CN101765659A

CN101765659A - L-赖氨酸的生产方法

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Publication number: CN101765659A
Application number: CN200880100226A
Authority: CN
Inventors: 土井秀高; 植田拓嗣
Original assignee: Ajinomoto Co Inc
Current assignee: Ajinomoto Co Inc
Priority date: 2007-07-23
Filing date: 2008-07-22
Publication date: 2010-06-30
Anticipated expiration: 2028-07-22
Also published as: EP2180052A4; ES2403199T3; CN101765659B; BRPI0814659B1; PL2180052T3; KR20100056460A; BRPI0814659A2; WO2009014117A1; KR101537508B1; US20100190217A1; EP2180052A1; JP2010226956A; EP2180052B1

Abstract

通过在培养基中培养下述具有L-赖氨酸生产能力的大肠杆菌，并从该培养基收集L-赖氨酸，来生产L-赖氨酸，所述大肠杆菌经过修饰而降低了内消旋α，ε-二氨基庚二酸合成途径的1种或2种以上的酶，例如2，3，4，5-四氢吡啶-2，6-二羧酸N-琥珀酰转移酶、琥珀酰二氨基庚二酸转氨酶、琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰基酶或二氨基庚二酸差向异构酶的活性，并且其中导入了编码二氨基庚二酸脱氢酶的基因。

Description

L-赖氨酸的生产方法

技术领域

本发明涉及使用大肠杆菌的L-赖氨酸生产方法。L-赖氨酸是一种必需氨基酸，并被用作药物或者动物用饲料添加物等营养混合物的组分。

背景技术

L-赖氨酸等L-氨基酸是使用具有生产这些L-氨基酸的能力的棒状杆菌型细菌或埃希氏菌属细菌等氨基酸生产菌，采用发酵方法来工业生产的。作为这些氨基酸生产菌，为了提高生产力，人们使用了从自然界分离出来的菌株或该菌株的人工突变株或者通过基因重组而增强了L-氨基酸生物合成酶活性的重组体等。L-赖氨酸的生产方法包括例如专利文献1～4中所述的方法。

作为提高L-赖氨酸等氨基酸的生产能力的方法，除了有增加目的氨基酸的固有生物合成途径的酶的表达量的方法以外，还开发了通过修饰呼吸链途径来改善能量效率的方法(专利文献5)、通过扩增烟酰胺核苷酸转氢酶基因来提高烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸生产能力的方法(专利文献6)。

此外，作为对各种氨基酸的生物合成的共有途径进行修饰的方法，已知有补给途径经过修饰的L-氨基酸生产菌，如增加了丙酮酸羧化酶活性的棒状杆菌型细菌L-赖氨酸生产菌(专利文献7)、缺损了丙酮酸激酶的埃希氏菌属L-赖氨酸生产菌(专利文献8)、缺损了苹果酸醌氧化还原酶(malatequinine oxidoreductase)的棒状杆菌型细菌L-赖氨酸生产菌(专利文献9)等。

作为L-赖氨酸的前体，有内消旋α，ε-二氨基庚二酸(以下也称“meso-DAP”)。meso-DAP不但是L-赖氨酸的前体，而且同时作为细胞壁的构成成分，也是细菌生长所必需的物质。关于埃希氏菌属(Escherichia)细菌的meso-DAP合成，已知meso-DAP是从其前体2，3，4，5-四氢吡啶-2，6-二羧酸(以下也称“THDP”)通过属于meso-DAP合成途径的四种酶的功能来合成的，这四种酶是：2，3，4，5-四氢吡啶-2，6-二羧酸N-琥珀酰转移酶(以下也称“DapD”，非专利文献1)、琥珀酰二氨基庚二酸转氨酶(以下也称“DapC”，非专利文献2)、琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰基酶(以下也称“DapE”，非专利文献3)、以及二氨基庚二酸差向异构酶(以下也称“DapF”，非专利文献4)。已经清楚在棒状杆菌型细菌中另外存在一条以THDP为前体的meso-DAP合成途径，其使用meso-DAP脱氢酶(以下也称“二氨基庚二酸脱氢酶”或“DDH”)通过一步反应从THDP合成meso-DAP，而且还已知DDH表达对于meso-DAP的生产是有用的(专利文献10)。此外，已经公开了如下内容：在考察埃希氏菌属细菌L-赖氨酸生物合成的限速步骤的过程中，将编码棒状杆菌型细菌DDH的基因导入埃希氏菌属的L-赖氨酸生产菌中，作为增强属于meso-DAP合成途径的酶的活性的替代手段，来进行L-赖氨酸生产。然而，人们并未预想到，当在埃希氏菌属细菌中表达DDH时，降低属于meso-DAP合成途径的酶的活性对L-赖氨酸生产是有效的。

专利文献1特开平10-165180号公报

专利文献2特开平11-192088号公报

专利文献3特开2000-253879号公报

专利文献4特开2001-057896号公报

专利文献5特开2002-17363号公报

专利文献6特许第2817400号公报

专利文献7特表2002-508921号公报

专利文献8国际公开第WO03/008600号小册子

专利文献9美国专利申请公开第0044943号

专利文献10特开昭61-289887号公报

专利文献11国际公开第WO2006/093322号公报

专利文献12美国专利申请公开第2006/0160191号公报

专利文献13美国专利6040160

非专利文献1Richaud，C.et al.，J.Biol.Chem.，259(23)：14824-14828，1984

非专利文献2Heimberg，H.et al.，Gene.90(1)：69-78，1990

非专利文献3Bouvier，J.et al.，J.Bacteriol.，174(16)：5265-71，1992

非专利文献4Wiseman，J.S.et al.，J.Biol.Chem.，259(14)：8907-14，1984

发明内容

发明所要解决的问题

本发明的目的是提供L-赖氨酸生产能力提高的大肠杆菌以及使用该大肠杆菌来生产L-赖氨酸的方法。

解决问题的方法

本发明人等对上述问题进行了深入研究，结果发现：通过对大肠杆菌进行修饰而降低属于meso-DAP合成途径的酶的活性，并且导入编码二氨基庚二酸脱氢酶的基因，能够提高L-赖氨酸生产能力，从而基于上述认识完成了本发明。

即，本发明如下所述。

(1)一种具有L-赖氨酸生产能力的大肠杆菌，该大肠杆菌经过修饰而降低了内消旋α，ε-二氨基庚二酸合成途径的1种或2种以上的酶的活性，并且导入了编码二氨基庚二酸脱氢酶的基因。

(2)前述的大肠杆菌，其中，所述内消旋α，ε-二氨基庚二酸合成途径的酶选自2，3，4，5-四氢吡啶-2，6-二羧酸N-琥珀酰转移酶、琥珀酰二氨基庚二酸转氨酶、琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰基酶以及二氨基庚二酸差向异构酶。

(3)前述的大肠杆菌，其中，所述2，3，4，5-四氢吡啶-2，6-二羧酸N-琥珀酰转移酶、琥珀酰二氨基庚二酸转氨酶、琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰基酶以及二氨基庚二酸差向异构酶分别由dapD基因、dapC基因、dapE基因以及dapF基因编码。

(4)前述的大肠杆菌，其中，内消旋α，ε-二氨基庚二酸合成途径的酶的活性是通过降低所述基因的表达量或破坏所述基因而降低的。

(5)前述的大肠杆菌，其经过修饰而至少降低了2，3，4，5-四氢吡啶-2，6-二羧酸N-琥珀酰转移酶活性。

(6)前述的大肠杆菌，其中，所述编码二氨基庚二酸脱氢酶的基因是棒状杆菌型细菌的ddh基因。

(7)前述的大肠杆菌，其中，所述2，3，4，5-四氢吡啶-2，6-二羧酸N-琥珀酰转移酶是下述(A)或(B)所述的蛋白质：

(A)具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白质；

(B)具有在SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列中包含1个或数个氨基酸的取代、缺失、插入或添加而得到的氨基酸序列，且具有2，3，4，5-四氢吡啶-2，6-二羧酸N-琥珀酰转移酶活性的蛋白质。

(8).前述的大肠杆菌，其中，所述琥珀酰二氨基庚二酸转氨酶是下述(C)或(D)所述的蛋白质：

(C)具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的蛋白质；

(D)具有在SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列中包含1个或数个氨基酸的取代、缺失、插入或添加而得到的氨基酸序列，且具有琥珀酰二氨基庚二酸转氨酶活性的蛋白质。

(9).前述的大肠杆菌，其中，所述琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰基酶是下述(E)或(F)所述的蛋白质：

(E)具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的蛋白质；

(F)具有在SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列中包含1个或数个氨基酸的取代、缺失、插入或添加而得到的氨基酸序列，且具有琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰基酶活性的蛋白质。

(10).前述的大肠杆菌，其中，所述二氨基庚二酸差向异构酶是下述(G)或(H)所述的蛋白质：

(G)具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的蛋白质；

(H)具有在SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列中包含1个或数个氨基酸的取代、缺失、插入或添加而得到的氨基酸序列，且具有二氨基庚二酸差向异构酶活性的蛋白质。

(11).前述的大肠杆菌，其中，所述dapD基因是下述(a)或(b)所述的DNA：

(a)包含SEQ ID NO：1的碱基序列的DNA；或

(b)与SEQ ID NO：1的碱基序列或能够由该碱基序列制备的探针在严格条件下杂交，且编码具有2，3，4，5-四氢吡啶-2，6-二羧酸N-琥珀酰转移酶活性的蛋白质的DNA。

(12).前述的大肠杆菌，其中所述dapC基因是下述(c)或(d)所述的DNA：

(c)包含SEQ ID NO：3的碱基序列的DNA；或

(d)与SEQ ID NO：3的碱基序列或能够由该碱基序列制备的探针在严格条件下杂交、且编码具有琥珀酰二氨基庚二酸转氨酶活性的蛋白质的DNA。

(13).前述的大肠杆菌，其中所述dapE基因是下述(e)或(f)所述的DNA：

(e)包含SEQ ID NO：5的碱基序列的DNA；或

(f)与SEQ ID NO：5的碱基序列或能够由该碱基序列制备的探针在严格条件下杂交，且编码具有琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰基酶活性的蛋白质的DNA。

(14).前述的大肠杆菌，其中所述dapF基因是下述(g)或(h)所述的DNA：

(g)包含SEQ ID NO：7的碱基序列的DNA；或

(h)与SEQ ID NO：7的碱基序列或能够由该碱基序列制备的探针在严格条件下杂交，且编码具有二氨基庚二酸差向异构酶活性的蛋白质的DNA。

(15).前述的大肠杆菌，其中，所述二氨基庚二酸脱氢酶是下述(I)或(J)所述的蛋白质：

(I)具有SEQ ID NO：10、12、14、16或18所示的氨基酸序列的蛋白质；

(J)具有在SEQ ID NO：10、12、14、16或18所示的氨基酸序列中包含1个或数个氨基酸的取代、缺失、插入或添加而得到的氨基酸序列，且具有二氨基庚二酸脱氢酶活性的蛋白质。

(16).前述的大肠杆菌，其中所述ddh基因是下述(i)或(j)所述的DNA：

(i)包含SEQ ID NO：9、11、13、15或17的碱基序列的DNA；或

(j)与SEQ ID NO：9、11、13、15或17的碱基序列或能够由该碱基序列制备的探针在严格条件下杂交，且编码具有二氨基庚二酸脱氢酶活性的蛋白质的DNA。

(17).前述的大肠杆菌，该大肠杆菌还具有解除了由L-赖氨酸导致的反馈抑制的二氢吡啶二羧酸合酶，以及解除了由L-赖氨酸导致的反馈抑制的天冬氨酸激酶，并且该大肠杆菌的二氢吡啶二羧酸还原酶活性得到了增强。

(18).一种生产L-赖氨酸的方法，其特征在于，在培养基中培养权利要求1～17中任一项所述的大肠杆菌，并且从该培养基中收集L-赖氨酸。

发明的具体实施方式

以下对本发明进行具体说明。

<1>本发明的大肠杆菌

本发明的大肠杆菌(以下也称“本发明的细菌”)是具有L-赖氨酸生产能力、经过修饰而降低了属于meso-DAP合成途径的酶的活性、而且导入了编码二氨基庚二酸脱氢酶的基因的大肠杆菌。

此外，本发明的优选的细菌，是除了具有上述性质外，还具有解除了由L-赖氨酸导致的反馈抑制的二氢吡啶二羧酸合酶以及解除了由L-赖氨酸导致的反馈抑制的天冬氨酸激酶，且二氢吡啶二羧酸还原酶活性得到了增强的细菌。

本发明的细菌可以这样获得：以具有L-赖氨酸生产能力的大肠杆菌作为亲本株，对其进行修饰而使得其属于meso-DAP合成途径的酶的活性降低，进而向其中导入编码二氨基庚二酸脱氢酶的基因。对于降低属于meso-DAP合成途径的酶的活性的修饰，和编码二氨基庚二酸脱氢酶的基因的导入这两者的顺序而言，没有特别限制。此外，L-赖氨酸生产的赋予可以在所述修饰和基因导入之间进行，还可以在最后进行。

就为了获得本发明的细菌而使用的大肠杆菌亲本株而言，没有特殊限制，具体地说可以利用Neidhardt等的著作(Neidhardt，F.C.et al.，Escherichiacoli and Salmonella Typhimurium，American Society for Microbiology，Washington D.C.，1029 table 1)中列举的微生物。具体而言，可以列举出原型野生株K12株来源的大肠杆菌W3110(ATCC 27325)、大肠杆菌MG1655(ATCC 47076)等。

这些菌株可以从例如美国典型培养物保藏中心(地址12301 ParklawnDrive，Rockville，Maryland 20852，United States of America)通过分售获得。即，各菌株被给予了对应的登录号，可以利用该登录号通过分售获得。对应于各菌株的登录号见美国典型培养物保藏中心的目录。

<1-1>L-赖氨酸生产能力的赋予以及具有L-赖氨酸生产能力的大肠杆菌

作为大肠杆菌中的L-赖氨酸生产菌的例子，可以列举出对L-赖氨酸类似物具有抗性的突变株。L-赖氨酸类似物可抑制大肠杆菌的生长，但在培养基中有L-赖氨酸共同存在时，这种抑制会被完全或部分地解除。作为L-赖氨酸类似物的例子，可以列举出氧代赖氨酸(oxalysine)、赖氨酸氧肟酸(lysinehydroxamate)、S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸(AEC)、γ-甲基赖氨酸、α-氯己内酰胺等，但不限于此。对这些赖氨酸类似物具有抗性的突变株可以通过对大肠杆菌实施常规人工突变处理来获得。作为可用于L-赖氨酸生产的细菌菌株的具体例子，可以列举出大肠杆菌(E.coli)AJ11442(FERM BP-1543，NRRL B-12185；参照美国专利4,346,170)以及大肠杆菌VL611。在这些微生物中，L-赖氨酸对天冬氨酸激酶造成的反馈抑制已被解除。

WC196株可以用作大肠杆菌中的L-赖氨酸生产菌。该菌株是通过对大肠杆菌K-12来源的W3110株赋予AEC抗性而选育获得的。该菌株被命名为大肠杆菌AJ13069，于1994年12月6日保藏在工业技术院生命工学工业技术研究所(现为独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)，保藏号FERMP-14690，并于1995年9月29日转为基于布达佩斯条约的国际保藏，保藏号FERM BP-5252(美国专利5,827,698)。

作为用于衍生L-赖氨酸生产菌的亲本株的例子，还可以列举出1种或1种以上的编码L-赖氨酸生物合成系统酶的基因的表达增加的菌株。作为这样的基因的例子，可以列举出编码二氢吡啶二羧酸合酶(dapA)、天冬氨酸激酶(lysC)、二氢吡啶二羧酸还原酶(dapB)、二氨基庚二酸脱羧酶(lysA)、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(ppc)、天冬氨酸半醛脱氢酶(asd)以及天冬氨酸酶(aspA)(EP 1253195 A)的基因，但不限于此。此外，亲本株中与能量效率相关的基因(cyo)(EP 1170376 A)、编码烟酰胺核苷酸转氢酶的基因(pntAB)(美国专利5,830,716)、ybjE基因(WO2005/073390)、编码谷氨酸脱氢酶的基因(gdhA)(Gene23：199-209(1983))或这些基因的组合表达水平增加也是可以的。括号内是所述基因的简称。

大肠杆菌的lysC基因的碱基序列如SEQ ID NO：21所示，编码的天冬氨酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：22所示。大肠杆菌的dapA基因的碱基序列如SEQ ID NO：23所示，编码的二氢吡啶二羧酸合酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：24所示。大肠杆菌的dapB基因的碱基序列如SEQ ID NO：25所示，编码的二氢吡啶二羧酸还原酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：26所示。

已知大肠杆菌来源的野生型二氢吡啶二羧酸合酶受到L-赖氨酸的反馈抑制，而大肠杆菌来源的野生型天冬氨酸激酶受到L-赖氨酸的阻遏和反馈抑制。因此，在使用dapA基因和lysC基因时，这些基因优选是编码不受由L-赖氨酸导致的反馈抑制的突变型酶的突变型基因。

作为编码不受由L-赖氨酸导致的反馈抑制的突变型二氢吡啶二羧酸合酶的DNA，可以列举编码具有SEQ ID NO：24的第118位的组氨酸残基被酪氨酸残基取代而得的序列的蛋白质的DNA。此外，作为编码不受由L-赖氨酸导致的反馈抑制的突变型天冬氨酸激酶的DNA，可以列举对具有SEQID NO：22的第352位的苏氨酸残基被异亮氨酸残基取代、第323位的甘氨酸残基被天冬酰胺残基取代、第318位的甲硫氨酸被异亮氨酸取代而成的序列的AKIII编码的DNA(关于这些突变体，参照美国专利5661012以及6040160)。突变型DNA可以通过基于PCR等的定点突变法来获得。

已知的RSF1010来源的广宿主域质粒RSFD80、pCAB1、pCABD2(美国专利6040160)是包含编码具有如上文所述的突变的大肠杆菌突变型二氢吡啶二羧酸合酶的突变型dapA以及编码突变型天冬氨酸激酶的突变型lysC的质粒。经RSFD80转化的大肠杆菌JM109株(美国专利6040160)被命名为AJ12396，该菌株于1993年10月28日被保藏于通产省工业技术院生命工学工业技术研究所(现为独立行政法人产业技术综合研究所专利生物保藏中心，

305-8566日本国茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6)，保藏号FERM P-13936，并于1994年11月1日转为基于布达佩斯条约的国际保藏，保藏号FERM BP-4859。RSFD80可以从AJ12396株采用公知方法获得。pCAB1是在所述RSFD80中进一步插入大肠杆菌的dapB基因而制备的。此外，pCABD2是通过在该pCAB1中进一步插入乳发酵短杆菌(谷氨酸棒杆菌)2256株(ATCC13869)的ddh基因而制备的(美国专利6040160)。

作为L-赖氨酸生产菌或用于衍生L-赖氨酸生产菌的亲本株的例子，可以列举出催化从L-赖氨酸的生物合成途径中改道而生成L-赖氨酸以外的化合物的反应的酶的活性降低或缺损的菌株。作为催化从L-赖氨酸的生物合成途径中改道而生成L-赖氨酸以外的化合物的反应的酶的例子，可以列举出高丝氨酸脱氢酶、赖氨酸脱羧酶(美国专利5,827,698)、以及苹果酸酶(WO2005/010175)。这里，为了降低或缺损赖氨酸脱羧酶活性，优选降低编码赖氨酸脱羧酶的cadA基因和ldcC基因这两者的表达(国际公布第WO2006/038695号小册子)。

为了提高甘油同化性，本发明中使用的细菌的glpR基因(EP1715056)的表达可以被弱化，或者其glpA、glpB、glpC、glpD、glpE、glpF、glpG、glpK、glpQ、glpT、glpX、tpiA、gldA、dhaK、dhaL、dhaM、dhaR、fsa以及talC基因等甘油代谢基因(EP1715055A)的表达可以被强化。

<1-2>本发明的大肠杆菌的构建

接下来，对降低属于meso-DAP合成途径的酶的活性的修饰以及编码二氨基庚二酸脱氢酶的基因的导入进行说明。

大肠杆菌所具有的meso-DAP合成途径是指从(S)-2，3，4，5-四氢吡啶-2，6-二羧酸((S)-2，3，4，5-四氢吡啶二羧酸)生成meso-DAP(内消旋-2，6-二氨基庚二酸、内消旋-α，ε-二氨基庚二酸、或内消旋-二氨基庚二酸)的途径，其由以下的4步反应催化。这些反应是可逆反应。在大肠杆菌中，meso-DAP合成途径也称为DapDCEF途径。

1)DapD(2，3，4，5-四氢吡啶-2，6-二羧酸N-琥珀酰转移酶)(EC 2.3.1.117)

琥珀酰-CoA+(S)-2，3，4，5-四氢吡啶-2，6-二羧酸+H₂O→CoA+N-琥珀酰-L-2-氨基-6-酮庚二酸(N-succinyl-L-2-amino-6-oxoheptanedioate)

DapD由dapD基因编码。大肠杆菌的dapD基因的序列如SEQ ID NO：1所示，DapD的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

DapD的酶活性可以参考S.A，Simms等的方法(J.Biol.Chem.，1984，Mar10；259(5)：2734-2741)来测定。

2)DapC(琥珀酰二氨基庚二酸转氨酶)(也称SDAP氨基转移酶)(EC2.6.1.17)

N-琥珀酰-LL-2，6-二氨基庚二酸+2-酮戊二酸→N-琥珀酰-L-2-氨基-6-酮庚二酸+L-谷氨酸

DapC由dapC基因编码。大肠杆菌的dapC基因的序列如SEQ ID NO：3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

DapC的酶活性可以采用Thilo，M.等的方法(J.Bacteriol.，2000，Jul；182(13)：3626-3631)来测定。

3)DapE(琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰基酶)(也称SDAP脱琥珀酰化酶)(EC 3.5.1.18)

N-琥珀酰-LL-2，6-二氨基庚二酸+H₂O→琥珀酸+LL-2，6-二氨基庚二酸

DapE由dapE基因编码。大肠杆菌的dapE基因的序列如SEQ ID NO：5所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。

DapE的酶活性可以采用Lin，Y.K.等的方法(J.Biol.Chem.，1988，Feb5；263(4)：1622-1627)来测定。

4)DapF(二氨基庚二酸差向异构酶(EC5.1.1.7)

LL-2，6-二氨基庚二酸→内消旋-2，6-二氨基庚二酸(meso-2，6-diaminopimalate)

DapF由dapF基因编码。大肠杆菌的dapF基因的序列如SEQ ID NO：7所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。

DapF的酶活性可以参考Wiseman，J.S.等的方法(J.Biol.Chem.，1984，Jul 25；259(14)：8907-8914)来测定。

此外，在本发明中，DDH(二氨基庚二酸脱氢酶)(EC1.4.1.16)是可逆地从内消旋-2，6-二氨基庚二酸生成(S)-2，3，4，5-四氢吡啶-2，6-二羧酸的酶，其催化以下的反应。

内消旋-2，6-二氨基庚二酸+H₂O+NADP⁺→(S)-2，3，4，5-四氢吡啶-2，6-二羧酸+NH₃+NADPH+H+

DDH的酶活性可以参考Misono，H.等的方法(J.Biol.Chem.，255，10599-10605，1980)来测定。

编码DDH的ddh基因在埃希氏菌属细菌中是不存在的，可以使用谷氨酸棒杆菌(SEQ ID NO：9)、乳发酵短杆菌(SEQ ID NO：11)、Corynebacteriumefficiens(SEQ ID NO：13)等棒状杆菌型细菌的ddh基因。

谷氨酸棒杆菌ATCC13032的ddh基因(NCgl2528)登录于GenbankNP_601818.2 GI：23308957，Corynebacterium efficiens的ddh基因(CE2498)登录于NP_739108.1 GI：25029054。

此外，除了棒状杆菌型细菌以外，还可以利用Herminiimonasarsenicoxydans的ddh基因(SEQ ID NO：15)、多形拟杆菌(Bacteroidesthetaiotaomicron)的ddh基因(SEQ ID NO：17)。Herminiimonas arsenicoxydans的ddh基因登录于Genbank YP_001100730.1GI：134095655，多形拟杆菌的ddh基因登录于NP_810892.1 GI：29347389。

上述各基因以及所述的L-赖氨酸生物合成系统酶基因不仅限于具有上述基因信息的基因或者具有公知序列的基因，也可以是这些基因的同源物、人工修饰体等具有保守突变的基因，只要无损于所编码的蛋白质的功能即可。也就是说，可以是编码具有在公知的蛋白质的氨基酸序列中包含1个或者数个位置上的1个或数个氨基酸的取代、缺失、插入或添加等而成的序列的蛋白质的基因。

这里，“1个或者数个”因氨基酸残基在蛋白质立体结构中的位置或氨基酸残基的种类而异，具体地说优选为1～20个、更优选1～10个、更优选1～5个。保守突变的代表是保守取代。所谓保守取代，当取代位点是芳香族氨基酸时为Phe、Trp和Tyr之间，当取代位点是疏水氨基酸时为Leu、Ile和Val之间，是极性氨基酸时为Gln和Asn之间，是碱性氨基酸时为Lys、Arg和His之间，当是酸性氨基酸时为Asp和Glu之间，是具有羟基的氨基酸时为Ser和Thr之间的相互取代的突变。视为保守取代的取代具体包括例如：用Ser或Thr取代Ala；用Gln、His或Lys取代Arg；用Glu、Gln、Lys、His或Asp取代Asn；用Asn、Glu或Gln取代Asp；用Ser或Ala取代Cys；用Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg取代Gln；用Gly、Asn、Gln、Lys或Asp取代Glu；用Pro取代Gly；用Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr取代His；用Leu、Met、Val或Phe取代Ile；用Ile、Met、Val或Phe取代Leu；用Asn、Glu、Gln、His或Arg取代Lys；用Ile、Leu、Val或Phe取代Met；用Trp、Tyr、Met、Ile或Leu取代Phe；用Thr或Ala取代Ser；用Ser或Ala取代Thr；用Phe或Tyr取代Trp；用His、Phe或Trp取代Tyr；和用Met、Ile或Leu取代Val。此外，这样的氨基酸的取代、缺失、插入、添加或倒位等还包括因基于提供所述基因的微生物的个体差异、种间差异等情形而天然发生的突变(mutant或variant)而产生的那些取代、缺失、插入、添加或倒位。这样的基因可以通过对公知基因的碱基序列进行修饰，例如采用定点突变法使得所编码的蛋白质的特定部位的氨基酸残基包含取代、缺失、插入或添加来获得。

而且，具有如上所述的保守突变的基因可以是编码这样的蛋白质的基因，所述蛋白质相对于编码的氨基酸序列整体具有80％以上、优选90％以上、更优选95％以上、特别优选97％以上的同源性，且具有与野生型蛋白质等同的功能。而且，在本说明书中，“同源性”(homology)”有时指“同一性”(identity)。

此外，可以将基因的序列中的各密码子分别替换成易于在基因所导入的宿主中使用的密码子。

具有保守突变的基因可以通过突变剂处理等用于常规突变处理的方法来获得。

此外，基因还可以是这样的DNA：其在严格条件下与能够从公知的基因序列制备的探针、例如上文所述基因序列或其互补序列杂交，且编码具有与公知的基因产物等同的功能的蛋白质。这里，“严格条件”是指形成所谓特异性杂交体而不形成非特异性杂交体的条件。举一实例，有这样的条件：在该条件下，具有高同源性的DNA之间，例如具有80％以上，优选90％以上，更优选95％以上，特别优选具有97％以上同源性的DNA之间相互杂交，而同源性较之为低的DNA之间则不发生杂交；或者是这样的条件：在与常规Southern杂交的洗涤条件即60℃，1×SSC、0.1％SDS，优选0.1×SSC、0.1％SDS，更优选68℃，0.1×SSC、0.1％SDS相当的盐浓度和温度下，洗涤一次，更优选两次至三次的条件。

作为探针，也可以使用基因的互补序列的一部分。这样的探针可以使用基于公知基因序列制作的寡核苷酸作为引物，以包含这些碱基序列的DNA片段为模板进行PCR来制作。例如，当使用300bp左右长度的DNA片段作为探针时，杂交的洗涤条件可以是例如50℃、2×SSC、0.1％SDS。

“经过修饰而降低了meso-DAP合成途径的酶活性”是指：经过了修饰而使得属于meso-DAP合成途径(以下也称“DapDCEF途径”)的酶、具体地是DapD、DapC、DapE以及DapF这4种酶中的至少一种的活性完全消失，或者与大肠杆菌的非修饰株例如野生株相比活性降低。

被降低活性的酶可以是DapD、DapC、DapE以及DapF中的任何酶，并且可以是1种或2种以上。优选DapDCEF途径的上游侧的酶的活性，特别优选的是进行修饰而至少降低DapD的活性。

所谓降低了DapDCEF途径的酶活性，优选是指，例如，DapDCEF途径的各种酶活性与非修饰株例如野生株相比，每个菌体降低至50％以下、优选30％以下，更优选10％以下。

此处，作为对照的大肠杆菌包括例如作为野生株的原型野生株K12株来源的大肠杆菌W3110(ATCC 27325)、大肠杆菌MG1655(ATCC 47076)等。

关于使得DapDCEF途径的酶活性降低的修饰，具体地说可以这样来实现：缺损染色体上的编码DapDCEF途径的酶的基因，具体地是dapD、dapC、dapE或dapF基因的编码区域的一部分或全部，或者对启动子、ShineDargarno(SD)序列等表达调节序列进行修饰等。此外，通过对表达调节序列以外的非翻译区域进行修饰也能够降低基因的表达量。而且，还可以缺失整个基因，包括染色体上的基因上下游序列。此外，还可以通过采用基因重组在染色体上的编码酶的区域中导入氨基酸取代(错义突变)、或者导入终止密码子(无义突变)、或者导入一～二个碱基的添加或缺失的移框突变来实现(Journal of Biological Chemistry 272：8611-8617(1997)Proceedings of theNational Academy of Sciences，USA 95 5511-5515(1998)，Journal of BiologicalChemistry 266，20833-20839(1991))。

在本发明中，优选利用同源重组，通过缺损染色体上的基因的表达调节序列例如启动子区域、或编码区域、或非编码区域的一部分或全部，或者通过在这些区域中插入其它序列，来降低细胞内的酶活性。然而，还可以通过照射X射线或紫外线，或通过使用N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍等突变剂进行的常规突变处理来进行修饰，只要该修饰使得DapDCEF途径的酶活性降低即可。

表达调节序列的修饰优选为1个碱基以上、更优选2个碱基以上、特别优选3个碱基以上。此外，当缺失编码区域时，发生缺失的区域可以是N末端区域、内部区域、C末端区域中的任何区域，也可以是编码区域整体，只要产生的酶蛋白质的功能降低或缺失即可。通常，缺失的区域越长，越能够切实地使基因失活。此外，优选的是，要缺失的区域的上游和下游的阅读框不一致。

当在编码区域中插入其它序列的场合，基因的任何区域都可以插入，且插入的序列越长，越能够切实地使编码酶的基因失活。优选的是插入部位的上下游序列的阅读框不一致。作为所述其它序列，没有特殊限制，只要其能够降低或缺损酶蛋白质的功能即可，包括例如：携带抗生素抗性基因或对L-赖氨酸生产有用的基因的转座子等。

为了对染色体上的基因进行诸如所述的修饰，例如可以这样来实现：制作经过修饰而缺失了基因的部分序列、不产生正常发挥功能的酶蛋白质的缺失型基因，用包含该基因的DNA转化细菌，使缺失型基因与染色体上的基因之间发生同源重组，从而将染色体上的基因替换成缺失型基因。缺失型基因所编码的酶蛋白质即使产生也具有与野生型酶蛋白质不同的立体结构，其功能降低或消失。基于利用如上所述的同源重组的基因取代的基因破坏已经确立，包括下述方法：称为“Red驱动整合(Red-driven integration)”的方法(Datsenko，K.A，and Wanner，B.L.Proc.Natl.Acad.Sci.U S A.97：6640-6645(2000))、Red驱动整合法与λ噬菌体来源的切出系统(Cho，E.H.，Gumport，R.I.，Gardner，J.F.J.Bacteriol.184：5200-5203(2002))相结合的方法(参照WO2005/010175号)等使用线性DNA的方法，或者使用含有温度敏感复制起点的质粒、可接合转移的质粒的方法，利用在宿主内不具有复制起点的自杀载体的方法，等等(美国专利6303383、或特开平05-007491号)。

基因转录量的降低可以通过将从该基因转录的mRNA的量与野生株或非修饰株进行比较来确认。评价mRNA量的方法包括例如Northern杂交、RT-PCR等(Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press，Coldspring Harbor(USA)，2001))。

基因所编码的蛋白质的量降低可以通过使用抗体进行western印迹来确认(Molecular cloning(Cold spring Harbor Laboratory Press，Cold spring Harbor(USA)，2001))。

为了在大肠杆菌中导入编码DDH的基因(ddh)，例如，可以利用质粒、噬菌体等载体用ddh基因转化大肠杆菌。这样的载体包括例如pUC19、pUC18、pBR322、pHSG299、pHSG298、pHSG399、pHSG398、RSF1010、pMW119、pMW118、pMW219、pMW218等。DDH基因可以使用该基因固有的启动子，也可以使用在大肠杆菌中高效发挥功能的启动子，只要DDH基因能在大肠杆菌中表达即可。这样的启动子包括例如lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、λ噬菌体的PR启动子、PL启动子、tet启动子等。

此外，ddh基因也可以通过利用转导、转座子(Berg，D.E.and Berg，C.M.，Bio/Technol.，1，417(1983))、Mu噬菌体(特开平2-109985)或同源性重组(Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring Harbor Lab.(1972))的方法整合到大肠杆菌的染色体上。而且，还可以使整合到染色体上的ddh基因发生转移，来提高拷贝数。

ddh基因导入的确认可以通过例如Southern杂交来进行。此外，导入ddh基因的大肠杆菌具有DDH活性，可以通过例如采用味园春雄，发酵与工业(発酵と工業)45，964(1987)中记载的方法测定DDH活性来确认。此外，也可以使用抗体通过的western印迹检测DDH。

<2>L-赖氨酸的生产方法

本发明的L-赖氨酸生产方法用培养基培养本发明的细菌，在该培养基中或菌体内生成并蓄积L-赖氨酸，并从该培养基或菌体收集L-赖氨酸。

作为所使用的培养基，可以使用在利用微生物的L-赖氨酸发酵生产中传统上使用的培养基。即，可以使用含有碳源、氮源、无机离子以及视需要而定的其它有机成分的常规培养基。这里，作为碳源，可以使用葡萄糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、果糖、淀粉水解物等糖类，甘油、山梨醇等醇类，富马酸、柠檬酸、琥珀酸等有机酸类。作为氮源，可以使用硫酸铵、氯化铵、磷酸铵等无机铵盐，大豆水解物等有机氮、氨气、氨气水等。作为有机微量营养源，理想的是掺入适量的维生素B1、L-高丝氨酸等要求的物质或酵母提取物等。除此之外，还可以视需要少量添加磷酸钾、硫酸镁、铁离子、锰离子等。而且，本发明中使用的培养基可以是天然培养基，也可以是合成培养基，只要是包含碳源、氮源、无机离子以及视需要而定的其它有机微量成分的培养基即可。

特别地，在本发明中优选使用甘油作为碳源。甘油可以是作为试剂的甘油，但理想的是使用工业生产的含杂质的甘油。例如，理想的是使用通过用于生物柴油燃料生产的酯化反应来工业生产的甘油(Mu Y，et al，Biotechnol Lett.，28，1755-91759(2006)，Haas MJ，et al；Bioresour Technol.97，4，671-8678(2006))。

本发明的培养基中所含的甘油可以作为单独的碳源，也可以使用除甘油之外还添加了其它碳源的混合培养基。作为其它碳源，优选葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖、废糖蜜、淀粉水解物以及生物质水解而得到的糖液等糖类，乙醇等醇类，富马酸、柠檬酸、琥珀酸等有机酸类。当使用混合培养基时，优选甘油相对于培养基中的总碳源的比率为50％以上、60％以上、理想的是70％以上、更理想的是80％以上、特别理想的是90％以上。

培养可以在好氧条件下实施1～7天，培养温度可以是24℃～37℃，培养中的pH可以是5～9。而且，pH调整可以使用无机或者有机的酸性或者碱性物质，还可以使用氨气等。从发酵液中回收L-赖氨酸可以通过组合使用常规的离子交换树脂法、沉淀法及其它公知方法来实施。而且，当L-赖氨酸在菌体内蓄积时，可以例如利用超声波等破碎菌体，再离心分离除去菌体而得到上清，然后用离子交换树脂法等回收L-赖氨酸。

而且，还可以通过采用下述方法进行发酵，并回收赖氨酸的方法来进行生产，所述方法中控制培养中的pH为6.5～9.0、培养结束时培养基的pH为7.2～9.0，并且控制发酵中发酵罐内压力为正，或者，向培养基中供给二氧化碳或含有二氧化碳的混合气体，使得存在培养基中的碳酸氢根离子和/或碳酸根离子为至少2g/L以上的培养期，并且以所述碳酸氢根离子和/或碳酸根离子作为以碱性氨基酸为主的阳离子的反荷离子(参照特开2002-065287号，美国专利申请公开2002025564)。

实施例

以下，通过实施例更具体地说明本发明。

〔实施例1〕dapD被破坏的L-赖氨酸生产菌的构建

<1-1>dapD基因破坏株的构建

首先，使用大肠杆菌野生型株MG1655株进行dapD破坏株的构建。

以pMW118(λattL-Km^r-λattR)(参照国际公布第WO2006093322号公报)质粒为模板，以SEQ ID NO：19以及20所示的、在引物3’末端具有对应于λ噬菌体附着位点的序列attL和attR的两端的序列、在引物5’末端具有对应于作为目的基因的dapD基因的一部分的序列的合成寡核苷酸为引物进行PCR，采用美国专利申请公开第2006/0160191号公报以及WO2005/010175所述的λ-red法构建了MG1655ΔdapD::att-Km株。λ-red法中Km抗性重组体的获得是通过于37℃在含Km(卡那霉素)(50mg/L)的L-琼脂培养基上进行平板培养，并选择Km抗性重组体来进行的。

<1-2>用ΔdapD::att-kan转化L-赖氨酸生产菌WC196LC/pCABD2株

从<1-1>中所得的MG1655ΔdapD::att-Km株按常规方法获得P1溶胞产物，以采用美国专利申请公开第2006/0160191号公报所述的方法构建的L-赖氨酸生产菌WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2株作为宿主，采用P1转化法构建了WC196ΔcadAΔldcCΔdapD::att-Km/pCABD2株。WC196ΔcadAΔldc株是采用将Red驱动整合法(Datsenko，K.A.and Wanner，B.L.，2000.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.97：6640-6645)与λ噬菌体来源的切出系统(Cho，E.H.，Gumport，R.I.，Gardner，J.F.J.Bacteriol.184：5200-5203(2002))相结合的方法(参照WO2005/010175号)破坏了大肠杆菌WC196的赖氨酸脱羧酶基因cadA和ldc而得到的菌株。在该菌株中导入pCABD2而得的菌株为WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2。

目标转化株可以通过于37℃在含Km(卡那霉素)(50mg/L)和Sm(链霉素)(20mg/L)的L-琼脂培养基上进行平板培养，并选择Km抗性且Sm抗性的重组体来获得。

此外，将这些菌株于37℃在含20mg/L链霉素的L培养基中进行培养至终OD600≈0.6，然后加入与培养液等量的40％甘油溶液并搅拌，再以适当的量进行分装，于-80℃保存。这称作甘油保存液。

〔实施例2〕dapD被破坏的L-赖氨酸生产菌的L-赖氨酸生产能力评价

融解实施例1中所得菌株的甘油保存液，取100μL均匀涂布在含20mg/L链霉素的L平板上，于37℃培养24小时。将所得平板上的约1/8量的菌体悬浮在0.5mL的生理盐水中，用分光光度计U-2000(日立)测定波长600nm的浊度。将所得包含菌体的悬浊液接种在500mL坂口烧瓶中的含20mg/L链霉素的发酵培养基(MS培养基，组成如下述)20mL中，其中接种的液量使得波长600nm的浊度为0.15，用往复式振荡培养装置在搅拌速度114rpm、温度37℃的条件下培养约24小时。培养后，使用Biotec AnalyzerAS210(SAKURA精机)测定培养基中蓄积的L-赖氨酸的量，以及残存的葡萄糖。此外，使用Biotec Analyzer BF-5(王子计测机器)测定培养基中蓄积的甘油。

〔发酵培养基组成，g/L〕

葡萄糖或甘油 40

(NH₄)₂SO₄ 24

K₂HPO₄ 11.0

MgSO₄·7H₂O 1.0

FeSO₄·7H₂O 0.01

MnSO₄·5H₂O 0.01

酵母提取物 2.0

用KOH调整至pH7.0，于115℃高压灭菌10分钟(但葡萄糖或甘油以及MgSO₄·7H₂O另行灭菌)后，加入符合药典的CaCO₃ 30g/L(180℃，干热灭菌2小时)。添加20mg/L的链霉素。

结果如表1所示(OD表示26倍稀释后于吸光度660nm测定而得的菌体量，Lys(g/L)表示烧瓶中蓄积的L-赖氨酸蓄积量，葡萄糖(g/L)、甘油(g/L)表示培养基中残存的葡萄糖、甘油的量，收率(％)表示从基质收获的L-赖氨酸的收率)。由表1可知，与dapD基因未缺损的WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2株相比，WC196ΔcadAΔldcCΔdapD::att-Km/pCABD2株蓄积了更多量的L-赖氨酸。

表1

MS葡萄糖培养基

菌株名	O.D.(x26)	Lys(g/L)	葡萄糖(g/L)	收率(％)
					WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2株	0.361	8.28	18.67	38.82
WC196ΔcadAΔldcCΔdapD::att-Km/pCABD2株	0.377	8.75	18.13	40.01

MS甘油培养基

菌株名	O.D.(x26)	Lys(g/L)	甘油(g/L)	收率(％)
菌株名	O.D.(x26)	Lys(g/L)	甘油(g/L)	收率(％)	WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2株	0.248	2.79	28.64	24.57
WC196ΔcadAΔldcCΔdapD::att-Km/pCABD2株	0.320	5.10	23.69	31.12	WC196ΔcadAΔldcC/pCABD2株	0.248	2.79	28.64	24.57

〔序列表的说明〕

SEQ ID NO：1：大肠杆菌dapD的碱基序列

SEQ ID NO：2：大肠杆菌DapD的氨基酸序列

SEQ ID NO：3：大肠杆菌dapC的碱基序列

SEQ ID NO：4：大肠杆菌DapC的氨基酸序列

SEQ ID NO：5：大肠杆菌dapE的碱基序列

SEQ ID NO：6：大肠杆菌DapE的氨基酸序列

SEQ ID NO：7：大肠杆菌dapF的碱基序列

SEQ ID NO：8：大肠杆菌DapF的氨基酸序列

SEQ ID NO：9：谷氨酸棒杆菌(C.glutamicum)的ddh基因的碱基序列

SEQ ID NO：10：谷氨酸棒杆菌的DDH的氨基酸序列

SEQ ID NO：11：乳发酵短杆菌(B.lactofermentum)的ddh基因的碱基序列

SEQ ID NO：12：乳发酵短杆菌的DDH的氨基酸序列

SEQ ID NO：13：C.efficiens的ddh基因的碱基序列

SEQ ID NO：14：C.efficiens的DDH的氨基酸序列

SEQ ID NO：15：H.arsenicoxydans的ddh基因的碱基序列

SEQ ID NO：16：H.arsenicoxydans的DDH的氨基酸序列

SEQ ID NO：17：多形拟杆菌(B.thetaiotaomicron)的ddh基因的碱基序列

SEQ ID NO：18：多形拟杆菌的DDH的氨基酸序列

SEQ ID NO：19：dapD基因缺失用引物

SEQ ID NO：20：dapD基因缺失用引物

SEQ ID NO：21：大肠杆菌lysC的碱基序列

SEQ ID NO：22：大肠杆菌LysC的氨基酸序列

SEQ ID NO：23：大肠杆菌dapA的碱基序列

SEQ ID NO：24：大肠杆菌DapA的氨基酸序列

SEQ ID NO：25：大肠杆菌dapB的碱基序列

SEQ ID NO：26：大肠杆菌DapB的氨基酸序列

工业实用性

根据本发明，在依照使用大肠杆菌的发酵方法进行L-赖氨酸的生产中，能够提高L-赖氨酸的生产量和/或发酵收率。此外，本发明能够用于大肠杆菌的L-赖氨酸生产菌的选育。

序列表

<110> 味之素株式会社 ( Ajinomoto Co.,Inc)

<120>L-赖氨酸的生产方法

<130>C919-C8129

<150>JP2007-190795

<151>2007-07-23

<160>26

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>825

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(825)

<400>1

atg cag cag tta cag aac att att gaa acc gct ttt gaa cgc cgt gcc 48

Met Gln Gln Leu Gln Asn Ile Ile Glu Thr Ala Phe Glu Arg Arg Ala

1 5 10 15

gag atc acg cca gcc aat gca gac acc gtt acc cgc gaa gcg gta aat 96

Glu Ile Thr Pro Ala Asn Ala Asp Thr Val Thr Arg Glu Ala Val Asn

20 25 30

cag gtg atc gcc ctg ctg gat tcc ggc gca ctg cgt gta gcg gaa aaa 144

Gln Val Ile Ala Leu Leu Asp Ser Gly Ala Leu Arg Val Ala Glu Lys

35 40 45

att gac ggt cag tgg gtg acg cat cag tgg ttg aaa aaa gcg gtg ctg 192

Ile Asp Gly Gln Trp Val Thr His Gln Trp Leu Lys Lys Ala Val Leu

50 55 60

ctc tct ttc cgt att aat gat aat cag gtg atc gaa ggg gca gaa agc 240

Leu Ser Phe Arg Ile Asn Asp Asn Gln Val Ile Glu Gly Ala Glu Ser

65 70 75 80

cgc tac ttc gac aaa gtg ccg atg aaa ttc gcc gac tac gac gaa gca 288

Arg Tyr Phe Asp Lys Val Pro Met Lys Phe Ala Asp Tyr Asp Glu Ala

85 90 95

cgt ttc cag aaa gaa ggc ttc cgc gtt gtg cca cca gcg gcg gta cgt 336

Arg Phe Gln Lys Glu Gly Phe Arg Val Val Pro Pro Ala Ala Val Arg

100 105 110

cag ggt gcg ttt att gcc cgt aac acc gtg ctg atg ccg tct tac gtc 384

Gln Gly Ala Phe Ile Ala Arg Asn Thr Val Leu Met Pro Ser Tyr Val

115 120 125

aac atc ggc gca tat gtt gat gaa ggc acc atg gtt gat acc tgg gcg 432

Asn Ile Gly Ala Tyr Val Asp Glu Gly Thr Met Val Asp Thr Trp Ala

130 135 140

acc gtc ggt tct tgt gcg cag att ggt aaa aac gtc cac ctt tcc ggt 480

Thr Val Gly Ser Cys Ala Gln Ile Gly Lys Asn Val His Leu Ser Gly

145 150 155 160

ggc gtg ggc atc ggc ggc gtg ctg gaa ccg ctg cag gct aac cca acc 528

Gly Val Gly Ile Gly Gly Val Leu Glu Pro Leu Gln Ala Asn Pro Thr

165 170 175

atc att gaa gat aat tgc ttc atc ggc gcg cgc tct gaa gtg gtt gaa 576

Ile Ile Glu Asp Asn Cys Phe Ile Gly Ala Arg Ser Glu Val Val Glu

180 185 190

ggg gtg att gtc gaa gaa ggt tcc gtc att tcc atg ggc gta tac att 624

Gly Val Ile Val Glu Glu Gly Ser Val Ile Ser Met Gly Val Tyr Ile

195 200 205

ggt cag agc acc cgt att tac gac cgt gaa acc ggc gaa atc cac tac 672

Gly Gln Ser Thr Arg Ile Tyr Asp Arg Glu Thr Gly Glu Ile His Tyr

210 215 220

ggt cgc gtt ccg gcg ggg tct gtg gtt gtt tca ggt aat ctg ccg tca 720

Gly Arg Val Pro Ala Gly Ser Val Val Val Ser Gly Asn Leu Pro Ser

225 230 235 240

aaa gat ggc aaa tac agc ctc tac tgt gcg gtt atc gtt aag aaa gtt 768

Lys Asp Gly Lys Tyr Ser Leu Tyr Cys Ala Val Ile Val Lys Lys Val

245 250 255

gac gcg aaa act cgc ggc aaa gtc ggc att aac gaa ctg ctg cgt acc 816

Asp Ala Lys Thr Arg Gly Lys Val Gly Ile Asn Glu Leu Leu Arg Thr

260 265 270

atc gac taa 825

Ile Asp

<210>2

<211>274

<212>PRT

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<400>2

Met Gln Gln Leu Gln Asn Ile Ile Glu Thr Ala Phe Glu Arg Arg Ala

1 5 10 15

Glu Ile Thr Pro Ala Asn Ala Asp Thr Val Thr Arg Glu Ala Val Asn

20 25 30

Gln Val Ile Ala Leu Leu Asp Ser Gly Ala Leu Arg Val Ala Glu Lys

35 40 45

Ile Asp Gly Gln Trp Val Thr His Gln Trp Leu Lys Lys Ala Val Leu

50 55 60

Leu Ser Phe Arg Ile Asn Asp Asn Gln Val Ile Glu Gly Ala Glu Ser

65 70 75 80

Arg Tyr Phe Asp Lys Val Pro Met Lys Phe Ala Asp Tyr Asp Glu Ala

85 90 95

Arg Phe Gln Lys Glu Gly Phe Arg Val Val Pro Pro Ala Ala Val Arg

100 105 110

Gln Gly Ala Phe Ile Ala Arg Asn Thr Val Leu Met Pro Ser Tyr Val

115 120 125

Asn Ile Gly Ala Tyr Val Asp Glu Gly Thr Met Val Asp Thr Trp Ala

130 135 140

Thr Val Gly Ser Cys Ala Gln Ile Gly Lys Asn Val His Leu Ser Gly

145 150 155 160

Gly Val Gly Ile Gly Gly Val Leu Glu Pro Leu Gln Ala Asn Pro Thr

165 170 175

Ile Ile Glu Asp Asn Cys Phe Ile Gly Ala Arg Ser Glu Val Val Glu

180 185 190

Gly Val Ile Val Glu Glu Gly Ser Val Ile Ser Met Gly Val Tyr Ile

195 200 205

Gly Gln Ser Thr Arg Ile Tyr Asp Arg Glu Thr Gly Glu Ile His Tyr

210 215 220

Gly Arg Val Pro Ala Gly Ser Val Val Val Ser Gly Asn Leu Pro Ser

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Lys Asp Gly Lys Tyr Ser Leu Tyr Cys Ala Val Ile Val Lys Lys Val

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Ile Asp

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<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<220>

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245 250 255

Leu Gly Gly Gly Phe Pro Ile Ser Ala Met Leu Thr Thr Ala Glu Ile

260 265 270

Ala Ser Ala Phe His Pro Gly Ser His Gly Ser Thr Tyr Gly Gly Asn

275 280 285

Pro Leu Ala Cys Ala Val Ala Gly Ala Ala Phe Asp Ile Ile Asn Thr

290 295 300

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305 310 315 320

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340 345 350

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370 375 380

Glu Asp Ala Asp Ile Asp Glu Gly Met Gln Arg Phe Ala His Ala Val

385 390 395 400

Ala Lys Val Val Gly Ala

405

<210>5

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<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1128)

<400>5

atg tcg tgc ccg gtt att gag ctg aca caa cag ctt att cgc cgc cct 48

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1 5 10 15

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20 25 30

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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275 280 285

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290 295 300

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305 310 315 320

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325 330 335

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340 345 350

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<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

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Arg Arg Gly Ser Leu Thr Cys Asn Leu Thr Ile His Gly Val Gln Gly

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Phe Phe Pro Ala Thr Ser Met Gln Ile Ala Asn Ile Gln Ala Gly Thr

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Gly Ser Asn Asn Val Ile Pro Gly Glu Leu Phe Val Gln Phe Asn Phe

245 250 255

Arg Phe Ser Thr Glu Leu Thr Asp Glu Met Ile Lys Ala Gln Val Leu

260 265 270

Ala Leu Leu Glu Lys His Gln Leu Arg Tyr Thr Val Asp Trp Trp Leu

275 280 285

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290 295 300

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305 310 315 320

Thr Gly Gly Thr Ser Asp Gly Arg Phe Ile Ala Arg Met Gly Ala Gln

325 330 335

Val Val Glu Leu Gly Pro Val Asn Ala Thr Ile His Lys Ile Asn Glu

340 345 350

Cys Val Asn Ala Ala Asp Leu Gln Leu Leu Ala Arg Met Tyr Gln Arg

355 360 365

Ile Met Glu Gln Leu Val Ala

370 375

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<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<220>

<221>CDS

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65 70 75 80

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85 90 95

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100 105 110

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130 135 140

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165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

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Glu Leu Pro Gly Gly Arg Leu Asp Ile Ala Trp Lys Gly Pro Gly His

245 250 255

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Pro Leu Tyr Met Thr Gly Pro Ala Val His Val Tyr Asp Gly Phe Ile

260 265 270

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His Leu

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<211>274

<212>PRT

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<400>8

Met Gln Phe Ser Lys Met His Gly Leu Gly Asn Asp Phe Met Val Val

1 5 10 15

Asp Ala Val Thr Gln Asn Val Phe Phe Ser Pro Glu Leu Ile Arg Arg

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Leu Ala Asp Arg His Leu Gly Val Gly Phe Asp Gln Leu Leu Val Val

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Ala Arg Phe Val Arg Leu Lys Gly Leu Thr Asn Lys Arg Asp Ile Arg

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Val Ser Thr Ala Asn Gly Arg Met Val Leu Thr Val Thr Asp Asp Asp

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Leu Val Arg Val Asn Met Gly Glu Pro Asn Phe Glu Pro Ser Ala Val

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Val Ile Gln Val Asp Asp Val Asp Thr Ala Ala Val Glu Thr Leu Gly

165 170 175

Pro Val Leu Glu Ser His Glu Arg Phe Pro Glu Arg Ala Asn Ile Gly

180 185 190

Phe Met Gln Val Val Lys Arg Glu His Ile Arg Leu Arg Val Tyr Glu

195 200 205

Arg Gly Ala Gly Glu Thr Gln Ala Cys Gly Ser Gly Ala Cys Ala Ala

210 215 220

Val Ala Val Gly Ile Gln Gln Gly Leu Leu Ala Glu Glu Val Arg Val

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245 250 255

Pro Leu Tyr Met Thr Gly Pro Ala Val His Val Tyr Asp Gly Phe Ile

260 265 270

His Leu

<210>9

<211>963

<212>DNA

<213>谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(963)

<400>9

atg acc aac atc cgc gta gct atc gtg ggc tac gga aac ctg gga cgc 48

Met Thr Asn Ile Arg Val Ala Ile Val Gly Tyr Gly Asn Leu Gly Arg

1 5 10 15

agc gtc gaa aag ctt att gcc aag cag ccc gac atg gac ctt gta gga 96

Ser Val Glu Lys Leu Ile Ala Lys Gln Pro Asp Met Asp Leu Val Gly

20 25 30

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Ile Phe Ser Arg Arg Ala Thr Leu Asp Thr Lys Thr Pro Val Phe Asp

35 40 45

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Val Ala Asp Val Asp Lys His Ala Asp Asp Val Asp Val Leu Phe Leu

50 55 60

tgc atg ggc tcc gcc acc gac atc cct gag cag gca cca aag ttc gcg 240

Cys Met Gly Ser Ala Thr Asp Ile Pro Glu Gln Ala Pro Lys Phe Ala

65 70 75 80

cag ttc gcc tgc acc gta gac acc tac gac aac cac cgc gac atc cca 288

Gln Phe Ala Cys Thr Val Asp Thr Tyr Asp Asn His Arg Asp Ile Pro

85 90 95

cgc cac cgc cag gtc atg aac gaa gcc gcc acc gca gcc ggc aac gtt 336

Arg His Arg Gln Val Met Asn Glu Ala Ala Thr Ala Ala Gly Asn Val

100 105 110

gca ctg gtc tct acc ggc tgg gat cca gga atg ttc tcc atc aac cgc 384

Ala Leu Val Ser Thr Gly Trp Asp Pro Gly Met Phe Ser Ile Asn Arg

115 120 125

gtc tac gca gcg gca gtc tta gcc gag cac cag cag cac acc ttc tgg 432

Val Tyr Ala Ala Ala Val Leu Ala Glu His Gln Gln His Thr Phe Trp

130 135 140

ggc cca ggt ttg tca cag ggc cac tcc gat gct ttg cga cgc atc cct 480

Gly Pro Gly Leu Ser Gln Gly His Ser Asp Ala Leu Arg Arg Ile Pro

145 150 155 160

ggc gtt caa aag gca gtc cag tac acc ctc cca tcc gaa gac gcc ctg 528

Gly Val Gln Lys Ala Val Gln Tyr Thr Leu Pro Ser Glu Asp Ala Leu

165 170 175

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180 185 190

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195 200 205

atc gaa aac gac atc cgc acc atg cct gat tac ttc gtt ggc tac gaa 672

Ile Glu Asn Asp Ile Arg Thr Met Pro Asp Tyr Phe Val Gly Tyr Glu

210 215 220

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225 230 235 240

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Gly Met Pro His Gly Gly His Val Ile Thr Thr Gly Asp Thr Gly Gly

245 250 255

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Phe Asn His Thr Val Glu Tyr Ile Leu Lys Leu Asp Arg Asn Pro Asp

260 265 270

ttc acc gct tcc tca cag atc gct ttc ggt cgc gca gct cac cgc atg 864

Phe Thr Ala Ser Ser Gln Ile Ala Phe Gly Arg Ala Ala His Arg Met

275 280 285

aag cag cag ggc caa agc gga gct ttc acc gtc ctc gaa gtt gct cca 912

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<213>乳发酵短杆菌(Brevibacterium lactofermentum)

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Gly Val Gln Lys Ala Val Gln Tyr Thr Leu Pro Ser Glu Glu Ala Leu

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Glu Lys Ala Arg Arg Gly Glu Ala Gly Asp Leu Thr Gly Lys Gln Thr

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Ile Glu Asn Asp Ile Arg Thr Met Pro Asp Tyr Phe Val Gly Tyr Glu

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275 280 285

Lys Gln Gln Gly Gln Ser Gly Ala Phe Thr Val Leu Glu Val Ala Pro

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85 90 95

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100 105 110

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Lys Glu Ala Gly Gln Ala Gly Ala Phe Thr Val Leu Glu Val Ala Pro

290 295 300

tac ctc ctg tcc ccg aca cca ctc gat gac ctg atc gcc cgc gac gtc 960

Tyr Leu Leu Ser Pro Thr Pro Leu Asp Asp Leu Ile Ala Arg Asp Val

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tag 963

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<211>320

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<213>Corynebacterium efficiens

<400>14

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1 5 10 15

Ser Val Glu Lys Leu Ile Val Gln Gln Pro Asp Met Glu Leu Val Gly

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Ile Phe Ser Arg Arg Asp Thr Leu Asp Thr Asp Thr Pro Val Phe Asn

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65 70 75 80

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Arg His Arg Gln Val Met Asp Glu Ala Ala Arg Ala Ala Gly Asn Val

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Ser Val Val Ala Thr Gly Trp Asp Pro Gly Met Phe Ser Ile Asn Arg

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Glu Lys Ala Arg Arg Gly Glu Ala Glu Gly Leu Thr Gly Lys Gln Thr

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275 280 285

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Pro Ser Ala Glu Ala Met Glu Leu Val Arg Ser Gly Ser Gln Pro Gln

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Leu Ser Thr Arg Glu Lys His Thr Arg Glu Cys His Val Val Leu Glu

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Ala Gly Ala Asp Ala Lys Ala Val Glu His Ala Ile Val Ser Met Pro

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Asp Tyr Phe Ala Asp Tyr Asp Thr Thr Val His Phe Ile Ser Glu Glu

225 230 235 240

Glu Leu Arg Ser Asn His Ser Ala Met Pro His Gly Gly Phe Val Ile

245 250 255

Arg Ser Gly Gln Thr Gly Asp Gly Ser Lys Gln Val Ile Glu Tyr Ser

260 265 270

Leu Lys Leu Gly Ser Asn Pro Glu Phe Thr Ala Ala Val Leu Val Ala

275 280 285

Tyr Ala Arg Ala Ala Phe Arg Leu His Lys Lys Gly Val His Gly Ala

290 295 300

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<213>多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)

<220>

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65 70 75 80

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85 90 95

atc gtt gac ctg cgc cgc acg ctg gat gcc acc gcc aaa gag cac aaa 336

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100 105 110

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115 120 125

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130 135 140

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165 170 175

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180 185 190

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225 230 235 240

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Gln Asn Gln Leu Phe Glu Phe Asn Met Arg Ile Asn Asn Pro Ala Leu

245 250 255

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Thr Ala Gln Val Leu Val Cys Val Ala Arg Ala Ser Met Lys Gln Gln

260 265 270

ccg ggg tgc tac acc atg gta gaa gtc ccc gtc atc gac ctc ctt ccg 864

Pro Gly Cys Tyr Thr Met Val Glu Val Pro Val Ile Asp Leu Leu Pro

275 280 285

ggc gac cgc gaa gag tgg atc gga cac ctg gta taa 900

Gly Asp Arg Glu Glu Trp Ile Gly His Leu Val

290 295

<210>18

<211>299

<212>PRT

<213>多形拟杆菌(Bacteroides thetaiotaomicron)

<400>18

Met Lys Lys Val Arg Ala Ala Ile Val Gly Tyr Gly Asn Ile Gly His

1 5 10 15

Tyr Val Leu Glu Ala Leu Gln Ala Ala Pro Asp Phe Glu Ile Ala Gly

20 25 30

Val Val Arg Arg Ala Gly Ala Glu Asn Lys Pro Glu Glu Leu Ala Asn

35 40 45

Tyr Ala Val Val Lys Asp Ile Lys Glu Leu Glu Gly Val Glu Val Ala

50 55 60

Ile Leu Cys Thr Pro Thr Arg Ser Val Glu Lys Tyr Ala Lys Glu Tyr

65 70 75 80

Leu Ala Met Gly Ile Asn Thr Val Asp Ser Phe Asp Ile His Thr Gly

85 90 95

Ile Val Asp Leu Arg Arg Thr Leu Asp Ala Thr Ala Lys Glu His Lys

100 105 110

Ala Val Ser Ile Ile Ser Ala Gly Trp Asp Pro Gly Ser Asp Ser Ile

115 120 125

Val Arg Thr Met Leu Glu Ala Ile Ala Pro Lys Gly Ile Thr Tyr Thr

130 135 140

Asn Phe Gly Pro Gly Met Ser Met Gly His Thr Val Ala Val Lys Ala

145 150 155 160

Ile Asp Gly Val Lys Ala Ala Leu Ser Met Thr Ile Pro Thr Gly Thr

165 170 175

Gly Ile His Arg Arg Met Val Tyr Ile Glu Leu Lys Asp Gly Tyr Lys

180 185 190

Phe Glu Glu Val Ala Ala Ala Ile Lys Ala Asp Pro Tyr Phe Val Asn

195 200 205

Asp Glu Thr His Val Lys Leu Val Pro Ser Val Asp Ala Leu Leu Asp

210 215 220

Met Gly His Gly Val Asn Leu Thr Arg Lys Gly Val Ser Gly Lys Thr

225 230 235 240

Gln Asn Gln Leu Phe Glu Phe Asn Met Arg Ile Asn Asn Pro Ala Leu

245 250 255

Thr Ala Gln Val Leu Val Cys Val Ala Arg Ala Ser Met Lys Gln Gln

260 265 270

Pro Gly Cys Tyr Thr Met Val Glu Val Pro Val Ile Asp Leu Leu Pro

275 280 285

Gly Asp Arg Glu Glu Trp Ile Gly His Leu Val

290 295

<210>19

<211>69

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>primer

<400>19

atgcagcagt tacagaacat tattgaaacc gcttttgaac gccgtgccga tctagacgct 60

caagttagt 69

<210>20

<211>70

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>primer

<400>20

ttagtcgatg gtacgcagca gttcgttaat gccgactttg ccgcgagttt agatcttgaa 60

gcctgctttt 70

<210>21

<211>1350

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(1350)

<400>21

atg tct gaa att gtt gtc tcc aaa ttt ggc ggt acc agc gta gct gat 48

Met Ser Glu Ile Val Val Ser Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asp

1 5 10 15

ttt gac gcc atg aac cgc agc gct gat att gtg ctt tct gat gcc aac 96

Phe Asp Ala Met Asn Arg Ser Ala Asp Ile Val Leu Ser Asp Ala Asn

20 25 30

gtg cgt tta gtt gtc ctc tcg gct tct gct ggt atc act aat ctg ctg 144

Val Arg Leu Val Val Leu Ser Ala Ser Ala Gly Ile Thr Asn Leu Leu

35 40 45

gtc gct tta gct gaa gga ctg gaa cct ggc gag cga ttc gaa aaa ctc 192

Val Ala Leu Ala Glu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Arg Phe Glu Lys Leu

50 55 60

gac gct atc cgc aac atc cag ttt gcc att ctg gaa cgt ctg cgt tac 240

Asp Ala Ile Arg Asn Ile Gln Phe Ala Ile Leu Glu Arg Leu Arg Tyr

65 70 75 80

ccg aac gtt atc cgt gaa gag att gaa cgt ctg ctg gag aac att act 288

Pro Asn Val Ile Arg Glu Glu Ile Glu Arg Leu Leu Glu Asn Ile Thr

85 90 95

gtt ctg gca gaa gcg gcg gcg ctg gca acg tct ccg gcg ctg aca gat 336

Val Leu Ala Glu Ala Ala Ala Leu Ala Thr Ser Pro Ala Leu Thr Asp

100 105 110

gag ctg gtc agc cac ggc gag ctg atg tcg acc ctg ctg ttt gtt gag 384

Glu Leu Val Ser His Gly Glu Leu Met Ser Thr Leu Leu Phe Val Glu

115 120 125

atc ctg cgc gaa cgc gat gtt cag gca cag tgg ttt gat gta cgt aaa 432

Ile Leu Arg Glu Arg Asp Val Gln Ala Gln Trp Phe Asp Val Arg Lys

130 135 140

gtg atg cgt acc aac gac cga ttt ggt cgt gca gag cca gat ata gcc 480

Val Met Arg Thr Asn Asp Arg Phe Gly Arg Ala Glu Pro Asp Ile Ala

145 150 155 160

gcg ctg gcg gaa ctg gcc gcg ctg cag ctg ctc cca cgt ctc aat gaa 528

Ala Leu Ala Glu Leu Ala Ala Leu Gln Leu Leu Pro Arg Leu Asn Glu

165 170 175

ggc tta gtg atc acc cag gga ttt atc ggt agc gaa aat aaa ggt cgt 576

Gly Leu Val Ile Thr Gln Gly Phe Ile Gly Ser Glu Asn Lys Gly Arg

180 185 190

aca acg acg ctt ggc cgt gga ggc agc gat tat acg gca gcc ttg ctg 624

Thr Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Tyr Thr Ala Ala Leu Leu

195 200 205

gcg gag gct tta cac gca tct cgt gtt gat atc tgg acc gac gtc ccg 672

Ala Glu Ala Leu His Ala Ser Arg Val Asp Ile Trp Thr Asp Val Pro

210 215 220

ggc atc tac acc acc gat cca cgc gta gtt tcc gca gca aaa cgc att 720

Gly Ile Tyr Thr Thr Asp Pro Arg Val Val Ser Ala Ala Lys Arg Ile

225 230 235 240

gat gaa atc gcg ttt gcc gaa gcg gca gag atg gca act ttt ggt gca 768

Asp Glu Ile Ala Phe Ala Glu Ala Ala Glu Met Ala Thr Phe Gly Ala

245 250 255

aaa gta ctg cat ccg gca acg ttg cta ccc gca gta cgc agc gat atc 816

Lys Val Leu His Pro Ala Thr Leu Leu Pro Ala Val Arg Ser Asp Ile

260 265 270

ccg gtc ttt gtc ggc tcc agc aaa gac cca cgc gca ggt ggt acg ctg 864

Pro Val Phe Val Gly Ser Ser Lys Asp Pro Arg Ala Gly Gly Thr Leu

275 280 285

gtg tgc aat aaa act gaa aat ccg ccg ctg ttc cgc gct ctg gcg ctt 912

Val Cys Asn Lys Thr Glu Asn Pro Pro Leu Phe Arg Ala Leu Ala Leu

290 295 300

cgt cgc aat cag act ctg ctc act ttg cac agc ctg aat atg ctg cat 960

Arg Arg Asn Gln Thr Leu Leu Thr Leu His Ser Leu Asn Met Leu His

305 310 315 320

tct cgc ggt ttc ctc gcg gaa gtt ttc ggc atc ctc gcg cgg cat aat 1008

Ser Arg Gly Phe Leu Ala Glu Val Phe Gly Ile Leu Ala Arg His Asn

325 330 335

att tcg gta gac tta atc acc acg tca gaa gtg agc gtg gca tta acc 1056

Ile Ser Val Asp Leu Ile Thr Thr Ser Glu Val Ser Val Ala Leu Thr

340 345 350

ctt gat acc acc ggt tca acc tcc act ggc gat acg ttg ctg acg caa 1104

Leu Asp Thr Thr Gly Ser Thr Ser Thr Gly Asp Thr Leu Leu Thr Gln

355 360 365

tct ctg ctg atg gag ctt tcc gca ctg tgt cgg gtg gag gtg gaa gaa 1152

Ser Leu Leu Met Glu Leu Ser Ala Leu Cys Arg Val Glu Val Glu Glu

370 375 380

ggt ctg gcg ctg gtc gcg ttg att ggc aat gac ctg tca aaa gcc tgc 1200

Gly Leu Ala Leu Val Ala Leu Ile Gly Asn Asp Leu Ser Lys Ala Cys

385 390 395 400

ggc gtt ggc aaa gag gta ttc ggc gta ctg gaa ccg ttc aac att cgc 1248

Gly Val Gly Lys Glu Val Phe Gly Val Leu Glu Pro Phe Asn Ile Arg

405 410 415

atg att tgt tat ggc gca tcc agc cat aac ctg tgc ttc ctg gtg ccc 1296

Met Ile Cys Tyr Gly Ala Ser Ser His Asn Leu Cys Phe Leu Val Pro

420 425 430

ggc gaa gat gcc gag cag gtg gtg caa aaa ctg cat agt aat ttg ttt 1344

Gly Glu Asp Ala Glu Gln Val Val Gln Lys Leu His Ser Asn Leu Phe

435 440 445

gag taa 1350

Glu

<210>22

<211>449

<212>PRT

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<400>22

Met Ser Glu Ile Val Val Ser Lys Phe Gly Gly Thr Ser Val Ala Asp

1 5 10 15

Phe Asp Ala Met Asn Arg Ser Ala Asp Ile Val Leu Ser Asp Ala Asn

20 25 30

Val Arg Leu Val Val Leu Ser Ala Ser Ala Gly Ile Thr Asn Leu Leu

35 40 45

Val Ala Leu Ala Glu Gly Leu Glu Pro Gly Glu Arg Phe Glu Lys Leu

50 55 60

Asp Ala Ile Arg Asn Ile Gln Phe Ala Ile Leu Glu Arg Leu Arg Tyr

65 70 75 80

Pro Asn Val Ile Arg Glu Glu Ile Glu Arg Leu Leu Glu Asn Ile Thr

85 90 95

Val Leu Ala Glu Ala Ala Ala Leu Ala Thr Ser Pro Ala Leu Thr Asp

100 105 110

Glu Leu Val Ser His Gly Glu Leu Met Ser Thr Leu Leu Phe Val Glu

115 120 125

Ile Leu Arg Glu Arg Asp Val Gln Ala Gln Trp Phe Asp Val Arg Lys

130 135 140

Val Met Arg Thr Asn Asp Arg Phe Gly Arg Ala Glu Pro Asp Ile Ala

145 150 155 160

Ala Leu Ala Glu Leu Ala Ala Leu Gln Leu Leu Pro Arg Leu Asn Glu

165 170 175

Gly Leu Val Ile Thr Gln Gly Phe Ile Gly Ser Glu Asn Lys Gly Arg

180 185 190

Thr Thr Thr Leu Gly Arg Gly Gly Ser Asp Tyr Thr Ala Ala Leu Leu

195 200 205

Ala Glu Ala Leu His Ala Ser Arg Val Asp Ile Trp Thr Asp Val Pro

210 215 220

Gly Ile Tyr Thr Thr Asp Pro Arg Val Val Ser Ala Ala Lys Arg Ile

225 230 235 240

Asp Glu Ile Ala Phe Ala Glu Ala Ala Glu Met Ala Thr Phe Gly Ala

245 250 255

Lys Val Leu His Pro Ala Thr Leu Leu Pro Ala Val Arg Ser Asp Ile

260 265 270

Pro Val Phe Val Gly Ser Ser Lys Asp Pro Arg Ala Gly Gly Thr Leu

275 280 285

Val Cys Asn Lys Thr Glu Asn Pro Pro Leu Phe Arg Ala Leu Ala Leu

290 295 300

Arg Arg Asn Gln Thr Leu Leu Thr Leu His Ser Leu Asn Met Leu His

305 310 315 320

Ser Arg Gly Phe Leu Ala Glu Val Phe Gly Ile Leu Ala Arg His Asn

325 330 335

Ile Ser Val Asp Leu Ile Thr Thr Ser Glu Val Ser Val Ala Leu Thr

340 345 350

Leu Asp Thr Thr Gly Ser Thr Ser Thr Gly Asp Thr Leu Leu Thr Gln

355 360 365

Ser Leu Leu Met Glu Leu Ser Ala Leu Cys Arg Val Glu Val Glu Glu

370 375 380

Gly Leu Ala Leu Val Ala Leu Ile Gly Asn Asp Leu Ser Lys Ala Cys

385 390 395 400

Gly Val Gly Lys Glu Val Phe Gly Val Leu Glu Pro Phe Asn Ile Arg

405 410 415

Met Ile Cys Tyr Gly Ala Ser Ser His Asn Leu Cys Phe Leu Val Pro

420 425 430

Gly Glu Asp Ala Glu Gln Val Val Gln Lys Leu His Ser Asn Leu Phe

435 440 445

Glu

<210>23

<211>879

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(879)

<400>23

atg ttc acg gga agt att gtc gcg att gtt act ccg atg gat gaa aaa 48

Met Phe Thr Gly Ser Ile Val Ala Ile Val Thr Pro Met Asp Glu Lys

1 5 10 15

ggt aat gtc tgt cgg gct agc ttg aaa aaa ctg att gat tat cat gtc 96

Gly Asn Val Cys Arg Ala Ser Leu Lys Lys Leu Ile Asp Tyr His Val

20 25 30

gcc agc ggt act tcg gcg atc gtt tct gtt ggc acc act ggc gag tcc 144

Ala Ser Gly Thr Ser Ala Ile Val Ser Val Gly Thr Thr Gly Glu Ser

35 40 45

gct acc tta aat cat gac gaa cat gct gat gtg gtg atg atg acg ctg 192

Ala Thr Leu Asn His Asp Glu His Ala Asp Val Val Met Met Thr Leu

50 55 60

gat ctg gct gat ggg cgc att ccg gta att gcc ggg acc ggc gct aac 240

Asp Leu Ala Asp Gly Arg Ile Pro Val Ile Ala Gly Thr Gly Ala Asn

65 70 75 80

gct act gcg gaa gcc att agc ctg acg cag cgc ttc aat gac agt ggt 288

Ala Thr Ala Glu Ala Ile Ser Leu Thr Gln Arg Phe Asn Asp Ser Gly

85 90 95

atc gtc ggc tgc ctg acg gta acc cct tac tac aat cgt ccg tcg caa 336

Ile Val Gly Cys Leu Thr Val Thr Pro Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gln

100 105 110

gaa ggt ttg tat cag cat ttc aaa gcc atc gct gag cat act gac ctg 384

Glu Gly Leu Tyr Gln His Phe Lys Ala Ile Ala Glu His Thr Asp Leu

115 120 125

ccg caa att ctg tat aat gtg ccg tcc cgt act ggc tgc gat ctg ctc 432

Pro Gln Ile Leu Tyr Asn Val Pro Ser Arg Thr Gly Cys Asp Leu Leu

130 135 140

ccg gaa acg gtg ggc cgt ctg gcg aaa gta aaa aat att atc gga atc 480

Pro Glu Thr Val Gly Arg Leu Ala Lys Val Lys Asn Ile Ile Gly Ile

145 150 155 160

aaa gag gca aca ggg aac tta acg cgt gta aac cag atc aaa gag ctg 528

Lys Glu Ala Thr Gly Asn Leu Thr Arg Val Asn Gln Ile Lys Glu Leu

165 170 175

gtt tca gat gat ttt gtt ctg ctg agc ggc gat gat gcg agc gcg ctg 576

Val Ser Asp Asp Phe Val Leu Leu Ser Gly Asp Asp Ala Ser Ala Leu

180 185 190

gac ttc atg caa ttg ggc ggt cat ggg gtt att tcc gtt acg gct aac 624

Asp Phe Met Gln Leu Gly Gly His Gly Val Ile Ser Val Thr Ala Asn

195 200 205

gtc gca gcg cgt gat atg gcc cag atg tgc aaa ctg gca gca gaa ggg 672

Val Ala Ala Arg Asp Met Ala Gln Met Cys Lys Leu Ala Ala Glu Gly

210 215 220

cat ttt gcc gag gca cgc gtt att aat cag cgt ctg atg cca tta cac 720

His Phe Ala Glu Ala Arg Val Ile Asn Gln Arg Leu Met Pro Leu His

225 230 235 240

aac aaa cta ttt gtc gaa ccc aat cca atc ccg gtg aaa tgg gca tgt 768

Asn Lys Leu Phe Val Glu Pro Asn Pro Ile Pro Val Lys Trp Ala Cys

245 250 255

aag gaa ctg ggt ctt gtg gcg acc gat acg ctg cgc ctg cca atg aca 816

Lys Glu Leu Gly Leu Val Ala Thr Asp Thr Leu Arg Leu Pro Met Thr

260 265 270

cca atc acc gac agt ggt cgt gag acg gtc aga gcg gcg ctt aag cat 864

Pro Ile Thr Asp Ser Gly Arg Glu Thr Val Arg Ala Ala Leu Lys His

275 280 285

gcc ggt ttg ctg taa 879

Ala Gly Leu Leu

290

<210>24

<211>292

<212>PRT

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<400>24

Met Phe Thr Gly Ser Ile Val Ala Ile Val Thr Pro Met Asp Glu Lys

1 5 10 15

Gly Asn Val Cys Arg Ala Ser Leu Lys Lys Leu Ile Asp Tyr His Val

20 25 30

Ala Ser Gly Thr Ser Ala Ile Val Ser Val Gly Thr Thr Gly Glu Ser

35 40 45

Ala Thr Leu Asn His Asp Glu His Ala Asp Val Val Met Met Thr Leu

50 55 60

Asp Leu Ala Asp Gly Arg Ile Pro Val Ile Ala Gly Thr Gly Ala Asn

65 70 75 80

Ala Thr Ala Glu Ala Ile Ser Leu Thr Gln Arg Phe Asn Asp Ser Gly

85 90 95

Ile Val Gly Cys Leu Thr Val Thr Pro Tyr Tyr Asn Arg Pro Ser Gln

100 105 110

Glu Gly Leu Tyr Gln His Phe Lys Ala Ile Ala Glu His Thr Asp Leu

115 120 125

Pro Gln Ile Leu Tyr Asn Val Pro Ser Arg Thr Gly Cys Asp Leu Leu

130 135 140

Pro Glu Thr Val Gly Arg Leu Ala Lys Val Lys Asn Ile Ile Gly Ile

145 150 155 160

Lys Glu Ala Thr Gly Asn Leu Thr Arg Val Asn Gln Ile Lys Glu Leu

165 170 175

Val Ser Asp Asp Phe Val Leu Leu Ser Gly Asp Asp Ala Ser Ala Leu

180 185 190

Asp Phe Met Gln Leu Gly Gly His Gly Val Ile Ser Val Thr Ala Asn

195 200 205

Val Ala Ala Arg Asp Met Ala Gln Met Cys Lys Leu Ala Ala Glu Gly

210 215 220

His Phe Ala Glu Ala Arg Val Ile Asn Gln Arg Leu Met Pro Leu His

225 230 235 240

Asn Lys Leu Phe Val Glu Pro Asn Pro Ile Pro Val Lys Trp Ala Cys

245 250 255

Lys Glu Leu Gly Leu Val Ala Thr Asp Thr Leu Arg Leu Pro Met Thr

260 265 270

Pro Ile Thr Asp Ser Gly Arg Glu Thr Val Arg Ala Ala Leu Lys His

275 280 285

Ala Gly Leu Leu

290

<210>25

<211>822

<212>DNA

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(822)

<400>25

atg cat gat gca aac atc cgc gtt gcc atc gcg gga gcc ggg ggg cgt 48

Met His Asp Ala Asn Ile Arg Val Ala Ile Ala Gly Ala Gly Gly Arg

1 5 10 15

atg ggc cgc cag ttg att cag gcg gcg ctg gca tta gag ggc gtg cag 96

Met Gly Arg Gln Leu Ile Gln Ala Ala Leu Ala Leu Glu Gly Val Gln

20 25 30

ttg ggc gct gcg ctg gag cgt gaa gga tct tct tta ctg ggc agc gac 144

Leu Gly Ala Ala Leu Glu Arg Glu Gly Ser Ser Leu Leu Gly Ser Asp

35 40 45

gcc ggt gag ctg gcc gga gcc ggg aaa aca ggc gtt acc gtg caa agc 192

Ala Gly Glu Leu Ala Gly Ala Gly Lys Thr Gly Val Thr Val Gln Ser

50 55 60

agc ctc gat gcg gta aaa gat gat ttt gat gtg ttt atc gat ttt acc 240

Ser Leu Asp Ala Val Lys Asp Asp Phe Asp Val Phe Ile Asp Phe Thr

65 70 75 80

cgt ccg gaa ggt acg ctg aac cat ctc gct ttt tgt cgc cag cat ggc 288

Arg Pro Glu Gly Thr Leu Asn His Leu Ala Phe Cys Arg Gln His Gly

85 90 95

aaa ggg atg gtg atc ggc act acg ggg ttt gac gaa gcc ggt aaa caa 336

Lys Gly Met Val Ile Gly Thr Thr Gly Phe Asp Glu Ala Gly Lys Gln

100 105 110

gca att cgt gac gcc gct gcc gat att gcg att gtc ttt gct gcc aat 384

Ala Ile Arg Asp Ala Ala Ala Asp Ile Ala Ile Val Phe Ala Ala Asn

115 120 125

ttt agc gtt ggc gtt aac gtc atg ctt aag ctg ctg gag aaa gca gcc 432

Phe Ser Val Gly Val Asn Val Met Leu Lys Leu Leu Glu Lys Ala Ala

130 135 140

aaa gtg atg ggt gac tac acc gat atc gaa att att gaa gca cat cat 480

Lys Val Met Gly Asp Tyr Thr Asp Ile Glu Ile Ile Glu Ala His His

145 150 155 160

aga cat aaa gtt gat gcg ccg tca ggc acc gca ctg gca atg gga gag 528

Arg His Lys Val Asp Ala Pro Ser Gly Thr Ala Leu Ala Met Gly Glu

165 170 175

gcg atc gcc cac gcc ctt gat aaa gat ctg aaa gat tgc gcg gtc tac 576

Ala Ile Ala His Ala Leu Asp Lys Asp Leu Lys Asp Cys Ala Val Tyr

180 185 190

agt cgt gaa ggc cac acc ggt gaa cgt gtg cct ggc acc att ggt ttt 624

Ser Arg Glu Gly His Thr Gly Glu Arg Val Pro Gly Thr Ile Gly Phe

195 200 205

gcc acc gtg cgt gca ggt gac atc gtt ggt gaa cat acc gcg atg ttt 672

Ala Thr Val Arg Ala Gly Asp Ile Val Gly Glu His Thr Ala Met Phe

210 215 220

gcc gat att ggc gag cgt ctg gag atc acc cat aag gcg tcc agc cgt 720

Ala Asp Ile Gly Glu Arg Leu Glu Ile Thr His Lys Ala Ser Ser Arg

225 230 235 240

atg aca ttt gct aac ggc gcg gta aga tcg gct ttg tgg ttg agt ggt 768

Met Thr Phe Ala Asn Gly Ala Val Arg Ser Ala Leu Trp Leu Ser Gly

245 250 255

aag gaa agc ggt ctt ttt gat atg cga gat gta ctt gat ctc aat aat 816

Lys Glu Ser Gly Leu Phe Asp Met Arg Asp Val Leu Asp Leu Asn Asn

260 265 270

ttg taa 822

Leu

<210>26

<211>273

<212>PRT

<213>大肠杆菌(Escherichia coli)

<400>26

Met His Asp Ala Asn Ile Arg Val Ala Ile Ala Gly Ala Gly Gly Arg

1 5 10 15

Met Gly Arg Gln Leu Ile Gln Ala Ala Leu Ala Leu Glu Gly Val Gln

20 25 30

Leu Gly Ala Ala Leu Glu Arg Glu Gly Ser Ser Leu Leu Gly Ser Asp

35 40 45

Ala Gly Glu Leu Ala Gly Ala Gly Lys Thr Gly Val Thr Val Gln Ser

50 55 60

Ser Leu Asp Ala Val Lys Asp Asp Phe Asp Val Phe Ile Asp Phe Thr

65 70 75 80

Arg Pro Glu Gly Thr Leu Asn His Leu Ala Phe Cys Arg Gln His Gly

85 90 95

Lys Gly Met Val Ile Gly Thr Thr Gly Phe Asp Glu Ala Gly Lys Gln

100 105 110

Ala Ile Arg Asp Ala Ala Ala Asp Ile Ala Ile Val Phe Ala Ala Asn

115 120 125

Phe Ser Val Gly Val Asn Val Met Leu Lys Leu Leu Glu Lys Ala Ala

130 135 140

Lys Val Met Gly Asp Tyr Thr Asp Ile Glu Ile Ile Glu Ala His His

145 150 155 160

Arg His Lys Val Asp Ala Pro Ser Gly Thr Ala Leu Ala Met Gly Glu

165 170 175

Ala Ile Ala His Ala Leu Asp Lys Asp Leu Lys Asp Cys Ala Val Tyr

180 185 190

Ser Arg Glu Gly His Thr Gly Glu Arg Val Pro Gly Thr Ile Gly Phe

195 200 205

Ala Thr Val Arg Ala Gly Asp Ile Val Gly Glu His Thr Ala Met Phe

210 215 220

Ala Asp Ile Gly Glu Arg Leu Glu Ile Thr His Lys Ala Ser Ser Arg

225 230 235 240

Met Thr Phe Ala Asn Gly Ala Val Arg Ser Ala Leu Trp Leu Ser Gly

245 250 255

Lys Glu Ser Gly Leu Phe Asp Met Arg Asp Val Leu Asp Leu Asn Asn

260 265 270

Leu

Claims

1.一种具有L-赖氨酸生产能力的大肠杆菌，其特征在于该大肠杆菌经过修饰而降低了内消旋α，ε-二氨基庚二酸合成途径的1种或2种以上的酶的活性，并且导入了编码二氨基庚二酸脱氢酶的基因。

2.根据权利要求1所述的大肠杆菌，其中，所述内消旋α，ε-二氨基庚二酸合成途径的酶选自2，3，4，5-四氢吡啶-2，6-二羧酸N-琥珀酰转移酶、琥珀酰二氨基庚二酸转氨酶、琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰基酶以及二氨基庚二酸差向异构酶。

3.根据权利要求2所述的大肠杆菌，其中，所述2，3，4，5-四氢吡啶-2，6-二羧酸N-琥珀酰转移酶、琥珀酰二氨基庚二酸转氨酶、琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰基酶以及二氨基庚二酸差向异构酶分别由dapD基因、dapC基因、dapE基因以及dapF基因编码。

4.根据权利要求3所述的大肠杆菌，其中，所述内消旋α，ε-二氨基庚二酸合成途径的酶的活性是通过降低所述基因的表达量或破坏所述基因而降低的。

5.根据权利要求2～4中任一项所述的大肠杆菌，其经过修饰而至少降低了2，3，4，5-四氢吡啶-2，6-二羧酸N-琥珀酰转移酶活性。

6.根据权利要求1～5中任一项所述的大肠杆菌，其中，所述编码二氨基庚二酸脱氢酶的基因是棒状杆菌型细菌的ddh基因。

7.根据权利要求2～6中任一项所述的大肠杆菌，其中，所述2，3，4，5-四氢吡啶-2，6-二羧酸N-琥珀酰转移酶是下述(A)或(B)所述的蛋白质：

(A)具有SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列的蛋白质；

8.根据权利要求2～7中任一项所述的大肠杆菌，其中，所述琥珀酰二氨基庚二酸转氨酶是下述(C)或(D)所述的蛋白质：

(C)具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列的蛋白质；

9.根据权利要求2～8中任一项所述的大肠杆菌，其中，所述琥珀酰二氨基庚二酸脱琥珀酰基酶是下述(E)或(F)所述的蛋白质：

(E)具有SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的蛋白质；

10.根据权利要求2～9中任一项所述的大肠杆菌，其中，所述二氨基庚二酸差向异构酶是下述(G)或(H)所述的蛋白质：

(G)具有SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列的蛋白质；

11.根据权利要求3～10中任一项所述的大肠杆菌，其中，所述dapD基因是下述(a)或(b)所述的DNA：

(a)包含SEQ ID NO：1的碱基序列的DNA；或

(b)与SEQ ID NO：1的碱基序列或能够由该碱基序列制备的探针在严格条件下杂交，并且编码具有2，3，4，5-四氢吡啶-2，6-二羧酸N-琥珀酰转移酶活性的蛋白质的DNA。

12.根据权利要求3～11中任一项所述的大肠杆菌，其中，所述dapC基因是下述(c)或(d)所述的DNA：

(c)包含SEQ ID NO：3的碱基序列的DNA；或

(d)与SEQ ID NO：3的碱基序列或能够由该碱基序列制备的探针在严格条件下杂交，并且编码具有琥珀酰二氨基庚二酸转氨酶活性的蛋白质的DNA。

13.根据权利要求3～12中任一项所述的大肠杆菌，其中，所述dapE基因是下述(e)或(f)所述的DNA：

(e)包含SEQ ID NO：5的碱基序列的DNA；或

14.根据权利要求3～13中任一项所述的大肠杆菌，其中，所述dapF基因是下述(g)或(h)所述的DNA：

(g)包含SEQ ID NO：7的碱基序列的DNA；或

15.根据权利要求1～14中任一项所述的大肠杆菌，其中，所述二氨基庚二酸脱氢酶是下述(I)或(J)所述的蛋白质：

16.根据权利要求6～13中任一项所述的大肠杆菌，其中，所述ddh基因是下述(i)或(j)所述的DNA：

(i)包含SEQ ID NO：9、11、13、15或17的碱基序列的DNA；或

17.根据权利要求1～16中任一项所述的大肠杆菌，该大肠杆菌还具有解除了由L-赖氨酸导致的反馈抑制的二氢吡啶二羧酸合酶以及解除了由L-赖氨酸导致的反馈抑制的天冬氨酸激酶，并且该大肠杆菌的二氢吡啶二羧酸还原酶活性得到了增强。

18.一种生产L-赖氨酸的方法，其特征在于，在培养基中培养权利要求1～17中任一项所述的大肠杆菌，并且从该培养基中收集L-赖氨酸。