CN101448403A - 含原花色素茶饮料 - Google Patents

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Abstract

本发明提供可持续摄取，并且通过促进从血管内皮细胞分泌NO，增强NO的作用等，从而具有改善血管内皮功能效果的饮料。提供含有原花青素B1(procyanidin B1；PB1)和原花青素B3(procyanidin B3；PB3)，其合计量为一定浓度以上，易于饮用而无口味偏好的含原花色素茶饮料，其可连续摄取，具有改善血管内皮功能的效果。

Description

含原花色素茶饮料
技术领域
本发明涉及提供含有临床上有效量的原花色素的食品、特别是提供有效并可持续摄取的具有血管内皮功能改善作用的茶饮料。
背景技术
近年来，伴随着饮食生活、生活方式的改变，生活习惯病正在增加。所谓的生活习惯病就是高血压症、高血脂症、糖尿病等疾病，再加上心绞痛、心肌梗塞、脑循环障碍、恶性肿瘤等通常认为通过改善生活习惯即可防止发病的疾病的总称。高血压症、高血脂症、糖尿病等大多反复发病，合并发作时使其病态相互增重，从而高频率地引发动脉硬化等继发症导致预后恶化。
最近，逐步搞清楚了这种恶性循环的原因之一与血管的内皮功能低下相关(参照非专利文献1)。作为血管内皮功能低下的危险因素，可例举高血压、耐糖功能异常、高血脂症、闭经后女性、抽烟等，但认为在导致血管病变的最终状态的动脉硬化之前，发现、预防作为其开端的血管内皮功能低下，对预防生活习惯病非常重要。特别是对于慢性无症状性病态的血管病变，认为利用可长期安全地摄取的食品进行预防更加重要，所以期待开发出具有这种效果的食品。
另一方面，现已证明多酚的摄取量越多，循环器官疾病的发病就越少，最近的研究中已报道可可、巧克力、葡萄、葡萄酒等含有丰富的作为主要的多酚的原花青素的食品、其材料，对人体具有血管内皮功能的改善效果(参照非专利文献2～4)。此外，通过口服给药含有含该原花青素的松树皮提取物的胶囊剂，确认也具有血管内皮功能的改善效果(参照非专利文献5，6)。
非专利文献1 Verma S，Anderson TJ，Circulation 2002；105：546-549
非专利文献2 Stein JH，Circulation 1999；100：1050-5
非专利文献3 Chou EJ，Am J Cardiol 2001；88：553-5
非专利文献4 Agewall S，Eur Heart J 2000；21：74-8
非专利文献5 Shand B，Phytother Res 2003；17：490-4
非专利文献6 Young JM，Free Radic Res 2006；40：85-94
发明内容
上述非专利文献5(Shand B，Phytother Res 2003；17：490-4)中记载：作为松树皮提取物使用Enzogenol，通过将其连续摄取12周，会使上臂最大血流增加，即具有血管内皮功能改善作用。此外，上述非专利文献6(Young JM，FreeRadic Res 2006；40：85-94)中记载：作为松树皮提取物使用Enzogenol，通过将其连续摄取12周，会使血管内径增大。上述文献中均使用了固体口服摄取用组合物(胶囊剂)，并且必须摄取480mg/day这样比较大量的松树皮提取物，不便于每天摄取。通常来说，因为摄取固体的口服摄取用组合物时比较费事，容易产生摄取这种义务化的感觉，并且由于片剂、胶囊剂、颗粒剂等固体口服摄取用组合物的形态接近于医药品的形态，所以容易产生如摄取医药品的感觉。鉴于上述理由，有人指出作为可持续摄取的形态，优选在进餐中或在休息中可轻松摄取的饮料的形态。因此，也可以说上述固状松树皮提取物的大量摄取不适合持续摄取。
此外，上述文献中所述的效果并未在血液生化检验中反映出来，明确的有效性还未得到确认。
本发明的课题是，提供可持续摄取，并且通过促进从血管内皮细胞中分泌NO，增强NO的作用等，从而具有改善血管内皮功能的明确效果的饮料。
本发明者确立了低聚原花色素的分析方法，可定量测定松树皮提取物中的原花色素(日本特开2006-38763号)。而且通过本分析方法判明，所谓具有热稳定性的原花色素，通过杀菌处理一部分被分解及/或被异构化而降低。根据该结论，认为仅仅配合松树皮提取物，不可能获得临床上有效的血流改善组合物，基于这种想法，本发明者为了解决上述课题进行精心研究，结果发现原花青素B1(procyanidin B1(PB1))及原花青素B3(procyanidin B3(PB3))的合计量可作为原花色素含量的指标。而且证明该PB1及PB3的合计量为6.4mg/L以上，优选为8.1mg/L以上的含原花色素茶饮料，通过平均每日摄取350mL，连续摄取1～12周，血管内皮功能得到了显著改善。此外，从感官评价来看，优选PB1及PB3的合计量为30mg/L以下，更优选为20mg/L以下的含原花色素茶饮料，并且发现用热水提取的松树皮提取物与用乙醇提取的松树皮提取物相比，阿魏酸等苯丙烷类及二氢槲皮素等二氢黄酮醇含量少，在香味方面极为优选，于是完成了本发明。
即本发明为：
1.含原花色素茶饮料，其含有式(I)表示的原花青素B1(procyanidinB1；PB1)和式(II)表示的原花青素B3(procyanidin B3；PB3)，其合计量为6.4mg/L以上。
2.如上述1所述的茶饮料，其中，所述PB1和PB3是以含有于松树皮提取物中的形式进行添加。
3.如上述2所述的茶饮料，其中，所述松树皮提取物是松树皮的热水提取物。
4.如上述1～3中任一项所述的茶饮料，其为经过在茶提取液中配合原花色素配制调和液的配制工序、将所述调和液进行杀菌处理的杀菌工序、将杀菌后的调和液填充到容器内的填充工序而获得的容器装茶饮料。
5.如上述1～4中任一项所述的茶饮料，其具有血管内皮功能的改善作用。
本发明将原花青素B1(procyanidin B1；PB1)和原花青素B3(procyanidinB3；PB3)的合计量作为有效成分的指标，提供含有上述PB1及PB3的合计量为6.4mg/L以上，优选为8.1mg/L以上的茶饮料。平均每天仅摄取350mL该饮料，即可通过增强NO的产生等改善血管内皮功能，预防动脉硬化等循环器官疾病。
附图说明
图1表示给入本发明的被检饮料所引起的大鼠的反应性充血后的动脉流入量/安静时动脉流入量(TBF level；tail blood flow level)的经时变化。此外，图表中PBE是松树皮提取物组，PF是高原花青素含量组分组。
图2表示给入本发明的被检饮料所引起的大鼠的反应性充血后从0秒到120秒的动脉流入量/安静时动脉流入量比曲线下面积(AUC；area under thecurve)。
图3表示摄取本发明的试验饮料所引起的人体的动脉血流增加比(％FBF)、即反应充血时动脉血流量除以安静时基础血流量的值(B/A)的经时变化。
图4表示摄取本发明的试验饮料所引起的人体的动脉血流增加比(％FBF)、即反应充血时动脉血流量除以安静时基础血流量的值(B/A)的经时变化。
图5表示在即将摄取本发明的试验饮料之前及摄取12周后，相对于人体安静时的驱血释放后前臂动脉血流量(FBF)之比(％FBF)的测定结果。
图6表示在即将摄取本发明的试验饮料之前及摄取12周后，相对于人体安静时的驱血释放后前臂动脉血流量(FBF)之比(％FBF)的测定结果。
具体实施方式
(原花色素)
本发明的茶饮料，含有原花色素、特别是来自松树皮的原花色素作为有效成分。来自松树皮的原花色素可通过将松树皮用50～120℃、优选用70～100℃的热水或食品制造时允许的溶剂(乙醇等)或其水溶液提取而获得(以下前者用“水提取物”、后者的通过乙醇或乙醇水溶液的提取物用“乙醇提取物”表示)。作为原料的松树皮，作为松树皮提取物的原料的松树皮，优选使用法国海岸松(Pinus Martima)、日本落叶松、黑松、赤松、日本五针松(Pinuspentaphylla)、日本五针松(Pinus parviflora)、红松、偃松、琉球松、平头赤松、长叶松、白皮松、加拿大魁北克(Quebec)地方的Anedda等的树皮等，其中优选法国海岸松的树皮。在此，法国海岸松是指在法国南部大西洋沿岸的部分地区生长的海洋性松树。
这种法国海岸松的树皮，含有儿茶素、原花色素以及有机酸等成分。根据提取溶剂不同获得的提取物的组成，例如，松树皮中含有的阿魏酸等苯丙烷类(PP)，在水提取物中几乎不含有，而在乙醇提取物中约含有10％左右。此外，二氢槲皮素等二氢黄酮醇(DHF)，在水提取物中也几乎不含有，而在乙醇提取物中含有数个百分点左右。已知阿魏酸、二氢槲皮素是优异的抗氧化剂，对于阿魏酸，已报道了其脑血管保护作用(第14次日本循环药理学会要旨集programeA5，2004)、血管内皮功能改善作用(参照日本特开2003-261444号)。因此，如果使用乙醇提取物，虽可期待原花色素和阿魏酸以及/或二氢槲皮素的相加或协同的血管内皮功能的改善效果，但上述PP、DHF有时对香味方面产生影响，特别是如本发明的饮料，因为香味是持续摄取的重要的因素，其影响不可无视。在感官检查中，判断与乙醇提取物相比较，添加水提取物的茶饮料风味良好，所以在本发明的茶饮料中，优选使用水提取物。具体来说，以阿魏酸和二氢槲皮素作为指标，优选使用其合计量为10μg/mg以下，更优选5μg/mg以下的提取物。
松树皮提取物中的阿魏酸及二氢槲皮素的含量，例如可按如下所述使用HPLC等进行分析。将松树皮提取物以1mg/mL的浓度溶解在pH4～5的缓冲液中，加入β-葡萄糖苷酶(纤维素酶RS，苦杏仁酶等)在40℃下保温1～6小时，形成苷元。在含有该苷元的反应溶液中加入等量的乙腈(含有0.1～1％的三氟乙酸)中止酶反应，同时使苷元溶解。该溶液通过用反相HPLC分析可进行定量。
(HPLC条件)
·色谱柱：Shim-pack FC-ODS，4.6mm x 150mm
·流动相：A：0.1％三氟乙酸/H2O、B：0.1％三氟乙酸/90％CH3CN、0.6ml/min
·梯度：B20％→B70％(10min)、B70％iso(5min)
·检测：Photodiodearrey检测器(岛津制作所SPD-M10A)、A330nm
·进样量：10μL
HPLC除此之外，如果是反相体系，可使用ODS、C30等载体。
从松树皮中提取的方法无特别限制，例如可单独使用或组合使用下述多种公知的方法，如加温提取法、超临界流体提取法、液体二氧化碳间歇法、液体二氧化碳回流法、超临界二氧化碳回流法等。
在本发明中，在松树皮中加入提取溶剂(热水、乙醇、含水乙醇等)提取后，可将过滤获得的滤液、或其精制品作为提取液使用，也可使用将该提取液通过冷冻干燥等获得的粉末状物。此外，也可使用作为松树皮提取物市售的Flavangenol(松树萃取物)(株式会社东洋新药)、(碧萝芷(Pycnogenol)(Siberhegner株式会社)等，其中，鉴于上述理由，可优选使用水提取的Flavangenol(松树萃取物)。
本发明中的原花色素，是指由以黄烷-3-醇及/或黄烷-3，4-二醇为结构单元的聚合度为2以上的缩聚物组成的化合物组。作为松树皮中的原花色素，已知有PB1、PB3、PB6等二聚体以及原花青素C2(C-C-C)的三聚体等。已知从葡萄种子中提取的原花色素对热稳定(日本专利第2694748号)，但本发明的茶饮料，特别是被加热杀菌装在容器内销售的茶饮料，因为是在超过120℃的温度下进行杀菌处理，所以有效成分的原花色素的一部分被分解或被异构化，因此，加热(杀菌处理)前的松树皮提取物中的原花色素与加热(杀菌处理后)的松树皮中的原花色素，其含量及组成有时不同。本发明的茶饮料的特征在于，含有临床上有效量的原花色素。如上所述，原花色素经过饮料制造工序的杀菌处理等有时会被分解，但其含量可以式(I)表示的原花青素B1(procyanidin B1；PB1)和式(II)表示的原花青素B3(procyanidin B3；PB3)的合计量作为指标。
Figure A200780018106D00101
Figure A200780018106D00111
本发明的具有血管内皮功能改善作用的茶饮料，优选以上述PB1及PB3的合计量为指标，来选择及调整原花色素或含有其的植物提取物的种类·添加量。
本发明以PB1及PB3作为指标，提供含有成人(体重60kg)平均每天为2.2mg以上、优选为2.8mg以上的茶饮料。例如制成的350mL的容器内PB1及PB3的合计含量为2.2mg(优选2.8mg)的配合松树皮提取物的茶饮料，虽然每天饮用1瓶(350mL)这样少的量，但也可获得血管内皮功能的改善作用。
这样，本发明通过将原花色素作为茶饮料摄取，虽然量少但可产生显著的效果。实际上在本发明的茶饮料中配合的原花色素没有上限，但因原花色素的配合量和其效果的大小无显著相关性，(参照图4、图6)，所以考虑到经济性，配合临床上有效的量即可。此外，使用松树皮作原花色素时，大量配合时感觉香味发涩、有口味偏好，且变得难于饮用，所以不优选大量配合，具体来说，以PB1及PB3的合计含量为指标，可配合30mg/L以下，优选配合20mg/L以下。
本发明的茶饮料中的PB1及PB3含量，例如可按以下方法进行测定。首先通过色谱柱等对茶饮料进行预处理。作为色谱柱可例举ShephadexLH-20等。填充ShephadexLH-20，将茶饮料加入到用水润湿膨胀后的色谱柱中，用水洗涤后，用35％乙醇及70％乙醇洗脱。将70％乙醇洗脱组分在减压浓缩下进行浓缩后，装到容量瓶内，将各洗脱组分供给HPLC。
(HPLC条件)
·色谱柱：Cosmosil 5C18-MS-II、5μm、4.6mmφ x 150mm
·流动相：A-0.05％三氟乙酸/H2O、B-90％CH3CN/0.05％三氟乙酸/H2O、1ml/min
·梯度程序：9％B 等强度(15min)  9％B→100％ B(1min)100％ B 等强度(10min)  100％ B→9％B(1min)平衡10分钟后，开始以下分析。
·检测：A225nm
·进样量：10μL
(茶饮料的制造方法)
本发明的茶饮料，通过在茶的提取液中添加含有PB1及PB3的原花色素，优选添加含有原花色素的植物提取物而配制。茶的提取液通过用温水提取原料茶叶，从该茶提取液中除去提取残渣而获得。作为在本发明中使用的原料茶叶，可使用煎茶、玉露、碾茶等绿茶类，统称为乌龙茶的铁观音、色种、黄金桂等的半发酵茶，称为红茶的大吉岭红茶(Darjeeling Tea)、阿萨姆(ASSAM)、锡兰红茶等发酵茶，以及其他包种茶、松叶茶、麦茶、其他混合茶等，没有特别限定，其中从风味良好方面来看，优选使用绿茶类、包种茶。此外，茶叶的品种、产地、采摘时期、采摘方法等均无限制，可使用任何茶叶，例如也可将新鲜茶叶等(包括叶、茎)作为原料茶叶。可通过使用捏和机等提取装置的公知方法进行提取，具体为：相对于原料茶叶，用20～100倍量的70～100℃(优选70～90℃)的提取水，用约1分钟～20分钟的时间，根据需要搅拌1次～数次，在常压或加压下进行提取即可。在此，提取时使用的提取水，除纯水(包括硬水、软水、离子交换水)之外，还可例举含抗坏血酸的水溶液及pH值调整水等。
通过提取原料茶叶获得的茶提取液，接着通过过滤等从该茶提取液中除去提取残渣，根据需要进行离心分离等除去微粉。离心分离的条件(流速、旋转数)，可考虑最终获得的茶饮料的澄清度来适当选择。此外，进行离心分离时，可将提取液冷却至5～40℃左右。通过冷却后进行离心分离，最终获得的茶饮料的澄清度增高。
本发明的茶饮料，通过在除去上述提取残渣的茶提取液中，添加并混合溶解原花色素或含有其的植物提取物而制造(配制工序)。本发明的茶饮料以含有临床上有效量的原花色素为特征，其含量以PB1及PB3的合计含量为指标，为6.4mg/L以上，优选为8.1mg/L以上。考虑到经过杀菌处理原花色素被分解或被异构化，所以要在配制工序中添加比目标含量多的原花色素。
此外，在本发明的茶饮料中，为了调整pH为6.0前后、调整浓度、调整口味等，根据需要可添加抗坏血酸、抗坏血酸钠、碳酸氢钠等。添加抗坏血酸不仅可防止茶饮料中的茶提取成分的氧化，而且还可期待抗坏血酸具有的抗氧化作用与本发明的原花色素相加或协同地提高血管内皮功能改善作用。
本发明的茶饮料优选作为容器装饮料而提供。在此所说的容器装饮料是指装在PET容器、罐、瓶、纸容器等容器中的饮料，不用稀释可直接饮用。容器装饮料，通常是将通过配制工序获得的调和液加热处理后，填充到容器中而制造。加热杀菌处理进行日本食品卫生法规定的处理即可，例如是罐饮料时，进行加热罐后填充，进行蒸馏杀菌(例如在适当加压下(1.2mmHg等)、在121℃加热杀菌7分钟)；如果是塑料瓶饮料时，可进行超高温杀菌机(UHT)杀菌(使调和液在120～150℃下保持1秒～数十秒)。
此外，如上所述，本发明的茶饮料，经过用温水提取茶叶的提取工序、从茶提取液中除去提取残渣的工序、在茶提取液中混合原花色素或含有其的植物提取物等配制调和液的配制工序、其他适当的杀菌工序、容器填充工序而制造。但是，该制造工序只是例子之一。可调换各工序的顺序，并且也可在各工序间插入其他的工序。
(血管内皮功能改善作用)
血管内皮不仅仅是覆盖血管内壁表层的组织，而且在保持血管的恒常性方面具有重要的作用。在评价血管内皮功能时，可使用血流依赖性血管扩张反应测定法(flow mediated dilatation；FMD)。作为实验求出FMD的方法，通常使用的方法是，利用体积描记法测定反应充血时动脉血流量及安静时基础血流量。这是在测定安静时的基础血流量后，将上臂躯血，测定躯血释放后的每单位肌肉组织(100mL)的血流量(反应充血时动脉血流量)的变化，作为评价项目，可例举(1)躯血释放后的血流量的AUC(反应充血时动脉血流量/安静时动脉流入量比曲线下面积(AUC；area under the curve))、(2)躯血释放后的最大血流量、(3)躯血释放30～60秒后的血流量等(J Pharmacol Sci.2003；93：399-404)。本发明的含原花色素茶饮料，通过持续摄取(连续摄取1～12周时间)躯血释放后的血流量的AUC增加，躯血释放后的最大血流量增加，躯血释放45秒后的血流量增加，所以可以说具有优异的血管内皮功能改善作用。
此外，通过血液检查也可评价血管内皮功能。已知在血管的最内侧存在的内皮细胞分泌以一氧化氮(NO)为代表的各种生理活性物质，因此，测定与该血管内皮功能紧密相关的NO量就可评价血管内皮功能。在测定NO时，因为NO在血管内皮细胞分泌后立刻被氧化，所以用其代谢物NO2 -、亚硝基硫醇、NOx等。在连续摄取试验、免疫学研究中，使用NO2 -和NO3 -的总和NOx，也有报告称在高血压者、抽烟者的血中NOx的量低。因为本发明的含原花色素茶饮料，通过持续摄取4～12周时间，血中的NOx增加，所以可以说具有NO依赖性血管内皮功能改善作用。
如上所述，本发明的茶饮料具有血管内皮功能的改善作用。因此，可优选用于血管内皮功能低下的人(动脉硬化者及有该倾向的人)，健康的人饮用也可期待有其预防效果。此外，动脉血流增加比，即反应充血时动脉血流量除以安静时基础血流量的值的最大值，健康人的动脉血流增加比大约为400以上，而血管内皮功能低下的人为0以上400以下。本发明的主要对象者是动脉血流增加比的最大值为0～400的人。
实施例
以下通过实施例及试验例对本发明进行说明，但本发明并不仅限于这些实施例、试验例。
[试验例1]血管内皮功能改善作用(in vivo评价)
1.高原花色素含量组分(PF；procyanidin fraction)的配制
作为松树皮提取物(PBE；pine bark extract)，使用Flavangenol(松树萃取物)(株式会社东洋新药Lot.T-0027)。从该松树皮提取物中进行分离·精制，配制高原花青素含量组分(PF；procyanidin fraction)。即：将松树皮提取物7.5g溶解于30mL的10％乙醇中，加入ShephadexLH-20树脂(AmershamPharmacia株式会社)柱中，用3L的H2O、3L的35％乙醇进行依次洗脱，然后分别用1.5L的70％乙醇，分离成4个组分，将70％乙醇洗脱的2～4组分合并，减压浓缩后冷冻干燥配制成高原花青素含量组分(PF)。此外，LH-20柱用1.5L的50％丙酮洗涤后，用水4.5L平衡后再使用。
2.血管功能评价(动物试验)
从日本Charles River公司购入Crl:CD(SD)雄性大鼠，驯化一定时间后，在20～21周龄供给实验。动物在具备空调设备的饲养室(SPF、温度23.5±1.0℃、湿度55±10％、换气次数12-15次/小时、照明7:00-19:00/日)饲养。驯化期间使其自由摄取市售的饲料(CE-2、日本柯力亚(Clea)株式会社)以及自来水。
将断食一夜后的大鼠16只分成3组，作为水给药组(对照组control)、松树皮提取物给药组(松树皮提取物组PBE)、高原花青素含量组分给药组(高原花青素含量组分组PF)，分别强制口服给入被检试样溶液5ml/kg。松树皮提取物的给药量为干重150mg/kg，高原花青素含量组分为干重120mg/kg，松树皮提取物组和高原花青素含量组分组的原花青素的量，根据下述树皮组合物的组成分析项所示的分析值来计算、设定，两者几乎相同。
被检试样溶液给入1小时后，在腹腔内给入麻醉药戊巴比妥(Nembutal)0.08ml/kg，然后在设定为37℃的加热垫子(KN-210-5，株式会社夏目制作所)上进行实验(实验室的温度设定为23℃左右)。在尾基部安装袖带(DC1.6，D.E.Hokanson，Inc)，在距袖带2～4cm的末端部位卷入水银应变计(6.0cm，D.E.Hokanson，Inc)，用体积描记法(EC6，D.E.Hokanson，Inc)测量动脉流入量。在测量安静时的动脉流入量6次以上后，在尾基部卷入的袖带处施加300mmHg的压力，进行3分钟躯血。反应性充血后的动脉流入量从0秒开始以20秒间隔测定15次。将获得的测定结果用非观血式脉管分析系统(NIVP3，D.E.Hokanson，Inc)进行分析。
安静时动脉流入量在各组之间未发现显著差异。计算反应性充血后的动脉流入量/安静时动脉流入量(TBF level；tail blood flow level)，将基准值校正为0。其结果如图1所示。与对照组相比，松树皮提取物组(PBE)、高原花青素含量组分组(PF)均显示高的数值，证明具有血管内皮功能改善作用。此外，对反应性充血后0秒到120秒的动脉流入量/安静时动脉流入量比曲线下面积(AUC；area under the curve)进行分析的结果如图2所示。与对照组相比，松树皮提取物组、高原花青素含量组分组均显示高的数值，这也证明具有血管内皮功能改善作用。
由上述表明，松树皮提取物中与血管内皮功能改善作用相关的物质是原花色素。
3.松树皮提取物的组成分析
对于动物试验中使用的松树皮提取物及高原花青素含量组分，进行其组成分析。具体为：测定儿茶素及表儿茶素含量(C+EC)、原花色素含量(Pr)、苯丙烷类含量(PP)、二氢黄酮醇含量(DHF)以及其它成分(others)。各自的测定方法如下所述。
1.儿茶素及表儿茶素含量(C+EC)
将2mg松树皮提取物溶解于10mL的10％乙醇中，用0.45μm的过滤器过滤后，提供给下述条件的HPLC(岛津制作所LC-10A系统/SPD-10Avp检测器)，根据HPLC的测定结果，使用(+)-儿茶素(catechin)及(-)-表儿茶素(epicatechin)的50μg/mL及10μg/mL的10％乙醇溶液制作的校正曲线，对试样中的儿茶素类进行定量。定量时使用A225nm的面积值。本条件下(+)-儿茶素(catechin)及(-)-表儿茶素(epicatechin)的洗脱时间为8.1min及9.5min。
(HPLC条件)
·色谱柱：Cosmosil5C18-MS-II、5μm、4.6mmφ x 150mm(Nacalai Tesque株式会社)
·流动相：A-0.05％三氟乙酸/H2O、B-90％CH3CN/0.05％三氟乙酸/H2O、1ml/min
·梯度程序：9％B等强度(15min)9％B→100％B(1min)100％B等强度(10min)100％B→9％B(1min)平衡10分钟后，开始进行下次分析。
·检测：A225nm
·进样量：10μL
2.原花色素含量(Pr)
将松树皮提取物1mg溶解于装有1mL的0.6N-盐酸/丁醇的玻璃试管内，在90℃的水浴中静置2小时。并且将反应结束后的液体用0.45μm的过滤器过滤，供给以下条件的HPLC，对花色素(anthocyanidin)进行定量。用于定量的标准物质使用花青素(cyanidin)(从Funakoshi株式会社购入)。此外，因为花青素(cyanidin)在5.5分钟洗脱出来，λmax为525nm，所以将与此一致的成分作为花青素(cyanidin)定量。作为原花青素(OPC)的标准物质，使用原花青素B1(procyanidin B1)(Funakoshi株式会社)0.5mg/mL，进行同样的反应，比较生成的花青素(cyanidin)量，求出原花色素含量(Pr)。
(HPLC条件)
·色谱柱：YMC-ODS-A312，6mmφ x 150mm
·流动相：CH3COOH:MeOH:H2O＝15:17.5:67.5
·检测：A520nm(PDA在400～600nm处测定)
3.苯丙烷类含量(PP)
将松树皮提取物以0.5mg/mL溶解于酶液(含有0.5mg/mL纤维素酶RS(养乐多(Yakult)株式会社)的0.06M醋酸钠缓冲液)中，在40℃保温1.5小时，用0.1％三氟乙酸/CH3CN稀释2倍，用0.45μm的过滤器过滤，供给以下条件的HPLC。用于定量的标准物质，使用阿魏酸(从Nacalai Tesque株式会社购入)。此外，阿魏酸在7.5分钟洗脱出来，λmax为327nm，所以将与此一致的成分作为阿魏酸进行定量。并且将用同一HPLC求出的对香豆酸及咖啡酸的总和，作为苯丙烷类含量(PP)。
(HPLC条件)
·色谱柱：Shim-pack FC-ODS，4.6mm x 150mm
·流动相：A：0.1％三氟乙酸/H2O、B：0.1％三氟乙酸/90％CH3CN、0.6ml/min
·梯度：B20％→B70％(10min)、B70％iso(5min)
·检测：Photodiodearrey检测器(岛津制作所SPD-M10A)、A330nm
·进样量：10μL
4.二氢黄酮醇含量(DHF)
使HPLC的检测在A280nm处进行，除此之外，其他与上述PP相同，进行HPLC，对二氢槲皮素进行定量。用于定量的标准物质使用二氢槲皮素(商品名：花旗松素(Taxifolin)，从Funakoshi株式会社购入)。此外，二氢槲皮素在7.2分钟洗脱出来，λmax为286nm，所以将与此一致的成分作为二氢槲皮素进行定量。此外，计算用相同HPLC求出的二氢山奈酚及二氢杨梅素的总和，作为DHF含量。
分析结果如表1所示。根据动物试验及分析结果，表明血管内皮功能的改善作用与原花色素相关。
表1
(单位：重量％)
 
C+EC Pr PP DHF others
PBE 6 60 0.5 0.5 33
PF 12 75 0 0 13
此外，PBE的原花色素中的PB1、PB3及其合计量分别为39.3mg/g、19.7mg/g、59mg/g，PF的原花色素中的PB1及PB3为102.9mg/g、58.7mg/g、161.6mg(测定方法与实施例1相同)。
[实施例1]配合原花色素的茶饮料对人体被检验者的血管内皮功能改善作 用-1
1.配合原花色素的茶饮料的制造
在8kg绿茶及包种茶的混合茶叶中加入约80℃的温水300L，提取5分钟后，冷却到30℃以下，通过离心分离除去茶叶获得茶提取液。根据表2所示的处方，在该茶提取液中混合并溶解松树皮提取物及L-抗坏血酸，添加碳酸氢钠调整pH为6.0，获得调和液。接着对该调和液进行脱气处理、杀菌处理(杀菌条件：135℃、30秒)，填充(约80℃)到350mL的PET瓶容器中并冷却，获得对照(P)以及3种被检饮料(Q、R、S)共计4种饮料。此外，在试验饮料之间(P、Q、R、S)，确认在感官方面(香味)、外观、形状上无法识别。
表2
Figure A200780018106D00191
※1：(株)东洋新药(Flavangenol Lot.T-0030；水提取物)
2.PB1及PB3含量的测定
对于4种试验饮料(P、Q、R、S)，procyanidin B1(PB1)及procyanidinB3(PB3)的量通过以下方法测定。
首先，对于4种试验饮料(P、Q、R、S)，用ShephadexLH-20进行预处理填充干重为0.25g的LH-20(Amersham生物科学株式会社)，在用水润湿膨胀的柱子上加入试验饮料5mL，用2mL水洗涤后，用35％乙醇2mL、70％乙醇4mL洗脱
将70％乙醇洗脱组分在减压下浓缩后装入2mL的容量瓶，用0.45μm的过滤器过滤，获得各种试验溶液。
在下述条件下供给HPLC，对PB1进行定量。定性是在与标准品相同的条件下，对试验溶液进行HPLC分析，将与PB1标准品的洗脱保留时间(6.3分钟)一致的峰、以及与洗脱时间7.5分钟的原花青素B3(PB3)一致的峰，分别鉴定为PB1、PB3，并作为原花青素类计算总和。定量试验是测量鉴定为PB1的洗脱峰的峰面积，利用基于PB1标准品的峰面积制作的校正曲线计算试验溶液中的PB1类含量。校正曲线是将PB1标准品溶解于10％乙醇溶液中，将配制的2、5、10μg/mL的溶液作为各浓度的标准溶液(用时配制)，对于各标准溶液，在下述HPLC条件下进行操作，以横轴为PB1的浓度，纵轴为峰面积来制作。
(HPLC条件)
·色谱柱：Cosmosil5C18-MS-II(4.6Φ×150mm、Nacalai Tesque株式会社制)
·流动相：(A液)乙腈—水(8:92)0.05％三氟乙酸
          (B液)乙腈—水(50:50)0.05％三氟乙酸
·流速：1.0ml/min
·温度：40℃
·检测：紫外吸收225nm
·进样量：10μL
·梯度程序：参照表3
表3
Figure A200780018106D00201
测定结果如表4所示。此外，对被检饮料Q不进行杀菌处理时，PB1及PB3分别为1.84、3.29mg/L，合计为5.13mg/L。
表4
 
PB1 PB3 合计
P(松树皮提取物：0mg) 0.39 1.62 2.00
Q(松树皮提取物：40mg) 1.96 2.80 4.76
R(松树皮提取物：80mg) 3.40 4.70 8.10
S(松树皮提取物：160mg) 7.25 8.51 15.76
(单位：mg/L)
3.通过体积描记法评价血管内皮功能
出于伦理道德的考虑，在试验开始前征得同意参加试验的20岁以上65岁以下的21名健康成人男女中，将符合下述任一条件的人选定为被检验者，即：2周前的预检查时空腹时血糖为110～139mg/dL的男性，或血压的收缩压为130～159mmHg或舒张压为85～99mmHg的男性，或绝经后的女性。将被检验者分为n＝4～6的随机4组，采用双盲法的摄取1周时间的交叉法即：使4组被检验者分别1天饮用1瓶(350mL)，饮用1周时间，对4种试验饮料(P、Q、R、S)分别进行这种试验。
血管内皮功能，使用体积描记法(Plethysmograph EC6、Primetech Co.)，测定被检验者的反应充血时动脉血流量和安静时基础血流量。安静时基础血流量，被检验者保持仰卧姿势30分钟安静后，在常用手腕的对侧手腕上卷入3个袖带和应变计15分钟后开始测定前臂动脉血流量。测定7次以上，从该测定结果中计算5次中间值的平均值。反应充血时动脉血流量，在测定安静时基础血流量之后，在上臂卷入袖带处施加比收缩压高50mmHg以上的压力，在5分钟驱血释放后，从0秒开始以15秒间隔测定释放时的、释放后的前臂动脉血流量。
图3及图4中表示动脉血流增加比(％FBF)，即反应充血时动脉血流量除以安静时基础血流量的值的经时变化。此外，表5表示安静时基础血流量(安静时前臂动脉血流量)(A)、反应充血时动脉血流量(驱血释放后的最大前臂动脉血流量)(B)的测定结果，以及根据该测定结果计算的动脉血流增加比(％FBF)，即反应充血时动脉血流量除以安静时基础血流量的值(B/A)的计算结果。
安静时基础血流量(A)，摄取前及摄取后的任何被检饮料(Q、R、S)摄取组与对照(P)摄取组相比较，均没有显著差异，但反应充血时动脉血流量(驱血释放后的最大前臂动脉血流量＝驱血释放0秒后的血流量)(B)及动脉血流增加比(B/A)，添加松树皮提取物80mg的被检饮料(R)摄取组及添加160mg松树皮提取物的被检饮料(S)摄取组，与对照(P)摄取组相比，其值显著高。此外，因为本次作为被检验者使用的健康人的动脉血流增加比(B/A)的最大值为190.1～1436.2，所以认为其中也包括了血管内皮功能低下的人。被检验者的动脉血流增加比，连续摄取被检饮料(Q、R、S)的结果变为235.4～2200.3。
表5
Figure A200780018106D00211
表中的值用平均值±标准偏差表示
与对照(P)摄取组的比较#：p<0.05##：p<0.01  ###：p<0.001(paired t test)
此外，还对驱血释放45秒后的血流量C进行了分析。表6表示驱血释放45秒后的血流量C及由此计算的动脉血流增加比(C/A)的结果(安静时基础血流量A采用表5的值)。驱血释放45秒后的血流量(C)及动脉血流增加比(C/A)，任一种被检饮料(Q、R、S)摄取组与对照(P)组相比均为高数值，特别是添加松树皮提取物80mg的被检饮料(R)摄取组及添加160mg松树皮提取物的被检饮料(S)摄取组，与对照(P)摄取组相比均为高数值。
表6
Figure A200780018106D00221
表中的值用平均值±标准偏差表示
与对照(P)摄取组的比较#：p<0.05   ##：p<0.01   ###：p<0.001(paired t test)
进而，计算从刚驱血释放后开始到驱血释放60秒后的％FBF曲线的曲线下面积(AUC)，其结果如表7所示。添加松树皮提取物80mg的被检饮料(R)摄取组及添加160mg松树皮提取物的被检饮料(S)摄取组，与对照(P)摄取组相比，AUC均为高数值。
表7
Figure A200780018106D00222
表中的值用平均值±标准偏差表示
与对照(P)摄取组比较#：p<0.05  ##：p<0.01  ###：p<0.001(paired t test)
上述结果表明，通过连续摄取1周时间的添加松树皮提取物40mg以上的茶饮料，显示改善了血管内皮功能，特别是添加松树皮提取物80mg以上的茶饮料，即含有的PB1及PB3为8.10mg/L以上的浓度的茶饮料，确认其具有优异的血管内皮功能改善作用。
[实施例2]配合原花色素的茶饮料对人体被检验者的血管内皮功能改善作 用-2
1.配合原花色素的茶饮料的制造
与实施例1相同配制茶饮料，按照表8所示的处方，在其中混合并溶解松树皮提取物及L-抗坏血酸，然后添加碳酸氢钠调整pH为6.0。接着，与实施例1同样进行脱气处理、杀菌处理后，填充到350mL的PET瓶容器内，获得对照(L)及2种被检饮料(M、N)共计3种试验饮料。此外，L、M、N在感官方面(香味)、外观、形状上无法识别。
表8
※2：(株)东洋新药制(Flavangenol Lot.T-0030；水提取物)
2.PB1及PB3含量的测定
对于对照(L)及被检饮料(M、N)，用与实施例1同样的方法，测定procyanidinB1(PB1)及procyanidin B3(PB3)的量。测定结果如表9所示。
表9
 
PB1 PB3 合计
L(松树皮提取物：0mg) 0.70 1.72 1.72
M(松树皮提取物：60mg) 2.39 4.00 6.39
N(松树皮提取物：80mg) 3.12 5.27 8.38
(单位：mg/L)
3.通过体积描记法评价血管内皮功能
出于伦理道德方面考虑，在试验开始前征得同意参加试验的20岁以上65岁以下的67名健康成人男女中，将符合下述任一条件的人选定为被检验者，即：2周前的预检查时空腹时血糖为110～139mg/dL、收缩压为130～159mmHg或舒张压为85～99mmHg、具有更年期症状的女性(Kupperman指数21以上)。将被检验者分为n＝22或23的3组，进行根据双盲法的摄取12周时间的3组平行组间比较试验，即：使3组被检验者分别1天饮用1瓶(350ml)对照(L)或被检饮料(M、N)，饮用12周时间。
血管内皮功能，与实施例1相同，使用体积描记法(Plethysmograph EC6、Primetech Co.)进行测定。不过血管内皮功能的测定是在摄取4周前(前观察)、即将摄取之前(0周时间)、摄取4、8、12周后及摄取结束4周后(后观察)共计实施6次。
此外，本次作为被检验者使用的健康人，动脉血流增加比(B/A)的初期值为166.0～1265.6，认为包括了血管内皮功能低下的人。被检验者的动脉血流增加比，连续摄取被检饮料(M、N))的结果变为261.9～1417.5。
图5及图6表示即将摄取试验饮料之前及摄取12周后的动脉血流增加比(％FBF)，即反应充血时动脉血流量(前臂动脉血流量)除以安静时基础血流量的值的经时变化。摄取12周时间后，在驱血释放0～90秒后的任意时间，被检饮料(M、N)摄取组与对照(L)摄取组相比均为高数值。
表10表示相对于安静时基础血流量(安静时前臂动脉血流量)的驱血释放45秒后的血流量C的动脉血流增加比(C/A)(％FBF)的变化(上段：实测值、下段：从即将摄取之前开始的变化量(Δ值))。动脉血流增加比(C/A)，任一种被检饮料(M、N)摄取组与对照(L)摄取组相比均为高数值。证明被检饮料(M、N)摄取组的效果，在Δ值上与对照(L)摄取组相比存在显著差异。
表10
Figure A200780018106D00241
数值为平均值±标准偏差
组间比较：+p<0.1，#p<0.05，##p<0.01(Dunnett法的多重比较检验)
表11表示从刚驱血释放后到驱血释放60秒为止的％FBF曲线的曲线下面积(AUC)的推移(上段：实测值、下段：从即将摄取前开始的变化量(Δ值))。在摄取4周以上时，任一种被检饮料(M、N)摄取组的AUC与对照(L)摄取组相比均为高数值。证明被检饮料(M、N)摄取组的效果，在Δ值上与对照(L)摄取组相比存在显著差异。
表11
Figure A200780018106D00251
数值为平均值±标准偏差
组间比较：+p<0.1.#p<0.05，##：p<0.01(Dunnett法的多重比较检验)
上述结果表明，通过连续摄取添加60mg以上松树皮提取物的茶饮料，即含有PB1及PB3为6.39mg/L以上的合计浓度的茶饮料，血流量增加。特别是，如图6所示，通过连续摄取添加60mg以上松树皮提取物的茶饮料，不仅是最大前臂动脉血流量增加，而且直到驱血释放90秒后为止的血流量也增加，认为这表明血管内皮功能获得了大大改善。
4.通过血液生化检验的血管内皮功能评价
在摄取4周前(前观察)、即将摄取之前(0周时间)、摄取4、8、12周后及摄取结束4周后(后观察)实施血液检查，分析血中NOx浓度(NO2 -和NO3 -的总和)。此外，在即将摄取之前及摄取12周后测定尿中8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)浓度。
表12表示血中NOx的浓度变化(μM)。对照(L)摄取组中没有发现由试验饮料引起的变化，但被检饮料(M、N)摄取组中与即将摄取之前相比NOx均增加，其增加随着摄取时间增长而增大。特别是添加80mg松树皮提取物的茶饮料(N)摄取组与对照(L)摄取组相比，数值显著增高。该结果表明，通过连续摄取添加60mg以上松树皮提取物的茶饮料，即含有PB1及PB3为6.39mg/L以上的合计浓度的茶饮料，显示NO依赖性血管内皮功能的改善。
表12
Figure A200780018106D00261
数值为平均值±标准偏差
组间比较：+p<0.1，#p<0.05(Dunnett法的多重比较检验)
与即将摄取之前比较：+p<0.1，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001(Bonferroni法的多重比较检验)
表13表示尿中8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)浓度(mg/mL)的变化。对于任一被检饮料(L、M、N)摄取组，通过12周时间摄取饮料，其尿中的8-羟基脱氧鸟苷(8-OHdG)的浓度均降低，特别是添加80mg松树皮提取物的茶饮料(N)摄取组与摄取前相比，数值显著降低。由此证明，通过连续摄取茶饮料，氧化应激障碍降低，特别是连续摄取添加80mg以上松树皮提取物的茶饮料，即含有PB1及PB3为8.1mg/L以上的合计浓度的茶饮料，氧化应激障碍降低。
表13
Figure A200780018106D00262
数值为平均值±标准偏差
与即将摄取之前比较：*p<0.05(paired t test)
[实施例3]感官评价试验-1
将8kg绿茶加到80℃的热水300L中，在同温度下提取5分钟。将获得的提取液冷却后进行离心分离，收集澄清的上清将其作为绿茶提取物。将该提取液用碳酸氢钠和维生素C调整pH为约6.0，进一步添加用热水提取的松树皮提取物(Flavangenol(松树萃取物)、株式会社东洋新药Lot.T-0030)，使最终组合物(350mL)中含有0、40、60、80、100、125、150、175、200、250、300mg，用纯水调整最终容量为1000L。将其作为配合Flavangenol(松树萃取物)的绿茶饮料，制造后立即请8名评委(男性3名、女性5名)试饮进行香味评价。要求上述8名评委排出优选顺序，根据下述标准计算分数。此外，参照实施例1对试验饮料中含有的PB1、PB3进行定量。
感官评价结果如表14所示，PB1及PB3的测定结果如表15所示。结果为：每350mL中松树皮含量为0～200mg，优选0～125mg的茶饮料，即含有PB1及PB3的合计量为30mg/L以下，优选为20mg/L以下浓度的茶饮料，涩味少、并且无口味偏好，容易饮用。
(评价标准)
最优选：5分
优选：4分
普通：3分
不太优选：2分
不优选：1分
表14
表15
单位(mg/L)
 
松树皮提取物添加量 PB1 PB3 合计
0 0 2.43 2.43
40 3.24 4.61 7.85
60 5.06 5.82 10.88
80 7.03 6.74 13.77
100 8.55 7.85 16.40
125 10.13 9.24 19.37
200 16.20 13.33 29.53
250 20.25 16.06 36.31
300 24.30 18.78 43.08
[实施例4]感官评价试验-2
将8kg绿茶加到80℃的热水300L中，在同温度下提取5分钟。将获得的提取液冷却后进行离心分离，收集澄清的上清作为绿茶提取物。将该提取液用碳酸氢钠和维生素C调整pH为约6.0，进一步添加热水提取的松树皮提取物“Flavangenol”(松树萃取物)(株式会社东洋新药Lot.T-0030；T-27)，使最终组合物(350mL)中含有80mg，或者添加含水乙醇提取的松树皮提取物“Pycnogenol”(日本SiberHegner株式会社制Lot.F-830；F830)，使最终组合物(350mL)中含有80mg，用纯水调整最终容量为1000L。制造后立即请8名评委(男性3名、女性5名)试饮进行香味评价。评价项目与实施例3相同。此外，与实施例1相同，进行松树皮提取物中的组成分析。此外，作为比较，也对含水乙醇提取的松树皮提取物“Flavangenol(松树萃取物)”(株式会社东洋新药Lot..P-0015；P-15)实施组成分析。
感官评价结果如表16所示，组成分析结果如表17所示，苯丙烷类(PP)中的阿魏酸及二氢黄酮醇(DHF)中的二氢槲皮素浓度如表18所示。如表16可表明，结果为配合热水提取的松树皮提取物的茶饮料，与配合含水乙醇提取的松树皮提取物的茶饮料相比，涩味少、并无口味偏好，容易饮用。根据表17，判明热水提取物与含水乙醇提取物相比PP、DHF极少。根据表18，可以说将阿魏酸及二氢槲皮素的合计量作为指标，优选使用10μg/mg，更优选5μg/mg的松树皮提取物。
(评价标准)
最优选：5分
优选：4分
普通：3分
不太优选：2分
不优选：1分
表16
Figure A200780018106D00291
表17
                                             (单位：重量％)
 
C+EC Pr PP DHF others
T-27 热水提取物 6 60 0.5 0.5 33
P-15 含水乙醇提取物 5 45 10 2 38
F830 含水乙醇提取物 3 48 6 4 39
表18
 
阿魏酸 二氢槲皮素
μg/mg μg/mg
T-27 热水提取物 1.664 1.468
P-15 含水乙醇提取物 9.382 2.308
F830 含水乙醇提取物 5.74 30.77

Claims (5)

1.含原花色素茶饮料，其含有式(I)表示的原花青素B1和式(II)表示的原花青素B3，其合计量为6.4mg/L以上。
Figure A200780018106C00021
Figure A200780018106C00031
2.如权利要求1所述的茶饮料，其中，所述PB1和PB3是以含有于松树皮提取物中的形式进行添加。
3.如权利要求2所述的茶饮料，其中，所述松树皮提取物是松树皮的热水提取物。
4.如权利要求1～3中任一项所述的茶饮料，其为经过在茶提取液中配合原花色素配制调和液的配制工序、将所述调和液进行杀菌处理的杀菌工序、将杀菌后的调和液填充到容器内的填充工序而获得的容器装茶饮料。
5.如权利要求1～4中任一项所述的茶饮料，其具有血管内皮功能的改善作用。
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