CN101309932B

CN101309932B - 新粘蛋白型糖蛋白及其应用

Info

Publication number: CN101309932B
Application number: CN2006800382137A
Authority: CN
Inventors: 丑田公规; 益田晶子; 堂前直; 古川英光; 宫胁敦史
Original assignee: Independent Administrative Institution Physical Chemistry Institute
Current assignee: Independent Administrative Institution Physical Chemistry Institute; RIKEN Institute of Physical and Chemical Research
Priority date: 2005-08-12
Filing date: 2006-08-11
Publication date: 2012-04-11
Anticipated expiration: 2026-08-11
Also published as: EP1947111B1; WO2007020889A1; JPWO2007020889A1; CA2618791C; US20100151514A1; JP5057383B2; ES2359645T3; AU2006280838A1; DE602006020061D1; US7829679B2; EP1947111A4; EP1947111A1; CA2618791A1; AU2006280838B2; CN101309932A

Abstract

本发明涉及一种新型粘蛋白型糖蛋白及其制备方法。特别是，本发明提供了一种具有重复结构粘蛋白型糖蛋白，每个重复结构包含3至2000个重复单位，每个重复单位的氨基酸序列如式I所示：Val-Xaa-Glu-Thr-Thr-Ala-Ala-Pro[其中Xaa代表Val或Ile]，上述结构中的一个或以上氨基酸残基与由一个或以上单糖组成的糖链相结合。本发明还涉及一种包含所述新型粘蛋白型糖蛋白组合物。此外，本发明涉及一种包含该新型粘蛋白型糖蛋白的分子量标记物。

Description

新粘蛋白型糖蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及一种新型的粘蛋白型糖蛋白及其合成方法。本发明还涉及包含该新型粘蛋白型糖蛋白的组合物。另外，本发明涉及包含该新型粘蛋白型糖蛋白的一种分子量标记物。

背景技术

在糖蛋白中，其中的糖链包含一个到十个单糖的高分子的糖蛋白物质通过O-糖苷键以一定的间隔结合到具有简单重复结构的肽链上，这类糖蛋白物质统称为粘蛋白。在自然界中，多种粘蛋白存在于细胞中，或作为组分存在于植物和动物粘液中，且已知在生命系统中具有多种重要作用。而且，植物和动物中的粘蛋白，以及食物中存在于粘液组分中的粘蛋白，即使被作为食物吸收后，在生命活力中，或在消化和吸收过程中均具有重要的生物学效应。

迄今为止已在人中发现约十种粘蛋白。这些粘蛋白主要分布和存在于粘膜部分，如唾液和胃粘膜。由这些粘蛋白组成的粘液组织具有包括作为细胞外基质的抗菌作用，可抑制病毒等感染之类的生物学效应；以及一些生理作用，例如对细胞和组织的保湿，保护和润滑作用(H.Nakata，Diversity of Mucin and Mucin-type Sugar Chain and Its Meaning：Understandable Glycobiology in Post-Genomic Era，Wakaru Jikken-Igaku Series(Understandable Experimental Medicine)(in Japanese)，N.Taniguchi ed.，Chapter 3，Yodosha Co.，Ltd.，2002；K.Hotta，K.Ishihara，Search for Attractiveness of Gastric Mucus：Elucidation of Mucin using Newest Approach(in Japanese)，Medical View Co.，Ltd.，1999)。

粘蛋白的生理作用并不总是源于其特异的化学反应。其生理作用也被认为是源于其物质特性，例如其形态学特性包括可塑性，粘性，保湿性等，以及与具有三维结构的肽链结合的无定形糖链具有识别多种分子(如凝集素)的能力。因此，包含粘蛋白肽链的聚合体部分的物理特性和三维结构，以及无定形糖链部分的分子识别能力对粘蛋白行使功能而言是必需的。

另一方面，此类组成粘膜或细胞外基质的部分或全部成分的化合物即使是从外界吸收的也可发挥作用。因此，人们认为此类化合物具有很大的利用价值，其可通过人工合成，并以药品，化妆品，食品等方式供应市场(JP 8-269091A(1996))。在糖链化合物中，软骨素，硫酸软骨素和透明质酸等细胞外基质的主要成分，已先于其他化合物从多种原材料中被提取和纯化，并以食品，药品，化妆品等方式供应市场。然而，粘蛋白只通过膳食方式摄入，例如某些食物(天南星科植物，秋葵和黑木耳)或动物(牛肉和猪肉)(见JP 7-33623A(1995)；JP8-256788A(1996)；JP 6-199900A(1994)；JP 5-310799A(1993)；和JP7-126292A(1995))，尚未作为化合物大规模和批量的供应。

包括粘蛋白在内的糖蛋白具有分子识别能力，因此具有多种用途，例如可用于制药。然而尚未发现一种合适的合成方法。其中一些编码肽序列的基因已被确定。然而，由于肽链合成后引入糖链尚有困难，基因转移或克隆的方法成效甚微(PolysaccharideSeparation/Purification Method，Biological and Chemical ExperimentalMethods 20(in Japanese)，edited by K.Matsuda，Japanese ScientificSocieties Press，1987)。对多数糖蛋白，其合成方法无一例外的通过下列途径，使用E.coli等先合成肽链，然后向其中引入糖链(见WO96/13516)。此方法的不利因素是不适合大规模生产。

糖蛋白包括，含有粘蛋白型糖链的糖蛋白或含有天冬酰胺型糖链的糖蛋白。对某些天冬酰胺型糖链，现已发现能够调节其糖链结合的分子伴侣，其中某些糖链的结合位点也已被证实。然而，目前还很难确定合成时引入糖链的位点。即使糖链可依次引入到合成的肽链中，据推测，肽链的高级结构会因为糖的结合而产生很大的改变。因此，不能保证肽链可再折叠形成天然的高级结构。

同时，限于粘蛋白型糖蛋白，其肽链通过折叠形成高级结构，然后进行糖链修饰。因此，糖链可结合到肽链，并保持其三维结构和蛋白质功能。由此，糖链被引入，且其肽链的整体高级结构基本不变(M.Fukuda，Mucin-type Sugar Chain，pp.35-56，Y.Kohata，S.Hakomori，and K.Nagai ed.，″Diverse World of Sugar Chain″(in Japanese)，Kodansha Scientific，Ltd.，1993)。由此看来，粘蛋白型糖蛋白在用于药物研发时具有优势。然而，已知的粘蛋白型糖蛋白结合位点的氨基酸序列中未发现具有任何规则，因此很难在所需位点引入糖链。而且，虽然粘蛋白型糖蛋白有相对简单的一级结构，通过有机化学途径合成整体的粘蛋白型糖蛋白仍有很大困难。基于上述原因，虽然粘蛋白型糖蛋白具有多种优势特征，批量生产粘蛋白型糖蛋白的工业途径目前尚未形成。

凝胶过滤法，也称为大小排除色谱法(Size ExclusionChromatography，SEC)，已广泛用作方便和准确的测定高分子化合物分子量的方法。该方法不仅可使用开放柱进行分析，还可用作高效液相色谱法，而且可以根据分子量进行分离，特别是自动分离(A.Fallon，R.F.G.Booth，L.D.Bell，translated by T.Osawa，High-Performance Liquid Chromatography，Biochemical ExperimentalMethod 9(in Japanese)，Chapter 5，Tokyo Kagaku Dojin Co.，Ltd.1989)。然而，在技术上很难仅通过这些检测方法确定未知物的分子量绝对值。对此具体而言有两项必要条件，其一，使用柱载体，这样可保证根据理论校正曲线，凝胶过滤具有很好的重现性；其二，使用准确的标准分子量标记物。因此，应非常谨慎的选择待测物和柱载体的组合，以及待测物和分子量标记物的组合。

近年来，一种使用飞行时间质谱仪的测定方法(MALDI-TOF MS)已广泛用于绝对分子量的测定。该方法能获得绝对测定数值，从而准确的确定高分子化合物的分子量。然而，该方法所需的仪器设备比液相色谱要昂贵许多。实际上不太可能将该仪器设备推广到所有的化学合成实验室，工厂，医疗机构等。分析检测可在一个具备上述昂贵仪器或可进行外包的地方集中进行。然而，实验室需要快速反馈和快速检测，因此仍频繁使用SEC进行分析。在这种情况下，优选使用一种能MALDI-TOF MS和SEC两种方法共同测定的物质作为标准，进行绝对分子量的测定。

使用SEC方法时，与待测物和分子量标记物联合使用的标准物质应尽可能的与待测物具有相似的物理特性。SEC的原理为，根据溶质大小(分子量)，利用聚合体填料网的分子筛效应进行分离。因此，分离取决于物理性质，例如大小或形状，而不取决于能引起溶质和固定相相互作用的化学性质。特别是，应选择具有与溶剂(流动相)中的聚合体相似的流体动力学半径和形状的物质作为标准。SEC的使用者通常根据商品目录选择和使用聚合体分子量标记物，其具有相似的构型。然而，对已有的标记物，其分子量分布很窄，或分子量控制在一定范围内，最便捷的方法就是使用控制合成的方法已知的合成的聚合体。市售的可作为分子量标记物的物质，其数量非常有限。特别是，现在市场上只有线性结构的聚合体，例如聚苯乙烯，聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)，聚乙烯，聚乙二醇，聚乙烯氧化物，聚丙烯酸，和普鲁兰(例如，JP专利号3012917(JP 10-60005A(1998)))。在这种情况下，不可能包含所有的高分子化合物。

一些生理活性受到关注的糖蛋白(例如，酶，粘蛋白，和激素)中也没有合适的标准分子量标记物。糖蛋白广泛存在于自然界，且比非糖蛋白数量大。其中有些糖蛋白具有多条糖链结合在肽链上，呈刷状形式，也有每分子中只结合一条糖链的糖蛋白，即使这些糖蛋白也具有很大的糖链部分覆盖分子的表面。当这样的糖蛋白用SEC根据分子大小和形状进行分离分析时，使用具有线性结构的传统的分子量标记物显然是不合适的。一种多聚糖，例如，普鲁兰，由于其含糖而用作分子量标记物。然而，迄今为止，尚不能保证这样的分子量标记物能提供准确的分子量。在现今这种情况下，测定的分子量，也许是错误的，其只能显示与所用标记物的相对关系。特别是，只用SEC估测的分子量基本上不准确，需要另一种方法进行证实。

电泳法，例如SDS-PAGE，也是分离蛋白的方法，可在实验室中方便的使用。与SEC中类似，此类分析方法中也需要应用合适的分子量标记物。分子量标记物也用于除SEC和电泳法之外的多种常用的生物化学分析中。

水母主要见于夏季，有时所见数量巨大，因此极大的降低了核电厂或热电厂的进水/排水系统的效率和经济效益，以及紧邻海洋，海港，有捕鱼网(如固定在岸上的捕鱼网)的渔场等的工厂的工业用水的进/排水系统的效率和经济效益。特别是像海月水母(Aurelia aurita)等游动能力很差的水母必须有效根除，尤其在其数量很大的情况下。如Echizen-kurage水母(Nemopilema nomurai)之类的大型水母在数量很大时，因其重量大，需要用重型机器通过大型操作将其从水底连根拔起。如此操作的结果是，大量水母一次从水底拔起。然而，根据现今日本法律，水母拔起后即视为废物而禁止将其再次弃置入海洋中。因此，这些水母会在岸上蓄积。已有人提出利用这些累积的水母作为食物或肥料的方法(例如JP 2004-99513A；JP 2003-321497A；JP2001-178492A；JP 2002-370991A；WO 95/17428；JP 2002-143824A；JP6-217737A(1994)；和V.Schmidt，A.Bally，K.Beck，M.Haller，W.K.Schlage，C.Weber″The extracellular matrix(mesoglea)of hydrozoanjellyfish and its ability to support cell adhesion and spreading.Hydrobiologia 216-217，pp.3-10(1997))。然而由于缺少其他有效途径使用水母，出于环境保护原因而对其进行处理对相关公司或政府造成极大的经济负担。为收回处理的成本，需要从水母中分离哪怕只是很小量的昂贵物质。然而迄今尚未发现有效的方法。

所见到的大量海月水母是通过空中观察而估计的，在某些区域可达到每个海湾有几十万吨(T.Yasuda ed.，″Marine UFO Jellyfish″(in Japanese)，pp.4 1-77 VII Emergence and Distribution，KouseishaKouseikaku Co.，Ltd.，2003)。水母作为海洋资源而大量存在于地球上，对于蓄积的废物水母以及活的水母的利用均应纳入考虑范畴。

发明内容

本发明的目的是提供一种可通过大规模生产用于医疗，食品等领域、且可作为人粘蛋白的替代物使用的粘蛋白型糖蛋白，以及所述糖蛋白的生产方法和应用。本发明的另一目的是提供一种可用于糖蛋白分子量测定的分子量标记物。

为实现这些目标而进行努力研究的结果是，本发明人现已成功的从水母中分离和纯化出新型的粘蛋白型糖蛋白，并在分析了该粘蛋白型糖蛋白的结构和性质后发现该粘蛋白型糖蛋白可作为人粘蛋白的替代物。而且，本发明人现已发现，从水母中分离和纯化出的粘蛋白型糖蛋白，因其具有广泛的分子量分布，从而可在糖蛋白的分子量测定中用作分子量标记物。基于上述发现，本发明得以完成。

具体而言，本发明涉及下列(1)到(9)：

(1)具有重复结构的粘蛋白型糖蛋白，其包含三个或以上的重复单位，该重复单位具有如式(I)所示的氨基酸序列：

Val-Xaa-Glu-Thr-Thr-Ala-Ala-Pro(I)

[其中Xaa代表Val或Ile]，

所述结构中一个或以上的氨基酸残基结合到由一个或以上的单糖组成的糖链上。

上述的粘蛋白型糖蛋白，为在自然界存在的蛋白质的情况下，推测其糖蛋白约含3至2000个重复单位，优选3至700个重复单位。此外，约50％的主要成分具有含40至180个重复单位的重复结构。在此所述的重复结构可直接结合或通过接头结合。

对于粘蛋白型糖蛋白，优选地，与糖链相结合的氨基酸残基为苏氨酸(Thr)。例如，98％或以上与糖链结合的氨基酸残基为苏氨酸(Thr)。

在粘蛋白型糖蛋白中，糖链包括但并不限于选自：N-乙酰半乳糖胺，半乳糖，N-乙酰葡糖胺，唾液酸，阿拉伯糖，和岩藻糖的单糖。优选地，糖链包含N-乙酰半乳糖胺。更优选地，糖链包含N-乙酰半乳糖胺和半乳糖。

在粘蛋白型糖蛋白中可从重复结构的N端去除一个或几个氨基酸，例如Val。

优选地从水母中提取粘蛋白型糖蛋白，例如海月水母(Aureliaaurita)，Echizen-kurage水母(Nemopilema nomurai)，或咖啡金黄水母(Chrysaora melanaster)。

(2)粘蛋白型糖蛋白的生产方法含下列步骤：

切取水母的坚硬部分；

用盐溶液提取水母的切断部分(或片段)；

用离心和透析法从提取物中分离粗粘蛋白；

纯化粘蛋白型糖蛋白。

(3)粘蛋白型糖蛋白的生产方法含下列步骤：

切取水母的坚硬部分；

用盐溶液提取水母的切断部分(或片段)；

用离心和透析法从提取液中分离粗粘蛋白；

纯化粘蛋白型糖蛋白，

其中，所有步骤在0至25℃进行。

粘蛋白型糖蛋白的生产方法优选所有步骤在接近冰点温度的低温下进行(0至25℃，优选4℃)，不进行加热。

(4)包含上述的粘蛋白型糖蛋白中的任何一种的组合物。

所述组合物可用于细胞和组织保护，湿度保持或皮肤表面吸收，健康促进，药物施用，疾病治疗或预防，抗生素的使用等。而且更优选地，所述组合物以水溶液，膜，或树脂状形式存在。

(5)修饰粘蛋白型糖蛋白的方法，其特征在于通过糖基转移酶的作用修饰上述粘蛋白型糖蛋白的糖链。

(6)含重复结构的蛋白，该重复结构包含1至2000个重复单位，每个单位含有下列式I所示的氨基酸序列：

Val-Xaa-Glu-Thr-Thr-Ala-Ala-Pro(I)

[其中Xaa代表Val或Ile]。

(7)生产糖蛋白的方法，蛋白质中的至少一个氨基酸残基结合到含有一个或多个单糖的糖链上。

(8)一种分子量标记物，其包含粘蛋白型糖蛋白，通过绝对分子量测定方法测得其分子量分布和分子分布的中值，该粘蛋白型糖蛋白具有包含3至2000个重复单位的重复结构，每个单位含有下列式I所示的氨基酸序列：

Val-Xaa-Glu-Thr-Thr-Ala-Ala-Pro(I)

[其中Xaa代表Val或Ile]，

分子量标记物可含有10至1400kDa的分子量。而且，优选所述分子量标记物为冻干形式。

(9)生成分子量标记物的方法，包括下列步骤：

将粘蛋白型糖蛋白用大小排阻色谱法进行分馏，粘蛋白型糖蛋白具有包含3至2000个重复单位的重复结构，每个单位含有式I所示的氨基酸序列：

Val-Xaa-Glu-Thr-Thr-Ala-Ala-Pro(I)

[其中Xaa代表Val或Ile]，

结构中一个或以上的氨基酸残基结合到由一个或以上的单糖组成的糖链上；

收集并纯化馏分；

测定纯化后的馏分的绝对分子量。

制备分子量标记物的方法还可包括冻干经纯化的馏分的步骤。

有益效果

本发明提供了一种新型粘蛋白型糖蛋白。粘蛋白型糖蛋白可用作人粘蛋白的替代物，并可应用于制药，农业，和食品领域。而且，粘蛋白型糖蛋白易从水母中大量制备，成为出色的经济和环境保护技术。

本发明还提供含粘蛋白型糖蛋白的分子量标记物。分子量标记物具有从天然聚合体中获得的分枝的聚合物链。使用该分子量标记物可进行糖蛋白等分枝聚合体的分子量的准确测定。

附图简述

图1说明了处理水母分离粘蛋白型糖蛋白的步骤摘要；

图2说明了分离粘蛋白型糖蛋白的特殊步骤；

图3显示了将从海月水母(Aurelia aurita；实线)和咖啡金黄水母(Chrysaora melanaster；虚线)中分离的粗粘蛋白进行离子交换液相色谱的结果。星号显示粘蛋白型糖蛋白的色谱峰。

图4显示了使用自动氨基酸分析仪对海月水母和咖啡金黄水母中纯化出的粘蛋白型糖蛋白的氨基酸组成进行分析的结果。

图5-1显示了使用脉冲液相方法对海月水母中纯化出的粘蛋白型糖蛋白的氨基酸序列进行分析的结果。

图5-2显示了使用脉冲液相方法对咖啡金黄水母中纯化出的粘蛋白型糖蛋白的氨基酸序列进行分析的结果。

图6-1显示了海月水母中纯化出的粘蛋白型糖蛋白的单糖分析结果。

图6-2显示了咖啡金黄水母中纯化出的粘蛋白型糖蛋白的单糖分析结果。

图7显示了海月水母中纯化出的粘蛋白型糖蛋白的凝胶过滤(大小排阻)HPLC分析结果。

图8显示了从多种水母中纯化出的粘蛋白型糖蛋白的大小排阻色谱法的分析结果。

图9显示了对海月水母中纯化出的粘蛋白型糖蛋白进行大小排阻色谱法所得的组分，对这些组分再进行分馏。

图10-1显示了使用MALDI-TOF MS方法对各个组分进行分子量测定的结果。

图10-2显示了使用MALDI-TOF MS方法对各个组分进行分子量测定的结果。

图10-3显示了使用MALDI-TOF MS方法对各个组分进行分子量测定的结果。

图11是从海月水母中纯化出的粘蛋白型糖蛋白和普鲁兰的分子量曲线图。

本发明的最佳实施方案

以下将对本发明进行细节性阐述。本发明申请要求2005年8月12日申请的日本专利申请号2005-234108的优先权，包括其说明书和/或附图中所描述的内容。

本发明提供了一种新型的粘蛋白型糖蛋白。粘蛋白型糖蛋白是指一种糖蛋白，其具有包含特定氨基酸序列为单位的重复结构，并具有粘蛋白型糖链(也称作O-连接糖链)。在粘蛋白型糖蛋白中，N-乙酰半乳糖胺通常以O-糖苷键结合到蛋白质中丝氨酸或苏氨酸残基的羟基上，或单糖结合到N-乙酰半乳糖胺上形成糖链。

根据本发明，对粘蛋白型糖蛋白(本发明中的粘蛋白型糖蛋白)的结构和性质描述如下。该粘蛋白型糖蛋白具有包含三个或以上重复单位的重复结构，该重复单位具有如式I(SEQ ID NO：1)所示的氨基酸序列：

Val-Xaa-Glu-Thr-Thr-Ala-Ala-Pro(I)

[其中Xaa代表Val或Ile]。

粘蛋白型糖蛋白是一种高分子化合物，具有不确定的分子量为特征。即使从相同种类的原料并在相同的实验中获得的粘蛋白型糖蛋白，在不同的单个分子中，其重复单位的数目也不同。作为凝胶过滤分析的结果，本发明人分离出的粘蛋白型糖蛋白的分子量为10至1400kDa，该凝胶过滤分析的结果用氨基酸序列分析所得的数值平均进行校正。因此，综合考虑后述的糖链的结构，推定自然界可能存在一种分子量为实验所得的多聚体(具有约3至700个重复单位)的约3倍的聚合体。即使是这样的粘蛋白型糖蛋白也不太可能在物理特性或功能上与小的糖蛋白有很大差别。因此，所估计的重复单位的数目约为3～2000，优选3～700。在此情况下，分子量约为4.5kDa的粘蛋白型糖蛋白的重复单位数目估计约为3，而分子量约为750kDa的粘蛋白型糖蛋白的重复单位数目估计约为40，假定所有苏氨酸(Thr)残基结合到糖链上，且糖链部分大多数是典型的GalNAc-Gal序列。本说明书中，除非有特殊说明，重复单位的数目均基于同样的假设从分子量计算得出。

实验(实施例6)中作为使用MALDI-TOF所得绝对分子量的校正结果，从水母中获得的粘蛋白型糖蛋白的凝胶过滤色谱图显示，总量的50％具有60kDa至270kDa，即40至180个重复单位。类似地，色谱图显示，分子量为90kDa至210kDa，即60至150个重复单位，的组分占总量的30％。

重复单位可直接结合或通过接头结合。例如，接头可以是，但并不限于，半胱氨酸形成的S-S键。

另外，例3和4中所示的分析结果说明分离出的粘蛋白型糖蛋白包含与上述重复结构中的氨基酸不同的氨基酸。然而，以摩尔比来说，数量为5％或更低。这些附加的氨基酸可能来自于杂质，或主要存在于末端，或在重复结构的接合处，作为具有附加功能的部分，例如，可促进膜结合的体内固定功能。因此，本发明的粘蛋白型糖蛋白除重复结构外，可含有不影响其作为粘蛋白的功能(例如，粘性，抗菌性质，和湿润性质)的其他的氨基酸。此外，重复结构中的重复单位可有氨基酸转换(shift)。尤其是如例4所示，从咖啡金黄水母中获得的一种粘蛋白型糖蛋白具有VEXXAAPV的重复单位，它是式I中所示的重复单位转换一个氨基酸而得到的。因此，本发明的粘蛋白型糖蛋白还包括下述的蛋白，即缺失重复结构N端的一个或几个氨基酸，结果使重复单位发生转换的蛋白质。优选地，这种蛋白是重复结构N端的Val缺失的粘蛋白型糖蛋白。

本发明的粘蛋白型糖蛋白中，重复结构中的一个或以上的氨基酸残基结合到由一个或以上的单糖组成的糖链上。结合到糖链上的氨基酸残基并没有特殊限制。优选是苏氨酸残基(Thr)结合到糖链上。例如，在该粘蛋白型糖蛋白中，98～100％的结合到糖链上的氨基酸残基可以是苏氨酸(Thr)。而且，如上所述粘蛋白型糖蛋白是一种高分子化合物，具有不确定的分子量。因此，结合到糖链上的氨基酸残基的数量在不同分子中是不同的。然而，希望重复单位中全部两个苏氨酸残基均结合到糖链上。因此，该粘蛋白型糖蛋白中结合糖链的数目因重复单位数目不同而不同。

对构成糖链的单糖没有特殊限制，只要是在常见的粘蛋白型糖蛋白中存在的单糖即可。举如包括N-乙酰半乳糖胺，半乳糖，N-乙酰葡糖胺，唾液酸，阿拉伯糖，和岩藻糖。优选地，糖链包含N-乙酰半乳糖胺和/或半乳糖。具体而言，优选重复单位中的苏氨酸残基(Thr)结合到N-乙酰半乳糖胺和半乳糖上形成Thr-GalNAc-Gal的结构，或其结合到N-乙酰半乳糖胺上形成Thr-GalNAc的结构。例如，如下式中所示的粘蛋白型糖蛋白：

[其中空心圆圈所代表的Gal可去除]。

糖链包含以线性或分枝状形式连接的1至10个，优选1至8个，最优选1至5个单糖。由于粘蛋白型糖蛋白具有分子量不确定的特性，该粘蛋白型糖蛋白中糖链的数目、类型、结构、大小等在不同的粘蛋白型糖蛋白中有所不同。在一个粘蛋白型糖蛋白所含的糖链也互不相同。如实施例2至6所述，从海月水母和咖啡金黄水母中提取的粘蛋白型糖蛋白进行比较，其具有完全相同的肽链重复部分，只是其糖链部分的构成糖的类型和组成比例有所不同。而且，这些粘蛋白型糖蛋白似乎以相同的目的存在于海月水母和咖啡金黄水母共存的自然界中。由此认为，两种水母中的粘蛋白型糖蛋白在功能上差别不大。因此，糖链结构不会改变粘蛋白型糖蛋白的主要性质，可能是在特异性的精细调控中起作用。因此，糖链部分不同，但具有重复肽链结构的一类粘蛋白型糖蛋白包括在本发明的范围内。

本发明的粘蛋白型糖蛋白的糖链可通过体内的糖基转移酶转化。因此，该粘蛋白型糖蛋白的糖链并不限于上述情况，下述的粘蛋白型糖蛋白同样包含在本发明的范围内，所述的粘蛋白型糖蛋白具有经修饰的糖链、具有包含三个或以上如式I所示的氨基酸序列的重复单位的重复结构，其中上述结构中一个或以上的氨基酸残基结合到由一个或以上的单糖的糖链上。这是因为预期上述的粘蛋白型糖蛋白具有相关的功能和特性。

含有经糖基转移酶修饰的糖链的粘蛋白型糖蛋白，因糖链的修饰而赋予的更高的分子识别能力，可能具有新的用途。因此，本发明提供了一种通过糖基转移酶作用修饰粘蛋白型糖蛋白中糖链的方法。可使用的糖基转移酶的例子包括糖基转移酶，半乳糖基转移酶，N-乙酰半乳糖胺转移酶，唾液酸转移酶，和岩藻糖转移酶。通过糖基转移酶修饰糖链的方法是公知的，实现上述目的的任何方法均可使用。

本发明中的粘蛋白型糖蛋白是一种化合物，其具有粘蛋白型糖蛋白中称做1型核心的Thr-GalNAc-Gal连接，和/或具有简单结构Thr-GalNAc连接。本发明粘蛋白型糖蛋白可作为能够通过已知的酶将其糖链部分转化为所需结构的原材料使用。例如，唾液酸可通过商业所售a2→3NeuAc转移酶的作用结合到半乳糖上，如同正常淋巴细胞中发生的反应。

另外，可通过去掉全部或部分糖链，限制粘蛋白型糖蛋白的作用，提高其特殊的功效，或使其具有新的作用。还可以去除部分附加的糖来提高物质的同质性。本发明提供的糖链修饰也包括从糖链释放特殊的糖。可使用的糖释放酶包括葡萄糖苷酶，半乳糖苷酶，N-乙酰氨基半乳糖苷酶，唾液酸酶，和岩藻糖苷酶等。

将本发明中的粘蛋白型糖蛋白中的糖链转化成所需的糖链可准确调控糖链的分子识别能力，从而可将该粘蛋白型糖蛋白原有的识别能力转化成具有所需特异性和亲和性的分子识别能力。例如，已开发出黏附在细胞和病毒，或由此产生的毒素上的物质，并投入应用。这些物质是将可识别作为糖结合蛋白之一的糖结合性蛋白质，即凝集素，的不同糖链引入到聚苯乙烯等不同的聚合体中形成的(K.Kobayashi，Artificial Complex Sugar Chain Polymer，pp.181-195，K.Kobayashi and S.Shoda ed.，″The Recent Trends of Glycochemistry″(inJapanese)，Part 2，Chapter 2.1，CMC Publishing Co.，Ltd.，2005)。该粘蛋白型糖蛋白还可以具有与这些多聚体物质相似的功能。例如，已知O-157产生的Shiga毒素可与三糖Galα1-4Galβ1-4Glcβ或二糖Galα1-4Galβ1牢固结合。因此，该粘蛋白型糖蛋白可通过与这些糖适量结合而对Shiga毒素具有抗性效果。已知大量糖链具有此种效果。因此，具有识别能力的糖链没有限制。而且，糖链所识别的对象也不受限制，可以是细胞内或细胞外、细胞表面、细胞膜内、病毒内外以及病毒表面存在的糖蛋白(如凝集素)，毒素，试剂等。

本发明还涉及一种具有下述重复结构的蛋白，所述的重复结构包含具有1至2000个式I所示的氨基酸序列的重复单位。该蛋白可通过糖基转移酶，按上述相同的方式结合到糖链上。

本发明中的粘蛋白型糖蛋白是从水母中提取的。水母是指刺胞动物门(Cnidaria)的生物。典型的例子包括海月水母(Aurelia aurita)(Ulmaridae科)，咖啡金黄水母(Chrysaora melanaster)(Pelagiidae科)，Aequorea coerulescens(Owan-kurage水母)(Aequoreidae科)，巨型水母 Nemopilema nomurai(Echizen-kurage水母)(Stomolophidae科)，Charybdea rastoni(Andon-kurage水母)(Carybdeidae科)，海蜇(Rhopilema esculenta)(Bizen-kurage水母)(Rhizostomidae科)，和Chiropsalmus quadrigatus(Habu-kurage水母)(Chirodropidae科)。用于制备本发明中的粘蛋白型糖蛋白的水母优选是那些已经证明对人和动物安全的种类。例如，这样的水母包括但不限于，已用于食品中的海月水母，海蜇，和巨型水母Nemopilema nomurai。水母可以多种形式使用。例如，生的，冷冻的，干的和盐腌制过的水母均可使用。而且，用于提取粘蛋白型糖蛋白的水母，对其所用部位没有特殊限制。例如，表皮，口腔臂，胃，体液等，或冷藏或室温保存所产生的液体组分均可使用。

利用冷冻水母生成粘蛋白型糖蛋白的方法的例子，如图1中所示。首先，将冷冻水母解冻并用水清洗。例如，当使用生的或干的水母时，应用相同方法清洗水母。如需要，利用离心来分离固体物质和液体物质。

随后，用剪刀将水母(固体部分)剪成约0.5mm至2cm的方形块，优选是1cm的方块。这种剪断或破碎的方法应适合所用标本的形态，以及后面过程中所用离心机的性能等。若需要更小的片段，可使用合适的剪断-破碎方法，如自动搅拌器。当样品的表皮开始降解，或柔软的液体部分不新鲜时，优选用丙酮处理进行脱脂和脱水。丙酮处理后，脱水的样品应用水再次膨胀后使用。

当使用体液或冷藏或室温保存所产生的液体组分时，可省略上述步骤直接进入下一步。

接下来将固体样品加入到盐溶液中，进行振摇提取。所用盐溶液包括，但不限于，NaCl，KCl，MgCl₂，CaCl₂，草酸铵，LiBr，EDTA，或中性缓冲溶液(例如，磷酸盐或柠檬酸盐缓冲液)，优选0.2～3.5％NaCl，优选是0.2％NaCl。在此情况下，若水母样品含有大量盐分，所加盐的量也应进行调整，使最终盐浓度在该范围内。提取温度约为2至 25℃，优选4℃。

提取后，将溶液在1000至10000g，优选最大速度10000g，离心5至20分钟，并保持恒温。将乙醇加入到提取液中进行沉淀。将溶液在0至4℃静置过夜，然后将溶液在1000至10000g，优选10000g，离心5至20分钟，并保持恒温。

将所得沉淀物溶解于少量水中，然后将溶液在1000至10000g，优选10000g，离心5至20分钟，并保持恒温。然后移出上清液，并经透析处理进行纯化。所得产物即是粘蛋白型糖蛋白粗提物，随即将其冻干。

在粘蛋白型糖蛋白的纯化过程中，蛋白分离和纯化中常用的生化方法，如有机溶剂分馏法，超滤法，多种电泳法，多种透析法，凝胶色谱法，疏水色谱法，反相色谱法，离子交换色谱法，和亲和色谱法等，可单独或选择性的联合使用。例如，主峰附近的组分可通过离子交换液相色谱法获得，如例2所示纯化所需的粘蛋白型糖蛋白。

优选该粘蛋白型糖蛋白的生成不包括加热步骤。例如，该粘蛋白型糖蛋白的生成在25℃以下进行，优选0至25℃，最优选在4℃。

该粘蛋白型糖蛋白的生成方法是从水母中提取糖蛋白的一种有效的方法，且其优势在于能利用经济的生产方法将大量粘蛋白型糖蛋白引入市场，例如，可使用从水母水产业或海港或捕渔业中得到的水母废物为原料。

通过将本发明中的粘蛋白型糖蛋白和已知的粘蛋白糖蛋白进行对比，很明显的发现，本发明中的粘蛋白型糖蛋白与同样含8个残基重复结构的人粘蛋白型糖蛋白MUC5AC相似，(H.Nakata，Diversityof Mucin and Mucin-type Sugar Chain and Its Meaning：UnderstandableGlycobiology in Post-Genomic Era，Wakaru Jikken-Igaku Series(Understandable Experimental Medicine)(in Japanese)，N.Taniguchi ed.， Chapter 3，Yodosha Co.，Ltd.，2002；K.Hotta，K.Ishihara，Search forAttractiveness of Gastric Mucus：Elucidation of Mucin using NewestApproach(in Japanese)，Medical View Co.，Ltd.，1999)。该人粘蛋白型糖蛋白主要存在于呼吸道和胃粘膜中。蛋白中重复单位的氨基酸序列如式II(SEQ ID NO：2)所示，同时显示的还有本发明中的粘蛋白型糖蛋白的重复单位的氨基酸序列(式I)：

本发明中的粘蛋白型糖蛋白：

Val-Val-Glu-Thr-Thr-Ala-Ala-Pro(I)

(Ile)

人MUC5AC：

Thr-Thr-Ser-Thr-Thr-Ser-Ala-Pro(II)

1 2 3 4 5 6 7 8

对比这两段氨基酸序列，在8个氨基酸残基中，第4，5，7，8位的氨基酸是相同的。在本发明中的粘蛋白型糖蛋白中，只有第4和5位的苏氨酸残基可作为糖链结合位点，而在MUC5AC中，第1，2，3，4，5，6位的氨基酸(Ser或Thr)均可作为糖链结合位点。然而，人MUC5AC，从整体上却含有小量比例的糖。这提示了本发明中的粘蛋白型糖蛋白可以与MUC5AC混合或单独使用作为MUC5AC的替代化合物，因为本发明的粘蛋白型糖蛋白与MUC5AC显示相似的特性，尽管其氨基酸序列和糖链结构有所不同。本发明的粘蛋白型糖蛋白也可作为其他粘蛋白型糖蛋白的替代物。

例如，MUC5AC通常称为“凝胶形成粘蛋白”。其主要功能之一是维持粘膜或粘液的胶状形式。例如，维持胃粘膜的胶状形式和防止胃液损伤胃壁的功能在胃内层的表面具有很重要的作用。本发明中的粘蛋白型糖蛋白还可在水溶液中形成胶状的类似物，因此可用作上述用途的替代物。

本发明的粘蛋白型糖蛋白，因其含8个氨基酸残基的短重复结构而具有如下所述的独特的生理特性，作为一种有用化合物很容易显示其功能。其重复单位中8个残基的一维长度约为4nm，而构成单位的大小约为1nm。因此，该粘蛋白型糖蛋白具有的优势在于，其形成了相对于细胞，病毒和细菌的非常均一的基质环境，约为100nm至1μm。

本发明的粘蛋白型糖蛋白可作为一种组合物。例如，其可混合或稀释或混悬于合适的载体中形成组合物。适合的载体可包括通常使用的盐溶液(如生理盐水)，乳糖，葡萄糖，蔗糖，山梨醇，甘露醇，木糖醇，赤藓糖醇，麦芽糖醇，淀粉，阿拉伯树胶，藻酸盐，明胶，磷酸钙，硅酸钙，纤维素，甲基纤维素，微晶纤维素，聚乙烯吡咯烷酮，水，甲基羟基苯甲酸盐，丙基羟基苯甲酸盐，滑石粉，硬脂酸镁，和矿物油。此外，所述组合物还可包含赋形剂，表面活性剂，分散剂，缓冲液，防腐剂，增溶剂，镇定剂，稳定剂，弹性剂等。

当本发明的粘蛋白型糖蛋白溶于高浓度的盐溶液(如生理盐水)中所形成的组合物用作人粘液替代物时，其可具有以下效果和用途：

(1)补给粘膜本身，例如，增强粘膜的多种(组织保护，湿度保持，润滑等)功能；

(2)治疗中，作为粘液替代物补给由损伤(胃内层的溃疡)等引起的粘液物质的不足；

(3)作为药物释放载体有效地将药物运送到与粘液物质接触的组织；

(4)作为有抗菌作用的人工基质，其能捕获与粘液物质接触的组织中的病毒，细菌和其他感染物。

如上所述，本发明的粘蛋白型糖蛋白在制药领域是一种有效的药物组合物。而且，所述的粘蛋白型糖蛋白还可与蛋白(如胶原蛋白)或碳水化合物(如透明质酸)混合，制备人工细胞外基质的组成物质。所述的人工细胞外基质可用于形成在研发和再生药物中有用的细胞外基质。

由于该粘蛋白型糖蛋白的来源是水母，该粘蛋白型糖蛋白可用作人和动物的食物。因此，该粘蛋白型糖蛋白可用于食物或食品添加剂中，作为食物增稠剂，抗菌包原料，或健康食品。可通过混合，浸渍，涂抹，或喷雾的方法将其加入到食品和食品添加剂中。

另外，已知粘蛋白是一种滋润或抗衰老成分。因此，该粘蛋白型糖蛋白还可用于化妆品中。加入了该粘蛋白型糖蛋白的化妆品包括乳液，奶液，面霜和粉底。如实施例1所示，该粘蛋白型糖蛋白已确定具有和当今化妆品中典型的吸湿滋润成分透明质酸等同的滋润和吸湿能力。

本发明的粘蛋白型糖蛋白可用作合成类似粘蛋白型糖蛋白的起始材料。在使用酶的合成过程或通常的有机合成反应中，重复单位本身(重复一次的肽链)可用作标记来预测引入糖链的产量或通过使用分光计如NMR来确定糖链的引进。

本发明的粘蛋白型糖蛋白具有非常好的粘性。因此，含本发明的粘蛋白型糖蛋白的水溶液可浇铸成膜或树脂形式，这可通过干燥该水溶液铺展成一个薄层或用戊二醛或多羧基酸将糖链部分凝胶化来实现。所得膜或树脂形式的组合物具有非常好的生物亲合能力和生物降解能力，可用于手术后缝合膜，人造骨的表面保护物质，润滑剂等。

如上所述，包含本发明的粘蛋白型糖蛋白的组合物可用于细胞组织保护，皮肤表面保湿，健康促进，药品施用，疾病治疗和预防，抗菌素的应用等。

此外，本发明的粘蛋白型糖蛋白具有以下特性：1)可分离具有大范围分子量分布的粘蛋白型糖蛋白；2)可作为化合物以固态形式稳定贮存；3)根据液相色谱法使用合适的色谱柱通过分馏法可将具有相同的分子量分布和分子分布中值的样品以可再现的方式纯化；4)可通过MALDI-TOF MS测定具有单一分子量的分馏样品的绝对分子量。具有不同的分子量分布和分子分布中值的组分可作为分子量标记物。

用作分子量标记物的粘蛋白型糖蛋白优选从多种水母或水母的多个部位提取。例如如实施例7中所示，从Echizen-kurage水母(Nemopilema nomurai)表皮中获得的粘蛋白型糖蛋白具有非常宽的分子量分布。因此，粘蛋白型糖蛋白可从Nemopilema nomurai的表皮中分离出，从而制备分子量范围很大的分子量标记物。

包含本发明的粘蛋白型糖蛋白的分子量标记物可按如下方法制备：如上所述分离粘蛋白型糖蛋白，然后在适当条件下用合适的色谱柱(见实施例7)进行大小排阻色谱法(SEC)尽可能准确地分离每个洗脱时间的馏分。有经验的技术人员根据待制备的标记物的所需分子量范围适当地决定包括所用色谱柱，洗脱液的成分和流速，和柱温的洗脱条件。

收集、纯化各馏分。可通过适当组合各种已知的纯化方法进行纯化。例如，优选用透析法进行脱盐处理。纯化后可将具有单一分子量的粘蛋白型糖蛋白部分冻干并作为固体使用。该固体样品优选在4℃左右冷藏。然后，对各粘蛋白型糖蛋白部分用MALDI-TOF MS等方法测定其绝对分子量(见实施例8)。

该分子量标记物包括很宽范围的分子量，如实施例6和7所示。尤其是，本发明可制备分子量约为10至1400kDa的分子量标记物。所制备的粘蛋白型糖蛋白部分的分子量可通过调整大小排阻色谱法分馏步骤中的洗脱时间来确定。例如，馏分可如实施例8所示分馏而制备分子量标记物，其分子量分布约为8至15kDa(中值：11kDa)，15至25kDa(中值：19kDa)，28至38kDa(中值：32kDa)，45至55kDa(中值：49kDa)，70至100kDa(中值：86kDa)，和80至150kDa(中值：110kDa)以及其他不同的中值。

本发明的该分子量标记物用于未知物的分子量测定时，可按常用分子量标记物的方式进行处理。在此情况下，优选联合使用具有复数分子量的分子量标记物。该分子量标记物适合用于蛋白质分子量测定和蛋白质分离等常用的生化方法中，例如，多种电泳法赫色谱法(例如，SEC)。特别是，将该分子量标记物溶解于用于固体样品的洗脱溶剂中，在适当的洗脱条件下进行大小排阻色谱法(SEC)测定。包括所用色谱柱，洗脱液的成分和流速和柱温的洗脱条件随待测未知样品性质的不同而变化，其可由有经验的技术人员可适当地确定。

在测定结果的基础上，用分子量标记物的绝对分子量和洗脱时间绘制校正曲线。在此程序中，分子量标记物的分子量优选在特定范围内，该范围能建立下列关于分子量和洗脱时间(洗脱体积)的理论关系：

log(分子量)＝A-B×洗脱时间(洗脱体积)

[其中A和B为正数]。

然后，未知样品可用该校正曲线(分子量和洗脱时间的关系)进行测定。

如实施例3所示，该分子量标记物在绝对值上与传统使用的普鲁兰有约3倍的不同。通常情况下，MALDI-TOF MS的结果更可靠。因此，至少在已测定出糖蛋白的分子量分布的情况下，才可以说使用上述的分子量标记物进行测定更为准确。而且，此结果与结合了氨基酸序列分析中的Edman降解效率后所确定的数值具有很好的一致性。

如上所述，包含在该分子量标记物中的粘蛋白型糖蛋白是一种含有结合的糖链的肽链的蛋白，因此是一种分枝多聚体。另一方面，传统的分子量标记物是合成多聚体，是没有分枝的线性多聚体。由于线性多聚体与分枝多聚体在流体力学半径或形状上不同，本发明的分子量标记物能更准确地测定传统的分子量标记物的合成线性多聚体很难对其准确测定的分枝多聚体(例如，糖蛋白)的分子量。

下面通过实例对本发明进行详细描述。然而，本发明的技术范围不限于这些实例。

实施例1

根据本发明，可根据下列方法从海月水母和咖啡金黄水母中提取作为新型粘蛋白型糖蛋白前体的粗粘蛋白，如图2所示：

1)解冻并用水清洗冷冻的整个水母，离心分离固体物质和液体部分；

2)剩下的固体部分用剪刀切成约5mm至1cm的方块。

3)切割后的片段用丙酮处理进行脱脂和脱水，然后浸水再次膨胀；

4)将固体样品加入0.2％NaCl水溶液中并在4℃振摇提取；

5)将步骤4所得的溶液在4℃以10000g的速度离心15分钟；

6)向步骤5所得的提取液中加入3倍体积的乙醇，使沉淀成胶体状；

7)将步骤6所得的溶液置于冰箱中静置过夜，然后在4℃以10000g离心15分钟；

8)从步骤7所得的沉淀物溶于少量水中，将此溶液在4℃以10000g离心15分钟；

9)移出从步骤8所得的上清液，并将其透析纯化，冻干制成粗粘蛋白；

10)对从步骤8所得的沉淀物，以适当次数重复操作步骤7和8，从而获得粗粘蛋白。

实施例2

对从实施例1中获得的两种水母中提取的粗粘蛋白进行离子交换液相色谱分析，纯化图3中所示的标有星号的色谱峰得到高纯度的粘蛋白型糖蛋白。

所用色谱法的条件如下所示：

TSK gel DEAE-ToyoPearl 650M 25mm i.d.×150mm

A：10mM NaPi，pH 7

B：0.5M NaCl/10mM NaPi，pH 7

流速2ml/min，监测器UV(215nm)

梯度0-60min(％B：0-100)

样品：海月水母

5ml(2mg/ml粗粘蛋白/10mM NaPi溶液)

咖啡金黄水母

1.3ml

实施例3

将实施例2中纯化的化合物用自动氨基酸分析仪进行氨基酸分析。每一个如上所述经离子交换色谱法纯化并透析的样品(每个约为12μg)移入水解试管中，并用离心蒸发器蒸发至干。将干燥的样品置于含有持续沸腾的盐酸(5.7N)的外层套管中，并减压密封。用气相法在110℃水解20小时。

打开外层套管，用同样方法干燥水解管。干燥的水解产物溶于100μl的0.02N盐酸中。用高速氨基酸分析仪L-8500A(Hitachi Ltd.生产)对水解产物进行氨基酸分析。根据厂商(Hitachi Ltd.)提供的具体的氨基酸分析方法，用离子交换色谱柱，以5种缓冲溶液对水解产物中的氨基酸进行分离。分离的氨基酸以柱后法与水合茚三酮反应，并用两个波长的可见光进行检测。基于对2nmol的标准氨基酸混合物，葡萄糖胺和半乳糖胺进行分析所得的数值，可用570nm色谱图对氨基糖和正常的氨基酸进行定量，用440nm色谱图对脯氨酸进行定量。

图4显示了氨基酸组成分析的结果。如图4中所示的氨基酸浓度比，在海月水母和咖啡金黄水母中，粘蛋白型糖蛋白的肽部分的组成为：苏氨酸(Thr)：谷氨酸(Glu)：脯氨酸(Pro)：丙氨酸(Ala)：缬氨酸(Val)+异亮氨酸(Ile)：N-乙酰半乳糖胺(GalNAc)的比例为2∶1∶1∶2∶2∶2，误差均在10％内。而且，丝氨酸或其他氨基酸的浓度比例只有约0.05％。因此，其可能来源于杂质或末端结构，与粘蛋白型糖蛋白的重复结构无关。

实施例4

在本实例中，将使用Applied Biosystems Procise 494 HT用脉冲液相法分析实例2中纯化的蛋白(每个为1.8μg)，并标示每个循环中PTH氨基酸的量。

图5显示了从两种水母中提取的粘蛋白型糖蛋白的氨基末端的氨基酸序列分析结果(图5-1显示海月水母的结果；图5-2显示咖啡金黄水母的结果)。图5-1中，有实心方块的交替长短虚线表示缬氨酸(Val)；虚线表示谷氨酸(Glu)；有空心方块的线表示丙氨酸(Ala)；有空心圆圈的链状双虚线表示脯氨酸(Pro)；有实心圆圈的线表示异亮氨酸(Ile)。用自动蛋白氨基酸序列分析仪分析了三十个残基。结果为，发现3.75个从N端开始，包含Val-Val(Ile)-Glu-X-X-Ala-Ala-Pro(X代表未知氨基酸)的重复结构的循环。这说明，粘蛋白型糖蛋白包含VVEXXAAP(有些情况下是VIEXXAAP)的重复序列。而且，从实例3的结果推测，X可能是苏氨酸。这种含八个残基重复氨基酸序列的粘蛋白是一种无法从蛋白质数据库中搜索到的蛋白，迄今为止尚未发现。因此这是一种新型蛋白。

此外，假设早期产量约为30pmol，Edman降解的早期产量为50％，则所得的粘蛋白型糖蛋白相当于60pmol。因此，重复单位的数目(肽链部分的分子量约为768，若包括后面所述的糖链，则分子量约为1500)约为40。由该数值确定的60kDa的分子量可视为均值分子量。

N末端的VEXXAAPV(有些情况下是IEXXAAPV)重复单位是从咖啡金黄水母中获得的(图5-2)。除了缺失第一个残基，其与从海月水母中获得的重复单位是相同的。这些重复单位本质上没有区别。

实施例5

如上所述用离子交换色谱法纯化并透析的每个样品(约6μg)移入反应管中，用离心蒸发机蒸发至干。加入酶，然后用4M的三氟醋酸在100℃水解3小时，其中所含的唾液酸转化成游离的还原糖。N-乙酰化后，荧光标记(ABEE)样品，随后用Honen Pak C18色谱柱(75mm×4.6mm i.d.)，以混合溶剂0.2M硼酸钾缓冲溶液(pH 8.9)/乙腈(93∶7)进行分离。在荧光305nm波长进行检测。以同法处理的11种单糖标准混合物的色谱图为基础，对单糖组分比进行定量。

图6-1显示了海月水母的结果；图5-2显示了咖啡金黄水母的结果。

图6-1所示的，根据海月水母中粘蛋白型糖蛋白的单糖组分分析而估测出的单糖结果显示如下：

(交替的长短虚线) (虚线)

半乳糖 0.6nmol 0.9nmol

N-乙酰半乳糖胺 0.8nmol 1.2nmol

由这些分析结果认为，肽重复单位中的两个苏氨酸分别结合N-乙酰半乳糖胺，其全部或部分与半乳糖结合。假设其中未结合其他糖，糖链部分的分子量为730。因此，所估测的单位糖蛋白的分子量约为1500(含糖量约为50％)。

另一方面，图6-2中所示的咖啡金黄水母中粘蛋白型糖蛋白的单糖组分分析没有标准品，且涉及无法识别的未知糖。因此，所有糖中单糖的比例是未知的。从该分析中估测的已知单糖的浓度如下所示：

(虚线)

半乳糖 0.7nmol

N-乙酰半乳糖胺 0.8nmol

实施例6

取0.05ml(1mg/ml纯化的新型粘蛋白/0.1M NaPi溶液)的海月水母粘蛋白型糖蛋白样品，在Shodex SB-806HQ上进行凝胶过滤(大小排阻)HPLC分析，洗脱液：0.1M NaPi，pH 7；流速：0.5ml/min；检测器UV(215nm)&RI。普鲁兰用作分子量标记物。

分析结果显示在图7中。结果说明，峰分子量约为450kDa(图7A)。而且，从色谱图中计算出的数均和重均分子量分别约为180kDa和约500kDa。(图7B)。在凝胶过滤中使用普鲁兰为标准物质，分子量分布显示为10至1400kDa。

凝胶过滤法确定的数均分子量约为180kDa，这是氨基酸序列分析估测出的60kDa分子量的3倍。用两种最可靠的测定方法进行多聚体糖链化合物的分子量测定。然而，这两种方法所得的绝对值会也会产生数倍的误差。这样的误差视为现今技术通常发生的错误范围内，在多聚体糖链化合物的分子量测定中是不可避免的。考虑到相对测定中所用的标准物质(普鲁兰)的适合性问题，基于氨基酸序列分析所得的重复单位数目的、数均分子量的绝对值似乎比凝胶过滤法的结果更准确。在此情况下，氨基酸序列分析能确定准确分子量的绝对值，但不能确定分子量分布，而凝胶过滤法只能测定分子量分布，而这只是相对值。这可通过包括实施例7和9的下列步骤来确证。

凝胶过滤法测定的分子量分布可用实施例9中所示的使用MALDI-TOF的方法将其换算成绝对值。在本说明书中，该方法作为确定分子量的参考测定方法使用。MALDI-TOF测定的分子量数值与氨基酸序列分析估测出的分子量一致。这两种方法测定的数均分子量的比率((以普鲁兰为标准测定的分子量)/(MALDI-TOF方法测定的分子量)＝约为3)对全部分子量有效。用该数值校正后，峰分子量约为150kDa；重均分子量为170kDa；色谱法所得的峰分子量的上限为470kDa。相应的氨基酸序列的重复数目：对应峰值是100，对应重均分子量是110，对应分子量上限是700。

此外，色谱图显示，总量的50％在60至270kDa范围内(校正后)，峰分子量为150kDa，总量的30％在90至210kDa范围内(校正后)。即说明总量的50％具有40至180个重复单位，总量的30％具有60至150个重复单位。

实施例7

在本实例中，将从多种水母中提取的粘蛋白型糖蛋白进行大小排阻色谱分析(SEC)。

使用与实例1中相同的方法从水母中提取粘蛋白型糖蛋白。色谱条件如下所示：

色谱柱：TSK gel G5000PW_XL

洗脱液：0.1M醋酸铵水溶液

流速：0.5ml/min

样品浓度：0.3至0.9mg/ml

结果如图8所示。图8中的结果说明了从水母中提取的粘蛋白型糖蛋白具有广泛的分子量分布。特别是，从Echizen-kurage水母(Nemopilema nomurai)的伞表面(表皮)提取的粘蛋白型糖蛋白比其他糖蛋白具有较低的分子量和更广泛的分子量分布。

实施例8

实例7中，从海月水母中提取的粘蛋白型糖蛋白通过SEC分馏成图9所示的各个馏分，并进行MALDI-TOF质谱分析。使用BrukerDaltonics生产的Reflex设备，用反吲哚-3-丙烯酸为基质，以线性方式进行MALDI-TOF MS操作。

结果如图10所示。在图表中，标题部分描述的M+两位数代表图9中的组分号。因在每个组分中得到一个清晰的峰，可以此来确定分子量。特别是，图10中，根据目测计算，分子量分布(及其中值)为：M28部分约为8至15kDa(中值：11kDa)；M26部分约为15至25kDa(中值：19kDa)；M24部分约为28至38kDa(中值：32kDa)； M22部分约为45至55kDa(中值：49kDa)；M20部分约为70至100kDa(中值：86kDa)；M19部分约为80至150kDa(中值：110kDa)。

实施例9

实例7中，从海月水母中提取的粘蛋白型糖蛋白通过SEC分馏成图9所示的各个馏分。实例8中通过MALDI-TOF MS测定的分子量绘制成曲线图。普鲁兰的测定结果也绘制成曲线图作为对照。

结果如图11所示。在图11中，粘蛋白型糖蛋白的结果(实心方块)下方显示的数字表示图9中的组分号。该结果说明了，从水母中提取的粘蛋白型糖蛋白和普鲁兰均有很好的线性关系，而其绝对值约有3倍的差异。因此，这提示了该粘蛋白型糖蛋白可通过上述分馏法用作分子量标记物，尤其是在高分子化合物如糖蛋白的分子量测定中。

实施例10

测定本发明中的粘蛋白型糖蛋白的吸湿性和滋润性。吸湿性按如下方法测定：从海月水母中纯化的粘蛋白型糖蛋白在含硅胶的干燥器中干燥至恒定重量，取20mg置于称量瓶中，并放置在干燥器中，该干燥器的相对湿度(RH)用饱和硫酸铵水溶液调节至79％(25℃)。经时测定样品的增重，增重的量显示为吸水的量。结果如下面表1所示。

另一方面，滋润性按如下相似方法测定：从海月水母中纯化的粘蛋白型糖蛋白在含硅胶的干燥器中干燥至恒定重量，取20mg置于称量瓶中，加入10％的水后，放置在干燥器中，该干燥器的相对湿度(RH)用饱和氢氧化钠水溶液调节至49％。24小时后测定样品的失重，计算保留的水分的量。结果如下面表1所示。

这两种测定值以透明质酸为标准物质确定为相对数值，透明质酸具有很高的吸湿性和滋润性，在化妆品中用作滋润成分。

表1

^*结果显示为与透明质酸的相对数值，名义分子量300kDa设为1.0.

吸湿性的结果说明了，本发明中纯化的粘蛋白型糖蛋白的吸湿性约为透明质酸的三倍，具有非常好的短期吸湿性。

滋润性的结果说明了，本发明中纯化的粘蛋白型糖蛋白的滋润性在相对湿度(RH)为49％或更低的低湿度条件下，约为透明质酸的60％，而透明质酸具有非常高的滋润性。

本说明书中引用的所有文献、专利和专利申请在此全部归入参考文献。

工业实用性

本发明提供了一种新型粘蛋白型糖蛋白。例如，粘蛋白型糖蛋白可用于化学结构已准确鉴定的人粘蛋白的替代物，也可应用于制药、农业和食品领域。此外，粘蛋白型糖蛋白易从水母中大量制备，因此从经济和环保角度来看具有很大意义。

另外，本发明提供了含粘蛋白型糖蛋白的分子量标记物。分子量标记物有从天然多聚体中获得的分枝状多聚体链。该分子量标记物的使用可对分枝状多聚体，如糖蛋白，的分子量进行准确测定。

Claims

1.一种具有重复结构的粘蛋白型糖蛋白，其中所述重复结构包含3至2000个重复单位，每个重复单位具有如式I所示的氨基酸序列：Val-Xaa-Glu-Thr-Thr-Ala-Ala-Pro(I)，式中，Xaa代表Val或Ile，上述结构中的一个或以上的氨基酸残基与由一个或以上单糖组成的糖链结合。

2.权利要求1所述的粘蛋白型糖蛋白，其中粘蛋白型糖蛋白具有包含3至700个重复单位的重复结构。

3.权利要求1所述的粘蛋白型糖蛋白，其中粘蛋白型糖蛋白具有包含40至180个重复单位的重复结构。

4.权利要求1所述的粘蛋白型糖蛋白，其中重复单位直接结合或通过接头结合。

5.权利要求1所述的粘蛋白型糖蛋白，其中与糖链结合的氨基酸残基是苏氨酸(Thr)。

6.权利要求5所述的粘蛋白型糖蛋白，其中98％或以上与糖链结合的氨基酸残基是苏氨酸(Thr)。

7.权利要求1所述的粘蛋白型糖蛋白，其中糖链包含选自：N-乙酰半乳糖胺，半乳糖，N-乙酰葡糖胺，唾液酸，阿拉伯糖以及岩藻糖的单糖。

8.权利要求7所述的粘蛋白型糖蛋白，其中糖链包含N-乙酰半乳糖胺。

9.权利要求7所述的粘蛋白型糖蛋白，其中糖链包含N-乙酰半乳糖胺和半乳糖。

10.权利要求1所述的粘蛋白型糖蛋白，其中重复结构N端的一个或几个氨基酸缺失。

11.权利要求1所述的粘蛋白型糖蛋白，其中该粘蛋白型糖蛋白是从水母提取的。

12.一种制备粘蛋白型糖蛋白的方法，包含下列步骤：

剪断水母的固体部分；

用盐溶液提取水母的切断部分；

用离心和透析法从提取物中分离粗粘蛋白；

用乙醇提取粗粘蛋白；

通过离心分离从提取获得的沉淀物；

将沉淀物溶解于水中；

通过离心和透析分离上清液；和

纯化粘蛋白型糖蛋白，

其中，所有的步骤在0-25℃下进行。

13.一种组合物，其包含权利要求1至11中任一项所述的粘蛋白型糖蛋白。

14.权利要求13所述的组合物，其为水溶液，膜或树脂的形式。

15.权利要求13所述的组合物在制备用于细胞和组织保护，皮肤表面的水分保持或吸收，健康促进，药品施用，疾病的治疗或预防，或抗菌素的使用的药物组合物中的用途。

16.一种修饰粘蛋白型糖蛋白的方法，其包括用糖基转移酶的作用于权利要求1至11中任一项所述粘蛋白型糖蛋白的糖链，对其进行修饰。

17.一种具有重复结构的蛋白，每个重复结构含1至2000个重复单位，每个重复单位具有如式I所示的氨基酸序列：

a)Val-Xaa-Glu-Thr-Thr-Ala-Ala-Pro(I)式中，Xaa代表Val或Ile。

18.一种制备糖蛋白的方法，其特征为，在权利要求17所述的蛋白中至少一个氨基酸残基与由一个或以上单糖组成的糖链结合。

19.一种含粘蛋白型糖蛋白的分子量标记物，含有通过绝对分子量测定方法测定的分子量分布和分子分布中值，该粘蛋白型糖蛋白具有重复结构，每个重复结构包含3至2000个重复单位，每个重复单位具有如式I所示的氨基酸序列：Val-Xaa-Glu-Thr-Thr-Ala-Ala-Pro(I)，式中Xaa代表Val或Ile，上述结构中的一个或以上的氨基酸残基与由一个或以上单糖组成的的糖链结合。

20.权利要求19所述的分子量标记物，其中该分子量标记物的分子量为10至1400kDa。

21.权利要求19或20所述的分子量标记物，其中该分子量标记物为冷冻干燥物。

22.一种制备分子量标记物的方法，该方法包括下列步骤：将粘蛋白型糖蛋白用大小排阻色谱法进行分馏，所述粘蛋白型糖蛋白具有重复结构，每个重复结构包含3至2000个重复单位，每个重复单位具有如式I所示的氨基酸序列：Val-Xaa-Glu-Thr-Thr-Ala-Ala-Pro(I)式中Xaa代表Val或Ile，上述结构中的一个或以上氨基酸残基与由一个或以上单糖组成的糖链结合；收集和纯化所得的馏分；测定纯化后馏分的绝对分子量。

23.权利要求22所述的方法，其进一步包括冻干纯化后的馏分的步骤。