WO2010093284A1 - Дипептидные миметики нейротрофинов ngf и bdnf - Google Patents

Дипептидные миметики нейротрофинов ngf и bdnf Download PDF

Info

Publication number
WO2010093284A1
WO2010093284A1 PCT/RU2010/000067 RU2010000067W WO2010093284A1 WO 2010093284 A1 WO2010093284 A1 WO 2010093284A1 RU 2010000067 W RU2010000067 W RU 2010000067W WO 2010093284 A1 WO2010093284 A1 WO 2010093284A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
lys
mmol
solution
compound according
added
Prior art date
Application number
PCT/RU2010/000067
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Сергей Борисович СЕРЕДЕНИН
Татьяна Александровна ГУДАШЕВА
Original Assignee
Учреждение Российской Академии Медицинских Наук Научно-Исследовательский Институт Фармакологии Имени В.В.Закусова Рамн
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Учреждение Российской Академии Медицинских Наук Научно-Исследовательский Институт Фармакологии Имени В.В.Закусова Рамн filed Critical Учреждение Российской Академии Медицинских Наук Научно-Исследовательский Институт Фармакологии Имени В.В.Закусова Рамн
Priority to US13/148,830 priority Critical patent/US20110312895A1/en
Priority to EP10741465.8A priority patent/EP2397488B1/en
Priority to CN201080014235.6A priority patent/CN102365294B/zh
Publication of WO2010093284A1 publication Critical patent/WO2010093284A1/ru
Priority to US14/460,881 priority patent/US9683014B2/en

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06104—Dipeptides with the first amino acid being acidic
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/14—Drugs for disorders of the nervous system for treating abnormal movements, e.g. chorea, dyskinesia
    • A61P25/16—Anti-Parkinson drugs
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/24—Antidepressants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/02—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing at least one abnormal peptide link
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06026—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atom, i.e. Gly or Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0606—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing heteroatoms not provided for by C07K5/06086 - C07K5/06139, e.g. Ser, Met, Cys, Thr
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0606—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing heteroatoms not provided for by C07K5/06086 - C07K5/06139, e.g. Ser, Met, Cys, Thr
    • C07K5/06069—Ser-amino acid
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06078—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06086—Dipeptides with the first amino acid being basic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06104—Dipeptides with the first amino acid being acidic
    • C07K5/06113—Asp- or Asn-amino acid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Definitions

  • the invention relates to bioorganic chemistry, namely to new substituted dipeptides, mimetics of neurotrophic factors, which may be useful as pharmaceutical agents for regulating growth, differentiation, survival and programmed death of neurons. More specifically, this invention relates to monomeric and dimeric dipeptide mimetics of loop-shaped regions of NGF and BDNF, which may be useful for the treatment of neurodegenerative diseases, including Parkinson's and Alzheimer's disease, Huntington's chorea, strokes, cerebral ischemia, traumatic brain injury, depression and others.
  • neurodegenerative diseases including Parkinson's and Alzheimer's disease, Huntington's chorea, strokes, cerebral ischemia, traumatic brain injury, depression and others.
  • Nerve growth factor and neurotrophic factor of brain origin (BDNF) are members of the family of neurotrophins that improve the survival of neurons and prevent neurodegeneration resulting from illness or injury. Sensory, sympathetic and cholinergic neurons are sensitive to NGF.
  • NGF therapy is believed to be able to prevent the development of Alzheimer's disease, prevent the loss of brain function in stroke, and make life easier for patients with peripheral diabetic neuropathy.
  • NGF is believed to be useful in treating neuronal lesions and be targeted in neuroectodermal tumors.
  • BDNF in the central nervous system acts as a powerful trophic factor for head and spinal motor neurons that degenerate in amyotrophic lateral sclerosis (Toepep H. et al, CR Acad Sretei III. 1993,316 (9): 1 158-63), and for dopaminergic neurons substantia nigra (substapti pigra), which are lost in Parkinson's disease (Sripa M.V. et al. J Neurochem. 1992 Jul; 59 (1): 99-106).
  • BDNF has a neurotrophic effect on small fiber neurons involved in a number of types of sensory neuropathy (Lipdsau R. M. Neurobiol Agipg.
  • the biological effects of NGF, BDNF, and other neurotrophins are mediated by binding to two classes of cell receptors: the high affinity (K d 10 "11 ) receptors of the tyrosine kinase family and the low affinity (K d 10 ⁇ 9 ) p75 receptor.
  • the p75 receptor is a glycoprotein with a molecular weight of 75 kilodaltons. It has no internal catalytic activity, but is associated with ERK, a family of soluble kinases (Volopte C. et al. MoI Biol CeIl. 1993 Jan; 4 (l): 71-8) and plays a role in protecting neurons from apoptosis. With this receptor all neurotrophins bind.
  • Trk tyrosine kinase
  • NGF and NT-3 bind to TrkA
  • BDNF and NT-4/5 bind to TrkB.
  • Receptor dimerization follows, which leads to autophosphorylation intracellular tyrosine receptor residues by internal kinase domains, which, in turn, initiates a cascade of enzymatic reactions that result in the biological effects of neurotrophins, including increased neuronal survival (Var basid M. J Neurobiol. 1994 Nov; 25 (l l): 1386-403).
  • Neurotrophins are homodimers that consist of two identical subunits of approximately 120 amino acid residues linked by hydrophobic interactions. X-ray diffraction studies carried out for the NGF homodimer (McDopal NQ et al. J MoI Viol. 1991 Ju 20; 219 (4): 595-601) and for the BDNF / NT-3 heterodimer (Robipsop R.C. et al. Biochemistr. 1995 1995 Arr 4; 34 (13): 4139-46) revealed a single three-dimensional structure of neurotrophins.
  • loops 1, 2, 3, and 4 contain structural elements exposed to water, which are called loops 1, 2, 3, and 4 and are hairpin-shaped structures, three of which have beta-turning sections at the ends (the so-called sections A-A ", A '" - B and CD, loops 1,2,4) and one section consisting of three consecutive reverse turns (called section BC, loop 3). It is believed that it is hairpin-like structures that are responsible for specific binding to a certain type of neurotrophin receptors.
  • loop 1 is responsible for binding to the p75 receptor. .Res., 1997).
  • neurotrophins to protect neurons in experimental models of neurodegenerative diseases has generated optimism about the possibility of their therapeutic use.
  • neurotrophins were unsuccessful drugs, because, like proteins, they are orally inaccessible, unable to cross the blood-brain and other biological barriers, and quickly degrade in the blood.
  • neurotrophins have a pleiotropic effect and can cause carcinogenesis.
  • the interaction of neurotrophins with the p75 receptor causes the death of neurons due to apoptosis.
  • a significant drawback of neurotrophins is the development of pain when using them. This is due to the involvement of neurotrophins in endogenous pain regulation.
  • the clinical application of neurotrophic factors has been unsuccessful (Repp RD et al. Neurosurgegu.
  • Cyclic peptide analogues are formed using a disulfide or other (ionic, metal-chelate, etc.) bonds between linear peptides that fully or partially correspond to sequences 28-36 of the 1 NGF loop, 42-49 of the 2 NGF loop, 59-67 and 91-99 loops 3 and 4 of NGF.
  • the minimum molecular weight of a cyclic peptide with agonistic activity was 1500 daltons, the peptide consisted of 16 amino acids. Peptides are active in vitro.
  • binding to the neurotrophin receptor was ensured by the presence of an extended region, usually corresponding to the pentapeptide (with the exception of the tripeptide region of the 4th loop of BDNF interacting with the p75 receptor), and this region had to be cyclized to form an active rotational conformation.
  • agonistic activity was achieved by combining two such cycles into a bivalent structure.
  • n 2 and the compounds are dimers in which the monomeric dipeptides are linked by the C-terminal spacer -R-R- or N-terminal spacer — R'-R'-.
  • n l and the compounds are monomeric substituted dipeptides.
  • a study of the biological properties of the claimed compounds showed that, depending on the structure, they exhibit neuroprotective or neurodegenerative activity, and, depending on which loop mimetic they are, mainly neurotrophic or differentiating activity.
  • Figure 1.1 The effect of different molar concentrations of the peptide GK-2B on the viability of HT22 cells.
  • Fig. 1. Neuroprotective effect of the peptide GK-6 under conditions of oxidative stress. MTT test. The introduction of GK-6 24 hours before H 2 O 2 .
  • Fig. 1.3 Neuroprotective effect of peptide GK-26 under conditions of oxidative stress.
  • Fig. 1.4 Neuroprotective effect of peptide GK-2g under conditions of oxidative stress.
  • Fig. 1.5 Neuroprotective effect of peptide GK-2d under conditions of oxidative stress.
  • Figure 1.6 The effect of the GSB-104 peptide on the survival of HT-22 cells under conditions of oxidative stress introduced 24 hours before hydrogen peroxide .. MTT test.
  • Figure 1.7 The effect of the GSB-106 peptide on the survival of HT-22 cells under conditions of oxidative stress.
  • Fig. 1.8 The effect of the GBK-108 peptide on the survival of HT22 cells under conditions of oxidative stress when applied 24 hours before hydrogen peroxide.
  • Figure 1.13 The effect of various concentrations of peptides GK-1 and GK-2 on the accumulation of Hsp70 in a culture of hippocampal neurons of the HT-22 line.
  • Figure 1.14 The effect of various concentrations of peptides TK-1 and GK-2 on the accumulation of Hsp32 in a culture of hippocampal neurons of the HT-22 line.
  • Fig. 1.15 The effect of peptides GK-3, GK-4, GK-5 on the accumulation of Hsp70 in a culture of hippocampal neurons of the HT-22 line.
  • Fig. 1.16 The effect of peptides GK-3, GK-4, GK-5 on the accumulation of Hsp32 in a culture of hippocampal neurons of the HT-22 line.
  • 1.2 - control 3.4 - NGF (100 ng / ml) 5.6 - GK-5 (10 '6 M)
  • Fig. 1.17 The effect of GK-2 and GK-3 on the phosphorylation of tyrosine kinase A in the culture of hippocampal neurons HT-22. 1 minute exposure. Densitometry results of the original Western blot.
  • FIG.18 The effect of GK-4 and GK-5 on the phosphorylation of tyrosine kinase A in the culture of hippocampal neurons HT-22. 1 minute exposure. Densitometry results of the original Western blot.
  • Figure 1.19 The effect of GK-1 (10 ⁇ 5 M) on the phosphorylation of tyrosine kinase A in the culture of hippocampal neurons HT-22. 1 minute exposure. Densitometry results of the original Western blot. * p ⁇ 0.05 relative to control by t-student criterion.
  • Fig. 1.20 Effect of GK-2 and NGF on tyrosine kinase A phosphorylation in HT-22 hippocampal neuron culture. 2 minutes of exposure. Densitometry results of the original Western blot.
  • Fig. 2.2 Reduced neurological deficit in ischemic rats treated with GK-2 (1 mg / kg ip).
  • A - 4 days after ischemia
  • B - 7 days after ischemia, test "limb”.
  • Figure 2.3 Decreased neurological deficit in rats, which were administered GK-2 (1 mg / kg ip) after ischemia.
  • the test "cylinder”.
  • Figure 2.4 The protective effect of GK-2 (1 mg / kg ip) during photothrombosis of the prefrontal cortex of the rat brain. * - p ⁇ 0.05 compared with NaCl.
  • FIG. 2.9 The effect of GK-2 (1 mg / kg ip) on the survival of rat cerebral cortex cells after bilateral carotid ligation (MTT test).
  • Fig. 2.11 The effect of GK-2 on the spontaneous alternation of arms in the T-labyrinth of rats receiving scopolamine.
  • Fig. 2.13 The effect of different doses of GBK-108 and GBK-201 (24 hours before the second landing) on the learned helplessness in mice * p ⁇ 0.05 relative to the control according to the U Mann-Whitney criterion.
  • the above compounds of formula I were obtained by well-known methods for the synthesis of peptides.
  • the usual process for the preparation of the subject compounds is the mixing and condensation of the required amino acids, usually in a homogeneous phase.
  • Condensation in a homogeneous phase can be performed as follows: a) condensation of an amino acid having a free carboxyl group and a protected other reactive group with an amino acid that has a free amino group and protected other reactive groups in the presence of a condensing agent; b) the condensation of an amino acid having an activated carboxyl group and a protected other reactive group with an amino acid that has a free amino group and protected other reactive groups; c) condensation of an amino acid having a free carboxyl group and a protected other reactive group with an amino acid having an activated amino group and protected other reactive groups.
  • the carboxyl group can be activated by converting it to an acid chloride, azide, anhydride group or an activated ester, such as N-oxysuccinimide, N-hydroxybenzotriazole, pentachlorophenyl or paranitrophenyl ether.
  • the amino group can be activated by converting it to phosphitamide or the "phosphorus" method.
  • the preferred condensation method for the preparation of peptides of formula I is the activated ester method, which is carried out mainly using succinimide, pentafluorophenyl or p-nitrophenyl esters of amino protected amino groups.
  • the best solvent is dimethylformamide.
  • Reactive groups that should not be involved in condensation can be protected by groups that are easily removed, for example, by hydrolysis or reduction.
  • the carboxyl group can be protected by esterification with ethanol, methanol, tert-butanol, benzyl alcohol.
  • the amino group is usually effectively protected by acid groups, for example, residues of aliphatic, aromatic, heterocyclic carboxylic acids, such as acetyl, benzoyl, pyridinecarboxyl, acid groups derived from carbonic acid, such as ethoxycarbonyl, benzyloxycarbonyl, tert-butyloxycarbonyl; or acid groups derived from sulfonic acid, such as para-toluenesulfonyl.
  • acid groups for example, residues of aliphatic, aromatic, heterocyclic carboxylic acids, such as acetyl, benzoyl, pyridinecarboxyl, acid groups derived from carbonic acid, such as ethoxycarbonyl, benzyloxycarbonyl, tert-butyloxycarbonyl; or acid groups derived from sulfonic acid, such as para-toluenesulfonyl.
  • N-acyl derivatives were prepared using the corresponding anhydrides, preferably succinic or acetic anhydride.
  • Amides of the peptides of formula I are obtained by ammonolysis (i.e. by reaction with NH 3 ) of an alkyl ester of the corresponding dipeptide or by reaction with an amino acid as the desired amide.
  • Amides of dipeptides can also be prepared by introducing an amide group into the corresponding dipeptide in any suitable manner, for example, by treatment with an amine in the presence of a condensing agent.
  • diamines mainly hexamethylenediamine, which were introduced into the reaction with the carboxy component in the conditions of the peptide synthesis described above.
  • the protective groups were removed in accordance with the nature of these groups: the carbobenzoxy group and the benzyl group were removed by hydrogenolysis by passing hydrogen in methanol over 10% palladium on carbon, the tert-butyloxycarbonyl group and the tert-butyl group were removed in acidic HCl in dioxane or anhydrous trifluoroacetic acid.
  • the melting temperature was determined in open capillaries and not adjusted; specific optical rotation was recorded on a Pegin-Elmer-241 automatic polarimeter; Proton magnetic resonance spectra (PMR) were obtained on a Bruker AC-250 spectrometer, chemical shifts were expressed in ppm.
  • TCX was carried out in the following solvent systems: chloroform-methanol-acetic acid-water, 15: 10: 2: 3 (A); n-butanol-pyridine-acetic acid-water, 15: 10: 3: 6 (B); chloroform-methanol, 9: 1 (B); chloroform-ethanol, 9: 1 (D); n-butanol-acetic acid-water 4: 1: 1 (D); hexane-ethyl acetate, 2: 1 (E); hexane-ethyl acetate 4: 1 (G); ethyl acetate (3); dioxane-water, 10: 1 (I); chloroform-methanol-water, 80:10: 1 (K); pyridine-water-acetic acid-ethyl acetate, 20: 11: 6: 120 (Jl); chloroform-methanol-water-acetic acid, 60: 45: 6.4: 13.6 (M).
  • Rf The values of Rf are respectively indicated: Rf (X) - the value of Rf in the system X (A, B, C, etc.).
  • the reaction mixture was diluted with 200 ml of ethyl acetate, washed with 100 ml of water, 100 ml of 2% H 2 SO 4 and 100 ml of 3% Na 2 CO 3 , and then evaporated. The residue was recrystallized from 80 ml of methanol and 30 ml of water. Further used without drying.
  • the reaction mixture was diluted with 200 ml of ethyl acetate and washed with 100 ml of water, 100 ml of 2% H 2 SO 4 and 100 ml of 3% Na 2 CO 3 in turn. After evaporation of the ethyl acetate solution, the product crystallized. Further used without drying.
  • the reaction mixture was diluted with 200 ml of ethyl acetate and washed with 100 ml of water, 100 ml of 2% H 2 SO 4 and 100 ml of 3% Na 2 CO 3 in turn.
  • the ethyl acetate solution was evaporated, the residue was recrystallized from 80 ml of methanol and 30 ml of water. Further used without drying.
  • the reaction mixture was diluted with 200 ml of ethyl acetate and washed with 100 ml of water, 100 ml of 2% H 2 SO 4 and 100 ml of 3% Na 2 CO 3 in turn. After evaporation of the ethyl acetate solution, the product crystallized. Further used without drying.
  • the resulting product was dissolved in 150 ml of methanol was added 3.0 g of 10% Pd / C and hydrogenated under stirring at 40 0 C 3 ml (59.9 mmol) conc. ammonium formate solution, adding it in portions. After 4 hours, the catalyst was filtered off, washed with methanol, and the filtrate was evaporated. The resulting product was dissolved in 500 ml of water and purified on a column with 100 ml of SP-Sephadex in a gradient of 0.1 M ⁇ 0.2 M pyridine acetate buffer. The appropriate fractions (TCX control) were collected and evaporated, re-evaporated with isopropanol.
  • the reaction mixture was diluted with 200 ml of ethyl acetate and 150 ml of water, the aqueous layer was extracted with 200 ml of ethyl acetate.
  • the ethyl acetate solution was washed with 100 ml of water, the solvent was evaporated, 200 ml of diethyl ether was added to the residue, and left to crystallize in the cold.
  • the precipitate was filtered off, washed with ether. 3.1 g (60%) of the product are obtained.
  • the product was dissolved in methanol, 3.0 g of 10% Pd / C was added to the suspension, and 3 ml (59.9 mmol) conc. Were hydrogenated with stirring at room temperature. ammonium formate solution with the addition of a small amount of acetic acid. After the disappearance of the starting material (TCX control), the catalyst was filtered off, washed with methanol, and the filtrate was evaporated. The residue was dissolved in DMF and 5.0 g (15.0 mmol) of N-benzyloxycarbonyl-glycine i-nitrophenyl ester (Z-GIy-ONp) was added. The reaction mass was allowed to mix for 1 night at room temperature.
  • a mixture of 10.00 g (100.00 mmol) of succinic anhydride and 1 1 ml (101.70 mmol) of benzyl alcohol was heated to boiling point for 6 hours.
  • the reaction mixture was cooled to room temperature and washed with diethyl ether.
  • the ethereal solution was filtered off from an insoluble precipitate of succinic acid and washed with us.
  • NaHCO 3 solution (3 x 40 ml).
  • the aqueous layer containing the sodium salt of HOOC (CH 2 ) 2 CO-OBzl was separated from the ether layer containing the reaction by-product, succinic acid dibenzyl ester, insoluble in an aqueous slightly alkaline medium.
  • the aqueous solution was acidified with 2 N.
  • Crystalline NaHCO 3 was added to the resulting aqueous solution with stirring in small portions, adjusting the pH to 6. A white crystalline precipitate formed from the aqueous solution. An aqueous solution with a precipitate was left for several hours at a temperature of + 5 ° C. Then the precipitate was filtered off, washed several times with cold water, and dried in vacuum. Received 12.00 g (30%) of the product with so pl. 169-170 0 C. Literature data: mp. 169-170 0 C. (J. Chet. Sos, 1950, 3239).
  • N-hydroxysuccinimide was dissolved at room temperature in 60 ml of THF. The solution was cooled to 0 ° C. With vigorous stirring, a solution of 6.18 g (29.93 mmol) of DCCA in 20 ml of THF was added cooled to 0 ° C. The reaction mixture was stirred at 0 0 C for 24 hours. The precipitated white precipitate of dicyclohexylurea was filtered. THF was evaporated in vacuo. A viscous oily mass was obtained, which was dissolved in 35 ml of methylene chloride. The resulting solution was left at a temperature of 0 ° C for 24 hours. The precipitate formed was filtered off. The filtrate was evaporated in vacuo. Received 14.06 g (97%) of an oily product.
  • the aqueous phase was further washed with ethyl acetate (3 x 50 ml).
  • the organic phases were combined and washed with us. NaCl (2 x 50 ml), dried with anhydrous Na 2 SO 4 .
  • the solvent was removed in vacuo.
  • the resulting residue was triturated with diethyl ether at room temperature, and crystallization of the product occurred.
  • the resulting crystals were washed with ether and dried in vacuo. 4.81 g (72%) of crystalline product was obtained.
  • V-monocytocynyl-glutamyl-lysine (GK-2g), ethylene diamide # ic - (./ V-monocytocynyl-glutamyl-lysine) (GK-2d), (HOOC (CH 2 ) 2 CO-Glu-Lys-NH- ) 2 (CH2) n , where n: 2, 3, 4, 5 a) Preparation of N-monobenzylcycinyl- ⁇ -benzyl-glutamyl-N ⁇ - (2-chlorophenylbenzyloxycarbonyl) lysine, BzU-OC (CH 2 ) 2 CO-Glu (OBzl) -Lys (2-Cl-Z) -OH
  • the reaction mixture was stirred for 2 days at room temperature. The precipitate was filtered off, the solvent was removed in vacuo. To the residue were added 100 ml of chilled 10% citric acid solution and 200 ml of ethyl acetate. The organic layer was separated from the aqueous. The aqueous phase was further washed with ethyl acetate (3 x 100 ml). The organic phases were combined, washed us. NaCl (2 x 100 ml), dried with anhydrous Na 2 SO 4 and evaporated. The resulting residue was triturated with diethyl ether at room temperature, and crystallization of the product occurred. The resulting crystals were washed with ether and dried in vacuo. Received 12.43 g (92%) of a pale yellow crystalline product with so pl. 80-82 0 C.
  • the resulting viscous crystalline mass was dissolved in 50 ml of methylene chloride, the resulting solution was left at a temperature of 0 0 C per day. The precipitate formed was filtered off. The solvent was evaporated, the residue was dried in vacuo. Received 12.80 g (100%) of the product as a viscous crystalline mass.
  • GK-2B For the synthesis of GK-2B, GK-2g, GK-2d, 3.20 g (3.90 mmol) of BzIO-OC (CH 2 ) 2 CO-Glu (OBzl) -Lys (2-Cl-Z) -OSu were taken for each synthesis and 1.95 mmol of tetramethylenediamine, propylene diamine, ethylenediamine, respectively. All compounds were synthesized according to the procedure described for GK-26. Tetramethylene diamide bis- (N-monocytcinyl-glutamyl-lysine), (HOOC (CH 2 ) 2 CO-Glu-Lys-NH-) 2 (CH 2 ) 4 (GK-2c)
  • the solution was kept at + 4 ° C for 4 h and again filtered from the residue of the precipitated dicyclohexylurea precipitate, after which it was evaporated not to dryness to the state of a liquid oil.
  • the resulting residue was dissolved in 300 ml of boiling hexane, the solution was left for 2 hours at room temperature, and then at + 5 ° C for 1 night.
  • the precipitated crystals were filtered off, washed with cold hexane (2 x 150 ml), and dried in vacuo at 50 ° C for 4 h. 35.53 g (92%) of the product was obtained.
  • the reaction mixture was stirred at room temperature for 4 hours. Then, 0.2 ml (2.00 mmol) was added to the solution. stirred for another 20 minutes and evaporated halfway.
  • the reaction mass was transferred to a separatory funnel, 100 ml of water and 100 ml of ethyl acetate were added. After extraction, the organic layer was separated and washed with 5% H 2 SO 4 , sat. Na 2 SO 4 , 5% NaHCO 3 and us. Na 2 SO 4 , then dried with anhydrous Na 2 SO 4 and evaporated. The resulting hardened amorphous mass was dissolved in 50 ml of TFA.
  • Ad (-Gly-Lys (Z) -NH (CH 2 ) 3 COOBzl) 2 was dissolved in a mixture of 20 ml of methanol, 1 ml of water and 5 ml of acetic acid, 1 g of 10% Pd / was added to the solution FROM, suspended in 5 ml of methanol, and 4 ml (39.49 mmol) of cyclohexene.
  • the reaction mixture was heated with stirring and refluxed for 30 minutes. After cooling, the catalyst was filtered off, washed with methanol (3 x 10 ml) and a 1: 1 water-acetic acid mixture (3 x 10 ml).
  • the precipitated white precipitate of DCGM was filtered off, the filtrate was evaporated, the remaining oil was crystallized from ethyl acetate-hexane mixtures (15 ml to 80 ml). The precipitated crystals were filtered off, washed with hexane and dried in vacuum. The mass of the obtained product was 7.18 g. The mother liquor was also evaporated and recrystallized from ethyl acetate-hexane (5 ml to 50 ml). The weight of the additional product obtained was 1.05 g. The total yield of the product was 8.23 g (89%), R f 0.42 (E), R f 0.13 (W), mp 134-135 ° C, [ ⁇ ] D 20 - 25.75 ° (s 0.4; DMF).
  • the combined aqueous fractions were extracted with chloroform (2 x 50 ml).
  • the organic fractions were combined and washed with 3% K 2 CO 3 (2 x 100 ml).
  • the resulting aqueous fractions were washed with chloroform (2 x 50 ml). All combined organic fractions were dried with anhydrous Na 2 SO 4 .
  • the resulting chloroform solution contains impurities in addition to the target product.
  • chloroform was removed in vacuo, the residue was dissolved in ethyl acetate. A white amorphous precipitate, also contaminated with impurities, began to precipitate immediately.
  • the reaction mass was stirred for 1 night, after the disappearance of the starting compound (TCX control), the reaction mass was poured into 25 ml of water. The precipitated white precipitate was filtered off, washed with water, and dried. The reaction mass was stirred for 2 hours, the disappearance of the starting compound (TCX control) was evaporated, the residue was crystallized with a mixture of ether-ethanol (4: 1), mashing and keeping at -20 °. The resulting crystalline substance was filtered off, washed with a chilled mixture of ether-ethanol (4: 1) and dried.
  • the reaction mixture was left for 1 night at room temperature, after which 250 ml of ethyl acetate and 200 ml of water were added, the organic phase was washed with 2% HCl (2 x 100 ml) and 100 ml of 3% NaHCO 3 , and evaporated to a volume of ⁇ 60 ml. A gradual precipitation was observed, the amount of which increased as a result of cooling the solution to -20 ° C. The precipitate was filtered off at room temperature, washed with ethyl acetate and dried. Received 3.3 g (29%) of product, Rf 0.59 (L), Rf QJl (M), mp 160-162 0 C, [ ⁇ ] D 20 -28.75 ° (s 0.4; methanol).
  • TCX control After the disappearance of the starting material (TCX control), 206 g of EDTA was added to the reaction mixture at 40–50 ° C in the form of an aqueous suspension with the addition of NaOH to pH ⁇ 10. After that, a solution of 133 g of Z-Cl (0.7 mol) in a small amount of water was added dropwise to the reaction mass, cooled to room temperature. After the disappearance of H-Lys (Boc) -OH (TCX control), 1.5 L of ethyl acetate was added to the reaction mass, its end was acidified. HCl solution to pH ⁇ 3; CuSO 4 was filtered. The organic layer was washed with water and evaporated.
  • the residue was dissolved in 20 ml of DMF and 1.2 g (12.0 mmol) of succinic anhydride was added.
  • the reaction mixture was stirred at room temperature until completion of the reaction (TCX control), after which 2 ml of DMPDA was added and held for 30 minutes.
  • the reaction mixture was diluted with 200 ml of ethyl acetate and washed with 100 ml of water, 100 ml of 2% H 2 SO 4 and 100 ml of 3% Na 2 CO 3 in turn. After evaporation of the ethyl acetate solution, the product crystallized. Further used without drying.
  • Tris-HCl (Serva), dithiothreitol, sodium dodecyl sulfate (SDS) (Bio-Rad), Tween-20, TEMED (Bio-Rad), acrylamide (Bio-Rad), methylene bis acrylamide (Bio-Rad), mixture protease inhibitors (Biol), Folin's reagent (Megg), 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine (MPTP) (Sigma), ECL - electrochemiluminescent reagent (Sapta Cruz Biotechologu).
  • the second goat antibodies to monoclonal murine antibodies conjugated with horseradish peroxidase (Sapta Cruz Biothespologu).
  • the second goat antibodies to polyclonal rabbit antibodies conjugated with horseradish peroxidase (Sapta Cruz Biotechnology). Installations for electrophoresis (Mipi-Proteap 2 CeIl) and protein transfer (Semi-dru) (Bio-Rad) to the PVDF membrane.
  • a PC 12 rat adrenal cortex pheochromocytoma cell culture was obtained from the Museum of Cell Culture of the Institute of Molecular Genetics, Russian Academy of Sciences.
  • the HT-22 mouse immortalized hippocampal cell culture is a gift from Professor F. Viegant from the University of Utrecht (Holland).
  • Cells were cultured in DMEM containing 5% FBS, 2 mM L-glutamine. Cells were incubated at 37 ° C and 5% CO 2 .
  • the change of culture medium was made 24 hours after sieving and every subsequent 3 days. Sieving in culture bottles with a total area of 75 cm 2 was carried out every week.
  • the experiments were performed using culture 96, 48, and 6-well plates. Wells were treated for 30 minutes with a solution of poly-L-lysine (0.1 mg / ml) in sterile deionized ( ⁇ Q, Millipore) water. Then the wells were washed three times with sterile water and dried in a laminar box at room temperature.
  • PC 12 and HT-22 cells were scattered on 96-well plates with a density of 3.5xLO 3 per well, on 6-well plates — 500 xlO 3 per well.
  • the neurons of the midbrain and hippocampus were scattered into 48-well culture plates with a density of 350 xlO 3 cells per well. All cell types were dispersed in DMEM.
  • DMEM fetal calf serum
  • FBS FBS serum
  • Undifferentiated PC 12 cells were scattered at a density of 3.5 x 10 3 per well in DMEM with 1% FBS.
  • NGF 100 ng / ml, positive control
  • the studied peptides and NGF were added to the medium in one series of experiments every 24 hours, in another series - every 48 hours for 6 days.
  • the degree of cell differentiation was judged by the shape and size of the cells, the number and length of the processes.
  • the cells were placed in a culture medium with 5% FBS, to which was added a freshly prepared solution of H 2 O 2 at a final concentration of 1.5 mM and incubated for 30 min in 5% CO 2 at 37 ° C. After this, the medium was replaced and cultured for 4 hours under the same conditions.
  • MTT is a water-soluble yellow tetrazolium salt that easily penetrates cells. In living cells, MTT turns into water-insoluble crystals formazan purple.
  • the culture medium was replaced with MTT solution (0.5 mr / ml) and incubated for 30 minutes at 37 ° C and 5% CO 2 . Then, a MTT solution was taken from the wells and DMSO was added to dissolve the formazan. After that, the optical density of the solution was measured on a Multisap spectrophotometer (Thermo) at a wavelength of 600 nm.
  • Hsp70, Hsp32, and pTrkA were determined in the cytoplasmic fraction of HT-22 neurons.
  • heat shock proteins the substance was added to the culture 24 hours before testing, after which the cells were washed from the culture medium with a PBS solution.
  • pTrkA the substance was added to the culture immediately before cell lysis for 1 or 2 minutes, after which the culture medium was washed with PBS.
  • lysis buffer 50 mM Tgis-HCl, 5mM EDTA, ImM DTT, 1% Tritop X-100
  • pH 7.5 50 mM Tgis-HCl, 5mM EDTA, ImM DTT, 1% Tritop X-100
  • the supernatant containing cytosol proteins was analyzed using electrophoresis and immunoblotting. Proteins were separated on a 10% polyacrylamide gel (PAGE). Protein transfer from PAAG to the PVDF membrane was carried out by electroelution for 45 minutes.
  • PC-12 cells with the addition of nerve growth factors are able to differentiate according to the neuronal type, and therefore they are used as an object of study to determine the differentiating ability of various drugs.
  • GK-1 - GK-5 preparations were added to the cultivation medium at final concentrations of 10 "5 M - 10 " 8 M.
  • NGF was used as a positive control at a final concentration of 100 ng / ml.
  • GK-1 - GK-4 nerve growth factors did not cause differentiation of PC-12 cell lines in any of the concentrations.
  • GK-1 at a concentration of 10 ⁇ 5 M reduced the differentiating effect of NGF by 50% (the result was obtained by counting the number of differentiated and undifferentiated cells).
  • GK-5 has a differentiating effect in final concentrations of 10 "5 M and 10 " 6 M.
  • the central nervous system consists of 90% of the inserted neurons, which serve to process and switch nerve impulses.
  • One or more neurons can be located between afferent (from the sense organs to the central parts of the nervous system) and efferent neurons (motor, motor - impulses to the organs). Especially a lot of them in the reticular formation of the hind and midbrain, basal ganglia.
  • this peptide is advisable to use in situations when during neurodegenerative processes (for example, with ischemic and hemorrhagic stroke) there is a violation of motor functions. Some cells remain undifferentiated. The effect of GK-4 is observed much later than GK-3. This is characteristic of the development of intercalary neurons in the body with the so-called “embryonic compensation model”.
  • NGF (IOO NGF (50 NGF (30 ng / ml) ng / ml) ng / ml)
  • NGF IOO NGF NGF (30 ng / ml) (50 ng / ml) ng / ml)
  • GK-2 at concentrations of 10-5-10-8M, as well as NGF at a concentration of 100 ng / ml, introduced during cell culture and every subsequent 24 hours for 10 days, improves the viability of neurons in the absence of any damaging factors (table. 1.2.).
  • the mimetic NGF GK-2b reduced the viability of HT-22 cells (Fig. 1.1.).
  • the claimed compounds influenced the viability of hippocampal cells under conditions of oxidative stress (Table 1.3. -1.8., Fig. 1-5).
  • the peptides GK-1 and GSB-104 worsened the survival of neurons
  • the peptides GK-2, GK-2a, GK-26, GK-2d, GK-2e, G-K-3, GK-4, GK-5, GK-6, GSB-106, GSB-104, GBK-108 improved the survival of neurons, being introduced 24 hours before stress in the concentration range 10 '5 - 10 "
  • GK-2a 10, - ° 5 M 0.108 ⁇ 0.019 L GK-2a, 10 "6 M 0.092 ⁇ 0.02 GK-2a, 10 " 7 M 0.102 ⁇ 0.024 GK-2a, 10 "8 M 0.106 ⁇ 0.028 Table 1.6
  • NGF 100 ng / ml 0, 103 ⁇ 0,018
  • GK-2 at a concentration of 10 5 M was active in the primary culture of midbrain and hippocampal neurons of 18-day-old rat embryos in a model of oxidative stress, when administered 24 hours before stress (Table 1.10., 1.11.).
  • GK-2 has a significant protective effect. This effect is manifested when making gk-2 concurrently with MPTP only at a concentration of 5 ⁇ 10, whereas the introduction of 24 hours before MPTP is active at concentrations 10 and '5, and 10 "8 M ( Figure 1.9, 1.10.).
  • GK-5 peptide was inactive in this test.
  • the peptides GK-2, GK-4 and GSB-106 showed a protective effect under the conditions of glutamate cytotoxicity on HT-22 cell culture, being introduced 24 hours before glutamate (Fig. 1.12., Table 1.12.).
  • the BDNF GSB-106 mimetic was active in the concentration range 10 "5 -10 ⁇ 8 M, and the effect depth increased with decreasing concentration. Table 1.12
  • Hsp70 [Liu, H .; Nowak, R .; Shao, W .; Vlosh, K.D. Nevve ggowth ipodces apti-arorthotis heme oxygenase-1 ip rathechemosutoma PC 12 sells, J. of Neurochem. 2003, 86, 1553-1563; Pullask, SJ. Upd Narr, SJ. Small Molle Trk Resource Agopists and Otter Neurotorhis Fast Techniques; Surprt Dr Targets-SNS apd Neurologic Disorders 2002, 1, 59-80;], which exhibit a neuroprotective effect.
  • GK-1 line at final concentrations of 10 "5 M and 10 " 8 M does not affect the accumulation of these proteins.
  • GK-2 at final concentrations of 10 "5 M and 10 " 8 M causes the accumulation of Hsp70 and Hsp32 proteins. (Fig. 1.13, 1.14.).
  • GK-1 (10 "5 M) was added 30 minutes before GK-2, no increase in the amount of Hsp32 and Hsp70 was observed (Fig.1.13, 1.14).
  • GK-3 at a final concentration of 10 " 6 M causes a small accumulation of Hsp32 and does not affect by the amount of Hsp70 (Fig.
  • GK-4 (10 ⁇ 7 M) leads to a significant increase in the synthesis of Hsp70 and does not affect the accumulation of Hsp32 (Fig. 1.15, 1.16.).
  • GK-5 (10 ⁇ 6 M), on the contrary, increases the synthesis of Hsp32 and does not affect the content of Hsp70 (Fig. 1.15, 1.16.).
  • the protective effect of the claimed compounds is associated with the synthesis of heat shock proteins.
  • NGF shows an increase in tyrosine kinase phosphorylation.
  • the effect of GK-2 becomes more pronounced compared to the 1st minute (Fig. 1.20.).
  • peptides GK-1 - GK-5 are ligands of the TrkA receptor.
  • Mimetics of both the 4th and 1st loops of NGF and BDNF affect survival neurons.
  • monomeric mimetics of the 4th loop decrease the viability of neurons and their survival under damaging conditions, such as oxidative stress, glutamate excitotoxicity, and the action of the MPTP neurotoxin.
  • Dimeric analogs of the same loop in contrast, have neuroprotective activity. This activity depends on the length of the spacer between the dipeptide fragments of the mimetics.
  • both monomeric and dimeric analogues have neuroprotective activity. In addition to neuroprotective activity, these mimetics exhibit differentiating activity or are able to modulate the differentiating activity of NGF. Monomeric analogues of the 4th loop with neurodegenerative activity are able to inhibit the differentiating effects of NGF.
  • All neurotrophin mimetics with neuroprotective activity like NGF itself, increase the synthesis of heat shock proteins Hsp32 and / or ⁇ dronate modifier 70 depending on the structure of the mimetic, and also increase the amount of phosphorylated form of TrkA. This indicates that the claimed compounds are indeed neurotrophin mimetics and act through tyrosine kinase receptors.
  • the claimed compounds with neuroprotective activity identified in experiments in vitro, were studied in animal models of neurodegenerative diseases such as stroke, cerebral ischemia, Parkinson's disease, Alzheimer's disease.
  • neurodegenerative diseases such as stroke, cerebral ischemia, Parkinson's disease, Alzheimer's disease.
  • the most active compound with respect to neuroprotective effects was chosen - a dimeric mimetic of the 4th loop of NGF GK-2.
  • BDNF mimetics were studied in a classic animal model to detect antidepressant activity.
  • mice The work was performed on male outbred rats weighing an average of 270 g. All animals taken into the experiment were divided into groups: JIO - falsely operated; IS - rats with ischemic cerebral infarction; ISHG - animals, which 1 hour, day and two days after ischemia were injected with GK-2 in physiological saline at the rate of 1 mg of the drug per 1 kg of animal weight intraperitoneally (3 injections in total). Other groups at the same time intervals were injected with the same volume of saline, but without the drug.
  • Rat cerebral ischemia was caused by the introduction of silicone coated into the midbrain artery (Shimamura N, Mathett G, Tsukokawa T, Khukuma H, Zhang J. Komprisulopusulopulosa medicamenta 2006, 156 (1 -2): 161-5) of a nylon thread, as previously described (Zea Longa E, Weinstein PR, Carlson S & Cummins R. (1989) Revolutionary middlé sertreter oslusiop withotprocess 20. : 84-91).
  • Occlusion was performed for 60 min, after which the suture was removed from the vessel, restoring blood supply in the middle cerebral artery basin. During and after surgery, the animal's body temperature was maintained at 37D5DC. False-operated animals underwent the same procedures, with the exception of vascular transection and thread insertion.
  • a linear transmitter with an internal diameter of 72 mm was used to transmit the RF signal, and a surface receiving coil for the rat brain was used to detect the RF signal.
  • the total scan time is 4 minutes.
  • V d * ⁇ Ai, where ⁇ Ai is the sum of the areas of damage on all sections, d is the thickness of the sections.
  • a day before ischemia (day -1), a baseline study of the neurological status of all animals was performed using the Limb-placing and cylinder tests. Then, after 1 hour, day and two days (a total of 3 injections) after ischemia, GK-2 was administered in physiological saline at the rate of 1 mg of the drug per 1 kg of animal weight intraperitoneally. Other groups at the same time intervals were injected with the same volume of saline, but without the drug. On the 4th day, the animals were examined using the Limb-placing test, and on the 7th tests the Limb-placing and cylinder tests, as well as an MRI scan of the brain.
  • the affected area was defined as an increase in signal (hyperintensity) in T2-weighted images with respect to intact white matter due to the development of cytotoxic edema. According to our results, by this time the edema of the affected hemisphere was small and amounted to only 3% relative to the control hemisphere. In the control group of animals, edema of the damaged hemisphere was observed in 46%, in the group of treated GK-2 only in 9% of animals.
  • Using the limb test it was shown that treatment in the post-ischemic period with the GK-2 preparation significantly reduced neurological deficit in ischemic animals. If intact rats gain 14 points in the limb test, then after ischemia this indicator was 3 + 0.38 and 4.46 + 0.4 on the 4th and 7th day after ischemia, respectively. Three-time administration of the drug significantly improved these indicators to 5.9 + 0.62 for 4 days after ischemia and 7.67 + 0.75 for the 7th day. The results of behavioral tests are presented in (Fig. 2.2.).
  • GK-2 exhibits a pronounced anti-ischemic activity, which is expressed both in a decrease in the volume of the affected area of the brain and in a significant decrease in neurological deficit in animals that were injected with the drug in the post-ischemic period
  • the substance was administered intraperitoneally at a dose of 1 mg / kg according to the following scheme: 1 hour after surgery, 24 hours after the 1st injection, on the 4th day and on the 6th day after the first injection.
  • the latent period (LP) was determined — the time that passed from the beginning of the test until the rat crossed the hole separating the illuminated and dark compartments of the chamber.
  • LP latent period
  • the rat was placed in the illuminated compartment (100W lamp), examining which, after a while (PL before training), it passed into the dark compartment, after which the door to this compartment of the chamber was closed and the rat was left there for 5 minutes. After lh, the procedure was repeated and the rat was immediately removed from the dark compartment. The next day, the same procedure was repeated twice with an hourly interval.
  • Bilateral focal ischemic infarction of the prefrontal cortex of rats was created by photoinduced thrombosis (Watsop et al. 1985). Animals were anesthetized with chloral hydrate (ZOOmg / kg, ip). The photosensitized dye Bengal pink (Sigma Chem. Co.) was injected into the jugular vein (3% solution, 40 mg / kg). The animals' heads were fixed in stereotaxis and, after a longitudinal skin incision, the periosteum was removed.
  • the light guide (the diameter of the light beam at the exit 3 mm) was installed at a distance of l mm from the surface of the skull at the coordinates: 2.0 mm rostral to bregma and 2.0 mm lateral to the sagittal suture.
  • Cold light exposure (source - xenon lamp 25V, 250W) was carried out for 15 min on each side. False-operated animals underwent the same procedures, with the exception of the introduction of Bengal pink.
  • DA level of motor activity
  • Histological preparations were scanned on an Ersop regfestiop V100 PHOTO scanner slide adapter. This method allows you to get a file with an image of a brain section of a pale blue color, on which the focus of ischemic is clearly visible. damage - dark-colored along the edge and light in the middle. Sometimes necrotic tissue disintegrates; in this case, the missing tissue site was considered the lesion focus.
  • the area of ischemic damage was measured using computer image analysis programs in relative units and correlated with the area of the scanned square with a side of 10 mm, obtaining the value of the area of damage in mm 2 .
  • V DS n d, where d is the thickness of a pair of sections (200 ⁇ m); S n is the measured area of the ischemic focus of the serial cut in mm; D is the sum of the volumes of ischemic damage in sections.
  • KEZ coefficient of protection efficiency
  • V 0 the average total volume of the lesion in animals with the introduction of saline
  • V in the average volume of the lesion in animals with the introduction of the substance. This parameter allows you to compare the effectiveness of various substances on different models of ischemia.
  • the latent period of entry of animals into the dark compartment decreased from 300 s to 59.2 s.
  • the conditioned reflex was completely restored - the latent period was at least 300 s (Table 2.1.).
  • the lesion volume of both the left and the right hemisphere, as well as the lesion in the rat and the average lesion focus in the treated animals is less (Fig. 2.4.).
  • GK-2 along with the antiamnestic effect, which manifested itself in 100% preservation of passive avoidance reaction, developed before photoinduced thrombosis of the prefrontal cortex, also has a significant neuroprotective effect - the calculated coefficient of protection efficiency was 61%.
  • the rats were anesthetized with chloral hydrate (400 mg / kg intramuscularly), then craniotomy was performed and brain tissue was destroyed in the area of the internal capsule, followed by (2–3 min) injection into the site of blood damage (0.02–0.03 ml) taken from under the tongue of an animal.
  • a local autohemorrhagic bilateral stroke in the area of the inner capsule was simulated without significant damage to the brain and neocortex structures located above.
  • JlO false-operated
  • Violations of the behavior and condition of animals after GI were evaluated by traditional methods. Neurological status by the method of assessing neurological deficit according to the McGroow stroke assessment scale, modified by I.V. Gannushkina; method of recording muscle tone and coordination of movements; cognitive functions according to the conditioned reflex of passive avoidance (passive avoidance reaction); tentative research behavior using the Open Field methodology. The effect of the drug on rat survival was evaluated.
  • GK-2 introduced at a dose of 1 mg / kg immediately after the operation, and then every 2 days for 14 days, completely prevented the death of animals, while in the control the total death of animals was 40% (Table 2.2.) .
  • the number of animals with impaired coordination in the group of animals treated with GK-2 was two times less than in the group with GI and was close to that in the group of falsely operated animals (Table 2.Z.).
  • the number of animals with weakened muscle tone in the group with GK-2 practically did not differ from the number of animals in the group of pseudo-operated ones and on average was half that in the group of animals with GI (Table 2.4.).
  • GI causes a mink reflex disorder in animals, which is absent in the group of animals treated with GK-2 (Table 2.5.). Learning the conditioned reflex of passive avoidance in the group of animals with HI was also impaired: 100% of the animals entered the dark chamber, not remembering about the electric shock.
  • rats treated with GK-2, on days 1–7, the number of animals entering the dark chamber did not differ from the group of falsely operated animals. The latent period of the first call of the treated animals was not statistically different from the false-operated ones. On the 3rd day, a statistically significant difference was observed between this indicator of treated animals and the group with GI (Table 2.6.).
  • GK-2 restores learning disabilities in GI.
  • GK-2 reduces the severity of neurological disorders to the level of falsely operated animals on days 1, 3, 7 in terms of slow motion, limb weakness, on day 3 in terms of a cut of 1-4 limbs (Table 2.7.).
  • GI caused increased anxiety in animals, which was statistically reliably removed by GK-2 starting from the first day over the entire observation time (Table 2.9.).
  • GK-2 has a distinct anti-stroke effect in rats with hemorrhagic stroke.
  • 2 may be useful for the treatment of both ischemic and hemorrhagic strokes. This may allow the treatment of stroke patients to begin before differential diagnosis at the most important first stages of the disease.
  • Bilateral ligation of the carotid arteries in rats was used to model permanent cerebral hypoxia associated with neuronal death and cognitive deficit (Weshiet SAL, Teppiswood M., Chep Jia-Nua, Davidsop S. M, Keues M. T., Fortyp T ., Rarras V.A. Schhopis silver hurorfusiop elisits peuropl arorthosis apd Behavioral imrairmept. / NeuGoReroert. 1998. v. 9, p. 161-166).
  • the experiments were conducted on outbred male rats weighing from 350 to 420 g.
  • the test compound was administered intraperitoneally at a dose of 1 mg / kg.
  • the animals received the first injection of the compound.
  • day 2 he underwent surgery for bilateral ligation of the carotid arteries.
  • day 3 the animals received a second injection of the compound.
  • day 7 the animals received a third injection of the compound.
  • day 8 the animals were tested in the Open Field installation (Jaxop HF, Broadhurst PL
  • Rats were distributed into three groups (n> 8 for each group) randomly: group 1 - false-operated: animals received anesthesia, then they underwent a false operation, and then, in accordance with the experimental design, they received 4 physical injections. solution; group 2 - operated: animals received anesthesia, then they underwent surgery for bilateral ligation of the carotid arteries, and then, in accordance with the experimental design, they received 4 physical injections. solution; group 3 - operated + compound: the animals received anesthesia, then they underwent surgery for bilateral ligation of the carotid arteries, and then, in accordance with the experimental design, they received 4 injections of the studied compound.
  • the animal’s brain was quickly removed and placed in ice-cold physiological saline (0.9% NaCl) for 2 minutes. Then the brain was removed from the saline and placed on ice covered with filter paper to highlight various areas.
  • the hippocampus, striatum, cortex were isolated and these sections were transferred to ice serum.
  • the serum volume was 4 ml, for the striatum - 2 ml. Then, the brain regions along with the serum were passed through a 40 ⁇ m nylon filter (Miliroe) until a homogeneous mass (suspension) was formed.
  • the resulting cell suspension was centrifuged at room temperature for 5 minutes in a Thermo Jouap centrifuge at 1500 rpm. Then the supernatant was discarded and the cells were resuspended in 10 ml of DMEM containing 10% FBS. After this, the cells were counted in the Goryaev’s cell. For analysis, 2 x 10 6 cells in 1 ml were taken. 100 ⁇ l of sample was added to each well of a 96-well plate and 10 ⁇ l of MTT was added. Samples were kept for 30 minutes in a thermostat at a temperature of + 37 ° C until a blue-violet color developed.
  • the operation also helps to reduce the vertical motor activity of animals in the Open Field test, and GK-2 restores this indicator to the level recorded in falsely operated animals.
  • GK-2 As seen in fig. 2.7. and 2.8., the operated animals receiving GK-2 did not differ from the false-operated ones, that is, GK-2 prevented the drop in the studied parameters caused by the operation. Thus, GK-2 improved episodic memory and the ability of animals to perceive novelty.
  • the figure shows that GK-2 injections increased the viability of cerebral cortex cells in the operated animals.
  • the obtained data indicate the presence of anti-ischemic properties in GK-2 and the possibility of using this compound in hypoxic conditions. 3. Antiparkinsonian activity of GK-2
  • Parkinson's disease which is based on the weakening of the functions of dopaminergic (DA) neurons of the brain (Hirsch EC, Nepero MT. Neuroshem olesporkelopersoperodioperidoperisoresism. v. 74, 119-126).
  • This disease develops not only spontaneously at a late age, but can also be triggered by the use of antipsychotics, in particular haloperidol (RJ Nardié,
  • the first one includes tests simulating the development of catalepsy and other extrapyramidal disorders caused by the introduction of dopaminergic substances.
  • Catalepsy is usually caused by the introduction of various antipsychotics, of which haloperidol is most often used (Sapbegg P.R. Naloreridol-i-drug cumers is rostsupartis doremperresters. / Natura. 1980. v. 474.
  • the second approach involves selective damage to DA neurons, which can be caused by the introduction of neurotoxins, in particular, MPTP (Spuder SH, D'Amato RJ.
  • MPTP and pereutohyporepolitooportoceporezesetesuetesuetesuetesuetsesetesuetsesets. / Neurology, 1986. v. 36 (2), p. 250-258) 3.1. Anti-catalepsy in rats caused by haloperidol
  • Haloperidol blocker (1.0 mg / kg, ip) was used to induce catalepsy.
  • the intensity of catalepsy was assessed by the time the animals posed. The measurement was performed 60 minutes after the administration of haloperidol.
  • the studied compound in selected doses (0.01; 0.1; 1.0 and 5.0 mg / kg) was administered intraperitoneally 24 hours before haloperidol. Control animals received an injection of distilled water. The data obtained were processed statistically using the exact Fisher test. The results are presented in table 2.10. Table 2.10. The effect of GK-2 on the intensity of catalepsy caused by the introduction of haloperidol.
  • GK-2 at doses of 0.01, 1.0 and 5.0 mg / kg reliably attenuates catalepsy caused by haloperidol. These data indicate the presence of dopamine-positive (antiparkinsonian) properties in the studied compound.
  • the studied compound in a fixed dose of 1.0 mg / kg was administered intraperitoneally to male C57B1 / 6 male mice weighing 22-25 g 24 hours before MPTP injection (30 mg / kg, ip). Animals were placed in an “open field” installation 60 minutes after the administration of MPTP. The horizontal and vertical locomotor activity of animals was evaluated over 2 minutes of observation. Passive control was made by animals that received an intraperitoneal injection of distilled water instead of MPTP. Active control consisted of animals that received an intraperitoneal injection of distilled water instead of GK-2, and then MPTP. Experienced animals received an injection of GK-2, and then MPTP. The data obtained were statistically processed using the Mann-Whitney U-test. The results are presented in table 2.11.
  • apomorphine induce stereotypical behavior in rodents (LaI S., Sourkes T.L. Optogepu stereotured buhavioug apdupd amphetampeh tehph. P. 171-182).
  • the potentiation of the effects of apomorphine indicates the ability of the test substance to have a stimulating effect on DA transmission (Khabriev R.U. Guide to the experimental (preclinical) study of new pharmacological substances Moscow, 2000, pp. 147-152).
  • the experiments were performed on outbred male rats weighing 250-300 g.
  • the studied compound at a fixed dose of 1.0 mg / kg was administered intraperitoneally 24 hours before apomorphine injection or together with apomorphine.
  • the control group was injected with distilled water in the same way.
  • Apomorphine at a dose of 1.0 mg / kg was dissolved in distilled water with the addition of 0.01% ascorbic acid and injected subcutaneously into the neck.
  • the animals were seated in observation chambers and 5 minutes later, registration began. Registration was carried out in accordance with the guidelines given in the manual (Khabriev R.U. Manual on the experimental (preclinical) study of new pharmacological substances Moscow, 2000, p. 149.).
  • AD Alzheimer's disease
  • the main models of AD in animals that reproduce behavioral and cholinergic deficits in the absence of a pathomorphological picture of the disease include the hippocampus deafferentation model (Kugel U., Bigl V., Eschrich K., Wigl M. Dafferpta ⁇ f th réelle metabolis ev Canalpts ip alzheimer dis facedase / ipt. J. devougessiepse. 2001. v.19, 263-277). Using this model, the effectiveness of GK2 was evaluated. Cholinergic deficiency was also modeled in the scopolamine amnesia model.
  • the first administration of the studied compound to the experimental group dose 1.0 mg / kg, ip) or to the control group with distilled water was made 2 hours after transection. Further injections were made every 48 hours. During the experiment, 7 injections of the test compound were given to each animal.
  • mice of the Balb / line weighing 20-22 g were used. On the first day, animals were placed in a narrow container with water, temperature 22 0 C, for 10 minutes. After 60 minutes, the test compound was administered intraperitoneally to the animals (HCB-106 at a dose of 1 mg / kg, GBK-108 and GBK-201 at doses of 0.01; 0.1; 1.0; 10.0 mg / kg). After 24 hours, the animals were re-placed under the same conditions and during the 5-minute test period the time of preservation of the characteristic immobility posture of the animals (refusal of active defensive and research behavior) was recorded. Imipramine was administered 60 minutes before the 5 minute test period (on the second day). Control groups received distilled water. In each experimental group there were at least 6 animals. Mann-Whitney U-test and Fisher's exact test were used to identify differences between the experimental groups. Data are presented as median samples +/- interquartile intervals.
  • Figure 2.13 shows that imipramine and GSB-106 exhibit antidepressant properties, reducing the duration of immobility in the test.
  • GBK 201 at doses of 0.01 and 0.1, ip
  • GBK 108 at a dose of 10 mg / kg, ip
  • the increase in immobility time in the test “Earned helplessness)) according to Porsolt is characteristic of substances with antipsychotic activity.
  • BDNF dimeric mimetics with neuroprotective activity exhibit antidepressant activity in the Porsolt test.
  • Monomeric mimetics that reduce the viability of neurons have pro -pressant activity.

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Neurology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Psychiatry (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Psychology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

Изобретение относится к соединениям, обладающим агонистической или антагонистической активностью нейротрофинов NGF и BDNF и представляющим собой мономерные или димерные замещенные дипептиды, которые являются аналогами экспонированных наружу участков петель 1 или 4 этих нейротрофинов, близких к бета-изгибам этих петель или совпадающих с ними. N-ацильные заместители этих дипептидов представляют собой биоизостеры аминокислотных остатков, предшествующих этой дипептидной последовательности в первичной структуре нейротрофина. Димерная структура образована преимущественно с помощью гексаметилендиамина, к которому дипептиды присоединяются своими карбоксильными группами. Заявляемые соединения обладают нейропротективной и дифференцирующей активностями на клеточных моделях, увеличивают концентрацию фосфорилированной формы тирозинкиназы А и белков теплового шока Hsp32 и Hsp70 в концентрациях 10"5 - 10~9 M. Они также обладают нейропротективной, антипаркинсонической, противоинсультной, антиишемической, антидепрессивной, антиамнестической активностями на животных моделях и проявляют активность на экспериментальных моделях болезни Альцгеймера. Эффекты in vivo заявляемые соединения проявляют в интервале доз 0,01-10 мг/кг при внутрибрюшинном введении.

Description

ДИПЕПТИДНЫЕ МИМЕТИКИ НЕЙРОТРОФИНОВ NGF И BDNF
Область изобретения
Изобретение относится к биоорганической химии, а именно к новым замещенным дипептидам, миметикам нейротрофических факторов, которые могут быть полезны как фармацевтические агенты для регуляции роста, дифференцировки, выживания и запрограммированной гибели нейронов. Более определенно, это изобретение относится к мономерным и димерным дипептидным миметикам петлеобразных участков NGF и BDNF, которые могут быть полезными для лечения нейродегенеративных заболеваний, включая болезни Паркинсона и Альцгеймера, хорею Гентингтона, инсульты, ишемию мозга, черепно-мозговые травмы, депрессию и другие.
Уровень техники
Фактор роста нервов (NGF) и нейротрофический фактор мозгового происхождения (BDNF) являются членами семейства нейротрофинов, которые улучшают выживаемость нейронов и предотвращают нейродегенерацию, происходящую в результате болезни или травмы. К NGF чувствительны сенсорные, симпатические и холинергические нейроны. Терапия с помощью NGF, как полагают, способна предупредить развитие болезни Альцгеймера, предотвратить потерю функций мозга при инсульте и облегчить жизнь больного при периферической диабетической нейропатии. Кроме того, NGF, как предполагается, может применяться для лечения нейрональных повреждений и быть объектом воздействия при нейроэктодермальных опухолях. Обзор по применению NGF в терапии см. (Sаrаgоvi Н.U. апd Вurgеss К. Ехреrt Орiпiоп iп Тhеrареutiс Раtепts, 1999, 9:737-751; Sсhultе- Herbruggen O. еt аl. Сшт.Меd. Сhеm., 2007, 14(22):2318-2329).
BDNF в ЦНС действует как мощный трофический фактор для головных и спинальных мотонейронов, которые дегенерируют при амилотрофическом латеральном склерозе (Тhоепеп H. еt аl, С R Асаd Sсi III. 1993,316(9): 1 158-63), и для дофаминэргических нейронов черной субстанции (substапtiа пigrа), которые теряются при болезни Паркинсона (Sрiпа М.В. еt аl. J Nеurосhеm. 1992 Jul;59( 1 ):99- 106). На периферии BDNF обладает нейротрофным действием в отношении малых волоконных нейронов, вовлеченных в ряд типов сенсорной нейропатии (Liпdsау R.М. Nеurоbiоl Аgiпg. 1994 Mar-Apг;15(2):249-51). Биологические эффекты NGF, BDNF и других нейротрофинов опосредованы связыванием с двумя классами клеточных рецепторов: высокоаффинными (Kd 10"11) рецепторами тирозинкиназного семейства и низкоаффинным (Kd 10~9) рецептором p75. Рецептор p75 представляет собой гликопротеин с молекулярной массой 75 килодальтон. Он не обладает внутренней каталитической активностью, но ассоциирован с ERK - семейством растворимых киназ (Vоlопtе С. еt аl. MoI Вiоl CeIl. 1993 Jan;4(l):71-8 ) и играет роль в защите нейронов от апоптоза. С этим рецептором связываются все нейротрофины.
Специфичность действия отдельных нейротрофинов определяется связыванием с определенным типом тирозинкиназных (Тrk) рецепторов pl40"* - так, NGF и NT-3 связываются с ТrkА, BDNF и NT-4/5 связываются с ТrkВ. За связыванием следует димеризация рецептора, которая приводит к автофосфорилированию внутриклеточных остатков тирозина рецептора внутренними киназными доменами. Это, в свою очередь, инициирует каскад ферментативных реакций, в результате которых и реализуются биологические эффекты нейротрофинов, в том числе увеличивается выживаемость нейронов (Ваrbасid M. J Nеurоbiоl. 1994 Nov;25(l l):1386-403).
Нейротрофины представляют собой гомодимеры, которые состоят из двух идентичных субъединиц, приблизительно по 120 аминокислотных остатков, связанных гидрофобными взаимодействиями. Рентгеноструктурные исследования, проведенные для гомодимера NGF (МсDопаld N.Q. еt аl. J MoI Вiоl. 1991 Juп 20;219(4):595-601) и для гетеродимера BDNF/NT-3 (Rоbiпsоп R.С. еt аl. Вiосhеmistrу. 1995 Арr 4;34(13):4139-46) выявили единую трехмерную структуру нейротрофинов. Все они содержат экспонированные в воду структурные элементы, получившие название петель 1 , 2, 3 и 4 и представляющих собой шпилькообразные структуры, три из которых имеют бета-поворотные участки на концах (так называемые участки A- A", A'"-B и C-D, петли 1,2,4) и один участок, состоящий из трех последовательных реверсных поворотов (названный участком B-C, петля 3). Считается, что именно шпилькообразные структуры ответственны за специфическое связывание с определенным типом нейротрофиновых рецепторов.
Сайт-направленным мутагенезом (путем пересадки 2-й петли из BDNF в NGF) было показано, что 2-я петля определяет специфическое связывание BDNF с ТrkВ рецептором. Такой химерный нейротрофин связывался не с ТrkА, а с ТrkВ, и давал ВDNF-подобную активность (Ibапеz CF. еt аl. EMBO J. 1993 12(6):2281-93). Кроме того, дополнительные остатки петель 3 (Gln84) и 4 (Lys96 и Аrg 97) важны для активации ТrkВ, но, как считают, не участвуют в связывании. Все эти остатки расположены на поверхности молекулы.
В отношении NGF было показано, что за специфическое связывание с ТrkА отвечает участок с 29-го по 35-й аминокислотный остаток, соответствующий петле 2. Синтетические пептиды, соответствующие последовательности 29-35 NGF оказались антагонистами NGF. За связывание с p75-м рецептором отвечает петля 1 (МсDопаld апd Сhао. Struсtuгаl determinants of neurotrophin асtiоп. JBC 270, 19669-19672, 1995; Lопgо еt аl. Synthetic NGF рерtidе ргеvепt пеurопаl dеаth viа p75 гесерtоr-dерепdепt mесhапism. J.Nеurоsсi.Rеs., 1997).
Способность нейротрофинов защищать нейроны на экспериментальных моделях нейродегенеративных заболеваний породила оптимизм о возможности их терапевтического применения. Однако в действительности нейротрофины оказались неудачными лекарствами, поскольку, как белки, они орально недоступны, не способны преодолевать гематоэнцефалический и другие биологические барьеры и быстро деградируют в крови. Кроме того, нейротрофины обладают плейотропным действием и могут вызывать канцерогенез. Взаимодействие нейротрофинов с p75-м рецептором вызывает гибель нейронов за счет апоптоза. Существенным недостатком нейротрофинов является развитие болевого синдрома при их использовании. Это связано с участием нейротрофинов в эндогенной регуляции боли. Клиническое применение нейротрофических факторов оказалось безуспешным (Репп R.D. еt аl. Nеurоsurgегу. 1997, 40(l):94-9; disсussiоп 99-100 1997). Это привело к попыткам создания низкомолекулярных аналогов нейротрофинов, стабильных в крови и способных преодолевать гастроинтестинальный и гематоэнцефалический барьер. Предполагалось, что низкомолекулярные аналоги нейротрофинов могли бы реализовывать только часть биологических эффектов благодаря тому, что они будут селективно взаимодействовать только с некоторыми участками связывания части нейротрофиновых рецепторов и, таким образом, будут активировать только нужные звенья сигнальных каскадов. Имеется несколько патентов на низкомолекулярные пептидные аналоги нейротрофинов. Линейные пептиды с последовательностью, соответствующей последовательности шпилькообразных структур проявляли антагонистическую активность (Lопgо F. M. еt аl. CeIl Rеgul. 1990 Jап; 1(2): 189-95). Пептидные агонисты нейротрофинов были получены среди циклопептидов, способных сохранять конформацию, близкую к поворотной конформации нейротрофиновых петель. При этом необходимым условием для получения агонистической активности было создание бивалентных аналогов, имитирующих гомодимерную структуру нейротрофинов. Так, Лонго и др. (F.М.Lопgо еt аl., 1999, US Раtепt 5,958,875) запатентовал циклические мономерные и димерные пептиды, соответствующие последовательностям 43-47 и 92-97 NGF (2-я и 4-я петли). Циклы образованы с помощью дисульфидных связей по остаткам цистеина или пеницилламина, которые дополнительно вводились в состав указанных пептидов. Бициклические аналоги демонстрировали агонистическую активность в тестах iп vitrо.
Аналогичные соединения запатентованы Сарагови и др. (Н.U. Sаrаgоvi еt аl., 2002, US Раtепt 6,017,878). Циклические пептидные аналоги образованы с помощью дисульфидной или иной (ионной, металл-хелатной и др.) связи между линейными пептидами, полностью или частично соответствующими последовательностям 28-36 петли 1 NGF, 42-49 петли 2 NGF, 59-67 и 91-99 петель 3 и 4 NGF. Минимальная молекулярная масса циклического пептида с агонистической активностью составила 1500 дальтон, пептид состоял из 16 аминокислот. Пептиды активны iп vitrо.
Ричард Хьюз (R.А. Нughеs еt аl., 2000, PCT WO 00/75176 Al) подал заявку на моно- би- и трициклические пептидные аналоги 2-й и 4-й петель BDNF с агонистической и антагонистической активностью. Для циклизации использованы дисульфидные мостики, связь между циклами осуществляется как через дисульфидные мостики, так и через боковые карбокисльные и аминогруппы аминокислот. Длина спейсера влияла на активность- максимальной активностью обладали бивалентные аналоги с расстоянием между циклопептидными фрагментами, равным таковому у BDNF. Агонистической активностью обладали и мономерные циклические пептиды- аналоги участка связывания p75-гo рецептора 4-й петли BDNF.
Таким образом, во всех случаях связывание с нейротрофиновым рецептором обеспечивалось наличием протяженного участка, обычно соответствующего пентапептиду (за исключением трипептидного участка 4-й петли BDNF, взаимодействующего с p75 рецептором), причем для образования активной поворотной конформации этот участок было необходимо зациклизовать. При наличии связывания с Тrk рецепторами агонистическая активность достигалась путем объединения двух таких циклов в бивалентную структуру.
Однако соединения, описанные в приведенных выше ссылках, не открывают и не предполагают новых структурных вариаций патентуемых соединений.
Сущность изобретения
Нашей целью явилось получение низкомолекулярных аналогов нейротрофинов NGF и BDNF с агонистической и антагонистической активностью. Эта цель была достигнута путем использования минимальных, дипептидных, последовательностей нейротрофинов в качестве лигандов нейротрофиновых рецепторов. Мы исходили из предположения, что основное взаимодействие между нейротрофиновыми петлями и тирозинкиназным рецептором осуществляется на сверхмалом участке, наиболее выступающим наружу и совпадающим с центральным участком бета-изгиба петлеобразного участка или, по крайней мере, расположенном в непосредственной близости от него. Это соответствует N-ацилзамещенному дипептидному лиганду, который способен относительно долго находиться в необходимой конформации без ковалентной циклизации. В случае миметиков 4-й петли NGF и BDNF такие дипептиды обладали антагонистической активностью, так как связывались с Тrk- рецептором, но были неспособны его димеризовать. Для получения бивалентной структуры с агонистической активностью два дипептида могли быть объединены обычным линкером из метиленовых групп в середине и активных групп по концам, длина которого может быть выбрана любой. В случае миметиков 1-й петли агонистическую активность проявляли и мономерные дипептиды, возможно, благодаря непрямому действию через p75-й рецептор. Для блокирования заряженных групп на концах дипептида было необходимо ввести заместитель. Оказалось удобным выбрать такие заместители, чтобы они имитировали предшествующий и последующий аминокислотные остатки. Всё это дало возможность получить аналоги нейротрофинов, обладающие как агонистической, так и антагонистической активностью, с минимальной молекулярной массой - менее 1000 дальтон. В результате мы нашли, что наша цель может быть достигнута соединениями общей формулы I:
(R-CH2-CO-A-B-NH-R')n, (I) где А и В- аминокислотные остатки дипептидной последовательности AB; R= боковой радикал аминокислотного остатка, предшествующего дипептидному фрагменту AB в последовательности нейротрофина, H или бивалентный радикал -R - , в частности, -(CH2)m-; R'= боковой радикал аминокислотного остатка, следующего за дипептидным фрагментом AB в последовательности нейротрофина, H или бивалентный радикал - R'-, в частности, -(CH2)m- .
При наличии бивалентного радикала -R'- или -R- n=2 и соединения представляют собой димеры, в которых мономерные дипептиды связаны С-концевым спейсером -R-R- или N-концевым спейсером — R'-R'-. В остальных случаях n=l и соединения представляют собой мономерные замещенные дипептиды.
Примерами осуществления изобретения могут служить следующие соединения:
Аналоги 4-й петли NGF:
Формула шифр
1. HOOC(CH2)2C(O)-Glu-Lys-NH2 ГK-1
2. HOOC(CH2)2C(O)-Glu-Lys-NH ГK-2
(CH2)6 HOOC(CH2)2C(O)-Glu-Lys-NH
3. HOOC(CH2)2C(O)-Glu-Lys-NH ГK-26
(CH2)5 HOOC(CH2)2C(O)-Glu-Lys-NH
4. HOOC(CH2)2C(O)-Glu-Lys-NH ГK-2в
(CH2)4 HOOC(CH2)2C(O)-Glu-Lys-NH
5. HOOC(CH2)2C(O)-Glu-Lys-NH ГK-2г
(CH2)3 HOOC(CH2)2C(O)-Glu-Lys-NH
6. HOOC(CH2)2C(O)-Glu-Lys-NH ГK-2д
(CH2)2
7. HOOC(CH2)2C(O)-Glu-Lys-NH
8. HOOC(CH2)2C(O)-Glu-Lys-NH ГK-2a
Figure imgf000008_0001
NH (Ctн2)3 NH
C(O) (CH2)5 HOOC(CH2)2C(O)-Glu-Lys-NH
8а. HOOC(CH2)2C(O)-Gly-Lys-NH ГK-2ч
(CH2)6 HOOC(CH2)2C(O)-Gly-Lys-NH
Аналоги 1-й петли NGF
9. CH3C(O)-LyS-GIu-NH2 ГK-3
10. CH3C(O)-LyS-GIu-NH
Figure imgf000009_0001
1 1. NH2-(CH2)5-C(O)-Gly-Lys-NH2 ГK-5
12. NH2-(CH2)5-C(O)-Gly-Lys-ψH ГK-6
(CH2)6 NH2-(CH2)5-C(O)-Gly-Lys-NH2
13. CH3C(O)-Gly-Lys-NH-(CH2)3-COOH ГK-7
14. C(O)-Gly-Lys-NH-(CH2)3-COOH ГK-8 (CH2)4 C(O)-Gly-Lys-NH-(CH2)3-COOH
Аналоги 4-й петли BDNF
15. HOOC(CH2)2C(O)-Ser-Lys-NH2 ГСБ- 104
16. HOOC(CH2)2C(O)-Seг-Lys-NH
Figure imgf000009_0002
HOOC(CH2)2C(O)-Seг-Lys-NH ГСБ- 106
17. HO-(CH2)2-CO-Lys-Lys-NH ГСБ- 120
(CH2)6 HO-(CH2)2-CO-Lys-Lys-NH
18. CH3C(O)- Asp-Ser-NH2 ГБK-108
Аналоги 1-й петли BDNF
19. HOOC(CH2)2C(O)-Met-Ser-NH2 ГCБ-207
20. HOOC(CH2)2C(O)-Met-Ser-NH ГCБ-214
(CH2)7 HOOC(CH2)2C(O)-Met-Ser-NH
21. CH3C(O)- Asp-Met-NH2 ГБK-201
Изучение биологических свойств заявляемых соединений показало, что, в зависимости от структуры они проявляют нейропротективную или нейродегенеративную активность, а, в зависимости от того, миметиком какой петли они являются, преимущественно нейротрофную или дифференцирующую активность.
Соединения с нейропротективной активностью увеличивают фосфорилирование тирозинкиназы и содержание белков теплового шока Hsp32 и/или Hsp70.
Изучение фармакологических свойств наиболее активного из заявляемых соединений, миметика 4-й петли ГK-2 показало, что он обладает антипаркинсонической, антиишемической, антиамнестической, нейропротекторной, противоинсультной активностями и эффективен на экспериментальной модели болезни Альцгеймера. Изучение миметиков BDNF в классическом тесте на антидепрессантную активность (тест Порсолта) показало, что димерные миметики как 1-й, так и 4-й петель BDNF обладают антидепрессивной активостью, тогда как мономерные - продепрессивной активностью.
Краткое описание рисунков
Pиc.1.1. Влияние разных молярных концентраций пептида ГK-2в на жизнеспособность клеток HT22.
* - р < 0,05 относительно контроля по t-критерию Стьюдента.
Рис. 1. 2. Нейропротекторный эффект пептида ГK-6 в условиях оксидативного стресса. МТТ-тест. Внесение ГK-6 за 24 часа до H2O2.
* p<0,05 относительно контроля, Л p<0,05 относительно H2O2 по t-критерию Стьюдента.
Рис.1.3. Нейро протекторный эффект пептида ГK-26 в условиях окси дативного стресса.
* p<0,05 относительно контроля, A p<0,05 относительно H2O2 по t-критерию Стьюдента.
Рис.1.4. Нейропротекторный эффект пептида ГK-2г в условиях оксидативного стресса.
*-p<0,05 относительно контроля, Л p<0,05 относительно H2O2 по t-критерию Стьюдента.
Рис.1.5. Нейропротекторный эффект пептида ГK-2д в условиях оксидативного стресса.
* p<0,05 относительно контроля, Л p<0,05 относительно H2O2
Pиc.1.6. Влияние пептида ГCБ-104 на выживаемость клеток HT-22 в условиях оксидативного стресса, внесенного за 24 часа до перекиси водорода.. МТТ-тест.
* p<0,05 относительно контроля, Л p<0,05 относительно H2O2 по t-критерию Стьюдента.
Pиc.1.7. Влияние пептида ГCБ-106 на выживаемость клеток HT-22 в условиях оксидативного стресса.
* p<0,05 относительно контроля, A p<0,05 относительно H2O2 по t-критерию Стьюдента.
Рис.1.8. Влияние пептида ГБK-108 на выживаемость клеток HT22 в условиях окислительного стресса при внесении за 24 часа до перекиси водорода.
*p<0,05 относительно контроля, Лp<0,05 относительно H2O2 по t-критерию Стьюдента.
Рис.1.9. Влияние 10~5 M и 10"8M ГK-2 на жизнеспособность клеток линии PC 12 при одновременном введении с MPTP.
Достоверность отличий от контроля: * - р < 0,05. Достоверность отличий от MPTP: Л - р < 0,05 по t-критерию Стьюдента.
Pиc.1.10. Влияние 10"5 M и 10"8M ГK-2 на жизнеспособность клеток линии PC- 12 при внесении за 24 часа до MPTP.
Достоверность отличий от контроля: * - р < 0,05. Достоверность отличий от MPTP: Л - р < 0,05 по t-критерию Стьюдента. Pиc.1.11. Влияние ГK-2a, ГK-3, ГK-4, ГK-5 на жизнеспособность клеток линии PC- 12 при моделировании болезни Паркинсона при внесении за 24 часа до MPTP. Достоверность отличий от контроля: * - р < 0,05. Достоверность отличий от M PTP: Л - р < 0,05 по t-критерию Стьюдента.
Pиc.1.12. Нейропротекторный эффект пептида ГCБ-106 в условиях глутаматной нейротоксичности.
Достоверность отличий от контроля: * - p< 0,05. Достоверность отличий от глутамата: Λ - p< 0,05 по t-критерию Стьюдента.
Pиc.1.13. Влияние различных концентраций пептидов ГK-1 и ГK-2 на накопление Hsp70 в культуре гиппокампальных нейронов линии HT-22.
1 - тепловой шок (42° С, 1 час) 2 - NGF ( 100 нг/мл) 3 - контроль
4 - TK-I( IO-5 M) 5 - TK-I (IO-8 M) 6 - ГK-2 (10'5 M)
7 - ГK-2 (10"8 M) 8 - TK-I + ГK-2 (10 5 M)
Pиc.1.14. Влияние различных концентраций пептидов TK- 1 и ГK-2 на накопление Hsp32 в культуре гиппокампальных нейронов линии HT-22.
1 - тепловой шок (42° С, 1 час) 2 - NGF (ЮОнг/мл) 3 - контроль
4 - TK-I (IO-5 M) 5 - TK-I (IO-8 M) 6 - ГK-2 (10'5 M)
7 - ГK-2 ( 10 8 M) 8- TK- 1 + ГK-2 ( 10"5 M)
Рис. 1.15. Влияние пептидов ГK-3, ГK-4, ГK-5 на накопление Hsp70 в культуре гиппокампальных нейронов линии HT-22.
1,2 - контроль 3,4 - NGF (100 нг/мл) 5,6 - ГK-5 (10"6 M)
7 - ГK-3 (106 M) 8 - ГK-4 (10"7 M) 9 - тепловой шок (42° С, 1 час)
Рис. 1.16. Влияние пептидов ГK-3, ГK-4, ГK-5 на накопление Hsp32 в культуре гиппокампальных нейронов линии HT-22. 1,2 - контроль 3,4 - NGF (100 нг/мл) 5,6 - ГK-5 (10'6 M)
7 - ГK-3 (10~6 M) 8 - ГK-4 (10 7 M) 9 - тепловой шок (42° С, 1 час)
Рис. 1.17. Влияние ГK-2 и ГK-3 на фосфорилирование тирозинкиназы А в культуре гиппокампальных нейронов HT-22. 1 минута экспозиции. Результаты денситометрии оригинального Вестрн-блота.
Pиc.1.18. Влияние ГK-4 и ГK-5 на фосфорилирование тирозинкиназы А в культуре гиппокампальных нейронов HT-22. 1 минута экспозиции. Результаты денситометрии оригинального Вестерн-блота. Рис.1.19. Влияние ГK-1 (10~5 M) на фосфорилирование тирозинкиназы А в культуре гиппокампальных нейронов HT-22. 1 минута экспозиции. Результаты денситометрии оригинального Вестерн-блота. *p<0,05 относительно контроля по t- критерию Стьюдента.
Рис. 1.20. Влияние ГK-2 и NGF на фосфорилирование тирозинкиназы А в культуре гиппокампальных нейронов HT-22. 2 минуты экспозиции. Результаты денситометрии оригинального Вестерн-блота.
Pиc.2.1. Влияние ГK-2 (1 мг/кг в/б) на объем очага повреждения мозга крыс.
Рис. 2.2. Уменьшение неврологического дефицита у ишемизированных крыс, леченых ГK-2 (1 мг/кг в/б). (А) — 4 дня после ишемии, (Б) — 7 дней после ишемии, тест «limb».
Pиc.2.3. Снижение неврологического дефицита у крыс, которым после ишемии вводили ГK-2 (1 мг/кг в/б). Тест «цилиндp».
* p<0,05 относительно контроля по U-критерию Манна-Уитни.
Pиc.2.4. Защитный эффект ГK-2 (1 мг/кг в/б) при фототромбозе префронтальной коры головного мозга крысы. *- p<0,05 в сравнении с NaCl.
Pиc.2.5. Влияние ГK-2 (1 мг/кг в/б) на горизонтальную двигательную активность оперированных крыс в тесте «Oткpытoe пoлe».
* достоверно по отношению к ложнооперированным (U-критерий Манна-Уитни,
P=O-Ol);
* достоверно по отношению к оперированным (U-критерий Манна-Уитни, p=0.05).
Pиc.2.6. Влияние ГK-2 (1 мг/кг в/б) на вертикальную двигательную активность оперированных крыс в тесте «Oткpытoe пoлe».
* достоверно по отношению к ложнооперированным (U-критерий Манна-Уитни, P=0,03);
* достоверно по отношению к оперированным (U-критерий Манна-Уитни, p=0,04).
Pиc.2.7. Влияние ГK-2 (1 мг/кг в/б) на время обнюхивания объектов оперированными крысами в тесте «Иccлeдoвaниe oбъeктoв».
* достоверно по отношению к ложнооперированным (U-критерий Манна-Уитни, p=0.048).
Pиc.2.8. Влияние ГK-2 (1 мг/кг в/б) на динамику обнюхивания объектов крысами в тесте «Иccлeдoвaниe объектов)).
* достоверно по отношению к ложнооперированным (Точный критерий Фишера, p=0.02);
Pиc.2.9. Влияние ГK-2 (1 мг/кг в/б) на выживаемость клеток коры головного мозга крыс после двусторонней перевязки сонных артерий (МТТ-тест).
* достоверно по отношению к ложнооперированным (U-критерий Манна-Уитни, p=0.02);
* достоверно по отношению к оперированным (U-критерий Манна-Уитни, p=0.04).
Pиc.2.10. Влияние ГK-2 (1 мг/кг в/б) на интенсивность стереотипии у крыс, вызванной введением апоморфина.
* достоверно по отношению к группе «aпoмopфин» (p=0.02).
Рис. 2.11. Вляние ГK-2 на спонтанное чередование рукавов в Т-лабиринте крысами, получившими скополамин.
* - отличия достоверны по отношению к контрольной группе (p=0,0015);
# - отличия достоверны по отношению к группе активного контроля (p=0,02).
Рис. 2.12. Влияние ГCБ-106 (1 мг/кг, в/б, за 24 часа до второй посадки) на выученную беспомощность у мышей.
* p<0,05 относительно контроля по U критерию Манна-Уитни.
Рис. 2.13. Влияние различных доз ГБK-108 и ГБK-201 (за 24 часа до второй посадки) на выученную беспомощность у мышей * p<0.05 относительно контроля по U критерию Манна-Уитни.
Описание изобретения
Приведенные выше соединения формулы I были получены хорошо известными способами синтеза пептидов. Обычный процесс получения рассматриваемых соединений состоит в смешивании и конденсации требуемых аминокислот, как правило, в гомогенной фазе.
Конденсация в гомогенной фазе может быть выполнена следующим образом: а) конденсация аминокислоты, имеющей свободную карбоксильную группу и защищенную другую реакционноспособную группу, с аминокислотой, которая имеет свободную аминогруппу и защищенные другие реакционноспособные группы, в присутствии конденсирующего агента; б) конденсация аминокислоты, имеющей активированную карбоксильную группу и защищенную другую реакционноспособную группу, с аминокислотой, которая имеет свободную аминогруппу и защищенные другие реакционноспособные группы; в) конденсация аминокислоты, имеющей свободную карбоксильную группу и защищенную другую реакционноспособную группу, с аминокислотой, имеющей активированную аминогруппу и защищенные другие реакционноспособные группы.
Карбоксильная группа может быть активирована превращением ее в хлорангидридную, азидную, ангидридную группу или активированный эфир, такой как N-оксисукцинимидный, N-оксибензтриазольный, пентахлорфениловый или паранитрофениловый эфир. Аминогруппа может быть активирована превращением ее в фосфитамид или "фосфоразным" методом.
Наиболее общими для рассмотренных выше реакций конденсации являются: карбодиимидный метод; азидный метод; метод смешанных ангидридов; метод активированных эфиров. Эти методы описаны в "Тhе Рерtidеs". VoI.1. 1965 (Асаdеmiс
Рrеss), Е.Sсhrоеdеr, К.Lubkе, или в "Тhе Рерtidеs", VoI.1. 1979 (Асаdеmiс Ргеss) Е.Grоss, J.Меiепhоfеr.
Предпочтительным методом конденсации при получении пептидов формулы I является метод активированных эфиров, который проводят преимущественно с применением сукцинимидных, пентафторфениловых или п-нитрофениловых эфиров защищенных по аминогруппе аминокислот. Лучшим растворителем является диметилформамид.
Использовался также метод смешанных ангидридов в условиях Андерсона (G.W.Апdеrsоп еt аl. J.Аm.Сhеm.Sос, 89, 5012-5017 (1967)).
Реакционноспособные группы, которые не должны участвовать в конденсации, могут быть защищены группами, которые легко удаляются, например, гидролизом или восстановлением. Так, карбоксильная группа может быть защищена этерификацией этанолом, метанолом, трет-бутанолом, бензиловым спиртом.
Аминогруппу обычно эффективно защищают кислотными группами, например остатками алифатических, ароматических, гетероциклических карбоновых кислот, такими как ацетил, бензоил, пиридинкарбоксил, кислотными группами, производными от угольной кислоты, такими как этоксикарбонил, бензилоксикарбонил, третбутилоксикарбонил; или кислотными группами, производными от сульфокислоты, такой как пара-толуолсульфониловая.
При синтезе заявляемых дипептидов использовали коммерчески доступные защищенные аминокислоты преимущественно в виде карбобензокси-производных и трет-бутилокискарбонильных производных по аминогруппам. Карбоксильные группы были защищены бензиловыми и трет-бутильными эфирами. Оксигруппа серина была защищена бензильным эфиром.
N-ацильные производные получали, используя соответствующие ангидриды, преимущественно янтарный или уксусный ангидрид.
Амиды пептидов формулы I получают аммонолизом (т.е. реакцией с NH3) алкилэфира соответствующего дипептида или реакцией с аминокислотой в виде желательного амида. Амиды дипептидов также могут быть получены введением амидной группы в соответствующий дипептид каким-либо подходящим способом, например обработкой амином в присутствии конденсирующего агента.
В качестве спейсера использовали диамины, преимущественно гексаметилендиамин, которые вводили в реакцию с карбоксикомпонентой в условиях пептидного синтеза, описанных выше.
Защитные группы снимали в соответствии с природой этих групп: карбобензоксигруппу и бензильную группу снимали гидрогенолизом пропусканием водорода в метаноле над 10%-нoм палладии на угле, трет-бутилоксикарбонильную группу и трет-бутильную группу снимали в кислой среде HCl в диоксане или безводной трифторуксусной кислотой.
Примеры
В дальнейшем используются следующие сокращения:
Ad - адипинил
Аsр - аспартил
Вое - /ире/w-бутилоксикарбонил
BzI - бензил
GIu - глутамил
GIy - глицил
Lуs - лизил
Меt - метионил
Np - нитрофенил
OSu - оксисукцинил
Рfр - пентафторфенил
PyBOP - гексафторфосфат бeнзoтpиaзoлилoкcитpиc(пиppoлидинo)фocфoния
Sеr - серил
SP - сульфопропил t-Вu - трет-буτип TFA - трифторуксусная кислота
Ts - и-толуолсульфат
Z - карбобензокси
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография
ДИЭА - диизопропилэтиламин
ДМПДА - диметилпропилдиамин
ДМСО - диметилсульфоксид
ДМФА - диметилформамид
ДЦГК - дициклогексилкарбодиимид
ДЭАЭ - диэтиламиноэтил
ДЭТМДА - NД-диэтилтриметилендиамин
ИДЭА - изопропилдиэтиламин нас. - насыщеный
ПМР - протонный магнитный резонанс
ТГФ - тетрагидрофуран
TCX - тонкослойная хроматография
ТЭА - триэтиламин
В примерах температуру плавления определяли в открытых капиллярах и не корректировали; удельное оптическое вращение регистрировали на автоматическом поляриметре Peгkin-Elmer-241 ; спектры протонного магнитного резонанса (ПМР) были получены на спектрометре Вrukеr AC-250, химические сдвиги выражали в м.д. относительно тетраметилсилана, для обозначения резонансных сигналов использовали следующие сокращения: с - синглет, д - дублет, дд - дублет дублетов, т - триплет, кв - квардуплет, м - мультиплет; тонкослойную хроматографию проводили на пластинах Кiеsеlgеl 60 (Меrсk, Германия), проявляли нингидрином, в парах йода или в ультрафиолетовых лучах;
TCX проводили в следующих системах растворителей: хлороформ-метанол- уксусная кислота-вода, 15:10:2:3 (А); н-бутанол-пиридин-уксусная кислота-вода, 15:10:3:6 (Б); хлороформ-метанол, 9:1 (В); хлороформ-этанол, 9: 1 (Г); н-бутанол- уксусная кислота-вода 4:1 :1 (Д); гексан-этилацетат, 2:1 (E); гексан-этилацетат, 4:1 (Ж); этилацетат (3); диоксан-вода, 10: 1 (И); хлороформ-метанол-вода, 80:10: 1 (К); пиридин-вода-уксусная кислота-этилацетат, 20: 11 :6: 120 (Jl); хлороформ-метанол- вода-уксусная кислота, 60:45:6.4: 13.6 (M).
Значения Rf соответственно обозначены: Rf (X) - значение Rf в системе X (А, Б, В и т.д.).
Данные элементного анализа соединений относительно процентного содержания С, H и N отклоняются от теоретических данных не более чем на 0,4%.
Пример 1
Синтез амида УV-моносукцинил-глутамил-лшина, HOOC-(CH2)г-CO-Glu-Lys-NH2
(ГK-1) а) Получение амида N-бeнзилoкcикapбoнил-γ-тpeт-бyтил-глyтaмил-Nε-тpeт- бутилоксикарбонил-лизина, Z-Glu(OBu')-Lys(Boc)-NH2
Раствор 4.0 г (8.4 ммоль) N-оксисукцинимидного эфира N- бензилоксикарбонил-Λ^-wреm-бутилоксикарбонил-лизина (Z-Lys(Boc)-OSu) в 20 мл ДМФА обрабатывали 2 мл конц. аммиака, через 5 мин разбавляли водой, выпавший осадок амида N-бензилоксикарбонил-Λ^-wреm-бутилоксикарбонил-лизина (Z- Lys(Boc)-NH2) отфильтровывали. Затем полученный продукт растворяли в метаноле, добавляли 3.0 г 10% Рd/С и гидрировали при комнатной температуре. Катализатор отфильтровывали, растворитель удаляли в вакууме, остаток растворяли в 20 мл ДМФА. К раствору добавляли 3.9 г (9.0 ммоль) iV-оксисукцинимидного эфира N- бензилоксикарбонил-у-отреm-бутил-глутаминовой кислоты (Z-Glu(OBu')-OSu). Реакционную смесь перемешивали 6 ч при комнатной температуре (TCX контроль), после чего добавляли 2 мл ДМПДА и выдерживали 30 мин. Реакционную смесь разбавляли 200 мл этилацетата, поочерёдно промывали 100 мл воды, 100 мл 2 % H2SO4 и 100 мл 3 % Na2CO3, после чего упаривали. Остаток перекристаллизовывали из 80 мл метанола и 30 мл воды. Далее использовали не высушивая.
б) Получение амида N-мoнocyкцинил-γ-тpeт-бyтил-глyтaмил-Nε-тpeт- бyтилoкcикapбoнил-лизинa, HOOC(CH2)2CO-Glu(OBut)-Lys(Boc)-NH2
Весь полученный Z-Glu(OBu')-Lys(Boc)-NH2 гидрировали в метаноле над 10%
Рd/С при комнатной температуре. После исчезновения исходного вещества (TCX контроль) катализатор отфильтровывали, растворитель удаляли в вакууме. Остаток растворяли в 20 мл ДМФА и добавляли 1.2 г (12.0 ммоль) янтарного ангидрида. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре до окончания реакции (TCX контроль), после чего добавляли 2 мл ДМПДА и выдерживали 30 мин.
Реакционную смесь разбавляли 200 мл этилацетата и поочерёдно промывали 100 мл воды, 100 мл 2% H2SO4 и 100 мл 3 % Na2CO3. После упаривания этилацетатного раствора продукт кристаллизовался. Далее использовали не высушивая.
в) Получение амида N-моносукцинил-глутамил-лизина, HOOC(CHb)2CO- GIu-LyS-NH2 (ГK-1)
Весь полученный HOOC(CH2)2CO-Glu(OBu')-Lys(Boc)-NH2 обрабатывали 30 мл 4 M HCl в диоксане, при этом соединение растворялось, а затем в ходе реакции выпадал липкий осадок. Через 30 мин растворитель декантировали, остаток промывали диэтиловым эфиром, растворяли в 50 мл воды, добавляли 100 мл уксусной кислоты. Поученную массу, содержащую продукт в виде ацетатной формы, наносили на колонку с ДЭАЭ-сефадексом 5x15 см. Элюировали 0.1 M пиридин-ацетатным буфером. Соответствующие фракции собирали (TCX контроль) и упаривали. После сушки в вакууме получили 1.3 г (общий выход 36 %) белого кристаллического продукта, Rf 0.50 (А), Я/ 0.22 (Б), т.пл. 216°C (с разложением), [α]25 D -37.0° (с 0.1; вода). Ci5H26N4O7.
Спектр Η-ЯМР (ДMCO-d6 - CF3COOD): 1.33 (2 H, м, CγH2 Lуs), 1.54 (2 H, м,- C8H2 Lуs), 1.50 и 1.72 (2 H, два м, CβH2 Lуs), 1.74 и 1.92 (2 H, два м, CβH2 GIu), 2.29 (2 H, т, CγH2 GIu), 2.44 (4 H, м, HOOCCH2CH2CO-), 2.78 (2 H, м, CεH2 Lуs), 4.18 (1 H, м, CαH Lуs), 4.23 (1 H, м, CαH GIu), 7.08 и 7.30 (2 H, 2 с, NH2 амид), 7.72 (3 H, м, NH3 + Lуs), 7.88 (1 H, д, NH Lуs), 8.17 (1 H, д, NH GIu). HOOC(CH2)2CO- и -COOH GIu обмениваются с HDO.
Пример 2
Синтез гексаметилендиамида бm>(./V-мoнocyкцинил-глyтaмил-лизинa),
(HOOC(CH2)2CO-Glu-Lys-NH-)2(CH2)б (ГK-2) а) Получение гексаметилендиамида биc-(N-бeнзилoкcикapбoнил-Nε-тpeт- бутилоксикарбонил-лизина), (Z-Lys(Boc)-NH-)2(CH2)б
Раствор 4.3 г (9.0 ммоль) N-оксисукцинимидного эфира N- бензилоксикарбонил-ТV^-трет-бутилоксикарбонил-лизина (Z-Lys(Boc)-OSu) и 0.5 г (4.3 ммоль) гексаметилендиамина в 20 мл ДМФА перемешивали 4 ч при комнатной температуре, при этом образовывался мутный раствор. Реакционную смесь разбавляли 80 мл воды и оставляли на несколько часов. После затвердевания выпавший осадок отфильтровывали и промывали водой. Далее использовали не высушивая.
б) Получение гексаметилендиамида биc-(N-бeнзилoкcикapбoнил-γ-тpeт-бyтил- глyтaмил-Nε-тpeт-бyтилoкcикapбoнил-лизинa), (Z-Glu(OBu')-Lys(Boc)-NH-2(CH2)б
Весь полученный (Z-Lys(Boc)-NH-)2(CH2)6 гидрировали в метаноле над 10%
PoVC при комнатной температуре. После исчезновения исходного вещества (TCX контроль) катализатор отфильтровывали, растворитель удаляли в вакууме. Остаток растворяли в 20 мл ДМФА, добавляли 3.9 г (9.0 ммоль) iV-оксисукцинимидного эфира N-бензилоксикарбонил-у-wре/я-бутил-глутаминовой кислоты (Z-Glu(OBu')-OSu). Раствор перемешивали ночь при комнатной температуре, после чего добавляли 2 мл ДМПДА и выдерживали 30 мин. Реакционную смесь разбавляли 200 мл этилацетата и поочерёдно промывали 100 мл воды, 100 мл 2 % H2SO4 и 100 мл 3 % Na2CO3. Этилацетатный раствор упаривали, остаток перекристаллизовывали из 80 мл метанола и 30 мл воды. Далее использовали не высушивая.
в) Получение гексаметилендиамида биc-(N-мoнocyкцинил-γ-тpeт-бyтил- глyтaмил-Nε-тpeт-бyтилoкcикapбoнил-лизинa), (HOOC(CHa)2CO-GIu(OBu')- Lys(Boc)-NH-)2(CH2)6
Весь полученный (Z-Glu(OBu')-Lys(Boc)-NH-)2(CH2)6 гидрировали в метаноле над 10% Рd/С при комнатной температуре. После исчезновения исходного вещества (TCX контроль) катализатор отфильтровывали, растворитель удаляли в вакууме. Остаток растворяли в 20 мл ДМФА и добавляли 1.2 г (12.0 ммоль) янтарного ангидрида. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре до окончания реакции (TCX контроль), после чего добавляли 2 мл ДМПДА и выдерживали 30 мин. Реакционную смесь разбавляли 200 мл этилацетата и поочерёдно промывали 100 мл воды, 100 мл 2 % H2SO4 и 100 мл 3 % Na2CO3. После упаривания этилацетатного раствора продукт кристаллизовался. Далее использовали не высушивая.
г) Получение гексаметилендиамида биc-(N-мoнocyкцинил-глyтaмил-лизинa), (HOOC(CH2)2CO-Glu-Lys-NH-)2(CH2)б (ГK-2)
Весь полученный (HOOC(CH2)2CO-Glu(OBu')-Lys(Boc)-NH-)2(CH2)6 растворяли в уксусной кислоте и обрабатывали 30 мл 4 M HCl в диоксане. Через 40 мин растворитель декантировали, остаток промывали диэтиловым эфиром декантацией, растворяли в 50 мл воды и обрабатывали при перемешивании смолой Амберлит IRA-410 до стабилизации значения рН ~ 2. Очистку проводили методом обращенно-фазной C8 ВЭЖХ в градиенте 0-15 % изопропанола в 0.1 M уксусной кислоте. Соответствующие фракции собирали (TCX контроль), упаривали и сушили в вакууме. Получали 1.3 г (общий выход 32 %) продукта в виде белого твердого вещества, Rf 0.41 (A), Rf 0.20 (Б), т.пл. 120-128°C (не имеет четкой температуры плавления, очень гигроскопичное), [α]25o -47.0° (с 0.1; вода).
Спектр Η-ЯМР (ДMCO-J6 - CF3COOD): 1.24 и 1.40 (8 H, м, - NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-), 1.38 (4 H, м, 2 CγH2 Lуs), 1.53 (4 H, м, 2 C5H2 Lуs), 1.50 и 1.67 (4 H, м каждый, 2 CβH2 Lуs), 1.78 и 1.90 (4 H, м каждый, 2 CβH2 GIu), 2.29 (4 H, т, 2 CγH2 GIu), 2.44 (8 H, м, 2 HOOCCH2CH2CO-), 2.77 (4 H, м, 2 C8H2 Lуs), 3.04 (4 H, м, -NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-), 4.14 (2 H, м, 2 CαH Lуs), 4.23 (2 H, м, 2 CαH GIu), 7.70 (6 H, м, 2 NH3 + Lуs), 7.72 (2 H, т, -NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH1), 7.90 (2 H, д, 2 NH Lуs), 8.18 (2 H, д, 2 NH GIu). 2 HOOC(CH2)2CO- и 2 -COOH GIu обмениваются с HDO.
Пример 3
Синтез амида 7V-aцeтил-лизил-глyтaминoвoй кислоты, СНзСО-Lуs-Glu-NНг (ГК-
3) а) Получение амида γ-бензил-глутаминовой кислоты, H-GIu(OBzI)-NH2
8.0 г (17.4 ммоль) и-нитрофенилового эфира
Figure imgf000021_0001
бензил-глутаминовой кислоты (Boc-Glu(OBzl)-ONp) растворяли в 30 мл ДМФА, добавляли 3.5 мл водного аммиака и выдерживали в течение 5 мин. Затем к реакционной смеси добавляли 100 мл воды, 50 мл диэтилового эфира и 100 мл гексана, после чего выдерживали при +50C в течение нескольких часов. Выпавший осадок отфильтровывали, твердый остаток промывали водой и гексаном. Полученный продукт растворяли в 80 мл TFA, раствор выдерживали 1 час при комнатной температуре. Растворитель удаляли в вакууме, остаток кристаллизовали с эфиром. Постепенно кристаллизующийся осадок отфильтровывали и промывали эфиром. Получали 5.8 г (96 %) продукта с т.пл. 68-70°C, [α]26 D +10.0° (с 0.3; вода-этанол, 1 :2).
б) Получение амида N-тpeт-бyтилoкcикapбoнил-Nε-бeнзилoкcикapбoнил-лизил-γ- бензил-глутаминовой кислоты, Boc-Lys(Z)-Glu(OBzl)-NH2
К раствору 5.8 г (16.7 ммоль) трифторацетета амида у-бензил-глутаминовой кислоты (H-GIu(OBzI)-NH2) и 9.0 г (18.0 ммоль) п-нитрофенилового эфира N-трет- бутилоксикарбонил-Λ^-бензилоксикарбонил-лизина (Boc-Lys(Z)-ONp) в 30 мл ДМФА при перемешивании добавляли 2.5 мл (18.0 ммоль) ТЭА и оставляли на ночь при комнатной температуре. После окончания реакции (TCX контроль) добавляли 2 мл ДМПДА и выдерживали 1 час. Затем к раствору добавляли 200 мл воды и 200 мл диэтилового эфира. Выпавший осадок отфильтровывали, промывали водой и эфиром. Получали 9.3 г (93 %) продукта с т.пл. 122°C, [α]27 D -10.7° (с 0.3; ДМФА).
в) Получение амида Nε-бeнзилoкcикapбoнил-лизил-γ-бeнзил-глyтaминoвoй кислоты, H-LyS(Z)-GIu(OBzI)-NH2
Раствор 9.3 г (15.5 ммоль) Boc-Lys(Z)-Glu(OBzl)-NH2 в 70 мл TFA выдерживали 1 час. Растворитель удаляли в вакууме, остаток растирали с диэтиловым эфиром. Кристаллизующийся осадок отфильтровывали. Получали 9.1 г (96 %) продукта в виде трифторацетата с т.пл. 145-146°C, [α]26o +13.3° (с 0.3; вода-этанол, 1 :2).
г) Получение амида N-ацетил-лизил-rлутаминовой кислоты, СНзСО-Lуs-Glu- NH2 (ГK-3)
9.1 г (14.9 ммоль) трифторацетата H-Lys(Z)-Glu(OBzl)-NH2 и 3.0 г (16.6 ммоль) и-нитрофенилового эфира уксусной кислоты (AcONp) растворяли в 30 мл ДМФА, добавляли при перемешивании 2.3 мл (16.6 ммоль) ТЭА. Реакционную смесь перемешивали 3 ч при комнатной температуре (TCX контроль), затем добавляли 200 мл эфира и 200 мл воды. Выпавший осадок отфильтровывали, сушили в вакууме. Полученный продукт растворяли в 150 мл метанола, добавляли 3.0 г 10% Рd/С и гидрировали при перемешивании при 400C 3 мл (59.9 ммоль) конц. раствора формиата аммония, добавляя его порциями. Через 4 ч катализатор отфильтровывали, промывали метанолом, фильтрат упаривали. Полученный продукт растворяли в 500 мл воды и очищали на колонке со 100 мл SР-сефадекса в градиенте 0.1 М → 0.2 M пиридин-ацетатного буфера. Соответствующие фракции (TCX контроль) собирали и упаривали, переупаривали с изопропанолом. Остаток растирали с метанолом, кристаллизующийся твердый осадок отфильтровывали и высушивали в вакууме. Получали 2.2 г (40 %; общий выход 34 %) продукта в виде белого кристаллического вещества, Д/0.43 (А), Д/0.27 (Б), т.пл. 198-199°C, [α]26 D -32.3° (с 1; вода). C13H24N4O5. Спектр Η-ЯМР (ДMCO-d6 - CF3COOD): 1.32 (2 H, м, CγH2 Lуs), 1.52 (2 H, м, C5H2 Lуs), 1.65 и 1.80 (2 H, два м, CβH2 Lуs), 1.85 (3 H, с, CH3CO-), 2.00 и 1.82 (2 H, два м, CβH2 GIu), 2.21 (2 H, т, CγH2 GIu), 2.75 (2 H, м, CεH2 Lуs), 4.17 (2 H, м, CαH Lуs, CαH GIu), 7.07 и 7.81 (2 H, 2 с, NH2 амид), 7.68 (3 H, м, N8H3 + Lуs), 7.91 (1 H, д, NH GIu), 8.08 (1 H, д, NH Lуs). Сигнал COOH GIu обменивается с HDO.
Пример 4
Синтез гексаметилендиамида #иc-(iV-aцeтил-лизил-глyтaминoвoй кислоты), (CH3CO-Lys-Glu-NH-)2(CH2)б) (ГK-4) а) Получение гексаметилендиамида биc-(γ-бeнзил-глyтaминoвoй кислоты), (H-
GIU(OBZI)-NH )2(CHZ)6
6.0 г (13.1 ммоль) я-нитрофенилового эфира iV-mре/w-бутилоксикарбонил-у- бензил-глутаминовой кислоты (Boc-Glu(OBzl)-ONp) и 0.76 г (6.5 ммоль) гексаметилендиамина растворяли в 30 мл ДМФА и перемешивали ночь при комнатной температуре. После окончания реакции (TCX контроль) к реакционной смеси добавляли 1 мл ДМПДА и выдерживали 1 час при комнатной температуре. Затем к раствору добавляли 150 мл этилацетата и 200 мл воды и промывали 150 мл 3% H2SO4, 100 мл воды. Слой этилацетата упаривали, полученный твердый остаток растворяли в 80 мл TFA и выдерживали в течение 1 часа при комнатной температуре. Затем растворитель отгоняли, остаток растирали с диэтиловым эфиром. После выдерживания при +5°C в течение нескольких часов эфир декантировали, твердый остаток сушили в вакууме. Получали 4.9 г (96 %) продукта.
б) Получение гексаметилендиамида биc-(N-тpeт-бyтилoкcикapбoнил-Nε- бензилоксикарбонил-лизил-γ-бензил-глутаминовой кислоты), (Boc-Lys(Z)- Glu(OBzl)-NH-)2(CH2)б
4.9 г (6.2 ммоль) (H-Glu(OBzl)-NH-)2(CH2)6 и 6.6 г (13.2 ммоль) п- нитрофенилового эфира iV-mреm-бутилоксикарбонил-Λ^-бензилоксикарбонил-лизина (Boc-Lys(Z)-ONp) растворяли в 30 мл ДМФА, при перемешивании добавляли 1.8 мл (13.2 ммоль) ТЭА. Реакционную смесь перемешивали 1 ночь при комнатной температуре. По окончании реакции (TCX контроль) к реакционной смеси добавляли 2 мл ДМПДА и выдерживали 1 час. Затем к раствору добавляли 200 мл воды и 200 мл диэтилового эфира. Выпавший осадок отфильтровывали, промывали водой и эфиром. Получали 6.3 г (80 %) продукта с т.пл. 137-138°C, [α]21 D -15.2° (с 1; ДМФА).
в) Получение гексаметилендиамида биc-(Nε-бeнзилoкcикapбoнил-лизил-γ- бензил-глутаминовой кислоты), (H-Lys(Z)-Glu(OBzI)-NH-)2(CH2)б
Раствор 6.3 г (5.0 ммоль) (Boc-Lys(Z)-Glu(OBzl)-NH-)2(CH2)6 в 70 мл TFA выдерживали 1 час. Растворитель удаляли в вакууме, остаток растирали с диэтиловым эфиром. Кристаллизующийся осадок отфильтровывали. Получали 6.2 г (95 %) продукта с т.пл. 172-174°C, [α]27 D +3.6° (с 1; ДМФА). г) Получение гексаметилендиамида биc-(N-aцeтил-Nε-бeнзилoкcикapбoнил- лизил-γ-бензил-глутаминовой кислоты), (CHзCO-Lys(Z)-Glu(OBzl)-NH-)2(CH2)б
К раствору 6.2 г (4.8 ммоль) (H-Lys(Z)-Glu(OBzl)-NH-)2(CH2)6 и 2.3 г (12.7 ммоль) и-нитрофенилового эфира уксусной кислоты (AcONp) в 30 мл ДМФА при перемешивании добавляли 1.8 мл (12.7 ммоль) ТЭА. Реакционную массу перемешивали при комнатной температуре в течение 3 ч. Продукт выпадал в ходе реакции (TCX контроль). Затем к реакционной смеси добавляли 200 мл диэтилового эфира и 200 мл воды. Выпавший осадок отфильтровывали и сушили в вакууме. Получали 5.1 г (92 %) продукта с т.пл. 220-2220C, [α]21 D -11.2° (с 1 ; ДМФА).
д) Получение гексаметилендиамида биc-(N-aцeтил-лизил-глyтaминoвoй кислоты), (CHзCO-Lys-GIu-NH-)2(CH2)б (ГK-4)
5.1 г (4.4 ммоль) (CH3CO-Lys(Z)-Glu(OBzl)-NH-)2(CH2)6 растворяли в 150 мл метанола, к суспензии добавляли 3.0 г 10% Рd/С и гидрировали при перемешивании при 400C 3 мл (59.9 ммоль) конц. раствора формиата аммония, добавляя его порциями. Через 4 ч катализатор отфильтровывали, промывали метанолом, фильтрат упаривали. Полученный продукт растворяли в 500 мл воды и очищали на колонке со 100 мл SР-сефадекса в градиенте 0.1 M → 0.2 M пиридин-ацетатного буфера. Соответствующие фракции собирали (TCX контроль) и упаривали, а затем переупаривали с изопропанолом. Остаток растирали с метанолом. Кристаллизующийся твердый осадок отфильтровывали и высушивали в вакууме. Получали 3.4 г (93 %; общий выход 63 %) белого кристаллического вещества, i?/0.30 (А), Rf 0.20 (Б), т.пл. 205-206°C, [α]27 D -39.3° (с 1; вода). C32H58N8O10. Спектр Η-ЯМР (ДMCO-d6 - CF3COOD): 1.21 (4 H, м, NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-), 1.33 (8 H, м, -NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-, 2 CγH2 Lуs), 1.52 (4 H, м, 2 C8H2 Lуs), 1.90 и 1.75 (4 H, м каждый, 2 CβH2 GIu), 1.85 (6 H, с, 2 CH3CO-), 2.25 (4 H, т, 2 CγH2 GIu), 2.74 (4 H, м, 2 CεH2 Lуs), 3,02 (4 H, м, - NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-), 4.17 (4 H, м, 2 CαH Lуs, 2 CαH GIu), 7.81 (2 H, т, - NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-), 7.70 (6 H, м, 2 NH3 + Lуs), 7.94 (2 H, д, 2 NH GIu), 8,11 (2H, д, 2 NH Lуs). Сигналы 2 -COOH GIu обмениваются с HDO.
Пример 5
Синтез амида 7V-(6-aминoкaпpoил)глицил-лизинa, H2N(CH2)SCO-GIy-LyS-NH2
(ГK-5) а) Получение амида N-бeнзилoкcикapбoнил-глицил-Nε-тpeт-бyтилoкcикapбoнил- лизина, Z-Gly-Lys(Boc)-NHг Раствор 7.0 г (14.6 ммоль) N-оксисукцинимидного эфира N- бeнзилoкcикapбoнил-Λ^-m/?ew-бyтилoкcикapбoнил-лизинa (Z-Lys(Boc)-OSu) в 20 мл ДМФА обрабатывали 5 мл аммиака в течение 10 мин. Затем к реакционной массе добавляли 100 мл воды со льдом. Выпавший осадок отфильтровывали и промывали водой. Получали 5.3 г (96 %) амида N-бензилоксикарбонил-Λ^-wреw- бутилоксикарбонил-лизина (Z-Lys(Boc)-NH2). Продукт растворяли в метаноле, к суспензии добавляли 3.0 г 10% Рd/С и гидрировали при перемешивании при комнатной температуре 3 мл (59.9 ммоль) конц. раствора формиата аммония с добавлением небольшого количества уксусной кислоты. После исчезновения исходного вещества (TCX контроль) катализатор отфильтровывали, промывали метанолом, фильтрат упаривали. Остаток растворяли в ДМФА и добавляли 4.8 г (14.6 ммоль) и-нитрофенилового эфира УV-бензилоксикарбонил-глицина (Z-GIy-ONp). Реакционную смесь оставляли перемешиваться на ночь при комнатной температуре. По окончании реакции (TCX контроль) добавляли 1 мл ДМПДА и выдерживали 30 мин. Затем к раствору добавляли 300 мл этилацетата и поочерёдно промывали 200 мл воды, 50 мл нас. NaCl и 3 % K2CO3 (З χ 150 мл). Этилацетатную фракцию упаривали, остаток кристаллизовали под диэтиловым эфиром. Получали 4.3 г (71 %) продукта.
б) Получение N-оксисукцинимидного эфира N-тpeт-бyтилoкcикapбoнил-6- аминокапроновой кислоты, Boc-HN(CH2)sCO-OSu
К раствору 7.0 г (53.4 ммоль) 6-aминoкaпpoнoвoй кислоты в 80 мл ДМФА добавляли 13.1 г (60.0 ммоль) ди-/wpew?-бyтилпиpoкapбoнaтa. Реакционную смесь перемешивали 2 ч при комнатной температуре. ДМФА удаляли в вакууме, остаток растворяли в этилацетате, добавляли 6.9 г (60.0 ммоль) N-гидроксисукцинимида и 12.4 г (60.0 ммоль) ДЦГК. Реакционную смесь оставляли перемешиваться на ночь при комнатной температуре. На следующие сутки осадок дициклогексилмочевины отфильтровывали, раствор упаривали, остаток перекристаллизовывали из смеси изопропанол-гексан в соотношении 1 :1. Получали 16.0 г (96 %) продукта.
в) Получение амида N-(N-тpeт-бyтилoкcикapбoнил-6-aминoкaпpoил)глицил-Nε- трет-бутилоксикарбонил-лизина, Boc-HN(CH2)5CO-Gly-Lys(Boc)-NH2
4.3 г (10.0 ммоль) Z-Gly-Lys(Boc)-NH2 гидрировали в метаноле 3 мл (59.9 ммоль) конц. раствора формиата аммония с добавлением уксусной кислоты. После исчезновения исходного вещества (TCX контроль) катализатор отфильтровывали, промывали метанолом, фильтрат упаривали. Остаток растворяли в ДМФА, добавляли 3.9 г (12.4 ммоль) Boc-HN(CH2)5CO-OSu. Реакционную смесь оставляли перемешиваться на ночь при комнатной температуре. По окончании реакции (TCX контроль) добавляли 1 мл ДМПДА и выдерживали 30 мин. Реакционную смесь разбавляли 200 мл этилацетата и 150 мл воды, водный слой экстрагировали 200 мл этилацетата. Этилацетатный раствор промывали 100 мл воды, растворитель упаривали, к остатку добавляли 200 мл диэтилового эфира и оставляли кристаллизоваться на холоде. Выпавший осадок отфильтровывали, промывали эфиром. Получали 3.1 г (60 %) продукта.
г) Получение амида N-(6-aминoкaпpoил)глицил-лизинa, H2N(CH2)SCO-GIy-LyS- NH2(ГK-5)
3.1 г (6.0 ммоль) Boc-HN(CH2)5CO-Gly-Lys(Boc)-NH2 обрабатывали 100 мл
TFA в течение 1 часа. Затем реакционную смесь упаривали, остаток растирали с 200 мл диэтилового эфира. Эфир декантировали, полученный продукт растворяли в 500 мл воды и очищали на колонке со 100 мл SР-сефадекса в градиенте 0.1 М → 0.6 M пиридин-ацетатного буфера. Соответствующие фракции (TCX контроль) собирали, упаривали и переупаривали с изопропанолом, полученный осадок сушили в вакууме. Получали 2.5 г (96 %; общий выход 39 %) гигроскопичного белого твердого вещества, R/0.65 (А), Я/0.51 (Б), т.пл. 50-52°C, [α]25 D -7.8° (с 0.17; вода). Спектр Η-ЯМР (ДMCO-J6): 1.27 и 1.47 (12 H, м, -C13H2C1H2C5H2- LУS > NH2CH2CH2CH2CH2CH2CO-), 2.12 (2 H, т, NH2CH2CH2CH2CH2CH2CO-), 2.64 (4 H, м, NH2CH2CH2CH2CH2CH2CO-, C6H2 Lуs), 3.65 и 3.72 (2 H, два дд, CH2 GIy), 4.13 (1 H, м, CαH Lуs), 7.08 и 7.52 (2 H, два с, NH2 амид), 8.11 (1 H, д, NH Lуs), 8.46 (1 H, т, NH GIy). NεH2 Lуs и NH2CH2CH2CH2CH2CH2CO- обмениваются с HDO.
Пример 6
Синтез гексаметилендиамида øш>(УV-(6-aминoкaпpoил)глицил-лизинa),
(H2N(CH2)5CO-Gly-Lys-NH-)2(CH2)6 (ГK-6) а) Получение гексаметилендиамида биc-(N-бeнзилoкcикapбoнил-глицил-Nε-тpeт- бутилоксикарбонил-лизина), (Z-Gly-Lys(Boc)-NH-)2(CH2)б
Раствор 7.2 г (15.0 ммоль) N-оксисукцинимидного эфира N- бензилоксикарбонил-Λ^-mреди-бутилоксикарбонил-лизина (Z-Lys(Boc)-OSu) и 0.85 г (7.3 ммоль) гексаметилендиамина в 20 мл ДМФА перемешивали 1 ночь при комнатной температуре. По окончании реакции (TCX контроль) добавляли 1 мл ДМПДА и выдерживали 30 мин, после чего добавляли 10 мл уксусной кислоты. Затем высаживали продукт в течение 1 ночи при +5°C 150 мл воды, при этом образующееся масло постепенно затвердевало. Осадок отфильтровывали, промывали водой. Продукт растворяли в метаноле, к суспензии добавляли 3.0 г 10% Рd/С и гидрировали при перемешивании при комнатной температуре 3 мл (59.9 ммоль) конц. раствора формиата аммония с добавлением небольшого количества уксусной кислоты. После исчезновения исходного вещества (TCX контроль) катализатор отфильтровывали, промывали метанолом, фильтрат упаривали. Остаток растворяли в ДМФА и добавляли 5.0 г (15.0 ммоль) я-нитрофенилового эфира N- бензилоксикарбонил-глицина (Z-GIy-ONp). Реакционную массу оставляли перемешиваться на 1 ночь при комнатной температуре. По окончании реакции (TCX контроль) добавляли 1 мл ДМПДА и выдерживали 30 мин. Реакционную смесь разбавляли 300 мл этилацетата и поочерёдно промывали 200 мл воды, 50 мл нас. NaCl, 200 мл 2% H2SO4 и 3% K2CO3 (3 х 150 мл). Этилацетатную фракцию упаривали, остаток кристаллизовали под диэтиловым эфиром. Получали 5.6 г (80 %) продукта.
б) Получение гексаметилендиамида биc-(N-(N-тpeт-бyтилoкcикapбoнил-6- aминoкaпpoил)глицил-Nε-тpeт-бyтилoкcикapбoнил-лизинa), (BoC-HN(CH2)SCO- Gly-Lys(Boc)-NH-)2(CH2)б
5.6 г (5.9 ммоль) (Z-Gly-Lys(Boc)-NH-)2(CH2)6 гидрировали в метаноле при перемешивании при комнатной температуре 3 мл (59.9 ммоль) конц. раствора формиата аммония с добавлением 3.0 г 10% Рd/С и небольшого количества уксусной кислоты. После исчезновения исходного вещества (TCX контроль) катализатор отфильтровывали, промывали метанолом, фильтрат упаривали. Остаток растворяли в ДМФА и добавляли 4.3 г (13.8 ммоль) N-оксисукцинимидного эфира N-трет- бyтилoкcикapбoнил-6-aминoкaпpoнoвoй кислоты (Boc-HN(CH2)5CO-OSu, синтез данного соединения описан в Примере 5, пункт «б»). Реакционную массу оставляли перемешиваться на 1 ночь при комнатной температуре. По окончании реакции (TCX контроль) добавляли 1 мл ДМПДА и выдерживали 30 мин. Реакционную смесь разбавляли 200 мл этилацетата и 150 мл воды, водный слой экстрагировали 200 мл этилацетата. Этилацетатную фракцию промывали 100 мл воды, растворитель упаривали. К остатку добавляли 200 мл диэтилового эфира и оставляли кристаллизоваться на холоде на 1 ночь. Образовавшийся осадок отфильтровывали и промывали эфиром. Получали 6.2 г (95 %) продукта. в) Получение гексаметилендиамида биc-(N-(6-aминoкaпpoил)глицил-лизинa), (H2N(CH2)5CO-Gly-Lys-NH-)2(CH2)б (ГK-6)
6.2 г (5.6 ммоль) (Boc-HN(CH2)5CO-Gly-Lys(Boc)-NH-)2(CH2)6 обрабатывали
100 мл TFA в течение 1 часа. Затем реакционную смесь упаривали, остаток растирали с 200 мл диэтилового эфира. Растворитель декантировали, полученный продукт растворяли в 500 мл воды и очищали на колонке со 100 мл SР-сефадекса в градиенте 0.1 M → 0.6 M пиридин-ацетатного буфера с добавлением аммиака. Соответствующие фракции (TCX контроль) собирали, упаривали и переупаривали с изопропанолом. Полученный остаток сушили в вакууме и очищали на обращенно- фазовой C8 ВЭЖХ в градиенте 0-20% изопропанола в 0.1 M уксусной кислоте. Фракцию, соответствующую продукту, упаривали, сушили в вакууме. Получали 3.8 г (95%; общий выход 72 %) конечного продукта в виде масла, i?/0.50 (A), Rf 0.08 (Б), [α]27D -129.6° (с 0.17; вода).
Спектр Η-ЯМР (ДMCO-J6): 1.10-1.70 (32 H, м, 2 -C15H2C7H2C5H2- Lуs, 2 NH2CH2CH2CH2CH2CH2CO-, -NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-), 2.12 (4 H, т, 2 NH2CH2CH2CH2CH2CH2CO-), 2.65 (8 H, м, 2 NH2CH2CH2CH2CH2CH2CO-, 2 CεH2 Lуs), 3.01 (4 H, м, -NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-), 3.66 и 3.69 (4 H, дд каждый, 2 CH2 GIy), 4.14 (2 H, м, 2 CαH Lуs), 8.09 (2 H, т, -NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-), 8.19 (2 H, д, 2 NH Lуs), 8.45 (2 H, т, 2 NH GIy). 2 NεH2 Lуs и 2 NH2CH2CH2CH2CH2CH2CO- обмениваются с HDO.
Пример 7
Синтез триметилендиамида έшo(7V-мoнocyкцинил-глyтaмил-лизил-6- аминогексановой кислоты), (HOOC(CH2)2CO-Glu-Lys-NH(CH2)5CO-NH-)2(CH2)з
(ГK-2a) а) Получение монобензилового эфира янтарной кислоты, HOOC(CH2^CO-OBZI
Смесь 10.00 г (100.00 ммоль) янтарного ангидрида и 1 1 мл (101.70 ммоль) бензилового спирта нагревали до температуры кипения в течение 6 ч. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры и промывали диэтиловым эфиром. Эфирный раствор отфильтровывали от нерастворимого осадка янтарной кислоты и промывали нас. раствором NaHCO3 (3 х 40 мл). Водный слой, содержащий натриевую соль HOOC(CH2)2CO-OBzl, отделяли от эфирного слоя, содержащего побочный продукт реакции - дибензиловый эфир янтарной кислоты, нерастворимый в водной слабощелочной среде. Водный раствор подкисляли 2 н. HCl, при этом в осадок выпадала белая кристаллическая масса. Осадок отфильтровывали, дополнительно промывали холодной водой и сушили в вакууме. Получали 10.00 г (48 %) белого кристаллического продукта с т.пл. 58-59°C. Литературные данные: т.пл. 58-59°C. (J Сhет. Sос, 1955, 1097). б) Получение сукцинимидного эфира монобензилянтарной кислоты, BzIO- OC(CH2)2CO-OSu.
7.50 г (36.02 ммоль) HOOC(CH2)2CO-OBzl и 4.17 г (36.20 ммоль) N- гидроксисукцинимида растворяли при комнатной температуре в 70 мл ТГФ. Полученный раствор охлаждали до 00C. При интенсивном перемешивании к раствору добавляли охлаждённый до 00C раствор 7.47 г (36.20 ммоль) ДЦГК в 30 мл ТГФ. Реакционную смесь перемешивали при O0C в течение 6 ч. Выпавший белый осадок дициклогексилмочевины отфильтровывали. Растворитель удаляли в вакууме. Полученную вязкую маслообразную массу растворяли в 50 мл хлористого метилена, раствор оставляли при температуре 00C на 24 ч. Образовавшийся осадок отфильтровывали. Фильтрат упаривали в вакууме, получая маслообразный, способный к кристаллизации продукт 10.78 г (98 %).
в) Получение γ-бензилового эфира глутам иновой кислоты, H-GIu(OBzI)-OH
Смесь 29.40 г (0.20 моль) глутаминовой кислоты, 82 мл (0.80 моль) бензилового спирта и 41.85 г (0.22 моль) моногидрата и-толуолсульфокислоты нагревали при температуре 100-1050C 25 мин при интенсивном перемешивании до тех пор, пока реакционная смесь не стала гомогенной и прозрачной. Реакционную смесь охлаждали и добавляли 300 мл бензола. Полученный раствор промывали водой (5 х 200 мл), водную фазу, содержащую соль и-толуолсульфокислоты H-GIu(OBzI)-OH и непрореагировавшую глутаминовую кислоту, отделяли от органической. В полученный водный раствор добавляли при перемешивании небольшими порциями кристаллический NaHCO3, доводя рН среды до 6. При этом из водного раствора выпадал белый кристаллический осадок. Водный раствор с выпавшим осадком оставляли на несколько часов при температуре +5°C. Затем осадок отфильтровывали, промывали несколько раз холодной водой, сушили в вакууме. Получали 12.00 г (30%) продукта с т.пл. 169-1700C. Литературные данные: т.пл. 169-1700C. (J. Сhет. Sос, 1950, 3239).
г) Получение N-бензилсукцинил-γ-бензил-глутаминовой кислоты, BzIO- OC(CH2)2CO-Glu(OBzl)-OH
7.12 г (30.00 ммоль) γ-бензилового эфира глутаминовой кислоты (H-GIu(OBzI)- ОН) суспендировали в 50 мл ДМФА. Полученную суспензию охлаждали до 00C и при интенсивном перемешивании добавляли сначала раствор 5.19 мл (30.00 ммоль) ДИЭА в 10 мл ДМФА, а затем раствор 9.16 г (30.00 ммоль) BzЮ-OC(CH2)2CO-OSu в 50 мл ДМФА. После того, как полученная реакционная масса стала гомогенной, охлаждение прекратили. Реакционную смесь перемешивали в течение 18 ч при комнатной температуре. Затем при интенсивном перемешивании в реакционную смесь добавляли 400 мл охлаждённого 5% раствора лимонной кислоты, при этом выпадал белый мелкодисперсный кристаллический осадок. Полученную суспензию промывали этилацетатом (3 х 200 мл). Органические фазы объединяли, промывали 200 мл нас. NaCl и сушили безводным Na2SO4, растворитель удаляли в вакууме. Получали 11.94 г (93 %) светло-жёлтого маслообразного продукта.
д) Получение N-оксисукцинимидного эфира N-бензилсукцинил-γ-бензил- глутаминовой кислоты, BzlO-OC(CH2)2CO-Glu(OBzl)-OSu
11.81 г (27.63 ммоль) BzlO-OC(CH2)2CO-Glu(OBzl)-OH и 3.44 г (29.93 ммоль)
N-гидроксисукцинимида растворяли при комнатной температуре в 60 мл ТГФ. Раствор охлаждали до 00C. При интенсивном перемешивании к раствору добавляли охлаждённый до 00C раствор 6.18 г (29.93 ммоль) ДЦГК в 20 мл ТГФ. Реакционную смесь перемешивали при 00C в течение 24 ч. Выпавший белый осадок дициклогексилмочевины отфильтровывали. ТГФ упаривали в вакууме. Получали вязкую маслообразную массу, которую растворяли в 35 мл хлористого метилена. Полученный раствор оставляли при температуре 00C на 24 ч. Образовавшийся осадок отфильтровывали. Фильтрат упаривали в вакууме. Получали 14.06 г (97 %) маслообразного продукта.
е) Получение N-оксисукцинимидного эфира N-тpeт-бyтилoкcикapбoнил-Nε-(2- xлop-бeнзилoкcикapбoнил)лизинa, Boc-Lys(2-Cl-Z)-OSu
6.00 г (14.46 ммоль) 7V-mpew-бyтилoкcикapбoнил-Λ'e-(2-xлop- бeнзилoкcикapбoнил)лизинa (Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH) и 1.83 г (15.91 ммоль) N- гидроксисукцинимида растворяли при комнатной температуре в 35 мл ТГФ. Раствор охлаждали до 00C. При интенсивном перемешивании к раствору добавляли охлаждённый до 00C раствор 3.28 г (15.91 ммоль) ДЦГК в 10 мл ТГФ. Реакционную смесь перемешивали при 00C в течение 24 ч. Выпавший белый осадок дициклогексилмочевины отфильтровывали. ТГФ упаривали в вакууме. Полученную вязкую маслообразную массу растворяли в 20 мл хлористого метилена. Раствор оставляли при температуре 00C в течение 24 ч. Образовавшийся осадок отфильтровывали. Фильтрат упаривали в вакууме. Получали 6.90 г (93 %) маслообразного продукта.
ж) Получение N-тpeт-бyтилoкcикapбoнил-Nε-(2-xлop-бeнзилoкcикapбoнил)лизил- 6-aминoгeкcaнoвoй кислоты, Boc-Lys(2-Cl-Z)-NH(CH2)sCOOH
1.58 г (12.05 ммоль) 6-aминoгeкcaнoвoй кислоты суспендировали в 10 мл воды.
К суспензии при комнатной температуре при перемешивании добавляли 4.8 мл 2 н. NaOH, 1.01 г (12.05 ммоль) NaHCO3 и 12 мл ДМФА. Полученную суспензию охлаждали до 00C и при интенсивном перемешивании добавляли 6.17 г (12.05 ммоль) раствора Boc-Lys(2-Cl-Z)-OSu в 12 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивали 1 ч при 00C, после чего добавляли 24 мл смеси ДMФA-H2O в соотношении 1:1. Температуру реакционной смеси постепенно повышали до комнатной, после чего перемешивали в течение 24 ч. Затем при интенсивном перемешивании добавляли 150 мл охлаждённого 5% раствора лимонной кислоты. Реакционную смесь промывали этилацетатом (3 х 50 мл). Этилацетатные растворы объединяли, промывали нас. NaCl (3 х 50 мл) и сушили безводным Na2SO4. Растворитель удаляли в вакууме. Получали 5.97 г (94 %) прозрачного светло-жёлтого маслообразного продукта.
з) Получение Nε-(2-xлop-бeнзилoкcикapбoнил)лизил-6-aминoгeкcaнoвoй кислоты, Lys(2-Cl-Z)-NH(CH2)5COOH
5.96 г (11.29 ммоль) Boc-Lys(2-Cl-Z)-NH(CH2)5COOH добавляли при перемешивании к 50 мл 4 M НСl/Diохапе при комнатной температуре. Реакционную массу перемешивали в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем растворитель удаляли в вакууме при температуре 25-300C. Маслообразный остаток промывали хлористым метиленом. Постепенно нерастворимая маслообразная масса подвергалась кристаллизации, в результате чего образовывался белый кристаллический осадок, который отфильтровывали, промывали несколько раз хлористым метиленом и сушили в вакууме. Получали 3.72 г (71%) белого кристаллического продукта.
и) Получение N-бeнзилcyкцинил-γ-бeнзил-глyтaмил-Nε-(2-xлop- бeнзилoкcикapбoнил)-лизил-6-aминoгeкcaнoвoй кислоты, BzlO-OC(CH2)2CO- Glu(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-NH(CH2)5COOH
3.70 г (7.97 ммоль) Lys(2-Cl-Z)-NH(CH2)5COOH растворяли в 15 мл ДМФА.
Раствор охлаждали до 5°C. Добавляли раствор 1.8 мл (15.94 ммоль) N- метилморфолина в 5 мл ДМФА и раствор 4.18 г (7.97 ммоль) BzlO-OC(CH2)2CO- GIu(OBzI)-OSu в 15 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивали 2 сут при комнатной температуре. Выпавший осадок отфильтровывали, растворитель удаляли в вакууме при температуре 25-500C. К остатку добавляли 50 мл охлаждённого 10% раствора лимонной кислоты и 100 мл этилацетата. Слой этилацетатного раствора отделяли от водного. Водную фазу дополнительно промывали этилацетатом (3 х 50 мл). Органические фазы объединяли и промывали нас. NaCl (2 х 50 мл), сушили безводным Na2SO4. Растворитель удаляли в вакууме. Полученный остаток растирали с диэтиловым эфиром при комнатной температуре, при этом происходила кристаллизация продукта. Образовавшиеся кристаллы промывали эфиром и сушили в вакууме. Получали 4.81 г (72 %) кристаллического продукта.
к) Получение N-оксисукцинимидного эфира N-бензилсукцинил-γ-бензил- глyтaмил-Nε-(2-xлop-бeнзилoкcикapбoнил)лизил-6-aминoгeкcaнoвoй кислоты, BzЮ-OC(CH2)2CO-Glu(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-NH(CH2)5CO-OSu
4.80 г (5.73 ммоль) BzlO-OC(CH2)2CO-Glu(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-NH(CH2)5COOH и 0.73 г (6.30 ммоль) N-гидроксисукцинимида растворяли при комнатной температуре в 35 мл ТГФ. При интенсивном перемешивании к этому раствору добавляли 1.30 г (6.30 ммоль) раствора ДЦГК в 5 мл ТГФ. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре в течение 36 ч. Выпавший белый осадок дициклогексилмочевины отфильтровывали. ТГФ упаривали в вакууме. Образовавшуюся вязкую кристаллическую массу растворяли в 30 мл хлористого метилена, полученный раствор оставляли при температуре 00C на 24 ч. Образовавшийся осадок отфильтровывали. Фильтрат упаривали, остаток сушили в вакууме. Получали 5.35 г (100 %) продукта в виде вязкой кристаллической массы.
л) Получение триметилендиамида биc-(N-бeнзилcyкцинил-γ-бeнзил-глyтaмил-Nε- (2-xлop-бeнзилoкcикapбoнил)лизил-6-aминoгeкcaнoвoй кислоты), (BzlO-OC(CH2)2CO-Glu(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-NH(CH2)5CO-NH-)2(CH2)з
К раствору 0.2 мл (2.85 ммоль) пропилендиамина в 15 мл ДМФА, охлаждённому до 00C в токе азота, при перемешивании прибавляли сначала раствор 1 мл (5.70 ммоль) ДИЭА в 5 мл ДМФА, а затем охлаждённый раствор 5.33 г (5.70 ммоль) BzЮ-OC(CH2)2CO-Glu(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-NH(CH2)5CO-OSu в 30 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивали в течение 1 ч при 00C и затем 24 ч при комнатной температуре. Растворитель упаривали в вакууме при температуре 25-500C. К маслообразному остатку при интенсивном перемешивании добавляли 50 мл охлаждённого 10% раствора лимонной кислоты. Выпавший кристаллический осадок отфильтровывали, последовательно промывали 50 мл 5% NaHCO3, водой (2 х 50 мл), ацетоном (2 х 50 мл), этилацетатом (2 х 50 мл) и диэтиловым эфиром, высушивали в вакууме. Получали 3.08 г (63 %) белого кристаллического продукта.
м) Получение триметилендиамида биc-(N-мoнocyкцинил-глyтaмил-лизил-6- аминогексановой кислоты), (HOOC(CH2)2CO-Glu-Lys-NH(CH2)5CO-NH-)2(CH2)з (ГK-2a)
2.50 г (1.46 ммоль) (BzlO-OC(CH2)2CO-Glu(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-NH(CH2)5CO-
NH-)2(CH2)3 растворяли при комнатной температуре в 30 мл этанола, добавляли 5 мл циклогексена и осторожно при перемешивании 1.0 г 10% Рd/С. Полученную суспензию нагревали при перемешивании до температуры кипения и кипятили 5 ч. Реакционную смесь остужали до комнатной температуры, катализатор отфильтровывали. Растворитель упаривали, остаток промывали гексаном и диэтиловым эфиром, сушили в вакууме. Получали 1.38 г (93 %; общий выход 42 %) конечного белого кристаллического продукта, Я/0.41 (А), R/0.20 (Б), т.пл. 118-121°C, [α]25 D -30.0° (с 1; вода).
Спектр Η-ЯМР (ДMCO-d6): 1.09-1.96 (26 H, м, 2 -C13H2C7H2C5H2- Lуs, 2 - NHCH2CH2CH2CH2CH2CO-, -NHCH2CH2CH2NH-), 1.74 и 1.89 (4 H, м каждый, 2 CβH2 GIu), 2.03 (4 H, т, 2 -NHCH2CH2CH2CH2CH2CO-), 2.26 (4 H, м, 2 CγH2 GIU), 2.39 (8 H, м, 2 HOOCCH2CH2CO-), 2.74 (4 H, м, 2 CεH2 Lуs), 3.00 (8 H, м, 2 - NHCH2CH2CH2CH2CH2CO-, -NHCH2CH2CH2NH-), 4.10 (2 H, м, 2 CαH Lуs), 4.16 (2 H, м, 2 CαH GIu), 7.74 (2 H, т, -NHCH2CH2CH2NH1), 7.84 (2 H, т, 2 - NHCH2CH2CH2CH2CH2CO-), 7.94 (2 H, д, 2 NH Lуs), 8.22 (2 H, д, 2 NH GIu). 2 HOOC(CH2)2CO-, 2 -COOH GIu и 2 -NεH2 Lуs обмениваются с HDO.
Пример 8
Синтез пентаметилендиамида £иc-(./V-мoнocyкцинил-глyтaмил-лизинa) (ГK-26), тетраметилендиамида #иc-(./V-мoнocyкцинил-глyтaмил-лизинa) (ГK-2в), триметилендиамида #иc-(./V-мoнocyкцинил-глyтaмил-лизинa) (ГK-2г), этилендиамида #иc-(./V-мoнocyкцинил-глyтaмил-лизинa) (ГK-2д), (HOOC(CH2)2CO-Glu-Lys-NH-)2(CH2)n, где п: 2, 3, 4, 5 а) Получение N-мoнoбeнзилcyкцинил-γ-бeнзил-глyтaмил-Nε-(2-xлop- бeнзилoкcикapбoнил)лизинa, BzЮ-OC(CH2)2CO-Glu(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-OH
К раствору 6.55 г (18.65 ммоль) гидрохлорида 7Vε-(2-xлop- бeнзилoкcикapбoнил)-лизинa (HClxH-Lys(2-Cl-Z)-OH) в 35 мл ДМФА при температуре +5°C прибавляли раствор 4.1 мл (37.30 ммоль) N-метилморфолина в 10 мл ДМФА и раствор 9.78 г (18.65 ммоль) BzЮ-OC(CH2)2CO-Glu(OBzl)-OSu (синтез данного соединения описан в Примере 7, пункт «д») в 35 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивали 2 сут при комнатной температуре. Выпавший осадок отфильтровывали, растворитель удаляли в вакууме. К остатку добавляли 100 мл охлаждённого 10% раствора лимонной кислоты и 200 мл этилацетата. Органический слой отделяли от водного. Водную фазу дополнительно промывали этилацетатом (3 х 100 мл). Органические фазы объединяли, промывали нас. NaCl (2 х 100 мл), сушили безводным Na2SO4 и упаривали. Полученный остаток растирали с диэтиловым эфиром при комнатной температуре, при этом происходила кристаллизация продукта. Образовавшиеся кристаллы промывали эфиром и сушили в вакууме. Получали 12.43 г (92%) бледно-жёлтого кристаллического продукта с т.пл. 80-820C.
б) Получение сукцинимидного эфира N-монобензилсукцинил-γ-бензил- глyтaмил-Nε-(2-xлop-бeнзилoкcикapбoнил)лизинa, BzЮ-OC(CH2)2CO-GIu(OBzl)- Lys(2-CI-Z)-OSu
К раствору 1 1.30 г (15.60 ммоль) BzlO-OC(CH2)2CO-Glu(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-OH и 1.98 г (17.16 ммоль) N-гидроксисукцинимида в 100 мл ТГФ, охлаждённому до 00C, при интенсивном перемешивании добавляли также охлаждённый до 00C раствор 3.54 г (17.16 ммоль) ДЦГК в 20 мл ТГФ. Реакционную смесь перемешивали при 00C в течение 36 ч. Выпавший белый осадок дициклогексилмочевины отфильтровывали. Растворитель удаляли в вакууме. Образовавшуюся вязкую кристаллическую массу растворяли в 50 мл хлористого метилена, полученный раствор оставляли при температуре 00C на сутки. Образовавшийся осадок отфильтровывали. Растворитель упаривали, остаток сушили в вакууме. Получали 12.80 г (100 %) продукта в виде вязкой кристаллической массы.
в) Получение пентаметилендиамида биc-(N-бeнзилcyкцинил-γ-бeнзил-глyтaмил- Nε-(2-xлop-бeнзилoкcикapбoнил)лизинa), (BzЮ-OC(CH2)2CO-Glu(OBzl)-Lys(2-Cl- Z)-NH )2(CH2)S
К раствору 228 мг (1.95 ммоль) пентаметилендиамина в 10 мл ДМФА, охлаждённому до 00C в токе азота, при перемешивании прибавляли раствор 429 мкл (3.90 ммоль) N-метилморфолина в 5 мл ДМФА и охлаждённый раствор 3.20 г (3.90 ммоль) BzlO-OC(CH2)2CO-Glu(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-OSu в 15 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивали 1 ч при 00C и затем 24 ч при комнатной температуре. Растворитель удаляли в вакууме при температуре 25-5O0C. К маслообразному остатку добавляли при интенсивном перемешивании 50 мл охлаждённого 10% раствора лимонной кислоты. Выпавший кристаллический осадок отфильтровывали и затем промывали поочерёдно 50 мл 5% NaHCO3, водой (2 х 50 мл), ацетоном (2 х 50 мл), этилацетатом (2 х 50 мл) и диэтиловым эфиром. Кристаллы сушили в вакууме. Получали 1.71 г (51%) белого кристаллического продукта.
Спектр Η-ЯМР (DMSO-J6): 1.10-1.46 (14H, м, 2CγH2CδH2 Lуs, NHCH2CH2CH2CH2CH2NH), 1.48 и 1.60 (4H, два м, 2CβH2 Lуs), 1.76 и 1.92 (4H, два м, 2CβH2 GIu), 2.38 (4H, м, 2CγH2 GIU), 2.49 и 2.54 (8H, два м, 2COCH2CH2CO), 2.96 (8H, м, 2CεH2 Lуs, NHCH2CH2CH2CH2CH2NH), 4.12 (2H, м, 2CαH Lуs), 4.26 (2H, м, 2CαH GIu), 5.04 (4H, с, 2OCH2C6H5 Lуs), 5.07 (8H, с, 2OCH2C6H5 GIu, 2C6H5CH2OOCCH2CH2CO), 7.25-7.48 (28H, м, 4C6H5, 2C6H4Cl), 7.43 (2H, т, 2NεH Lуs), 7.74 (2H, т, NHCH2CH2CH2CH2CH2NH), 7.83 (2H, д, 2NH Lуs), 8.15 (2H, д, 2NH GIu).
г) Получение пентаметиледиамида биc-(N-мoнocyкцинил-глyтaмил-лизинa), (HOOC(CH2)2CO-Glu-Lys-NH-)2(CH2)5 (ГK-2б)
1.65 г (0.97 ммоль) (HOOC-(CH2)2-CO-Glu(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-NH-)2(CH2)6 растворяли при комнатной температуре в 30 мл этанола, добавляли 5 мл циклогексена и осторожно при перемешивании 1 г 10% Рd/С. Полученную суспензию нагревали при перемешивании до температуры кипения и кипятили 5 ч. Реакционную смесь охлаждали до комнатной температуры, катализатор отфильтровывали. Растворитель упаривали, остаток промывали гексаном и диэтиловым эфиром и высушивали в вакууме. Получали 777 мг (98%; общий выход 40%) зеленоватого твердого вещества, расплывающегося на воздухе, R/ 0.41 (A), Rf 0.20 (Б), [α]25o -35.2° (с 0.5; вода- метанол, 1 :1).
Спектр Η-ЯМР (ДMCOч/6): 1.10-1.70 (18 H, м, 2 -C13H2C7H2C5H2- Lуs, - NHCH2CH2CH2CH2CH2NH-), 1.73 и 1.88 (2 H, м каждый, 2 CβH2 GIu), 2.26 (4 H, м, 2 CγH2 GIu), 2.40 (8 H, м, 2 HOOCCH2CH2CO-), 2.74 (4 H, м, 2 C6H2 Lуs), 3.00 (4 H, м, - NHCH2CH2CH2CH2CH2NH-), 4.08 (2 H, м, 2 CαH Lуs), 4.18 (2 H, м, 2 CαH GIu), 7.73 (2 H, т, -NHCH2CH2CH2CH2CH2NH-), 7.95 (2 H, д, 2 NH Lуs), 8.26 (2 H, д, 2 NH GIu). 2 HOOC(CH2)2CO- и 2 -COOH GIu обмениваются с HDO.
Для синтеза ГK-2в, ГK-2г, ГK-2д брали по 3.20 г (3.90 ммоль) BzIO- OC(CH2)2CO-Glu(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-OSu на каждый синтез и 1.95 ммоль тетраметилендиамина, пропилендиамина, этилендиамина соответственно. Все соединения синтезировали по методике, описанной для ГK-26. Тетраметилендиамид биc-(N-мoнocyкцинил-глyтaмил-лизинa), (HOOC(CH2)2CO- Glu-Lys-NH-)2(CH2)4 (ГK-2в)
Белое твердое вещество, расплывающееся на воздухе, Rf OAl (A), R/ 0.20 (Б),
[α]25 D -33.3° (c l.0; вoдa).
Спектр Η-ЯМР (ДМСОчfc): 1.10-1.70 (16 H, м, 2 -C13H2C1H2C8H2- Lуs, - NHCH2CH2CH2CH2NH-), 1.73 и 1.89 (4 H, м каждый, 2 CβH2 GIu), 2.26 (4 H, м, 2 CγH2 GIu), 2.40 (8 H, м, 2 HOOCCH2CH2CO-), 2.74 (4 H, м, 2 C6H2 Lуs), 3.02 (4 H, м, - NHCH2CH2CH2CH2NH-), 4.09 (2 H, м, 2 CαH Lуs), 4.18 (2 H, м, 2 CαH GIu), 7.80 (2 H, т, -NHCH2CH2CH2CH2NH-), 7.93 (2 H, д, 2 NH Lуs), 8.21 (2 H, д, 2 NH GIu). 2 HOOC(CH2)2CO-, 2 -COOH и 2 N8H2 Lуs обмениваются с HDO.
Триметилендиамид биc-(N-мoнocyкцинил-глyтaмил-лизинa), (HOOC(CH2)2CO- Glu-Lys-NH-)2(CH2)з (ГK-2г)
Белое твердое вещество, расплывающееся на воздухе, R/ 0.41 (A), R/ 0.20 (Б),
[α]25 D -35.2° (с 0.5; вода-метанол, 1 :1).
Спектр Η-ЯМР (ДМСО-ύfe): 1.11-1.70 (14 H, м, 2 -C13H2C7H2C8H2- Lуs, - NHCH2CH2CH2NH-), 1.75 и 1.88 (4 H, м каждый, 2 CβH2 GIu), 2.26 (4 H, м, 2 CΗ2 GIU), 2.39 (8 H, м, 2 HOOCCH2CH2CO-), 2.75 (4 H, м, 2 C8H2 Lуs), 3.02 (4 H, м, - NHCH2CH2CH2NH-), 4.11 (2 H, м, 2 CαH Lуs), 4.15 (2 H, м, 2 CαH GIu), 7.84 (2 H, т, - NHCH2CH2CH2NH-), 7.96 (2 H, д, 2 NH Lуs), 8.25 (2 H, д, 2 NH GIu). 2 HOOC(CH2)2CO-, 2 -COOH и 2 N8H2 Lуs обмениваются с HDO.
Этилендиамид биc-(N-мoнocyкцинил-глyтaмил-лизинa), (HOOC(CH2)2CO-GIu- Lys-NH-)2(CH2)2 (ГK-2д)
Твердое серое вещество, расплывающееся на воздухе, R/ 0 Al (A), R/ 0.20 (Б),
[α]25D -31.6° (с 0.5; вода-метанол, 1 :1).
Спектр Η-ЯМР (ДMCO-4,): 1.10-1.70 (12 H, м, 2 -C13H2C7H2C8H2- LyS), 1.73 и 1.88 (4 H, м каждый, 2 C13H2 GIu), 2.26 (4 H, м, CγH2 GIu), 2.39 (8 H, м, 2 HOOCCH2CH2CO-), 2.75 (4 H, м, 2 C8H2 Lуs), 3.10 (4 H, м, -NHCH2CH2NH-), 4.1 1 (2 H, м, 2 CαH Lуs), 4.18 (2 H, м, 2 CαH GIu), 7.84 (2 H, т, -NHCH2CH2NH-), 7.96 (2 H, д, 2 NH Lуs), 8.24 (2 H, д, 2 NH GIu). 2 HOOCCH2CH2CO-, 2 -COOH и 2 N8H2 Lуs обмениваются с HDO.
Пример 9
Синтез vY-ацетил-глицил-лизил-D-аминомасляной кислоты, CH3CO-Gly-Lys-NH(CH2)зCOOH (ГK-7) а) Получение тозилата бензилового эфира γ-аминомасляной кислоты, TsOHxH- NH(CH2)3CO-OBz Раствор 10.32 г. (0.10 моль) γ-аминомасляной кислоты, 20.93 г (0.11 моль) моногидрата о-толуолсульфокислоты и 50 мл (0.48 моль) бензилового спирта в 100 мл бензола кипятили при перемешивании с обратным холодильником в течение 5 ч до прекращения выделения воды, при этом выделилось воды ~ 4 мл (использовали насадку Дина-Старка). Раствор остужали и добавляли 200 мл диэтилового эфира, при этом выпадал осадок. Смесь оставляли на ночь при +5°C. Выпавшие кристаллы отфильтровывали от маточного раствора, промывали диэтиловым эфиром (2 х 200 мл). Осадок растворяли в 500 мл кипящего этилацетата. Полученный горячий раствор остужали в течение 4 ч при комнатной температуре и оставляли на ночь при +5°C. Выпавшие кристаллы отфильтровывали, промывали 200 мл холодного этилацетата и 200 мл диэтилового эфира. Высушивали в вакууме при температуре 400C. Получали 35.85 г (98 %) продукта в виде кристаллов. Т.пл. 1050C.
Спектр Η-ЯМР (ДМСО-flfe): 1.80 (2 H, м, -NHCH2CH2CH2CO-), 2.28 (3 H, с, -CH3 TsOH), 2.48 (2 H, т, -NHCH2CH2CH2CO-), 2.82 (2 H, м, -NHCH2CH2CH2CO-), 5.10 (2 H, с, -OCH2C6H5), 7.12 и 7.49 (4 H, м, -C6H4- TsOH), 7.36 (5 H, м, -OCH2C6H5), 7.67 (3 H, ш.с, NH3 +). б) Получение пентафторфенилового эфира N-трет-бутилоксикарбонил-глицина, Вос-Glу-ОРfр
К раствору 17.52 г (0.10 моль) Вос-Glу-ОН и 20.25 г (0.1 1 моль) пентафторфенола в 250 мл ТГФ, охлаждённому до 00C, при перемешивании по каплям добавляли раствор 21.70 г (0.1 1 моль) ДЦГК в 50 мл ТГФ в течение 10 мин. Раствор оставляли перемешиваться на 1 ночь на ледяной бане. Выпавший белый осадок дициклогексилмочевины отфильтровывали, промывали ТГФ (2 х 100 мл). Собранный фильтрат упаривали, остаток растворяли в 150 мл диэтилового эфира. Раствор выдерживали при +4°C в течение 4 ч и снова профильтровывали от остатков выпавшего осадка дициклогексилмочевины, после чего упаривали не досуха до состояния жидкого масла. Полученный остаток растворяли в 300 мл кипящего гексана, раствор оставляли на 2 ч при комнатной температуре, а затем при +5°C на 1 ночь. Выпавшие кристаллы отфильтровывали, промывали холодным гексаном (2 х 150 мл), сушили в вакууме при 500C в течение 4 ч. Получали 35.53 г (92 %) продукта. Спектр 1H-ЯMP (ДMCO-d6): 1.37, 1.40 (9 H, два с, (CH3)3CO-), 4.12 и 4.15 (2 H, два д, CH2 GIy), 7.17 и 7.56 (1 H, два т, NH GIy). в) Получение пентафторфенилового эфира N-тpeт-бyтилoкcикapбoнил-ND- бензилоксикарбонил-лизина, Boc-Lys(Z)-OPfp
Получение аналогично Вос-Glу-ОРfр (Пример 9, пункт «б»). Из 38.04 г (0.10 моль) Boc-Lys(Z)-OH и 20.25 г (0.11 моль) пентафторфенола получили 51.92 г (95%) продукта с т.пл. 76-77°C. г) Получение бензилового эфира N-тpeт-бyтилoкcикapбoнил-Nε- бензилоксикарбонил-лизил-γ-аминомасляной кислоты, Boc-Lys(Z)-NH(CH2)зCO- OBzI
К раствору 8.75 г (16.02 ммоль) Boc-Lys(Z)-OPfp и 6.29 г (17.20 ммоль)
TsOHxH-NH(CH2)3CO-OBzl в 70 мл ДМФА при перемешивании по каплям добавляли 2.5 мл (14.30 ммоль) ДИЭА в течение 5 мин. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре 3 ч. Затем раствор переносили в делительную воронку и добавляли 300 мл воды, 100 мл этилацетата и 50 мл диэтилового эфира. После экстракции отделяли органический слой, промывали его 5% H2SO4, нас. Na2SO4, 5% NaHCO3, нас. Na2SO4, сушили безводным Na2SO4 и упаривали. Полученное масло в течение 2-х дней закристаллизовалось. Кристаллы промывали гексаном (2 х 100 мл) и сушили в вакууме. Получали 8.10 г (91%) продукта с т.пл.77°C.
Спектр 1H-ЯMP (ДМСО-βfe): 1.10-1.57 (6 H, м, -C13H2^H2C8H2- Lуs), 1.66 (2 H, м, - NHCH2CH2CH2CO-), 3.35 (2 H, т, -NHCH2CH2CH2CO-), 2.96 (2 H, м, CΗ2 Lуs), 3.07 (2 H, м, -NHCH2CH2CH2CO-), 3.78 (1 H, м, CαH Lуs), 4.99 (2 H, с, -CO-OCH2C6H5 Lys(Z)), 5.07 (2 H, с, -OCH2C6H5), 6.76 (1 H, д, NH Lуs), 7.21 (1 H, т, NεH Lуs), 7.34 (10 H, м, -CO-OCH2C6H5 LyS(Z), -OCH2C6H5), 7.80 (1 H, т, -NHCH2CH2CH2CO-). д) Получение гидрохлорида бензилового эфира ND-бeнзилoкcикapбoнил-лизил-γ- аминомасляной кислоты, HClxLys(Z)-NH(CH2)зCO-OBzl
К раствору 3.23 г (5.80 ммоль) Boc-Lys(Z)-NH(CH2)3CO-OBzl в 5 мл диоксана прибавляли 20 мл 4 M НСl/Diохапе. Через 30 мин реакционную массу упаривали в вакууме, остаток растирали с 70 мл диэтилового эфира. Полученную смесь оставляли при +5°C на 4 ч, затем кристаллический осадок отфильтровывали, промывали холодным диэтиловым эфиром (2 х 50 мл) и сушили в вакууме при 500C в течение 3 ч. Получали 2.84 г (99 %) продукта с т.пл.113-114°C.
Спектр 1H-ЯMP (ДMCO-</6): 1.25 (2 H, м, CγH2 Lуs), 1.39 (2 H, м, C5H2 Lуs), 1.70 (4 H, м, CβH2 Lуs, -NHCH2CH2CH2CO-), 2.40 (2 H, т, -NHCH2CH2CH2CO-), 2.96 (2 H, м, CεH2 Lуs), 3.13 (2 H, м, -NHCH2CH2CH2CO-), 3.66 (1 H, м, CαH Lуs), 5.00 и 5.08 (4 H, два с, 2 -OCH2C6H5), 7.23 (1 H, т, NεH Lуs), 7.35 (10 H, м, -CO-OCH2C6H5 Lys(Z), - OCH2C6H5), 8.17 (3 H, м, NH3 + Lуs), 8.55 (1 H, т, -NHCH2CH2CH2CO-). е) Получение трифторацетата бензилового эфира глицил-Nε- бензилоксикарбонил-лизил-γ-аминомасляной кислоты, TFAxH-Gly-Lys(Z)- NH(CH2)3CO-OBzl
К раствору 2.05 г (6.00 ммоль) Вос-Glу-ОРfр и 2.73 г (5.55 ммоль) HCIxH- Lys(Z)-NH(CH2)3CO-OBzl в 30 мл ТГФ и 15 мл ДМФА добавляли 1.4 мл (8.00 ммоль)
ДИЭА. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре 4 ч. Затем к раствору добавляли 0.2 мл (2.00 ммоль)
Figure imgf000039_0001
перемешивали ещё 20 мин и упаривали наполовину. Реакционную массу переносили в делительную воронку, добавляли 100 мл воды и 100 мл этилацетата. После экстракции отделяли органический слой и поочерёдно промывали его 5% H2SO4, нас. Na2SO4, 5% NaHCO3 и нас. Na2SO4, затем сушили безводным Na2SO4 и упаривали. Полученную затвердевшую аморфную массу растворяли в 50 мл TFA. Через 30 мин раствор упаривали, остаток растирали с 50 мл диэтилового эфира. Полученную смесь оставляли в при +5°C на 4 ч, затем кристаллический осадок отфильтровывали, промывали холодным эфиром (2 х 50 мл) и сушили в вакууме при 500C в течение 3 ч. Получали 3.24 г (93%) продукта. ж) Получение бензилового эфира N-aцeтил-глицил-Nε-бeнзилoкcикapбoнил- лизил-γ-аминомасляной кислоты, CHзCO-Gly-Lys(Z)-NH(CHг)зCO-OBzI
К раствору 0.50 г (4.34 ммоль) JV-гидроксисукцинимида в 10 мл ТГФ прибавляли 0.4 мл (4.00 ммоль) уксусного ангидрида, после чего перемешивали 2 ч. Затем к раствору добавляли ещё 10 мл ДМФА, а затем 1.68 г (2.68 ммоль) TFAχH- Gly-Lys(Z)-NH(CH2)3CO-OBzl и 1 мл (5.70 ммоль) ДИЭА. Реакционную смесь перемешивали 2 ч, затем переносили в делительную воронку, добавляли 100 мл воды и 100 мл этилацетата. После экстракции отделяли органический слой и поочерёдно промывали его 5% H2SO4, нас. Na2SO4, 5% NaHCO3 и нас. Na2SO4, затем сушили безводным Na2SO4 и упаривали. Остаток растворяли в смеси 5 мл этилацетата и 0.5 мл метанола и хроматографировали на колонке со 100 г силикагеля (Siliса gеl 60, 230- 400 mеsh ASTM), элюируя смесью этилацетата и метанола. Продукт элюировался в смеси этилацетат-метанол (9:1). Собранный раствор упаривали, твёрдый остаток растирали с 40 мл диэтилового эфира, отфильтровывали, промывали холодным эфиром (2 х 50 мл), сушили в вакууме при 500C в течение 3 ч. Получали 1.40 г (92 %) белого кристаллического вещества с т.пл. 139-1400C.
Спектр Η-ЯМР (ДMCO-d6): 1.22-1.66 (6 H, м, -CPH2C7H2C5H2- Ly s), 1.66 (2 H, м, - NHCH2CH2CH2CO-), 2.35 (2 H, м, -NHCH2CH2CH2CO-), 2.94 (2 H, м, C6H2 Lуs), 3.06 (2 H, м, -NHCH2CH2CH2CO-), 3.68 (2 H, д, CH2 GIy), 4.13 (1 H, м, CαH Lуs), 4.99 (2 H, с, - CO-OCH2C6H5 Lys(Z)), 5.07 (2 H, с, -OCH2C6H5), 7.20 (1 H, т, NεH Lуs), 7.33 (10 H, м, - CO-OCH2C6H5 Lys(Z), -OCH2C6H5), 7.88 (1 H, т, -NHCH2CH2CH2CO-), 7.94 (1 H, д, NH Lуs), 8.10 (I H, т, NH GIy). з) Получение N-ацетил-глицил-лизил-γ-аминомасляной кислоты, CH3CO-Gly-Lys-NH(CH2)3COOH (ГK-7)
1.27 г (2.40 ммоль) CH3CO-Gly-Lys(Z)-NH(CH2)3COOBzl растворяли в смеси 15 мл метанола, 1 мл воды и 2 мл уксусной кислоты. К раствору добавляли 1 г 10% Рd/С, суспендированный в 5 мл метанола, и 4 мл (39.49 ммоль) циклогексена. Реакционную массу кипятили при перемешивании с обратным холодильником в течение 30 мин. После охлаждения катализатор отфильтровывали, промывали метанолом (2 х 10 мл). Собранный фильтрат упаривали, полученное масло растворяли в 50 мл воды. Водный раствор промывали 50 мл этилацетата, после чего водный слой упаривали, остаток растворяли в 25 мл уксусной кислоты и упаривали. Полученное масло сушили в вакууме. Получали 882 мг (94%, общий выход 71%) белого твердого вещества с т.пл. 198-2020C. Ci4H26N4O5.
Спектр 1H-ЯMP (ДMCO-</6): 1.26 (2 H, м, CγH2 Lуs), 1.48 (2 H, м, C5H2 Lуs), 1.62 (2 H, м, -NHCH2CH2CH2COOH), 1.78 (2 H, м, CβH2 Lуs), 1.85 (3 H, с, CH3CO-), 2.08 (2 H, м, -NHCH2CH2CH2COOH), 2.69 (2 H, м, CεH2 Lуs), 2.91 и 3.10 (2 H, м, - NHCH2CH2CH2COOH), 3.70 (2 H, д, CH2 GIy), 4.13 (1 H, м, CαH Lуs), 8.10 (1 H, д, NH Lуs), 8.31 (1 H, т, -NHCH2CH2CH2COOH), 8.40 (1 H, т, NH GIy).
Пример 10
Синтез ΛyV-aдипинил-#иc-(глицил-лизил-γ-aминoмacлянoй кислоты), Ad(-Gly-
Lys-NH(CH2)3COOH)2 (ГK-8) а) Получение ди-N-оксисукцинимидного эфира адипиновой кислоты,
(CHz)4(COOSu)2
К раствору 7.31 г (50.00 ммоль) адипиновой кислоты и 13.81 г (120.00 ммоль)
7V-rидpoкcиcyкцинимидa в 200 мл ТГФ при охлаждении до 00C добавляли раствор 22.70 г (110.00 ммоль) ДЦГК в 50 мл метиленхлорида. Реакционную смесь оставляли перемешиваться на 1 ночь на ледяной бане. Затем реакционную смесь отфильтровывали от выпавшего осадка дициклогексилмочевины, полученный раствор упаривали до получения кристаллической массы. Так как масса осадка после фильтрования превысила расчетную массу для дициклогексилмочевины, то его перемешивали с 200 мл ДМФА и отфильтровывали в колбу с полученным кристаллическим остатком, дополнительно отделяя продукт от остатков дициклогексилмочевины. При этом практически весь кристаллический остаток растворялся в диметилформамидном фильтрате. Полученный диметилформамидный раствор еще раз отфильтровывали от небольшого количества дициклогексилмочевины, упаривали и полученную кристаллическую массу растирали со смесью 200 мл этилацетата и 100 мл ТГФ, при этом примесь N- гидроксисукцинимида переходила в раствор. Кристаллический продукт отфильтровывали, промывали 150 мл этилацетата, диэтиловым эфиром (2 х 150 мл), сушили в вакууме при 500C в течение 4 ч. Получали 12.92 г (76 %) продукта.
б) Получение N-aдипинил-биc-(бeнзилoвoгo эфира глицил-Nε- бензилоксикарбонил-лизил-γ-аминомасляной кислоты), Ad(-Gly-Lys(Z)- NH(CH2)3COOBzl)2
К раствору 375 мг (1.10 ммоль) (CH2)4(COOSu)2 и 1.50 г (2.39 ммоль) TFAxH-
Gly-Lys(Z)-NH(CH2)3CO-OBzl (получение соединения описано в Примере 9, пункт «e») в 25 мл ДМФА прибавляли 3 мл (2.73 ммоль) N-метилморфолина. Реакционную смесь перемешивали в течение 2 ч. Затем полученный раствор профильтровывали, упаривали до состояния жидкого масла (~ на 2/3) и к остатку добавляли 100 мл 1 н. HCl. Полученный осадок последовательно промывали 50 мл 1 н. HCl, водой (2 х 50 мл), этилацетатом (2 х 50 мл) и диэтиловым эфиром (2 х 50 мл), после чего сушили в вакууме при 500C 4 ч. Полученный остаток растворяли в смеси 15 мл хлороформа и 2 мл метанола и наносили на слой силикагеля (Siliса gеl 60, 230-400 mеsh ASTM) на фильтре (объём 100 мл), используя в качестве элюента смесь хлороформ-метанол- уксусная кислота (20:2: 1). Соответсвующую фракцию (500 мл) упаривали, твёрдый остаток растирали с 50 мл диэтилового эфира, отфильтровывали и промывали эфиром (2 х 50 мл). Получали 1.20 г (94 %) продукта с т.пл. 186-187°C.
Спектр Η-ЯМР (ДMCO-J6): 1.15-1.45 (12 H, м, 2 -C13H2C7H2C5H2- Lуs), 1.45 (8 H, м, (CH2)4 Ad), 1.65 (4 H, м, 2 -NHCH2CH2CH2CO-), 2.10 (4 H, м, 2 CεH2 Lуs), (4 H, т, 2 - NHCH2CH2CH2CO-), 3.06 (4 H, м, NHCH2CH2CH2CO), 3.68 (4 H, д каждый, 2 CH2 GIy), 4.12 (2 H, м, 2 CαH Lуs), 4.98 (4 H, с каждый, 2 -CO-OCH2C6H5 Lys(Z)), 5.07 (4 H, с каждый, 2 -CH2C6H5), 7.21 (2 H, т каждый, 2 NεH Lуs), 7.27-7.37 (20 H, м, 2 -CO- OCH2C6H5 Lys(Z), 2 -CH2C6H5), 7.91 (2 H, т каждый, 2 -NHCH2CH2CH2CO-), 7.94 (2 H, д каждый, 2 NH Lуs), 8.05 (2 H, т каждый, 2 NH GIy).
в) Получение N-aдипинил-биc-(глицил-лизил-П-aминoιиacлянoй кислоты), Ad (- Gly-Lys-NH(CH2)3COOH)2 (ГK-8)
1.16 г (1.00 ммоль) Ad(-Gly-Lys(Z)-NH(CH2)3COOBzl)2 растворяли в смеси 20 мл метанола, 1 мл воды и 5 мл уксусной кислоты, к раствору добавляли 1 г 10% Рd/С, суспендированного в 5 мл метанола, и 4 мл (39.49 ммоль) циклогексена. Реакционную смесь нагревали при перемешивании и кипятили с обратным холодильником 30 мин. После охлаждения катализатор отфильтровывали, промывали метанолом (3 x 10 мл) и смесью вода-уксусная кислота 1:1 (3 х 10 мл). Собранный фильтрат упаривали, полученное масло растворяли в смеси 50 мл воды и 5 мл уксусной кислоты. Полученный раствор промывали 50 мл этилацетата, упаривали, остаток растворяли в 25 мл уксусной кислоты и повторно упаривали, полученное масло сушили в вакууме. Получали 0,76 г (94%, общий выход 67%) маслообразного продукта в виде диацетата. Спектр Η-ЯМР (ДМСО-йfe): 1.16-1.77 (20 H, м, 2 -CPH2C7H2C5H2- Lуs, - COCH2CH2CH2CH2CO-, 2 -NHCH2CH2CH2CO-), 1.83 (6 H, с, 2 CH3COOH), 2.13 (8 H, м, 2 -NHCH2CH2CH2CO-, -COCH2CH2CH2CH2CO-), 2.72 (4 H, м, 2 CΗ2 Lуs), 3.00 (4 H, м, 2 -NHCH2CH2CH2CO-), 3.70 (4 H, д, 2 CH2 GIy), 4.32 (2 H, м, 2 CαH Lуs), 8.10 (2 H, т, 2 -NHCH2CH2CH2CO-), 8.1 1 (2 H, д, 2 NH Lуs), 8.33 (2 H, т, 2 NH GIy).
Пример 11
Синтез амида N-моносукцинил-серил-лизина, HOOC(CH2)2CO-Ser-Lys-NH2
(ГCБ-104) а) Получение амида N-тpeт-бyтилoкcикapбoнил-Nε-(2-xлop- бeнзилoкcикapбoнил)-лизинa, Boc-Lys(2-Cl-Z)-NHг
К раствору 1.5 г (3.62 ммоль) Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH в 10 мл ДМФА при -100C последовательно добавляли 0.34 мл (3.62 ммоль) N-метилморфолина, а затем 0.52 мл (3.62 ммоль) изобутилхлорформиата, поддреживая в процессе каждого прибавления температуру не выше -5°C. После этого приливали 10 мл ДМФА, насыщенного аммиаком (рН 8). Реакционную массу перемешивали 1 час при -10°C и ещё час при комнатной температуре. Растворитель удаляли в вакууме, остаток растворяли в 30 мл хлороформа и поочерёдно промывали водой, 5% NaHCO3, 1 н. HCl и снова водой. Затем раствор упаривали и сушили в вакууме. Получали 1.3 г (87%) белого порошка, Rf 0.49 (В), т.пл. 105-106°C, [α]20 D-8.5° (с 0.4; хлороформ).
Спектр Η-ЯМР (ДMCO-J6): 1.36 (9H, с, -CO-OC(CH3)3), 1.17-1.65 (6H, м, - C13H2C1H2C5H2- Lуs), 2.97 (2H, м, C6H2 Lуs), 3.80 (IH, м, CαH Lуs), 5.07 (2H, с, -CO- OCH2C6H4Cl), 6,73 (IH, д, NH Lуs), 6.96 и 7.25 (2H, два с, NH2 амид), 7.37 (IH, т, NεH Lуs), 7.30-7.50 (4H, м, -CO-OCH2C6H4Cl).
б) Получение трифторацетата амида Nε-(2-xлop-бeнзилoкcикapбoнил) ιлизина TFA х H-Lys(2-Cl-Z)-NH2 Раствор 400 мг Boc-Lys(2-Cl-Z)-NH2 в 3 мл TFA и 3 мл дихлорметана перемешивали 30 мин при комнатной температуре. Затем растворитель удаляли в вакууме, после чего остаток дважды упаривали с 10 мл эфира и высушивали в вакууме. Получали 410 мг (99%) продукта в виде трифторацетатной соли, т.пл. 67- 71°C.
Спектр Η-ЯМР (ДMCO-J6): 1.31 (2H, м, CΗ2 Lуs), 1.40 (2H, м, C5H2 Lуs), 1.70 (2H, м, CβH2 Lуs), 2.99 (2H, м, C8H2 Lуs), 3.68 (IH, м, CαH Lуs), 5.08 (2H, с, -CO-OCH2C6H4Cl), 7.31-7.52 (4H, м, -CO-OCH2C6H4Cl), 7.57 и 7.88 (2H, два с, NH2 амид), 8.09 (ЗН, с, NH3 +LyS).
в) Получение амида N-тpeт-бyтилoкcикapбoнил-0-бeнзил-cepил-Nε-(2-xлop- бeнзилoкcикapбoнил)лизинa, Boc-Ser(OBzl)-Lys(2-CI-Z)-NH2
К раствору 240 мг (0.82 ммоль) Boc-Ser(OBzl)-OH и 532,2 мг (0.90 ммоль)
PyBOP в 10 мл ДМФА прибавляли 0.43 мл (2.46 ммоль) ДИЭА. Полученный раствор прибавляли к раствору 350 мг (0.82 ммоль) TFA х H-Lys(2-Cl-Z)-NH2 в 10 мл ДМФА. Полученный раствор оставляли на 1 ночь. Затем в реакционную смесь добавляли 0.5 мл ДЭТМДА и перемешивали в течение 30 мин. Полученную реакционную массу разбавляли 200 мл этилацетата и поочерёдно промывали водой, 2% H2SO4 , 3% K2CO3 и нас. NaCl, сушили безводным MgSO4. Затем растворитель удаляли в вакууме, остаток сушили в вакууме. Получили 0.51 г белого порошка, в котором методами ВЭЖХ были обнаружены два компонента Rf 0.35 и Я/0.40 (Г). После разделения на ВЭЖХ получали 330 мг (68.2%) конечного продукта в виде белого порошка, Rf 0.35 (Г), т.пл. 127-129°C, [α]20 D -2.5° (с 0.4; ДМФА).
Спектр Η-ЯМР (ДMCO-J6): 1.15-1.85 (6H, м, -C13H2C1H2C8H2- Lуs), 1.37 (9H, с, -CO- OC(CH3)3), 2.93 (2H, м, C6H2 Lуs), 3.58 (2H, м, CβH2 Sеr), 4.17 (IH, м, CαH Lуs), 4.21 (IH, м, CαH Sеr), 4.46 (2H, с, -CH2C6H5 Ser(OBzl)), 5.06 (IH, с, -CO-OCH2C6H4Cl), 7.05 (IH, д, NH Sеr), 7.09 и 7.25 (2H, два с, NH2 амид), 7.2-7.5 (9H, м, -CH2C6H5 Ser(OBzl), - CO-OCH2C6H4Cl), 7.45 (IH, т, NεH Lуs), 7.87 (IH, д, NH Sеr).
г) Получение трифторацетата амида 0-бeнзил-cepил-Nε-(2-xлop- бeнзилoкcикapбoнил)лизинa, TFA х H-Ser(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-NH2
Раствор 287 мг (0.5 ммоль) Boc-Ser(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-NH2 в 2 мл TFA перемешивали 30 минут, затем упаривали. Остаток криталлизовали с эфиром. Получали 265 мг (90 %) продукта в виде белых кристаллов, Rf 0.03 (Г), т.пл. 153- 155°C, [α]20D +6.25° (с 0.4; ДМФА). Спектр Η-ЯМР (ДМСО-йfe): 1.27 (2H, м, CγH2 Lуs), 1.39 (2H, м, C5H2 Lуs), 1.54 и 1.65
(2H, м, CβH2 Lуs), 2.97 (2H, м, CεH2 Lуs), 3.67 и 3.74 (2H, два дд, CβH2 Sег), 4.11 (IH, м, CαH Sег), 4.24 (IH, м, CαH Lуs), 4.54 (2H, с, -CH2C6H5 Ser(OBzl)), 5.07 (2H, с, -CO- OCH2C6H4Cl), 7.14 и 7.45 (9H, м, -CH2C6H5 Ser(OBzl)), -CO-OCH2C6H4Cl), 7.35 (IH, т, NεH Lуs), 8.25 (ЗН, ушир. с, NH3 + Sег), 8.57 (IH, д, NH Lуs).
д) Получение амида N-мoнocyкцинил-0-бeнзил-cepил-Nε-(2-xлop- бeнзилoкcикapбoнил)лизинa, HOOC(CH2)2CO-Ser(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-NH2
К раствору 240 мг (0.40 ммоль) TFAχH-Seг(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-NH2 в 4 мл
ДМФА прибавляли 0.06 мл (0,44 ммоль) ТЭА. Через 15 минут перемешивания прибавляли 60 мг (1.2 ммоль) янтарного ангидрида. Реакционную массу перемешивали 1 ночь, по исчезновению исходного соединения (TCX контроль) реакционную массу заливали 25 мл воды. Выпавший белый осадок отфильтровывали, промывали водой, высушивали. Получали 207 мг (88%) продукта, т.пл. 158-166 С, Rf 0.28 (В).
Спектр Η-ЯМР (ДMCO-t/6): 1.25 (2H, м, CγH2 Lуs), 1.35 (2H, м, C5H2 Lуs), 1.52 и 1.68 (2H, два м, CβH2 Lуs), 2.41 (4H, м, HOOCCH2CH2CO-), 2.94 (2H, м, CεH2 Lуs), 3.58 и 3.60 (2H, два дд, CβH2 Sег), 4.13 (IH, м, CαH Lуs), 4.47 (IH, м, CαH Sег), 4.48 (2H, с, - CH2C6H5 Ser(OBzl)), 5.07 (2H, с, -CO-OCH2C6H4Cl), 7.06 и 7.14 (2H, два с, NH2 амид), 7.20-7.50 (9H, м, -CH2C6H5 Ser(OBzl), -CO-OCH2C6H4Cl), 7.34 (IH, т, NεH Lуs), 7.92 (IH, д, NH Lуs), 8.25 (IH, д, NH Sег).
е) Получение амида N-моносукцинил-серил-лизина, HOOC(CH2)2CO-Ser-Lys- NH2 (ГCБ-104)
К раствору 180 мг (0.30 ммоль) HOOC(CH2)2CO-Ser(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-NH2 в
10 мл ДМФА присыпали 180 мг 10%-нoгo Рd/С и перемешивали в атмосфере водорода до исчезновения исходного соединения (ТСХ-контроль) в течение двух суток. Затем катализатор отфильтровывали, фильтрат упаривали. Получали 95 мг (100%, общий выход 51.7 %) продукта в виде гигроскопичного порошка, i?/0.11 (Д), RfO (В), [α]D 20- 15.75° (с 0.4; ДМФА).
Спектр Η-ЯМР (ДMCO-d6): 1.29 (2H, м, CγH2 Lуs), 1.79 (2H, м, CβH2 Lуs), 2.03 (2H, м, C8H2 Lуs), 2.51 (2H, дд, HOOCCH2CH2CO-), 2.68 (2H, дд, HOOCCH2CH2CO-), 3.91 И 4.16 (2H, два дд, CβH2 Sег), 4.53 (IH, м, CαH Lуs), 4.62 (IH, м, CαH Sег), 4.78 (IH, с, - COOH Sег), 7.21 (2H, с, NH2 амид), 8.31-8.35 (5H, м, N6H3 + Lуs, NH Sег, NH Lуs). Пример 12
Синтез rескаметилендиамида #иc-(7V-мoнocyкцинил-cepил-лизинa), (HOOC(CH2)2CO-Ser-Lys-NH-)2(CH2)б (ГCБ-106) а) Получение пентафторфенилового эфира N-тpeт-бyтилoкcикapбoнил-Nε-(2- xлop-бeнзилoкcикapбoнил)лизинa, Boc-Lys(2-Cl-Z)-OPfp
В раствор 7.6 г (17 ммоль) Boc-Lys(2-Cl-Z)-OH в 80 мл тетрагидрофурана добавляли 3.33 г (18 ммоль) пентафторфенола, после чего раствор охлаждали до -5 С и постепенно вводили раствор 3.50 г (17 ммоль) ДЦГК в 20 мл ТГФ, следя за тем, чтобы температура не превышала О С. Затем реакционную массу перемешивали 3 часа при -5 С и оставляли на ночь при +4 С. Выпавший белый осадок ДЦГМ отфильтровывали, фильтрат упаривали, оставшееся масло кристаллизовали из смеси этилацетат-гексан (15 мл к 80 мл). Выпавшие кристалы отфильтровывали, промывали гексаном и сушили в вакууме. Масса полученного продукта 7.18 г. Маточный раствор также упаривался и перекристаллизовывался из смеси этилацетат-гексан (5 мл к 50 мл). Масса дополнительно полученного продукта составлиа 1.05 г. Общий выход продукта 8.23 г (89%), Rf 0.42 (E), Rf 0.13 (Ж), т.пл. 134-135°C, [α]D 20 - 25.75° (с 0.4; ДМФА).
Спектр Η-ЯМР (ДMCO-40: 1.29 (2H, м, CγH2 Lуs), 1.42 (9H, с, -CO-OC(CH3)3), 1.55 (2H, м, C8H2 Lуs), 1.78 (2H, м, CβH2 Lуs), 4.42 (IH, м, CαH Lуs), 5.34 (2H, с, -CO- OCH2C6H4Cl), 6.76 (IH, д, NH Lуs), 7.05-7.20 (4H, м, -CO-OCH2C6H4Cl), 7.39 (IH, т, NεH Lуs).
б) Получение гексаметилендиамида биc-(тpeт-бyтилoкcикapбoнил-Nε-(2-xлop- бeнзилoкcикapбoнил)лизинa), (Boc-Lys(2-Cl-Z)-NH-)2(CH2)б
К раствору 2 г (3.66 ммоль) Boc-Lys(2-Cl-Z)-OPfp в 20 мл этилацетата добавляли раствор 200 мг (1.72 ммоль) гексаметилендиамина. Реакционную массу перемешивали в течение часа, затем упаривали, растворяли в 100 мл этилацетата и поочерёдно промывали 1 н. H2SO4, нас. NaCl, 3% K2CO3 и снова нас. NaCl, затем сушили безводным Na2SO4 и упаривали. Полученный твёрдый кристаллический осадок промывали гексаном и сушили в вакууме. Получали 1.45 г (96%) продукта, Rf 0.56 (3), т.пл. 109-114°C, [α]D 20 - 12.0° (с 0.4; ДМФА).
Спектр 1H-ЯMP (ДMCO-4): 1-29 (8H, м, 2 CγH2 Lуs, -NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-), 1.42 (18H, с, 2 -CO-OC(CH3)3), 1.55 (8H, м, 2 C8H2 Lуs, - NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-), 1.79 (4H, м, 2 CβH2 Lуs), 2.96 (4H, м, 2 CεH2 Lуs), 3.20 (4H, м, -NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-), 4.53 (2H, м, 2 CαH Lуs), 5.34 (4H, с, 2 - CO-OCH2C6H4Cl), 6.76 (2H, д, 2 NH Lуs), 7.39 (2H, т, 2 NεH Lуs), 8.01 (2H, т, - NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-).
в) Получение дигидрохлорида гексметилендиамида биc-(Nε-(2-xлop- бeнзилoкcикapбoнил)лизинa), 2HCl х (H-Lys(2-Cl-Z)-NH-)2(CH2)б
К раствору 1.42 г (1.71 ммоль) (Boc-Lys(2-Cl-Z)-NH-)2(CH2)6 в 10 мл диоксана прибавляли 10 мл 4 н. HCl в диоксане. По окончании реакции (TCX контроль) раствор упаривали досуха. Полученную пену (затвердевшее масло) продукта, не обрабатывая, запускали в следующую стадию.
Спектр Η-ЯМР (ДMCO-Λ6): 0.95-1.75 (2OH, м, 2 -CH2 13CH2 7CH2 8- Lуs, - NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-), 2.98 (4H, м, -NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-), 3.09 (4H, м, 2 CεH2 Lуs), 3.70 (2H, м, 2 C°H Lуs), 5.07 (4H, с, 2 -CO-OCH2C6H4Cl), 7.37 (2H, т, -NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-), 7.45 (8H, м, 2 -CO-OCH2C6H4Cl), 8.23 (6H, м, 2 N+H3 Lуs), 8.59 (2H, т, 2 NεH Lуs).
г) Получение гексаметилендиамида биc-(N-тpeт-бyтилoкcикapбoнил-0-бeнзил- cepил-Nε-(2-xлop-бeнзилoкcикapбoнил)лизинa), (Boc-Ser(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)- NH-)2(CH2)6
К раствору 2HClχ(H-Lys(2-Cl-Z)-NH-)2(CH2)6 (1.32 ммоль) в 10 мл ДМФА сначала прибавляли 0.46 мл (2.64 ммоль) ДИЭА (pH8), а затем 2.44 г (2.64 ммоль) Boc-Ser(OBzl)-OPfp. Реакционную смесь перемешивали 1 час при комнатной температуре и оставляли на 1 ночь. На следующий день к реакционной массе добляли 0.5 мл ДЭТМДА, перемешивали 15 минут, после чего разбавляли 150 мл этиацетата, поочерёдно промывали водой, 3% H2SO4, 2% K2CO3 и нас. NaCl, сушили безводным Na2SO4 и упаривали. Продукт перекристаллизовывали из метанола. Получали 0.75 г (45%) продукта в виде белого порошка, Rf 0.44 (В), т.пл. 143-15 ГС, [α]D 20 -2.5° (с 0.4; ДМФА).
Спектр 1H-ЯMP (ДMCO-^6): 0.93-1.83 (38H, м, 2 -CO-OC(CH3)3, 2 -CH2^H2 7CH2 5- Lуs, -NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-), 2.93 (8H, м, 2 CεH2 Lуs, - NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-), 3.59 (4H, м, 2 CβH2 Sеr), 4.20 (4H, м, 2 CαH Lуs, 2 CαH Sеr), 4.47 (4H, с, 2 -CH2C6H5 Ser(OBzl)), 5.07 (4H, с, 2 -CO-OCH2C6H4Cl), 7.00 (2H, д, NH Sеr), 7.19-7.50 (2OH, м, 2 -CH2C6H5 Ser(OBzl), 2 -CO-OCH2C6H4Cl, - NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-), 7.77 (2H, т, NεH Lуs), 7.91 (2H, д, NH Lуs).
д) Получение дитрифторацетата гексаметилендиамида биc-(O-бeнзил-cepил-Nε- (2-xлop-бeнзилoкcикapбoнил)лизинa), 2TFA х (H-Ser(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)- NH )2(CHz)6 0.34 г (Boc-Ser(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-NH-)2(CH2)6 растворяли в 3 мл TFA и перемешивали в течение 40 минут, после чего реакционную массу упаривали. К остатку дважды прибавляли по 15 мл бензола и снова упаривали. Получили 0.42 г бежевого порошка, который кристаллизовали с эфиром. В результате получали 0.25 г (72%) продукта в виде белого порошка, хроматографически однородного, R/0.33 (В), Д/0.67 (Д), т.пл. 117-122°C, [α]D 20+4.75° (с 0,4; ДМФА).
е) Получение гексаметилендиамида биc-(N-мoнocyкцинил-O-бeнзил-cepил-Nε-(2- xлop-бeнзилoкcикapбoнил)лизинa), (HOOC(CH2)2CO-Ser(OBzI)-Lys(2-Cl-Z)- NH-)2(CH2)6
В 5 мл ДМФА суспендировали 0.23 г (0.178 ммоль) 2TFAχ(H-Ser(OBzl)-Lys(2- C1-Z)-NH-)2(CH2)6. К суспензии добавляли 0.055 мл (0.40 ммоль) ТЭА, перемешивали 30 минут, затем добавляли 0.108 г (1.078 ммоль) янтарного ангидрида. Рекционную смесь перемешивали 1 час, в течение которого суспензия начала становиться прозрачной, после чего выдерживали 1 ночь. По исчезновению исходного соединения (TCX контроль) реакционную массу заливали водой, выпавший белый осадок отфильтровали, промыли эфиром, сушили в вакууме. Получали 0.18 г (91 %), Rf O .12 (В), т.пл. 178-180°C, [α]D 20- 11.25° (с 0.4; ДМФА).
Спектр Η-ЯМР (ДMCO-J6): 0.95-1.78 (2OH, м, 2 -СН/СН/СНД Lуs, - NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-), 2.42 (8H, м, 2 HOOCCH2CH2CO-), 2.97 (8H, м, 2 CεH2 Lуs, -NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-), 3.60 (4H, м, 2 CβH2 Sеr), 4.14 (2H, м, 2 CαH Lуs), 4.44 (2H, м, 2 CαH Sеr), 4.45 (4H, с, 2 -CH2C6H5 Ser(OBzl)), 5.07 (4H, с, 2 -CO- OCH2C6H4Cl), 7.20-7.49 (2OH, м, 2 -CH2C6H5 Ser(OBzl)), 2 -CO-OCH2C6H4Cl, - NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-), 7.53 (2H, т, 2 NεH Lуs), 7.89 (2H, д, 2 NH Lуs), 8.24 (2H, д, 2 NH Sеr).
ж) Получение гексаметилендиамида биc-(N-мoнocyкцинил-cepил-лизинa), (HOOC(CH2)2CO-Ser-Lys-NH-)2(CH2)б (ГCБ-106)
К раствору 96 мг (0.0759 ммоль) (HOOC(CH2)2CO-Ser(OBzl)-Lys(2-Cl-Z)-NH-
)2(CH2)6 в 30 мл метанола прибавляли 200 мг 10%-нoгo палладия на активированном угле и перемешивали в атмосфере водорода в течение 11 часов. По окончании гидирования (ТСХ-контроль) катализатор отфильтровывали, фильтрат упаривали, остаток высушивали в вакууме. Получали 65 мг продукта (количественно). R/ О (В), Rf 0.04 (Д). C32H58N8O12. Спектр Η-ЯМР QЩCO-dь): 1.00-1.75 (2OH, м, 2 -CH2 13CH2 7CH2 5- Lуs, - NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-), 2.42 (8H, м, 2 HOOCCH2CH2CO-), 2.74 (4H, м, 2 CεH2 Lуs), 3.00 (4H, м, -NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-), 3.52 и 3.63 (4H, два дд, 2 CβH2 Sеr), 4.14 (2H, м, 2 CαH Lуs), 4.27 (2H, м, 2 CαH Sеr), 7.68 (2H, т, - NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-), 7.72 (ш.с, N6H3 + Lуs), 7.95 (2H, д, NH Lуs), 8.10 (2H, д, NH Sеr), 7.43 (ш.с, -ОН).
Пример 13
Синтез гексаметилендиамида #иc-(/V-(γ-oкcибyтиpил)лизил-лизинa), (HO(CH2)зCO-Lys-Lys-NH-)2(CH2)6 (ГCБ-120) а) Получение пентафторфенилового эфира N-тpeт-бyтилoкcикapбoнил-Nε- бензилоксикарбонил-лизина, Boc-Lys(Z)-OPfp
К раствору 10 г (26.285 ммоль) Boc-Lys(Z)-OH в 100 мл ТГФ прибавляли раствор 4.84 г (26.285 ммоль) пентафторфенола в 40 мл ТГФ. К полученному раствору, охлаждённому до -3°C, прибавляли раствор 5.42 г (26.285 ммоль) ДЦГК в 40 мл ТГФ. Рекционную массу перемешивали в течение lч 15 мин при -5-0°C, после чего выдерживали 1 ночь при +5°C. На следующий день отфильтровывали белый осадок дициклогексилмочевины, фильтрат упаривали. Остаток перекристаллизовывали из смеси этилацетат-гексан. Получали 12.55 г (87.5%) продукта, R/0.56 (E).
б) Получение гексаметилендиамида биc-(N-тpeт-бyтилoкcикapбoнил-Nε- бензилоксикарбонил-лизина), (Boc-Lys(Z)-NH-)2(CH2)б
К раст вору 0.50 г (4.31 ммоль) гексаметилендиамина в 50 мл ДМФА прибавляли раствор 4.91 г (9.0 ммоль) Boc-Lys(Z)-OPfp в 50 мл ДМФА. Реакционную массу перемешивали в течение 1 часа, после чего выдерживали 1 ночь при комнатной температуре. На следующий день к реакционной смеси прибавляли 0.5 мл ДЭТМДА и перемешивали в течение 30 мин. Затем реакционную массу упаривали вдвое, после чего разбавляли 100 мл этилацетата. Органическую фазу промывали нас. Na2SO4 (4 х 25 мл), водные фракции объединяли и промывали 50 мл этилацетата. Этилацетатные растворы объединяли, поочерёдно промывали 3% H2SO4 (2 х 50 мл), 3% K2CO3 (2 х 50 мл) и нас. Na2SO4 (2 х 50 мл), сушили безводным Na2SO4 и упаривали. Получали 3.59 г (99.16%) продукта, Λ/0.91 (Д), т.пл. 97-990C, [α]D 20-7.25° (с 0.4; ДМФА).
в) Получение дитрифторацетата гексаметилендиамида биc-(Nε- бензилоксикарбонил-лизина), 2TFA х (H-Lys(Z)-NH-)2(CH2)б
3.59 г (4.27 ммоль) (Boc-Lys(Z)-NH-)2(CH2)6 растворяли в 8 мл TFA, перемешивали в течение 50 минут и упаривали. Полученный остаток повторно упаривали с диэтиловым эфиром ещё 6 раз. Полученный продукт 3.71 г в виде масла, не обрабатывая, передавали на следующую стадию. R/0.29 (Д).
г) Получение гексаметилендиамида биc-(N-тpeт-бyтилoкcикapбoнил-Nε- бeнзилoкcикapбoнил-лизил-Nε-бeнзилoкcикapбoнил-лизинa), (Boc-Lys(Z)-Lys(Z)- NH-)2(CH2)6
К раствору 2TFAx(H-Lys(Z)-NH-)2(CH2)6 3.71 г (4.27 ммоль) в 30 мл ДМФА прибавляли 2 мл 7V-мeтилмopфoлинa (pH8) и 5.129 г (9.39 ммоль) Boc-Lys(Z)-OPfp. Полученную реакционную массу перемешивали в течение 45 минут и выдерживали 1 ночь, после чего прибавляли 0.5 мл ДЭТМДА и перемешивали 30 минут. Затем реакционную смесь разбавляли хлороформом до 300 мл. Органическую фазу поочерёдно промывали 100 мл воды и 3% H2SO4 (2 х 100 мл). Объединенные водные фракции экстрагировали хлороформом (2 х 50 мл). Органические фракции объединяли и промывали 3% K2CO3 (2 х 100 мл). Полученные водные фракции промывали хлороформом (2 х 50 мл). Все объединённые органические фракции сушили безводным Na2SO4. По данным TCX полученный хлороформный раствор помимо целевого продукта содержит примеси. Для выделения продукта хлороформ удаляли в вакууме, остаток растворяли в этилацетате. Сразу же начал выпадать белый аморфный осадок, тоже загрязнённый примесями. Растворитель удаляли в вакууме, остаток очищали хроматографически (элюент - диoкcaн-вoдa=10:l; неподвижная фаза Кiеsеlgеl 70-230 mеsh, 6θA (Аldriсh); высота колонки 21 см, ø 15 мм). Получали 2.4 г (41%) продукта, R1 0.90 (Д), Д/ 0.91 (И), т.пл. 179-182°C, [α]D 20 -10.25° (с 0.4; ДМФА).
Спектр Η-ЯМР (ДMCO-d6): 1.12-1.72 (32H, м, 4 -СН/СН/СШ8- Lуs1'2, - NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-), 1.36 (18H, с, 2 -CO-OC(CH3)3), 2.95 (12H, м, 4 CεH2 Lуs1'2, -NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-), 3.84 (2H, м, 2 CαH Lуs1), 4.17 (2H, м, 2 CαH Lуs2), 4.99 (8H, с, 4 -CO-OCH2C6H5), 6.92 (2H, д, 2 NH Lуs1), 7.20 и 7.23 (4H, два т, 4 NεH Lуs1'2), 7.33 (20 H, м, 4 -CO-OCH2C6H5), 7.68 (2H, д, 2 NH Lуs2), 7.83 (2H, т, - NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-).
д) Получение дитрифторацетата гексаметилендиамида биc-(Nε- бeнзилoкcикapбoнил-лизил-Nε-бeнзилoкcикapбoнил-лизинa), 2TFA х (H-Lys(Z)-
Lys(Z)-NH-)2(CH2)б
0.639 г (0.47 ммоль) (Boc-Lys(Z)-Lys(Z)-NH-)2(CH2)6 разбавляли 3 мл TFA, перемешивали 30 минут и упаривали. Остаток ещё трижды упаривали с эфиром. Полученное масло кристаллизовали с эфиром. Получали 0.597 г (91.25 %) продукта в виде белого порошка, Д/0.71 (Д), т.пл. 143-1480C, [α]D 20 +10.5° (с 0.4; ДМФА). Спектр Η-ЯМР (ДMCO-</6): 1.07-1.78 (32H, м, 4 -CH2^H2 7CH2 5- Lуs1'2, - NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-), 2.96 (12H, м, 4 C6H2 Lуs1'2, NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-), 3.78 (2H, м, 2 CαH Lуs1), 4.22 (2H, м, 2 CαH Lуs2), 4.99 (8H, с, 4 -CO-OCH2C6H5), 7.21 и 7.23 (4H, два т, 4 NεH Lуs1'2), 7.33 (20 H, м, 4 - CO-OCH2C6H5), 8.00 (2H, т, -NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-), 8.07 (6H, м, 2 NH3 + Lуs1), 8.49 (2H, д, 2 NH Lуs2).
е) Получение гексаметилендиамида биc-(N-(O-бeнзил-γ-oкcибyтиpил)-Nε- бeнзилoкcикapбoнил-лизил-Nε-бeнзилoкcикapбoнил-лизинa), (BzlO(CH2)зCO- Lys(Z)-Lys(Z)-NH-)2(CH2)6
К раствору 0.50 г (359 ммоль) 2TFAx(H-Lys(Z)-Lys(Z)-NH-)2(CH2)6 и 0.35 г
(0.790 ммоль) ВОР в 10 мл ДМФА прибавляли 0.370 мл N-этилморфолина (pH7.5) и 0,140 мл (0.790 ммоль) BzlO(CH2)3COOH. Реакционную смесь перемешивали 2 суток (TCX контроль отсутствовал в связи с тем, что Rf исходного вещества совпадает с Rf ДМФА). Затем реакционную массу разбавляли 100 мл хлороформа, приливали 40 мл воды. Выпавший аморфный осадок отфильтровывали, сушили в вакууме. Получали 0.29 г (53.35 %) продукта, Я/ 0.06 (Д), Я/ 0.23 (К), т.пл. 204-208°C, [α]D 20 -12.0° (с 0.4; ДМФА).
Спектр Η-ЯМР (ДMCO-Λ6): 1.11-1.68 (32H, м, 4 -CH2 13CH2 7CH2 5- Lуs1'2, - NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-), 1.75 м, 2.20 т, 3.35 т (12H, 2 ВzЮ-СН/СН/СН/СО- ), 2.95 (12H, м, 4 CεH2 Lуs1'2, -NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-), 4.14 (4H, м, 4 CαH Lуs1'2), 4.42 (4H, с, 2 C6H5CH2O-), 4.98 (8H, с, 4 -CO-OCH2C6H5), 7.19 (4H, т, 4 NεH Lуs1'2), 7.31 (30 H, м, 2 C6H5CH2O-, 4 -CO-OCH2C6H5), 7.74 (4H, м, 2 NH Lуs1,- NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-), 7.95 (2H, д, 2 NH Lуs2).
ж) Получение гексаметилендиамида биc-(N-(γ-oкcибyтиpил)лизил-лизинa), (HO(CH2)зCO-Lys-Lys-NH-)2(CH2)б (ГCБ-120)
К 0.165 г (0.109 ммоль) измельченного (BzЮ(CH2)3CO-Lys(Z)-Lys(Z)-NH-
)2(CH2)6 и 0.450 г 10% Рd/С прибавляли 30 мл метанола. Перемешивали в атмосфере водорода при нагревании (температура бани 48°C) в течение ~15 часов. По окончании гидирования (ТСХ-контроль) катализатор отфильтровали, фильтрат упарили, остаток высушивали в вакууме. Получали продукт количественно, Rf 0.0 (Д, К, Л, M).
C38H76N10O8. Спектр 1H-ЯMP (ДМСОчfc): 1.20-1.60 (36H, м, 4 -CH2 13CH2 7CH2 5- Lуs1'2, - NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-, 2 ВzlО-СН/СН/СНгТО-), 2.17 (4H, т, 2 BzIO- CHZCH2PCH2 01CO-), 2.74 (4H, м, -NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-), 3.01 (8H, м, 4 CΗ2 Lуs1'2), 3.37 (4H, т, 2 ВzlО-СНУСН/СН/СО-), 4.16 и 4.32 (4H, два м, 4 C0H Lуs1'2), 7.80 (2H, ушир. т, -NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-), 7.87 и 8.03 (4H, два д, 4 NH Lуs1'2). 4 N6H2 Lуs обмениваются с HDO.
Пример 14
Синтез амида N-моносукцинил-метионил-серина, HOOC(CH2)2CO-Met-Ser-NH2 (ГCБ-207) а) Получение метилового эфира N-трет-бутилоксикарбонил-метионил-серина, Вос-Меt-Sеr-ОМе
К 6.38 г (41 ммоль) гидрохлорида Н-Sеr-ОМе и 15.8 г (41 ммоль) Вос-Меt-ОNр в 50 мл ДМФА при перемешивании прибавляли 5.7 мл (41 ммоль) ТЭА. Реакционную смесь выдерживали 1 ночь при комнатной температуре. По завершении реакции (TCX контроль) прибавляли 2 мл ДМПДА, перемешивали в течение 30 мин и упаривали. К остатку добавляли 150 мл этилацетата и 100 мл воды. Органическую фазу последовательно промывали 3% K2CO3 (3 х 60 мл) и 100 мл 2% HCl, сушили безводным Na2SO4 и упаривали. Остаток растворяли в 50 мл эфира, добавляли гептан до помутнения. Выпавшие кристаллы отфильтровывали, промывали гептаном и высушивали. Получали 11.6 г (80.7 %) продукта, Rf 0.67 (Jl), i?/ 0.80 (M), т.пл. 65- 68°C, [α]D 20 -20.75° (с 0.4; метанол).
Спектр Η-ЯМР (ДМСО-йfe): 1.36 (9 H, с, -CO-O(CH3)3), 1.81 (2H, м, CβH2 Меt), 2.45 (2H, т, CγH2 Меt), 3.62 (ЗН, с, -OCH3), 3.70 (2H, м, CβH2 Sеr), 4.08 (IH, м, CαH Меt), 4.33 (IH, м, CαH Sеr), 5.08 (IH, т, -ОН Sеr), 6.98 (IH, д, NH Меt), 8.07 (IH, д, NH Sеr).
б) Получение амида N-трет-бутилоксикарбонил-метионил-серина, Вос-Меt-Sеr- NH2
Раствор 4г (11.4 ммоль) Вос-Меt-Sеr-ОМе в 10 мл метанола насыщали аммиаком при 0°C и выдерживали 3 суток при комнатной температуре в закрытой колбе. Затем упаривали, остаток криталлизовали со смесью 30 мл эфира и 5 мл этанола. Образовавшиеся кристаллы отфильтровывали и высушивали. Получали 3.19г
(83.4 %) продукта, Λ/ 0.57 (Л), R1 0.71 (M), т.пл. 120-12ГC, [α]D 20 -12.25° (с 0.4; метанол).
Спектр Η-ЯМР (ДMCO-<&): 1.38 (9 H, с, -CO-O(CH3)3), 1.82 (2H, м, CPH2 Меt), 2.03 (ЗН, с, -SCH3 Меt), 2.46 (2H, т, CγH2 Меt), 3.56 (2H, м, CβH2 Sеr), 4.0 (IH, м, CαH Меt),
4.17 (IH, м, CαH Sеr), 4.90 (IH, т, -ОН Sеr), 7.12 и 7.23 (2H, два с, NH2 амид), 7.14 (IH, д, NH Меt), 7.65 (IH, д, NH Sеr).
в) Получение амида N-моносукцинил-метионил-серина, HOOC(CH2)2CO-Met- Ser-NH2 (ГCБ-207)
2.99 г (8.9 ммоль) Boc-Met-Ser-NH2 растворяли в 15 мл TFA, перемешивали в течение 1 часа и упаривали. Остаток кристаллизовали с эфиром, образовавшиеся кристаллы отфильтровывали и промывали эфиром. Затем растворяли в 20 мл 50% этанола, обрабатывали смолой Аmbеrlitе IRA-900 (-ОН форма) до pH~10, фильтровали и упаривали. После этого повторно упаривали с добавлением ДМФА. Полученный остаток растворяли в 10мл ДМФА и прибавляли 1 г (10 ммоль) янтарного ангидрида. Реакционную массу перемешивали 1 ночь, по исчезновению исходного соединения (TCX контроль) реакционную массу заливали 25 мл воды. Выпавший белый осадок отфильтровывали, промывали водой, высушивали. Реакционную массу перемешивали 2 часа, по исчезновению исходного соединения (TCX контроль) упаривали, остаток кристаллизовали со смесью эфир-этанол (4 : 1), затирая и выдерживая при -20°. Образовавшиеся кристаллическое вещество отфильтровывали, промывали охлажденной смесью эфир-этанол (4 : 1) и высушивали. Получали 0.96 г (32 %, общий выход 21.5 %) продукта, Rf OA l (Л), Rf 0.45 (M), т.пл. 101-105°C, [α]D 2° -14.25° (с 0.4; метанол). Q2H2IN3O6S. Спектр Η-ЯМР (ДMCO-J6): 1.75 и 1.90 (2H, два м, CβH2 Меt), 2.03 (ЗН, с, -SCH3 Меt), 2.41 (4H, м, HOOCCH2CH2CO-), 2.44 (2H, м, C7H2 Меt), 3.58 (2H, м, CβH2 Sеr), 4.16 (IH, м, CαH Sеr), 4.31 (IH, м, CαH Меt), 7.08 и 7.17 (2H, два с, NH2 амид), 7.75 (IH, д, NH Sеr), 8.16 (IH, д, NH Меt).
Пример 15
Синтез гептаметилендиамида ^иc-(N-мoнocyкцинил-мeтиoнил-cepинa),
(HOOC(CH2)2CO-Met-Ser-NH-)2(CH2)7 (ГCБ-214) а) Получение гидразида N-трет-бутилоксикарбонил-метионил-серина, Вос-Меt-
Ser-N2H3
К раствору 6.31 г (18 моль) Вос-Меt-Sеr-ОМе (получение соединения описано в Примере 14, пункт «a») в 10 мл метанола прибавляли 3 мл гидразин-гидрата и выдерживали 1 ночь. По исчезновению исходного соединения (TCX контроль) к реакционной массе добавляли 10 мл воды, выдерживали при -20°, выпавший осадок отфильтровывали, промывали охлажденным водным метанолом и высушивали.
Получали 6,31 г (100 %) продукта, Rf 0.47 (Л), fl/ 0.66 (M), т.пл. 160-1620C, [α]D 20 - 21.75° (с 0.4; метанол).
Спектр Η-ЯМР (ДMCOч/б): 1.37 (9H, с, -CO-O(CH3)3), 1.80 (2H, м, CβH2 Меt), 2.02 (ЗН, с, -SCH3 Меt), 2.43 (2H, т, CγH2 Меt), 3.54 (2H, м, CβH2 Sеr), 4.00 (IH, м, CαH Меt), 4.19 (IH, м, CαH Sеr), 4.19 (2H, д, -NH-NH2), 4.88 (IH, т, -ОН Sеr), 7.07 (IH, д, NH Меt), 7.69 (IH, д, NH Sеr), 9.02 (IH, т, -NH-NH2).
б) Получение гептаметилендиамида биc-(N-тpeт-бyтилoкcикapбoнил-мeтиoнил- серина), (Boc-Met-Ser-NH-)2(CH2)7
К 5.23 г (14.9 ммоль) Boc-Met-Ser-N2H3 в 25 мл ДМФА, охлаждённому до -
20°C, сначала прибавляли HCl в диоксане (~4M, 50 мл), а затем 1.75 мл (15 ммоль) н- бутилнитрита, поддерживая температуру -20°C ÷ -30°C. Реакционную смесь выдерживали 3 мин, после чего добавляли сначала 7.7 мл (45 ммоль) ИДЭА, а затем раствор 0.91 г (7 ммоль) гептаметилендиамина в 3 мл ДМФА. Реакционную смесь оставляли на 1 ночь при комнатной температуре, после чего прибавляли 250 мл этилацетата и 200 мл воды, органическую фазу промывали 2% HCl (2 х 100 мл) и 100 мл 3% NaHCO3, упаривали до объема ~ 60мл. Наблюдалось постепенное выпадение осадка, количество которого увеличивалось в результате охлаждения раствора до - 20°C. Выпаший осадок отфильтровывали при комнатной температуре, промывали этилацетатом и высушивали. Получали 3.3 г (29 %) продукта, Rf 0.59 (Л), Rf QJl (M), т.пл. 160-1620C, [α]D 20 -28.75° (с 0.4; метанол).
Спектр 1H-ЯMP (ДMCO-</6): 1.18-1.40 (10 H, М, -NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-), 1.37 (18H, с, 2 -CO-O(CH3)3), 1.80 (4H, м, 2 CβH2 Меt), 2.02 (6H, с, 2 -SCH3 Меt), 2.44 (4H, т, 2 CΗ2 Меt), 3.02 (4H, м, -NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-), 3.53 (4H, м, 2 CβH2 Sеr), 3.99 (2H, м, 2 CαH Меt), 4.17 (2H, м, 2 CαH Sеr), 7.12 (2H, д, 2 NH Меt), 7.68 (2H, д, 2 NH Sеr), 7.71 (2H, т, -NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-).
б) Получение гептаметилендиамида биc-(N-мoнocyкцинил-мeтиoнил-cepинa), (HOOC(CH2)2CO-Met-Ser-NH-)2(CH2)7 (ГCБ-214)
3.14 г (4.1 ммоль) (Boc-Met-Ser-NH-)2(CH2)7 растворяли в 20 мл TFA и перемешивали в течение 30 мин, после чего упаривали. Остаток растирали с диэтиловым эфиром, декантировали, растворяли в 50 мл 50% этанола, обрабатывали смолой Аmbеrlitе IRA-900 (ОН- форма) до рН ~ 10, раствор упаривали. После этого повторно упаривали с добавлением ДМФА. Полученный остаток растворяли в 10мл ДМФА и прибавляли 1 г (10 ммоль) янтарного ангидрида. Реакционную массу перемешивали 2 часа и упаривали. Остаток растирали с ацетоном, отфильтровывали, не высушивая кипятили с 30 мл этанола (растворяется не полностью), выдерживали при -20°C, отфильтровывали и последовательно промывали холодным этанолом, эфиром и гексаном. После высушивания получали 1.75 г (100 %, общий выход 23.4 %) продукта, Rf 0.0 (Л), Rf 0.57 (M), т.пл. 162-163°C, [α]D 20 -9.00° (с 0.4; ДМФА). C3IH54N6Oi2S2.
Спектр Η-ЯМР (ДMCO-J6): 1.20-1.40 (ЮН, м, -NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-), 1.76 и 1.89 (4H, два м, 2 CβH Меt), 2.02 (6H, с, 2 -SCH3 Меt), 2.40 (8H, м, 2 HOOCCH2CH2CO-), 2.42 (4H, м, 2 CγH2 Меt), 3.01 (4H, м, - NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-), 3.55 (4H, м, 2 CβH2 Sеr), 4.17 (2H, м, 2 CαH Sеr), 4.30 (2H, м, 2 CαH Меt), 7.61 (2H, т, -NHCH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2NH-), 7.76 (2H, д, 2 NH Sеr), 8.16 (2H, д, 2 NH Меt).
Пример 16
Синтез амида N-ацетил-аспартил-серина, CHзCO-Asp-Ser-NH2 (ГБK-108) а) Получение β-бензилового эфира аспарагиновой кислоты, H-Asp(OBzl)-OH
Раствор 167 мл бензилового спирта, 167 мл диэтилового эфира и 16.7 мл конц. H2SO4, приготовленного при комнатной температуре, упаривали без нагрева, удаляя диэтиловый эфир. К полученному раствору при комнатной температуре и интенсивном перемешивании небольшими порциями прибавляли 22.2 г Н-Аsр-ОН (166.8 ммоль). Полученную суспензию интенсивно перемешивали при 20°C до получения полностью гомогенного прозрачного раствора, который выдерживали при комнатной температуре в течение 2 сут. Затем к реакционной смеси при интесивном перемешивании добавляли 335 мл этилового спирта и 85 мл пиридина. Реакционную смесь перемешивали при 20°C в течение 1 часа. Происходило постепенное выпадение белого мелкодисперсного осадка. Раствор с выпавшим осадком оставляли при 0°C на 1 сут. Затем осадок отфильтровывали и промывали водой. Полученную кристалическую массу перекристаллизовывали из 335 мл воды с добавлением 335 мкл пиридина. Перекристаллизацию осуществляли из горячего раствора (80-85°C) с охлаждением его до комнатной температуры и последующего выдерживания в течение 1 сут. Выпавшие кристаллы отфильтровывали, промывали ацетоном, сушили. Получали 10.5 г (28 %) продукта в виде белых кристаллов, Λ/ 0.28 (Д), Λ/ 0.15 (И), т.пл. 214-215°C. Спектр Η-ЯМР (ДMCO-c/6 - CF3COOD): 2.95 и 2.99 (2H, два д, CH2 Аsр), 4.24 (IH, м,
CH Аsр), 5.14 (2H, с, -CH2C6H5), 7.35 (5H, м, -CH2C6H5), 8.42 (уср. с, NH2 амид, ОН).
б) Получение β-бензилового эфира N-трет-бутилоксикарбонил-аспарагиновой кислоты Boc-Asp(OBzl)-OH
К раствору 5.58 г (25.0 ммоль) H-Asp(OBzl)-OH в 75 мл смеси диоксан-вода (2
: 1) при интенсивном перемешивании прибавляли 25 мл 1 н. NaOH. Затем реакционную смесь охлаждали до 0°C и прибавляли 6.0 г (27.5 ммоль) BoC2O. Полученный раствор перемешивали 2 часа при 20°C, после чего из реакционной смеси удаляли диоксан при пониженном давлении. К оставшемуся водныму раствору добавляли равное по объёму количество этилацетата. Смесь подкисляли 10 % раствором лимонной кислоты до рНЗ. Водную фазу отделяли от органической и промывали этилацетатом (3 х 50 мл). Объединённые органические вытяжки промывали нас. NaCl, высушивали безводным Na2SO4, растворитель упаривали, полученные кристаллы промывали петролейным эфиром и высушивали. Получали 6.84 г (85 %) продукта в виде белых кристаллов, Λ/0.88 (Д), Я/ 0.85 (И), т.пл. 97-98°C, [α]D 20 +3.71° (с 0.01; метанол).
в) Получение N-оксисукцинимидного эфира N-трет-бутилоксикарбонил-β- бензил- аспарагиновой кислоты, Boc-L-Asp(OBzl)-OSu
К раствору 8,08 г (25.0 ммоль) Boc-Asp(OBzl)-OH и 3.165 г (27.5 ммоль) JV- гидроксисукцинимида в 60 мл ТГФ, охлаждённому до 0°C, при интенсивном перемешивании прибавляли охлаждённый раствор 5.67 г (27.5 ммоль) ДЦГК в 20 мл ТГФ. Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 18 часов. Выпавший осадок дициклогексилмочевины отфильтровывали. Растворитель удаляли в вакууме. Маслообразный остаток растворяли в 40 мл CH2Cl2 и оставляли при 0°C на 1 сут. Выпавшие кристаллы отфильтровывали, фильтрат упаривали. Получали кристаллический (аморфнокристаллический) продукт с почти количественным выходом. Rf 0.33 (В), Я/ 0.53 (Д), Rf 0.93 (И), т.пл. 93-94°C, [α]D 20 +9.29° (с 0.01; метанол).
Спектр Η-ЯМР (ДMCO-^6): 1.37 (9H, с, -CO-O(CH3)3), 2.79 (4H, ш. с, -CH2CH2- -OSu), 2.88 и 3.01 (2H, два дд, CH2 Аsр), 4.77 (IH, м, CH Аsр), 5.12 (2H, с, -CH2C6H5), 7.36 (5H, м, -CH2C6H5), 7.73 (IH, д, NH Аsр). г) Получение N-оксисукцинимидного эфира N-трет-бутилоксикарбонил-О- бензил-серина, Boc-L-Ser(OBzl)-OSu Данное соединение получали аналогично Boc-L-Asp(OBzl)-OSu.
д) Получение амида N-трет-бутилоксикарбонил-О-бензил-серина, Boc-Ser(OBzl)- NH2
К раствору 9,81 г (25 ммоль) Boc-Ser(OBzl)-OSu в 125 мл ДМФА, охлаждённому до 0°C, при интенсивном перемешивании прибавляли 7.0 мл конц. NH4OH. Реакционную смесь интенсивно перемешивали при 0°C в течение 1 сут. Осадок отфильтровывали. Фильтрат охлаждали до 0°C и при перемешивании подкисляли 50-55 мл 10 % раствора лимонной кислоты, доводя до рН ~ 7. Полученный раствор концентрировали при пониженном давлении, упаривая до 1/5 части от первоначального объёма. Остаток разбавляли 100 мл CH2Cl2 и промывали 10 % NaHCO3 (3 х 50 мл) и нас. NaCl (3 х 50 мл). Органическую фазу сушили безводным Na2SO4, растворитель упаривали. Полученную кристаллическую массу промывали сначала диэтиловым, а затем петролейным эфиром, высушивали в вакууме. Получали 5.81 г (79 %) продукта, Д/0.23 (В), Д/0.91 (Д), Д/0.85 (И), т.пл. 98-99°C, [α]D 20 +25.17° (с 0.01; метанол).
е) Получение гидрохлорида амида О-бензил-серина, HCl χ H-Ser(OBzl)-NH2
K 5.5 г (18.8 ммоль) Boc-Ser(OBzl)-NH2 добавляли раствор газообразного HCl в диоксане (~4M, 50 мл). Полученную суспензию интенсивно перемешивали при 20°C в течение 1.5 час. Кристаллическую массу отфильтровывали и последовательно промывалит диэтиловым эфиром, CH2Cl2 и петролейным эфиром, после чего высушивали в вакууме. Получали 3.7 г (85 %) продукта в виде белого кристаллического продукта, Я/ 0.0 (В), Я/ 0.46 (Д), Я/ 0.44 (И), т.пл. 185-186°C, [α]D 20 +22.94° (с 0.01; метанол).
Спектр 1H-ЯMP (ДMCO-</6): 3.79 (2H, д, CH2 Sеr), 3.98 (IH, м, CH Sеr), 4.48 и 4.55 (2H, два д, -CH2C6H5), 7.34 (5H, м, -CH2C6H5), 7.30 и 7.60 (2H, два с, NH2 амид), 8.03 (IH, с, HCl), 8.30 (2H, с, NH2 амид).
ж) Получение амида N-трет-бутилоксикарбонил-β-бензил-аспартил-О-бензил- серина, Boc-Asp(OBzl)-Ser(OBzl)-NH2
К раствору 1.85 г (10 ммоль) HClχH-Ser(OBzl)-NH2 в 30 мл ДМФА при охлаждении до 5°C прибавляли раствор 2.2 мл (20.0 ммоль) iV-метилморфолина в 10 мл ДМФА и раствор 4.2 г (10.0 ммоль) Boc-Asp(OBzl)-OSu в 20 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивали при 20°C в течение 48 ч. Растворитель отгоняли при пониженном давлении, упаривая до 1/5 части от первоначального объёма.
Остаток разбавляли 100 мл этилацетата и при перемешивании подкисляли 50 мл охлаждённого 10 % раствора лимонной кислоты. Смесь интенсивно перемешивали 15 мин, после чего водную фазу отделяли от органической и промывали 50 мл этилацетата. Этилацетатные растворы объединяли, промывали нас. NaCl, высушивали безводным Na2SO4 и упаривали. Полученные кристаллы растворяли в CH2Cl2, раствор последовательно промывали 5 % NaHCO3 (3 х 50мл) и нас. NaCl, высушивали безводным Na2SO4, упаривали. Получали 3.92 г (78 %) продукта в виде кристаллов, Rf 0.09 (В), Я/ 0.96 (Д), Я/ 0.93 (И), т.пл. 114-117°C, [α]D 20 +17.64° (с 0.01; метанол). Спектр Η-ЯМР (ДMCO-^6): 1.35 (9H, с, -CO-O(CH3)3), 2.61 и 2.81 (2H, два дд, CH2 Аsр), 3.55 и 3.65 (2H, два дд, CH2 Sеr), 4.40 (2H, ш.с, CH Sеr, CH Аsр), 4.46 (2H, с, - CH2C6H5 Ser(OBzl)), 5.08 (2H, с, -CH2C6H Asp(OBzl)), 7.27 и 7.43 (2H, два с, NH2 амид), 7.34 и 7.81 (2H, д каждый, NH Аsр, NH Sеr).
з) Получение гидрохлорида амида β-бензил-аспартил-О-бензилсерина, HCl x H- Asp(OBzI)-Ser(OBzl)-NH2
К 3.5 г (7.0 ммоль) Boc-Asp(OBzl)-Ser(OBzl)-NH2 при 20°C прибавляли раствор газообразного HCl в диоксане (~4M, 50 мл). Полученный раствор интенсивно перемешивали при 20°C в течение 1.5 часов. Затем растворитель удаляли в вакууме. Аморфнокристаллический остаток поочерёдно промывали этилацетатом и петролейным эфиром, после чего высушивали в вакууме. Получали 3.0 г (98 %) продукта в виде белых кристаллов, Д/0.04 (В), Я/ 0.68 (Д), Я/ 0.78 (И), т.пл. 147-150°C, [α]D 20 +17.91° (с 0.01; метанол).
Спектр 1H-ЯMP (ДМСО-йfe): 2.91 и 3.07 (2H, два дд, CH2 Аsр), 3.60 и 3.70 (2H, два дд, CH2 Sеr), 4.25 (IH, м, CH Аsр), 4.45 (IH, м, CH Sеr), 7.30 и 7.55 (2H, два с, NH2 амид), 8.46 (ЗН, ш.с, NH3 +ASp), 8.83 (IH, д, NH Sеr).
и) Получение N-оксисукцинимидного эфира уксусной кислоты, CH3CO-OSu
К раствору 1.43 мл (25 ммоль) уксусной кислоты и 2.2 мл (0.25 ммоль) N- гидроксисукцинимида в 50 мл диоксана при 5°C прибавляли 2.2 мл (25 ммоль) ДЦГК. Реакционную смесь перемешивали 20 часов при 20°C. Выпавшый осадок отфильтровывали и промывали безводным диоксаном, фильтраты объединяли и упаривали. Получали 3.65 г (93 %) продукта в виде белых кристаллов, Rf OAl (В), Rf 0.75 (И), т.пл. 103-105°C. Спектр Η-ЯМР (ДMCOч/б): 2.34 (ЗН, с, CH3CO-), 2.80 (4H, м, -CH2CH2- -OSu).
к) Получение амида N-ацетил-β-бензил-аспартил-О-бензил-серина, СНзСО- Asp(OBzl)-Ser(OBzl)-NH2
К раствору 2.83 г (6.5 ммоль) HClxH-Asp(OBzl)-Ser(OBzl)-NH2 в 25 мл ДМФА при охлаждении до 5°C прибавляли раствор 1.43 мл (13.0 ммоль) N-метилморфолина в 5 мл ДМФА и раствор 1.02 г (6.5 ммоль) CH3CO-OSu в 15 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивали при 20°C в течение 18 ч. Растворитель отгоняли при пониженном давлении, упаривая до 1/5 части от первоначального объёма. Остаток разбавляли 100 мл этилацетата и при перемешивании подкисляли 50 мл охлаждённого 10 % раствора лимонной кислоты. Смесь интенсивно перемешивали 15 мин, после чего водную фазу отделяли от органической и промывали 50 мл этилацетата. Этилацетатные растворы объединяли, промывали нас. NaCl, высушивали безводным Na2SO4. Затем растворитель упаривали, полученную в остатке кристаллическую массу поочерёдно промывали сначала диэтиловым, а затем петролейным эфиром и высушивали в вакууме. Получали 1.9 г (66 %) продукта, R/0.0 (В), Rf 0.79 (Д), Я/0.81 (И), т.пл. 158-160°C, [α]D 20 -7.26° (с 0.01; метанол). Спектр Η-ЯМР (JЩCO-dв): 1.82 (ЗН, с, CH3CO-), 2.61 и 2.84 (2H, два дд, CH2 Аsр), 3.58 и 3.66 (2H, два дд, CH2 Sеr), 4.38 (IH, м, CH Sеr), 4.47 (2H, с, -CH2C6H5 Ser(OBzl)), 4.73 (IH, м, CH Аsр), 5.09 (2H, с, -CH2C6H5 Asp(OBzl)), 7.24 и 7.40 (2H, два с, NH2 амид), 7.26 и 7.47 (ЮН, м, 2 -CH2C6H5), 8.0 (IH, д, NH Sеr), 8.33 (IH, д, NH Аsр).
л) Получение амида N-ацетил-аспартил-серина, CHзCO-Asp-Ser-NH2 (ГБK-108)
К раствору 1.77 г (4.0 ммоль) CH3CO-Asp(OBzl)-Ser(OBzl)-NH2 в 25 мл этанола прибавляли 5 мл циклогексена, после чего при интенсивном перемешивании и 20°C прибавляли 1.0 г 10 % PdVC. Реакционную смесь кипятили с обратным холодильником 2 ч, затем охлаждали до 20°C, катализатор отфильтровывали, растворитель удаляли в вакууме. Остаток промывали петролейным эфиром и высушивали в вакууме. Получали 993 мг (95 %, общий выход 11.4 %) продукта, R/ 0.0 (В), Rf 0.57 (Д), Rf 0.24 (И), т.пл. 168-169°C, [α]D 20 -46.36° (с 0.01; метанол). C9H15N3O6.
Спектр Η-ЯМР (ДMCO-J6): 1.84 (ЗН, с, CH3CO-), 2.47 и 2.68 (2H, два дд, CH2 Аsр), 3.54 и 3.62 (2H, два дд, CH2 Sеr), 4.11 (IH, м, CH Sеr), 4.52 (IH, м, CH Аsр), 7.15 и 7.19 (2H, два с, NH2 амид), 7.82 (IH, д, NH Sеr), 8.25 (IH, д, NH Аsр).
Пример 17
Синтез амида УV-ацетил-аспартил-метионина, CHзCO-Asp-Met-NH2 (ГБK-201) а) Получение N-трет-бутилоксикарбонил-метионина, Вос-Меt-ОН
К раствору 7.46 г (50.0 ммоль) Н-Меt-ОН в 50 мл IM NaOH прибавляли раствор 2.5 г NaHCO3 в 25 мл воды и раствор 14.25 г (65.3 ммоль) BoC2O в 50 мл изопропанола. Реакционную смесь интенсивно перемешивали при 20°C в течение 2 часов, затем разбавляли водой до объёма 250 мл, после чего промывали петролейным эфиром. Водную фазу подкисляли лимонной кислотой до рН 3-3.5 и промывали этилацетатом (3 х 100 мл). Объединённые органические фракции промывали нас. NaCl, высушивали безводным Na2SO4 и упаривали. Получали 10.85 г (87 %) продукта, т.пл. 135-137°C.
б) Получение N-оксисукцинимидного эфира N-трет-бутилоксикарбонил- метионина, Вос-Меt-ОSu
К раствору 5,88 г Вос-Меt-ОН (25.0 ммоль) и 3.165 г (27.5 ммоль) N- гидроксисукцинимида в 60 мл ТГФ, охлаждённому до 0°C, при интенсивном перемешивании прибавляли охлаждённый раствор 5.67 г (27.5 ммоль) ДЦГК в 20 мл ТГФ. Реакционную смесь перемешивали при 0°C в течение 18 часов. Выпавший осадок отфильтровывали, фильтрат упаривали. Маслообразный остаток растворяли в 40 мл CH2Cl2 и выдерживали при 0°C 1 сут. Выпавшие кристаллы повторно отфильтровывали, фильтрат упаривали. Получали кристаллический продукт с количественным выходом.
в) Получение амида N-трет-бутилоксикарбонил-метионина, Вос-Меt-NНг
К раствору 8,31 г Вос-Меt-ОSu (25 ммоль) в 125 мл ДМФА, охлаждённому до 00C, при интенсивном перемешивании прибавляли 7 мл конц. NH4OH. Образовавшуюся суспензию интенсивно перемешивали при 0°C в течение 1 сут. Выпавший осадок отфильтровывали, фильтрат охлаждали до 0°C и при перемешивании добавляли 50-55 мл 10 % раствора лимонной кислоты, доводя рН до ~7. Полученный раствор концентрировали при пониженном давлении, упаривая до 1/5 части от первоначального объёма. Остаток разбавляли 100 мл CH2Cl2 и последовательно промывали 10 % NaHCO3 (3 х 50 мл) и нас. NaCl (3 х 50мл). Органическую фазу высушивали безводным Na2SO4 и упаривали. Полученную кристаллическую массу промывали сначала диэтиловым, а затем петролейным эфиром и высушивали в вакууме. Получали 4.53 (73 %) продукта, Rf ОЛl (В), Λ/0.88 (Д), Д/0.85 (И), т.пл. 120-1210C, [α]D 20 +20.16° (с 0.01; метанол).
г) Получение гидрохлорида амида метионина, HCl х Н-Меt-NНг
К 4.4 г (17.7 ммоль) Boc-Met-NH2 прибавляли раствор газообразного HCl в диоксане (~4M, 50 мл). Полученный раствор интенсивно перемешивали при 20°C в течение 1.5 часов. Затем растворитель удаляли в вакууме. Кристаллический остаток поочерёдно промывали диэтиловым эфиром, CH2Cl2 и петролейным эфиром, после чего высушивали в вакууме. Получали 3.2 г (98 %) продукта в виде белых кристаллов, R10.0 (В), Я/ 0.43 (Д), Я/ 0.22 (И), т.пл. 193-198°C, [α]D 20 +89.93° (с 0.01; метанол).
д) Получение амида N-трет-бутилоксикарбонил-β-бензил-аспартил- мeтиoнинa,Boc-Asp(OBzl)-Met-NHг
К раствору 1,85 г (10 ммоль) HClxH-Met-NH2 в 30 мл ДМФА, охлаждённому до 5°C, прибавляли раствор 2.2 мл (20.0 ммоль) iV-метилморфолина в 10 мл ДМФА и раствор 4.20 г (10.0 ммоль) Boc-Asp(OBzl)-OSu в 20 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивали при 20°C в течение 48 ч. Полученный раствор концентрировали при пониженном давлении, упаривая до 1/5 части от первоначального объёма. Остаток разбавляли 100 мл этилацетата и прибавляли 50 мл охлаждённого 10 % раствора лимонной кислоты. Смесь интенсивно перемешивали 15 мин, затем водную фазу отделяли от органической и промывали 50 мл этилацетата. Органические вытяжки объединяли, промывали нас. NaCl, высушивали безводным Na2SO4 и упаривали. Полученные кристаллы растворяли в CH2Cl2, раствор поочерёдно промывали 5% NaHCO3 (3 х 50мл) и нас. NaCl, высушивали безводным Na2SO4 и упаривали. Получали 3.32 г (73 %) продукта, Я/ 0.17 (В), Λ/0.94 (Д), Λ/0.87 (И), т.пл. 132-134°C, [α]D 20 -28.26° (с 0.01 ; метанол).
е) Получение гидрохлорида амида β-бензил-аспартил-метионина, HCl х H- Asp(OBzl)-Met-NH2
К 3.15 г (7.0 ммоль) Boc-Asp(OBzl)-Met-NH2 при 20°C прибавляли раствор газообразного HCl в диоксане (~4M, 50 мл). Реакционную смесь интенсивно перемешивали при 20°C в течение 1.5 часов и упаривали. Аморфнокристаллический остаток последовательно промывали этилацетатом и петролейным эфиром и высушивали в вакууме. Получали 2.65 г (97 %) продукта в виде белых кристаллов, Rf
0.04 (В), fl/0.68 (Д), Rf 0.14 (И), [α]D 20 +4.8° (с 0.01; метанол).
ж) Получение амида. N-ацетил-β-бензил-аспартил-метионина, CHзCO-Asp(OBzl)- Met-NH2
К раствору 2.54 г (6.5 ммоль) HClχAsp(β-OBzl)-Met-NH2 в 25 мл ДМФА, охлаждённому до 5°C, прибавляли раствор 1.43 мл (13.0 ммоль) ТV-метилморфолина в 5 мл ДМФА и раствор 1.02 г (6.5 ммоль) CH3CO-OSu (синтез соединения описан в Примере 16 пункт «и») в 15 мл ДМФА. Реакционную смесь перемешивали при 20°C в течение 18 ч. Полученный раствор концентрировали при пониженном давлении, упаривая до 1/5 части от первоначального объёма. Остаток разбавляли 100 мл этилацетата и прибавляли 50 мл охлаждённого 10 % раствора лимонной кислоты. Смесь интенсивно перемешивали 15 мин, после чего водную фазу отделяли от органической и промывали 50 мл этилацетата. Органические вытяжки объединяли, промывали нас. NaCl, высушивали безводным Na2SO4 и упаривали. Полученную в кристаллическую массу промывали сначала диэтиловым, а затем петролейным эфиром и высушивали в вакууме. Получали 1.25 г (49 %) продукта, R/0.02 (В), /?/0.80 (Д), Д/0.86 (И), т.пл. 142-144°C, [α]D 20 -16.39° (с 0.01; метанол).
з) Получение амида N-ацетил-аспартил-метионина, СНзСО-Аsр-Меt-NНг (ГБК- 201)
К раствору 30 мг (0.0759 ммоль) CH3CO-Asp(OBzl)-Met-NH2 в 30 мл метанола прибавляли 30 мг 10% % PdVC и перемешивали в атмосфере водорода в течение 7 дней, постоянно прибавляя новые порции катализатора (-3-4 раза в день по 10-30 мг). По завершении реакции (ТСХ-контроль) катализатор отфильтровали, растворитель упаривали. Получали 24 мг (87 %, общий выход 18.8 %) продукта в виде твердого кристаллического вещества, Rf 0.53 (Д). CuHIgN3O5S.
Спектр Η-ЯМР (ДMCO-^6): 1.52 и 1.67 (2H, два м, CPH2 Меt), 1.83 (ЗН, с, CH3CO-), 1.83 (ЗН, с, -SCH3 Меt), 2.33 (2H, м, CγH2 Меt), 2.58 и 2.76 (2H, два м, CH2 Аsр), 4.06 (IH, м, CαH Меt), 4.8 (IH, м, CH Аsр), 7.08 и 7.29 (2H, два с, NH2 амид), 7.80 (IH, д, NH Меt), 8.29 (IH, д, NH Аsр).
Пример 18
Синтез гексаметилендиамида биc-(N-мoнocyкцинил-глицил-лизинa), (HOOC- (CH2)2-CO-Gly-Lys-NH-)2(CH2)б (ГK2ч) а) Получение дициклогексиламмониевой соли N-бeнзилoкcикapбoнил-Nε-тpeт- бутилоксикарбонил-лизина, Z-Lys(Boc)-OH*ДЦГA
К раствору 182,6 г (1 моль) гидрохлорида лизина в 1 л воды при перемешивании прибавляли сначала 137,3 г (0,55 моль) CuSO4*5H2O, предварительно растворенного в 0,6 л горячей воды, а затем конц. раствор NaOH до pH~9, после чего вносили 229 г BoC2O (1,05 моль), растворённого в небольшом количестве изопропанола. Реакционную массу перемешивали при 33-35° в течение 12 часов, поддерживая pH~9 с помощью NaOH. После исчезновения исходного вещества (TCX контроль) к реакционной смеси при 40-50° прибавляли 206 г EDTA в виде водной суспензии с добавлением NaOH до pH~10. После этого к реакционной массе, охлаждённой до комнатной температуры, добавляли по каплям раствор 133 г Z-Cl (0,7 моль) в небольшом количестве воды. После исчезновения H-Lys(Boc)-OH (TCX контроль) к реакционной массе добавляли 1,5 л этилацетата, подкисляли её конц. раствором HCl до pH~3, отфильтровывали CuSO4. Органический слой промывали водой и упаривали. Остаток растворяли в 1,8 л диэтилового эфира и добавляли 0,9 моль ДЦГА, при этом продукт кристаллизовался в виде дициклогексиламмониевой соли. Получили 294,5 г (0,525 моль, 52,5%) продукта в виде белых кристаллов. Вещество, не охарактеризовывая, запускали в следующую стадию.
б) Получение N-оксисукцинимидного эфира N-бeнзилoкcикapбoнил-Nε-тpeт- бутилоксикарбонил-лизина, Z-Lys(Boc)-OSu
Раствор 294 г (0,525 моль) Z-Lys(Boc)-OH*ДЦГA в 0,5 л этилацетата перемешивали с 0,6 моль H2SO4 (5% раствор) 30 мин, затем отделяли органический слой и упаривали этилацетат. Остаток растворяли в 1 л этилацетата и добавляли 65,5 г (0,57 моль) HOSu и 185 г (0,9 моль) ДЦГК. Реакционную массу перемешивали при комнатной температуре 12 ч. После исчезновения исходного вещества (TCX контроль) отфильтровали образовавшуюся дициклогексилмочевину. Растворитель удаляли в вакууме. Полученное масло перекристаллизовывали из смеси 0,15 л изопропанола и 1,5 л диэтилового эфира (1 : 10). Получили 225,7 г (0,473 моль, 90%) продукта в виде белого кристаллического вещества. Rf 0,9 (А), 0,83 (Б); т.пл. 118- 122°C; [α]D 25 -20,66° (с 0,41, этанол). Спектр 1H- ЯМР (ДMCO-d6): 1,18-1,92 (6H, м, CβH2 , CΗ2 > CδH2 Lуs), 1,35 (9H, с, -C(CH3)3 Вое), 2,79 (4H, м, -CH2-CH2- Su), 2,85-3,04 (2H, м, CεH2 Lуs), 4,39 (IH, м, CαH Lуs), 5,05 (2H, с, OCH2, Z), 6,78 (IH, т, NHε Lуs), 7,34 (5H, м, C6H5 Z), 7,97-8,12 (IH, д, NHα Lуs) в) Получение биc-(N-бeнзилoкcикapбoнил-Nε-тpeт-бyтилoкcикapбoнил-лизил)- гексаметилендиамида, (Z-Lys(Boc)NH)г(CH2)б
Раствор 2,575 г (5,4 ммоль) Z-Lys(Boc)-OSu и 0.299 г (2,6 ммоль) гексаметилендиамина в 14 мл диметилформамида перемешивали 4 ч при комнатной температуре, при этом образовывался мутный раствор. Реакционную смесь разбавляли 56 мл воды и оставляли на несколько часов. После затвердевания выпавший осадок отфильтровывали, промывали водой, высушивали над P2O5. Получили 2,085 г (выход 96%) белого кристаллического продукта. Rf 0,90 (А), 0,93 (Б); т.пл. 138-147°C; [α]D 25 -9,31° (с 0,29, этанол). Спектр 1H- ЯМР (ДMCO-d6): 1,05- 1,69 (12H, м, 2 CβH2, 2 CγH2, 2 C5H2 Lуs; 8H, м, -NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2- NH- ), 1,35 (18H, с, 2 -C(CH3)3 Вое), 2,87 (4H, м, 2CεH2 Lуs), 3,01 (4H, м, -NH-CH2-CH2- CH2-CH2-CH2-CH2-NH-), 3,89 (2H, м, 2 CαH Lуs), 5,01 (4H, с, 2 OCH2, Z), 6,74 (2H, т, - NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-), 7,13-7,39 (ЮН, м, 2 C6H5 Z; 2H, д, 2 NHα Lуs), 7,81 (2H, т, 2 NHε Lys)
г) Получение биc-(Nε-тpeт-бyтилoкcикapбoнил-лизил)-гeкca-мeтилeндиaмидa, (H-Lys(Boc)NH)2(CH2)б l,86г (2,2ммoль) (Z-Lys(Boc)NH)2(CH2)6 гидрировали в 25 мл метанола 25мл над 10% Рd/С (0,37г) в течение lч 25мин при комнатной температуре. После исчезновения исходного вещества (TCX контроль) катализатор отфильтровывали, растворитель удаляли в вакууме. Полученное масло высушивали над CaCl2 и парафином. Далее проводили высаживание смесью петролейного и диэтилового эфира (3:1) и отфильтровывали. Получили 0,99 г вещества (выход 78%) в виде белого порошка. Rf 0,48 (А), 0,68 (Б); т.пл. 70-75°C; [α]D 25 5,1° (с 1, этанол). Спектр 1H- ЯМР (ДМСО-dб): 1,11-1,65 (12H, м, 2 CβH2, 2 CγH2, 2 C5H2 Lуs; 8H, м, -NH-CH2-CH2-CH2- CH2-CH2-CH2- NH-; 18H, с, 2 -C(CH3)3 Вое), 2,86 (4H, м, 2 CεH2 Lys), 3,04 (4H, м, -NH- CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-), 3,40 (2H, м, 2 CαH Lуs), 6,73 (2H, т, 2 NHεLys), 7,78 (2H, т, -NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-).
д) Получение N-оксисукцинимидного эфира N-бензилоксикарбонил-глицина, Z- GIy-OSu
К раствору 5,28 г (28 ммоль) Z-GIy-OH в 80 мл этилацетата добавляли 3,22 г
(28 ммоль) HOSu и 6,36 г (28 ммоль) ДЦГК. Реакционную массу перемешивали при 10°C 2 ч. После исчезновения исходного вещества (TCX контроль) отфильтровали образовавшуюся дициклогексилмочевину. Растворитель удаляли в вакууме. Полученное масло перекристаллизовывали из смеси 3 мл петролейного эфира и 8 мл хлороформа. Получили 5,87 г продукта (выход 80%) в виде белого кристаллического вещества.
е) Получение гексаметилендиамида биc-(N-бeнзилoкcикapбoнил-глицил-Nε-тpeт- бутилоксикарбонил-лизина), (Z-Gly-Lys(Boc)-NH-)2(CHг)б
К раствору 0,90 г (1,6 ммоль) Lys(Boc)NH)2(CH2)б в 6 мл диметилформамида прикапывали при перемешивании раствор 1,103 г (3,8 ммоль) Z-GIy-OSu в 4 мл диметилформамида и продолжали перемешивание 2 ч 10 мин при комнатной температуре (TCX контроль). Далее добавили 1,5 мл диэтилпропилдиамина и перемешивали еще 30 мин, после чего реакционную смесь разбавляли 70 мл воды. Продукт и органические примеси экстрагировали хлороформом (3:1) и промывали поочередно 25 мл воды, 25 мл 2 % H2SO4 и 25 мл 3 % Na2CO3. Затем раствор сушили MgSO4 и отфильтровывали. После упаривания хлороформа получили продукт в виде смеси желтоватого масла с белыми кристаллами. Продукт закристаллизовывали под диэтиловым эфиром (20 мл). Получили 1,26 г (выход 84%) белого порошка. Rf 0,89 (А), 0,95 (Б); т.пл. 120-126°C; [α]D 25 -11,0° (с 0,1, этанол). Спектр 1H- ЯМР (ДMCO-d6): 1,05-1,70 (12H, м, 2 CβH2, 2 CγH2, 2 C8H2 Lуs; 8H, м, -NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2- NH-; 1,35 18H, c,2 -C(CH3)3 Вое), 2,85 (4H, м, 2 C6H2 Lуs), 3,00 (4H, м, -NH-CH2-CH2- CH2-CH2-CH2-CH2-NH-), 3,65 (4H, д, 2 CH2 GIy), 4,15 (2H, м, 2 CαH Lуs), 5,03 (4H, с, 2 OCH2 Z), 7,25 (2H, т, -NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-), 7,14-7,37 (ЮН, м, 2 C6H5 Z; 2H, д, 2 NHα Lуs), 7,81 (2H, т, 2 NHε Lуs).
ж) Получение биc-(глицил-Nε-тpeт-бyтилoкcикapбoнил-лизил)- гексаметилендиамида, (H-Gly-Lys(Boc)NH)2(CH2)б
1,17г (1,2 ммоль) (Z-Gly-Lys(Boc)NH)2(CH2)6 гидрировали в 20 мл метанола над 10% PaVC (0,23 г) в течение 20 мин при комнатной температуре. После исчезновения исходного вещества (TCX контроль) катализатор отфильтровывали, растворитель удаляли в вакууме. Полученное масло высаживали диэтиловым эфиром (20 мл) и отфильтровывали. Вещество в виде белого порошка без дополнительной очистки отправляли на следующую стадию.
Остаток растворяли в 20 мл ДМФА и добавляли 1.2 г (12.0 ммоль) янтарного ангидрида. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре до окончания реакции (TCX контроль), после чего добавляли 2 мл ДМПДА и выдерживали 30 мин. Реакционную смесь разбавляли 200 мл этилацетата и поочерёдно промывали 100 мл воды, 100 мл 2 % H2SO4 и 100 мл 3 % Na2CO3. После упаривания этилацетатного раствора продукт кристаллизовался. Далее использовали не высушивая.
з) Получение гексаметилендиамида биc-(N-мoнocyкцинил- глицил-Nε-тpeт- бутилоксикарбонил-лизина), (HOOC(CH2)2CO-Gly-Lys(Boc)-NH-)2(CH2)б
К раствору (H-Gly-Lys(Boc)NH)2(CH2)6 в 5 мл ДМФА добавили 0,24 г (2,4 ммоль) янтарного ангидрида. Реакционную смесь перемешивали при комнатной температуре 4 ч (TCX контроль) до окончания реакции. Затем реакционную смесь разбавляли 20 мл этилацетата и 15 мл воды. К ДMФA/H2O фракции добавляли 5 мл 3% Na2CO3, насыщали раствор 1,5 г Na2SO4, прибавляли 15 мл бутанола и 10% H2SO4 до pH~3. Далее промывали 10% Na2SO4. Растворитель полностью упаривали. Остаток растирали с диэтиловым эфиром и отфильтровывали. Получили 0,872 г (выход 82 %) продукта в виде белого порошка. Rf 0,80 (А), 0,67 (Б); т.пл. 86-92°C; [α]D 25 -10,4° (с 1 , этанол). Спектр 1H- ЯМР (ДМСО-dб): 1,1 1-1,75(12H, м, 2 CβH2, 2 CγH2, 2 C5H2 Lуs; 8H, м, -NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2- NH-; 1,35 18H, с, 2 -C(CH3)3 Вое), 2,36 (4H, м, 2 CH2 Suс), 2,72 (4H, м, 2 C6H2 Lуs), 2,96 (4H, м, -NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-), 3,65 (4H, с, 2 CH2 GIy), 4,10 (2H, м, 2 C°H Lуs), 6,71 (2H, т, -NH-CH2-CH2-CH2-CH2- CH2-CH2-NH-), 7,83 (2H, т, 2 NHε Lуs), 8,13(2H, д, 2NHα Lуs), 8,87 (2H, т, 2 NH GIy), 2 HOOC(CH2)2CO- обмениваются с HDO.
и) Получение гексаметилендиамида биc-(N-мoнocyкцинил-глицил-лизинa), (HOOC(CH2)2CO-Gly-Lys-NH-)2(CH2)б)
Весь полученный (HOOC(CH2)2CO-Gly-Lys(Boc)-NH-)2(CH2)6 растворяли в уксусной кислоте и обрабатывали 3 мл 4 M НСl/Diохапе. Через 40 мин растворитель декантировали, остаток промывали диэтиловым эфиром декантацией, растворяли в 5 мл воды и обрабатывали при перемешивании смолой Амберлит IRA-410 до стабилизации значения pH~5. Очистку проводили методом обращенно-фазовой C8 ВЭЖХ в градиенте 0-13 % изопропанола в 0.1 M уксусной кислоте. Соответствующие фракции собирали (TCX контроль), упаривали и сушили в вакууме. Лиофилизовали с помощью жидкого азота и перекристаллизовывали из смеси этилацетат-этанол (3: 1). Получили 0,515 г (общий выход 29 %) конечного продукта в виде белого порошка. Rf 0.14 (A), Rf 0.38 (Б), т.пл. 97-100°C, [a]25 D -15.7° (с 1; вода). Спектр 1H- ЯМР (ДМСО- dб): 1,06-1,85 (12H, м, 2 CβH2, 2 CΗ2, 2 C8H2 Lуs; 8H, м, -NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2- CH2- NH-; 1,35 18H, c,2 -C(CH3)3 Вое;), 2,26 (4H, м, 2 CH2 Suс), 2,84 (4H, м, 2 C6H2 Lуs), 3,05 (4H, м, -NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-), 3,69 (4H, с, 2 CH2 GIy), 4,10
(2H, м, 2 CαH Lуs), 7,65 (2H, т, -NH-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2-NH-), 8,34 (2H, д, 2 NHα Lуs), 8,64 (2H, т, 2NHε GIy), 2 HOOC(CH2)2CO- обмениваются с HDO.
I. Результаты биологического изучения заявляемых соединений iп vitrо
Материалы и методы
Материалы
Культуральные флаконы, пробирки, планшеты (Соrпiпg апd Соstаг), культуральная среда ДМЕМ, среда Хенкса, эмбриональная бычья сыворотка (FBS), фосфатный буфер (PBS), поли- L-лизин, гидробромид 3-(4,5-димeтилтиaзoл-2-ил)-2,5- тетразолия (MTT), диметилсульфоксид (DMSO) (ICN), фактор роста нервов из мышиной поднижнечелюстной железы (NGF-7s) с мол. массой 130 кДа (Sigmа). Трис- HCl (Sеrvа), дитиотрейтол, додецилсульфат натрия (SDS) (Вiо-Rаd), Tвин-20, TEMEД(Bio-Rad), aкpилaмид(Bio-Rad), метилен-бис-акриламид (Вiо-Rаd), смесь ингибиторов протеаз (Вiоmоl), реактив Фолина (Мегсk), 1 -мeтил-4-фeнил- 1,2,3,6- тетрагидропиридин (MPTP) (Sigmа), ECL - электрохемилюминисцентный реагент (Sапtа Сruz Вiоtесhпоlоgу).
Первые козлиные поликлональные антитела M- 19 на крысиную HSP32 (гемоксигеназа - 1) (Stгеssgеп) и мышиные моноклональные антитела W27 на HSP70 из клеток HeLa (Stгеssgеп). Первые мышиные моноклональные антитела E-6 против фосфорилированной формы крысиной тирозинкиназы А (рТrkА) (Sапtа Сruz Вiоtесhпоlоgу). Вторые козлиные антитела к моноклональным мышиным антителам, коньюгированные с пероксидазой хрена (Sапtа Сruz Вiоtесhпоlоgу). Вторые козлиные антитела к поликлональным кроличьим антителам, коньюгированные с пероксидазой хрена (Sапtа Сruz Вiоtесhпоlоgу). Установки для электрофореза (Мiпi-Рrоtеап 2 CeIl) и переноса белков (Sеmi-drу) (Вiо-Rаd) на мембрану PVDF.
Методы •
Культивирование клеток Культивирование клеток PC12, HT-22
Культура клеток феохромоцитомы коры надпочечников крысы линии PC 12 была получена из музея клеточных культур Института молекулярной генетики РАН. Культура иммортализованных клеток гиппокампа мыши линии HT-22 - подарок профессора Ф. Виеганта из Утрехтского университета (Голландия). Клетки культивировали в среде ДМЕМ, содержащей 5% FBS, 2мM L- глутамина. Клетки инкубировали при 37°C и 5% CO2 . Смену культуральной среды производили через 24 часа после рассева и каждые последующие 3 дня. Рассев в культуральные флаконы общей площадью 75 см2 осуществляли каждую неделю.
Выделение и культивирование нейронов среднего мозга и гиппокампа мбрионов крыс
Для эксперимента использовали 18-ти дневные эмбрионы крыс линии MR
(Маudslеу rеасtivе). Десекцию мозга и выделение нейронов среднего мозга и гиппокампа производили в среде Хенкса. Далее выделенные нейроны переносили в центрифужные пробирки со средой ДMEM/F-12, ресуспендировали и центрифугировали в течение 10 мин при 1500 об/мин. Затем надосадочную жидкость сливали, добавляли 2 мл среды ДMEM/F-12 и снова центрифугировали при тех же параметрах. Процедуру смены среды повторяли, клетки снова ресуспендировали, считали и рассаживали в культуральные 48-лyнoчныe планшеты с плотностью 350- 400 тыс. клеток на лунку.
Подготовка культуральных планшетов
Эксперименты проводили с использованием культуральных 96, 48, и 6- луночных планшетов. Лунки обрабатывали в течение 30 минут раствором поли-L- лизина (0, 1 мг/мл) в стерильной деионизированной (μQ, Миллипор) воде. Затем лунки промывали трижды стерильной водой и высушивали в ламинарном боксе при комнатной температуре.
Рассев клеток для постановки экспериментов
Клетки PC 12 и HT-22 рассеивали на 96-лyнoчныe планшеты с плотностью 3,5xlO3 на лунку, на 6-лyнoчныe планшеты - 500 хlО3 на лунку. Нейроны среднего мозга и гиппокампа рассеивали в 48-лyнoчныe культуральные планшеты с плотностью 350 хlО3 клеток на лунку. Все типы клеток рассеивали в среде ДМЕМ. В случае клеток линий PC 12 и HT-22 добавляли 5% сыворотки FBS, а для культивирования эмбриональных нейронов - 10% FBS. Эксперименты проводились на линейных клетках на 3 день после пассажа, на нейронах из эмбрионов - на 6 день. Клетки культивировались до образования монослоя. Получение дифференцированных клеток PC 12 для постановки экспериментов
Клетки рассеивали с плотностью 3,5x103 на лунку в среде ДМЕМ с 5% FBS и добавляли NGF (100 нг/мл) в момент посева, затем каждые 48 часов. Все эксперименты с дифференцированными PC 12 проводили на 6 день культивирования.
Исследование способности низкомолекулярных пептидомиметиков фактора роста нервов вызывать дифференцировку PC 12
Недиференцированные клетки PC 12 рассеивали с плотностью 3,5x103 на лунку в среде ДМЕМ с 1% FBS. В момент посева в среду культивирования добавляли NGF (100 нг/мл, положительный контроль) или изучаемые вещества в конечной концентрации от 10"5 до 10"9M. В дальнейшем исследуемые пептиды и NGF вносили в среду в одной серии опытов каждые 24 часа, в другой серии - каждые 48 часов в течение 6 суток. О степени дифференцировки клеток судили по форме и размерам клеток, количеству и длине отростков.
Модель оксидативного стресса
Для индукции оксидативного стресса клетки помещали в культуральную среду с 5% FBS, в которую добавляли свежеприготовленный раствор H2O2 в конечной концентрации 1,5 мМ и инкубировали в течение 30 мин в 5% CO2 при 37°C. После этого заменяли среду и культивировали в течение 4 часов в тех же условиях.
Моделирование болезни Паркинсона в культуре клеток линии PC12
Для моделирования болезни Паркинсона использовали MPTP в конечной концентрации I MM [Shimоkе К., Сhibа H. Nеrvе grоwth fасtоr ргеvепts l-mehyl-1-4- phenyl-l,2,3,6-tetrahydropyridine-induced сеll dеаth viа thе Аkt раthwау bу suррrеssiпg caspase-3-like асtivitу using PC 12 сеlls: rеlеvапсе tо thеrареutiсаl аррliсаtiоп fоr Раrкiпsоп's disеаsе, J Nеuгоsсi Rеs. 2001, 63, 402-409.]. MPTP вносили в клеточную среду, содержащую 1% FBS, через 24 часа после пассажа клеток. Пептиды добавляли в клеточную среду одновременно с MPTP или за 24 часа до него. Выживаемость клеток определяли через 24 часа с использованием МТТ-теста. Определение жизнеспособности клеток в культуре
Определение жизнеспособности клеток проводили с использованием МТТ- теста. MTT - водорастворимая соль тетразолия желтого цвета, легко проникающая в клетки. В живых клетках MTT превращается в нерастворимые в воде кристаллы формазана фиолетового цвета. По окончании эксперимента среду культивирования заменяли раствором MTT (0,5 мr/мл) и инкубировали 30 минут при 37°C и 5% CO2. Затем отбирали раствор MTT из лунок и добавляли для растворения формазана DMSO. После этого измеряли оптическую плотность раствора на спектрофотометре "Мultisсап" (Тhеrmо) при длине волны 600 нм.
Методика Вестерн-блота
Содержание Hsp70, Hsp32 и рТrkА определяли в цитоплазматической фракции нейронов линии HT-22. В случае белков теплового шока вещество добавляли к культуре за 24 часа до тестирования, после чего клетки отмывали от культуральной среды раствором PBS. В случае рТrkА вещество добавляли к культуре непосредственно перед лизисом клеток на 1 или 2 минуты, после чего культуральную среду отмывали PBS. Затем клетки соединяли с лизирующим буфером (50 mМ Тгis- HCl, 5mM EDTA, ImM DTT, 1% Тritоп X-100), рН 7,5 при температуре 4°C, лизировали в течение 5 минут, затем соскребали, помещали в центрифужную пробирку объемом 1,5 мл и центрифугировали 10 минут при 13000 об/мин и 4°C. Супернатант, содержащий белки цитозоля, анализировали с использованием электрофореза и иммуноблоттинга. Белки разделяли в 10% полиакриламидном геле (ПААГ). Перенос белков с ПААГ на мембрану PVDF осуществляли электроэлюцией в течение 45 минут. Преинкубацию Вестерн-блотов проводили в растворе TBST с добавлением 1% Tвин-20 с 5% (вес/объем) обезжиренным молоком в течение 1 часа. Затем Вестерн-блоты инкубировали в присутствии первых поликлональных антител против Hsp32 при разведении 1 :1000, первых моноклональных антител против Hsp70 в таком же разведении 1 :1000, первых моноклональных антител против фосфорилированной формы тирозинкиназы А в разведении 1:1000 в течение 1 часа. Затем после отмывки блоты инкубировали в присутствии вторых антител, конъюгированных с пероксидазой хрена (разведение 1 : 2000) в течение 1 часа. Детектирование Hsp32, Hsp70 и рТrkА осуществляли в реакции с ECL на пленку фирмы Коdаk.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием t- критерия Стьюдента. Результаты
1. Дифференцирующая активность
1.1. Влияние миметиков NGF ГK-1 - ГK-5 на дифференцировку клеток линии PC-12
Клетки PC- 12 при добавлении факторов роста нервов способны дифференцироваться по нейрональному типу, в связи с чем они применяются как объект исследования для выяснения дифференцирующей способности различных препаратов.
В среду культивирования добавлялись препараты ГK-1 - ГK-5 в конечных концентрациях 10"5 M - 10"8 M. В качестве положительного контроля использовался NGF в конечной концентрации 100 нг/мл.
Было показано, что данные пептидомиметики ГK-1 - ГK-4 фактора роста нервов не вызывали дифференцировку клеток линии PC- 12 ни в одной из концентраций. Однако, ГK-1 в концентрации 10~5 M снижал дифференцирующий эффект NGF на 50% (результат получен путем подсчета количества дифференцированных и недифференцированных клеток).
ГK-5 обладает дифференцирующим действием в конечных концентрациях 10"5 М и 10"6 M.
Для изучения возможного модулирующего действия пептидов ГK-3, ГK-4 и ГK-5 на эффекты NGF их вносили в конечных концентрациях ГK-3 10"6 M, ГK-4 10"7 M и ГK-5 10"6 M. Все эти пептиды в исследуемых конечных концентрациях оказывали модулирующее действие на дифференцирующие эффекты NGF. При измерении самых длинных отростков и начала их ветвления после сочетанного внесения ГK-3 с NGF оказалось, что величина их практически не отличается от таковых при внесении фактора роста нервов. Однако ветвятся эти отростки гораздо дальше от тела клетки, чем в пробах с NGF (25 мкм и 14 мкм соответственно), что свидетельствует об увеличении способности нейронов к регенерации. Эффект ГK-3 наступает через 4 дня после начала эксперимента.
Морфология популяции клеток, образующихся из PC- 12 в присутствии ГK-3 и NGF свидетельствует о том, что данный пептид может оказывать положительное действие на нейроны периферической нервной системы, в частности на парасимпатические и симпатические ганглии, а также на чувствительные ганглии спинного мозга. Поэтому данный пептид может оказаться эффективным в ситуациях, когда нарушается иннервация внутренних органов. При измерении самых длинных отростков и начала их ветвления после внесения ГK-4 совместно с NGF оказалось, что величина отростков больше, чем при внесении только NGF (65 мкм и 36 мкм соответственно). Начало ветвления отростков от тела клетки ближе, чем при внесении NGF (20 мкм и 31 мкм соответственно). После сочетанного внесения ГK-4 и NGF в популяции дифференцированных клеток можно выделить три основные морфологические группы нейронов: униполярные (сенсорное ядро тройничного нерва), псевдоуниполярные (сгруппированы вблизи спинного мозга в межпозвонковых ганглиях) (10%) и вставочные (90 %). Центральная нервная система состоит на 90% из вставочных нейронов, которые служат для переработки и переключения нервных импульсов. Один или несколько нейронов могут находиться между афферентными (от органов чувств в центральные отделы нервной системы) и эфферентными нейронами (двигательные, моторные - импульсы к органам). Особенно их много в ретикулярной формации заднего и среднего мозга, базальных ганглиях. Поэтому данный пептид целесообразно использовать в ситуациях, когда в ходе нейродегенеративных процессов (например, при ишемическом и геморрагическом инсульте) происходит нарушение моторных функций. Часть клеток остается недифференцированными. Эффект ГK-4 наблюдается гораздо позже, чем ГK-3. Это характерно для развития вставочных нейронов в организме при так называемой «эмбpиoнaльнoй модели компенсацию).
При измерении самых длинных отростков и начала их ветвления после совместного внесения ГK-5 с фактором роста нервов оказалось, что начало их ветвления не отличается от проб с NGF, но максимальная величина отростков больше (55 мкм и 37 мкм соответственно). Данный пептид может оказаться эффективным в ситуациях, когда нарушается иннервация внутренних органов.
Таблица 1.1. Влияние ГK-4 и ГK-5 на дифференцирующую активность NGF на клетках PC 12 Контроль NGF(IOO ГK-4(10"7 ГK-4(10"7 ГK-4(10-7 нг/мл) M) + M) + M) +
NGF(IOO NGF(50 NGF(30 нг/мл) нг/мл) нг/мл)
Максимальная 8±0,2 36±7,7* 65±12,2' 56±13,2' 52±10,3' длина отростков клеток, мкм на 6-й день Контроль NGF(IOO ГK-5(10-6 ГK-5 (106 ГK-5(10" нг/мл) M) + M)+ M) +
NGF(IOO NGF NGF(30 нг/мл) (50 нг/мл) нг/мл)
Максимальная 7±0,6 37±7,7* 55±1 1,3' 73±9,5' 67±4,5' длина отростков клеток (мкм) на 6-й день
2. Нейропротективная активность
2.1. Влияние миметиков нейротрофинов на жизнеспособность нейронов линии HT-22
ГK-2 в концентрациях 10-5- 10-8M, как и NGF в концентрации 100 нг/мл, введенный при посеве клеток и каждые последующие 24 часа в течение 10 дней, улучшает жизнеспособность нейронов в отсутствии каких-либо повреждающих факторов (табл. 1.2.).
Таблица 1.2
Figure imgf000072_0001
* - р < 0,05 относительно контроля по t-критерию Стьюдента.
Миметик NGF ГK-2в снижал жизнеспособность клеток HT-22 (Рис.1.1.).
2.2. Изучение нейропротекторных свойств миметиков NGF и BDNF в культуре клеток линии HT-22 в условиях оксидативного стресса
Заявляемые соединения влияли на жизнеспособность гиппокампальных клеток в условиях оксидативного стресса (Табл.1.3. -1.8., рис.1-5). При этом пептиды ГK-1 и ГCБ-104 ухудшали выживаемость нейронов, а пептиды ГK-2, ГK-2a, ГK-26, ГK-2д, ГK-2e, Г-K-3, ГK-4, ГK-5, ГK-6, ГCБ-106, ГCБ-104, ГБK-108 улучшали выживаемость нейронов, будучи введены за 24 часа до стресса в интервале концентраций 10'5- 10"
9M. Таблица 1.3
Figure imgf000073_0001
Достоверность отличий от контроля: * - р < 0,05. Достоверность отличий от H2 O2 : Л р < 0,05.
Таблица 1.4
Figure imgf000073_0002
Достоверность отличий от H2 O2: Л - р < 0,05. Таблица 1.5
Название гpyпп,n=12 Значения оптической плотности
Контроль 0,1275±0,021 H2O2, 1,5 мМ 0,087 ±0,006 *
ГK-2a, 10 ,-°5 M 0,108±0,019Л ГK-2a, 10" 6M 0,092±0,02 ГK-2a, 10"7 M 0,102±0,024 ГK-2a, 10"8 M 0,106±0,028 Таблица 1.6
Название гpyпп,n=12 Значения оптической плотности
Контроль 0,lll±0,009 H2O2, 1,5 мМ 0,093 ±0,004 * NGF , 100 нг/мл 0,103±0,018 ГK-3, 10"5 M 0,109±0,019 ГK-3, 10" 6M 0,ll±0,014Л ГK-3, 10"7 M 0,099±0,014 ГK-3, 10"8 M 0,091±0,014 Достоверность отличий от контроля: * - р < 0,05. Достоверность отличий от H2 O2 : Л
- р < 0,05.
Таблица 1.7
Название гpyпп,n=12 Значения оптической плотности
Контроль 0,123±0,013
H2O2, 1,5 мМ 0,097±0,017*
NGF , 100 нг/мл 0, 103±0,018
ГK-4, 10-5 M 0,104±0,015
ГK-4, 10" 6M 0,101±0,009
ГK-4, 10'7 M 0, 109±0,0141 Λ
ГK-4, 10"8 M 0,104±0,016
Достоверность отличий от контроля: * - p< 0,05. Достоверность отличий от H2 O2 : Л - р < 0,05
Таблица 1.8
Название гpyпп,n=12 Значения оптической плотности
Контроль 0,097±0,009
H2O2, 1,5 мМ 0,056±0,009 *
NGF , 100 нг/мл 0,071±0,009 Л
ГK-5, 10"5 M 0,065±0,008
ГK-5, 10" 6M 0,066±0,008 л
ГK-5, 10"7 M 0,062±0,009
ГK-5, 10"8 M 0,058±0,007
Достоверность отличий от контроля: * - р < 0,05. Достоверность отличий от H2 O2 : A - р < 0,05.
* p<0,05 относительно контроля, Л p<0,05 относительно H2O2 по t-критерию Стьюдента.
Был проведен эксперимент, при котором пептид ГK-2 вводили сразу после оксидативного стресса (Табл.1.9.). ГK-2 показал лечебный эффект в концентрациях 10"5 - 10"8M. Таблица 1.9. Влияние различных концентраций ГK-2 на выживаемость клеток линии HT-22, введенного после оксидативного стресса.
Figure imgf000075_0001
Достоверность отличий от H2 O2: Л - P < 0,05. ГГKK--11 ( (10~5 M), введенный за 30 минут до ГK-2, снимал нейропротекторный эффект ГK-2.
2.3. Оценка нейропротекторного действия ГK-2 на культурах нейронов среднего мозга и гиппокампа 18-ти дневных эмбрионов крысы в условиях оксидативного стресса
ГK-2 в концентрации 10"5 M проявил активность на первичной культурой нейронов среднего мозга и гиппокампа 18-ти дневных эмбрионов крысы на модели оксидативного стресса, будучи введенным за 24 часа до стресса (табл.1.10., 1.11.).
Таблица 1.10. Влияние пептида ГK-2 на выживаемость нейронов среднего мозга 18-ти дневных эмбрионов крысы после оксидативного стресса.
Figure imgf000075_0002
Достоверность отличий от контроля: * - P < 0,05. Достоверность отличий от H2 O2: Л - P < 0,05.
Таблица 1.11. Влияние пептида ГK-2 на выживаемость гиппокампальных нейронов 18-ти дневных эмбрионов крысы после оксидативного стресса.
Figure imgf000075_0003
Достоверность отличий от H2 O2: Л - P < 0,05.
Полученные результаты показывают, что пептид ГK-2 обладает нейропротекторным эффектом в отношении эмбриональных нейронов гиппокампа и среднего мозга.
2.4. Активность ГK-2,ГK-2a, ГK-3, ГK-4, ГK-5 в клеточной модели болезни Паркинсона
В условиях клеточной модели болезни Паркинсона ГK-2 обладает достоверным защитным эффектом. Этот эффект проявляется при внесении ГK-2 одновременно с MPTP только в концентрации 10~5, тогда как при внесении за 24 часа до MPTP он активен в концентрациях и 10'5, и 10"8M (Рис.1.9, 1.10.). Пептиды ГK-2a, ГK-3, ГK-4, внесенные за 24 часа до MPTP на модели болезни Паркинсона, обладали защитным эффектом (Рис. 1.11.). Пептид ГK-5 был неактивен в этом тесте.
2.5. Защитный эффект заявляемых соединений в условиях глутаматной цитотоксичности на культуре клеток HT-22
Пептиды ГK-2, ГK-4 и ГCБ-106 проявляли защитный эффект в условиях глутаматной цитотоксичности на культуре клеток HT-22, будучи введенными за 24 часа до глутмата (Рис.1.12., табл. 1.12.). Миметик BDNF ГCБ-106 был активен в интервале концентраций 10"5-10~8M, причем глубина эффекта с уменьшением концентрации увеличивалась. Таблица 1.12
Figure imgf000076_0001
Достоверность отличий от контроля: * - р < 0,05. Достоверность отличий от M PTP: A - р < 0,05.
3. Исследование влияния ГK-1, ГK-2, ГK-3, ГK-4, ГK-5 на белки теплового шока в культуре клеток линии HT-22
Хорошо известно, что NGF активирует синтез белков теплового шока Hsp32 и
Hsp70 [Liu, H.; Nоwаk, R.; Сhао, W.; Вlосh, К.D. Nегvе gгоwth iпduсеs апti-арорtоtiс hеmе oxygenase-1 iп rаt рhеосhгоmосуtоmа PC 12 сеlls, J. оf Nеurосhеm. 2003, 86, 1553- 1563; Роllасk, SJ. апd Наrреr, SJ. Smаll Моlесulе Тrk Rесерtоr Аgопists апd Оthеr Nеurоtrорhiс Fасtоr Мimеtiсs; Сurrепt Drаg Таrgеts-СNS апd Nеurоlоgiсаl Disоrdеrs 2002, 1, 59-80;], которые проявляют нейропротекторное действие.
По результатам Вестерн-блот анализа, проведенного через 24 часа после внесения пептидов в культуру гиппокампальных нейронов линии HT-22, ГK-1 в конечных концентрациях 10"5 M и 10"8 M не влияет на накопление данных белков. ГК- 2 в конечных концентрациях 10"5 M и 10"8 M вызывает накопление белков Hsp70 и Hsp32. (Pиc.1.13, 1.14.). При внесении ГK-1 (10"5 M) за 30 минут до ГK-2 увеличение количества Hsp32 и Hsp70 не наблюдается (Рис.1.13, 1.14). ГK-3 в конечной концентрации 10"6 M вызывает небольшое накопление Hsp32 и не влияет на количество Hsp70 (Рис.1.15, 1.16.). Внесение ГK-4 (10~7 M) приводит к достоверному увеличению синтеза Hsp70 и не влияет на накопление Hsp32 (Рис.1.15, 1.16.). ГK-5 (10~6 M) наоборот увеличивает синтез Hsp32 и не влияет на содержание Hsp70 (Рис.1.15, 1.16.).
По-видимому, защитный эффект заявляемых соединений связан с синтезом белков теплового шока.
4. Влияние пептидов на процесс фосфорилирования тирозинкиназы А в культуре нейронов линии HT-22
Результаты Вестерн-блот анализа влияния ГK-1, ГK-2, ГK-3, ГK-4 и ГK-5 на фосфорилирование тирозинкиназы А по сравнению с NGF говорят о том, что на первой минуте экспозиции с клетками HT-22 сам NGF практически не увеличивает фосфорилирование тирозинкиназы А. В то же время дипептиды ГK-2, ГK-3, ГK-4 и ГK-5 уже на первой минуте увеличивают количество фосфорилированной тирозинкиназы (Рис. 1.17., 1.18, 1.19.). Пептид ГK-1, напротив, на первой минуте уменьшал фосфорилирование ТrkА (Рис.1.19.). Это согласуется с его антагонистической по отношению к NGF активностью в тестах iп vitrо (уменьшение выживаемости клеток и ингибирование дифференцирующей активности NGF). Остальные пептиды проявляют агонистические эффекты.
На второй минуте экспозиции NGF показывает увеличение фосфорилирования тирозинкиназы. При этом эффект ГK-2 становится более выраженным по сравнению с 1-й минутой (Рис.1.20.).
Таким образом, пептиды ГK-1 - ГK-5 являются лигандами ТrkА-рецептора.
Анализ полученных данных об активности заявляемых соединений iп vitrо позволяет заключить следующее:
Миметики как 4-й, так и 1-й петель NGF и BDNF влияют на выживаемость нейронов. При этом мономерные миметики 4-й петли уменьшают жизнеспособность нейронов и их выживаемость в повреждающих условиях, таких как оксидативный стресс, глутаматная эксайтотоксичность и действие нейротоксина MPTP. Димерные аналоги этой же петли, напротив, обладают нейропротективной активностью. Эта активность зависит от длины спейсера между дипептидными фрагментами миметиков.
В случае миметиков 1-й петли NGF как мономерные, так и димерные аналоги обладают нейропротективной активностью. В дополнении к нейропротективной активности, эти миметики проявляют дифференцирующую активность или способны модулировать дифференцирующую активность NGF. Мономерные аналоги 4-й петли, обладающие нейродегенеративной активностью, способны ингибировать дифференцирующие эффекты NGF.
Все миметики нейротрофинов с нейропротективной активностью, как и сам NGF, увеличивают синтез белков теплового шока Hsp32 и/или Нsр 70 в зависимости от структуры миметика, а также увеличивают количество фосфорилированной формы ТrkА. Это указывает на то, что заявляемые соединения действительно являются миметиками нейротрофинов и действуют через тирозинкиназные рецепторы.
П. Результаты биологического изучения заявляемых соединений iп vivо
Заявляемые соединения с нейропротективной активностью, выявленные в экспериментах iп vitrо, были изучены на животных моделях нейродегенеративных заболеваний, таких как инсульт, ишемия мозга, болезнь Паркинсона, болезнь Альцгеймера. Для экспериментов на животных моделях было выбрано наиболее активное в отношении нейропротективных эффектов соединение - димерный миметик 4-й петли NGF ГK-2.
Миметики BDNF были изучены на классической животной модели для выявления антидепрессивной активности.
1. Противоинсультная активность
1.1. Активность ГK-2 на модели ишемического инсульта, индуцированного односторонним внутрисосудистым перекрытием ветви средней мозговой артерии
Методика
Работа выполнена на самцах беспородных крыс массой в среднем 270 г. Все взятые в эксперимент животные были разделены на группы: JIO - ложнооперированные; ИШ - крысы с ишемическим инфарктом головного мозга; ИШСГ — животные, которым через 1 час, сутки и двое суток после ишемии вводили ГK-2 в физиологическом растворе из расчета 1 мг препарата на 1 кг веса животного внутрибрюшинно (всего 3 инъекции). Другим группам в эти же временные интервалы вводили такой же объем физиологического раствора, но без препарата.
Животных перед операцией анестезировали хлоралгидратом (ЗООмг/кг, в/б). Ишемию головного мозга крысы вызвали введением в среднемозговую артерию покрытой силиконом (Shimаmurа N, Маtсhеtt G, Тsubоkаwа T, Оhkumа H, Zhang J. Соmраrisоп оf siliсоп-соаtеd пуlоп sutuге tо рlаiп пуlоп suturе iп thе rаt middlе сеrеbrаl агtеrу оссlusiоп mоdеl.J Nеurоsсi Меthоds. 2006 , 156(1 -2): 161-5) нейлоновой нити, как было описано ранее (Zеа Longa E, Weinstein PR, Carlson S & Cummins R. (1989) Rеvеrsiblе middlе сеrеbrаl агtеrу оссlusiоп withоut сrапiесtоmу iп rаts. Strоkе 20: 84-91). Окклюзию проводили в течение 60 мин, после чего нить извлекали из сосуда, восстанавливая кровоснабжение в бассейне средней мозговой артерии. Во время и после операции температура тела животного поддерживалась на уровне 37D5DC. Ложнооперированные животные подвергались тем же процедурам, за исключением перерезки сосудов и введения нити.
Все поведенческие тесты проводились за один день до начала операции, так называемая базовая линия. После операции неврологический дефицит животных оценивался на 4-й и 7-й день по тесту стимулирования конечностей и на 7 день по тесту «цилиндp» (Sсhаllеrt T, Fleming SM, Lеаsurе JL, Tillerson JL, Bland ST. CNS рlаstiсitу апd аssеssmепt оf fоrеlimb sепsоrimоtоr оutсоmе iп uпilаtеrаl rаt mоdеls оf strоkе, соrtiсаl аblаtiоп, раrkiпsопism апd sрiпаl соrd iпjurу. Nеurорhаrmасоlоgу. 2000 Маг 3;39(5):777-87). Анализ поведения животных проводился с двойным слепым контролем. В тесте "цилиндр" оценивается асимметрия использования животным передних конечностей в течение спонтанного исследования стенок цилиндра.
Для оценки сенсоромоторного восстановления конечностей крысы применяли модифицированную версию теста стимулирования кoнeчнocтeй» (Limb-рlасiпg) De Rусk M, Van Reempts J, Воrgеrs M, Wаuquiеr А, Jапssеп PA. Рhоtосhеmiсаl strоkе mоdеl: fluпаriziпе рrеvепts sепsоrimоtоr dеfiсits аftеr пеосоrtiсаl iпfаrсts iп rаts.Strоkе. 1989, 20(10): 1383-90). Тест заключается в ответе задних и передних конечностей на тактильную и проприоцептивную стимуляцию. Тест состоял из 7 различных испытаний для левой и правой стороны тела. Для оценки нарушений в работе конечностей использовали следующую систему подсчета: 2 балла - крыса полностью выполняла испытание; 1 балл - крыса выполняла испытание с задержкой в более чем 2с и/или не полностью; 0 баллов - крыса не отвечала на стимулирование конечности. Головной мозг всех экспериментальных животных исследовали с помощью магнитно-ядерной резонансной томографии (ЯМРТ) на 7-е сутки после операции. Все ЯМРТ эксперименты были выполнены на приборе ВiоSрес 70/30 (Вrukеr, Gеrmапу) с индукцией магнитного поля 7 Тл и градиентной системой 105 мТл/м.
Для передачи РЧ-сигнала использовали линейный трансмиттер с внутренним диаметром 72 мм, для детекции РЧ-сигнала - поверхностную приемную катушку для мозга крысы. Для получения T2-взвeшeнныx изображений использовали импульсную последовательность на основе спинового эха - RARE (Rарid Асquisitiоп with Rеlахаtiоп Епhапсеmепt) со следующими параметрами: TR = 6000 мс, ТЕ = 63,9 мс, толщина среза 0,5 мм, поле зрения 4,2 х 3,1 см, размер матрицы 256 х 384, разрешение 0,164 х 0,164 мм/пиксель. Общее время сканирования - 4 мин. 48 сек. Животных анестезировали хлоралгидратом и помещали в устройство позиционирования с системой стереотаксиса и терморегуляции. Во время MPT исследования измеряли ЭКГ, частоту дыхания и ректальную температуру с помощью прибора для контроля жизнедеятельности Smаll Апimаl Мопitоriпg апd Gаtiпg Sуstеm, (SA Iпstrumепts Iпс, USA). Анализ МР-изображений проводился в программе ImаgеJ 1.38x (Nаtiопаl Iпstitutеs оfНеаlth, USA)
Используя программу для анализа изображений, измеряли площадь инфаркта, включающую в себя кору и подкорковые структуры для каждого среза. Объем инфаркта (V) определяли по формуле: V=d*ΣAi, где ΣАi - сумма площадей повреждения на всех срезах, d - толщина срезов.
На T2-взвeшeнныx МР-изображениях, полученных на 7-е сутки после ишемии определяли: объем инфаркта, % отека мозга (Вагопе FC, Сlаrk RK, Feuerstein G, Lenkinski RE, Sаrkаr SK. Quапtitаtivе comparison of magnetic resonance imaging (MRI) апd histоlоgiс апаlуsеs оf fосаl isсhеmiс dаmаgе iп thе rаt. Вrаiп Rеs BuIl. 1991, 26(2):285-91). Статистическую обработку данных проводили с использованием компьютерной программы Stаtistiса 6.0 ("StаtSоft", USA). Нормальность распределения признака в выборке оценивали по W критерию Шапиро-уилка. Для оценки статистической значимости различий в поведенческих тестах использовали U критерий Манна-Уитни. Данные представлены в виде: среднее D ошибка среднего. Результаты
За сутки до ишемии (день -1) проводили базовое исследование нейрологического статуса всех животных при помощи тестов «Limb-placing» и «цилиндp». Далее через 1 час, сутки и двое суток (всего 3 инъекции) после ишемии вводили ГK-2 в физиологическом растворе из расчета 1 мг препарата на 1 кг веса животного внутрибрюшинно. Другим группам в эти же временные интервалы вводили такой же объем физиологического раствора, но без препарата. На 4-й день животные были исследованы при помощи теста «Limb-placing», а на и 7-й тестов «Limb-placing» и «цилиндp», а также проведено ЯМРТ исследование головного мозга .При исследовании головного мозга крыс на 7-е сутки после ишемии с помощью ЯМРТ зона поражения определялась как повышение сигнала (гиперинтенсивность) на T2-взвeшeнныx изображениях по отношению к интактному белому веществу, за счет развития цитотоксического отека. По нашим результатам, к этому времени отек пораженного полушария был небольшой и составлял всего 3% относительно контролатерального полушария. В контрольной группе животных отек поврежденного полушария наблюдался у 46%, в группе леченых ГK-2 только у 9% животных. Данные по различию количества животных с отеком в группах ИШ и ИШСГ являются статистическими значимыми (p=0.019 вычислен с двухсторонним критерием статистической значимости для различий между двумя пропорциями). Смертность составила по 3 животных как в контрольной, так и в опытной группах. По результатам морфометрии ЯМРТ-изображений размер ишемического очага у животных, которым инъецировали только физиологический раствор, был равен 266+20 мм3 (n=12 животных). При лечении ГK-2 наблюдалась тенденция уменьшения очага повреждения, в этом случае его объем был 222+16 мм3 (n=12 животных) (pиc.2.1.). По средним данным объем очага уменьшался на 16,5%.
Количественные данные, указывающие на уменьшение объема очага у животных, которым инъецировали ГK-2, полностью коррелировали с данными о сенсоромоторных нарушениях конечностей этих животных, полученных с помощью поведенческих тестов. С помощью теста «limb» показано, что лечение в послеишемический период препаратом ГK-2 позволило достоверно уменьшить нейрологический дефицит у ишемизированных животных. Если интактные крысы набирают в тесте «limb» 14 баллов, то после ишемии этот показатель составлял 3+0,38 и 4,46+0,4 на 4-й и 7-й день после ишемии соответственно. Трехкратное введение препарата позволило достоверно улучшить эти показатели до 5,9+0,62 для 4-го дня после ишемии и 7,67+0,75 для 7-го дня. Результаты поведенческих тестов представлены на (рис. 2.2.).
В тесте «цилиндp» перед индукцией ишемии независимое использование контро- и ипсилатеральной передней лапы у групп ИШ и ИШСГ было примерно одинаковым. На 7 день после операции у крыс группы ИШ использование поврежденной лапы (контролатеральной поврежденному полушарию головного мозга) и одновременное использование 2-х лап статистически значимо снижалось. Это снижение было гораздо менее выражено у крыс, которым после ишемии вводили ГK-2 (Pиc.2.3.).
Таким образом, ГK-2 проявляет четко выраженную антиишемическую активность, которая выражается как в снижении объема пораженного участка головного мозга, так и в достоверном снижении неврологического дефицита у животных, которым в послеишемический период инъецировали препарат
1.2. Активность ГK-2 на модели ишемического инсульта, вызванного двусторонним фототромбозом кровеносных сосудов префронтальной коры головного мозга
Методика
Животные - беспородные крысы-самцы 180-200г.
Этапы эксперимента: операция фототромбоза, исследование двигательной активности (до и на 9 сутки после фототромбоза); выработка УРПИ и проверка сохранения на 9-ые сутки после фототромбоза; забой животных, извлечение и фиксация мозгов; морфологическое исследование и вычисление объема очага ишемии.
Вещество вводили внутрибрюшинно в дозе 1 мг/кг по следующей схеме: через 1 час после операции, через 24 часа после 1-го введения, на 4-е сутки и на 6-е сутки после первого введения.
УРПИ вырабатывали по следующей схеме. Определяли латентный период (ЛП) - время, которое проходило от начала теста до момента пересечения крысой отверстия, разделяющего освещенный и темный отсеки камеры. В первый день обучения крысу помещали в освещенный отсек (лампа мощностью 100Вт), обследовав который, она через некоторое время (ЛП до обучения) переходила в темный отсек, после чего дверь в этот отсек камеры закрывали и оставляли там крысу на 5 мин. Через lч процедуру повторяли и крысу сразу извлекали из темного отсека. На следующий день эту же процедуру повторяли дважды с часовым интервалом. При повторном заходе крысы в темный отсек камеры дверь в него закрывали и через металлические прутья пола пропускали электрический ток (l,ЗмA, 50Гц, 5с). УРПИ считали выработанным, если ЛП составлял не менее 300с. Животных с меньшим ЛП исключали из эксперимента.
Двусторонний фокальный ишемический инфаркт префронтальной коры головного мозга крыс (поля FrI и Fr2 согласно атласу Рахiпоs апd Wаtsоп, 1986) создавали методом фотоиндуцируемого тромбоза (Wаtsоп еt аl. 1985). Животных наркотизировали хлоралгидратом (ЗООмг/кг, в/б). Фотосенсибилизируемый краситель бенгальский розовый (Sigmа Сhеm.Со.) вводили в яремную вену (3% раствор, 40мг/кг). Голову животных фиксировали в стереотаксисе и после продольного разреза кожи удаляли надкостницу.
Световод (диаметр светового пучка на выходе Змм) устанавливали на расстоянии lмм от поверхности черепа по координатам: 2,0 мм ростральнее брегмы и 2,0 мм латеральнее сагиттального шва. Облучение холодным светом (источник - ксеноновая лампа 25В, 250Вт) проводили в течение 15мин с каждой стороны. Ложнооперированные животные подвергались тем же процедурам, за исключением введения бенгальского розового. Для оценки функционального состояния животных исследовали уровень их двигательной активности (ДА) в автоматизированной установке POДЭO-1, время наблюдения 5 мин. Проводили анализ ДА до и на 9-ые сутки после фототромбоза префронтальной коры.
Для морфометрического измерения площади очага и объема ишемического повреждения использовали мозг экспериментальных животных, фиксированный методом погружения в смесь формалин-спирт-уксусная кислота (ФУС) в пропорции 2:7:1. После фиксации материал переносили на сутки в 70° спирт и резали в дистиллированной воде на вибротоме (vibrаtоmе sеriеs 1000 sесtiопiпg sуstеm Теспiсаl Рrоduсt international inc USA) с шагом 100 мкм. Каждый второй серийный вибротомный срез последовательно монтировали на предметных стеклах, покрытых желатиной, окрашивали 0,2% раствором метиленового синего. Далее препараты обрабатывали по стандартной гистологической методике: обезвоживали в спиртах восходящей концентрации, просветляли в ксилоле и заключали в бальзам. Гистологические препараты сканировали на слайдовой приставке сканера Ерsоп регfесtiоп V100 PHOTO. Этот метод позволяет получить файл с изображением среза мозга нежно-голубого цвета, на котором четко виден очаг ишемического повреждения - темноокрашенный по краю и светлый в середине. Иногда некротическая ткань распадается, в таком случае очагом поражения считали недостающий участок ткани. Площадь ишемического повреждения промеряли с помощью программ анализа компьютерного изображения в относительных единицах и соотносили с площадью сканированного квадрата со стороной 10 мм, получая значение площади повреждения в мм2.
Объем очага повреждения фотоиндуцированным тромбозом определяли по формуле: V = D Sn d, где d - толщина пары срезов (200 мкм); Sn - измеренная площадь ишемического очага серийного среза в мм ; D - сумма объемов ишемического повреждения на срезах.
Кэффициент эффективности защиты (КЭЗ) рассчитывали по формуле:
KЭЗ=( V0- Vв)/Vox 100%,
Где V0- средний суммарный объем очага поражения у животных с введением физраствора, Vв - средний объем очага поражения у животных с введением вещества. Этот параметр позволяет сравнивать эффективность действия различных веществ на разных моделях ишемии.
Результаты
Все экспериментальные животные были разделены на три группы:
1. Обученные + ложнооперированные
2. Oбyчeнныe+ фототромбоз префронтальной коры
3. Обученные+фототромбоз коры + ГK-2
У всех взятых в эксперимент животных до операции был выработан условный рефлекс пассивного избегания (УРПИ) — до латентности (ЛП) 300 сек.
Таблица 2.1. Латентный период УРПИ на 8-ые сутки после фототромбоза префронтальной коры (с) Ложнооперированные фототромбоз+физ. р-р фoтoтpoмбoз+ГK-2
300 20 300
300 30 300
300 103 300
300 38 300
300 105 300
300 300
300
300
Figure imgf000085_0001
После фототромбоза латентный период захода животных в темный отсек уменьшился с 300 с до 59,2с. У леченых ГK-2 крыс условный рефлекс полностью восстанавливался - латентный период был не менее 300 с (Табл.2.1.).
Таким образом, полученные данные патофизиологического исследования свидетельствуют о четко выраженном антиамнестическом эффекте препарата ГK-2 в условиях локальной ишемии мозга.
Объем поражения как левого, так и правого полушария, а также поражение на крысу и средний очаг поражения у леченых животных меньше (Рис. 2.4.).
ГK-2 наряду с антиамнестическим эффектом, который проявился в 100% сохранении УРПИ, выработанного до фотоиндуцированного тромбоза префронтальной коры, обладает и значительным нейропротективным действием — рассчитанный коэффициент эффективности защиты составил 61%. 1.3. Активность ГK-2 на модели геморрагического инсульта Методика
Эксперименты проводили на белых беспородных крысах-самцах массой 220- 250 г. Животных содержали в стандартных условиях вивария при свободном доступе к воде и пище. Моделирование локального кровоизлияния в головном мозге (ГИ) (интрацеребральная посттравматическая гематома), проводили по методике Макаренко (Макаренко А.Н. и др., ЖВНД, 2002, T.52,JЧ°6, C.765-768).
Для создания инсульта крыс наркотизировали хлоралгидратом (400 мг/кг внутримышечно), затем проводили трепанацию черепа и осуществляли деструкцию мозговой ткани в области внутренней капсулы с последующим (через 2-3 мин) введением в место повреждения крови (0.02-0.03 мл), взятой из-под языка животного. Таким способом моделировали локальный аутогеморрагический билатеральный инсульт в области внутренней капсулы (диаметр — 2 мм, глубина — 3 мм) без существенных повреждений расположенных выше образований мозга и неокортекса.
Через 24 ч после операции регистрировали неврологический дефицит, изменения в координации движений, мышечный тонус, ориентировочно- исследовательское поведение крыс.
Наблюдения проводили в течение 14 сут. после операции. Регистрировали особенности поведения и состояния животных на 1, 3, 7 и 14-е сутки.
Животные были разделены на 3 группы. В 1-ю вошли ложнооперированные (JlO) крысы, которым проводилась только трепанация черепа, во 2-ю — животные с ГИ, в 3-ю крысы с ГИ, которым вводили ГK-2 (1 мг/кг внутрибрюшинно через 3 ч после операции, затем через каждые 48 часов однократно 6 раз). Животным 1-й и 2-й групп вводили физиологический раствор в эквивалентном объеме.
Нарушения поведения и состояния животных после ГИ оценивали традиционными методами. Неврологический статус методом оценки неврологического дефицитата по шкале оценки инсульта МсGrоw в модификации И.В.Ганнушкиной; методом регистрации мышечного тонуса и координации движений; когнитивные функции по условному рефлексу пассивного избегания (УРПИ); ориентировочно- исследовательское поведение с помощью методики Открытого поля. Оценивали влияние препарата на выживаемость крыс.
Статистическую обработку данных проводили с вычислением средних арифметических и и их доверительных интервалов при p<0.05. Для оценки достоверности результатов использовали t-критерий Стьюдента и критерий χ2.
Результаты
ГK-2, введенный в дозе 1 мг/кг сразу после операции, и затем каждые 2-е сутки в течение 14 дней, полностью предотвращал гибель животных, в то время как в контроле общая гибель животных составила 40% (Табл. 2.2.). Число животных с нарушением координации движений в группе животных, леченых ГK-2 было в два раза меньше, чем в группе с ГИ и было близким к таковому в группе ложнооперированых животных (Табл. 2.З.). Количество животных с ослабленным мышечным тонусом в группе с ГK-2 практически не отличалось от количества животных в группе ложнооперированных и в среднем было вдвое меньше, чем в группе животных с ГИ (Табл. 2.4.).
ГИ вызывает у животных нарушение норкового рефлекса, которое отсутствует в группе животных, леченых ГK-2 (Табл. 2.5.). Обучение условному рефлексу пассивного избегания в группе животных с ГИ было также нарушено: 100% животных заходило в темную камеру, не помня об ударе током. В случае крыс, леченых ГK-2, на 1-е - 7-е сутки количество животных, зашедших в темную камеру, не отличалось от группы ложнооперированных животных. Латентный период первого захода леченых животных при этом статистически не отличался от ложнооперированных. На 3-й сутки наблюдалось статистически достоверное отличие этого показателя леченых животных от группы с ГИ (Табл. 2.6.). Таким образом, ГK-2 восстанавливает нарушенную при ГИ способность к обучению.
ГK-2 снижает выраженность неврологических нарушений до уровня ложнооперированных животных на 1, 3, 7 сутки по показателям замедленности движений, слабости конечностей, на 3-й сутки по показателю пореза 1-4 конечностей (Табл. 2.7.).
ГK-2 на 1-е и 7-е сутки после опреации восстанавливал нарушенные ГИ суммарные показатели двигательной активности и исследовательского поведения до уровня, зарегистрированного у ложнооперированных животных (Табл. 2.8.).
По результатам тестирования в крестообразном лабиринте ГИ вызывало повышенную тревожность у животных, которая статистически достоверно снималась ГK-2 начиная с первых суток на потяжении всего времени наблюдения (Табл. 2.9.).
Таким образом, ГK-2 обладает отчетливым противоинсультным действием у крыс с геморрагическим инсультом.
Таблица 2.2. Влияние ГK-2 на выживаемость животных после ГИ
Figure imgf000087_0001
* - достоверность отличий от ложно оперированных крыс при P < 0,05 (точный критерий Фишера)
# - достоверность отличий от инсультных крыс при P < 0,05 (точный критерий Фишера) Таблица 2.3. BлияниeГK-2 на координацию движений животных в тесте вращающегося стержня после геморрагического инсульта
Figure imgf000088_0001
* - достоверность отличий от ложно оперированных крыс при P < 0,05 (точный критерий Фишера)
# - достоверность отличий от инсультных крыс при P < 0,05 (точный критерий Фишера)
Таблица 2.4. Влияние ГK-2 на мышечный тонус животных в тесте горизонтальной перекладины после геморрагического инсульта
Figure imgf000088_0002
* - достоверность отличий от ложно оперированных крыс при P < 0,05 (точный критерий Фишера)
# - достоверность отличий от инсультных крыс при P < 0,05 (точный критерий Фишера) Таблица 2.5. Влияние ГK-2 на обучение
Figure imgf000089_0001
*- достоверность отличий от ложно оперированных крыс при P < 0,05 (t-тест
Стьюдента)
Таблица 2.6. Влияние ГK-2 на воспроизведение УРПИ у крыс с интрацеребральной посттравматической гематомой
Figure imgf000089_0002
* - достоверность отличий от ложно оперированных крыс при P < 0,05 (t-тест Стьюдента)
# - достоверность отличий от инсультных крыс при P < 0,05 (t-тест Стьюдента) Таблица 2.7. Влияние ГK-2 на неврологический дефицит у крыс после геморрагического инсульта по шкале МсGrоw
Figure imgf000090_0001
Таблица 2.8. Влияние ГK-2 на ориентировочно-исследовательское поведение и двигательную активность животных в условиях методики открытого поля после геморрагического инсульта
OO 1^O
Figure imgf000091_0001
*- достоверность отличий от ложно оперированных крыс при P < 0,05 (t-тест Стьюдента) #- достоверность отличий от инсультных крыс при P < 0,05 (t-тест Стьюдента)
О
Figure imgf000092_0001
Инсульт 67,4 ±41,8 67,4 ±41,8 8,6 ± 7,0 238,3 ±40,4 0* 0,4 ±0,2* 1,0 ±0,2
Инсульт + 2,5 ±0,3 '8,0 ± 2,2 9,2 ± 1,9 283,0 + 2,9 0,8 ± 0,4 1,1 ±0,2 1,5 + 0,2 ГK-2 (1 мг/кг)
14-е сутки после операции
Ложно 3,1 ±0,8 18,1 ± 12,5 29,7 ±15,0 252,2 ±28,1 0,7 + 1Д ±0,2 1,3 ±0,2 оперирован 0,15 ные
Инсульт 54,3 ± 49,2 57,7 ± 48,6 0,8 + 0,8 241,5 ± 48,4 0,2 + 0,2 + 0,2* 0,8 + 0,2
0,2*
Инсульт + 2,6 ± 0,4 16,4 ±8,5 8,8 + 2,3# 274,8 ±9,9 1,4 + 0,6 1Д ±0,3# 1,6 ± 0,4 ГK-2 (1 мг/кг)
ЧD
* - достоверность отличий от ложно оперированных крыс при P < 0,05 (t-тест Стьюдента)
# - достоверность отличий от инсультных крыс при P < 0,05 (t-тест Стьюдента)
Полученные результаты свидетельствуют о том, что изучаемое соединение ГК-
2 может быть полезно для лечения как ишемического, так и геморрагического инсультов. Это может позволить начать лечение пациентов с инсультом еще до проведения дифференциальной диагностики на самых важных первых этапах заболевания.
2. Антиишемическая активность
Старение, прогрессирующие нейродегенеративные и церевроваскулярные заболевания сопровождаются уменьшением мозгового кровотока. Недостаточное кровоснабжение тканей мозга вызывает гибель нейронов и, как следствие, неврологический дефицит и нарушение ряда когнитивных функций. Так, в частности, показано, что у пациентов с заболеваниями сонных артерий нарушаются различные психические функции (Ваkkеr F.C., Кlijп C.J., Jеппеkепs-Sсhiпkеl А., Карреllе LJ. Соgпitivе disоrdеrs iп раtiепts with оссlusivе disеаsе оf thе саrоtid аrtеrу: а sуstеmаtiс геviеw оf thе litегаturе. / Nеurоl. 2000. v. 247 (9), р. 669-676). Двусторонняя перевязка сонных артерий у крыс была использована для моделирования перманентной гипоксии головного мозга, связанной с ней нейрональной гибели и когнитивного дефицита (Вешiеtt S. A. L., Теппiswооd M., Сhеп Jiа-Нuа,. Dаvidsоп С. M, Кеуеs M. Т., Fоrtiп Т., Рарраs В. А. Сhгопiс сеrеbrаl hурореrfusiоп еliсits пеurопаl арорtоsis апd bеhаviоrаl imраirmепt. / NеuгоRероrt. 1998. v. 9, р. 161-166). Поведенческие тесты, выявляющие наличие психической патологии, вызванной ишемией (Открытое поле и Распознавание объектов), были выбраны в соответствии с рекомендациями Sагti еt аl., 2002 (Sагti С, Pantoni L, Bartolini L, Iпzitаri D. Соgпitivе imраirmепt апd сhгопiс сеrеbrаl hурореrfusiоп: whаt сап bе lеаrпеd fгоm ехреrimепtаl mоdеls. / J Nеurоl Sсi. 2002. v. 203- 204, р. 263-266).
2.1. Активность ГK-2 на модели ишемии, вызванной двусторонней перевязкой сонных артерий у крыс
Эксперименты были проведены на беспородных крысах-самцах массой от 350 до 420 г. Исследуемое соединение вводили внутрибрюшинно в дозе 1 мг/кг. В первый день эксперимента животные получили первую инъекцию соединения. Через 24 часа (день 2) им была проведена операция по двусторонней перевязке сонных артерий. Еще через 24 часа (день 3) животные получили вторую инъекцию соединения. 96 часов спустя (день 7) животные получили третью инъекцию соединения. Через 24 часа (день 8) животных тестировали в установке «Oткpытoe пoлe» (Jасksоп H.F., Broadhurst P. L. Тhе еffесts оf parachlorophenylalanine апd stimulus iпtепsitу on ореп-fiеld tеst mеаsurеs iп гаts. / Nеuгорhаrmасоlоgу. 1982. v. 21, р. 1279-1282), на следующие сутки (день 9) им предлагали обследовать новые объекты (модифицированный тест Ешiасеur & Dеlасоuг; А. Еппасеuг, J. Dеlасоur. А пеw опе-triаl tеst fоr пеuгоbiоlоgiсаl studiеs оf mеmоrу iп гаts. 1: Веhаviоrаl dаtа. / Веhаviоrаl Вrаiп Research.1988, v. 31, 47- 59). На 11 день животные получали четвертую инъекцию соединения. Животных забивали декапитацией через 120 часов после последней (четвертой) инъекции соединения (день 16). Крысы были распределены по трем группам (п > 8 для каждой группы) случайным образом: группа 1 - ложнооперированные: животные получили наркоз, затем им была проведена ложная операция, и далее в соответствии со схемой эксперимента они получили 4 инъекции физ. раствора; группа 2 - оперированные: животные получили наркоз, затем им была проведена операция по двусторонней перевязке сонных артерий, и далее в соответствии со схемой эксперимента они получили 4 инъекции физ. раствора; группа 3 - оперированные + соединение: животные получили наркоз, затем им была проведена операция по двусторонней перевязке сонных артерий, и далее в соответствии со схемой эксперимента они получили 4 инъекции изучаемого соединения. После декапитации, мозг животного быстро вынимали и помещали в ледяной физиологический раствор (0,9 % NaCl) на 2 минуты. Затем мозг вынимали из физраствора и помещали на лед, покрытый фильтровальной бумагой, для выделения различных областей. Выделяли гиппокамп, стриатум, кору и переносили эти отделы в ледяную сыворотку. Для коры и гиппокампа объем сыворотки составлял 4 мл, для стриатума - 2 мл. Далее области мозга вместе с сывороткой пропускали через нейлоновый фильтр 40 мкм (Мiliроrе) до образования гомогенной массы (суспензии). Полученную клеточную суспензию центрифугировали при комнатной температуре 5 минут на центрифуге "Тhеrmо Jоuап" при 1500 rрm. Далее надосадочную жидкость сливали и клетки ресуспендировали в 10 мл среды ДМЕМ, содержащей 10 % FBS. После этого клетки считали в камере Горяева. Для анализа брали 2 х 106 клеток в 1 мл. В каждую лунку 96-лyнoчнoй планшеты вносили 100 мкл пробы и добавляли 10 мкл MTT. Пробы выдерживали 30 минут в термостате при температуре + 37°C до развития сине- фиолетовой окраски. Затем для растворения кристаллов формазана в каждую лунку добавляли по 100 мкл DMSO. Светопоглощение проб измеряли на спектрофотометре "Мultisсап" (Тhеrmо) при длине волны 600 нм. Каждую пробу промеряли против собственной холостой пробы, не содержащей MTT. Статистическую обработку результатов экспериментов проводили в пакете программ Stаtistiса 6.0. с использованием U-критерия Манна-Уитни, точного критерия Фишера - для независимых выборок и критерия Вилкоксона парных сравнений - для зависимых. Данные представлены в виде медиан выборок плюс/минус интерквартильные интервалы (рис. 2.5. - 2.9.).
Результаты
Перманентная ишемия/гипоксия головного мозга, вызванная двусторонней перевязкой сонных артерий, повлияла на ориентировочно-исследовательское поведение крыс в тесте «Oткpытoe пoлe». Наиболее чувствительными к данному воздействию элементами исследовательского поведения оказались: горизонтальная двигательная активность и вертикальная двигательная активность.
На рисунке 2.5. видно, что операция способствует снижению горизонтальной двигательной активности животных в тесте «Oткpытoe пoлe». ГK-2 восстанавливает этот показатель до уровня, зарегистрированного у ложнооперированных животных.
Операция также способствует снижению вертикальной двигательной активности животных в тесте «Oткpытoe пoлe», а ГK-2 восстанавливает данный показатель до уровня, зарегистрированного у ложнооперированных животных.
В тесте ((Исследование oбъeктoв» эффект операции был выражен в снижении общего времени обнюхивания объектов (рис. 2.7.). Низкое значение данного показателя у оперированных животных происходило за счет снижения исследования объектов в первую минуту тестирования (рис. 2.8.).
Как видно на рис. 2.7. и 2.8., оперированные животные, получавшие ГK-2, не отличались от ложнооперированных, то есть, ГK-2 предотвращал падение исследуемых показателей, вызванное операцией. Таким образом, ГK-2 улучшал эпизодическую память и способность животных к восприятию новизны.
Результаты экспериментов показали, что жизнеспособность клеток гиппокампа и стриатума у ложнооперированных и оперированных животных не различается. Вместе с тем оказалось, что эффект операции в большей степени отразился на клетках коры (рис. 2.9.).
На рисунке видно, что инъекции ГK-2 увеличили жизнеспособность клеток коры головного мозга у оперированных животных.
В целом, полученные данные указывают на наличие у ГK-2 антиишемических свойств и возможность применения этого соединения при гипоксических состояниях. 3. Антипаркинсоническая активность ГK-2
В настоящее время одним из наиболее широко распространенных нейродегенеративных заболеваний является болезнь Паркинсона, в основе которой лежит ослабление функций дофаминергических (ДА) нейронов головного мозга (Нirsсh ЕС, Неrrеrо MT. Nеurосhеmiсаl соrrеlаtеs оf раrkiпsопism. RoIe оf dораmiпеrgiс lеsiопs. / Аdv Nеurоl. 1997, v. 74, 119-126). Данное заболевание развивается не только спонтанно в позднем возрасте, но также может быть спровоцировано приемом нейролептиков, в частности галоперидола (R. J. Наrdiе, A. J. Lееs. Nеurоlерtiс-iпduсеd Раrkiпsоп's sупdrоmе: сliпiсаl fеаturеs uпd rеsults оf trеаtеmепt with lеvоdора. / Jоumаl оf Nеuгоlоgу, Nеurоsurgеrу, апd Psychiatry.1988, v. 51, р. 850-854).
Для моделирования «in vivo» угнетения ДА-передачи применяют два подхода. Первый - включает тесты, моделирующие развитие каталепсии и другие экстрапирамидные нарушения, вызываемые введением дофаминергических веществ. Каталепсию вызывают, как правило, введением различных нейролептиков, из которых чаще всего используют галоперидол (Sапbегg Р.R. Наlореridоl-iпduсеd саtаlерsу is mеdiаtеd bу роstsупарtiс dораmiпе rесерtоrs. / Nаturе. 1980. v. 284 (5755). P.472-473. Второй подход предполагает избирательное повреждение ДА-нейронов, которое может быть вызвано введением нейротоксинов, в частности, МФТП (Sпуdеr S.H., D'Аmаtо RJ. MPTP: а пеurоtохiп rеlеvапt tо thе раthорhуsiоlоgу оf Раrkiпsоп's disеаsе. Thе 1985 Gеоrgе С. Соtziаs lесtuге. / Nеuгоlоgу. 1986. v. 36 (2), р. 250-258). 3.1. Противодействие каталепсии у крыс, вызванной галоперидолом
Эксперименты проводили на белых беспородных крысах - самцах массой 250- 280 г. Для индукции каталепсии использовали Д1/Д2 блокатор галоперидол (1,0 мг/кг, в/б). Интенсивность каталепсии оценивали по времени сохранения животным приданной позы. Измерение производили спустя 60 минут после введения галоперидола. Изучаемое соединение в выбранных дозах (0,01; 0,1; 1,0 и 5,0 мг/кг) вводили внутрибрюшинно за 24 часа до галоперидола. Контрольные животные получали инъекцию дистиллированной воды. Полученные данные обрабатывали статистически с применением точного критерия Фишера. Результаты представлены в таблице 2.10. Таблица 2.10. Влияние ГK-2 на интенсивность каталепсии, вызванной введением галоперидола.
Figure imgf000098_0001
* достоверно по отношению к контролю (p<0.05).
Исследования показали, что ГK-2 в дозах 0.01, 1.0 и 5.0 мг/кг достоверно ослабляет каталепсию, вызванную галоперидолом. Эти данные указывают на наличие у изучаемого соединения дофамин-позитивных (антипаркинсонических) свойств.
3. 2. Противодействие акинезии у мышей, вызванной M ФТП
Изучаемое соединение в фиксированной дозе 1,0 мг/кг вводили внутрибрюшинно мышам-самцам линии C57B1/6 массой 22-25 г за 24 часа до инъекции МФТП (30 мг/кг, в/б). Животных помещали в установку «oткpытoe пoлe» спустя 60 мин после введения МФТП. Оценивали горизонтальную и вертикальную двигательную активность животных за 2 минуты наблюдения. Пассивный контроль составляли животные, получившие внутрибрюшинную инъекцию дистиллированной воды вместо МФТП. Активный контроль составляли животные, получившие внутрибрюшинную инъекцию дистиллированной воды вместо ГK-2, а затем МФТП. Опытные животные получили инъекцию ГK-2, а затем МФТП. Полученные данные обрабатывали статистически с применением U-критерия Манна-Уитни. Результаты представлены в таблице 2.11.
Таблица 2.11. Влияние предварительного введение ГK-2 на акинезию, вызванную МФТП, у мышей в тесте «Oткpытoe пoлe».
Figure imgf000098_0002
* достоверно по отношению к пассивному контролю (p<0.05)
+ достоверно по отношению к активному контролю (p<0.05)
Эксперименты показали, что изучаемое соединение при отставленном введении эффективно предупреждает развитие поведенческой патологии, вызванной МФТП, что позволяет предположить наличие у соединения антипаркинсонической активности.
3.3. Усиление стереотипии у крыс, вызванной апоморфином
Психостимуляторы (в частности, апоморфин) вызывают стереотипное поведение у грызунов (LaI S., Sоurkеs Т.L. Опtоgепу оf stеrеоtуреd bеhаviоuг iпduсеd bу ароmоrрhiпе апd аmрhеtаmiпе iп thе гаt. / Аrсh Iпt Рhаrmасоdуп Тhеr. 1973. v. 202 (1). P. 171-182). Потенцирование эффектов апоморфина указывает на способность исследуемого вещества оказывать стимулирующее влияние на ДА-передачу (Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ Москва, 2000, с. 147-152).
Эксперименты проводили на беспородных крысах-самцах, массой 250-300 г. Изучаемое соединение в фиксированной дозе 1,0 мг/кг вводили внутрибрюшинно за 24 часа до инъекции апоморфина или совместно с апоморфином. Контрольной группе вводили дистиллированную воду по той же схеме. Апоморфин в дозе 1,0 мг/кг растворяли в дистиллированной воде с добавлением 0,01% аскорбиновой кислоты и вводили подкожно в область шеи. Сразу после введения апоморфина животных рассаживали в камеры для наблюдения и еще через 5 минут начинали регистрацию. Регистрацию проводили в соответствие с методическими указаниями, приведенными в руководстве (Хабриев Р.У. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ Москва, 2000, с. 149.). Регистрировали пероральную стереотипию (обнюхивание, лизание, укусы) в баллах: 1 балл - отдельные стереотипные движения, 2 балла - непродолжительная (эпизодическая) стереотипия, 3 балла - постоянная стереотипия. Для регистрации постоянной, глубокой и очень интенсивной стереотипии был введен четвертый балл в имеющуюся шкалу (глубокая стереотипия отличалась тем, что животные в этом состоянии не реагировали на внешние раздражители). Регистрацию стереотипии проводили 1 раз в 5 минут на протяжении 60 минут. По окончании эксперимента высчитывали сумму баллов для каждого животного за все время тестирования. Для выявления различий между экспериментальными группами был применен U-криτерий Манна-Уитни. Данные представлены в виде медиан выборок плюс/минус интерквартильные интервалы (рисунок 2.10).
Исследования показали, что изучаемое соединение при отставленном введении увеличивает интенсивность пероральной стереотипии, вызванной апоморфином, что подтверждает наличие у соединения дофамин-позитивных свойств.
4. Исследования эффектов ГK-2 на экспериментальных моделях болезни Альцгеймера
Наряду с болезнью Паркинсона, к нейродегенаривным заболеваниям относят и болезнь Альцгеймера (БА). Согласно «xoлинepгичecкoй гипoтeзe», прогрессивное развития когнитивного дефицита у пациентов с БА происходит за счет снижения функциональных показателей холинергической системы и дегенерации холинергических нейронов базальных ядер переднего мозга (Ваrtus, R.T., Dеап, R.L., Ропtесогvо, MJ., Fliсkеr, С. Тhе сhоliпеrgiс hуроthеsis: а histоriсаl оvегviеw, сuгrепt реrsресtivе, апd futurе dirесtiопs. / Ашi. Nеw Yоrk Асаd. Sсi. 1985. v. 444, 332-358). К основным моделям БА на животных, воспроизводящим поведенческий и холинергический дефицит при отсутствии патоморфологической картины заболевания, относят модель деафферентации гиппокампа (Кгugеl U., Вigl V., Еsсhriсh К., Вigl M. Dеаffеrепtаtiоп оf thе sерtо-hiрросаmраl раthwау iп гаts аs а mоdеl оf thе mеtаbоliс еvепts iп Аlzhеimеr's disеаsе./ Iпt. J. Dеvl Nеuгоsсiепсе. 2001. v.19, 263-277). С использованием этой модели была проведена оценка эффективности соединения ГK2. Холинергический дефицит моделировался также в модели скополаминовой амнезии.
4.1. Противодействие нарушению исследовательского поведения у крыс, вызванного перерезкой септо-гиппокампального пути (Fimbriа-Fоrпiх)
Эксперименты были проведены на крысах-самцах линии Вистар массой 280- 400 г. Наркотизированное и оскальпированное животное помещали в стереотаксис. В кости черепа делали косые надрезы шириной 1 мм: начальная точка для надреза находилась на уровне Брегмы (AP=0.0) и латеральнее ее на 2 мм (L=+/- 2); конечная точка надреза находилась на 2 мм каудальнее Брегмы и на 1 мм латеральнее ее (AP= - 2.0, L= +/- 1). После пропила кости, твердую мозговую оболочку аккуратно надрезали в области пропилов. В надрез опускали стерильную загнутую иглу на глубину 6.2 мм от поверхности кости (DV = - 6.2). С помощью одновременной работы двух винтов стереотаксиса иглу медленно перемещали почти до конечной точки косого разреза. Затем иглу медленно поднимали из надреза. Процедуру повторяли два раза на каждом полушарии. Процедура «лoжнoй» операции была схожа с процедурой перерезки, за исключением того, что иглу опускали на глубину 3 мм от поверхности кости (DV = - 3.0). Первое введение изучаемого соединения опытной группе (доза 1.0 мг/кг, в/б), или дистиллированной воды контрольной группе было сделано через 2 часа после перерезки. Далее инъекции были сделаны каждые 48 часов. На протяжении эксперимента каждому животному было сделано 7 инъекций исследуемого соединения.
Для выявления поведенческой патологии, вызванной перерезкой септо- гиппокампального пути был использован тест «Oткpытoe пoлe». Выбор данного теста был основан на результатах следующих исследований: 1) Lаmрrеа M.R., Саrdепаs F.P., Silvеirа R., Wаlsh TJ. , Моrаtо S. Еffесts оf sерtаl сhоliпеrgiс lеsiоп on rаt ехрlоrаtоrу bеhаviоr iп ап ореп-fiеld. / Вгаz J Меd Вiоl Rеs. 2003. v. 36(2), р. 233-238; 2) Саssеl J.C., Кеlсhе С, Реtегsоп G.M., Ваllоugh G.P., Gоерр L, WiIl В. Grаft-iпduсеd bеhаviоrаl rесоvеrу from subсаllоsаl sерtоhiрросаmраl dаmаgе iп rаts dерепds оп mаturitу stаgе оf dопоr tissuе. / Nеurоsсiепсе. 1991. v. 45(3), р. 571-586. Тестирование животных в установке ((Открытое πoлe» проводили через 48 часов после последней инъекции изучаемого соединения (14-ый день после операции). Для выявления различий между экспериментальными группами был применен критерий парных сравнений Вилкоксона. Результаты эксперимента приведены в таблице 2.12. Данные представлены в виде медиан соответствующих выборок.
Таблица 2.12. Влияние хронического введения ГK-2 на горизонтальную двигательную активность крыс в тесте ((Открытое пoлe». >
Группа Первая минута Вторая минута Третья Четвертая i минута
Контроль 15 11,5 11 * 2 *
Ложноопер. 21 14 9,5 * 9 *
Оперированн. 11,5 12 19 11,5
Оперированн. 12,5 11,5 15,5 6,5 *
+ ГK-2 достоверно по отношению к первой минуте тестирования (p< 0,05). Из таблицы видно, что у оперированных животных нарушен процесс привыкания (hаbituаtiоп) с течением времени к условиям установки ОП, что выражается в почти неизменном уровне горизонтальной двигательной активности на протяжении всего времени тестирования. Аналогичные результаты были получены в работах, указанных выше. У оперированных животных, получивших ГK-2, наблюдалось восстановление способности к привыканию. Полученные данные дают основание предположить, что изучаемое соединение обладает нейропротективной активностью в отношении холинергической системы.
Для проверки данного предположения, мы провели еще одно исследование, используя в качестве патологического агента антагонист мускариновых ацетилхолиновых рецепторов скополамин.
4.2. Противодействие нарушению рабочей памяти у крыс, вызванному скополамином
В эксперименте были использованы крысы-самцы линии Wistаr массой 190- 220 гр. Изучаемое соединение в дозе 1,0 мг/кг вводили внутрибрюшинно за 24 часа до введения скополамина (1,0 мг/кг, и/к). Контрольная группа получила инъекцию дистиллированной воды по той же схеме. Скополамин вводили животным за 60 минут до первой посадки в установку Т-образный лабиринт, и еще через 120 минут проводили тестирование животных в соответствии с оригинальным протоколом (Dеасоп R.M.J., Rаwliпs J. N.Р. Т-mаzе аltеrпаtiоп iп thе rоdепt / Nаtuге Рrоtосоls. 2006. v.l (l), p. 7- 12).
Для выявления различий между экспериментальными группами был применен точный критерий Фишера. Результаты эксперимента представлены на рисунке 2.11.
Эксперимент показал, что изучаемое соединение при отставленном введении предотвращает нарушения рабочей памяти, вызванные скополамином.
Таким образом, комплексный анализ полученных данных на основе стандартных методов фармакологической оценки позволяет сделать вывод о наличии противоинсультной, противопаркинсонической, антиишемической, антиамнестической, нейропротективной активностей в спектре биологических эффектов низкомолекулярного димерного миметика фактора роста нервов ГK-2. 4. Антидепрессивная активность
4.1. Эффекты миметиков BDNF в тесте выученной беспомощности по Порсолту
Для выявления возможной антидепрессантной активности пептидомиметиков BDNF использовали Тест «Bыyчeннaя беспомощность)) в оригинальной конфигурации (R.D. Рогsоlt, G.Апtоп, N. Вlаvеt, M. Jаlfrе. Веhаviоrаl dеsраir iп rаts: а пеw mоdеl sепsitivе tо апtidерrеssапts. / Еurореап Jоurпаl оf Рhаrmасоlоgу, 1978, V. 47, р. 379-391).
В экспериментах были использованы мыши-самцы линии Ваlb/с весом 20-22 гр. В первый день животных помещали в узкую емкость с водой, температурой 22 0C, на 10 минут. Через 60 мин животным внутрибрюшинно вводили исследуемое соединение (ГCБ-106 - в дозе 1 мг/кг, ГБK-108 и ГБK-201 в дозах 0,01; 0,1; 1,0; 10,0 мг/кг). Через 24 часа животных повторно помещали в те же условия и на протяжении 5 -минутного тестового периода регистрировали время сохранения животным характерной позы иммобильности (отказ от активно-оборонительного и исследовательского поведения). Имипрамин вводили за 60 минут до 5 -и минутного тестового периода (на второй день). Контрольные группы получали дистиллированную воду. В каждой экспериментальной группе было не менее 6-и животных. Для выявления различий между экспериментальными группами были применены U-критерий Манна-Уитни и точный критерий Фишера. Данные представлены в виде медиан выборок +/- интерквартильные интервалы.
Результаты эксперимента представлены на рисунках 2.12. и 2.13. На рисунке 2.13 видно, что имипрамин и ГCБ-106 проявляют антидепрессантные свойства, снижая длительность иммобильностив тесте. ГБK 201 (в дозах 0.01 и 0.1, в/б) и ГБК 108 (в дозе 10 мг/кг, в/б), наоборот, увеличивают время иммобильности в тесте. Увеличение времени иммобильности в тесте «Bыyчeннaя беспомощность)) по Порсолту характерно для веществ с нейролептической активностью.
Таким образом, димерные миметики BDNF с нейропротективной активностью проявляют антидепрессивную активность в тесте Порсолта. Мономерные миметики, уменьшающие жизнеспособность нейронов, обладают продепрессантной активностью.

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. Соединения общей формулы (R-CH2-CO- A-B-NH-R')n (I), представляющие собой замещенные линейные дипептиды, последовательность которых соответствует последовательности экспонированных в растворитель участков петель 1 или 4 нейротрофических факторов, при этом по крайней мере один аминокислотный остаток или его биоизостер входят в состав бета-изгиба петли, обладающие полной или частичной агонистической или антагонистической активностью.
2. Соединения по п.l, где нейротрофический фактор представляет собой фактор роста нервов (NGF) или мозговой нейротрофический фактор (BDNF).
3. Соединения по п.l, где
А и В- аминокислотные остатки дипептидной последовательности AB;
R= боковой радикал аминокислотного остатка, предшествующего дипептидному фрагменту AB в последовательности нейротрофина, H или бивалентный радикал -R -
, в частности, -(CH2)m-;
R'= боковой радикал аминокислотного остатка, следующего за дипептидным фрагментом AB в последовательности нейротрофина, H или бивалентный радикал -
R'-, в частности, -(CH2)m- ; n=l или 2.
При наличии бивалентного радикала -R'- или - R- n=2 и соединения представляют собой димеры, в которых мономерные дипептиды связаны С-концевым спейсером -
R-R- или N-концевым спейсером -R'-R'-. В остальных случаях n=l и соединения представляют собой мономерные замещенные дипептиды.
4. Соединение по п.З, где R= HO(O)C-CH2- ; A= GIu; B=Lys; R'=H, n=l
5. Соединения по п.З, где R= HO(O)C-CH2- ; A= GIu; B=Lys; R'= -(CH2)m-; m=l, или 1,5, или 2, или 2,5, или 3; n=2
6. Соединение по п.З, где R= HO(O)C-CH2- ; A= GIu; B=Lys; R'= -(CH2)S-NH-C(O)- (CH2)3/2-; n=2
7. Соединение по п.З, где R= H; A= Lуs; B= GIu; R'= H; n=l
8. Соединение по п.З, где R= H; A= Lуs; B= GIu; R'= -(CH2)3-; n=2
9. Соединение по п.З, где R= NH2-(CH2)5- ; A= Lуs; B= GIu; R'= H; n=l
10. Соединение по п.З, где R= NH2-(CH2)5- ; A= Lуs; B= GIu; R'= -(CH2)3-; n=2
11. Соединение по п.З, где R= H; A= GIy; B= Lуs; R'= -(CH2)3-COOH; n=l
12. Соединение по п.З, где R= -(CH2)2-CO-; A= GIy; B= Lуs; R'= -(CH2)3-COOH; n=2
13. Соединение по п.З, где R= HO(O)C-CH2-; A= Sеr; B= Lуs; R'= H; n=l
14. Соединение по п.З, где R= HO(O)C-CH2-; A= Sеr; B= Lуs; R'= -(CH2)3-; n=2
15. Соединение по п.З, где R= HO(O)C-CH2-; A= Lуs; B= Lуs; R'= -(CH2)3-; n=2
16. Соединение по п.З, где R= H; A= Аsр; B= Sеr; R'= H; n=l
17. Соединение по п.З, где R= HO(O)C-CH2-; A= Меt; B= Sеr; R'= H; n=l
18. Соединение по п.З, где R= HO(O)C-CH2-; A= Меt; B= Sеr; R'= -(CH2)7/2-; n=2
19. Способ лечения ишемических и геморрагических инсультов введением эффективного количества соединения по п. 5, где m=3
20. Способ лечения болезни Паркинсона введением эффективного количества соединения по п. 5, где m=3
21. Способ лечения болезни Альцгеймера введением эффективного количества соединения по п. 5, где m=3
22. Способ лечения депрессии введением эффективного количества соединения по п. 14
23. Фармацевтические композиции, содержащие в качестве активного "ингредиента терапевтически активные количества соединений по п. 3.
PCT/RU2010/000067 2009-02-16 2010-02-15 Дипептидные миметики нейротрофинов ngf и bdnf WO2010093284A1 (ru)

Priority Applications (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US13/148,830 US20110312895A1 (en) 2009-02-16 2010-02-15 Dipeptide mimetics of ngf and bdnf neurotrophins
EP10741465.8A EP2397488B1 (en) 2009-02-16 2010-02-15 Dipeptide mimetics of ngf and bdnf neurotrophins
CN201080014235.6A CN102365294B (zh) 2009-02-16 2010-02-15 神经营养因子ngf和bdnf的二肽模拟物
US14/460,881 US9683014B2 (en) 2009-02-16 2014-08-15 Dipeptide mimetics of NGF and BDNF neurotrophins

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
RU2009105176 2009-02-16
RU2009105176A RU2410392C2 (ru) 2009-02-16 2009-02-16 Дипептидные миметики нейротрофинов ngf и bdnf

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
US13/148,830 A-371-Of-International US20110312895A1 (en) 2009-02-16 2010-02-15 Dipeptide mimetics of ngf and bdnf neurotrophins
US14/460,881 Division US9683014B2 (en) 2009-02-16 2014-08-15 Dipeptide mimetics of NGF and BDNF neurotrophins

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2010093284A1 true WO2010093284A1 (ru) 2010-08-19

Family

ID=42561958

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/RU2010/000067 WO2010093284A1 (ru) 2009-02-16 2010-02-15 Дипептидные миметики нейротрофинов ngf и bdnf

Country Status (5)

Country Link
US (2) US20110312895A1 (ru)
EP (1) EP2397488B1 (ru)
CN (1) CN102365294B (ru)
RU (1) RU2410392C2 (ru)
WO (1) WO2010093284A1 (ru)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2678203C2 (ru) * 2017-05-30 2019-01-24 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова" Фармацевтическая композиция нейропротекторного действия для парентерального применения на основе гексаметилендиамида бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) в лиофилизированной лекарственной форме
WO2021249237A1 (zh) * 2020-06-08 2021-12-16 中国科学院昆明植物研究所 三环氧六氢色酮a及其药物组合物和其应用

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2289555A1 (en) * 2009-08-24 2011-03-02 OrgaNext Research B.V. Method of treating frailty
RU2606622C2 (ru) * 2010-08-31 2017-01-10 Бионуре Фарма, С.Л. Агонисты рецепторов нейротрофинов и их применение в качестве лекарственных средств
RU2613184C2 (ru) * 2013-05-17 2017-03-15 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова" (ФГБНУ "НИИ фармакологии имени В.В. Закусова") Вещества, обладающие ангиогенной активностью
RU2613314C2 (ru) * 2013-06-28 2017-03-15 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова" Малые молекулы с NGF-подобной активностью, обладающие антидиабетическими свойствами
RU2625752C2 (ru) * 2013-11-19 2017-07-18 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова" Вещество, обладающее антиангиогенной активностью
RU2559880C1 (ru) * 2014-06-18 2015-08-20 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова" Замещенный бисдипептид с нейропротективным и антидепрессивным эффектом
RU2693479C2 (ru) * 2017-11-20 2019-07-03 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова" Средство, обладающее антидиабетической активностью
RU2697254C1 (ru) * 2018-02-28 2019-08-13 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова" Фармацевтическая композиция на основе гексаметилендиамида бис-(N-моносукцинил-L-серил-L-лизина) (ГСБ-106)
RU2740754C1 (ru) * 2018-11-13 2021-01-20 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова" Фармацевтическая композиция нейропротекторного действия для перорального применения на основе гексаметиленамид бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) (варианты), выполненная в виде таблетки, диспергируемой в полости рта
RU2707301C1 (ru) * 2019-05-17 2019-11-26 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова" Низкомолекулярный миметик BDNF как средство для лечения опиоидной зависимости

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0335637A2 (en) * 1988-03-28 1989-10-04 The Regents Of The University Of California Nerve growth factor peptides
US5958875A (en) 1996-03-29 1999-09-28 The Regents Of The University Of California Synthetic peptides derivatives with nerve growth factor-like neurotrophic activity
US6017878A (en) 1994-02-07 2000-01-25 Mcgill University Nerve growth factor structural analogs and their uses
WO2000075176A1 (en) 1999-06-08 2000-12-14 The University Of Melbourne Small cyclic mimics of brain-derived neurotrophic factor (bdnf)

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6111057A (en) 1997-08-08 2000-08-29 Basf Aktiengesellschaft Polymer and process for their production
CN1318084C (zh) 2000-05-26 2007-05-30 奥索-麦克尼尔药品公司 神经保护肽
US7259146B2 (en) 2000-05-26 2007-08-21 Ortho-Mcneil Pharmaceutical, Inc. Neuroprotective peptides
US7906477B2 (en) * 2002-11-18 2011-03-15 Genspera, Inc. Activation of peptide prodrugs by hK2
TW200603795A (en) * 2004-06-09 2006-02-01 Avanir Pharmaceuticals Mediators of reverse cholesterol transport for the treatment of hypercholesterolemia

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0335637A2 (en) * 1988-03-28 1989-10-04 The Regents Of The University Of California Nerve growth factor peptides
US6017878A (en) 1994-02-07 2000-01-25 Mcgill University Nerve growth factor structural analogs and their uses
US5958875A (en) 1996-03-29 1999-09-28 The Regents Of The University Of California Synthetic peptides derivatives with nerve growth factor-like neurotrophic activity
WO2000075176A1 (en) 1999-06-08 2000-12-14 The University Of Melbourne Small cyclic mimics of brain-derived neurotrophic factor (bdnf)

Non-Patent Citations (47)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
ANDERSON ET AL., J. AM. CHEM. SOC., vol. 89, 1967, pages 5012 - 5017
BAKKER F.C., KLIJN C.J., JENNEKENS-SCHINKEL A., KAPELLE L.J.: "Cognitive disorders in patients with occlusive disease of the carotid artery: a systematic review of the literature", NEUROLOGY, vol. 247, no. 9, 2000, pages 669 - 676
BARBACID M., J. NEUROBIOL., vol. 25, no. 11, 1994, pages 1386 - 1403
BARONE FC, CLARK RK, FEUERSTEIN G, LENKINSKI RE, SARKAR SK: "Quantitative comparison of magnetic resonance imaging (MRI) and histological analyses of focal ischemic damage in the rat", BRAIN RES. BULL., vol. 26, no. 2, 1991, pages 285 - 91
BARTUS R.T., DEAN R.L., PONTECORVO M.J., FLICKER C.: "The cholinergic hypothesis: a historical overview, current perspective, and future directions", ARM. NEW YORK ACAD. SCI., vol. 44, 1985, pages 332 - 358
BENNETT S.A.L., TENNISWOOD M., CHEN JIA-HUA, DAVIDSON C.M., KEYES M.T., FORTIN T.: "Pappas B.A. Chronic cerebral hypoperfusion elicits neuronal apoptosis and behavioral impairment", NEUROREPORT, vol. 9, 1998, pages 161 - 166
CASSEL J.S., KELCHE C., PETERSON G.M., BALLOUGH G.P., GOEPP I., WILL B.: "Graft-induced behavioral recovery from subcallosal septohippocampal damage in rats depends on maturity stage of donor tissue", NEUROSCIENCE, vol. 45, no. 3, 1991, pages 571 - 586
DE RYCK M, VAN REEMPTS J, BORGERS M, WAUQUIER A, JANSSEN PA.: "Photochemical stroke model: flunarizine prevents sensorimotor deficits after neocortical infarcts in rats", STROKE, vol. 20, no. 10, 1989, pages 1383 - 90
DEACON R.M.J., RAWLINS J.N.P.: "T-maze alternation in the rodent", NATURE PROTOCOLS, vol. 1, no. 1, 2006, pages 7 - 12
E. GROSS, J. MEIENHOFER: "The Peptides", vol. 1, 1979, ACADEMIC PRESS
E. SCHROEDER, K. LUBKE: "The Peptides", vol. 1, 1965, ACADEMIC PRESS
ENNACEUR A., DELACOUR J.: "A new one-trial test for neurobiological studies of memory in rats. 1: Behavioral data", BEHAVIORAL BRAIN RESEARCH, vol. 31, 1988, pages 47 - 59
HARDIE R.J., LEES A.J.: "Neuroleptic-induced Parkinson's syndrome: clinical features and results of treatment with levodopa", JOURNAL OF NEUROLOGY, NEUROSURGERY AND PSYCHIATRY, vol. 51, 1988, pages 850 - 854
HIRSCH EC, HERRERO MT: "Neurochemical correlates of parkinsonism. Role of dopaminergic lesions", ADV. NEUROL., vol. 74, 1997, pages 119 - 126
IBANEZ C.F. ET AL., EMBO J., vol. 12, no. 6, 1993, pages 2281 - 93
J. CHEM. SOC., 1950, pages 3239
J. CHEM. SOC., 1955, pages 1097
JACKSON H.F., BROADHURST P.L.: "The effects of parachlorophenylalanine and stimulus intensity on open-field test measures in rats", NEUROPHARMACOLOGY, vol. 21, 1982, pages 1279 - 1282
KHABRIEV R.U.: "A Manual on Experimental (Preclinical) Studies of New Pharmacological Substances", 2000, pages: 147 - 152
KHABRIEV R.U.: "A Manual on Experimental (Preclinical) Studies of New Pharmacological Substances", 2000, pages: 149
KRUGEL U., BIGL V., ESCHRICH K., BIGL M.: "Deafferentation of the septo-hippocampal pathway in rats as a model of the metabolic events in Alzheimer's disease", INT. J. DEVL. NEUROSCIENCE, vol. 19, 2001, pages 263 - 277
LAL S., SOURKES T.L.: "Ontogeny of stereotyped behaviour induced by apomorphine and amphetamine in the rat. Arch", INT. PARMACODYN. THER., vol. 202, no. 1, 1973, pages 171 - 182
LAMPREA M.R., CARDENAS F.P., SILVEIRA R., WALSH T.J., MORATO S.: "Effects of septal cholinergic lesion on rat exploratory behavior in an open-field. Braz", J. MED. BIOL. RES., vol. 36, no. 2, 2003, pages 233 - 238
LINDSAY R.M., NEUROBIOL. AGING., vol. 15, no. 2, 1994, pages 249 - 251
LIU, H., NOWAK, R., CAO, W., BLOCH, K.D.: "Nerve growth factor induces anti-apoptotic heme oxygenase-I in rat pheochromocytoma PC 12 cells", J. NEUROCHEM., vol. 86, 2003, pages 1553 - 1563
LONGO ET AL.: "Synthetic NGF peptides prevent neuronal death via p75 receptor-dependent mechanism", J. NEUROSCI. RES., 1997
LONGO F.M. ET AL., CELL REGUL., vol. 1, no. 2, 1990, pages 189 - 195
MAKARENKO A.N. ET AL., ZH.V.N.D., vol. 52, no. 6, 2002, pages 765 - 768
MCDONALD N.Q. ET AL., J. MOL. BIOL., vol. 219, no. 4, 1991, pages 595 - 601
MCDONALD, CHAO: "Structural determinants of neurotrophin action", JBC, vol. 270, 1995, pages 19669 - 19672
MOROZOVA A.A. ET AL.: "Sintez tsilkicheskih analogov 4-i petli factora rosta nervov", BIOORGANICHESKAYA KHIMIYA, vol. 34, no. 5, 2008, pages 617 - 629, XP008167041 *
PENN R.D. ET AL., NEUROSURGERY, vol. 40, no. 1, 1997, pages 94 - 99,99-100
POLLACK, S.J., HARPER, S.J.: "Small molecule Trk receptor agonists and other neurotrophic factor mimetics: Current drug targets", CNS AND NEUROLOGICAL DISORDERS, vol. 1, 2002, pages 59 - 80
PORSOLT R.D., ANTON G., BLAVET N., JALFRE M.: "Behavioral despair in rats: a new model sensitive to antidepressants", EUROPEAN JOURNAL OF PHARMACOLOGY, vol. 47, 1978, pages 379 - 391
ROBINSON R.C. ET AL., BIOCHEMISTRY, vol. 34, no. 13, 1995, pages 4139 - 46
SANBERG P.R.: "Haloperidol-induced catalepsy is mediated by postsynaptic dopamine receptors", NATURE, vol. 284, no. 5755, 1980, pages 472 - 473
SARAGOVI H.U., BURGESS K., EXPERT OPINION IN THERAPEUTIC PATENTS, vol. 9, 1999, pages 737 - 751
SARTI C., PANTONI L., BARTOLINI L., INZITARI D.: "Cognitive impairment and chronic cerebral hypoperfusion: what can be learned from experimental models", J. NEUROL. SCI., 2002, pages 203 - 204,263-266
SCHALLERT T, FLEMING SM, LEASURE JL, TILLERSON JL, BLAND ST.: "CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury", NEUROPHARMACOLOGY, vol. 39, no. 5, 2000, pages 777 - 87
SCHULTE-HERBRUGGEN O. ET AL., CURR. MED. CHEM., vol. 14, no. 22, 2007, pages 2318 - 2329
SHIMAMURA N, MATCHETT G, TSUBOKAWA T, OHKUMA H, ZHANG J.: "Comparison of silicon-coated nylon suture to plain nylon suture in the rat middle cerebral artery occlusion model", J. NEUROSCI. METH., vol. 156, no. 1-2, 2006, pages 161 - 5
SHIMOKE K., CHIBA H.: "Nerve growth factor prevents 1-methyl-1,4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine-induced cell death via the Akt pathway by suppressing caspase-3-like activity using PC12 cells: relevance to therapeutic application for Parkinson's disease", J. NEUROSCI. RES., vol. 63, 2001, pages 402 - 409
SNYDER S., D'AMATO R.J.: "MPTP: a neurotoxin relevant to the pathophysiology of Parkinson's disease. The 1985 George C. Cotzias lecture", NEUROLOGY, vol. 36, no. 2, 1986, pages 250 - 258
SPINA M.B. ET AL., J. NEUROCHEM., vol. 59, no. 1, 1992, pages 99 - 106
THOENEN H. ET AL., C. R. ACAD. SCI. III, vol. 316, no. 9, 1993, pages 1158 - 63
VOLONTE C. ET AL., MOL. BIOL. CELL, vol. 4, no. 1, 1993, pages 71 - 78
ZEA LONGA E, WEINSTEIN PR, CARLSON S, CUMMINS R.: "Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats", STROKE, vol. 20, 1989, pages 84 - 91

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2678203C2 (ru) * 2017-05-30 2019-01-24 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В. Закусова" Фармацевтическая композиция нейропротекторного действия для парентерального применения на основе гексаметилендиамида бис-(N-моносукцинил-L-глутамил-L-лизина) в лиофилизированной лекарственной форме
WO2021249237A1 (zh) * 2020-06-08 2021-12-16 中国科学院昆明植物研究所 三环氧六氢色酮a及其药物组合物和其应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP2397488A1 (en) 2011-12-21
RU2009105176A (ru) 2010-08-27
EP2397488B1 (en) 2019-03-27
US9683014B2 (en) 2017-06-20
CN102365294B (zh) 2016-02-17
CN102365294A (zh) 2012-02-29
RU2410392C2 (ru) 2011-01-27
EP2397488A4 (en) 2014-03-19
US20110312895A1 (en) 2011-12-22
US20150111828A1 (en) 2015-04-23

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2010093284A1 (ru) Дипептидные миметики нейротрофинов ngf и bdnf
CN107982545B (zh) 药物偶联物，偶联方法，及其用途
CN110114075B (zh) 含有二硫化物的细胞穿透肽及其制备和使用方法
US6291247B1 (en) Methods of screening for factors that disrupt neurotrophin conformation and reduce neurotrophin biological activity
Gudasheva et al. Design and synthesis of dipeptide mimetics of the brain-derived neurotrophic factor
ES2439950T3 (es) Péptidos con permeabilidad celular inhibidores de la ruta de transducción de señales de la JNK
CA3023670A1 (en) Agonist agents of cd47 inducing programmed cell death and their use in the treatments of diseases associated with defects in programmed cell death
US5340802A (en) Peptide analog type-B CCK receptor ligands
BRPI0617751A2 (pt) compostos de ligação do domìnio iap bir
AU2004218294A1 (en) Alpha-keto carbonyl calpain inhibitors
MX2007006252A (es) Nuevos peptidos utiles como inhibidores duales de caspasa-2/-6 y sus aplicaciones biologicas.
US20230064978A1 (en) Cyclic peptide receptor lanthionine synthetase c-like protein (lancl) and uses thereof
RU2559880C1 (ru) Замещенный бисдипептид с нейропротективным и антидепрессивным эффектом
CN109354605A (zh) 一种Nogo-A受体结合肽及其衍生物与应用
Clark et al. Identification of the first biased NPS receptor agonist that retains anxiolytic and memory promoting effects with reduced levels of locomotor stimulation
AU2011284801A1 (en) Modulators of protease activated receptors
JP2009503027A (ja) アルツハイマー病ｉｉの治療のための置換エタン−１，２−ジアミン
WO2021200259A1 (ja) Ｖｉｐｒ２アンタゴニストペプチド
Blommaert et al. Structure-based design of new constrained cyclic agonists of the cholecystokinin CCK-B receptor
US20190284239A1 (en) Bicyclic peptidyl inhibitor of tumor necrosis factor-alpha
RU2697515C2 (ru) Циклические аналоги апелина
WO2022117116A1 (zh) 一种α9α10nAChR抑制活性肽及其应用
JP4603364B2 (ja) ペプチドギャップ結合モジュレーター
SA516371037B1 (ar) معدلات مستقبل nmda وعقاقير أولية منها وأملاح منها واستخداماتها
JP7032808B2 (ja) ペプチドもしくはその薬学的に許容される塩、またはそれらのプロドラッグ

Legal Events

Date Code Title Description
WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 201080014235.6

Country of ref document: CN

121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 10741465

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 13148830

Country of ref document: US

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 7037/DELNP/2011

Country of ref document: IN

WWE Wipo information: entry into national phase

Ref document number: 2010741465

Country of ref document: EP