀 수용체, 구체적으로 신경 성장 인자(NGF) 수용체 및 뇌 유래 뉴로트로핀 인자(BDNF) 수용체의 효현제로서의 하기 화학식 Ⅰ-Ⅴ의 펩토이드 화합물 및 이의 약학적으로 허용되는 염 및 프로드럭의 용도에 관한 것이다.
본 발명에서 유용한 화합물은 이하 보고되어 있지 않다. 따라서, 본 발명의 일 양태는 화학식 Ⅰ-Ⅴ의 신규한 화합물 및 이의 약학적으로 허용되는 염 및 프로드럭에 관한 것이다.
본 발명의 다른 양태는 NGF 수용체의 효현제로서의 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 및 이의 약학적으로 허용되는 염 및 프로드럭의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 다른 양태는 BDNF 수용체의 효현제로서의 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 및 이의 약학적으로 허용되는 염 및 프로드럭의 용도에 관한 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 약제로서 사용하기 위한 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 및 이의 약학적으로 허용되는 염 및 프로드럭을 제공하는 것이다. 본 발명의 일 양태에서, 약제는 신경 세포사 또는 신경 세포 손상을 예방하거나 치료하기 위해 사용하기 위한 것이다. 본 발명의 일 양태에서, 약제는 신경보호에서 사용하기 위한 것이다. 본 발명의 일 양태에서, 약제는 신경 세포의 재생에서 사용하기 위한 것이다. 본 발명의 일 양태에서, 약제는 신경활동촉진에서 사용하기 위한 것이다. 일 양태에서, 약제는 신경 질환 또는 정신 질환을 예방하거나 치료하기 위해 사용하기 위한 것이다. 본 발명의 일 양태에서, 약제는 신경 질환, 우선적으로 신경퇴행성 질병(예컨대, 근위축성 축삭 경화증(ALS), 파킨슨병, 알츠하이머병, 프레드라이히 운동실조, 헌팅턴병, 루이소체 치매 및 척수성 근위축증), 신경 염증(예컨대, 다발성 경화증 및 시신경 척수염), 주요 우울 장애, 정신분열증, 녹내장, 말초 신경병증(예컨대, 당뇨병 또는 AIDS 신경병증) 및 암(예컨대, 교모세포종, 성상세포종, 수모세포종, 신경초종, 신경아세포종, 뇌수막종, 대장암, 췌장암, 유방암, 전립선암, 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 골육종, 간세포 암종, 난소 암종, 폐 선암 및 식도 암종)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질환을 예방하거나 치료하기 위해 사용하기 위한 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 다발성 경화증을 치료하기 위한 약제로서 사용하기 위한 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 신경재생 약물인 약제로서 사용하기 위한 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 면역조절제인 약제로서 사용하기 위한 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 신경보호성 효과와 면역조절 효과의 조합을 갖는 약제로서 사용하기 위한 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 치료학적 유효량의 1종 이상의 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 신경 세포사 또는 신경 세포 손상을 치료하기 위한 약제의 제조에서의 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 신경보호를 제공하기 위한 약제의 제조에서의 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 신경 세포의 재생을 위한 약제의 제조에서의 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 신경 질환 또는 정신 질환을 예방하거나 치료하기 위한 약제의 제조에서의 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 신경 질환, 우선적으로 신경퇴행성 질병(예컨대, 근위축성 축삭 경화증(ALS), 파킨슨병, 알츠하이머병, 프레드라이히 운동실조, 헌팅턴병, 루이소체 치매 및 척수성 근위축증), 신경 염증(예컨대, 다발성 경화증 및 시신경 척수염), 주요 우울 장애, 정신분열증, 녹내장, 말초 신경병증(예컨대, 당뇨병 또는 AIDS 신경병증) 및 암(예컨대, 교모세포종, 성상세포종, 수모세포종, 신경초종, 신경아세포종, 뇌수막종, 대장암, 췌장암, 유방암, 전립선암, 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 골육종, 간세포 암종, 난소 암종, 폐 선암 및 식도 암종)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질환을 예방하거나 치료하기 위한 약제의 제조에서의 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 다발성 경화증을 예방하거나 치료하기 위한 약제의 제조에서의 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 신경재생 약물의 제조에서의 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 면역조절제의 제조에서의 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 신경보호성 효과와 면역조절 효과의 조합을 갖는 약제의 제조에서의 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 신경활동촉진 약물의 제조에서의 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭의 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 유효량의 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭, 또는 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭을 포함하는 유효량의 약학 조성물을 신경 세포사 또는 신경 세포 손상의 예방 또는 치료를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 것을 포함하는, 신경 세포사 또는 신경 세포 손상을 예방하거나 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 유효량의 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭, 또는 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭을 포함하는 유효량의 약학 조성물을 신경보호의 제공을 필요로 하는 피험체에게 투여하는 것을 포함하는, 신경보호를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 유효량의 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭, 또는 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭을 포함하는 유효량의 약학 조성물을 면역조절의 제공을 필요로 하는 피험체에게 투여하는 것을 포함하는, 면역조절을 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 유효량의 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭 또는 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭을 포함하는 유효량의 약학 조성물을 신경 세포의 재생을 필요로 하는 피험체에게 투여하는 것을 포함하는, 신경 세포를 재생하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 신경 질환, 우선적으로 신경퇴행성 질병(예컨대, 근위축성 축삭 경화증(ALS), 파킨슨병, 알츠하이머병, 프레드라이히 운동실조, 헌팅턴병, 루이소체 치매 및 척수성 근위축증), 신경 염증(예컨대, 다발성 경화증 및 시신경 척수염), 주요 우울 장애, 정신분열증, 녹내장, 말초 신경병증(예컨대, 당뇨병 또는 AIDS 신경병증) 및 암(예컨대, 교모세포종, 성상세포종, 수모세포종, 신경초종, 신경아세포종, 뇌수막종, 대장암, 췌장암, 유방암, 전립선암, 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 골육종, 간세포 암종, 난소 암종, 폐 선암 및 식도 암종)으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 질환을 예방하거나 치료하는 방법으로서, 유효량의 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭, 또는 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭을 포함하는 유효량의 약학 조성물을 이를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 것을 포함하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 유효량의 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭, 또는 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭을 포함하는 유효량의 약학 조성물을 다발성 경화증, 알츠하이머병, 파킨슨병 또는 녹내장의 예방 또는 치료를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 것을 포함하는, 다발성 경화증, 알츠하이머병, 파킨슨병 또는 녹내장을 예방하거나 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 유효량의 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭을 투여하는 것을 포함하는, 뉴로트로핀 수용체 또는 뉴로트로핀의 활성의 자극의 결여를 앓고 있는 포유동물에서 뉴로트로핀 수용체 또는 뉴로트로핀의 활성의 자극에 반응하는 질환을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 뉴로트로핀 수용체 또는 뉴로트로핀의 활성의 자극에서 사용하기 위한, 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 뉴로트로핀 수용체 활성의 자극을 필요로 하는 피험체에게 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭을 투여하는 것을 포함하는, 상기 피험체에서 뉴로트로핀 수용체 활성을 자극하는 방법을 제공하는 것이다. 일 실시양태에서, 뉴로트로핀 수용체는 TrkA 수용체, TrkB 수용체 또는 p75 수용체이다.
본 발명의 추가의 양태는 유효량의 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭을 투여하는 것을 포함하는, 신경 성장 인자 수용체 또는 신경 성장 인자의 활성의 자극의 결여를 앓고 있는 포유동물에서 신경 성장 인자 수용체 또는 신경 성장 인자의 활성의 자극에 반응하는 질환을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 신경 성장 인자 수용체 또는 신경 성장 인자의 활성의 자극에서 사용하기 위한, 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 신경 성장 인자 수용체 활성의 자극을 필요로 하는 피험체에게 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭을 투여하는 것을 포함하는, 상기 피험체에서 신경 성장 인자 수용체 활성을 자극하는 방법을 제공하는 것이다. 일 실시양태에서, 신경 성장 인자 수용체는 TrkA 수용체 또는 p75 수용체이다.
본 발명의 추가의 양태는 유효량의 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭을 투여하는 것을 포함하는, 뇌 유래 뉴로트로핀 인자 수용체 또는 뇌 유래 뉴로트로핀 인자의 활성의 자극의 결여를 앓고 있는 포유동물에서 뇌 유래 뉴로트로핀 인자 수용체 또는 뇌 유래 뉴로트로핀 인자의 활성의 자극에 반응하는 질환을 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 뇌 유래 뉴로트로핀 인자 수용체 또는 뇌 유래 뉴로트로핀 인자의 활성의 자극에서 사용하기 위한, 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 양태는 뇌 유래 뉴로트로핀 인자 수용체 활성의 자극을 필요로 하는 피험체에게 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭을 투여하는 것을 포함하는, 상기 피험체에서 뇌 유래 뉴로트로핀 인자 수용체 활성을 자극하는 방법을 제공하는 것이다. 일 실시양태에서, 신경 성장 인자 수용체는 TrkB 수용체 또는 p75 수용체이다.
본 발명의 추가의 양태는 유효량의 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭을 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하는 것을 포함하는 약학 조성물을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가의 실시양태 및 이점이 부분적으로 하기 명세서에 기재되어 있고, 명세서로부터 진행되거나, 본 발명의 실행에 의해 습득될 수 있다. 본 발명의 실시양태 및 이점이 특히 특허청구범위에 기재된 구성요소 및 조합에 의해 구현되고 획득될 수 있다.
상기 개요 및 하기 상세한 설명 둘 다가 오직 예시적이고 설명적이지만 청구된 본 발명을 제한하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
도 1은 PC12 세포주에서의 용량 반응 분화 검정에서 G79, G80 및 G81에서의 실시예 2의 결과를 도시한 것이다. 도 1a는 G79의 존재 하에 분화된 PC12 세포의 이미지를 도시한 것이다. 도 1b는 G80의 존재 하에 분화된 PC12 세포의 이미지를 도시한 것이다. 도 1c는 G81의 존재 하에 분화된 PC12 세포의 이미지를 도시한 것이다. 도 1d는 용량 반응 분화 검정에서의 분화된 세포의 수를 보여준다. 도 1e는 NGF 유도 분화에 대해 계산된 분화된 세포의 백분율을 보여준다. 데이터는 각각 2회의 3 이상의 실험의 평균±SEM이다.
도 2는 RN22 세포 생존의 촉진에서의 G79, G80 및 G81의 효과를 보여준다. 각각 2회의 3 실험의 평균±S.E.이 도시되어 있다. 스트레스 대조군의 경우 *p < 0.05, **p < 0.01(ANOVA).
도 3은 분비촉진제 활성 검정(도 3a), 상승 활성 검정(도 3b), TrkA 활성화 검정(도 3c), LY294002의 존재 하의 신호전달 억제 검정(도 3d) 및 PD98059의 존재 하의 신호전달 억제 검정(도 3e)에서의 G79, G80 및 G81의 효과를 도시한 것이다. 도 3f∼도 3j는 NGF 유도 분화에 대해 계산된 분화된 세포의 백분율로서의 각각 도 3a∼도 3e에 도시된 효과를 보여준다.
도 4는 녹내장 모델에서의 G79의 결과를 도시한 것이다. 도 4a는 대조군, 위약, 200 ㎍/㎖ NGF, 200 ㎍/㎖ G79 및 400 ㎍/㎖ G79에 대한 망막 신경절 세포의 수를 보여준다. 도 4b는 대조군, 위약, 200 ㎍/㎖ NGF, 200 ㎍/㎖ G79 및 400 ㎍/㎖ G79에 의한 처치 후의 망막 절편을 보여준다. 도 4c는 대조군, 위약, 200 ㎍/㎖ G79, 티몰롤 및 200 ㎍/㎖ G79 및 티몰롤에 대한 망막 신경절 세포의 수를 보여준다.
도 5는 파킨슨병 모델(도 5a) 및 산화 스트레스 모델(도 5b)에서의 G79, G80 및 G81의 결과를 도시한 것이다.
도 6은 100 ng/㎖의 G79로 처치된 PC12 세포의 웨스턴 블롯 분석의 결과의 형광 이미지를 도시한 것이다.
도 7은 수용체 티로신 키나제(RTK)의 인산화에 의해 활성화된 세포내 경로를 보여준다.
도 8은 루미넥스(Luminex) 기술에 의해 시험된 인단백질 ATF-2, HSP-27, JNK 및 STAT-1의 활성화의 수준에 대한 G79 및 BDNF의 효과를 도시한 것이다.
도 9는 실시예 13의 세포계수 결합 검정에서의 G79의 효과를 도시한 것이다. 도 9a는 PC12(NGF/G79-FITC)에서의 경쟁 검정에서의 평균 채널 형광(MCF)을 보여준다. 도 9b는 항-TrkA 항체에 의한 PC12(NGF/G79-FITC)에서의 경쟁 검정에서의 MCF를 보여준다. 도 9c는 항-p76 항체에 의한 PC12(NGF/G79-FITC)에서의 경쟁 검정에서의 MCF를 보여준다. 도 9d는 SH-SY5Y(BDNF/G79-FITC)에서의 경쟁 검정에서의 MCF를 보여준다.
도 10은 근위축성 축삭 경화증(ALS)의 실험실내 모델에서의 G79, G80 및 G81의 결과를 도시한 것이다.
도 11은 G79 또는 감보그산 아미드의 i.p. 투여 후의(도 11a) 및 살리프로덴의 경구 투여 후의(도 11b) MS의 생체내 모델에서의 예방 적용에서의 G79, 감보그산 아미드 및 살리프로덴의 결과를 보여준다.
도 12는 경구 투여 후의 MS의 생체내 모델에서의 치유 적용에서의 G79, 감보그산 아미드 및 살리프로덴의 결과를 보여준다.
도 13은 48 시간 동안 효소 iNOS의 유도에서의 G79의 효과의 결과를 도시한 것이다.
도 14는 신경염증에 대한 실험실내 모델에서의 G79의 결과를 도시한 것이다. 도 14a는 소뇌 기관형 배양에서의 TNFα의 생성을 보여주고, 도 14b는 기관형 소뇌 배양에서의 IL-1β의 생성을 보여준다.
본 발명의 일 양태는 뉴로트로핀 수용체의 효현제, 특히 신경 성장 인자(NGF) 수용체 및 뇌 유래 뉴로트로핀 인자(BDNF) 수용체의 효현제로서의 화학식 Ⅰ-Ⅴ의 화합물 및 이의 약학적으로 허용되는 염 및 프로드럭의 용도에 기초한다. 이의 특성의 관점에서, 화학식 Ⅰ-Ⅴ의 화합물 및 이의 약학적으로 허용되는 염 및 프로드럭은 뉴로트로핀 수용체 및 특히 신경 성장 인자 또는 신경 성장 인자 수용체 또는 뇌 유래 뉴로트로핀 인자 또는 뇌 유래 뉴로트로핀 인자 수용체의 자극에 반응하는 질환을 예방하거나 치료하는 데 유용하다.
화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물은 PC12 세포의 분화를 유도하고 RN22 세포의 세포 생존을 촉진함으로써 "실험실내" 활성과 같은 우수한 NGF를 나타내고, 따라서 신경보호 특성을 갖는다.
이러한 본 발명의 양태에서 유용한 화합물은 하기 화학식 Ⅰ로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭이다:
Figure pct00001
[식 중,
R1은 할로겐 또는 트리플루오로메틸로 치환되고, 추가로 할로겐, C1-6 알킬, (C1-6)알콕시 및 할로(C1-6)알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 또는 2개의 치환기로 임의로 치환된 페닐이거나;
R1은 피롤리딘-1-일이고;
R2는 2-옥소-피롤리딘-1-일메틸 또는 설파모일페닐이고;
R3은 프로필, 1-메틸에틸, 부틸, 2-메틸프로필, 펜틸, 1-메틸부틸, 2-메틸부틸, 헥실, 4-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 2-메틸펜틸 및 1-메틸펜틸로부터 선택된다].
일 실시양태에서, 본 발명에서 유용한 화합물은 R1이 플루오로페닐인 화학식 Ⅰ의 화합물이다. 일 실시양태에서, 플루오로페닐 기는 2-플루오로페닐, 3-플루오로페닐 또는 4-플루오로페닐이다. 바람직하게는, R1은 2-플루오로페닐이다. 일 실시양태에서, 플루오로페닐 기는 할로겐, C1-6 알킬, (C1-6)알콕시 및 할로(C1-6)알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 또는 2개의 치환기; 바람직하게는 할로겐, C1-4 알킬, (C1-4)알콕시 및 할로(C1-4)알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 또는 2개의 치환기; 더 바람직하게는 할로겐, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 메톡시, 에톡시, 플루오로메틸 및 트리플루오로메틸로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 또는 2개의 치환기로 추가로 치환된다.
일 실시양태에서, 본 발명에서 유용한 화합물은 R1이 클로로페닐인 화학식 Ⅰ의 화합물이다. 일 실시양태에서, 클로로페닐 기는 2-클로로페닐, 3-클로로페닐 또는 4-클로로페닐이다. 일 실시양태에서, R1은 2-클로로페닐이다. 일 실시양태에서, 클로로페닐 기는 할로겐, C1-6 알킬, (C1-6)알콕시 및 할로(C1-6)알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 또는 2개의 치환기; 바람직하게는 할로겐, C1-4 알킬, (C1-4)알콕시 및 할로(C1-4)알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 또는 2개의 치환기; 더 바람직하게는 할로겐, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 메톡시, 에톡시, 플루오로메틸 및 트리플루오로메틸로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 또는 2개의 치환기로 추가로 치환된다.
일 실시양태에서, 본 발명에서 유용한 화합물은 R1이 브로모페닐인 화학식 Ⅰ의 화합물이다. 일 실시양태에서, 브로모페닐 기는 2-브로모페닐, 3-브로모페닐 또는 4-브로모페닐이다. 일 실시양태에서, R1은 2-브로모페닐이다. 일 실시양태에서, 브로모페닐 기는 할로겐, C1-6 알킬, (C1-6)알콕시 및 할로(C1-6)알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 또는 2개의 치환기; 바람직하게는 할로겐, C1-4 알킬, (C1-4)알콕시 및 할로(C1-4)알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 또는 2개의 치환기; 더 바람직하게는 할로겐, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 메톡시, 에톡시, 플루오로메틸 및 트리플루오로메틸로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 또는 2개의 치환기로 추가로 치환된다.
일 실시양태에서, 본 발명에서 유용한 화합물은 R1이 요오도페닐인 화학식 Ⅰ의 화합물이다. 일 실시양태에서, 요오도페닐 기는 2-요오도페닐, 3-요오도페닐 또는 4-요오도페닐이다. 일 실시양태에서, R1은 2-요오도페닐이다. 일 실시양태에서, 요오도페닐 기는 할로겐, C1-6 알킬, (C1-6)알콕시 및 할로(C1-6)알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 또는 2개의 치환기; 바람직하게는 할로겐, C1-4 알킬, (C1-4)알콕시 및 할로(C1-4)알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 또는 2개의 치환기; 더 바람직하게는 할로겐, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 메톡시, 에톡시, 플루오로메틸 및 트리플루오로메틸로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 또는 2개의 치환기로 추가로 치환된다.
일 실시양태에서, 본 발명에서 유용한 화합물은 R1이 트리플루오로메틸페닐인 화학식 Ⅰ의 화합물이다. 일 실시양태에서, 트리플루오로메틸페닐 기는 2-트리플루오로메틸페닐, 3-트리플루오로메틸페닐 또는 4-트리플루오로메틸페닐이다. 유용한 화합물은 R1이 2-트리플루오로메틸페닐인 화합물을 포함한다. 일 실시양태에서, 트리플루오로메틸페닐 기는 할로겐, C1-6 알킬, (C1-6)알콕시 및 할로(C1-6)알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 또는 2개의 치환기; 바람직하게는 할로겐, C1-4 알킬, (C1-4)알콕시 및 할로(C1-4)알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 또는 2개의 치환기; 더 바람직하게는 할로겐, 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 메톡시, 에톡시, 플루오로메틸 및 트리플루오로메틸로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 또는 2개의 치환기로 추가로 치환된다.
일 실시양태에서, 본 발명에서 유용한 화합물은 R1이 피롤리딘-1-일인 화학식 Ⅰ의 화합물이다.
일 실시양태에서, 본 발명에서 유용한 화합물은 R2가 2-옥소-피롤리딘-1-일-메틸인 화학식 Ⅰ의 화합물이다.
일 실시양태에서, 본 발명에서 유용한 화합물은 R2가 설파모일페닐인 화학식 Ⅰ의 화합물이다. 일 실시양태에서, 설파모일페닐 기는 2-설파모일페닐, 3-설파모일페닐 또는 4-설파모일페닐이다. 바람직하게는, R2는 4-설파모일에틸이다.
일 실시양태에서, 본 발명에서 유용한 화합물은 R3이 2-메틸프로필인 하기 화학식 Ⅱ를 갖는 화학식 Ⅰ의 화합물 및 이의 약학적으로 허용되는 염 및 프로드럭이다:
Figure pct00002
[식 중, R1 및 R2는 화학식 Ⅰ에 대해 상기 정의된 바와 같다].
일 실시양태에서, 본 발명에서 유용한 화합물은 하기와 같이 R1이 2-플루오로페닐 또는 피롤리딘-1-일이고, R2가 2-옥소-피롤리딘-1-일메틸 또는 4-설파모일페닐인 화학식 Ⅰ-Ⅱ의 화합물 및 이의 약학적으로 허용되는 염 및 프로드럭이다:
Figure pct00003
.
본 발명에 따른 바람직한 화합물은 하기 화학식 Ⅲ-V 중 임의의 화학식으로 표시되는 화학식 Ⅰ의 화합물 및 이들의 약학적으로 허용되는 염 및 프로드럭이다:
화학식 Ⅲ:
Figure pct00004
[N-(2-(2'-플루오로페닐)에틸)글리실]-[N-(2-메틸프로필)글리실]-N-[3-(2'-옥소피롤리디닐)프로필]글리신아미드(G79);
화학식 Ⅳ:
Figure pct00005
[N-(2-(2'-플루오로페닐)에틸)글리실]-[N-(2-메틸프로필)글리실]-N-[2-(4'-설파모일페닐)에틸] 글리신아미드(G80); 및
화학식 Ⅴ:
Figure pct00006
[N-(2-(1-피롤리디닐)에틸)글리실]-[N-(2-메틸프로필)글리실]-N-[2-(4'-설파모일페닐)에틸]글리신아미드(G81),
및 이의 약학적으로 허용되는 염 및 프로드럭.
일 실시양태에서, 화학식 Ⅰ의 화합물은 화학식 Ⅲ의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭이다.
일 실시양태에서, 화학식 Ⅰ의 화합물은 화학식 Ⅳ의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭이다.
일 실시양태에서, 화학식 Ⅰ의 화합물은 화학식 Ⅴ의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭이다.
유용한 할로겐 기로는 불소, 염소, 브롬 및 요오드를 들 수 있다.
유용한 알킬 기는 직쇄 및 분지쇄 C1 -6 알킬 기, 더 바람직하게는 직쇄 C1 -4 알킬 기 및 분지쇄 C1 -4 알킬 기로부터 선택된다. 통상적인 C1 -6 알킬 기로는 무엇보다도 메틸, 에틸, 프로필, 이소프로필, 부틸, sec-부틸, tert-부틸, 이소-부틸, 3-펜틸, 헥실을 들 수 있다.
유용한 할로(C1-6)알킬 기로는 1개 이상의 불소, 염소, 브롬 또는 요오드 원자로 치환된 상기 언급된 C1-6 알킬 기(예를 들면, 플루오로메틸, 디플루오로메틸, 트리플루오로메틸, 펜타플루오로에틸, 1,1-디플루오로에틸 및 트리클로로메틸 기) 중 어느 하나를 들 수 있다. 바람직하게는, 할로(C1-6)알킬 기는 트리플루오로메틸이다.
유용한 C1-6 알콕시 기로는 상기 언급된 C1-6 알킬 기로 치환된 산소(예를 들면, 메톡시, 에톡시, 프로폭시, 이소-프로폭시, 부톡시, tert-부톡시, 이소-부톡시, sec-부톡시 및 펜틸옥시)를 들 수 있다.
화학식 Ⅲ-V의 화합물이 스트레스 유도 후 PC12 세포의 분화 및 RN22 세포의 생존을 유도한다는 것이 밝혀졌다. 화학식 Ⅲ-V의 화합물의 작용 기전이 조사되었다. 따라서, 배양에서의 NGF와 함께 화학식 Ⅲ-V의 화합물의 효과를 시험하였다. 상기 화합물이 리간드로서 작용하거나 NGF에 의해 유도된 경로에서 방해하는 경우, 이것은 NGF의 활성을 억제할 수 있다. 달리 화합물이 상가 효과를 생성하는 경우, 이것은 평행 기전을 통해 작용할 수 있다. 그 결과, 본 발명자들은 G79, G80 및 G81이 NGF와 병용시 상가 효과를 생성하지 않는다는 것을 발견하였다. 병용 치료와 비교하여 상기 화합물로만 처치시 분화된 세포의 수의 큰 차이가 존재하지 않았다. 화학식 Ⅲ-V의 화합물이 NGF의 동일한 경로에서 작용한다는 것을 의미한다. NGF 뉴로트로핀 반응의 감소는 NGF의 부분 효현제의 프로필에 해당한다.
세포 표면에 대한 화학식 Ⅲ-V의 화합물의 결합을 더 잘 이해하기 위해, PC12 세포를 세포외 도메인에서의 NGF에 대한 TrkA의 결합 자리를 차단하는 항체 항-TrkA의 존재 하에 NGF 또는 화합물로 처치하였다. 따라서, 펩티도유사체가 결합 자리를 활성화함으로써 이의 활성을 발휘하는 경우, 이 항체의 존재는 이의 활성을 방지할 것이다. 그렇지 않으면, NGF 경로에 대한 활성이 유지되는 경우, 이는 뉴로트로핀 펩티도유사체가 TrkA의 결합 자리와 상이한 분자의 다른 지점에서의 TrkA를 활성화함으로써 이의 활성을 발휘한다는 것을 나타낼 것이다. 이 결과는 배양물에 항체 항-TrkA를 첨가함으로써 NGF 뉴로트로핀 활성이 감소하지만, 화합물 단독의 처치 또는 화합물과 항체의 조합의 치료 사이의 분화의 백분율이 매우 다르지 않다는 것을 보여준다. 이는 화합물의 활성이 TrkA 수용체의 세포외 부분에 대한 결합에 의해 중재되지 않는다는 것을 제시할 수 있다. 그러나, 이 결과는 화학식 Ⅲ-V의 화합물이 TrkA의 세포내 부분 또는 세포내 신호전달 경로의 다른 구성원에 결합한다는 것을 배제하지 않는다. G79가 뉴로트로핀 수용체에 대한 결합에 NGF 및 BDNF와 경쟁한다는 것이 또한 발견되었다. 이 효과는 실험에서 사용되는 세포주의 세포 표면에서 훨씬 많이 발현되는 p75 수용체에 대한 경쟁으로 인할 수 있다.
화학식 Ⅲ-V의 화합물이 분비촉진제로서 작용할 수 있는 가능성이 또한 고려되고, 이로써 NGF의 합성의 상향조절을 통한 이의 효과를 유도한다. 항체 항-NGF와 함께 NGF의 처치가 PC12 세포의 분화의 감소를 유도하지만, 화합물 단독의 처치와 비교하여 동일한 항체의 존재 하에 G79, G80 및 G81에 의해 유도된 분화의 백분율의 차이가 없다는 것이 발견되었다. 이러한 이유로, G79, G80 및 G81은 분비촉진제로서 작용하기 않는다.
화학식 Ⅲ-V의 화합물의 작용 기전을 연구하기 위해, 분자의 뉴로트로핀 활성이 TrkA 신호전달의 2개의 주요 경로인 AKT 및 ERK 활성화에 의존하는지에 대해 조사하였다. NGF와 억제제 LY294002 또는 PD98059의 조합의 처치가 NGF 단독의 처치에 비해 PC12 세포에서의 분화의 백분율을 감소시키면서, 또한 G79, G80 및 G81과 억제제의 조합의 분화의 백분율이 화합물 단독의 처치와 비교하여 감소하였다는 것이 발견되었다.
결과적으로, 본 발명의 NGF양 소분자는 NGF의 합성을 활성화하는 일 없이 분화를 유도한다. 이것은 또한 TrkA의 세포외 부분에 결합함이 없이 PI3K/AKT 및 MAPK/ERK TrkA 경로의 활성화를 통해 작용한다.
뉴로트로핀 경로를 활성화하는 화학식 Ⅲ-V의 화합물의 능력을 루미넥스 검정과 함께 Pi3K 및 MAP 키나제 경로의 억제제의 존재 하의 분화 검정에서 시험하였다. 이 결과에 따르면, 화합물 G79, G80 및 G81은 뉴로트로핀 경로를 활성화한다. 예를 들면, HSP-27과 같은 열 충격 단백질은 상이한 물질 및 뉴로트로핀 인자에 의해 활성화될 수 있다(Liu H. et al, J Neurochem., 86, 1553-1563, 2003; Yuan Y et al, Eur. J. Pharmacol. 586, 100-105, 2008; O'Reilly AM et al, Mol Neurobiol, 42, 124-132, 2010). 수행된 시험은 HSP-27이 NGF와 유사하게 G79 실험실내 자극 후 상당히 활성화된다는 것을 보여준다.
신경퇴행성 질환의 생체내 및 실험실내 모델에 대한 화학식 Ⅲ-V의 화합물의 효과를 또한 시험하였다. PD, ALS 및 신경염증의 실험실내 모델에서의 G79의 신경보호성 효과가 나타난다. 또한, G79는 EAE로 이환된 동물의 임상 점수를 개선하고, 녹내장 눈에서의 RGC의 세포사를 감소시키는, MS 및 녹내장 둘 다의 동물 모델에서의 생체내 유리한 효과를 보여준다. 화학식 Ⅲ-V의 화합물의 혈액-뇌 장벽(BBB)을 통한 침투를 또한 시험하였다. 이 결과에 따르면, G79는 능동 수송에 의한 BBB를 통한 더 우수한 침투를 보여주고, 이로써 G80 및 G81보다 이의 더 우수한 프로필을 설명한다. 이러한 형태의 수송은 수동 수송과 비교하여 더 특이적인 약물 전달 및 뇌 내부의 영구성을 보장한다.
결과적으로, 이 결과는 뉴로트로핀양 분자가 뇌로의 뉴로트로핀의 전달의 문제점을 극복하기 위한 우수한 치료 전략을 제공할 수 있어서, 신경퇴행성 질환의 치료에 대한 뉴로트로핀 그 자체의 유리한 효과를 보존하고, 심지어 개선한다는 것을 보여준다.
본원에 사용되는 "프로드럭"이라는 용어는, 개인에게 투여할 때, 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염을 개인에게 직접적으로 또는 간접적으로 제공할 수 있는, 에스테르, 아미드, 포스페이트 등과 같은 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물로부터 유도되는 임의의 화합물을 포함한다. 바람직하게는, 상기 유도체는, 개인에게 투여할 때, 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물의 생체이용율을 증가시키거나 생물학적 구획에서 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물의 방출을 촉진하는 화합물이다. 상기 유도체의 성질은 중요하지 않지만, 단 이것을 개인에게 투여할 수 있어야 하고 이것이 개인의 생물학적 구획에서 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물을 제공할 수 있어야 한다. 당업자에게 공지된 전통적인 방법에 의해 상기 프로드럭의 제조를 수행할 수 있다. 적합한 프로드럭 유도체의 선택 및 제조에 대한 전통적인 절차는, 예를 들면 문헌[Design of Prodrugs, H. Bundgaard ed., Elsevier (1985)]에 기재되어 있다. 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물의 프로드럭의 예는 리포솜으로의 이의 캡슐화일 수 있다. 이러한 절차에 의해, 펩토이드를 적절한 리포솜 전구체(레시틴, 콜레스테롤 및 물과 같은 인지질의 조합)로 처리하여 캡슐화한다. 펩토이드의 친유성에 따라, 화합물이 리포솜의 친유성 부분에서 또는 수성 내부 부분에서 보유될 수 있다. 치료 중합체와 관련하여, 펩토이드는 말단 카복스아미드의 위치선택적 가수분해 후 생성되는 공유 결합에 의해 중합체에 부착될 것이다. 이러한 가수분해는 중합체의 아미노 또는 히드록실 활성화 기와 축합될 수 있는 자유 카복실산이 되게 한다.
"약학적으로 허용되는"이라는 용어는 화합물 또는 화합물의 조합이 제제의 다른 성분과 충분히 상용성이고, 산업 기준에 의해 허용되는 수준까지 환자에게 해롭지 않다는 것을 의미한다.
치료 용도를 위해, 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물의 염은 반대 이온이 약학적으로 허용되는 것이다.
본원에 기재된 "염"이라는 용어는 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물이 형성할 수 있는 임의의 안정한 염을 포함하도록 의도된다. 약학적으로 허용되는 염이 바람직하다. 약학적으로 허용되지 않는 염은 또한 본 발명의 범위 내에 포함되는데, 왜냐하면 이것은 약리학적 활성을 갖는 화합물의 제조시 유용할 수 있는 중간체를 의미하기 때문이다.
화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물의 염기 형태를 편리하게는 염산 또는 브롬산, 황산, 질산, 인산 및 유사 산과 같은 무기 산; 또는 아세트산, 프로판산, 히드록시아세트산, 락트산, 피루브산, 옥살산(즉, 에탄이산), 말론산, 숙신산(즉, 부탄디온산), 말레산, 푸마르산, 말산(즉, 히드록시부탄이산), 타르타르산, 시트르산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산, p-톨루엔설폰산, 사이크람산, 살리실산, p-아미노살리실산, 파모산 및 유사 산과 같은 유기 산으로서의 이러한 적절한 산으로 처리함으로써 염을 얻을 수 있다.
화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물의 염기 형태를 예를 들면 염산, 브롬산 등; 황산; 질산; 인산 등; 또는 유기 산, 예를 들면 아세트산, 프로판산, 히드록시아세트산, 2-히드록시프로판산, 2-옥소프로판산, 옥살산, 말론산, 숙신산, 말레산, 푸마르산, 말산, 타르타르산, 2-히드록시-1,2,3-프로판-트리카복실산, 메탄설폰산, 에탄설폰산, 벤젠설폰산, 4-메틸벤젠설폰산, 시클로헥산설판산, 2-히드록시벤조산, 4-아미노-2-히드록시벤조산 및 유사 산을 비롯한 무기 산과 같은 이러한 적절한 약학적으로 허용되는 산으로 처리함으로써 약학적으로 허용되는 염을 얻을 수 있다.
반대로 염 형태를 알칼리에 의한 처리에 의해 자유 염기 형태로 전환할 수 있다.
"약학 조성물"이라는 용어는, 본 발명의 목적상, 활성 화합물로서, 전부 또는 부분적으로, 치료학적(예를 들면, 약학적) 효과가 기인하는, 1종 이상의 본 발명의 화합물 또는 이의 조합을 포함하고, 부형제, 담체 또는 기타 등등으로서 1종 이상의 약학적으로 허용되는 비활성 성분을 임의로 추가로 포함할 수 있는 임의의 조성물을 의미한다.
"예방하는"이라는 용어는 이러한 용어가 적용되는 질환, 질병 또는 병증 또는 질환, 질병 또는 병증과 관련되는 1종 이상의 증상의 개시 또는 재발이 발생하지 않거나, 존재하지 않거나, 대안적으로 지연시키는 것을 의미한다. "예방하는"이 직전 정의된 바대로, "예방"이라는 용어는 예방 작용을 의미한다.
본원에 사용되는 "치료하는"이라는 용어는 이러한 용어가 적용되는 질병 또는 병증 또는 질병 또는 병증과 관련되는 1종 이상의 증상의 진행을 역전, 완화 또는 억제하는 것을 의미한다. "치료하는"이 직전 정의된 바대로, "치료"라는 용어는 치료 작용을 의미한다.
"피험체"라는 용어는 동물, 특히 포유동물, 예컨대 개, 고양이, 소, 말, 양, 거위 및 인간를 의미한다. 특히 바람직한 피험체는 양성의 인간을 비롯한 포유동물이다.
"유효량"의 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 및 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭은 0.01 ㎎ 내지 50 g/일, 0.02 ㎎ 내지 40 g/일, 0.05 ㎎ 내지 30 g/일, 0.1 ㎎ 내지 20 g/일, 0.2 ㎎ 내지 10 g/일, 0.5 ㎎ 내지 5 g/일, 1 ㎎ 내지 3 g/일, 2 ㎎ 내지 2 g/일, 5 ㎎ 내지 1,5 g/일, 10 ㎎ 내지 1 g/일, 10 ㎎ 내지 500 ㎎/일 범위일 수 있다.
신경 세포는 뇌, 척수, 시신경, 망막 및 말초 신경절의 임의의 구역 유래의 세포를 포함한다. 뉴런은 해마, 소뇌, 척수, 피질(예를 들면, 운동 또는 체성 피질), 선조체, 전뇌 기저부(콜린작동성 뉴런), 복측 중뇌(흑질 세포) 및 청반핵(중추 신경계의 뉴로아드레날린 세포)로부터의 조직을 비롯하여 배아, 태아 또는 성인 신경 조직의 뉴런을 포함한다.
본 발명은 또한 신경 세포사 또는 신경 세포 손상의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에서의 활성 성분으로서의 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 및 이의 약학적으로 허용되는 염 및 프로드럭의 용도를 포괄한다. 즉, 본 발명은 신경 세포사 또는 신경 세포 손상의 예방 또는 치료에 사용하기 위한 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 및 이의 약학적으로 허용되는 염 및 프로드럭에 관한 것이다. 유사하게, 본 발명은 유효량의 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭을 신경보호를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 것을 포함하는 신경보호 방법에 관한 것이다.
본 발명의 일 실시양태에서, 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 및 이의 약학적으로 허용되는 염 및 프로드럭을 전자 수송 사슬의 억제제, 골지체 길항제, 액손 손상 또는 손실, 탈수초화, 염증, 병리학적 뉴런 파열(발작)(이들로 제한되지는 않음)을 비롯한 화학 물질, 예컨대 산화 스트레스 상태, 독성 물질, 감염성 생물체, 방사선, 외상성 손상, 저산소증, 허혈, 비정상 미스폴딩 단백질, 흥분독소, 자유 라디칼, 소포체 스트레스 요인, 미토콘드리아 스트레스 요인(이들로 제한되지는 않음)으로부터 선택되는 신경 세포사 또는 신경 세포 손상과 관련되는 1개 이상, 바람직하게는 2개 이상의, 병리학적 또는 해로운 병증의 예방 또는 치료에 사용할 수 있다. 또한 바람직하게는, 본 발명의 용도 및 방법은, 원인과 무관하게, 신경 세포사 또는 신경 세포 손상을 예방하거나 치료하는 것에 관한 것이다.
"신경보호", "신경보호성" 또는 "신경보호성 효과"라는 용어는 뉴런 및 신경교(glia)를 비롯하여 신경 세포에 대한 사망 또는 손상을 예방하거나 감소시키거나, 또는 예를 들면 뇌, 중추 신경계 또는 말초 신경계에의 병리학적 또는 해로운 증상 이후에 신경 세포를 구제하거나, 소생시키거나 회복시키는 능력을 의미한다. 따라서, 이 신경보호성 효과는 이의 뉴런 기능을 유지시키거나 회복시키는 뉴런 세포의 확인된 능력을 포함한다. 이는 뉴런 세포의 세포막을 안정화하거나 뉴런 세포 기능의 정상화를 돕는다. 이는 뉴런 세포의 생존율 또는 기능의 손실을 예방한다. 이는 세포사를 발생시키는 뉴런의 진행성 퇴행의 억제로 구성된다. 이는 스트레스로부터의 뉴런의 임의의 검출 가능한 보호를 의미한다. 신경보호는 신경 세포의 재생, 즉 질환 또는 외상 후 신경 세포의 집단의 재성장을 포함한다.
현재, 대부분의 신경 질환 및 정신 질환은 "질환 개선 약물"이라고도 칭하는 질환의 과정을 중지시키거나 완화하는 것을 목표하는 특이적 치료가 부족하다. 이는 이러한 질환에 일반적이지만 질환의 과정을 변화시키지 않는 대증 치료와 대조된다. 신경보호 약물은 뇌 질환의 치료를 위한 질환 개선 약물(DMD)이다.
그러므로, 일 실시양태에서, 본 발명은 신경 세포의 재생을 위한 약제의 제조에서의 활성 성분으로서의, 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 및 이의 약학적으로 허용되는 염 및 프로드럭의 용도에 관한 것이다. 즉, 본 발명은 신경 세포의 재생에 사용하기 위한, 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 및 이의 약학적으로 허용되는 염 및 프로드럭에 관한 것이다. 유사하게, 본 발명은 유효량의 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭을 신경 세포의 재생을 필요로 하는 피험체에게 투여하는 것을 포함하는 신경 세포를 재생하는 방법에 관한 것이다.
예를 들면, 스트레스 이후의 대뇌피질 배양에서의 아폽토시스 뉴런의 수의 감소에 의한 뉴런 사망의 지연 또는 예방을 측정함으로써, 신경보호를 직접 결정할 수 있다. 예를 들면, 중뇌 동맥(MCAO) 폐색 또는 재관류 손상 후 뇌경색의 크기의 감소를 측정함으로써, 이러한 스트레스 이후의 신경계의 조직 또는 기관에 대한 손상 또는 이에 의한 기능 소실의 정도 또는 중증도를 측정함으로써, 신경보호를 또한 직접 결정할 수 있다. 또한, (분광계, 눈 합착 단층촬영에 의해 뇌 용적, 트랙토그래피, N-아세틸-아스파르테이트의 수준을 측정하는) 자기 공명 영상에 의해 신경보호를 확인할 수 있다. 대안적으로, 힘옥시게나제(hemeoxygenase-1)(HO-1)(이로 제한되지는 않음)를 비롯하여 하나 이상의 2상 효소의 유도 또는 Keap1/Nrf2 경로의 활성화를 검출하는 것(이로 제한되지는 않음)을 비롯하여 뉴런을 보호하기 위한 1종 이상의 생물 기전의 활성화를 검출함으로써 신경보호를 간접적으로 검출할 수 있다. 뉴런 보호를 검출하고 측정하는 방법이 하기 실시예에 제공되고, 이러한 다른 방법은 당해 분야에 공지되어 있다.
화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 및 이의 약학적으로 염 및/또는 프로드럭의 다양한 용도 및 사용 방법은 본 발명에서 손상으로부터 수 분 내지 거의 수 시간 내에 발생하는 급성 투여, 또는 만성 신경 질환 또는 정신 질환에 적합한 만성 투여를 포함한다.
본 발명의 일 실시양태에서, 신경보호 또는 신경 세포사 또는 신경 세포 손상의 예방 또는 치료의 다양한 용도 및 방법에서, 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 및 이의 약학적으로 허용되는 염 및 프로드럭을 신경 질환 또는 정신 질환을 앓는 피험체에게 투여한다.
신경 질환은 뇌, 척수, 뇌 신경, 말초 신경, 신경근, 자율 신경계, 신경근 접합부 및 근육의 질병을 비롯하여 중추 신경계 및 말초 신경계의 질병이다.
본 발명에 따라 예방 및/또는 치료될 수 있는 중추 신경계 및 말초 신경계의 질환으로는, 임상 발현 진행에서의 지식으로서, 투명 중격 부재, 산 리파제 질환, 산 말타제 결핍증, 후천성 발작성 실어증, 급성 산재성 뇌척수염, 아디 동공(Adie's Pupil), 아디 증후군(Adie's Syndrome), 부신피질이영양증, 뇌량 무발생, 실인증, 아이카디 증후군(Aicardi Syndrome), 아이카디-고티에 증후군(Aicardi-Goutieres Syndrome) 병, AIDS - 신경 합병증, 알렉산더병(Alexander Disease), 알퍼스병(Alpers' Disease), 교대성 편마비, 알츠하이머병(Alzheimer's Disease), 근위축성 축삭 경화증, 무뇌증, 동맥류, 안젤만 증후군(Angelman Syndrome), 혈관종, 무산소증, 항인지질항체 증후군, 실어증, 실행증, 지주막 낭종, 지주막염, 아놀드-키아리 기형(Arnold-Chiari Malformation), 동정맥 기형, 아스페르거 증후군(Asperger Syndrome), 운동실조, 운동실조 모세혈관확장등, 운동실조 및 소뇌 또는 척수소뇌 변성, 심방 세동 및 뇌졸중, 주의력 결핍 과잉 행동 장애(ADHD), 자폐증, 자율신경 기능장애, 요통, 바스 증후군(Barth Syndrome), 바튼병(Batten Disease), 베커 근긴장증(Becker's Myotonia), 베체트병(Behcet's Disease), 벨 마비(Bell's Palsy), 양성 본태성 안검경련, 양성 국소성 근위축증, 양성 두개강내 고혈압증, 베르나르-로쓰 증후군(Bernhardt-Roth Syndrome), 빈스완거병(Binswanger's Disease), 안검경련, 블로크-슐쯔베르거 증후군(Bloch-Sulzberger Syndrome), 상완 신경총 분만 외상, 상완 신경총 손상, 브래드버리-이글스턴 증후군(Bradbury-Eggleston Syndrome), 뇌 및 척수성 종양, 뇌 동맥류, 뇌경색, 뇌 허혈, 뇌 손상, 브라운-씨쿼드 증후군(Brown-Sequard Syndrome), 연수척수성 근위축증, 카다실(CADASIL), 카나반병(Canavan Disease), 손목 터널 증후군, 작열통, 해면종, 해면상 혈관종, 해면상 기형, 중심 경수 증후군, 중심 척수 증후군, 중심 통증 증후군, 중심 교뇌 수초용해, 두부형 질병, 세라미다제 결핍증, 소뇌 변성, 소뇌 형성부전, 뇌 동맥류, 뇌 동맥경화증, 뇌 위축증, 뇌 각기병, 뇌 해면상 기형, 뇌 거인증, 뇌 저산소증, 뇌 마비, 뇌-눈-얼굴-골격 증후군, 샤르코-마리-투스 질환(Charcot-Marie-Tooth Disease), 키아리 기형(Chiari Malformation), 콜레스테롤 에스테르 저장 질환, 무도병, 유극적혈구증가무도병, 만성 염증성 파종성 다신경병증(CIDP), 만성 기립성 조절장애, 만성 통증, II형 카케인 증후군(Cockayne Syndrome), 코핀 로우리 증후군(Coffin Lowry Syndrome), COFS, 거대후두각, 혼수, 복합 부위 통증 증후군, 선천성 얼굴 양측마비, 선천성 근무력증, 선천성 근육병, 선천성 혈관 해면상 기형, 피질기저 변성, 두개 동맥염, 두개유합증, 크로이츠펠트-야콥병(Creutzfeldt-Jakob Disease), 누적 외상 질병, 쿠싱 증후군(Cushing's Syndrome), 거세포봉입체증, 거대세포바이러스 감염, 춤추는 눈-춤추는 발 증후군, 댄디-워커 증후군(Dandy-Walker Syndrome), 도슨병(Dawson Disease), 드 모르시어 증후군(De Morsier's Syndrome), 파킨슨병에 대한 뇌심부 자극, 더저린-클룸케 마비(Dejerine-Klumpke Palsy), 치매, 치매 - 다발 경색 치매 - 의미 치매 - 피질하, 루이소체 치매, 치상 소뇌 운동실조, 치상적핵 위축증, 피부근염, 발달적 실행장애, 데빅 증후군(Devic's Syndrome), 당뇨병 신경병증, 미만성 경화증, 드라벳 증후군(Dravet Syndrome), 실조증, 난필증, 난독증, 연하곤란, 통합운동장애, 마이오클로누스성 소뇌성 공동 운동 장애, 진행성 소뇌성 공동 운동 장애, 근육긴장이상, 조기 영아 간질성 뇌증, 엠프티 셀라 증후군(Empty Sella Syndrome), 뇌염, 기면성 뇌염, 뇌류, 뇌증, 뇌증, 가족성, 두개강내 석회화상 및 만성 뇌척수액 림프구증가증을 동반한, 영아; 크리 뇌염(Cree encephalitis); 슈도-토치 증후군(Pseudo-Torch syndrome); 유사 톡소플라스마증 증후군(Pseudotoxoplasmosis syndrome), 뇌삼차신경 혈관종, 간질, 간질성 편마비, 에브-뒤시엔느(Erb-Duchenne) 및 더저린-클룸케 마비, 에브 마비(Erb's Palsy), 본태성 수전증, 교뇌외 수초용해, 페브리병(Fabry Disease), 파 증후군(Fahr's Syndrome), 기절, 가족성 자율신경 실조증, 가족성 혈관종, 가족성 특발성 기저핵 석회화, 가족성 주기성 마비, 가족성 강직성 마비, 파버병(Farber's Disease), 열성 발작, 섬유근성 증식증, 피셔 증후군(Fisher Syndrome), 영아 저긴장 증후군, 하수족, 프레드라이히 운동실조(Friedreich's Ataxia), 전측두엽 치매, 강글리오시드증, 고셔병(Gaucher's Disease), 거스트만 증후군(Gerstmann's Syndrome), 게르스트만-슈투로이슬러-샤잉커병(Gerstmann-Straussler-Scheinker Disease), 거대 축색 신경병증, 거대 세포 동맥염, 거대 세포 포함 질환, 구형 세포 백질이영양증, 설인 신경병증, 글리코겐 저장 질환, 길랑 바레 증후군(Guillain-Barre Syndrome), 할러보든-스파츠병(Hallervorden-Spatz Disease), 머리 손상, 두통, 지속적 편두통, 반측안면 경련, 교대성 편마비, 유전적 신경병증, 유전적 강직성 대마비, 유전성 다발신경염성 실조, 헤르페스 조스터(Herpes Zoster), 헤르페스 조스터 옥티쿠스(Herpes Zoster Oticus), 히라야마 증후군(Hirayama Syndrome), 홀메스-아디 증후군(Holmes-Adie syndrome), 완전전뇌증, HTLV-1 관련 척수병증, 휴스 증후군(Hughes Syndrome), 헌팅턴병(Huntington's Disease), 수두무뇌증, 수두증, 수두증 - 정상 압력, 척수 공동증, 고코르티솔증, 과수면증, 고긴장증, 저긴장증, 저산소증, 면역 중재 뇌척수염, 포함체 근육염, 색소 실소증, 영아 저긴장증, 영아 신경축삭 퇴행위축, 영아 피탄산 저장 질환, 영아 레프섬병(Refsum Disease), 영아 경련, 염증성 근육병, 후두공뇌탈출증, 장내 지방 영양 장해, 두개강내 낭종, 두개강내 고혈압증, 이삭 증후군(Isaac's Syndrome), 주버트 증후군(Joubert Syndrome), 컨스-세이어 증후군(Kearns-Sayre Syndrome), 케네디병(Kennedy's Disease), 킨즈본 증후군(Kinsbourne syndrome), 클라인-레빈 증후군(Kleine-Levin Syndrome), 클리펠-파일 증후군(Klippel-Feil Syndrome), 클리펠-트레나우네이 증후군(KTS; Klippel-Trenaunay Syndrome), 클뤼버-부시 증후군(Kluver-Bucy Syndrome,), 코르사코프 기억상실 증후군(Korsakoff's Amnesic Syndrome), 크라베병(Krabbe Disease), 쿠겔베르그-벨란더병(Kugelberg-Welander Disease), 쿠루병(Kuru), 람버트-이튼 근무력 증후군(Lambert-Eaton Myasthenic Syndrome), 랜도-클래프너 증후군(Landau-Kleffner Syndrome), 외측 대퇴부 피부 신경 포착, 외측 연수 증후군, 학습 장애, 레이병(Leigh's Disease), 레녹스-가스토 증후군(Lennox-Gastaut Syndrome), 레쉬-니한 증후군(Lesch-Nyhan Syndrome), 백질이영양증, 레빈-크리츨리 증후군(Levine-Critchley Syndrome), 루이소체 치매, 지질 저장 질환, 유지질 단백증, 활뇌증, 감금 증후군, 루게릭병(Lou Gehrig's Disease), 루푸스 - 신경학적 후유증, 라임병 - 신경학적 합병증, 마차도-요셉 질환(Machado-Joseph Disease), 대뇌증, 거대뇌증, 멜커슨-로젠탈 증후군(Melkersson-Rosenthal Syndrome), 뇌수막염, 뇌수막염 및 뇌염, 멘케병, 대퇴 신경통, 이염성 백질이영양증, 소두증, 편두통, 밀러 피셔 증후군(Miller Fisher Syndrome), 경증 인지 장애, 미니-뇌졸중, 미토콘드리아 근육병, 뫼비우스 증후군(Moebius Syndrome), 단지 근위축증, 운동 뉴런 질환, 모야모야병(Moyamoya Disease), 뮤코지질증, 뮤코다당류증, 다초점성 운동 신경병증, 다발성 경색 치매, 다발성 경화증, 다계통 위축증, 기립성 저혈압을 동반한 다계통 위축증, 근 이영양증, 근무력증 - 선천성, 중증 근무력증, 말이집탈락성 광범위 경화증, 영아 근간대성 뇌증, 근육간대경련, 근육병, 근육병 - 선천성, 근육병 - 갑상샘 중독성, 근긴장증, 근긴장증 관절구축증, 기면증, 신경가시세포증가, 뇌 철 축적에 의한 신경퇴행, 신경섬유종증, 항정신병약물 악성 증후군, AIDS의 신경학적 합병증, 라임병의 신경학적 합병증, 거대세포바이러스 감염의 신경학적 후유증, 폼피병(Pompe Disease)의 신경학적 발현, 루푸스의 신경학적 후유증, 시신경 척수염, 신경근긴장증, 뉴런 세로이드 리포푸스신증, 뉴런 이동 질병, 신경병증 - 유전적, 신경유육종증, 신경독성, 모반 해면, 니만-피크병(Niemann-Pick Disease), 정상 압력 수두증, 후두 신경통, 오타하라 증후군(Ohtahara Syndrome), 올리브교소뇌 위축증, 안구간대경련-근간대경련, 기립성 저혈압, 오설리번-맥레오드 증후군(O'Sullivan-McLeod Syndrome), 과사용 증후군, 통증 - 만성, 판토테네이트 키나제 관련 신경퇴행, 부종양 증후군, 이상감각, 파킨슨병, 발작성 무도곰지락운동, 발작성 편두통, 패리-룸버그(Parry-Romberg), 펠리제우스-메르츠바하병(Pelizaeus-Merzbacher Disease), II형 페나 쇼커(Pena Shokeir) 증후군, 주변신경 낭종, 주기성 마비, 말초 신경병증, 뇌실주위 백질연화증, 지속적 식물인간 상태, 지속적 발달 장애, 피탄산 저장 질환, 픽병(Pick's Disease), 압박 신경, 이상근 증후군, 뇌하수체 종양, 다발성 근염, 폼피병, 공뇌증, 포진후 신경병증, 감염후 뇌척수염, 후 소아마비 증후군, 기립성 저혈압, 기립성 기립성 빈맥 증후군, 기립성 빈맥 증후군, 원발성 결절충 위축증, 원발성 축삭 경화증, 원발성 진행성 실어증, 프리온병(Prion Diseases), 진행성 반측안면 위축증, 진행성 보행 운동실조, 진행성 다초점성 백질뇌증, 진행성 경화성 다발성이영양증, 진행성 핵상 마비, 안면실인증, 가성 뇌종양, I형 람세이-헌트 증후군(Ramsay Hunt Syndrome)(이전에 마이오클로누스성 소뇌성 공동 운동 장애, 진행성 소뇌성 공동 운동 장애, 치상핵적핵 변성증 또는 람세이 헌트 소뇌 증후군으로 알려짐), II형 람세이-헌트 증후군(이전에 이성 대상포진으로 알려짐), 라스무센 뇌염(Rasmussen's Encephalitis), 반사성 교감신경 위축증 증후군, 레프섬병, 영아 레프섬병, 반복 운동 질병, 반복 스트레스 손상, 하지 불안 증후군, 레트로바이러스 관련 척수병증, 레트 증후군(Rett Syndrome), 라이 증후군(Reye's Syndrome), 류마티스성 뇌염, 릴리-데이 증후군(Riley-Day Syndrome), 천골 신경근 낭종, 무도병, 침샘 질환, 샌드호프병(Sandhoff Disease), 쉴더병(Schilder's Disease), 뇌갈림증, 자이텔베르거병(Seitelberger Disease), 발작 질병, 노인성 치매, 중격-시신경 형성이상, 영아 중증 근간대성 간질(SMEI; Severe Myoclonic Epilepsy of Infancy), 쉐이큰 베이비 증후군(Shaken Baby Syndrome), 대상포진, 샤이-드래거 증후군(Shy-Drager Syndrome), 쇼그렌 증후군(Sjogren's Syndrome), 수면 무호흡, 수면병, 소토스 증후군(Sotos Syndrome), 경직, 척추 갈림증, 척수 경색, 척수 손상, 척수 종양, 척수성 근위축증, 척수소뇌 위축증, 척수소뇌 변성, 스틸-리차드슨-올스제위스키 증후군(Steele-Richardson-Olszewski Syndrome), 강직 인간 증후군, 줄무늬체흑질 변성(Striatonigral Degeneration), 뇌졸중, 스터지-베버 증후군(Sturge-Weber Syndrome), 아급성 경화성 범뇌염, 피질하 동맥경화성 뇌증, SUNCT 두통, 연하 질병, 시데남 무도병, 실신, 매독성 척수성 경화증, 척수 구멍증, 척수 공동증, 전신성 홍반성 낭창, 척수로, 지발성 안면마비, 담낭-포낭, 테이-사흐병(Tay-Sachs Disease), 측두 동맥염, 구속성 척수 증후군, 톰슨형 근긴장증, 흉곽 출구 증후군, 갑상샘 중독성 근육병, 유통성 티크, 토트 마비(Todd's Paralysis), 뚜렛 증후군(Tourette Syndrome), 일과성 허혈 발작, 전염성 해면양 뇌증, 횡단성 척수염, 외상성 뇌 손상, 수전증, 3차 신경병증, 열대성 강직성 불완전마비, 트로이어 증후군(Troyer Syndrome), 결절성 경화증, 혈관 발기 종양, 중추 신경계 및 말초 신경계의 혈관염 증후군, 본 에코노모병(Von Economo's Disease), 본 힙펠-린다우병(VHL; Von Hippel-Lindau Disease), 본 레클링하우젠병(Von Recklinghausen's Disease), 발렌베리그 증후군(Wallenberg's Syndrome), 베르드니히-호프만병(Werdnig-Hoffman Disease), 베르니케 코르사코프 증후군(Wernicke-Korsakoff Syndrome), 웨스트 증후군(West Syndrome), 편타 증후군(Whiplash), 위플병(Whipple's Disease), 윌리암스 증후군(Williams Syndrome), 윌슨병(Wilson's Disease), 월만병(Wolman's Disease ), X 연관 척수성 및 연수 근위축증, 젤위거 증후군(Zellweger Syndrome), 시신경염, 만성 피로 증후군, 섬유근육통, 정신 질환, 예컨대 기분 질병, 주우울증, 양극성 증후군, 정신증, 정신분열증, 강박-증후군 등, 독성 또는 약물 남용 질환, 예컨대 알콜 중독 및 약물 남용, 간성 뇌증과 같은 뇌증을 들 수 있지만, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명에 따라 예방 및/또는 치료될 수 있는 정신 질병으로는 미국 정신병 협회가 발행한 정신 질환의 진단 및 통계 매뉴얼 4판(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fourth Edition(DSM-IV))에 기재된 것을 들 수 있고, 어린이 및 성인 둘 다에 대한 모든 정신의 건강 질병을 포괄한다. 특히, 정신 질병으로는 급성 스트레스 질병; 적응 장애 상태불명; 불안을 동반한 적응 장애; 우울한 기분을 동반한 적응 장애; 품행 장애를 동반한 적응 장애; 혼합형 불안 및 우울한 기분을 동반한 적응 장애; 감정 및 품행의 혼합형 장애를 동반한 적응 장애; 공황 장애의 병력이 없는 광장공포증; 신경성 식욕부진증; 반사회적 인격 장애; 의학 상태로 인한 불안 장애; 불안 장애, NOS; 회피성 인격 장애; 양극성 질병 NOS; I형 양극성 질병, 가장 최근의 우울증 삽화, 완전 관해로; I형 양극성 질병, 가장 최근의 우울증 삽화, 부분 관해로; I형 양극성 질병, 가장 최근의 경증 우울증 삽화; I형 양극성 질병, 가장 최근의 우울증 삽화, 중등도; I형 양극성 질병, 가장 최근의 중증 우울증 삽화 정신병적 양상을 갖는; I형 양극성 질병, 가장 최근의 중증 우울증 삽화 정신병적 양상을 갖지 않는; I형 양극성 질병, 가장 최근의 우울증 삽화, 상태불명; I형 양극성 질병, 가장 최근의 조증 삽화, 완전 관해로; I형 양극성 질병, 가장 최근의 조증 삽화, 부분 관해로; I형 양극성 질병, 가장 최근의 경증 조증 삽화; I형 양극성 질병, 가장 최근의 조증 삽화, 중등도; I형 양극성 질병, 가장 최근의 조증 삽화, 정신병적 양상 없이 중증; I형 양극성 질병, 가장 최근의 조증 삽화, 정신병적 양상 없이 중증; I형 양극성 질병, 가장 최근의 조증 삽화, 상태불명; I형 양극성 질병, 가장 최근의 혼재성 삽화, 완전 관해로; I형 양극성 질병, 가장 최근의 혼재성 삽화, 부분 관해로; I형 양극성 질병, 가장 최근의 혼재성 삽화, 경증; I형 양극성 질병, 가장 최근의 혼재성 삽화, 중등도; I형 양극성 질병, 가장 최근의 혼재성 삽화, 정신병적 양상 없이 중증; I형 양극성 질병, 가장 최근의 혼재성 삽화, 정신병적 양상 없이 중증; I형 양극성 질병, 가장 최근의 혼재성 삽화, 상태불명; I형 양극성 질병, 가장 최근의 삽화 상태불명; I형 양극성 질병, 가장 최근의 경조성 삽화; I형 양극성 질병, 단일 조증 삽화, 완전 관해로; I형 양극성 질병, 단일 조증 삽화, 부분 관해로; I형 양극성 질병, 단일 경증 조증 삽화; I형 양극성 질병, 단일 조증 삽화, 중등도; I형 양극성 질병, 단일 조증 삽화, 정신병적 양상 없이 중증; I형 양극성 질병, 단일 조증 삽화, 정신병적 양상 없이 중증; I형 양극성 질병, 단일 조증 삽화, 상태불명; II형 양극성 질병; 신체 기형 장애; 경계성 인격 장애; 호흡 관련 수면 장애; 단기 정신 장애; 폭식증; 일주기 리듬 수면 장애; 전환 장애; 순환성 장애; 망상 장애; 의존성 인격 장애; 이인증 질병; 우울 장애 NOS; 해리성 기억상싱증; 해리성 장애 NOS; 해리성 둔주; 해리성 정체성 장애; 성교통; 수면이상 NOS; 다른 질병과 관련된 수면이상; 기분 부전 장애; 섭식 장애 NOS; 노출증; 의학 상태로 인한 여성 성교통; 의학 상태로 인한 여성 성욕 감퇴 장애; 여성 오르가즘 장애; 여성 성적 흥분 장애; 주물숭배; 마찰도착증; 사춘기 또는 성인에서의 성 정체성 장애; 어린이에서의 성 정체성 장애; 성 정체성 장애 NOS; 범불안 장애; 히스테리성 인격 장애; 성욕 감퇴 장애; 건강염려증; 충동 조절 장애 NOS; 다른 질병과 관련된 불면; 간헐적 폭발 장애; 병적도벽; 주요 우울 장애, 재발, 완전 관해로; 주요 우울 장애, 재발, 부분 관해로; 주요 우울 장애, 재발, 경증; 주요 우울 장애, 재발, 중등도; 주요 우울 장애, 재발, 정신병적 양상 없이 중증; 주요 우울 장애, 재발, 정신병적 양상 없이 중증; 주요 우울 장애, 재발, 상태불명; 주요 우울 장애, 단일 삽화, 완전 관해로; 주요 우울 장애, 단일 삽화, 부분 관해로; 주요 우울 장애, 단일 삽화, 경증; 주요 우울 장애, 단일 삽화, 중등도; 주요 우울 장애, 단일 삽화, 정신병적 양상 없이 중증; 주요 우울 장애, 단일 삽화, 정신병적 양상 없이 중증; 주요 우울 장애, 단일 삽화, 상태불명; 의학 상태로 인한 남성 성교통; 남성 발기 장애; 의학 상태로 인한 남성 발기 장애; 의학 상태로 인한 남성 성욕 감퇴 장애; 남성 오르가즘 장애; 의학 상태로 인한 기분 질병; 자기애 인격 장애; 기면증; 악몽 장애; 강박 장애; 강박 인격 장애; 의학 상태로 인한 기타 여성 성 기능장애; 의학 상태로 인한 기타 남성 성 기능장애; 정신학적 인자 및 의학 상태 둘 다와 관련된 통증 질병; 정신학적 양상과 관련된 통증 질병; 광장공포증을 수반하는 공황 장애; 광장공포증을 수반하지 않는 공황 장애; 편집성 인격 장애; 성도착증, NOS; 사건수면 NOS; 병리학적 도박; 소아애호증; 인격 장애 NOS; 외상후 스트레스 질병; 조루; 일차성 과다수면; 일차성 불면증; 망상을 수반하는 의학 상태로 인한 정신 장애; 환각을 수반하는 의학 상태로 인한 정신 장애; 정신 장애, NOS; 방화벽; 분열정동 장애; 분열성 인격 장애; 긴장형 정신분열증; 해체형 정신분열증; 망상형 정신분열증; 잔재형 정신분열증; 감별불능형 정신분열증; 정신분열형 장애; 분열형 인격 장애; 성적 혐오 장애; 성 장애 NOS; 성 기능장애 NOS; 성 피학증; 성 가학증; 공유 정신 장애; 의학 상태로 인한 수면형 수면 장애; 의학 상태로 인한 불면형 수면 장애; 의학 상태로 인한 혼합형 수면 장애; 의학 상태로 인한 수면수반형 수면 장애; 야경증; 몽유병 질병; 사회 공포증; 신체화 장애; 신체형 장애 NOS; 특정 공포증; 의상도착증; 발모광; 미분화형 신체형 장애; 질경련; 및 관음증으로부터 선택되는 질병을 들 수 있다.
바람직하게는, 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 및 이의 약학적으로 허용되는 염 및 프로드럭을 NGF 또는 다른 뉴로트로핀이 생체내 또는 실험실내 TrkA, TrkB 및/또는 p75 경로를 통한 세포 분화 및 세포 생존에 대한 이의 개선 효과로 인해 당해 분야에서 효과적인 것으로 입증된 질환의 치료에 사용할 수 있다. 따라서, 본 발명에서 포괄되는 화합물을 신경퇴행성 질병, 예컨대 근위축성 축삭 경화증(ALS), 파킨슨병, 알츠하이머병, 프레드라이히 운동실조, 헌팅턴병, 루이소체 치매, 척수성 근위축증;　신경 염증, 예컨대 다발성 경화증 및 시신경 척수염; 주요 우울 장애; 정신분열증; 녹내장; 또는 말초 신경병증, 예컨대 당뇨병 또는 AIDS 신경병증 중에서 선택되는 신경 질환의 치료에서 사용할 수 있다. 더욱이, 본 발명의 화합물은 또한 NGF 세포 분화 활성을 조정하고 세포 증식을 중지시킴으로써 암의 치료에 적응증을 가질 수 있다. NGF가 생체내 또는 실험실내 TrkA 및/또는 p75 경로를 통한 세포 분화 및 세포 생존에 대한 개선 효과로 인해 당해 분야에서 효과적인 것으로 입증된 암 유형 중에서, 교모세포종, 성상세포종, 수모세포종, 신경초종, 신경아세포종, 뇌수막종, 대장암, 췌장암, 유방암, 전립선암, 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 골육종, 간세포 암종, 난소 암종, 폐 선암　 또는 식도 암종을 예로 들 수 있다.
본 발명의 일 실시양태에서, 신경보호 또는 신경 세포사 또는 신경 세포 손상의 예방 또는 치료의 다양한 용도 및 방법에서, 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 및 이의 약학적으로 허용되는 염 및 프로드럭을 건강한 피험체, 바람직하게는 18 세가 넘은 건강한 피험체, 더 바람직하게는 45 세가 넘은 건강한 피험체, 훨씬 더 바람직하게는 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 또는 100 세가 넘은 건강한 피험체에게 투여한다.
"건강한 피험체"라는 용어는 이의 단순한 의미로 또한 신경 질환 또는 정신 질환 이외의 1종 이상의 병리학적 병증을 앓을 수 있는 피험체를 포함하도록 의도된다.
화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 및 이의 약학적으로 염 및 프로드럭의 신경보호 특성은 결과로서 뉴런 세포사 또는 뉴런 세포 손상에 의해 야기되는 신경계 기능에서의 다양한 질병의 부분 또는 완전 예방 또는 치료를 갖는다. 따라서, 본 발명은 추가로 신경 질환 또는 정신 질환의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에서의 활성 성분으로서의, 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 및 이의 약학적으로 허용되는 염 및 프로드럭의 용도에 관한 것이다. 즉, 본 발명은 또한 신경 질환 또는 정신 질환의 예방 또는 치료에서 사용하기 위한, 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 및 이의 약학적으로 허용되는 염 및 프로드럭에 관한 것이다. 유사하게, 본 발명은 또한 유효량의 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭을 신경 질환 또는 정신 질환의 예방 또는 치료를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 것을 포함하는 신경 질환 또는 정신 질환의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다. 신경 질환 또는 정신 질환은 상기 기재된 것으로부터 임의의 질환일 수 있다.
바람직하게는, 신경 질환 또는 정신 질환은 신경퇴행성 질병, 염증 및 특정한 유형의 암, 다발성 경화증, 시신경 척수염, 근위축성 축삭 경화증(ALS), 파킨슨병, 알츠하이머병, 프레드라이히 운동실조, 헌팅턴병, 루이소체 치매, 척수성 근위축증, 주요 우울 장애, 정신분열증, 녹내장 또는 말초 신경병증(당뇨병 또는 AIDS 신경병증)으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 목표는 신경활동촉진 약물로서의 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 및 이의 약학적으로 허용되는 염 및 프로드럭의 용도, 또는 신경활동촉진 약물을 제조하기 위한 용도이다.
신경활동촉진 약물로는 학습 및 기억, 주의, 기분, 의사소통 능력 및 성기능을 개선하는 약물을 들 수 있다. 신경활동촉진 약물의 예로는 장기간 시냅스 전위(LTP) 또는 장기간 우울증(LTD), 칼슘 채널의 조정 또는 cAMP 반응 요소 결합(CREB) 단백질을 표적하는 것을 들 수 있다. cAMP는 사이클릭 아데노신 모노포스페이트의 머리글자이다. 신경활동촉진 약물의 특정한 예로는 로리프램과 같은 포스포디에스터라제 억제제; 도네파질; D-시클로세린과 같은 NMDA 글루타메이트 수용체의 효현제; 암파킨; 모다피닐; 메틸페니데이트를 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물을 이의 의도하는 목적을 성취하는 임의의 방식에 의해 투여할 수 있다. 예를 들면, 투여는 경구, 비경구, 피하, 정맥내, 근육내, 복강내, 경피, 비강내, 경점막, 직장 또는 협측 경로일 수 있다. 일 실시양태에서, 약학 조성물을 경구로 투여한다.
화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물 및 이의 약학적으로 허용되는 염 및 프로드럭을 투여 목적을 위한 다양한 약학 형태로 제제화할 수 있다. 적절한 조성물로서, 전신 투여하는 약물, 예를 들면 임의의 고체(예를 들면, 정제, 캡슐, 과립제 등) 또는 액체 조성물(예를 들면, 용액, 현탁액, 에멀션 등)에 일반적으로 사용되는 모든 조성물을 언급할 수 있다. 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물의 약학 조성물을 제조하기 위해, 유효량의 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물은, 임의로 염 형태 또는 프로드럭으로, 활성 성분으로서 약학적으로 허용되는 담체와 친밀하게 조합되고, 담체는 투여에 바람직한 제제의 형태에 따라 광범위한 형태를 취할 수 있다. 이 약학 조성물은 특히 경구로, 직장으로, 경피로, 척추강내로, 정맥내로 또는 비경구 주사에 의해 투여하기에 적합한 단위 제형으로 바람직하다. 예를 들면, 경구 제형의 조성물을 제조하는 데 있어서, 예를 들면 경구 액체 제제, 예컨대 현탁액, 시럽, 엘릭시르제, 에멀션 및 용액의 경우 물, 글리콜, 오일, 알콜 등; 또는 산제, 환제, 캡슐제 및 정제의 경우 고체 담체, 예컨대 전분, 당, 카올린, 활택제, 결합제, 붕괴제 등과 같은 임의의 일반적인 약학 매질을 사용할 수 있다. 이의 투여 용이성 때문에, 정제 및 캡슐은 가장 유리한 경구 용량 단위 형태를 나타내고, 이런 경우 고체 약학 담체를 명확히 사용한다. 비경구 조성물의 경우, 예를 들면 용해도를 보조하기 위해 다른 성분이 포함될 수 있지만, 담체는 일반적으로 적어도 아주 많이, 무균수를 포함한다. 담체가 식염수, 포도당 용액 또는 식염수와 포도당 용액의 혼합물을 포함하는 주사용 용수를 예를 들면 제조할 수 있다. 적절한 액체 담체, 현탁제 등을 사용할 수 있는 경우 주사용 현탁액을 또한 제조할 수 있다. 사용 직전, 액체 형태 제제로 전환하도록 의도되는 고체 형태 제제가 또한 포함된다. 경피 투여에 적합한 조성물에서, 담체는 임의로 침투 증강제 또는 적합한 습윤제 또는 둘 다를, 임의로 피부에 상당히 해로운 효과를 도입하지 않는 소량의 임의의 성질의 적합한 첨가제와 조합하여, 포함한다. 약물 투여를 위한 상이한 약학 형태 및 이의 제법의 개론을 문헌["Tratado de Farmacia Galenica", de C. Fauli i Trillo, 10th Edition, 1993, Luzan 5, S.A. de Edicione]에서 확인할 수 있다.
투여 용이성 및 용량 균일성을 위해 단위 제형에서 상기 언급된 약학 조성물을 제제화하는 데 특히 유리하다. 본원에 사용되는 단위 제형은 개별 용량으로서 적합한 물리학적 별개 단위를 의미하고, 각각의 단위는 필요한 약학 담체와 회합되어 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 소정의 분량의 활성 성분을 포함한다. 이러한 단위 제형의 예로는 (할선 정제 또는 코팅정을 포함하는) 정제, 캡슐, 환제, 좌제, 산제 패킷, 웨이퍼, 주사용 용액 또는 현탁액 등 및 이들의 분리된 복합물을 들 수 있다.
단위 제형을 비롯하여 본 발명에 따른 조성물은 약 0.1% 내지 70% 또는 약 0.5% 내지 50% 또는 약 1% 내지 25% 또는 약 5% 내지 20% 범위인 양으로 활성 성분을 포함할 수 있고, 나머지는 담체를 포함하고, 이전의 백분율은 조성물 또는 제형의 전체 중량에 대한 w/w이다.
투여하고자 하는 화학식 Ⅰ-Ⅴ 중 임의의 화학식의 화합물, 이의 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭의 용량은 개별 사례에 따라 달라지고, 통상적으로, 최적 효과에 대해 개별 사례의 증상에 따라 조정될 것이다. 따라서, 이는, 물론, 각각의 경우에 치료 또는 예방에 사용되는 화합물의 투여 빈도 및 효능 및 작용 기간, 그러나 또한 질환 및 증상의 성질 및 중증도, 및 치료하고자 하는 피험체의 성별, 연령, 중량, 병용 약제 및 개인 반응성 및 치료가 급성 또는 예방인지에 따라 달라진다. 용량을 체중의 함수로 그리고 소아 적용을 위해 조정할 수 있다. 1일 용량을 q.d. 또는 b.i.d., t.i.d. 또는 q.i.d와 같이 다수의 분량으로 투여할 수 있다.
화합물의 합성
본 발명의 화합물을 본 개시내용의 관점에서 당해 분야의 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 화합물을 문헌[Masip, et al., 2005]에 기재된 바대로 제조할 수 있다.
화합물의 시험
실시예에 기재된 시험 이외에, 본 발명의 화합물을 하기와 같이 알츠하이머병 실험실내 모델에 대해 시험할 수 있다: 알츠하이머병에서의 시험된 화합물의 신경보호성 효과를 연구하기 위해 인간 신경아세포종 세포주 SH-SY5Y를 사용한다. 세포를 시험된 화합물(100 ng/㎖)과 함께 상이한 농도(20 ng/㎖, 100 ng/㎖, 2 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖)에서의 시험된 화합물과 3 시간 동안 사전 처치한다. 이후, 아밀로이드 베타 피브릴(100 μM)을 첨가하고 24 시간 동안 항온처리한다. 생존 세포의 수를 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 검정 다음날에 결정한다.
본 발명의 화합물에 의한 TrkA, IκBα 및 SAPK/JNK 인산화의 유도를 하기와 같이 시험할 수 있다. TrkA의 활성화는 NGF 반응성 뉴런 및 PC12 세포의 분화 및 생존을 발생시키는 신호전달 캐스케이드에서의 첫번째 사건이다(Greene and Tischler, 1976; Chao, 2003; Huang and Reichardt, 2003). NGF양 펩토이드의 뉴로트로핀 활성이 TrkA 수용체와의 상호작용에 의해 중재되는지를 평가하기 위해, PC12 세포에서의 TrkA 인산화를 유도하는 이의 능력을 분석할 수 있다. 펩토이드의 활성을 PC12 세포 분화에 효과적인 농도의 범위에서 시험할 수 있다.
웨스턴 블롯 분석. 준포화(Subconfluent) 세포를 2% FBS 및 1% HS를 포함하는 배지 중에 밤새 성장시키고 표시된 시점 동안 100 ng/㎖ NGF 또는 NGF양 소 화학물질로 자극한다. 이후, 세포를 차가운 인산염 완충 식염수(PBS)로 세척하고 간단히 (β-머캅토에탄올 및 2 ㎜ PMSF를 포함하는) SDS 샘플 완충액 중에 음파처리한다. 융해물(200 ㎍의 전체 단백질)을 SDS-PAGE에서 분리하고, 니트로셀룰로스(Whatman, Dassel, Germany)에 옮긴다. TBST 완충액(10mM Tris pH 7.5; 150 ㎜ NaCl/0.2% Tween 20) 중의 5% 탈지 우유로 차단한 후, 블롯을 항-p-TrkA(Tyr 490) 항체(1:1000), 항-TrkA 항체(1:1000), 항-p-IκBα(Ser 32/36)(5A5) 마우스 항체(1/1000), 항-IκBα(L35A5) 마우스 항체(1:1000), 항-p-SAPK/JNK(Thr183/Tyr185) 항체(1:1000) 또는 항-SAPK/JNK 항체(1/1000)(이들 모두 Cell Signaling으로부터 구입)로 4℃에 밤새 프로빙하고, 이후 실온(RT)에서 1 시간 동안 HRP 콘쥬게이트 IgG(Jackson ImmunoResearch)로 항온처리한다. 증강형 화학발광(ECL) 시스템(GE Healthcare Bio-Sciences, Piscataway, NJ)을 이용하여 인산화 종의 검출을 수행한다.
본 발명의 화합물이 p75를 활성화하는지를 조사하기 위해, PC12 및 RN22 세포주에서의 NF-κB 경로(Bonizzi G, Karin M. 2004) 및 SAPK/JNK 경로(세포사)의 활성화를 분석할 수 있다. RN22 세포는 높은 수준의 p75 수용체 메시지 및 단백질을 발현하지만, TrkA 발현은 검출 가능하지 않다(Gentry et al., 2000). NF-κB는 p65 및 p50 하위단위로 이루어지는 원형 NF-κB 이합체인 이형이합체 또는 동형이합체로 이루어지는 이합체 형태의 전사 조절자로서 기능적으로 활성이다. NF-κB의 활성화는 주로 NF-κB 이합체에 결합하는 억제 단백질의 패밀리인 IκB 단백질의 퇴행을 통해 일어난다. 자극을 활성화하는 반응에서, 억제 단백질을 인산화하고, 이는 유비퀴틴화 및 후속 퇴행에 이를 표적한다. 억제제 패밀리의 일 구성원인 IκBα는 대부분의 NF-κB 활성자에 대한 반응으로 저하된다(Ghosh et al., 1998). NGF 및 상이한 분비된 펩토이드에 대한 반응에서의 NF-κB 활성화를 조사하기 위해, 다양한 시간 동안 NGF 및 펩토이드로 처치된 RN22 및 PC12 세포로부터의 전체 세포 추출물의 웨스턴 블롯을 항체 항-포스포-IκBα에 의해 프로빙한다.
여러 뉴런 시스템에서, JNK 활성화는 원인상 프로그래밍된 세포사의 유도와 관련된다(Bhakar et al., 2003). 배양시, p75를 통한 NGF 신호전달은 NF-κb 및 JNK 둘 다의 활성화를 발생시켜, 궁극적으로 프로그래밍된 세포사를 발생시킨다(Yoon et al., 1998). RN22 세포에서의 JNK의 활성을 조사하기 위해, 웨스턴 블롯을 항체 항-포스포-SAPK/JNK로 수행하여 경로의 활성화를 평가할 수 있다.
실험적 뇌척수염 자가면역(EAE)에서의 뉴로트로핀 펩티도유사체(예를 들면, NGF 유사체 펩토이드)의 효과를 다음과 같이 평가할 수 있다:
동물, 실험적 자가면역 뇌척수염 유도 및 치료. 동물 관리에 대한 바르셀로나 위원회 대학에 의해 실험을 승인받았다. Harlan로부터의 암컷 C57BL/6 마우스(8∼12 주령)를 문헌[Palacio et al., 2007]에 이미 기재된 바대로 불완전 프로인트 보강제(IFA) 중에 50 ㎍의 마이코박테리움 투베큘로시스(Mycobacterium tuberculosis)(H37Ra 균주; Difco, Detroit, MI)가 유화된 300 ㎍의 미엘린 희돌기교세포 당단백질(MOG) 펩티드 35-55(Spikem, Firenze)로 뒷 발바닥(hind pad)에서 피하로 면역화하였다. 마우스에 면역화시 및 2 일 후에 페르투시스 독소(Pertussis toxin)(Sigma)(500 ng)를 복강내로 주사하였다. 동물을 중량 측정하고 맹검 관찰자가 매일 질환의 임상 징후에 대해 조사하였다. 질환 EAE의 중증도를 하기 스케일에 따라 평가하였다: 0 = 정상; 0.5 = 약간 다리 절음; 1 = 다리 절음; 2 = 뒷다리의 약간 마비, 휘청하는 보행; 3 = 보통 마비, 자발 운동이 여전히 가능; 4 = 대마비 또는 운동실조; 5 = 빈사 상태. 임상 연구에 대해 기재된 데이터는 표시된 수의 동물로 수행된 2의 독립 실험을 대표한다(Moreno et al., 2006).
시험 화합물을 5% DMSO와 물 중에 제조한다. 동물을 면역화 후 시작하여 매일의 복강내 주사를 통해 시험 화합물(25, 50 및 100 ㎎/㎏) 또는 위약(물 + 5% DMSO)으로 처치한다. 연구 종료시, 마우스를 마취시키고 0.1 M 인산염 완충액(pH 7.6) 중에 4% 파라포름알데하이드로 심장 내로 관류시킨다. 뇌, 척수 및 비장을 절제하고 사용시까지 고정하거나 냉동시킨다. 연구에 포함된 모든 동물로부터 또한 혈청을 얻고, 아미노기 전이효소 수준을 측정한다.
"생체내" 뉴로트로핀 펩티도유사체(예를 들면, NGF양 펩토이드)의 효과를 평가하기 위해, MS의 동물 모델에서 뉴로트로핀 펩티도유사체(예를 들면, NGF 유사체 펩토이드)의 효과를 연구할 수 있다. MOG35-55 펩티드로 면역화된 C57BL/6 마우스를 화합물의 상이한 농도에서 0 일째 내지 25 일째 복강내로 시험 화합물로 매일 처치한다. CNS 및 말초 염증에서의 본 발명의 화합물의 효과를 다음과 같이 시험할 수 있다.
실시간 정량적 중합효소 사슬 반응. 사망시에 얻은 마우스로부터의 뇌 및 척수를 RNA 융해 완충액 중에 균질화한다. RNase-Free DNase Set(Quiagen)를 이용하는 DNase 처치를 비롯하여 RNeasy Mini Kit(Qiagen, Chatwworth, CA) 분리 시스템을 이용하여 전체 RNA를 추출한다. 전체 RNA(35 ㎍)를 역전사 시스템(High Capacity cDNA Archive Kit; Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 역전사한다. 실시간 반응을 25℃에서 10 분 동안, 이어서 37℃에서 2 시간 수행하고, 마지막으로 4℃에서 저장한다. 프라이머 및 표적 특이적 형광 표지 TaqMan 프로브를 Applied Biosystems(TaqMan Gene Expression assays)으로부터 구입할 수 있다. 예를 들면, TaqMan Universal Master Mix(Applied Biosystems)를 사용할 수 있다. 각각의 프라이머에 대해 0.9 μM 및 프로브에 대해 0.25 μM 및 20 ng 상보적 DNA를 사용하여 DNA Engine Opticon 2 Real-Time System(MJ Research, Watertown, MA)에서 상보적 DNA의 증폭을 수행한다. 반응 조건은 50℃에서의 초기 2 분, 이어서 95℃에서의 10 분 및 95℃에서의 15 초 및 60℃에서의 1 분의 40회 사이클이다. 각각의 샘플을 3회 수행하고, 각각의 플레이트에서 표적 및 내인성 대조군을 동일한 웰에서 증폭한다. 시험된 유전자의 발현을 항존 유전자 GAPDH의 수준에 대해 정량화한다(Palacio et al., 2008).
면역조직학. 뇌 및 척수의 파라포름알데하이드로 고정된 파라핀 포매 절편에서 조직학적 평가를 수행한다. 절편(10 ㎛ 두께)을 헤마톡시린 및 Luxol Fast Blue로 염색하여 염증 및 탈수초화를 평가한다. 염증 및 탈수초화에 대한 반정량적 조직학적 평가를 수행하고 하기 스케일을 사용하여 맹검으로 점수매긴다: 0 = 정상; 1 = 최소 탈수초화로 1 내지 3/절편 혈관주위 커프; 2 = 적당한 탈수초화가 동반되는 3 내지 10 혈관주위 커프/절편; 3 = 광범위하게 퍼진 혈관주위 커프, 큰 포화상태 병변을 갖는 광범위한 탈수초화(Villoslada et al., 2001).
면역조직학적 절차를 이미 기재된 바대로 뇌 및 척수의 10 ㎛ 파라핀 포매 절편으로 수행한다(Villoslada et al., 2001). 1차 항원을 MCA500(Serotec로부터의 랫트 항-마우스 CD3)에 대해 1/1000의 농도에서 그리고 MCA1107(Serotec로부터의 랫트 항-마우스 CD4)에 대해 1/500의 농도에서 첨가한다. 1차 항원 없이 절편을 항온처리하거나 면역 반응성을 발생시키지 않는 상응하는 동형 대조군을 사용하여 면역반응의 특이성을 결정한다.
증식 검정. 세포 증식에서의 시험 화합물의 효과의 실험실내 평가를 위해 태생의 비면역화 C57BL/6 마우스로부터의 비장 세포를 얻는다. 비장 세포 증식 검정을 이전에 기재된 바대로 수행한다(Martinez-Forero et al., 2008).
말초 면역 반응에서의 시험 화합물의 효과를 평가하기 위해, 태생의 동물의 비장 세포에서의 면역화 항원(MOG)에 대한 증식 반응 및 위약 및 처치 동물로부터의 비장 세포에서의 사이토카인 프로필을 평가한다. 인터류킨 2(IL2), 인터페론γ(IFNγ), 종양 괴사 인자 α(TNFα), 유도성 일산화질소 합성효소(iNOS) 및 인터류킨 10(IL10)의 유전자 발현을 위약 및 처치 동물로부터의 비장 세포에서의 실험 종료시 정량적 역전사효소 PCR에 의해 조사할 수 있다.
통계 분석. EAE 점수를 비교하기 위한 양방 검증 Mann-Whitney U 시험, 질환 발병률을 비교하기 위한 치(chi) 2 시험 및 EAE의 개시일에 차이에 대해 Kaplan-Meier 곡선으로 통계 분석을 수행할 수 있다. 0.05 미만의 p 값은 상당한 차이를 나타내는 것으로 생각된다. SPSS 16.0 통계 프로그램(SPSS, Chicago, IL)을 이용하여 통계 평가를 수행한다.
하기 실시예는 본 발명의 화합물, 조성물 및 방법을 예시하고 있지만, 제한하지 않는다. 일반적으로 임상 치료에서 마주치고 본 개시내용의 관점에서 당업자에게 명확한 다양한 조건 및 매개변수의 적합한 변형 및 개정이 본 발명의 범위 및 정신 내에 있다.
[실시예]
실시예 1
조합 화학에 의한 NGF 효현제의 설계
일반사항. 용매, 아민 및 다른 시약을 상업용 공급업자로부터 구입하고 추가의 정제 없이 사용하였다. 마이크로파 조사 하에 수행된 반응을 Dimroth 콘덴서가 장착된 100 ㎖ 환저 플라스크 내에서 수행하였다. 플라스크를 CEM Model Discover 장치의 단일 모드 공동에 도입하였다. NMR 스펙트럼을 Varian Inova 500 장치(1H NMR, 500 MHz; 13C NMR, 125 MHz) 및 Unity 300 장치(1H NMR, 300 MHz; 13C NMR, 75 MHz)에서 기록하였다. 적절한 경우, 화합물에 대한 1H 및 13C NMR 피크의 배정을 gDQCOSY 및 gHSQC 실험에 의해 확인하였다. 상이한 형태이성질체의 존재는 매우 복잡한 스펙트럼을 발생시키고; 하기 제공된 흡수는 샘플에 존재하는 주요 형태이성질체에 관한 것이다. RP-HPLC 분석을 220 ㎚에서 모니터하면서 이동상으로서 1 ㎖/min에서 CH3CN 완충제 포름산암모늄(20 mM, pH = 5.0) 혼합물로 역상 Kromasil 100 C8(25×0.46 cm, 5 ㎛) 칼럼을 사용하여 Hewlett Packard Series 1100(UV 검출기 1315A) 모듈식 시스템으로 수행하였다. 반제조용 RP-HPLC를 Waters(Milford, MA, U.S.A.) 시스템으로 수행하였다. 고해상 질량 스펙트럼(HRMS-FAB)을 IQAC - Instituto de Quimica Avanzada de Cataluna-(스페인)에서 수행하였디.
개별 펩토이드의 합성. 실험실내 및 생체내 검정에 대한 개별 펩토이드 G79, G80 및 G81의 합성을 주케르만(Zuckermann) 그룹이 보고한 하위구조 절차에 따라 여러 변형을 하여 수행하였다(Zuckermann et al, 1992)
플루오레닐메톡시카보닐(Fmoc) 보호 Rink 아미드 링커 AM RAM(0.79 mmol/g, Rapp Polymer; 독일)을 갖는 1% 가교결합 폴리스터렌 수지에서 합성을 수행하였다. 50 ㎖ DMF 중의 4 g의 수지의 현탁액을 자석 교반기가 제공된 100 ㎖ 환저 플라스크 내에 위치시켰다. 현탁액을 20℃에서 5 분 동안 교반하고, 폴리에틸렌 다공성 플라크가 제공된 60 ㎖ 폴리프로필렌 주사기를 통해 여과시켜 용매를 제거하였다. 이후, 수지를 다시 반응 플라스크에 옮겼다.
1. Fmoc 탈보호. DMF 중의 20% 피페리딘 60 ㎖의 용액을 수지를 포함하는 환저 플라스크에 첨가하였다. 혼합물을 마이크로파 활성화 하에 60℃ 및 150 W에서 5 분 동안 반응시켰다. 수지를 60 ㎖ 주사기에서 배출시키고 40 ㎖ DMF로 세척하였다. 처리를 2회 수행하였다. 이후, 수지를 여과시키고 DMF(3×40 ㎖), iPrOH(3×40 ㎖) 및 CH2Cl2(3×40 ㎖)로 세척하였다. 마지막으로, 이를 2 분 동안 배출시키고 반응 플라스크에 옮겼다. TNBS 시험(양성 대조군으로서의 적색 색상)을 이용하여 탈보호를 모니터하였다.
2. 제1 아실화. 수지를 50 ㎖ DMF 중의 5 당량의 브로모아세트산(2.2 g, 15.8 mmol) 및 5 당량의 N,N-디이소프로필카보디이미드(2.5 ㎖, 15.8 mmol)의 용액으로 처리하였다. 아실화를 마이크로파 조사(5 분, 60℃, 150 W) 하에 수행하였다. 이후, 수지를 주사기를 사용하여 여과시키고 40 ㎖ DMF로 세척하였다. 반응을 2회 수행하였다. 이후, 수지를 여과시키고 DMF(3×40 ㎖), iPrOH(3×40 ㎖) 및 CH2Cl2(4×10 ㎖)로 세척하였다. 다음에, 이를 2 분 동안 배출시키고 1차 아민의 부재를 TNBS 시험에 의해 평가하였다.
3. 제1 아미노화 커플링. 50 ㎖ DMF 중의 아실화 수지의 현탁액을 최종 화합물에 따른 적합한 1차 아민으로 처리하였다: 5 당량(2.2 ㎖, 15.8 mmol)의 2.2 ㎖ 1-(3-아미노프로필)-2-피롤리디논 또는 5 당량(3.2　g, 15.8　mmol)의 4-(2-아미노에틸)벤젠설폰아미드. 반응을 마이크로파 조사(7 분, 80℃, 150 W) 하에 수행하였다. 반응을 2회 수행하고 수지를 세척하고 처리 사이에 주사기를 통해 배출시켰다. 마지막으로, 수지를 2 분 동안 배출시키고 플라스크로 옮겼다. 아민의 도입을 클로로아닐 시험(2차 아민에 대한 녹색 색상)에 의해 확인하였다.
4. 제2 및 제3 아실화 단계. 이를 제1 아실화 단계와 유사하게 수행하였다. 이런 경우, 반응을 완료하기 위해 2의 아실화 처리가 충분하였다.
5. 제2 및 제3 아미노화 커플링 단계. 이를 제1 아미노화 단계와 유사하지만 상응하는 1차 아민을 사용하여 수행하였다. 따라서, 5 당량(1.8　ml, 15.8　mmol)의 2-메틸-1-프로판아민을 제2 아미노화 커플링에 사용하였다. 제3 아미노화의 경우, 5 당량(2.0 ㎖, 15.8 mmol)의 2-(2-플루오로페닐)에탄아민 또는 5 당량(2.0 ㎖, 15.8 mmol)의 2-(1-피롤리디닐)에탄아민을 상응하는 펩토이드의 조성물로서 사용하였다.
6. 개열. 수지를 배출시킨 후, 이를 4 액적으로 분할하고 각각의 액적을 20 ㎖의 개열 칵테일(60:40:2(v/v/v) TFA/CH2Cl2/H2O)로 처리하였다. 혼합물을 20℃에서 30 분 동안 교반하고 폴리에틸렌 다공성 플라크가 제공된 10 ㎖ 폴리프로필렌 주사기를 통해 여과시켰다. 여액을 250 ㎖ 플라스크 내에 수집하고 용매를 감압 하에 제거하였다. 마지막으로, 각각의 펩토이드에 대해 얻은 황색의 오일 잔류물을 H2O/ACN 혼합물 중에 재용해시키고 동결건조하여 HPLC에 의해 85% 초과의 순도의 1.25∼1.80　g의 예상된 미정제 펩토이드를 얻었다.
7. 정제 및 화학 규명. 60 ㎖/min의 유속 및 이동상으로서 0.1% TFA를 포함하는 CH3CN/H2O 혼합물로 용리시키면서 Waters PrePack®-C18(47×300 mm, ㎛) 칼럼을 사용하여 반제조용 HPLC에 의해 화합물을 정제하였다. HPLC에 의해 98%로 더 높은 순도에서 최종 화합물을 얻었다. 얻은 분량은 다음과 같다: 10.64 ㎎의 G79(99% 순도; HPLC), 7.55 ㎎의 G80(99% 순도; HPLC) 및 12.68 ㎎의 G81(99% 순도; HPLC).
[N-(2-(2'-플루오로페닐)에틸)글리실]-[N-(2-메틸프로필)글리실]-N-[3-(2'-옥소피롤리디닐)프로필]글리신아미드(G79). 화학식: C25H38FN5O4; MW 491,5987.
[N-(2-(2'-플루오로페닐)에틸)글리실]-[N-(2-메틸프로필)글리실]-N-[2-(4'-설파모일페닐)에틸] 글리신아미드(G80). 화학식: C26H36FN5O5S; MW 549,658.
[N-(2-(1-피롤리디닐)에틸)글리실]-[N-(2-메틸프로필)글리실]-N-[2-(4'-설파모일페닐)에틸] 글리신아미드(G81). 화학식: C24H40N6O5S; MW 524,6766.
실시예 2
PC12 세포주에서의 용량 반응 분화 검정
세포 배양: PC12 배양의 스톡을 2.5% 소 태아 혈청(FBS), 15% 말 혈청(HS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 햄(Ham)의 F12 배지 중에 유지시켰다. 37℃에서 5% CO2에서 세포 배양을 유지시켰다.
상이한 시험 농도(2-20-100 ng/㎖ 및 2-20-50 ㎍/㎖)에서 모든 시험 화합물(G79, G80 및 G81)로 세포를 처치함으로써 PC12 세포 분화를 평가하였다. 세포를 처음에 탈분화시키고자 하는 배지 중에 2.5% FBS를 갖는 콜라겐 코팅 24웰 플레이트에 플레이팅하였다. 72 시간 후, 시험 화합물을 첨가하고 NGF(Sigma Aldrich; 100 ng/㎖)를 분화의 양성 대조군으로서 사용하였다. 신경돌기가 길이가 2개 초과의 세포체로 진행되면서, 분화된 세포의 수를 3 일 처치 후 계수하였다. 100개의 세포로 3개의 무작위로 선택되는 장에서 세포 계수를 수행하였다.
화합물 G79, G80 및 G81은 PC12 세포(도 1a∼도 1d)의 분화를 유도하였다. NGF 양성 대조군은 100개의 세포의 장에서 16.1±1.9개의 세포의 분화를 유도하였다. G79는 용량 의존 방식(2-20-100 ng/㎖ 및 2-20 ㎍/㎖)으로 대조군 PC12 비처치 세포와 비교하여 상당한 분화를 유도하였다. 최고의 작업 농도는 20 ㎍/㎖(세포의 수: 11.3±2.68)이다. 50 ㎍/㎖에서, 분화된 세포의 수는 감소하였다.
G80은 PC12 세포에서 매우 긴 신경돌기로 우수한 분화를 유도하였다. 최고의 작업 농도는 20 ng/㎖이다. G81은 최고의 작업 농도(세포의 수: 9.2±3.9)인 100 ng/㎖까지 용량 의존 방식으로 대조군 PC12 비처치 세포와 비교하여 상당한 분화를 유도하였다. 최고의 농도의 경우, 분화된 세포의 수는 감소하였다. 분화된 세포의 백분율을 NGF 유도 분화에 대해 계산하였다(도 1e).
실시예 3
생존 검정
G79, G80 및 G81 뉴로트로핀 펩티도유사체는 세포 생존을 촉진한다.
세포 배양. 랫트 슈바놈(schwannome) 세포주 RN22를 10% FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 갖는 둘베코 변경 이글 배지(DMEM) 중에 배양하였다. 세포 배양을 37℃에서 5% CO2에서 유지시켰다.
RN22를 혈청 없는 배지 내에 30.000개 세포/웰의 농도로 24웰 플레이트에 플레이팅하였다. 24 시간 후, 시험 화합물 G79, G80 및 G81을 상이한 농도(1-10-50 ng/㎖ 및 1-10 ㎍/㎖)에서 첨가하고 NGF를 생존의 양성 대조군으로서 사용하였다. 세포를 이렇게 2 시간 동안 항온처리하였다. 150 ㎍/㎖의 최종 농도에서 황산구리(CuSO4)로 산화 스트레스를 유도하였다. 밤새 항온처리 후, MTT(Sigma Aldrich)를 첨가함으로써 흡수율을 판독함으로써 세포 생존율을 결정하였다.
생존 세포의 백분율을 NGF 유도 분화에 대해 계산하였다(도 2). G79은 10 ng/㎖에서의 최고의 작업 농도(비 스트레스 대조군에 대한 %로서의 98.11%의 세포 생존율)로 모든 시험 농도(1-10-50 ng/㎖ 및 1-10 ㎍/㎖)에서의 세포 생존율을 증가시켰다. G80은 50 ng/㎖에서의 최고의 작업 농도(비 스트레스 대조군에 대한 %로서의 99.86%의 세포 생존율)로 모든 시험 농도로 모든 시험 농도(1-10-50 ng/㎖ 및 1-10 ㎍/㎖)에서의 세포 생존율을 증가시켰다. G81은 50 ng/㎖에서의 최고의 작업 농도(비 스트레스 대조군에 대한 %로서의 101.86%의 세포 생존율)로 모든 시험 농도로 모든 시험 농도(1-10-50 ng/㎖ 및 1-10 ㎍/㎖)에서의 세포 생존율을 증가시켰다.
실시예 4
분비촉진제 활성 검정;
G79, G80 및 G81은 NGF 분비를 유도하지 않는다.
시험된 화합물, G79, G80 및 G81이 분비촉진제로서 작용하여, NGF의 합성을 통해 뉴로트로핀 활성을 유도하는지를 평가하기 위해, PC12 세포를 2.5% FBS만을 갖는 콜라겐 코팅 24웰 플레이트에 플레이팅하고 72 시간 후 세포를 항체 항-NGF(1 ㎍/㎖, AbCam)와 함께 시험된 화합물(각각 100 ng/㎖에서)로 처치하였다. 3 일 처치 후, 분화를 평가하였다. 100개의 세포로 3개의 무작위로 선택되는 장에서 세포 계수를 수행하였다.
항체 항-NGF와 함께 G79, G80 또는 G81의 처치는 시험된 화합물 단독에 의해 유도된 분화와 유사하게 PC12 분화를 유도하였다(도 3a). 항-NGF 항체를 첨가함으로써 NGF에 의한 분화된 세포의 수가 감소하지만(12.8±6.3 v 20.7±7.1), 시험된 화합물 단독에 의한 처치와 이 화합물 및 항-NGF 항체에 의한 처치를 비교함으로써 분화된 세포의 수가 쾌 유사하게 되었다. G79/항-NGF 처치는 각각의 장에 대해 분화된 세포의 수가 G79 단독에 의한 처치에 대해 18.8±4.9 대 11.5±2.8; G80/항-NGF의 경우 G80 단독에 의한 처치에 대해 14.1±1.8 대 15.1±6.3; G81/항-NGF의 경우 15.5±4.1 대 14.1±3.3이 얻어지게 하였다. 분화된 세포의 백분율을 NGF 유도 분화에 대해 계산하였다(도 3f).
실시예 5
상승 활성 검정
G79, G80 및 G81은 NGF와 상승 활성을 갖지 않는다.
소분자 G79, G80 및 G81이 NGF의 최대 활성을 방해하는지 또는 상가 효과를 발생시키는지 평가하기 위해, PC12 세포를 2.5% FBS를 갖는 콜라겐 코팅 24웰 플레이트에 플레이팅하고 72 시간 후 100 ng/㎖의 농도의 NGF와 함께 소 화학물질(각각 100 ng/㎖에서)로 처치하였다. 동일한 실험에서, PC12 세포를 대조군으로서 NGF 단독 또는 소분자로 처치하였다. 분화된 세포의 수를 처치 3 일 후 평가하였다. 100개의 세포로 3개의 무작위로 선택되는 장에서 세포 계수를 수행하였다.
이 결과가 도 3b에 도시되어 있다. NGF와 함께 G79, G80 또는 G81 분자에 의한 처치는 NGF의 활성을 감소시켜, 병용 처치 NGF/G79-G80-G81에서의 분화된 세포의 수를 감소시켰다. 이 실험에서의 NGF 분화된 세포의 수가 20±7.1이지만, 처치 NGF/G79에 의해 얻은 분화된 세포의 수는 11.3±2.6이다. 처치 NGF/G80에 의해 얻은 분화된 세포의 수는 13±5.9이다. 처치 NGF/G81에 의해 얻은 분화된 세포의 수는 13.3±3.8이다. 결국, 이 결과는 G79, G80 또는 G81이 NGF와 상가, 상승 또는 길항 효과를 가질 수 있다는 것을 배제한다. 분화된 세포의 백분율을 NGF 유도 분화에 대해 계산하였다(도 3g).
실시예 6
수용체 활성화 검정
G79, G80 및 G81이 TrkA의 세포외 부분(결합 자리)에 대한 결합을 통해 작용할 수 있고 티로신 키나제 수용체를 활성화할 수 있다는 가설을, PC12 세포를 티로신 키나제 억제제인 항체 항-TrkA 또는 K252a와 함께 소 화학물질에 의해 처치함으로써 시험하였다. 이러한 목적을 위해 PC12 세포를 2.5% FBS를 갖는 콜라겐 코팅 24웰 플레이트에 플레이팅하고 72 시간 후 소분자 단독으로 또는 항-TrkA 항체(AbCam, 1:2000) 또는 K252a와 조합하여 항온처리하였다. NGF(100 ng/㎖)를 대조군으로서 사용하고 단독으로 또는 항-TrkA 항체 또는 K252a와 조합하여 첨가하였다. 분화된 세포의 수를 처치 3 일 후 평가하였다. 100개의 세포로 3개의 무작위로 선택되는 장에서 세포 계수를 수행하였다. 이 결과가 도 3c에 도시되어 있다.
항체 항-TrkA와 함께 G79, G80 및 G81 분자에 의한 처치는 PC12 세포의 분화를 억제하지 않았다. 항-TrkA 항체를 첨가함으로써 NGF에 의한 분화된 세포의 수는 감소하지만(12.8±6.3 대 20.7±7.1), 분화된 세포의 수는 비슷하게 되었다. G79/항-TrkA 처치는 PC12 세포의 분화를 G79 단독에 의한 처치에 대해 19.6±8.1 대 11.5±2.8; G80/항-TrkA의 경우 G80 단독에 의한 처치에 대해 14.6±4.1 대 15.1±6.3; G81/항-TrkA의 경우 16.5±5.9 대 14.1±3.3으로 유도하였다. 분화된 세포의 백분율을 NGF 유도 분화에 대해 계산하였다(도 3h).
실시예 7
신호전달 억제 검정
G79, G80 및 G81은 NGF 분화 경로를 활성화한다.
G79, G80 및 G81에 의해 유도된 형질도입 경로가 AKT 및 ERK 활성화를 포함하는지를 평가하기 위해, PC12 세포를 PI3K의 억제제(AKT의 상향류 활성자)인 LY294002 및 MAPK 키나제의 억제제(ERK의 상향류 활성자)인 PD98059의 존재 하에 시험 화합물로 처치하였다. 이러한 목적을 위해 PC12 세포를 2.5% FBS를 갖는 콜라겐 코팅 24웰 플레이트에 플레이팅하고 72 시간 후 세포를 LY294002(Sigma Aldrich, 10 μM) 또는 PD98059(Sigma Aldrich, 50 μM)와 조합하여 소분자로 처치하였다. NGF(100 ng/㎖)를 대조군으로 사용하고 단독으로 또는 억제제와 조합하여 사용하였다.
G79, G80 또는 G81이 TrkA 신호전달 경로를 조절하는지를 평가하기 위해, AKT 및 ERK 경로의 억제제를 사용하였다. NGF + LY294002(도 3d)에 의한 처치는 NGF 단독과 비교하여 분화된 세포의 수를 감소시켰다(6.8±2.7 대 20.7±7.1). 이러한 방식으로, G79 + LY294002에 의한 처치는 G79 단독과 비교하여 분화된 세포의 수를 감소시켰다(5.28±2.54 대 11.5±2.8). G80 + LY294002에 의한 처치는 G80 단독과 비교하여 분화된 세포의 수를 감소시켰다(8.5±2.6 대 15.1±6.3). G81 + LY294002에 의한 처치는 G81 단독과 비교하여 분화된 세포의 수를 감소시켰다(6.6±4.02 대 14.1±3.3). 분화된 세포의 백분율을 NGF 유도 분화에 대해 계산하였다(도 3i).
NGF + PD98059(도 3e)에 의한 처치는 NGF 단독과 비교하여 분화된 세포의 수를 감소시켰다(2.1±1.9 대 20.7±7.1). 이러한 방식으로, G79 + PD98059에 의한 처치는 G79 단독과 비교하여 분화된 세포의 수를 감소시켰다(3.1±1.06 대 11.5±2.8). G80 + PD98059에 의한 처치는 G80 단독과 비교하여 분화된 세포의 수를 감소시켰다(4±2.3 대 15.1±6.3). G81 + PD98059에 의한 처치는 G81 단독과 비교하여 분화된 세포의 수를 감소시켰다(1.6±1.1 대 14.1±3.3). 분화된 세포의 백분율을 NGF 유도 분화에 대해 계산하였다(도 3j).
실시예 8
결합 검정
TrkA 또는 p75 수용체를 통한 시험 화합물, G79, G80 및 G81의 결합을 세포 기반 경쟁적 ELISA에 의해 시험할 수 있다. 처음에 PC12 세포를 96웰 플레이트(Fisher Scientific)에 시딩하고 85%∼90%의 포화상태(confluency)까지 항온처리하였다. TrkA 수용체에 대한 시험 화합물의 결합을 시험하기 위해, PC12 표면에서 발현된 p75 수용체를 수용체의 세포외 도메인에 결합하는 차단 항체 항-p75(AbCam)의 결합을 통해 억제하였다. 일정한 농도에서의 경쟁자로서의 각각의 소분자 존재 하에 또는 부재 하에 상이한 증가 농도(0.01-0.1-1 nM)에서 45' 동안 세포를 항온처리하였다. 차가운 PBS 중의 1회 세척 후, 세포를 PFA 4%로 15' 동안 고정하였다. 이후, 세포를 PBS로 세척하고 실온에서 1 시간 동안 항체 항-NGF(1 ㎍/㎖)와 항온처리하였다. 세포를 PBS로 2회 세정하고 실온에서 1 시간 동안 2차 항체 항-NGF(1:500; DyLight 488 콘쥬게이트 항체, Jackson ImmunoResearch)와 항온처리하였다. 세포를 세척하고 488 ㎚에서 분광 형광기에 의해 형광을 판독하였다.
실시예 9
녹내장 모델
G79는 녹내장에 대해 동물 모델에서 뉴런 죽음을 예방한다.
12 마리의 스프래그-다우리종(Sprague Dawley) 랫트(4 월령)를 이소부탄으로 마취시키고 오른쪽 눈의 상공막 정맥에 고장 식염수를 주사하였다. 수술 후 안압(IOP)을 측정하고 7 주 동안 TonoLab을 사용하여 1 주 1회 모니터하였다. 결막에서의 국소 투여에 의해 녹내장 유도 1 주일 후 G79에 의한 처치를 시작하였다. 2개의 상이한 실험을 수행하였다.
제1 실험에서, G79를 생리학적 용액 중에 용해시키고 2의 상이한 농도(200 ㎍/㎖ 및 400 ㎍/㎖)에서 사용하였다. NGF를 양성 대조군(200 ㎍/㎖)으로서 사용하고, 모든 분자를 용해시키도록 사용된 생리학적 용액을 위약으로서 투여하였다. 동물을 녹내장 - G79 200 ㎍/㎖; 녹내장 - G79 400 ㎍/㎖; 녹내장 - NGF; 녹내장 - 위약의 4개 군(각각의 군에서 3 마리의 동물)으로 분할하였다. 왼쪽 눈을 녹내장이 없는 음성 대조군으로서 사용하였다. 실험 둘 다에서, 녹내장 유도 7 주 후, 동물을 과용량의 마취제로 희생하고 이의 눈을 취하고 4% PFA 중에 고정하였다. 눈을 파라핀에 포함되게 하고 조직학적 연구(헤마토톡신-에오신 염색)를 위해 사용하기 위해 20 ㎛ 절편으로 절단하였다. 각각의 눈에 대해 10개의 상이한 장에서 무작위로 망막 신경절 세포(RGC)의 수의 세포 계수를 수행하였다.
랫트에 5 주 동안 높은 안압을 유도하는 눈에서 고장 용액을 주사하였다. 동물을 NGF(200 μM/㎖), G79(200-400 μM/㎖) 또는 위약의 점안액으로 5 주 동안 매일 처치하였다. 녹내장을 갖고 위약(식염수)로 처치된 동물은 대조군과 비교하여 망막 신경절 세포가 상당히 증가하였다. 대조적으로, NGF 점안액으로 처치된 동물 및 G79로 처치된 동물은 신경절 세포가 상당히 보호되었다(도 4a). 이 결과는 G79 처치가 망막 신경절 세포(RGC)에서 신경보호를 발휘한다는 것을 제시한다.
제2 실험에서, 200 ㎍/㎖의 농도의 G79를 사용하였다. 이 제2 실험의 목적은 안압을 감소시킴으로써 작용하는 녹내장에 대한 가장 일반적인 처치인 티몰롤에 대한 G79의 효과를 비교하는 것이다. 또한 이 실험에서, G79 및 티몰롤에 의한 병용 처치를 수행하였다. 동물을 녹내장-G79(200 ㎍/㎖)(n = 4); 녹내장-티몰롤(n = 4); 녹내장-G79/티몰롤(n = 4); 녹내장-위약(n = 4)의 각각의 군에서 4 마리의 동물을 갖는 4개 군으로 분할하였다. 왼쪽 눈을 녹내장이 없는 대조군으로서 사용하였다. 이 결과가 도 4c에 도시되어 있고, G79가 녹내장에서의 IOP에 대한 현재의 처치, 즉 티몰롤과 비교되었다. IOP 유도는 RGC의 수를 상당히 감소시켰고 이 감소는 대조군 눈(C)(p<0.0001) 및 모든 유형의 시험된 처치(p<0.0001)와 비교하여 상당하였다. 병용 처치는 RGC를 보호하는 데 있어서의 상가 효과를 발휘하지 않았다(**GL/티몰롤+G79 대 Ctr p = 0.02; § GL/티몰롤 대 GL/티몰롤+G79 p = 0.003).
실시예 10
파킨슨병 실험실내 모델( MPP 스트레스)
G79 , G80 및 G81 은 파킨슨병의 실험실내 모델에서 뉴런 죽음을 예방한다.
세포 배양: 인간 신경아세포종 세포주 SH-SY5Y를 10% FBS, 2 nM L-굴루타민 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 50% EMEM 배지 및 50% 햄의 F12 배지를 갖는 배양 중에 유지시켰다. 세포 배양을 37℃에서 95% 공기 및 CO2의 습윤 분위기에서 유지시켰다.
파킨슨병에서의 소분자의 신경보호성 효과를 연구하기 위해 인간 신경아세포종 세포주 SH-SY5Y를 사용하였다. 레티노산을 갖는 뉴런 표현형에 대한 분화 후 SH-SY5Y 세포를 상이한 농도(20 ng/㎖, 100 ng/㎖, 2 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖)에서의 시험 화합물 또는 양성 대조군으로서의 BDNF(20 ng/㎖)로 3 시간 동안 전처리하였다. 이후, 1-메틸-4-페닐-1,2,3,6-테트라히드로피리딘(MPTP)(100 μM)을 첨가하고 24 시간 동안 항온처리하였다. 생존 세포의 수를 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드(MTT) 검정에 의한 다음날 결정하였다.
인간 신경아세포종 세포주 SH-SY5Y를 MPTP에 노출시켜, 산화 스트레스를 통해 뉴런을 손상시켰다. 세포를 5 주 동안 매일 BDNF, G79, G80, G81 또는 위약으로 처치하였다. 위약(식염수)으로 처치된 세포는 대조군과 비교하여 세포 손실이 상당하였다. 대조적으로, BDNF에 의해 사전 처치된 세포 및 G79는 뉴런 세포를 상당히 보호하였다(도 5a).
실시예 11
인간 세포주 SH-SY5Y에서의 산화 스트레스
산화 스트레스에서의 시험 화합물 G79, G80 및 G81의 신경보호성 효과를 연구하기 위해 인간 신경아세포종 세포주 SH-SY5Y를 사용하였다. 세포를 상이한 농도(20 ng/㎖, 100 ng/㎖, 2 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖ 및 50 ㎍/㎖)에서의 시험 화합물 또는 양성 대조군으로서의 BDNF(20 ng/㎖)로 3 시간 동안 사전 처치하였다. 이후, H2O2(100 mM)를 첨가하고 24 시간 동안 항온처리하였다. 생존 세포의 수를 MTT 검정에 의해 결정하였다. BDNF보다 G79의 더 탄탄한 항산화 효과로 SH-SY5Y 뉴런 세포주에서 산화 스트레스를 유도하기 위해 H2O2를 사용할 때 G79, G80 및 G81의 보호 효과가 확인되었다(도 5b). 도 5b에서, BDNF 세포 생존율은 100%인 것으로 생각된다. H2O2 스트레스는 세포 생존율의 백분율의 감소를 유도하였다(비 스트레스 Ctr 대 H2O2 스트레스 = 100±2% 대 95.9±0.5%). G80 및 G81과 비교하여 G79는 20 ng/㎖의 농도에서 더 우수한 보호를 발휘하는 것이다(BDNF 대 G79 = 100±2.6 대 107.4±5.8).
실시예 12
웨스턴 블롯 분석 및 루미넥스 신호전달 검정
G79는 뉴로트로핀 경로를 활성화한다.
웨스턴 블롯 분석: 뉴로트로핀 수용체 TrkA 및 TrkB 활성화(인산화)를 하기와 같이 웨스턴-블롯에 의해 평가하였다: 24웰 플레이트에서 성장하는 PC12 세포를 저 혈청 배지(0.5% FBS) 중에 처치하여 인산화의 기준 수치를 감소시켰다. 24 시간 후, PC12 세포를 G79(100 ng/㎖)로 처치하고, 이후 회수하고 5-15-30-60 분에서 300 ㎕ 얼음 냉각된 융해 완충액(Sigma Aldrich) 중에 융해시켰다. 음파 처리 후, 세포 부유물을 원심분리(10 분 동안 14000 rpm)에 의해 제거하고 동량의 상청액(30∼35 ㎍/웰)을 로딩하고 10% 폴리아크릴 아미드 겔 전기영동(PAGE)에 의해 분리하고 이후 PVDF 막에 일렉트로블롯팅하였다. 막을 5% 탈지 우유에 의해 차단하고 이후 연속하여 1차 항원[포스포-TrkA, Tyr490(Cell Signaling) 또는 포스포-TrkB, Tyr515(NovusBiological)] 1:1000와 밤새 및 2차 항원 1:2000와 실온에서 1 시간 동안 항온처리하였다. 블롯을 화학발광 시스템(Amersham)에 의해 가시화를 위해 처리하고 Kodak 필름에 노출시켜 플루오로그래피 이미지를 가시화하였다. 도 6에 도시된 바대로, 수용체 둘 다 5 분 후 이미 인산화하였다.
루미넥스 신호전달 검정: 10-Plex MAPK/SAPK 신호전달 Kit-인단백질(Millipore)을 사용하여 루미넥스 신호전달 검정을 수행하기 위해 인간 신경아세포종 세포주 SH-SY5Y를 사용하였다. 이 세포주는 TrkB 수용체를 발현하고 MAPK/SAPK 신호전달 경로는 통상적으로 티로신 키나제 수용체에 의해 활성화된다. 키트에 포함된 인단백질 항체는 다음과 같다: ERK/MAP 키나제(Thr185/Tyr187); STAT-1(Tyr701); JNK(Thr183/Tyr185); MEK-1(Ser212); ATF-2(Thr69/71); p53(Ser15); HSP27(Ser78); c-Jun(Ser73); p38(Thr180/Tyr182), p70 S6 키나제(Thr412); IkBα(Ser32)(구입: Millipore).
세포를 증식시키고 이후 24웰 플레이트(30,000개 세포/웰)에 시딩하였다. 24 시간 후, 세포를 100 ng/㎖ 및 20 ㎍/㎖의 2의 상이한 농도의 NGF-수용체 효현제 G79로 처치하였다. G79를 배지에 첨가한 후, 세포를 하기 시점에서 키트의 융해 완충액 중에 수집하였다: 30 분, 1 시간, 2 시간 및 6 시간. 처치된 샘플을 음성 대조군으로서 사용되는 비처치 세포(비자극 SH-SY5Y 세포)와 비교함으로써 시간 및 용량 효과 둘 다를 평가하기 위해 이러한 방식으로 검정을 수행하였다. BDNF는 20 ng/㎖의 농도에서의 양성 대조군으로서 사용되고, 이는 문헌에 공지된 최고의 작업 농도이다. 루미넥스 플레이트에서, 각각의 샘플을 웰에 2회 첨가하였다. 모든 샘플을 첨가한 후, 루미넥스 키트에 포함된 인산화의 특이적 양성 및 음성 대조군을 첨가하였다. 검정 완충액을 또한 배경 대조군으로서 2회 첨가하였다.
도 7은 수용체 티로신 키나제(RTK)의 인산화에 의해 활성화되는 세포내 경로를 보여준다. 원에 활성화된 인자가 있고, 회색 원에 시험된 인자가 있다. 루미넥스로부터의 xMAP 검정을 이용하여 여러 경로의 인산화에서의 SY-SY5Y 세포주의 이의 효과를 평가하였다. 도 8은 기술에 의해 시험된 인단백질의 활성화의 수준을 보여준다. 활성화의 수준은 중앙 형광 강도(MFI)로 표시된다. 루미넥스 기술에 의해 시험된 바대로, ATF-2, HSP-27, JNK 및 STAT-1은 비자극 대조군과 비교하여 조정되고 상당히 포스포 활성화된다. 도 8은 상이한 시점에서의 G79 및 BDNF 처치 둘 다에 대한 MFI의 그래프를 보여준다.
ATF-2는 비자극 대조군과 비교하여 G79 처치(20 ㎍/㎖) 6 시간 후 상당히 활성화되었다(*p<0.05). BDNF 대조군은 처치 2 시간 후 상당한 ATF-2 활성을 보여준다(§ p<0.05). HSP-27은 비자극 대조군과 비교하여 (20 ㎍/㎖ 및 100 ng/㎖ 둘 다에서의) G79 처치 1 시간 후 상당히 활성화되었다(*p<0.05). BDNF는 HSP-27를 활성화하지 않았다. JNK는 비자극 대조군과 비교하여 (20 ㎍/㎖ 및 100 ng/㎖ 둘 다에서의) G79 처치 6 시간 후 상당히 활성화되었다(* 및 § p<0.05). BDNF 대조군은 처치 2 시간 후 상당한 JNK 활성화를 보여준다(
Figure pct00007
p<0.05). STAT-1은 비자극 대조군과 비교하여 G79 처치(20 ㎍/㎖) 6 시간 후 상당히 활성화되었다(* p<0.05). BDNF는 STAT-1을 활성화하지 않았다.
실시예 13
세포계수 결합 검정
G79는 뉴로트로핀 수용체에 대한 결합에 대해 NGF 및 BDNF와 경쟁한다.
TrkA(PC12 세포) 및 TrkB 수용체(SH-SY5Y)에 대한 G79의 결합을 평가하기 위해, 본 발명자들은 유세포 분석에 의해 경쟁적 결합 검정을 수행하였다. p75와 TrkA 사이의 결합 경쟁을 평가하기 위해, TrkA 및 p75 수용체 둘 다를 발현하는 PC12 세포를 일반 성장 배지 중에 배양하였다. 트립신 용액에 의해 세포를 탈착한 후, 200,000개 세포/웰을 하기 항온처리 동안 관에 첨가하였다. 1개의 관은 대조군 비처치 세포를 포함하였다. 다른 관에서, 세포를 상이한 농도의 NGF(0-10-20-50-100 ng/㎖)(TrkA 및 p75 수용체 둘 다에 직접 결합할 수 있어, 동일한 수용체에 경쟁하는 경우 G79의 가능한 결합을 차단함)로 45 분 동안 사전 항온처리하였다. 이후, 세포를 세척하는 일 없이, FITC 형광물질(100 ng/㎖)과 컨쥬게이트된 G79를 첨가하고 이렇게 세포를 1 시간 동안 항온처리하였다. 샘플을 세포계산기(FCAScan)에서 판독하였다.
수용체 둘 다에 대해 별개로 결합을 검출하기 위해, (NGF 항온처리 전) 차단 항체를 갖는 세포의 사전 항온처리를 수행하였다. 세포를 TrkA에 대한 결합을 검출하기 위해 차단 항체 항-p75(1:100; Chemicon Int.) 또는 p75에 대한 결합을 검출하기 위해 차단 항체 항-TrkA(1:200; AbCam)와 1 시간 동안 사전 항온처리하였다. 이 세포에 대한 TrkB 및 p75와의 결합을 검출하기 위해 SH-SY5Y 세포주로 동일한 실험 프로토콜을 반복하였다. 이런 경우, BDNF를 TrkB 및 p75에 대한 결합에 대한 경쟁자로서 사용하였다. 모든 결과를 평균 채널 형광(MCF)으로서 표시하고, 이는 G79-FITC 결합에 의해 생성된 세포 표면 형광의 측정치이다.
도 9a는 신호(MCF)가 NGF의 성장 농도의 존재 하에 감소한다는 것을 보여주고, 이는 G79가 동일한 NGF-수용체에 대한 결합에 경쟁한다는 것을 의미한다. p75에 대한 결합을 평가하기 위해, 세포를 항-TrkA 항체와 사전 항온처리하고, 신호(MCF)가 여전히 감소한다는 것을 발견하였고, 이는 G79가 p75 수용체에 결합한다는 것을 나타낸다(도 9b). TrkA에 대한 결합을 평가하기 위해, 항체 항-p75에 의한 사전 항온처리는 신호(MCF)를 변화시키지 않았고, 이는 G79가 명확히 TrkA에 대한 결합에 대해 NGF와 경쟁하지 않는다는 것을 의미한다(도 9c). 그러나, 이 결과는 p75(세포마다 약 75000개의 수용체)의 더 많은 존재와 비교하여 세포 표면에 대한 매우 소량의 TrkA의 존재에 의해 영향을 받는다. 유사하게, TrkB에 대한 G79의 결합을 SH-SY5Y 세포주를 사용하여 평가하였다(도 9d). 이런 경우, 신호(MCF)가 BDNF의 성장 농도의 존재 하에 감소하였고, 이는 G79가 이의 수용체 중 하나에 대해 BDNF와 경쟁한다는 것을 나타낸다.
실시예 14
근위축성 축삭 경화증(ALS)의 실험실내 모델
G79, G80 및 G81은 ALS의 실험실내 모델에서의 신경보호성이다.
세포 배양: 마우스 운동뉴런양 세포 NCS-34를 10% 열 불활성화 FBS 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 보충된 DMEM(Gibco) 중에 배양하였다. 세포 배양을 37℃에서 95% 공기 및 CO2의 습윤 분위기 내에서 유지시켰다.
운동뉴런에서의 영양 결핍 스트레스를 이전에 문헌[Masahito T. et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol. 65(8):816-825 (2006)]에서 기재된 바대로 수행하였다. ALS에 대한 영양 스트레스 조건의 효과를 평가하기 위해, 아폽토시스의 존재를 혈청 결핍을 이용하여 조사하였다. NSC-34 세포를 30,000개 세포/웰에서 24웰 폴리-리시네이티드(poly-lysinated) 플레이트 내에서 시딩하고 다양한 용량의 G79, G80 및 G81(20 ng/㎖, 100 ng/㎖, 2 ㎍/㎖, 20 ㎍/㎖, 50 ㎍/㎖) 및 G-CSF(2 ㎍/㎖) 또는 BDNF(20 ng/㎖)(둘 다 양성 대조군으로서 사용됨)와 함께 DMEM + 10% FBS 중에 24 시간 동안 사전 항온처리하였다(Masahito T. et al., ibid; Elliot J.L., Neurobiology of Disease 6:310-320 (1999)). 이후, 배지를 제거하고 FBS가 없는 새로운 DMEM로 대체하였다. 48 시간 후, 세포 생존율을 이전에 기재된 바대로 MTT 검정에 의해 평가하였다.
도 10에 도시된 바대로, G79, G80 및 G81은 혈청 결핍으로 공격받는 운동뉴런에 대해 신경보호를 발휘하였다. 세포 생존율을 스트레스 없는 대조군에 대한 백분율로서 표시한다. G79는 100 ng/㎖의 농도에서의 최고의 신경보호성 효과를 나타내고, 스트레스 대조군과 비교하여 세포 생존율이 상당한 증가하였다(98.11±6.14% 대 69.64±1.12%; p = 0.02). 또한 G79는, 심지어 상당하지 않더라도, 양성 대조군, G-CSF 및 BDNF 둘 다와 비교하여 세포 생존율 증가를 보여준다(G-CSF 세포 생존율: 76.50±8.3%; BDNF 세포 생존율: 80.62±6.2).
실시예 15
실험적 자가면역 뇌척수염(EAE) 모델
G79는 다발성 경화증(MS)의 동물 모델을 완화한다.
예방 실험(처치를 질환 유도시 시작한다) 및 치유 실험(처치를 동물이 이미 질환을 앓고 있을 때 시작한다)을 수행함으로써 실험적 자가면역 뇌척수염(EAE)인 MS의 동물 모델에서 G79의 효과를 시험하였다. Harlan로부터의 암컷 C57BL/6 마우스(8∼12 주령)를 문헌[Palacio et al., 2007]에 이미 기재된 바대로 불완전 프로인트 보강제(IFA) 중에 50 ㎍의 마이코박테리움 투베큘로시스(H37Ra 균주; Difco, Detroit, MI)가 유화된 300 ㎍의 미엘린 희돌기교세포 당단백질(MOG) 펩티드 35-55(Spikem, Firenze)로 뒷 발바닥에서 피하로 면역화하였다. 마우스에 면역화시 및 2 일 후에 페르투시스 독소(Sigma)(500 ng)를 복강내로 주사하였다. 동물을 중량 측정하고 맹검 관찰자가 매일 질환의 임상 징후에 대해 조사하였다. 질환 EAE의 중증도를 하기 스케일에 따라 30 일 동안 평가하였다: 0 = 정상; 0.5 = 약간 다리 절음; 1 = 다리 절음; 2 = 뒷다리의 약간 마비, 휘청하는 보행; 3 = 보통 마비, 자발 운동이 여전히 가능; 4 = 대마비 또는 운동실조; 5 = 빈사 상태. 연구 종료시, 마우스를 마취시키고 0.1 M 인산염 완충액(pH 7.6) 중에 4% 파라포름알데하이드로 심장 내로 관류시켰다. 뇌, 척수 및 비장을 절제하고 사용시까지 고정하거나 냉동시켰다. 연구에 포함된 모든 동물로부터 또한 혈청을 얻었다. 동물 관리에 대한 바르셀로나 위원회 대학에 의해 이 절차를 승인받았다.
뉴로트로핀 경로(감보그산 아미드 및 살리프로덴)를 표적하는 다른 약물 또는 MS, 즉 글라티라머 아세테이트의 처치에 대한 최우선 처치 중 하나와 비교하여 G79의 예방 효과 및 치유 효과 둘 다에 대해 2의 상이한 실험을 수행하였다.
예방 실험을 위해, 10 마리의 동물을 40 ㎎/㎏의 농도에서의 G79의 복강내 주사에 의해 처치하고, 10 마리의 동물을 100 ㎎/㎏의 농도에서의 G79의 복강내 주사에 의해 처치하고, 10 마리의 동물을 2 ㎎/㎏의 농도에서의 감보그산 아미드의 복강내 주사에 의해 처치하고, 10 마리의 동물을 10 ㎎/㎏의 농도에서의 살리프로덴의 경구 투여에 의해 처치하였다. 감보그산 아미드 및 살리프로덴 둘 다 상이한 백분율의 DMSO로 희석하고, 각각 5 마리의 동물을 위약(생리학적 용액 + 1% DMSO)의 복강내 주사에 의해 처치하고 다른 5 마리의 동물을 위약 경구(생리학적 용액 + 2.5% DMSO)에 의해 처치하였다. 면역화 일 이후 시작하여 매일 처치를 수행하였다.
치유 실험의 경우, 경구 투여와 복강내 주사 사이의 차이를 감소시키기 위해, 스트레스가 동물에서의 임상 점수의 전개에 매우 영향을 미칠 수 있으므로, 복강내 주사에 의해 모든 처치를 수행하였다. 이 연구를 위해, 8 마리의 동물을 40 ㎎/㎏의 농도의 G79로 처치하고, 8 마리의 동물을 100 ㎎/㎏의 농도의 G79로 처치하고, 8 마리의 동물을 2 ㎎/㎏의 농도의 감보그산 아미드로 처치하고, 8 마리의 동물을 10 ㎎/㎏의 농도의 살리프로덴으로 처치하고, 8 마리의 동물을 5 ㎎/㎏의 농도의 글라티라머 아세테이트로 처치하고, 8 마리의 동물을 위약(생리학적 용액 + 2.5% DMSO)으로 처치하였다. 2 점수에서의 임상 점수의 증가 후(이 점수에서의 2 일째 후) 매일 처치를 수행하였다.
도 11a 및 도 11b는 MS의 생체내 모델(질환 유도의 동일한 일자에서의 개시 처치)에서의 G79의 예방 적용의 결과를 보여준다. 그래프는 EAE에 의해 이환되고 면역화 일 이후의 상이한 약물로 처치된 마우스의 임상 점수를 보여준다. 도 11a에서, G79로 처치된 동물은 상당하지는 않더라도 질환의 존재의 지연을 보여준다. 특히, 100 ㎎/㎏의 농도는 질환을 지연시키는 데 더 효과적이었다. 또한, 30 일째에 G79 100 ㎎/㎏로 처치된 동물의 최종 임상 점수는 위약 처치된 동물과 비교하여 더 낮았다.
도 12는 치유 실험의 결과를 보여준다. 100 ㎎/㎏의 용량에서의 G79은 임상 점수를 개선하는 데 있어서의 최고의 처치 효과를 보여준다. 특히 G79는, 위약과 비교하여, 16 일째와 23 일째 사이에 임상 점수를 상당히 감소시켰다(16 일째: G79 점수 2.8±1.2 대 위약 점수 4±0.7, p = 0.01; 19 일째 G79 점수 1.75±1 대 위약 점수 3.3±0.5, p = 0.003; G79 점수 1.6±0.8 대 위약 점수 2.8±0.8, p = 0.02). 또한 100 ㎎/㎏의 G79는 다른 시험된 처치(감보그산 아미드, 살리프로덴, 글라티라머 아세테이트)와 비교하여 더 우수한 처치 효과를 발휘하였다.
실시예 16
신경염증 실험실내 모델
G79는 신경염증의 실험실내 모델에서 신경염증을 감소시킨다.
뇌 염증은 많은 신경 질환에서 흔한 과정이고 MS의 경우에 현저하다. 뇌 염증에서의 G79의 효과를 평가하기 위해, 내독소로 공격받는 기관형 소뇌 배양을 이용하여 신경염증의 실험실내 모델에서 이의 효과를 시험하였다. 우선, G79의 효과를 효소 iNOS의 유도에서 시험하였고, 이는 일산화질소를 생성하고 염증을 촉진하였다. 도 13에 도시된 바대로, G79는 iNOS의 발현을 감소시켰다. G79에 의해 사전 처치된 샘플은 위약 사전 처치된 샘플과 비교하여 LPS로 공격받는 24 시간 후 iNOS의 발현의 감소를 보여준다.
염증 촉진 사이토카인의 방출에서의 G79의 효과와 관련하여, TNFα 및 IL-1β의 수준을 LPS로 공격받는 기관형 소뇌 배양으로부터의 상청액에서 시험하였다. 도 14a는 소뇌 기관형 배양에서의 TNFα의 생성을 보여준다. TNFα의 생성은 위약과 비교하여 G79로 사전 처치된 기관형 배양에서 6 시간 및 12 시간에 감소하였다. 도 14b는 소뇌 기관형 배양의 IL-1β의 생성을 보여준다. G79에 의한 사전 처치는 IL-1β의 방출에 영향을 미치지 않았다.
소뇌 기관형 슬라이스 배양에서의 신경염증의 실험실내 모델: 신생자 마우스(출생 8 일 후(P8))를 마취 IP 주사 후 목을 자르고 전체 뇌를 무균으로 제거하였다. 소뇌를 뇌의 나머지로부터 분리하고 금속 바이브라톰 플레이트에 위치시켰다. 소뇌가 플레이트의 표면에 부착하면, 바이브라톰을 사용하여 400 ㎛ 시상면 절편을 절단하였다. 이후, 슬라이스를 플라스틱 파스퇴르(Pasteur) 피펫으로 기관형 배양 배지(이글 염, 25% 행크 완충 염 용액, 25% 불활성화 말 혈청, 5 ㎎/㎖ 포도당, 0.25 mM L-굴루타민 및 25 ㎍/㎖ 페니실린/스트렙토마이신을 갖는 50% 기준 배지 중의 5% CO2)를 포함하는 세포 배양 플레이트에 옮겼다. 각각의 슬라이스를 분리하고 단리한 후, 소뇌 슬라이스를 이후 3℃에서 2 시간 이상 동안 항온처리에 의해 사전 컨디셔닝된 1 ㎖ 완전 배양 배지 및 0.4 ㎛ 기공(Millipore)을 갖는 30 ㎜ 배양 플레이트 인서트를 포함하는 6웰 플레이트(각각의 웰에 3개의 슬라이스)에 옮기고, 5% CO2를 인서트 아래의 각각의 웰에 첨가하였다. 6웰 플레이트를 37℃에서 및 5% CO2 하에 유지시키고 배지의 절반을 2 일마다 대체하였다. 이러한 조건에서 배양 1 주일 후 모든 실험을 수행하였다.
기관형 소뇌 배양 1 주일 후, 각각의 웰의 배지를 새로운 배지로 대체하고 G79(100 ng/㎖) 또는 위약(생리학적 용액)을 웰에 첨가하고 1 시간 동안 항온처리에서 유지시켰다. 이후, 리포폴리사카라이드(LPS)(15 ㎍/㎖)를 첨가하고 항온처리에서 유지시켰다. 슬라이스 및 기관형 배양 배지를 0 시간, 1 시간, 3 시간, 6 시간, 12 시간, 24 시간 및 48 시간의 상이한 시점에서 회수하였다. 각각의 시점에, 대조군의 비처치 슬라이스, LPS/위약 비처치 슬라이스 및 LPS/G79 처치 슬라이스를 얻었다. RNA 추출을 위해 3의 상이한 실험에서 슬라이스를 수집하였다. 이 목적을 위해, 슬라이스를 RNA 융해 완충액(Qiagen)에서 직접 회수하고 동일한 완충액에서 -20℃에서 냉동시켰다. 다른 3의 상이한 실험에서, 슬라이스를 면역형광을 위해 회수하고 실온에서 45 분 동안 4% 파라포름알데하이드(PFA) 중에 고정하였다. 모든 실험에서, 기관형 배양 배지를 수집하고 ELISA 검정을 위해 -20℃에서 저장하였다.
실시간 정량적 중합효소 사슬 반응: LPS 자극 실험으로부터 수집한 기관형 슬라이스를 RNA 융해 완충액 중에 균질화하였다. RNase-Free DNase Set(Quiagen)를 이용하는 DNase 처치를 비롯하여 RNeasy Mini Kit(Qiagen, Chatwworth, CA) 분리 시스템을 이용하여 전체 RNA를 추출하였다. 전체 RNA(35 ㎍)를 역전사 시스템(High Capacity cDNA Archive Kit; Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 역전사하였다. 실시간 반응을 25℃에서 10 분 동안, 이어서 37℃에서 2 시간 수행하고, 마지막으로 4℃에서 저장하였다. 프라이머 및 표적 특이적 형광 표지 TaqMan 프로브를 Applied Biosystems(TaqMan Gene Expression assays)으로부터 구입하였다. iNOS의 유전자에 대한 프라이머를 사용하였다. TaqMan Universal Master Mix(Applied Biosystems)를 사용하였다. 각각의 프라이머에 대해 0.9 μM 및 프로브에 대해 0.25 μM 및 20 ng 상보적 DNA를 사용하여 DNA Engine Opticon 2 Real-Time System(MJ Research, Watertown, MA)에서 상보적 DNA의 증폭을 수행하였다. 반응 조건은 하기와 같다: 50℃에서의 초기 2 분, 이어서 95℃에서의 10 분 및 95℃에서의 15 초 및 60℃에서의 1 분의 40회 사이클. 각각의 샘플을 3회 수행하고, 각각의 플레이트에서 표적 및 내인성 대조군을 동일한 웰에서 증폭하였다. 시험된 유전자의 발현을 항존 유전자 GAPDH의 수준에 대해 정량화하였다.
ELISA 검정: ELISA에 의해 IL-1β 및 TNFα와 같은 사이토카인 생성을 평가하기 위해 소뇌 기관형 배양 배지로부터의 상청액을 사용하였다. IL-1β의 경우, Quantikine Immunoassay IL-1β 키트(R&D System)를 사용하고, TNFα의 경우 마우스 TNFα에 대한 ELISA 개발 키트(Peprotec)를 사용하였다. 모든 ELISA 검정을 제조업자의 지시에 따라 수행하였다.
실시예 17
혈액-뇌 장벽(BBB)을 통한 수송
2의 실험실내 모델을 이용하여 혈액-뇌 장벽을 횡단하는 화합물 G79, G80 및 G81의 능력을 시험하였다. PAMPA(평행 인공 막 투과성 검정; Parallel Artificial Membrane Permeability Assay) 모델을 이용하여 수동 수송을 시험하고, BBEC 및 성상교세포를 동시 배양함으로써 BBB의 실험실내 모델을 이용하여 능동 수송을 시험하였다. 그 결과, PAMPA 모델에서 가로지르는 우수한 능력을 갖는 프로판올올 및 카르바마제핀(효과적인 투과성(pe) 프로판올올 = 11.5; pe 카르바마제핀 = 10.3; pe G79 = 0×10-6 cm/s)과 같은 다른 약물과 비교하여 G79가 PAMPA 모델에서 BBB를 횡단할 수 없는 것으로 밝혀졌다. 대조적으로, BBB의 실험실내 세포 모델에서, 모든 3개의 분자는 능동 수송에 의한 BBB의 중간 내지 높은 횡단(pe G79 = 4.1; pe G80 = 2.8; pe G81 = 2.1×10-6 cm/s)을 나타냈다.
평행 인공 막 투과성 검정( PAMPA ) 검정: PAMPA를 수동 BBB 투과성의 실험실내 모델로서 사용하였다. 필터에 고정된 인공 막을 도너 구획과 억셉터 구획 사이에 위치시켰다. 시험의 시작시, 약물을 도너 구획에서 도입하였다. 투과 기간 이후, 도너 및 억셉터 구획에서의 약물의 농도를 UV 분광계를 사용하여 측정하였다. 따라서, UV 발색단에 의한 임의의 화합물의 투과성을 이 방법에 의해 결정할 수 있다.
시험된 화합물 스톡 용액을 pH 7.4에서의 유니버셜 완충액 중에 200배 희석하고 도너 웰에 첨가하였다. 필터 막을 도데칸 중의 PBL로 코팅하고 억셉터 웰을 pH 7.4 완충액으로 충전하였다. 억셉터 필터 플레이트를 조심스럽게 도너 플레이트 위에 놓아 (바닥에서 시험 화합물과 함께 수성 도너, 중간에서 인공 지질 막 및 상부에서 수성 억셉터로 이루어지는) '샌드위치'를 형성하였다. 시험 화합물은 지질 막을 통해 도너 웰로부터 그리고 억셉터 웰로 확산되었다. '샌드위치'를 18 시간 동안 방해하지 않고 놓고 투과가 일어났다. 억셉터, 도너 및 참조물질 웰에서의 시험 화합물의 농도를 UV 플레이트 리더를 사용하여 결정하였다. 각각의 화합물의 효과적인 투과성(Pe)을 pION PSR4p 소프트웨어를 이용하여 계산하였다. 샘플을 3회 분석하고 3회 실행의 평균을 기록하였다. 품질 관리 기준을 각각의 샘플 세트로 실행하여 분석 세트의 일관성을 모니터하였다.
혈액-뇌 장벽( BBB )을 통한 수송의 세포 실험실내 모델: 혈액-뇌 내피 세포(BBEC) 및 신생자 랫트 성상교세포의 동시 배양을 이용하여 세포 실험실내 모델을 확립하였다. 간략히, 세포 동시 배양(0.33 ㎠의 표면적 및 0.4 ㎛의 기공 크기를 갖는 24웰 폴리카보네이트 트랜스웰, Corning Costar) 전에, 플레이트 인서트의 상부 표면을 콜라겐 유형 IV 및 피브로넥틴으로 코팅하였다. 다음에, 인서트를 큰 페트리 접시에 거꾸로 위치시키고 (대략 45,000개의 성상교세포를 포함하는) 40 ㎕의 현탁액을 각각의 필터의 바닥에 위치시켰다. 페트리 접시를 1 시간 동안 항온처리기에 위치시키고 40 ㎕의 새로운 DMEM+S를 각각의 필터의 바닥에 15 분마다 첨가하였다. 이후, 인서트를 다시 플레이트에 옮기고 37℃, 5% CO2에서 3 일 동안 항온처리하였다. 이 시간 후, BBEC를 시딩하기 2 시간 전에, 배지를 125 ㎍/㎖의 헤파린이 보충된 DMEM+S로 대체하였다. 2 시간 후, 세포를 인서트(필터당 45,000개의 세포)에 시딩하였다. 플레이트를 항온처리기에서 37℃, 5% CO2에서 3 일 동안 유지시켰다. 동시 배양 3 일 후, 배지를 cAMP 및 RO-20-1724가 보충된 DMEM+S로 대체하고, 37℃ 및 5% CO2에서 유지시켰다. 동시 배양 8 일째에, 경내피 전기 저항(TEER) 측정은 이 시스템이 수송 연구에 준비되었다는 것을 보여준다. 모델의 성숙도를 입증하기 위해, 실험일과 동일자에, 실험실내 장벽의 통합 마커로서 루시퍼 옐로우(LY)와 평행하게 투과성 검정을 수행하였다. 투과성 검정 동안 샘플을 20 μM의 농도에서 LY와 동시 항온처리하여 검정 동안 세포 단층의 통합을 평가하였다.
옴 미터 Millicell ERS 시스템(MERS 000 01, Millipore)을 사용하여 TEER을 결정하였다. TEER 측정은 동시 배양 8 일째에 기능적으로 온전한 실험실내 BBB의 형성을 확인시켜준다. TEER 값은 실험실내 BBB의 견고 또는 통합을 나타낸다. 모든 웰에 대한 TEER 값(평균±SD)은 141±5.7 옴/㎠이다.
Papp = (dQ/dt)*(1/A)*(1/C 0 )(cm/s) (1)
상기 방정식 (1)에서, (dQ/dt)는 시간의 함수로서의 억셉터 구획에 존재하는 화합물의 양(nmol/s)이고, A는 인서트의 면적(㎠)이고, C0은 도너 구획에 적용된 화합물의 초기 농도(nmol/㎖)이다.
수송 연구 동안, 화합물을 LY(20 μM)와 동시 항온처리하여 수송 검정 동안 세포막의 통합을 보장한다.
현재 본 발명이 완전히 기재되어 있고, 당업자는 본 발명의 범위 또는 이의 임의의 실시양태에 영향을 미치는 일 없이 조건, 제제 및 다른 매개변수의 넓고 동등한 범위 내에 수행될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 다른 실시양태는 본원에 개시된 본 발명의 명세서 및 실행의 고려로부터 당업자에게 명확할 것이다. 명세서 및 실시예는 오직 예시로만 고려되고, 본 발명의 진정한 범위 및 사상은 특허청구범위에 의해 표시되는 것으로 의도된다.
본원에 인용된 모든 특허 및 공보는 그 전문이 참조문헌으로 완전히 포함된다.
참고문헌
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00011

Claims (60)

  1. 하기 화학식 Ⅰ을 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭:
    Figure pct00012

    [식 중,
    R1은 할로겐 또는 트리플루오로메틸로 치환되고, 추가로 할로겐, C1 -6 알킬, (C1-6)알콕시 및 할로(C1-6)알킬로 이루어지는 군으로부터 선택되는 1개 또는 2개의 치환기로 임의로 치환된 페닐이거나;
    R1은 피롤리딘-1-일이고;
    R2는 2-옥소-피롤리딘-1-일메틸 또는 설파모일페닐이고;
    R3은 프로필, 1-메틸에틸, 부틸, 2-메틸프로필, 펜틸, 1-메틸부틸, 2-메틸부틸, 헥실, 4-메틸펜틸, 3-메틸펜틸, 2-메틸펜틸 및 1-메틸펜틸로부터 선택된다].
  2. 제1항에 있어서, R3이 하기 화학식 Ⅱ를 갖는 2-메틸프로필인 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭:
    Figure pct00013

    [식 중, R1 및 R2는 제1항에 정의된 바와 같다].
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, R1이 플루오로페닐이고, R2가 제1항에 정의된 바와 같은 화합물.
  4. 제3항에 있어서, R1이 2-플루오로페닐인 화합물.
  5. 제1항 또는 제2항에 있어서, R1이 피롤리딘-1-일인 화합물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 2-옥소-피롤리딘-1-일메틸인 화합물.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 설파모일페닐인 화합물.
  8. 제7항에 있어서, R2가 4-설파모일페닐인 화합물.
  9. 제2항에 있어서, 하기 화학식 Ⅲ를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭:
    Figure pct00014
    .
  10. 제2항에 있어서, 하기 화학식 Ⅳ를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭:
    Figure pct00015
    .
  11. 제2항에 있어서, 하기 화학식 Ⅴ를 갖는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭:
    Figure pct00016
    .
  12. 약제로서 사용하기 위한, 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭.
  13. 제12항에 있어서, 신경 세포사 또는 신경 세포 손상의 예방 또는 치료에 유용한 약제로서 사용하기 위한 화합물.
  14. 제12항에 있어서, 약제가 신경보호 약물인 화합물.
  15. 제12항에 있어서, 약제가 신경 세포의 재생에 유용한 화합물.
  16. 제12항에 있어서, 약제가 신경활동촉진(neuroenhancing) 약물인 화합물.
  17. 제12항에 있어서, 약제가 신경 질환 또는 정신 질환의 예방 또는 치료에 유용한 화합물.
  18. 제12항에 있어서, 약제가 근위축성 축삭 경화증(ALS; neurological disease), 파킨슨병, 알츠하이머병, 프레드라이히 운동실조(Friedreich's ataxia), 헌팅턴병, 루이소체(Lewy body) 치매, 척수성 근위축증과 같은 신경 질환, 우선적으로 신경퇴행성 질병; 다발성 경화증 또는 시신경 척수염과 같은 신경 염증; 주요 우울 장애; 정신분열증; 녹내장; 당뇨병 또는 AIDS 신경병증과 같은 말초 신경병증; 및 교모세포종, 성상세포종, 수모세포종, 신경초종, 신경아세포종, 뇌수막종, 대장암, 췌장암, 유방암, 전립선암, 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 골육종, 간세포 암종, 난소 암종, 폐 선암 및 식도 암종과 같은 암으로부터 선택되는 질환의 예방 또는 치료에 유용한 화합물.
  19. 제12항에 있어서, 약제가 다발성 경화증의 치료에 유용한 화합물.
  20. 제12항에 있어서, 약제가 알츠하이머병의 치료에 유용한 화합물.
  21. 제12항에 있어서, 약제가 파킨슨병의 치료에 유용한 화합물.
  22. 제12항에 있어서, 약제가 녹내장의 치료에 유용한 화합물.
  23. 제12항에 있어서, 약제가 신경재생 약물인 화합물.
  24. 제12항에 있어서, 약제가 면역조절제인 화합물.
  25. 제12항에 있어서, 약제가 신경보호성 효과와 면역조절 효과의 조합을 갖는 것인 화합물.
  26. 치료학적 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 1종 이상의 화합물 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
  27. 신경 세포사 또는 신경 세포 손상의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에서의 활성 성분으로서의, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 용도.
  28. 신경보호 약제의 제조에서의 활성 성분으로서의, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 용도.
  29. 신경 세포의 재생을 위한 약제의 제조에서의 활성 성분으로서의, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 용도.
  30. 신경 질환 또는 정신 질환의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에서의 활성 성분으로서의, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 용도.
  31. 근위축성 축삭 경화증(ALS), 파킨슨병, 알츠하이머병, 프레드라이히 운동실조, 헌팅턴병, 루이소체 치매 및 척수성 근위축증과 같은 신경 질환, 우선적으로 신경퇴행성 질병; 다발성 경화증 또는 시신경 척수염과 같은 신경 염증; 주요 우울 장애; 정신분열증; 녹내장; 당뇨병 또는 AIDS 신경병증과 같은 말초 신경병증; 및 교모세포종, 성상세포종, 수모세포종, 신경초종, 신경아세포종, 뇌수막종, 대장암, 췌장암, 유방암, 전립선암, 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 골육종, 간세포 암종, 난소 암종, 폐 선암 및 식도 암종과 같은 암으로부터 선택되는 질환의 예방 또는 치료를 위한 약제의 제조에서의 활성 성분으로서의, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 용도.
  32. 제31항에 있어서, 질환이 다발성 경화증인 용도.
  33. 제31항에 있어서, 질환이 알츠하이머병인 용도.
  34. 제31항에 있어서, 질환이 파킨슨병인 용도.
  35. 제31항에 있어서, 질환이 녹내장인 용도.
  36. 신경재생 약물의 제조에서의 활성 성분으로서의, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 용도.
  37. 면역조절제의 제조에서의 활성 성분으로서의, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 용도.
  38. 신경보호성 효과와 면역조절 효과의 조합을 갖는 약제의 제조에서의 활성 성분으로서의, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 용도.
  39. 신경활동촉진 약물의 제조에서의 활성 성분으로서의, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 용도.
  40. 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 제26항의 약학 조성물을 신경 세포사 또는 신경 세포 손상의 예방 또는 치료를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 것을 포함하는, 신경 세포사 또는 신경 세포 손상을 예방 또는 치료하는 방법.
  41. 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 제26항의 약학 조성물을 신경보호를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 것을 포함하는, 신경보호 방법.
  42. 제41항에 있어서, 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 제26항의 약학 조성물을 면역조절을 필요로 하는 피험체에게 투여하는 것을 포함하는, 면역조절을 추가로 포함하는, 신경보호 방법.
  43. 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 제26항의 약학 조성물을 신경 세포의 재생을 필요로 하는 피험체에게 투여하는 것을 포함하는, 신경 세포를 재생하는 방법.
  44. 근위축성 축삭 경화증(ALS), 파킨슨병, 알츠하이머병, 프레드라이히 운동실조, 헌팅턴병, 루이소체 치매 및 척수성 근위축증과 같은 신경 질환, 우선적으로 신경퇴행성 질병; 다발성 경화증 또는 시신경 척수염과 같은 신경 염증; 주요 우울 장애; 정신분열증; 녹내장; 당뇨병 또는 AIDS 신경병증과 같은 말초 신경병증; 및 교모세포종, 성상세포종, 수모세포종, 신경초종, 신경아세포종, 뇌수막종, 대장암, 췌장암, 유방암, 전립선암, 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 골육종, 간세포 암종, 난소 암종, 폐 선암 및 식도 암종과 같은 암으로부터 선택되는 질환을 예방 또는 치료하는 방법으로서, 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 제26항의 약학 조성물을 이를 필요로 하는 피험체에게 투여하는 것을 포함하는 방법.
  45. 제44항에 있어서, 질환이 다발성 경화증인 방법.
  46. 제44항에 있어서, 질환이 알츠하이머병인 방법.
  47. 제44항에 있어서, 질환이 파킨슨병인 방법.
  48. 제44항에 있어서, 질환이 녹내장인 방법.
  49. 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭을 투여하는 것을 포함하는, 신경 성장 인자 수용체 또는 신경 성장 인자의 활성의 자극의 결여를 앓고 있는 포유동물에서, 신경 성장 인자 수용체 또는 신경 성장 인자의 활성의 자극에 반응하는 질환을 치료하는 방법.
  50. 신경 성장 인자 수용체 또는 신경 성장 인자의 활성을 자극하는 데 사용하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭.
  51. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭을 투여하는 것을 포함하는, 신경 성장 인자 수용체 활성의 자극을 필요로 하는 피험체에서 신경 성장 인자 수용체 활성을 자극하는 방법.
  52. 제51항에 있어서, 신경 성장 인자 수용체는 TrkA 수용체 또는 p75 수용체인 방법.
  53. 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭을 투여하는 것을 포함하는, 뉴로트로핀 인자 수용체 또는 뉴로트로핀 인자의 활성의 자극의 결여를 앓고 있는 포유동물에서, 뉴로트로핀 인자 수용체 또는 뉴로트로핀 인자의 활성의 자극에 반응하는 질환을 치료하는 방법.
  54. 뉴로트로핀 인자 수용체 또는 뉴로트로핀 인자의 활성을 자극하는 데 사용하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭.
  55. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭을 투여하는 것을 포함하는, 뉴로트로핀 인자 수용체 활성의 자극을 필요로 하는 피험체에서 뉴로트로핀 인자 수용체 활성을 자극하는 방법.
  56. 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭을 투여하는 것을 포함하는, 뇌 유래 뉴로트로핀 인자 수용체 또는 뇌 유래 뉴로트로핀 인자의 활성의 자극의 결여를 앓고 있는 포유동물에서, 뇌 유래 뉴로트로핀 인자 수용체 또는 뇌 유래 뉴로트로핀 인자의 활성의 자극에 반응하는 질환을 치료하는 방법.
  57. 뇌 유래 뉴로트로핀 인자 수용체 또는 뇌 유래 뉴로트로핀 인자의 활성을 자극하는 데 사용하기 위한, 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭.
  58. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭을 투여하는 것을 포함하는, 뇌 유래 뉴로트로핀 인자 수용체 활성의 자극을 필요로 하는 피험체에서 뇌 유래 뉴로트로핀 인자 수용체 활성을 자극하는 방법.
  59. 제58항에 있어서, 뇌 유래 뉴로트로핀 인자 수용체는 TrkB 수용체 또는 p75 수용체인 방법.
  60. 유효량의 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 따른 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염 또는 프로드럭을 약학적으로 허용되는 담체와 혼합하는 것을 포함하는, 약학 조성물을 제조하는 방법.
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