CH678918A5

CH678918A5 -

Info

Publication number: CH678918A5
Application number: CH819/89A
Authority: CH
Inventors: Nagy Peter Dr Literati; Maria Dr Boros; Jenoe Dr Szilbereky; Istvan Dr Racz; Gyoengyver Dr Soos; Miklos Dr Koller; Alan Dr Pinter; Gabor Nemeth
Original assignee: Biorex Kft
Priority date: 1988-03-09
Filing date: 1989-03-06
Publication date: 1991-11-29
Also published as: DE3907649C2; CA1334576C; GB2216418A; FI891145A0; BE1002890A3; SE8900828D0; KR890014103A; FI891145A; HUT60432A; GB8905385D0; NL8900574A; SE8900828L; FI94591C; HU209973B; FI94591B; FR2628324A1; GB2216418B; JPH01316316A; DE3907649A1; LU87471A1

Description

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Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein antivirales und/oder (immunstimulierendes Präparat und ein Verfahren zu seiner Herstellung.

Die mehrfach ungesättigten o>-3-Fettsäuren, wie 5,8,11,14,17-Eikosapentaensäure (im folgenden: EPA) und die 4,7,10,13,16,19-Dokosahexaensäure (im folgenden: DHA) haben, wie schon mehrfach beobachtet wurde, eine Wirkung gegen Viren. In seinen in vitro vorgenommenen Versuchen zeigte Szads (Antimicrobial Agents and Chemotherapy 12, 523 [1977]), dass diese Fettsäuren fähig sind, die Replika-tion der Viren zu verhindern. Diese Tatsache wurde von Reinhardt et al. (J. of Virology 25, 479 [1978]), die die Replikationshemmung an dem Bakteriophagen PR4 untersuchten, bestätigt.

In der US-PS 4 513 008 ist die antivirale Wirkung der mehrfach ungesättigten Fettsäuren, darunter auch die der EPA und der DHA, ausführlich beschrieben. In Tierversuchen mit Mäusen und Meerschweinchen wurde die Wirkung von EPA und DHA mit der Wirkung des gegenwärtig am häufigsten angewendeten antiviralen Mittels, des «Acyclovirs [9-(2-Hydroxyäthoxymethyl)-guanin], verglichen. Es konnte gezeigt werden, dass insbesondere die DHA enthaltenden Präparate gegen Herpesviren vorteilhafterwaren als das Acyclovir.

In der Fachliteratur befassen sich noch zahlreiche Artikel mit der antiviralen Wirkung von DHA und EPA, zum Beispiel Whitaker et al. (Proc. Nati. Acad. Sei. USA. 76. 5919 [1979]) sowie Goodnight et al. (Arterïosclerosis 2,87 [1982]) und Yoshiaki (Biochimica et Biophysica Acta 80,793 [1984]).

Prickett et al. (Immunologi 46, 819 [1982]) zeigten, dass die Eikosapentaensäure als ein Analoges der Arachidonsäure die humorale Immunantwort stimuliert. Die auf Eialbumin einsetzende spezifische IgG-und IgE-Produktion in Sprague-Dawley-Ratten (Inzucht) steigt bei Verabreichung EPA-reicher Diät auf den 4-8fachen Wert der Kontrolle an. Gemäss dem Artikel induziert die EPA-reiche Diät eine angestiegene Antikörper-Antwort Die Untersuchungen zeigten weiterhin, dass die EPA ihre Wirkung über die Hemmung des suppressiv wirkenden Prostaglandin-Systems ausübt, d.h. fähig ist, die Altersimmunschwäche und sonstige krankhafte Prozesse (autoimmune Prozesse, Tumorgenese) zu hemmen beziehungsweise zu korrigieren. Diese Feststellungen werden auch durch die Arbeiten von Kelley et al. (J. of Imnunol. 134.1914 [1985]) und Homey et al. (Clin. Exp. Immunol. 65,473 [1986]) gestützt.

Seit langem ist durch die in vivo vorgenommenen Untersuchungen von Pearson et al. (Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 79, 409 [1952]) bekannt, dass 1-Lysin auf das Virus der Encephalomyelitis hemmend wirkt. Später fand Tankersley (J. Bact. 87, 609 [1964]), dass Lysin unter in vitro Bedingungen in menschlichen Zellen die Replikation des Herpes simplex Virus (HSV) verhindert. Kagan zeigte 1974 auf Grund seiner an Menschen vorgenommenen Versuche, dass die durch oralen wie auch durch genitalen Herpes Simplex verursachten Läsionen durch eine Behandlung mit 1-Lysin sehr schnell verschwinden (The Lan-ceti, 137 [1974]).

Griffith et al. (Dermatologica 156. 257 [1978]) untersuchten unter Einbeziehung von 45 Patienten die therapeutische Wirkung des 1-Lysins in unterschiedlichen Dosen, während verschieden langer Behandlungszeiten an mit HSV I und HSV II infizierten Kranken. Das Alter der Patienten (in erster Linie Frauen) lag zwischen 8 und 60 Jahren. Die Autoren stellten fest, dass das 1-Lysin auf HSV nur supprimie-rend wirkt, jedoch nicht heilt.

Ziel der Erfindung war die Bereitstellung eines Arzneimittelpräparates neuartiger Zusammensetzung, das die günstigen pharmakologischen Wirkungen der ra-3-ungesättigten Fettsäuren und gewisser essentieller Aminosäuren, insbesondere des Lysins, Ornithins und Histidins, in sich vereint und stärker wirkt als alle bisher bekannten antiviralen Mittel.

Die Erfindung beruht auf der Erkenntnis, dass die getrennt bereits bekannten günstigen antiviralen Wirkungen der o-3-ungesättigten Fettsäuren, insbesondere EPA und DHA, und der Aminosäuren, insbesondere Lysin, sich in einem aus diesen Komponenten gebildeten Gemisch synergistisch verstärken und das Gemisch auch eine immunstimulierende Wirkung zeigt.

Gegenstand der Erfindung ist demnach ein antivirales und/oder immunstimulierendes Präparat, das als Wirkstoffe im Molverhältnis 1:4-4:1 im lebenden Organismus vorkommende Aminosäuren und/oder deren Ci-C4-Alkylester oder Amide, femer deren Hydrate und/oder Salze, vorzugsweise Alkali-, Erdalkali- oder Ammoniumsalze, und eine oder mehrere, wenigstens zwei Doppelbindungen enthaltende Fettsäuren der Kettenlänge C18-C24 und gegebenenfalls die in der Arzneimittelindustrie üblichen Trägerund sonstigen Hilfsstoffe enthält.

Als im lebenden Organismus vorkommende Aminosäuren kommen zum Beispiel Taurin, Cycloserin, Ho-moserin, Homocystein, Kanavanin, Sarkosin, Hydroxyprolin, Hydroxylysin, p-Hydroxyphenylalanin und essentielle Aminosäuren in Frage. Als Substituenten der Carboxylgruppe sind das Natrium- und das Kaliumion bevorzugt.

Die Fettsäurekomponente der erfindungsgemässen Komposition besteht vorzugsweise aus wenigstens zwei Doppelbindungen enthaltenden œ-3-Fettsâuren der Kettenlänge C18-C24. Besonders bevorzugt ist es, diese ungesättigten Fettsäuren mit basischen Aminosäuren zu vermischen. Als essentielle Aminosäuren kommen insbesondere Lysin, Histidin, Ornithin beziehungsweise deren Derivate in Betracht.

Das Präparat wird in an sich bekannter Weise durch Vermischen der Komponenten hergestellt. Als gegebenenfalls einsehbare Streck-, Träger- und Hilfsstoffe können die in der Arzneimittelherstellung

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üblichen Stoffe, zum Beispiel Lactose, Stärke und Magnesiumstearat verwendet werden. Bevorzugte Hilfsstoffe sind die Antioxydantien. Um eine Oxydation des Präparates zu verhindern, werden als aktives Haltbarkeitsmittel zweckmässig a-Tokoferol (Vitamin E), Glutathion oder herkömmliche Antioxydantien, zum Beispiel Butylhydroxytoluol, verwendet.

5 Die Wirksamkeit und die auf Zellkulturen eventuell ausgeübte Toxizität wurden an Hand der auf Vermehrung und Morphologie von Hep-2-Zellkulturen (epitheliale Tumorzellinie menschlichen Ursprungs) ausgeübten Wirkung untersucht. Die untersuchten Präparate bestanden aus einem Gemisch ca-3-unge-sättigter Fettsäuren (das 27,6% EPA und 44,6% DHA enthielt) und 1-Lysin in den Molverhältnissen 1:1, 1:4 und 4:1. Zur Durchführung der Versuche dienten Gewebekulturplatten aus Kunststoff, von denen 10 jede 6x4 Vertiefungen mit je 1,9 cm2 Grundfläche aufwies.

Aus den Testsubstanzen wurden mit Eagle MEM Medium (Hersteller: Serva GmbH, Heidelberg, BRD) Stammlösungen der Konzentration von 10 mg/ml hergestellt. Der klare Überstand der Stammlösung wurde zunächst auf das Doppelte verdünnt Mit den erhaltenen Lösungen wurde die doppelte Verdünnung noch zweimal wiederholt, wodurch die in der folgenden Tabelle zusammengestellten Lösungen sinkender 15 Konzentration entstanden (Lösungen 1-5). Die Zellkulturen wurden mit je 1 ml Lösung behandelt

Lösung Wirkstoffgehalt

Nr. ' ; |ig/ml

10000 1000 500 250 125

Die Einwirkungszeit betrug eine Stunde, dann wurden die Kulturen mit gepufferter Salzlösung (phosphate buffer saline, PBS) zweimal gewaschen. Dann wurde Nährflüssigkeit zu den Kulturen gege-30 ben. flach 24 Stunden wurde mit Methanol fixiert, dann wurden die Kulturen mit 4%iger äthanolischer Giemsa-Lösung (Hersteller: Reanal, Budapest, Ungarn) angefärbt, und die Morphologie der Zellen wurde mit einem Lichtmikroskop untersucht. Es erwies sich, dass alle Testsubstanzen erst in einer Konzentration von mehr als 1000 ng/ml toxisch sind.

Die Hemmwirkung auf die Virenvermehrung wurde auf die oben beschriebene Weise an Hep-2-Zellen 35 untersucht. Zur Infektion wurde das Virus Herpes simplex I in einer Konzentration von annähernd 1000 PFU (plaque forming unit) verwendet. Aus den Testsubstanzen wurden Lösungen der Konzentrationen von 1000, 500 und 250 ng/ml bereitet, und diese wurden in einer Menge von jeweils 0,1 ml zu der unverdünnten Virensuspension gegeben. Die Ansätze wurden bei 37°C eine Stunde lang inkubiert. Dann wurden die Zellen mit dem zusammen mit den Testsubstanzen vorinkubierten Virus behandelt, und die cyto-40 pathologischen Veränderungen wurden 7 Tage lang beobachtet.

Es wurde festgestellt, dass die Testsubstanzen in Konzentrationen von 500 und 250 (ig/ml die Vermehrung des Virus unmittelbar hemmen, der auf 0,1 ml bezogene negative Logarithmus der cytopathologi-schen Dosis (neg. log. CPDso) betrug 1,75-2,04, während der neg. log. CPDso der unbehandelten Kon-trollvirenkultur bei 4,5 lag. Bezogen auf die Kontrolle übersteigt der Wert der Virushemmung zwei Grös-45 senordnungen. Unter den gleichen Bedingungen zeigten EPA und DHA keine wahrnehmbare Hemmwirkung, während Lysin für sich die Replikation des Virus zwar hemmte, diese Hemmwirkung jedoch nur etwa eine Grössenordnung ausmachte.

In auf die gleiche Weise vorgenommenen in vitro Versuchen wurde auch das Vaccina-Virus behandelt. Der auf die angegebene Weise ermittelte infektive Titer (neg. log. CPDso) des behandelten Virus 50 betrug 1,75-2,15, der des unbehandelten Kontrollvirus 5,5, d.h. die Testsubstanz hemmte die Virusvermehrung bezogen auf die Kontrolle um drei Grössenordnungen.

Die auf das Immunsystem ausgeübte Wirkung des erfindungsgemässen Präparates wurde in vitro an Hand der Aktivierung von Lymphozyten durch polyklone Mitogene an der Blast-Transformation der Lymphozyten untersucht Eine mittels des Fico-Uromiro-Gradienten (Scand. J. Clin. Lab. Invest. 21. 97 55 [1968]) gewonnene Lymphozyten-Zellpopulation wurde in die Vertiefungen flacher Platten pipettiert, und zu jeder der parallelen Kulturen wurden 25 ng/ml Concanavalin A (Con. A, Hersteller: Pharmacia, Upp-sala, Schweden) und dann die 0,1,1,0 beziehungsweise 10 ng/ml Wirkstoff enthaltenden Lösungen der Testsubstanzen gegeben. Als Kontrolle diente eine Kultur, zu der nur 25 ng/ml Concanavalin A gegeben wurden. Die Platten wurden bei 37°C in einer 5% COz enthaltenden Atmosphäre 72 Stunden lang inku-60 biert. In der 64. Stunde wurden zu jeder Probe 0,4 p.Ci 3H-Thymidin gegeben. Nach Ablauf der 72 Stunden wurden die Kulturen auf Giasfilter filtriert. Die Filter wurden in Scintillationsküvetten eingebracht und in je 5 ml Toluol, das ein Fluoreszenzmittel enthielt, mit einem die Betastrahlung messenden Zähler untersucht. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.

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Behandlung

Wirkstoffkonzentr. »g/g

Einschläge pro Minute (cpm)

Wirkung

Kontrolle (Con. A)

25

8969 ±2984

A

1-Tyrosin • •

0,1

12 915 ± 2045

+

1,0

12 313 ± 2003

1-Lysin

0,1

11 063 ± 1528

—

1,0

11 833 ±1823

+

Na-Salz des ©-3-Fetlsäuregemischs

0,1

12 332 ±2235

—

(wie in Beispiel 1)

1,0

12 039 ±1640

-

Kontrolle (Con. A)

25

8396 ±2233

—

Komp. Beispiels

0,1

14 605 ±1747

+++

1.0

12010±2285

—

Komp. Beispiel 1

0,1

16 085 ±2063

+++

1,0

14 681 ±1769

-H-

Komp. Beispiel3

0,1

12661 ±1548

++

1,0

12420±1452

++

Komp. Beispiel 4

0,1.

11 920 ±2005

++

1,0

12240±1950

4+

Zeichenerklärung:

—schwache signifikante Abnahme

—nicht signifikant

+ schwacher signifikanter Anstieg

++ signifikanter Anstieg

•H-t- starker signifikanter Anstieg

Aus den Untersuchungen geht hervor, dass die erfindungsgemässen Kompositionen, insbesondere die Gemische mehrfach ungesättigter Fettsäuren zusammen mit Lysin und Tyrosin enthaltenden, eine starke immunstimulierende Wirkung zeigen, während die einzelnen Komponenten, für sich angewendet, entweder keine oder nur eine schwache signifikante Wirkung zeigten.

Als Ausgangsstoff zur Gewinnung der ungesättigten ©-3-Fettsäuren einer Kettenlänge von 0(8-C24 kommen in erster Linie die aus den Fischen der Nordsee, zum Beispiel dem Lachs und dem Dorsch, ferner aus Sardinen beziehungsweise die aus der Leber dieser Fische gewinnbaren Öle in Frage, jedoch können auch Fischöle aus Süsswasserfischen verwendet werden. Aus den Ölen können die ungesättigten «8-3-Fetfsäuren in an sich bekannter Weise (JACS 59, 117 [1982]) gewonnen werden. Diese Fettsäuren werden leicht oxydiert. Deshalb ist es zweckmässig, als Haltbarkeitsmittel Antioxydantien (z.B a-To-koferol, das Vitamin E) zu verwenden.

Die Wirkstoffe der erfindungsgemässen Komposition können in der üblichen Weise zu Tabletten, Kapseln, Dragees oder sonstigen Arzneimittelpräparaten formuliert werden.

Die erfindungsgemässen Arzneimittelpräparate habe folgende Hauptvorteile:

1. Sie enthalten als Wirkstoffe eine Komposition, deren Komponenten schon an sich über eine antivirale Wirkung verfügen, jedoch in Kombination miteinander ihre Wirkungen synergistisch verstärken.

2. Sie können bei akuten Virusinfektionen, besonders vorteilhaft im Falle der Infektion mit Herpes simplex zum Zurückdrängen der im Anfangsstadium befindlichen Infektion verwendet werden.

3. Da sie das Immunsystem stimulieren, können sie auch gegen Retroviren, zum Beispiel gegen das lm-munmangelsyndrom (AIDS), das durch HTLV III und HTLVIV verursacht wird, angewendet werden.

4. Die Präparate enthalten ausschliesslich physiologisch essentielle Wirkstoffe natürlichen Ursprungs, d.h. sie können, falls die Gefahr einer Vireninfektion besteht oder das Immunsystem angegriffen ist, auch über lange Zeit hinweg präventiv oder als Kur verabreicht werden.

5. Sie wirken auch von innen, d.h. von der in der antiviralen Therapie üblichen, unbequemen äusserli-chen Behandlung kann abgegangen werden.

Die Erfindung wird an Hand der folgenden Beispiele näher erläutert, ist jedoch nicht auf diese Beispiele beschränkt.

Beispiel 1

164 g (1 Mol) 1 -Lysin-monohydrat und 320 g (etwa 1 Mol) eines Gemisches aus ungesättigten o-3-Fett-säuren (das Gemisch enthält 27,6% EPA und 44,6% DHA) werden bei Raumtemperatur miteinander ver-

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mischt. Das homogene Gemisch wird in bekannter Weise in zur Aufnahme von 500 mg Wirkstoff geeignete Hartgelatinekapseln gefüllt.

Beispiel 2

155 g (1 Mol) 1-Histidin und 320 g (etwa 1 Mol) des gemäss Beispiel 1 verwendeten Fettsäuregemisches werden miteinander vermischt und wie in Beispiel 1 verkapselt.

Beispiel 3

41,0 g (0,25 Mol) 1-Lysin-monohydrat und 320 g (etwa 1 Mol) eines Gemisches aus o-3-Fettsäuren (das Gemisch enthält etwa 90,0%, EPA und 0,1% Vitamin E) werden miteinander vermischt und dann gemäss Beispiel 1 verkapselt.

Beispiel 4

Man arbeitet auf die im Beispiel 3 beschriebene Weise, verwendet jedoch statt des Fettsäuregemisches 328 g (etwa 1 Mol) Dokosahexaensäure (Hersteller: Sigma, St. Louis, USA; Katalognummer: D-6508 [1987]) und vermischt diese mit 164 g (1 Mol) 1-Lysin-monohydrat.

Beispiel 5

Man arbeitet auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise, verwendet jedoch statt 1-Lysin 181 g (1,0 Mol) 1-Tyrosin.

Beispiel 6

Man arbeitet auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise, verwendet statt 1-Lysin jedoch 120 g (1 Mol) 1-Threonin.

Beispiel 7

Man arbeitet auf die im Beispiel 3 beschriebene Weise, geht jedoch von 164 g (1 Mol) 1-Lysin-monohydrat und 80 g (etwa 0,25 Mo!) des gemäss Beispiel 3 verwendeten Gemisches ungesättigter Fettsäuren aus.

Beispiel 8

Man arbeitet auf die im Beispiel 3 beschriebene Weise, geht jedoch von 164 g (1 Mol) 1-Lysin-monohydrat und 302 g (1 Mol) Eikosapentaensäure (Hersteller: Sigma, St. Louis, USA; Katalognummer: E-7006 [1987]) aus.

Beispiel 9

Man arbeitet wie in Beispiel 1 beschrieben, verwendet statt 1-Lysin jedoch 132 g (1,0 Mol) 1-Ornithin. Beispiel 10

Man arbeitet auf die im Beispiel 3 beschriebene Weise, verwendet jedoch statt 1-Lysin 33 g (0,25 Mol) 1-Ornithin.

Beispiel 11

Man arbeitet auf die im Beispiel 4 beschriebene Weise, verwendet jedoch statt 1-Lysin 132 g (1,0 Mol) 1-Ornithin.

Beispiel 12

Man arbeitet auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise, verwendet jedoch statt 1 -Lysin 133 g (1,0 Mol) 1 -Asparaginsäure.

Beispiel 13

Man arbeitet auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise, verwendet jedoch statt 1 -Lysin 211 g (1,0 Mol) 1 -Arginin. HCl.

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Beispiel 14

Man arbeitet auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise, verwendet jedoch statt 1-Lysin 105 g (1,0 Mol) 1-Serin.

Beispiel 15

Man arbeitet auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise, verwendet jedoch statt 1-Lysin 145 g (1,0 Mol) 1-GIutamin.

Beispiel 16

Herstellung von Tabletten.

Aus der Komposition gemäss Beispiel 1 werden Tabletten der folgenden Zusammensetzung bereitet:

Komposition gemäss Beispie! 1

500 mg

Lactose

120 mg

Stärke

63 mg

Poiyvinylpyrralidon

3,5 mg

Magnesiumstearat

3,5 mg

Gewünschtenfalls können die Tabletten auf einer Dragiermaschine mit Zucker überzogen werden. Patentansprüche

1. Antivirale und/oder immunstimulierende Präparate, dadurch gekennzeichnet, dass sie als Wirkstoffe im Molverhältnis 1:4 bis 4:1 im lebenden Organismus vorkommende Aminosäuren und/oder deren Ci-C*-Alkylester oder Amide, ferner deren Hydrate und/oder Salze und eine oder mehrere, wenigstens zwei Doppelbindungen enthaltende Fettsäuren der Kettenlänge C18-C24 enthalten.

2. Präparat nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es Alkali-, Erdalkali- oder Ammoniumsalze der Aminosäuren enthält.

3. Präparat nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass es Träger- und weitere Hilfsstoffe enthält.

4. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es ungesättigte Fettsäuren aus Fischöl enthält.

5. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es als Wirkstoffe 5,8,11,14,17-Eikosapentaensäure und L-Lysin enthält.

6. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es als Wirkstoffe 4,7,10,13,16,19-Dokosahexaensäure und L-Lysin enthält.

7. Präparat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass es als Wirkstoffe DHA, EPA und L-Lysin enthält,

8. Verfahren zur Herstellung eines antiviral und/oder immunstimulierend wirkenden Arzneimittelpräparates, dadurch gekennzeichnet, dass man im Molverhältnis 1:4 bis 4:1 im lebenden Organismus vorkommende Aminosäuren und/oder deren Gi-C4-Alkylester oder Amide, ferner deren Hydrate und/oder Salze und eine oder mehrere, wenigstens zwei Doppelbindungen enthaltende Fettsäuren der Kettenlänge C18-C24 vermischt und zu Arzneimittelpräparaten formuliert.

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