CH670645A5 - - Google Patents
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Description
La présente invention a pour objet de nouveaux dérivés de gangliosides fonctionnels et plus précisément de nouveaux esters et aminés, leur procédé de préparation, des préparations pharmaceuti-io ques contenant ces esters et amides de gangliosides.
Les gangliosides sont des produits naturels contenus dans divers tissus ou organes animaux, surtout dans les tissus des systèmes nerveux central et périphérique, mais également dans la portion médullaire des glandes surrénales, dans les érythrocytes, dans la rate et 15 ailleurs, d'où on peut les extraire sous une forme purifiée. Il a été possible d'établir la structure de base de la plupart des gangliosides ainsi obtenus. Ce sont des glycosphingolipides, c'est-à-dire des composés qui résultent de l'union d'un Oligosaccharide avec une sphin-gosine et un certain nombre d'acides sialiques liés ensemble par des 20 liaisons glucosidiques et cétosidiques. Les gangliosides décrits jusqu'à maintenant dans la littérature et obtenus sous une forme purifiée ne représentent pas des composés chimiques unitaires, sauf peut-être pour leur partie saccharide (Oligosaccharide), car les composants céramides et sialiques sont, dans certaines limites, tout à fait 25 variables. Ainsi, lorsque l'on se réfère à des gangliosides «purs», il faut donner à cette expression l'interprétation large d'une espèce de gangliosides dans laquelle au moins une partie, par exemple la partie saccharide, est unitaire et est caractéristique d'un point de vue chimique. Cela étant, avant de décrire plus en détail l'arrière-plan de la 30 présente invention, il est utile de noter la formule générale suivante qui comprend toutes les structures des gangliosides obtenus jusqu'à maintenant sous une forme purifiée et met l'accent sur les fonctions qui sont modifiées, selon la présente invention (formule I):
HOOCnmi
HOOCt nui acide si ali-qtie_
5 5
111111 OH
► nu i iOH OH OH
nuoti céramide
Ö (D
OH
OLIGOSACCHARIDE
OH
Dans cette formule, un reste Oligosaccharide formé au maximum de 5 monosaccharides est relié par une liaison glucosidique à un reste céramide et à un ou plusieurs restes acide sialique, à la fois au so moyen d'autant de liaisons glucosidiques directes et au moyen d'une ou plusieurs de ces liaisons, car les restes acide sialique qui substituent sont reliés ensemble par des liaisons cétosides. La formule montre les groupes hydroxyles de la portion saccharide, des acides sialiques et du céramide, aussi bien que les liaisons glucosidiques 55 mentionnées ci-dessus avec les acides sialiques et le céramide, ainsi que les groupes carboxyliques des acides sialiques. Les acides sialiques qui font partie des gangliosides de formule I présentent la structure générale II:
■CCOH
(II)
670 645
4
dans laquelle un ou plusieurs des groupes hydroxyles primaires et secondaires peuvent également être acylés et dans laquelle les groupes acylés dérivent des acides acétique ou glycolique.
Le nombre d'acides sialiques présents dans les gangliosides varie habituellement de 1 à 5.
Les restes sialiques sont liés à l'oligosaccharide par une liaison cétosidique formée par l'hydroxyle en position 2 avec un hydroxyle d'Oligosaccharide. Lorsque plusieurs acides sialiques sont liés ensemble, leurs molécules sont réunies au moyen de liaisons cétosidiques formées entre les hydroxyles des positions 2 et 8 de deux molécules d'acides sialiques. Les acides sialiques des gangliosides, y compris les gangliosides purifiés décrits ci-dessus, sont des'mélanges de divers acides chimiquement unitaires, tels que les acides N-acétylneurami-nique et N-glycolylneuraminique, dans lesquels le premier est prédominant, et éventuellement d'un ou plusieurs de leurs dérivés O-acyles, tels que les dérivés 8-O-acyles.
On peut trouver les gangliosides dans la nature sous la forme de leurs sels métalliques, tels que les sels de sodium, et c'est (ce sont) la (les) fonction(s) carboxylique(s) des acides carboxyliques qui (est) sont salifiée(s). La forme libre des gangliosides peut s'obtenir facilement par traitement des sels, par exemple des sels de sodium, avec un échangeur d'acide du type ionique, en utilisant par exemple une résine telle que Dowex AG 50 x 8, sous sa forme protonée.
Le résidu de céramide dans les gangliosides de formule I représente plusieurs N-acyl-sphingosines correspondant à l'une des formules:
ÇHj-O- CH--0-
I I 2
GH-NH-acyle acyle
ÇH-OH (jîH-OH
5 CH CH,
\
<fH ÇH2
(CHj)n CH3 (CH^n — CH)
io dans laquelle n = 10 à 16, et l'acyle dérive d'un acide gras saturé ou non saturé possédant de 16 à 22 atomes de carbone, ou d'un hydroxyacide correspondant. L'oligosaccharide est formé au maximum de 5 monosaccharides 15 ou de leurs dérivés avec un groupe acylaminique, notamment d'hexoses et de leurs dérivés du type mentionné ci-dessus. Cependant, une molécule au moins de glucose ou de galactose est toujours présente dans l'oligosaccharide.
Le reste le plus fréquemment présent en tant que dérivé acylami-20 nique des sucres mentionnés ci-dessus est la N-acétylgalactosamine ou la N-acétylglucosamine.
Pour mieux illustrer la structure des gangliosides inclus dans la formule I, et en particulier le caractère de liaison entre les parties saccharides, les acides sialiques et le céramide, on a reproduit ci-25 dessous la formule d'un ganglioside GMI «pur» ne contenant qu'un seul acide sialique (représenté par l'acide N-acétylaminique ou l'acide N-glycolylneuraminique):
Il est bien connu que les gangliosides ont une importance fonctionnelle dans le système nerveux, et il a été démontré récemment qu'ils sont utiles dans la thérapeutique des pathologies du système nerveux périphérique. Cette action des gangliosides semble consister surtout dans la stimulation des phénomènes de bourgeonnement de la cellule nerveuse et dans l'activation des enzymes de membrane impliqués dans la conduction des stimulus nerveux, tels que l'enzyme (Na+, K+) ATPase. Le bourgeonnement des neurones stimulé par les gangliosides favorise la disparition des troubles fonctionnels du tissu nerveux endommagé.
D'autres études ont été menées pour trouver des composés qui puissent se montrer plus efficaces que les gangliosides dans la thérapeutique des pathologies du système nerveux. Ces études ont par exemple mené à la constatation que les esters internes des gangliosides, dans lesquels un ou plusieurs hydroxyles de la partie saccharide sont estérifiés par un ou plusieurs groupes carboxyliques des acides sialiques (réaction intramoléculaire) avec formation d'autant de cycles lactoniques, sont plus actifs que les gangliosides eux-mêmes pour favoriser le bourgeonnement des neurones et activer les enzymes de membrane impliqués dans la condition des stimulus nerveux, tels que l'enzyme (Na+, K+) ATPase (voir brevet des Etats-Unis d'Amérique N° 4476 119).
Selon la présente invention, on a maintenant trouvé un autre groupe de dérivés de gangliosides qui présentent des avantages par rapport aux gangliosides eux-mêmes, dans la mesure où ils ont une so activité prolongée dans le temps (effet «retard»). Ces composés sont des dérivés dans lesquels les groupes carboxyles des acides sialiques sont fonctionnellement modifiés par estérification ou par transformation en amide et en dérivés de ces esters ou amides dans lesquels les groupes hydroxyles de la partie saccharide, des acides sialiques et 55 du céramide sont également estérifiés par des acides organiques, ou plutôt des dérivés d'acylate (qui seront simplement désignés ci-après sous le nom d'«acylates» et spécifiquement d'«acétylates, propiony-lates», etc.). Les dérivés selon l'invention comprennent également des dérivés de gangliosides dans lesquels seuls les groupes hydr-60 oxyles sont estérifiés par des esters organiques, c'est-à-dire qu'ils contiennent des groupes carboxyles libres.
Deux esters méthyliques du groupe carboxyle d'un acide sialique des gangliosides sont décrits dans l'article «Notes on improved procédures for the chemical modification and dégradation of glyco-65 sphyngolipids», Journal of Lipid Research, 21, 642-645 (1980) par MacDonald et coll. Ces composés sont les esters méthyliques des gangliosides GM1 et GM3 [les abréviations utilisées ici pour identifier les gangliosides sont celles proposées par Svennerholm dans J. Neu-
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rochem., 10, 613 (1963)]. Cependant, MacDonald et coll. n'indiquent aucune activité biologique pour ces composés. L'ester méthylique du ganglioside GM3 est également utilisé dans la préparation de l'un de ces dérivés peracylates destinés à être utilisés dans plusieurs réactions de dégradation ou de copulation [Methods of Enzymology, 50, 137-140 (1978)]. L'article mentionné ci-dessus dans Journal of Lipid Research par MacDonald et coll. décrit également l'acétylation des esters méthyliques des gangliosides GMI et GM3, mais sans isolation des composés acylés.
L'acétylation avec un mélange anhydride acétique/pyridine des lipides extraits de la rate, du foie et des reins des rats Buffalo, des hépatomes de Morris et des cellules de fibroblaste est décrite par Terunobo Saito et Sen-Itiro Hakomori dans le Journal of Lipid Research, 12,257-259 (1971). Du produit acylé, les auteurs ont isolé par Chromatographie le mélange acétylé des gangliosides contenus dans ces lipides, en même temps que d'autres lipides, sans toutefois identifier aucun ganglioside spécifique. Parmi les amides, l'amide non substitué du ganglioside Gm3 a été décrit [Ad. Exp. Med. BioL, 19,95 (1972)], mais, même dans ce cas, aucune propriété biologique n'est mentionnée.
L'un des premiers objets de la présente invention consiste donc à procurer les nouveaux dérivés de gangliosides fonctionnels discutés ci-dessus, c'est-à-dire les esters et amides des groupes carboxyliques des gangliosides définis par la formule I, ou de leurs mélanges, les dérivés peracylés de ces esters et amides dans les groupes hydroxyles de l'oligosaccharide, des acides sialiques et du céramide des gangliosides de formule I ou de leurs mélanges avec des fonctions carboxyliques libres, et leurs sels.
Un second objet de la présente invention consiste à procurer de nouvelles préparations pharmaceutiques qui contiennent à la fois les nouveaux dérivés fonctionnels définis ci-dessus et ceux, déjà connus, décrits ci-dessus.
La présente invention concerne de nouveaux dérivés utiles de gangliosides. Ces nouveaux dérivés sont notamment obtenus par modification fonctionnelle des groupes carboxyles et/ou hydroxyles présents dans la structure de base du ganglioside. Les gangliosides ainsi obtenus sous une forme purifiée peuvent être représentés par la formule suivante (I), qui met également l'accent sur les groupes fonctionnels modifiés conformément à la présente invention:
HOOC l M « 11
HOOC [imi acide sialique
O O
OH
► liimOH
OH OH
( mOH
céramide
Ö (I)
OH
OLIGOSACCHARIDE
OH
Ces gangliosides, qui forment les matériaux de départ des dérivés fonctionnels selon l'invention, sont tous ceux que l'on peut extraire de divers organes et tissus animaux, notamment des tissus des systèmes nerveux central et périphérique, par exemple du cerveau, du liquide cérébro-spinal, des muscles, du plasma et du sérum sanguin, des reins, des surrénales, du foie, de la rate, de l'intestin, ainsi que des érythrocytes ou des leucocytes. Les gangliosides de départ peuvent également être les gangliosides purifiés décrits dans la littérature, par exemple ceux extraits des tissus et organes des vertébrés, notamment des mammifères tels que l'homme, le bétail — dont le veau —, le rat, la souris, ou des micro-organismes.
Selon la présente invention, ces dérivés de gangliosides sont modifiés par modification fonctionnelle des groupes hydroxyles et/ou carboxyliques existants dans la molécule de ganglioside de départ pour préparer de nouveaux dérivés de gangliosides. Les nouveaux dérivés selon l'invention s'obtiennent particulièrement:
a) en soumettant les groupes carboxyliques à une estérification ou à une transformation en amide, et/ou b) en acylant les groupes hydroxyles présents dans le ganglioside.
5 Les esters ou amides qui forment les nouveaux dérivés selon l'invention sont particulièrement des monoesters et des monoamides dans le cas des monosialogangliosides, et des polyesters et des polyamides dans le cas des polysialogangliosides, avec autant de groupes esters ou amides qu'il y a de groupes carboxyles présents dans la io molécule et, par conséquent, autant de groupes d'acide sialique que ceux qui sont présents.
Les dérivés de gangliosides selon l'invention peuvent se préparer par modification de gangliosides «purifiés» caractérisés individuellement, ou par modification d'un mélange de gangliosides tel qu'un 15 mélange de monosialogangliosides et de polysialogangliosides. Dans les mélanges que l'on utilise pour l'estérification ou la conversion en amides en vue de la préparation des composés actifs selon l'invention, tels que le mélange décrit dans l'exemple 3 ci-dessous, contenant à la fois des monosialogangliosides et des polysialogangliosi-20 des, tous les groupes carboxyliques sont modifiés, et l'on obtient des dérivés totalement éthérifiés ou transformés en amides. L'expression «esters ou amides» utilisée dans la présente description doit donc être interprétée dans ce sens comme signifiant: totalement estérifiés ou transformés en amides. Cela s'applique notamment aux dérivés 25 des exemples illustratifs donnés ci-dessous auxquels on se réfère simplement en tant qu'«esters ou amides». Ces indications désignent des mélanges qui contiennent des polysialogangliosides totalement estérifiés ou transformés en amides sur tous leurs groupes carboxyliques.
30 La présente invention embrasse donc des dérivés de gangliosides, qu'ils soient dérivés d'un simple ganglioside «purifié» ou d'un mélange de gangliosides. L'invention s'étend en outre à des dérivés obtenus à partir de diverses structures de gangliosides, car la structure des gangliosides peut notamment varier eu égard au nombre et 35 à la nature du reste acide sialique, du reste céramide ou du reste Oligosaccharide.
En ce qui concerne leur structure, les gangliosides de départ peuvent être des monosialo-, disialo-, trisialo-, tétrasialo- ou penta-sialogangliosides, les acides sialiques que l'on préfère étant les acides 40 N-acétylneuraminique et N-glycolylneuraminique. Les acides sialiques peuvent également être acylés sur l'un des hydroxyles de leur chaîne latérale, tel que l'hydroxyle en position 8, si cette position n'est pas déjà occupée par une liaison cétosidique qui la relierait à un autre reste sialique adjacent.
45 La partie céramide peut varier de la façon discutée ci-dessus, et également par la longueur des chaînes d'atomes de carbone des sphingosines qui comprennent une partie de la céramide qui peut comporter de 16 à 22 atomes de carbone. En outre, la longueur d'un reste acyle quelconque peut également varier, notamment dans les 50 mêmes limites de 16 à 22 atomes de carbone. A cela près, le reste céramide peut varier dans la mesure où la double liaison sphingosine peut être absente ou présente et, habituellement, ce reste est en grande partie composé de sphingosine N-acylée insaturée et d'un faible pourcentage du composé saturé correspondant (qui peut ce-55 pendant aller jusqu'à environ 10%). Le groupe acyle peut également être dérivé d'hydroxyacides aliphatiques comportant le nombre d'atomes de carbone mentionné ci-dessus, entre 16 et 22. Un groupe de gangliosides particulièrement important contient, dans le reste céramide, des sphingosines acylées possédant de 18 à 20 atomes de 60 carbone dans leurs chaînes et des composés correspondants saturés, tandis que leur groupe acyle saturé ou insaturé, non substitué par des hydroxyles, possède le même nombre d'atomes de carbone, soit 18 ou 20.
Comme discuté ci-dessus, la présente invention a pour objet, 65 d'une part, les dérivés fonctionnels de gangliosides «purs» de formule I, c'est-à-dire ayant une composition unitaire telle que décrite ci-dessus et, d'autre part, les dérivés fonctionnels de mélanges de gangliosides, par exemple sous forme d'extraits tels qu'ils sont
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obtenus à partir de divers tissus animaux. Dans le premier cas, les gangliosides de base sont de préférence ceux dans lesquels l'oligosaccharide est formé au maximum de 4 résidus hexose ou N-acétyl-hexosamine, puisque au moins un reste hexose est présent, et dans lesquels cette partie saccharide est chimiquement unitaire. Les hexoses sont de préférence choisis dans le groupe constitué par le glucose et le galactose et les N-acétylhexosamines dans le groupe comprenant la N-acétylglucosamine et la N-acétylgalactosamine (ganglioside du groupe A). Les gangliosides de ce groupe sont, par exemple, ceux extraits du cerveau des vertébrés tels que ceux décrits dans l'article «Gangliosides of the Nervous System» dans Glycolipid Methodology, Lloyd A. Witting Fd., American Oil Chemists' Society, Champaign, III., 187-214 (1976) (voir notamment le schéma I), par exemple les gangliosides GM4, GM3, GM2, GM1-GlcAC, GD2, GDla-GalNAC, GTIc, Gq, Tt1, et notamment ceux dans lesquels l'oligosaccharide contient au moins un reste glucose ou galactose et un reste N-acétylglucosamine ou N-acétylgalactosamine, notamment ceux qui suivent (ganglioside du groupe B)
Gmi
Gal(l -» 3)GalNAC(l -► 4)Gal(l -> 4)Glc(l -» l)céramide
NANA
Dia
Gal(l -* 3)GalNAC(l -» 4)Gal(I -*■ 4)Glc(l -► l)céramide © ©
NANA NANA
G
Dlb
Gal(l -» 3)GalNAC(l -* 4)Gal(l -► 4)Glc(I -» l)céramide ©
NANA ©
NANA
G ib
Gal(l -» 3)GalNAC(l -* 4)Gal(l -* 4)Glc(l -> l)céramide © ©
NANA NANA
NANA
dans lesquels
Glc représente le glucose;
GalNAC représente la N-acétylgalactosamine;
Gai représente le galactose, et
NANA représente l'acide N-acétylneuraminique.
Si l'on utilise des mélanges de gangliosides comme matières de départ pour les conversions fonctionnelles selon la présente invention, ces mélanges peuvent être constitués de ceux directement obtenus par l'extraction des gangliosides de divers tissus animaux, sous forme d'extraits de gangliosides «totaux» ou sous la forme de leurs diverses fractions. Ces extraits sont décrits dans la littérature, par exemple dans les articles mentionnés ci-dessus ou dans «Extraction and analysis of materials containing lipid-bound sialic acids», Glycolipid Methodology, Lloyd A. Witting Fd., American Oil Chemists' Society, Champaign, 111., 159-186 (1976) et «Gangliosides of the Nervous System» dans le même livre, 187-214. Quelques-uns des mélanges les plus importants à utiliser selon la présente invention sont des extraits de gangliosides obtenus à partir des tissus du système nerveux, en particulier du cerveau, et qui contiennent les gangliosides GM), GDla, GDlb et GT\b déjà mentionnés ci-dessus. Les mélanges de ce type sont par exemple ceux décrits dans l'exemple 2.
Sont spécifiées ci-après les fonctions alcool, amide et acyle spécifiques qui conviennent particulièrement à l'obtention de nouveaux composés spécialement intéressants selon l'invention, et ces groupes fonctionnels doivent être pris en considération à la fois pour les gangliosides unitaires «purs» et pour leurs mélanges, notamment ceux énumérés ici.
Dans chacun des groupes gangliosides mentionnés ci-dessus, les groupes carboxyliques des restes sialiques sont présents, selon l'un des objets de la présente invention, sous leur forme estérifiée ou sous forme d'amides.
Les groupes esters des nouveaux dérivés de gangliosides proviennent en particulier des alcools des séries aliphatiques, et notamment de ceux possédant un maximum de 12, notamment 6, atomes de carbone, ou de ceux des séries araliphatiques comportant de préférence un seul cycle benzénique éventuellement substitué par un à trois groupes alkyles inférieurs (Ci-C4), par exemple des groupes méthyliques et un maximum de 4 atomes de carbone dans la chaîne aliphatique ou des alcools des séries alicycliques ou aliphatique-alicycliques comportant un seul cycle cycloaliphatique et un maximum de 14 atomes de carbone ou des séries hétérocycliques comportant un maximum de 12, notamment 6, atomes de carbone et un seul cycle hétérocycEque contenant un atome choisi dans le groupe formé par N, O et S. Les groupes amides des fonctions carboxyliques des dérivés de gangliosides selon la présente invention dérivent de l'ammoniaque ou des aminés d'une classe quelconque possédant de préférence un maximum de 12 atomes de carbone.
Les alcools et aminés mentionnés ci-dessus peuvent être substitués ou non, notamment par des fonctions choisies dans le groupe constitué par des groupes hydroxyle, amine, alkoxyle comportant un maximum de 4 atomes de carbone dans les groupes alkyle, carboxyle ou carbalcoxy (par exemple carbonylméthoxy et carbonyléthoxy) comportant un maximum de 4 atomes dans le reste alkyle, alkyl-amine ou dialkylamine avec un maximum de 4 atomes de carbone dans les groupes alkyles et peuvent être saturés ou non saturés, notamment comporter ime seule double liaison. Les alcools qui estéri-fient les fonctions carboxyliques des gangliosides selon la présente invention peuvent être des monoalcools ou des polyalcools, notamment des dialcools. Parmi les alcools des séries aliphatiques, on préfère les alcools inférieurs comportant un maximum de 6 atomes de carbone, par exemple l'alcool méthylique, l'alcool éthylique, l'alcool propylique et l'alcool isopropylique, l'alcool butylique normal, l'alcool isobutylique, l'alcool tertiobutylique, et, parmi les dialcools, l'éthylèneglycol et le propylèneglycol. Parmi les alcools des séries araliphatiques, on préfère ceux ne comportant qu'un radical benzène, par exemple l'alcool benzylique et l'alcool phén-éthylique; parmi les alcools des séries alicycliques, on préfère ceux qui ne comportent qu'un seul cycle cycloaliphatique, par exemple l'alcool cyclohexylique (cyclohexanol), ou les alcools terpéniques, tels que menthanol, carvomenthol, ou l'un des terpinéols ou terpiné-nols ou pipéritols. Parmi les alcools des séries hétérocycliques, on préfère le tétrahydrofurannol ou le tétrahydropyrannol. Pour l'esté-rification des groupes gangliosides carboxyliques, on peut également utiliser des alcools aliphatiques substitués, notamment par des fonctions aminés, par exemple des aminoalcools, tels que ceux comportant un maximum de 4 atomes de carbone, et notamment des aminoalcools comportant un groupe dialkyle en Q à C4 aminé, tel que le diéthylaminoéthanol.
Les fonctions carboxyliques transformées en groupes amides selon la présente invention dérivent soit de l'ammoniac (et l'amide est dans ce cas l'amide non substitué — CONH2) ou d'amines primaires ou secondaires, notamment de celles contenant un maximum de 12 atomes de carbone. Ces aminés peuvent être de nature aroma5
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tique, hétérocyclique ou halocyclique, et notamment aliphatique. L'objet principal de la présente invention est constitué par les dérivés carboxyliques des aminés aliphatiques comportant un maximum de 12 atomes de carbone, et ces aminés peuvent comporter des chaînes ouvertes, droites ou ramifiées, ou elles peuvent être cycliques, par exemple des alkylamines comprenant des groupes alkyles comportant de 1 à 6 atomes de carbone, tels que méthyl-amine, éthylamine, éthylméthylamine, propylamine, butylamine, hexylamine, diméthylamine, diéthylamine, diisopropylamine, di-hexylamine ou benzylamine. Les aminés de ce groupe peuvent être substituées, en outre, par des groupes choisis parmi les groupes amine, alkylamine ou dialkylamine comportant au maximum 4 atomes de carbone dans les groupes alkyles, ou par des groupes hydroxyles ou alkoxy comportant au maximum 4 atomes de carbone dans les groupes alkyles, tels que diméthylaminoéthylamine, dimé-thylaminopropyl-1-amine et 6-hydroxyhexyl-l-amine, ou des alkyl-ène-amines comprenant des groupes alkylènes comportant une chaîne droite possédant entre 1 et 3 atomes de carbone ou des chaînes correspondantes substituées par 1 à 3 groupes méthyles,
telles que Pyrrolidine, pipéridine et azépine. Les groupes alkyles ou alkylènes de ces aminés peuvent également être interrompus dans la chaîne d'atomes de carbone ou substitués par d'autres hétéroatomes, en particulier par des atomes d'azote, et les aminés selon l'invention sont, dans ce cas, dérivées des diamines telles qu'éthylènediamine, triméthylènediamine, pipérazine; ou, si les groupes alkyles ou alkylènes doivent être interrompus ou substitués par des atomes d'oxygène ou de soufre, les amides représentent des dérivés d'amino-alcools, tels qu'aminoéthanol ou aminopropanol, ou ce sont des dérivés de morpholine ou de thiomorpholine. Ces groupes incluent donc par exemple des alkylamines du type mentionné ci-dessus, par exemple des alkylamines et des dialkylamines du type mentionné ci-dessus, par exemple de 1 à 6 atomes de carbone, qui sont en outre substitués dans les radicaux alkyles par d'autres groupes amino, al-kylamino ou dialkylamino comportant un maximum de 4 atomes de carbone dans les groupes alkyles, ou par des groupes hydroxyles ou alkoxyles comportant un maximum de 4 atomes de carbone dans le groupe alkyle, par exemple diméthylaminoéthylamino, 3-diméthyl-amino-propyl-1-amino et 6-hydroxyhexyl-l-amino. Les esters et amides spécifiés ci-dessus des gangliosides des groupes A et B mentionnés auparavant, ou leurs mélanges, sont spécialement intéressants dans la présente invention.
La présente invention comprend également des dérivés peracylés des hydroxyles de la partie saccharide, des acides sialiques et de la céramide des esters et des amides décrits ici. Dans ces dérivés, le groupe acyle peut être dérivé des acides des séries aliphatique, aromatique, araliphatique, alicyclique ou hétérocyclique; de préférence des acides des séries aliphatique, aromatique, araliphatique, alicyclique ou hétérocyclique comportant un maximum de 10, notamment 6, atomes de carbone, tels que les acides formique, acétique, propio-nique, butyrique, valérianique, capronique (ou caprinique). Ils peuvent également être dérivés d'acides comportant, par exemple, le même nombre d'atomes de carbone ou substitués, notamment par des hydroxyacides tels que l'acide lactique, des aminoacides tels que la glycine, ou des acides difonctionnels tels que les acides succinique, malonique ou maléique. Parmi les acides aromatiques, on préfère ceux ne comportant qu'un seul cycle benzénique, notamment l'acide benzoïque et ses dérivés, avec des groupes méthyle, hydroxyle, amine ou carboxyle, par exemple les acides para-aminobenzoïque, salicyli-que ou phtalique. Dans le procédé selon l'invention, on fait réagir ces acides sous la forme de leur anhydride pour les faire réagir avec le groupe hydroxyle d'un ganglioside estérifié ou comportant un groupe carboxylique libre.
L'invention comprend également des dérivés peracylés des gangliosides et leurs mélanges décrits ci-dessus, comportant cependant des fonctions carboxyliques libres. Pour ces dérivés aussi, les dérivés acylés provenant des acides décrits ci-dessus sont particulièrement importants. En ce qui concerne également les dérivés peracylés comportant des fonctions carboxyliques libres ou éthérifiés ou sous forme d'amides, les dérivés gangliosides des groupes A et B sont particulièrement importants, comme le sont leurs mélanges, notamment ceux comportant des groupes acylés, et ceux des esters et des amides mentionnés ci-dessus. De ce fait, un groupe de nouveaux dérivés de gangliosides que l'on préfère particulièrement est celui qui comprend des esters et des amides de gangliosides et leurs dérivés peracylés dans les groupes hydroxyles, aussi bien que de tels dérivés peracylés comportant des fonctions carboxyliques de ces gangliosides sous leur forme libre. Dans ces dérivés, les groupes esters sont dérivés des alcools formés par le groupe constitué d'alcools aliphatiques comportant au maximum 6 atomes de carbone saturés, non substitués ou substitués par des groupes hydroxyle, alkoxyle comportant un maximum de 4 atomes de carbone; des groupes aminique, alkylami-nique ou dialkylaminique comportant un maximum de 4 atomes de carbone dans les groupes alkyles; les groupes carboxyliques; des groupes carbalcoxyliques possédant un maximum de 4 atomes de carbone dans le reste alkylique; et les alcools correspondants comportant une double liaison au maximum, et des alcools araliphatiques ne comportant qu'un seul cycle benzénique, non substitués ou substitués par 1 à 3 groupes méthyles, des alcools cycloaliphatiques ou aliphatique-cycloaliphatiques comportant un cycle cyclohexane non substitués ou substitués par 1 à 3 groupes méthyles et un maximum de 4 atomes de carbone dans la partie aliphatique et le tétrahydrofurannol et le tétrahydropyrannol.
Les groupes amides sur les dérivés que l'on préfère particulièrement proviennent de l'ammoniaque ou des alkylamines, dialkylamines et alkylène-amines, dont les groupes alkyles comportent un maximum de 6 atomes de carbone et les groupes alkylènes entre 4 et 8 atomes de carbone et dans lesquels les chaînes d'atomes de carbone des groupes alkyles ou alkylènes peuvent être interrompues par des hétéroatomes choisis dans le groupe constitué par l'azote, l'oxygène et le soufre, le groupe pouvant être iminique, — NH, dans le cas de la présence d'un atome d'azote substitué par un alkyle comportant un maximum de 4 atomes de carbone et/ou peut être substitué par des groupes choisis parmi les groupes aminique, alkylamini-que ou dialkylaminique comportant un maximum de 4 atomes de carbone dans les groupes alkyles, ou par des groupes hydroxyles ou alkoxyles comportant un maximum de 4 atomes de carbone dans les groupes alkyles, ou par des aminés araliphatiques comportant un seul cycle benzénique qui peut être substitué par un maximum de 3 groupes méthyles et avec un maximum de 4 atomes de carbone dans la partie aliphatique.
Les groupes acylés qui estérifient les hydroxyles dans ces dérivés particulièrement préférés proviennent des acides aliphatiques,
saturés ou non saturés, comportant un maximum de 6 atomes de carbone, qui peuvent également être substitués par une fonction choisie dans les groupes hydroxyle, aminique et carboxyle et leurs sels. Ces groupes de dérivés que l'on préfère surtout, et notamment ceux des gangliosides des groupes A et B mentionnés ci-dessus, ainsi que les dérivés des mélanges de gangliosides des groupes A et B par exemple (comportant les groupes fonctionnels spécifiés ici), sont particulièrement intéressants comme constituants des préparations pharmaceutiques selon la présente invention. Parmi les nouveaux composés spécifiques de la présente invention, particulièrement importants dans les préparations pharmaceutiques, les dérivés suivants sont importants:
— l'ester éthylique du ganglioside GMI,
— l'ester propylique du ganglioside Gmi,
— l'ester isopropylique du ganglioside GM1,
— l'ester butylique normal du ganglioside GM1,
— l'ester isobutylique du ganglioside GM1,
—• l'ester tertiobutylique du ganglioside Gtmi»
— l'ester cyclohexylique du ganglioside GMIî
— les esters correspondant à ceux énumérés ici contenant le ganglioside GDib à la place du ganglioside GMi,
— les esters énumérés ci-dessus contenant le ganglioside GDIa à la place du ganglioside GM1,
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8
— les esters énumérés ici contenant le ganglioside GTlb à la place du ganglioside GM1,
— les peracétylates des esters nommés ci-dessus,
— les perpropionylates des esters nommés ci-dessus,
— les per-n-butyrylates des esters nommés ci-dessus,
— les permaléinylates des esters nommés ci-dessus,
— les permalonylates des esters nommés ci-dessus,
— les persuccinylates des esters nommés ci-dessus,
— les peracétylates des gangliosides GMi, GDlb, GDla, GTlb, et
— les perpropionylates, les per-n-butyrylates, les permalonylates, les persuccinylates et les permaléinylates des mêmes gangliosides,
— l'amide du ganglioside GM1,
— l'amide du ganglioside GDla,
— l'amide du ganglioside GDlb,
— l'amide du ganglioside GTlb,
— le méthylamide, l'éthylamide, le propylamide des gangliosides GMh GDlb, GDia, GX|b et également les amides de ces gangliosides dérivés de diméthylamine, diéthylamine, Pyrrolidine, pipéridine, pipérazine, morpholine, thiomorpholine, les peracétylates, les perpropionylates, les per-n-butyrylates, les permalonylates, les permaléinylates et les persuccinylates des amides que l'on vient de mentionner, les esters méthylique, éthylique, propylique, iso-propylique, tertiobutylique, benzylique, allylique, éthoxycarbo-nylméthylique des mélanges de gangliosides contenant GMI,
GDia, GDlb, Gnb comme gangliosides principaux, et notamment le mélange obtenu selon l'exemple illustratif N° 2, l'amidon non substitué, les méthylamide, éthylamide, benzylamide, isopropyl-amide, diméthylamide, diéthylamide, diméthylaminopropyl-amide, diméthylaminoéthylamide, éthanolamide des gangliosides contenant GM1, GDla, GDIb, GTIb comme gangliosides principaux, et notamment le mélange obtenu selon l'exemple illustratif N° 2, les dérivés peracétylés, per-n-butyrylés, perpropionylés, perma-léinylés, permalonylés, persuccinylés d'un mélange de gangliosides contenant GM1, GDla, GDIb, GTlb comme gangliosides principaux, et notamment le mélange obtenu selon l'exemple illustratif N°2.
A partir des nouveaux composés selon la présente invention comportant des fonctions carboxyliques libres, tels les peracylates des gangliosides, par exemple de ceux des groupes A et B, on peut préparer des sels métalliques qui font également partie de la présente invention. On peut également préparer des sels métalliques à partir d'autres dérivés selon l'invention qui possèdent une fonction acide libre, tels que les esters peracylés des amides avec des acides dibasi-ques. En outre, les sels obtenus par addition d'acide de dérivés de gangliosides contenant une fonction amine libre font également partie de la présente invention, par exemple en tant qu'esters avec des aminoalcools. Parmi les sels métalliques, on préfère particulièrement ceux que l'on peut utiliser en thérapeutique, par exemple les sels de métaux alcalins et de métaux alcalinoterreux, par exemple potassium, sodium, ammonium, calcium, magnésium, ou des sels de métaux ferreux tels que ceux d'aluminium, et également les sels avec des bases organiques telles que des aminés primaires, secondaires ou tertiaires aliphatiques, aromatiques ou hétérocycliques, par exemple méthylamine, éthylamine, propylamine, pipéridine, morpholine, éphédrine, furfurylamine, choline, éthylènediamine, aminoéthanol.
Parmi les acides susceptibles de donner des sels avec des dérivés de gangliosides par addition d'acide selon la présente invention,
ceux que l'on préfère particulièrement sont les hydracides, par exemple l'acide chlorhydrique, l'acide bromhydrique, les acides phosphoriques, l'acide sulfurique, les acides aliphatiques inférieurs comportant au maximum 7 atomes de carbone, tels que les acides formique, acétique ou propionique, succinique ou maléique. Des acides ou bases inutilisables en thérapeutique, par exemple l'acide picrique, peuvent être utilisés pour la purification des nouveaux dérivés de gangliosides, et ils font partie de la présente invention. Etant donné la relation étroite qui existe entre les nouveaux dérivés sous leur forme libre ou sous leur forme saline, la présente description de l'invention doit être considérée comme embrassant les deux formes, à moins que le contraire ne soit expressément spécifié.
Les nouveaux esters et amides de gangliosides selon l'invention représentent généralement des poudres amorphes, incolores ou gri-5 sâtres, que l'on réussit tout à fait bien à dissoudre dans l'eau, et les solvants polaires tels que des alcools aliphatiques inférieurs, par exemple l'alcool méthylique, éthylique ou propylique, ou également dans des cétones telles que l'acétone, ou dans des amides tels que le diméthylformamide, ou dans des sulfoxydes tels que le diméthylsulf-io oxyde, ou dans des éthers tels que le dioxanne ou le tétrahydrofu-ranne. La solubilité dans l'eau est cependant considérablement réduite pour les dérivés acylés sur les groupes hydroxyles tandis qu'elle est augmentée dans les solvants mentionnés ci-dessus. Pour la fabrication des préparations pharmaceutiques sous forme de solu-15 tions à usage parentéral, les solvants les plus convenables seront chaque fois choisis en fonction du caractère plus ou moins hydrophile ou lipophile des nouveaux dérivés.
La présente invention comprend également des méthodes de préparation des nouveaux dérivés de gangliosides décrits ci-dessus ou 20 de ceux déjà connus. D'une part, ces méthodes sont les méthodes classiques déjà connues de préparation des nouveaux esters et amides des acides carboxyliques et d'acylation des groupes hydroxyles pour la préparation des nouveaux dérivés acyliques, à l'exception des méthodes qui auraient pour effet d'altérer la base des gangliosi-25 des, telles que celles faisant usage d'agents extrêmement acides ou de celles qui sont dans tous les cas mises en œuvre dans des conditions hydrolysantes alcalines ou acides, ou également des méthodes qui peuvent occasionner une alkylation non souhaitée des groupes hydroxyles de la partie saccharide. D'autre part, l'invention comprend 30 également une nouvelle méthode de préparation à la fois pour les esters nouveaux et pour les esters connus, cette méthode partant des esters internes de gangliosides tels que décrits ci-après.
Comme l'invention comprend la préparation des dérivés de gangliosides comportant des groupes fonctionnels carboxyliques estéri-35 fiés ou sous forme d'amides et également des dérivés acylés dans les groupes hydroxyles de ces dérivés, il est possible de modifier de cette façon les fonctions carboxyliques à la fois des gangliosides libres, c'est-à-dire présentant des fonctions hydroxyles libres, et des gangliosides comportant des fonctions hydroxyles déjà acylées. D'autre 40 part, il est possible d'acyler les fonctions hydroxyles des dérivés déjà estérifiés ou des dérivés d'amides. Il est également possible selon l'invention d'acyler les fonctions hydroxyles seules en laissant libres les fonctions carboxyliques. Donc, selon la présente invention, un ganglioside ou un de ses dérivés peracylés est estérifié sur les groupes 45 carboxyliques, ou ceux-ci sont convertis en amides, ou les groupes hydroxyles de ces dérivés gangliosides ou les gangliosides comportant des fonctions carboxyliques libres sont acylés. Si on le souhaite, les composés salifiables obtenus sont transformés en leurs sels.
50 1. Estérification des groupes carboxyliques :
Parmi les méthodes connues de préparation des esters carboxyliques, on peut mentionner celles utilisées pour la préparation des esters méthyliques déjà connus des gangliosides GM1 et GM3 décrites dans l'article mentionné ci-dessus dans le Journal of Lipid Research, 55 21, 642-645 (1980). Selon cet article, il est possible d'obtenir les esters des groupes carboxyliques des gangliosides par réaction de ces derniers avec un alcool dont on obtient l'ester en présence d'un échangeur d'ions, par exemple une résine telle que Dowex 50. Le rendement est limité à cause de la formation simultanée d'esters in-60 ternes et de temps de réaction plus longs (2 à 3 jours).
La même méthode est également utilisée, par exemple, dans l'article mentionné ci-dessus, dans Methods of Enzymology, 50, 137-140 (1978), pour la préparation des esters méthyliques du ganglioside GM3. Cette sorte d'estérification partielle peut également s'obtenir de 65 façon claire, bien qu'avec un rendement encore plus faible, en l'absence de résine. A part la résine Dowex 50, on peut utiliser d'autres résines échangeuses d'ions acides dont la fonction est de transformer les gangliosides qui, comme on l'a déjà exposé, sont généralement
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présents, et notamment dans les extraits sous forme de sels, notamment de sels de sodium dans les gangliosides libres. Cette opération de transformation des sels de gangliosides en gangliosides libres convient également pour toutes les autres méthodes classiques décrites ici pour la modification fonctionnelle de la fonction carboxylique, telles que celles nécessaires pour la préparation des amides. Cependant, la meilleure méthode décrite dans l'article mentionné ci-dessus consiste à estérifier le ou les carboxyles présents dans les gangliosides en faisant passer une solution alcoolique de l'alcool recherché sur une résine telle que Dowex 50W x 8 (forme protonée, 100 à 200 mailles) et à traiter l'éluat dissous dans ce même alcool avec le diazométhane correspondant. Dans le cas spécifique décrit, les esters de gangliosides GM1 et GM3 sont préparés par un traitement semblable avec du méthanol et du diazométhane, ce qui donne un très bon rendement.
Une autre bonne méthode de préparation des esters carboxyliques de gangliosides consiste à traiter un sel métallique de ganglioside par un agent éthérifiant. On utilise des sels alcalins ou alcalino-terreux ou un sel d'un autre métal quelconque. Comme agent d'éthé-rification, on peut utiliser ceux qui sont connus en soi dans la littérature, notamment les esters de divers acides minéraux ou les acides sulfoniques organiques tels que les hydracides, en d'autres termes les halogénures hydrocarbonés tels que l'iodure de méthyle ou d'éthyle, etc., ou les sulfates neutres ou acides des hydrocarbures, les sulfites, les carbonates, les silicates, les phosphites ou les sulfonates d'hydrocarbures tels que le benzo- ou le p-toluolsulfonate de méthyle ou le chlorosulfonate de méthyle ou d'éthyle. La réaction peut s'effectuer dans un solvant convenable tel qu'un alcool, de préférence celui qui correspond au groupe alkyle que l'on doit introduire dans le groupe carboxylique, mais on peut également utiliser des solvants non polaires, tels que des cétones, des esters, par exemple le dioxanne ou le diméthylsulfoxyde.
Une nouvelle méthode caractéristique de la présente invention pour la préparation des esters de gangliosides, et que l'on peut utiliser à la fois pour la préparation des nouveaux gangliosides selon l'invention et également pour celle des esters déjà connus, consiste à traiter un ester interne de ganglioside avec un mélange de l'alcool recherché avec l'un de ses alcoolates correspondants. La réaction peut être mise en œuvre à une température correspondant au point d'ébullition de l'alcool. On peut également utiliser des températures plus basses mais, dans ce cas, les temps de réaction sont plus longs. Il est également possible, en abandonnant toutefois le très bon rendement et les temps de réaction courts, de traiter l'ester interne seulement avec l'alcool correspondant, de préférence à une température correspondant à son point d'ébullition. Les esters internes sont décrits par exemple dans le brevet belge mentionné ci-dessus N° 894024 et le brevet des Etats-Unis d'Amérique 4476119.
Comme alcoolates, il est préférable d'utiliser des alcoolates d'un métal alcalin, notamment l'alcoolate de sodium.
2. Préparation des amides:
Les nouveaux amides de gangliosides selon la présente invention peuvent se préparer par des méthodes connues en soi, notamment par les méthodes suivantes:
a) réaction des esters internes de gangliosides avec l'ammoniaque ou avec des aminés,
b) réaction des esters carboxyliques de gangliosides avec l'ammoniaque ou avec des aminés,
c) réaction des acides de gangliosides avec les groupes carboxyliques activés par l'ammoniaque ou les aminés.
La réaction a), qui a été décrite dans le cas de la préparation de l'amide du ganglioside Gm (voir ci-dessus), peut s'effectuer par traitement direct, avec ou sans solvant, de l'ester de ganglioside interne par l'ammoniaque ou par l'amine dont on doit préparer l'amide. La réaction peut s'effectuer à des températures très basses, par exemple de —5 à +10° C, mais la température ambiante ou une température plus élevée, par exemple comprise entre 30 et 120° C, est préférable. Comme solvants, on peut utiliser des cétones, des hydrocarbures aromatiques, le diméthylformamide, le diméthylsulfoxyde, le dioxanne ou le tétrahydrofuranne.
La réaction b) s'effectue de préférence dans les conditions décrites pour a). A part les esters décrits pour la présente invention, on peut utiliser d'autres esters, tels que des esters avec les phénols.
Pour l'activation du groupe carboxylique dans la réaction selon c), on utilise des méthodes connues en soi dans la chimie des pepti-des, en évitant celles qui impliquent des conditions trop acides ou trop basiques, qui occasionneraient une rupture de la molécule de ganglioside. Si les gangliosides de départ se trouvent sous leur forme de sels de sodium, par exemple, il est recommandé de traiter tout d'abord le sel avec une résine échangeuse d'ions du type Dowex ou avec une autre résine échangeuse d'ions acide. Il est par exemple possible d'utiliser la méthode de condensation en présence de carbo-diimides tels que dicyclohexylcarbodiimide, benzylisopropylcarbo-diimide ou benzyléthylcarbodiimide, en présence de 1-hydroxyben-zotriazol, ou de condensation en présence de N,N'-carbonyldiimida-zole.
3. Acylation des groupes hydroxyles:
L'acylation des groupes hydroxyles du saccharide, de la partie sialique et du céramide se produit aussi d'une façon déjà connue en soi, par exemple par acylation avec un halogénure ou un anhydride de l'acide à utiliser pour l'acylation, de préférence en présence d'une base tertiaire telle que la pyridine ou la collidine. La réaction peut avoir lieu à une faible température, par exemple à la température ambiante, en laissant le dérivé acide tel que l'anhydride réagir pendant un temps très long, de 12 à 24 heures par exemple, ou à une température légèrement plus élevée, par exemple de 50 à 100° C, pendant quelques heures.
L'invention comprend également des modifications dans les modes opératoires de préparation des nouveaux dérivés, dans lesquels un mode opératoire est interrompu à un moment donné ou dans lequel on commence la préparation avec un composé intermédiaire et où les étapes suivantes sont mises en œuvre, ou dans lequel les produits de départ sont formés in situ.
Exemple 1
Ester méthylique du ganglioside GMI
5 g de l'ester interne du ganglioside GM1 (3,27 mM) sont dissous dans 200 ml d'un mélange anhydre chlorure de méthylène/méthanol 4/1.176 mg (3,27 mM) de méthylate de sodium dissous dans 50 ml de méthanol anhydre sont ajoutés et l'on traite le mélange à reflux pendant 2 heures. A la fin de la réaction, on neutralise le mélange avec une résine anhydre Dowex AG 50 x 8 (forme protonée), on sépare la résine par filtration et on lave avec du méthanol et la solution est évaporée par séchage. Le résidu est rassemblé dans 50 ml d'un mélange chlorure de méthylène/méthanol 1/1 et on précipite le produit de la réaction en le versant dans 250 ml d'acétone. On purifie le produit brut (4,9 g) par Chromatographie préparative à haute pression avec du gel de silice Merck 60H, en utilisant comme solvant un mélange chloroforme/méthanol/isopropanol/carbonate d'ammonium à 2% 1140/820/180/140. On rassemble les fractions pures, on évapore par séchage, on redissout dans 15 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 1/1 et on précipite le produit avec 75 ml d'acétone. Ce produit représente l'ester méthylique du ganglioside Gm,. Le rendement est de 4,2 g.
Une spectroscopie IR effectuée sur des pellets de KBr montre la liaison typique de l'ester à 1750 cm-1.
Une Chromatographie sur des plaques de gel de silice avec un mélange chloroforme/méthanol/CaCl2 à 0,3% 55/45/10 et une détermination à l'aide d'un réactif d'Ehrlich (Rf 0,72) montre que le produit est un composé unitaire exempt de l'ester interne utilisé comme produit de départ (Rf 0,75) et du ganglioside GM1 (Rf 0,65). On coupe la liaison ester, ce qui conduit au produit primaire, GMI, par traitement avec une solution 0,1N de Na2C03 à 60° C pendant 1 heure.
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Exemple 2
Préparation d'un mélange de gangliosides (mélange G A ) par extraction à partir de tissu de cerveau de bovin et du mélange correspondant des esters internes (à utiliser dans les divers exemples suivants)
Du cortex de cerveau de bovin, retiré de l'animal, est homogénéisé dans un tampon de phosphate à pH 6,8; on ajoute 6 vol. de tétrahydrofuranne, et le mélange qui en résulte est centrifugé. On réextrait à deux reprises le surnageant avec du tétrahydrofuranne. Après centrifugation, on enlève les matières non polaires par séparation avec de l'éther éthylique, et la couche aqueuse tétrahydrofuran-nique est introduite sur une colonne d'échange d'ions équilibrée avec de l'éthanol à 50%. On ajoute de l'hydroxyde de baryum et 4 vol. d'éthanol glacé à l'efïluent de la colonne.
Après 18 heures de maintien à l'état froid, on rassemble le précipité et on l'acidule ensuite légèrement avec de l'acide chlorhydrique après mise en solution dans l'eau. La solution ainsi obtenue est dia-lysée et lyophilisée. A ce moment, le rendement est d'environ 0,6 mg de mélange de gangliosides bruts par gramme de tissu nerveux utilisé. La poudre lyophilisée est dispersée dans 20 vol. d'un mélange chloroforme/méthanol 2/1, la solution obtenue est filtrée jusqu'à ce qu'elle soit parfaitement claire et elle est ensuite séparée par addition de 0,2 vol. d'une solution de chlorure de potassium dans l'eau à 0,88%.
La couche supérieure est séparée, dialysée et lyophilisée. Le rendement final est d'environ 0,3 mg de mélange purifié de sels de gangliosides par gramme de tissu de cerveau.
5 g du mélange obtenu selon la méthode décrite ci-dessus sont dissous dans 50 ml de DMSO. 4 g de résine anhydre du type styrène (acide sulfonique) (forme protonée, 50 à 100 mailles) sont ajoutés au mélange et l'on agite le système qui en résulte pendant 30 minutes à la température ambiante. Ce traitement avec une résine échangeuse d'ions transforme tous les groupes carboxyliques salifiés. La transformation complète est confirmée par une méthode convenable d'analyse physique, par exemple par absorption atomique. On filtre ensuite la résine sous aspiration, et la solution est traitée avec 1,5 g de dicyclohexylcarbodiimide et on laisse reposer pendant 1 heure. On enlève la dicyclohexylurée qui précipite par filtration et la solution qui en résulte est traitée avec 100 ml de O, occasionnant la précipitation des esters de gangliosides internes formés.
Le rendement est de 4,6 g de mélange d'esters internes (environ 90 à 95% de la valeur théorique). La présence des dérivés d'esters internes est confirmée par spectroscopie infrarouge et ensuite par Chromatographie en couches minces. Spectroscopie IR sur pellets de KBr: la liaison lactonique estérifiante produit une raie à 1750 cm-1. Chromatographie en couches minces: sur plaques de gel de silice, solvant de développement: CHCl3/MeOH/CaCl2 0,3% (55/45/10 v/v/v), le Rf du mélange d'esters internes étant compris entre 0,7 et 0,85. Le Rf des produits finals est supérieur au Rf du mélange de la substance de départ; par conséquent, la Chromatographie démontre l'absence de matériaux de départ. Par traitement avec une solution de Na2C03 0,1N à 60° C pendant 1 heure, on coupe les liaisons esters, et il est possible d'obtenir le mélange primaire des gangliosides de départ.
On peut fractionner le mélange de gangliosides obtenu en diverses portions représentant sensiblement des gangliosides purs (au sens utilisé dans la description générale), en utilisant des colonnes à acide silicique et en éluant avec un mélange méthanol/chloroforme. De cette façon, on obtient une composition moyenne d'environ 40% du ganglioside GDla, 21% du ganglioside GM1,19% du ganglioside GTlb et 16% du ganglioside GDlb..
Exemple 3
Mélange des esters méthyliques d'un mélange de gangliosides
On dissout 5 g d'un mélange d'esters internes d'un mélange de gangliosides (obtenu par extraction à partir de tissu de cerveau de bovin, comme décrit dans l'exemple 2) dans 200 ml d'un mélange anhydre de chlorure de méthylène et de méthanol 4/1. On aj oute alors 318 g (5,86 mM) de méthylate de sodium dissous dans 50 ml de méthanol anhydre, et l'on traite le mélange au reflux pendant 2 heures. Le produit brut de la réaction est alors isolé comme décrit dans l'exemple 1 (4,9 g). On purifie alors le produit par Chromatographie sur une colonne Sephadex-DEAE A-25, forme acétate, en utilisant comme solvant un mélange chloroforme/méthanol/eau 30/60/8. Les fractions neutres mixtes sont évaporées, dialysées dans l'eau, évaporées de nouveau par séchage; on dissout les résidus dans 15 ml de chloroforme/méthanol 1/1, et l'on précipite le produit avec 75 ml d'acétone. Le rendement est de 4,3 g. Une spectroscopie IR effectuée sur des pellets de KBr indique la liaison typique de l'ester à 1750 cm"1. Une Chromatographie effectuée comme décrit dans l'exemple 1 montre que le produit qui représente le mélange des esters méthyliques des gangliosides présente un Rf de 0,72 à 0,85 (Rf du mélange de gangliosides: 0,2 à 0,70).
On peut confirmer une transestérification complète en déterminant la proportion moléculaire entre les groupes alkoxy et sialique que l'on obtient par Chromatographie en phase gazeuse quantitative «espace en tête» de l'alcool méthylique libéré après traitement avec une solution 0,1N de Na2C03 à 60° C pendant 1 heure, ce qui occasionne la rupture de toutes les liaisons esters, et avec la méthode de Svennerholm de détermination de l'acide N-acétylneuraminique.
Exemple 4
Ester éthylique du ganglioside &M1
L'ester éthylique de Gmi est préparé et isolé de la même façon que l'ester méthylique de l'exemple 1, en utilisant cependant de l'alcool éthylique et de l'éthylate de sodium à la place d'alcool méthylique et de méthylate de sodium et en utilisant les mêmes quantités molaires d'ester interne et d'éthylate que dans l'exemple 1. Un lavage de la résine Dowex est effectué avec de l'alcool éthylique, et le résidu obtenu par évaporation de la substance filtrée est dissous dans 50 ml d'un mélange chlorure de méthylène/éthanol 1/1. Le rendement en produit brut est de 4,9 g. On effectue également une purification comme dans l'exemple 1. Le rendement en ester éthylique du ganglioside Gmi purifié est de 4,3 g. Une analyse chromatographique du produit, effectuée de la même façon que dans l'exemple 1, montre la présence d'un composé unitaire ayant un Rf de 0,80 et l'absence du ganglioside GMI et de son ester interne (Rf 0,65 et 0,75, respectivement). Une hydrolyse par Na2C03, telle que décrite dans l'exemple 1, donne le ganglioside GMi- Un examen par spectroscopie IR sur des pellets de KBr montre la raie typique de l'ester à 1750 cm-1.
Exemple 5
Mélange des esters éthyligues d'un mélange de gangliosides
On prépare le mélange des esters éthyliques et on l'isole de la même façon que le mélange des esters méthyliques de l'exemple 3 en utilisant cependant de l'alcool éthylique et de l'éthylate de sodium au lieu d'alcool méthylique et de méthylate de sodium et en utilisant 5 g de mélange d'ester interne et 318 mg (5,86 mM) d'éthylate de sodium.
Le lavage de la résine Dowex est effectué avec de l'alcool éthylique et l'on dissout le résidu obtenu par évaporation de la substance filtrée dans 50 ml d'un mélange chloroforme/éthanol 1/1. Le rendement en produit brut est de 4,9 g. On effectue également une purification comme dans l'exemple 3. Le rendement en mélange d'ester éthylique purifié est de 4,5 g. Une spectroscopie IR, effectuée sur des pellets de KBr, montre la bande typique de l'ester à 1750 cm-1. Par Chromatographie sur des plaques de gel de silice avec une solution fraîchement préparée 1M dans un mélange chloroforme/méthanol/ hydroxyde de tétraméthylammonium 55/45/10 et détermination avec du réactif d'Ehrlich, on constate que le produit montre un Rf de 0,50 à 0,75 (mélange de gangliosides: 0,20 à 0,60).
La transestérification complète est démontrée de la même façon que décrit dans l'exemple 3.
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Exemple 6
Ester isopropylique du ganglioside GMI
On prépare ce dérivé et on l'isole de la même façon que l'ester méthylique de l'exemple 1, en utilisant cependant de l'alcool isopropylique, de l'isopropylate de sodium au heu d'alcool méthylique et de méthylate de sodium, et en utilisant les mêmes quantités molaires d'ester interne et d'isopropylate que dans l'exemple 1. On effectue le lavage de la résine Dowex avec de l'alcool isopropylique, et le résidu obtenu par évaporation de la substance filtrée est dissous dans 50 ml d'un mélange chlorure de méthylène/isopropanol 1/1. Le rendement en produit brut est de 4,9 g. On effectue également une purification comme dans l'exemple 1. Le rendement en ester isopropylique du ganglioside Gmi purifié est de 4,2 g.
Une analyse chromatographique du produit, effectuée de la même façon que dans l'exemple 1, montre la présence d'un composé unitaire présentant un Rf de 0,85 et l'absence du ganglioside GM1 ou de son ester interne. L'hydrolyse par Na2C03, telle que décrite dans l'exemple 1, donne le ganglioside GM1. Une spectroscopie IR sur des pellets de KBr montre la raie typique de l'ester à 1750 cm-1.
Exemple 7
Mélange d'esters isopropyliques d'un mélange de gangliosides
Ce mélange de dérivés est préparé et isolé de la même façon que le mélange des esters méthyliques de l'exemple 3 à l'aide cependant de l'alcool isopropylique et de l'isopropylate de sodium au lieu d'alcool méthylique et de méthylate de sodium et en utilisant 5 g de mélange d'ester interne et 537 mg (6,52 mM) d'isopropylate de sodium. On effectue le lavage de la résine Dowex avec de l'alcool isopropylique, et le résidu obtenu par évaporation de la substance filtrée est dissous dans 50 ml d'un mélange chloroforme/isopropanol 1/1. Le rendement en produit brut est de 5,9 g. On effectue la purification de la même façon que dans l'exemple 3 en utilisant cependant comme éluant chromatographique un mélange chloroforme/alcool isopropylique/eau 20/60/8. Le rendement en mélange des esters isopropyliques purifiés est de 4,3 g.
Par Chromatographie selon la méthode décrite dans l'exemple 5, le produit montre un Rf de 0,40 à 0,78 (mélange de gangliosides: 0,20 à 0,60). Une spectroscopie IR effectuée sur des pellets de KBr montre la raie typique de l'ester à 1750 cm-1. La transestérification complète est démontrée, comme décrit dans l'exemple 3.
Exemple 8
Ester tertiobutylique du ganglioside Gmi
On prépare ce dérivé et on l'isole de la même façon que l'ester méthylique de l'exemple 1 en utilisant cependant de l'alcool tertiobutylique et du tertiobutylate de sodium au lieu d'alcool méthylique et de méthylate de sodium, et en utilisant les mêmes quantités molaires d'esters internes et de tertiobutylate que dans l'exemple 1. On effectue le lavage de la résine Dowex avec de l'alcool tertiobutylique et l'on dissout le résidu obtenu par évaporation de la substance filtrée dans 50 ml d'un mélange chlorure de méthylène/butanol tertiaire 1/1. Le rendement en produit brut est de 4,9 g. Le rendement en ester tertiobutylique du ganglioside GM1 purifié est de 4,1 g.
Une analyse chromatographique du produit, effectuée de la même façon que dans l'exemple 1, montre la présence d'un composé unitaire ayant un Rf de 0,71 et l'absence du ganglioside GM1 ou de son ester interne. Une hydrolyse par Na2C03, telle que décrite dans l'exemple 1, conduit au ganglioside GMi- Une spectroscopie IR sur pellets de KBr montre la raie typique de l'ester à 1750 cm-1.
Exemple 9
Mélange d'esters tertiobutyliques d'un mélange de gangliosides
On prépare ce mélange et on l'isole de la même façon que le mélange des esters méthyliques de l'exemple 3, en utilisant toutefois de l'alcool tertiobutylique et du tertiobutylate de sodium au lieu d'alcool méthylique et de méthylate de sodium et en utilisant 5 g d'un mélange d'ester interne et 628,6 mg (6,52 mM) de tertiobutylate de sodium. On effectue le lavage de la résine Dowex avec de l'alcool tertiobutylique, et l'on dissout le résidu obtenu par évaporation de la substance filtrée dans 50 ml d'un mélange chloroforme/tertiobuta-nol 1/1. Le rendement en produit brut est de 4,9 g. On effectue également la purification comme dans l'exemple 3, en utilisant toutefois comme éluant chromatographique un mélange chloroforme/alcool tertiobutylique 1/1. Le rendement en esters tertiobutyliques purifiés est de 4,1 g. Une spectroscopie IR, effectuée sur des pellets de KBr, montre la liaison typique de l'ester à 1750 cm-1. Par Chromatographie selon la méthode décrite dans l'exemple 5, le produit montre un Rf de 0,25 à 0,70. La réaction complète est démontrée, comme on l'a décrit dans l'exemple 3.
Exemple 10
Ester benzylique du ganglioside Gmi
5 g de sel de potassium du ganglioside GM1 (3,14 mM) sont dissous dans 50 ml de DMSO et 1,58 g (12,5 mM) de chlorure de benzyle et 2,08 g (12,5 mM) de Kl sont ajoutés à la solution. On laisse réagir sous azote pendant 24 heures à 25° C. A l'achèvement de la réaction, on procède à la partition de la solution avec un mélange n-butanol/eau 2/1 pour éliminer le DMSO et les sels. On évapore la solution de butanol par séchage et l'on rassemble le résidu dans 50 ml d'un mélange chloroforme/alcool benzylique 1/1 et l'on précipite le produit de la réaction avec 250 ml d'acétone.
Le produit brut ainsi obtenu (5,3 g) est ensuite purifié par Chromatographie préparatìve sur des plaques de gel de silice en utilisant comme solvant un mélange chloroforme/méthanol/eau 65/32/7.
On mélange les fractions pures, on les évapore, on redissout dans 15 ml d'un mélange chloroforme/isopropanol 1/1 et l'on précipite le produit avec 75 ml d'acétone. Le rendement en ester benzylique pur est de 4,8 g.
Une spectroscopie IR, effectuée sur des pellets de KBr, montre la bande typique de l'ester à 1750 cm-1, et un examen en spectroscopie UV effectué dans l'alcool éthylique absolu présente trois maxima à 250, 255 et 261 nM.
Par Chromatographie sur plaques de gel de silice avec un mélange chloroforme/méthanol/CaCl2 à 0,3% 60/35/8 et avec un mélange chloroforme/méthanol/ammoniac 2,5N 55/45/12 et détermination avec du réactif d'Ehrlich, on constate que le produit est unitaire et présente un Rf de 0,65 et 0,53, respectivement, et qu'il est exempt du produit GM1 de départ (Rf 0,40 et 0,45, respectivement).
Le traitement avec une solution 0,1N de Na2C03 à 60° C pendant 1 heure occasionne la rupture de la liaison ester en redonnant les produits de départ (GM1 et alcool benzylique).
Exemple 11
Mélange des esters benzyliques d'un mélange de gangliosides
On dissout 5 g d'un mélange de gangliosides salifiés (sels de potassium) obtenu par extraction à partir de tissu de cerveau de bovin comme décrit dans l'exemple 2 et par substitution ultérieure du sodium par du potassium (échange d'ions) dans 100 ml de DMSO, et l'on ajoute à la solution 3,3 g (26,0 mM) de chlorure de benzyle et 216 g (13,0 mM) de Kl. On laisse le mélange réagir dans l'azote pendant 48 heures à 25° C. A l'achèvement de la réaction, on procède à la partition de la solution avec un mélange n-buta-nol/H20 2/1 pour éliminer le DMSO et les sels. On évapore la solution de butanol par séchage et l'on rassemble le résidu dans 50 ml d'un mélange chloroforme/alcool benzylique 1/1 et l'on précipite le produit avec 250 ml d'acétone. Le produit brut ainsi obtenu (5,6 g) est ensuite purifié par Chromatographie avec une colonne Sephadex-DEAE, forme acétate, en utilisant comme solvant un mélange chloroforme/méthanol/eau 30/60/8.
Les fractions neutres éluées sont mélangées, débarrassées du solvant par évaporation, on rassemble le résidu avec 15 ml d'un mélange chloroforme/isopropanol 1/1 et l'on précipite le mélange des esters benzyliques purifiés avec 75 ml d'acétone. Le rendement est de 4,9 g.
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Une spectroscopie IR, effectuée sur pellets de KBr, montre la liaison typique de l'ester à 1750 cm-1, et un examen par spectroscopie UV effectué dans de l'alcool éthylique absolu montre trois maxima à 250, 255 et 261 nM.
Par Chromatographie sur plaques de gel de silice avec un mélange chloroforme/méthanol/CaCl2 à 0,3% 60/25/8 et avec un mélange chloroforme/méthanol/ammoniac 2,5N 55/45/10 et détermination avec du réactif d'Ehrlich, on constate que le produit possède un Rf variant entre 0,40 et 0,70 et entre 0,29 et 0,53, respectivement (mélange original de gangliosides: 0,05 à 0,40 et 0,12 à 0,46, respectivement).
La réaction complète est effectuée comme on l'a décrit dans l'exemple 3.
Exemple 12
Ester allylique du ganglioside GMI
On dissout 5 g de sel de potassium (3,14 mM) du ganglioside GMi dans 50 ml de DMSO, et l'on ajoute 453,7 mg (3,75 mM) de bromure d'allyle et 625 mg (3,75 mM) de Kl à la solution. On laisse réagir pendant 48 heures à 25° C.
A l'achèvement de la réaction, on procède à la partition de la solution avec un mélange n-butanol/H20 2/1 pour éliminer le DMSO et les sels. La solution dans le butanol est évaporée par séchage, on rassemble le résidu dans 50 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 1/1 et l'on précipite le produit avec 250 ml d'acétone.
Le produit brut ainsi obtenu est alors purifié par Chromatographie préparatìve sur colonne de gel de silice en utilisant comme solvant un mélange chloroforme/méthanol/eau 60/35/8.
On mélange les fractions pures, on évapore, on redissout dans 15 ml d'un mélange chloroforme/isopropanol 1/1 et l'on précipite le produit avec 75 ml d'acétone. Le rendement en ester allylique pur est 4,5 g.
Une spectroscopie IR, effectuée sur des pellets de KBr, montre la raie typique de l'ester à 1750 cm-1.
Par Chromatographie sur des plaques de gel de silice avec un mélange chloroforme/méthanol/CaCl2 à 0,3% 60/40/9 et avec un mélange chloroforme/méthanol/ammoniac 2,5N 55/45/10 et détermination avec du réactif d'Ehrlich, on constate que le produit est un composé unitaire présentant des Rf de 0,56 et 0,39, respectivement, et qu'il est exempt du ganglioside GMi de départ (Rf 0,40 et 0,42, respectivement).
Un traitement avec une solution de Na2C03 0,1N à 60° C pendant 1 heure occasionne la rupture de la liaison ester et redonne le ganglioside GM1 de départ et l'alcool allylique.
Exemple 13
Ester éthoxycarbonylméthylique du ganglioside G Ml
On dissout 5 g du sel de potassium (3,14 mM) du ganglioside Gm1 dans 50 ml de DMSO et l'on ajoute 2,12 g (12,5 mM) d'éthyl-monobromoacétate et 2,08 g (12,5 mM) de Kl à la solution. On laisse réagir sous azote pendant 24 heures à 25° C. On procède ensuite à la partition de la solution avec un mélange n-butanol/eau 2/1 pour éliminer le DMSO et les sels. La solution dans le butanol est évaporée par séchage et l'on rassemble le résidu avec 50 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 1/1 et l'on précipite le produit avec 250 ml d'acétone. Le rendement est de 4,8 g.
On purifie le produit brut par Chromatographie préparatìve sur colonne de gel de silice en utilisant comme solvant un mélange chloroforme/méthanol/eau 60/32/7. On mélange les fractions pures, on les évapore par séchage, on dissout le résidu dans 15 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 1/1 et l'on précipite l'ester éthoxycarbonylméthylique avec 75 ml d'acétone. Le rendement est de 2,4 g.
Une spectroscopie IR, mise en œuvre sur des pellets de KBr, montre la raie typique de l'ester à 1750 cm-1.
Par Chromatographie sur des plaques de gel de silice avec un mélange chloroforme/méthanol/CaCl2 à 0,3% 60/35/8 et détermination avec du réactif d'Ehrlich, on constate que le produit est un composé unitaire de Rf égal à 0,64 et qu'il est exempt du composé de départ, le GMI (Rf 0,40).
Un traitement avec une solution 0,1N de Na2C03 à 60° C pendant 1 heure occasionne une rupture de la liaison ester et redonne le ganglioside GMI original.
Exemple 14
Amide du ganglioside GMI
On met en suspension 5 g de l'ester interne du ganglioside Gmi (3,27 mM) dans 100 ml d'alcool isopropylique anhydre. On maintient la solution agitée à basse température (—5° C) et l'on fait ensuite passer des bulles d'ammoniac sec à travers cette suspension dans des conditions anhydres pendant 3 heures.
A la fin de la réaction, on élimine le solvant par évaporation et l'on recueille le résidu dans 50 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 1/1 et l'on précipite le produit avec 250 ml d'acétone.
On traite le produit brut (4,9 g) avec 100 ml de Na2C03 à 1 % pendant 30 minutes à 25° C pour hydrolyser les groupes esters résiduels, on dialyse dans l'eau, on évapore par séchage sous vide et ensuite on purifie par Chromatographie préparatìve sur colonne de gel de silice, en utilisant comme premier solvant un mélange chloro-forme/méthanol/H20 60/40/9 et comme deuxième solvant un mélange chloroforme/méthanol/H20 55/45/10. Les fractions mixtes éluées pures sont évaporées par séchage, on dissout le résidu dans 15 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 1 /I et l'on précipite l'amide avec 75 ml d'acétone. Le rendement est de 4,8 g.
Par Chromatographie sur plaques de gel de silice avec un mélange chloroforme/méthanol/ammoniac 4N 55/45/10 et chloro-forme/méthanol/CaCl2 à 0,3% 55/45/10 et détermination avec du résorcinol comme réactif, on constate que le produit est un composé unitaire (Rf 0,10 et 0,32, respectivement) et qu'il est exempt de GM1 (Rf 0,35 et 0,65, respectivement).
Exemple 15
Mélange des amides d'un mélange de gangliosides
On fait réagir 5 g du mélange d'esters internes de gangliosides décrit dans l'exemple 2 avec de l'ammoniac comme dans l'exemple 14 et on précipite avec de l'acétone également comme décrit dans l'exemple 14. Après un traitement hydrolytique avec Na2C03 comme décrit dans l'exemple précédent, on purifie le produit brut de la façon suivante.
Le produit obtenu par hydrolyse est dialysé vis-à-vis de l'eau, on évapore la solution sous vide, on recueille le résidu avec 50 ml d'un mélange chloroforme/méthanol/H20 30/60/8 et on purifie ensuite par Chromatographie préparatìve avec une colonne Sephadex-DEAE A-25, forme acétate, en utilisant comme solvant un mélange chloroforme/méthanol/eau 30/60/8.
Les fractions neutres éluées sont évaporées jusqu'à siccité, on dialyse, on évapore encore une fois jusqu'à siccité, on dissout dans 15 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 1/1 et l'on précipite le mélange d'amides avec 75 ml d'acétone. Le rendement est de 4,8 g.
Une spectroscopie IR ne montre plus la raie typique de l'ester à 1750 cm-1.
Par Chromatographie sur plaques de gel de silice avec un mélange chloroforme/méthanol/ammoniac 4N 55/45/10 et chloro-forme/méthanol/CaCl2 à 0,3% 55/45/10 et détermination avec du résorcinol comme réactif, on constate que le produit présente un Rf variant entre 0,01 et 0,10 et entre 0,55 et 0,45, respectivement (mélange de gangliosides original: Rf 0,15 à 0,70 et 0,20 à 0,70, respectivement).
Exemple 16
Méthylamide du ganglioside G Ml
On met en suspension 5 g de l'ester interne du ganglioside GM1 (3,27 mM) dans 25 ml de mêthylamine anhydre dans un récipient équipé d'un réfrigérant à reflux à —25° C, dans des conditions anhydres. On maintient la suspension sous agitation à la température am5
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biante pendant 3 heures. A la fin de la réaction, on élimine le solvant par évaporation et l'on recueille le produit avec 50 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 1/1 et on précipite avec 250 ml d'acétone.
On traite le produit brut ainsi obtenu (4,9 g) avec 100 ml de Na2C03 à 1% pendant 30 minutes à 25° C pour hydrolyser les groupes esters résiduels et ensuite on dialyse dans l'eau. On évapore la solution jusqu'à siccité sous vide et l'on purifie le résidu par Chromatographie préparatìve avec une colonne Sephadex-DEAE A-25, forme acétate, en utilisant comme solvant un mélange chloroforme/ méthanol/eau 30/60/8.
Les fractions neutres mélangées sont évaporées jusqu'à siccité, on dialyse et on évapore de nouveau, on dissout dans 15 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 1/1 et l'on précipite le méthylamide avec 75 ml d'acétone. Le rendement est de 4,8 g.
Une spectroscopie IR ne montre pas la raie typique de l'ester à 1750 cm-1.
Par Chromatographie sur plaques de gel de silice avec un mélange chloroforme/méthanol/ammoniac 4N 55/45/10 et avec un mélange chloroforme/méthanol/CaCl2 à 0,3% 55/45/10 et détermination avec du résorcinol comme réactif, on constate que le produit est un composé unitaire dont le Rf est de 0,13 et 0,72, respectivement, et qu'il est exempt de GMI (Rf 0,35 à 0,65, respectivement).
Exemple 17
Mélange de méthylamides d'un mélange de gangliosides
On traite 5 g du mélange d'ester interne utilisé dans l'exemple 15 par la méthylamine comme dans l'exemple précédent, et le produit de la réaction est traité et isolé de la même façon que dans cet exemple. Le rendement en produit pur (mélange des méthylamides du mélange de gangliosides utilisé) est de 4,8 g.
Les valeurs de Rf déterminées comme dans l'exemple précédent sont respectivement de 0,01 à 0,10 et de 0,20 à 0,45 (mélange de gangliosides original: Rf 0,15 à 0,70 et 0,20 à 0,70, respectivement). Les données spectroscopiques IR sont les mêmes que dans l'exemple précédent.
Exemple 18
Ethylamide du ganglioside Gm
Ce dérivé est préparé à partir de 5 g d'ester interne du ganglioside GMi (3,27 mM) et de 25 ml d'éthylamine, de la même façon que dans l'exemple 16, et l'on suit la même méthode de purification. On obtient un rendement en ethylamide pur du ganglioside G^i de 4,8 g.
Les données spectroscopiques IR sont les mêmes que pour le méthylamide de l'exemple 16, et un examen par Chromatographie dans les mêmes conditions que dans cet exemple démontre que le produit est unitaire et exempt de ses valeurs Rf étant respectivement de 0,19 et 0,75 (Rf de GM1 : 0,35 et 0,65, respectivement).
Exemple 19
Mélange d'éthylamides d'un mélange de gangliosides
Ce mélange de dérivés est préparé avec 5 g du mélange des esters internes de gangliosides utilisé dans l'exemple 17 et de 25 ml d'éthylamine de la même façon que l'exemple 17, et l'on utilise la même méthode de purification. On obtient un rendement de 4,8 g du mélange d'éthylamides du mélange de gangliosides.
Les valeurs Rf déterminées par Chromatographie sur plaques de gel de silice avec un mélange chloroforme/méthanol/ammoniac 4N 55/45/10 et un mélange chloroforme/méthanol/CaCl2 à 0,3% 60/35/8 et détermination avec du résorcinol comme réactif sont de 0,11 à 0,24 et 0,35 à 0,55, respectivement (Rf du mélange original de gangliosides: 0,15 à 0,70 et 0,05 à 0,40, respectivement).
Exemple 20
Butyl-2-amide du ganglioside Gmi
On dissout 5 g de l'ester interne du ganglioside GM1 (3,27 mM) dans 25 ml de pyridine anhydre. On ajoute 12,5 ml de 2-butylamine
à la solution et l'on maintient le mélange sous agitation dans des conditions anhydres pendant 24 heures à 25° C.
A la fin de la réaction, on évapore le solvant et l'on recueille le résidu avec 50 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 1/1 et l'on précipite le produit de la réaction avec 250 ml d'acétone.
On traite alors le produit brut ainsi obtenu (5,2 g) avec 100 ml de Na2C03 à 1% pendant 30 minutes à 25° C en vue d'hydrolyser les groupes esters résiduels, on dialyse en présence d'eau, on évapore la solution dialysée sous vide jusqu'à siccité et l'on purifie le résidu par Chromatographie préparatìve sur gel de silice en utilisant comme solvant un mélange chloroforme/méthanol/eau 110/40/6. On mélange les fractions éluées pures, on évapore la solution jusqu'à siccité, on dissout le résidu dans 15 ml d'un mélange chloroforme/ isopropanol 1/1 et l'on précipite le butylamide avec 75 ml d'acétone. Le rendement est de 4,7 g.
Une spectroscopie IR ne montre plus la raie typique de l'ester à 1750 cm"1.
Par Chromatographie sur plaques de gel de silice avec un mélange chloroforme/méthanol/ammoniac 4N 60/40/9 et chlorofor-me/méthanol/CaCl2 à 0,3% 60/35/8 et détermination avec du résorcinol comme réactif, on constate que le produit est unitaire et exempt du ganglioside GM1, les valeurs de Rf étant de 0,30 et 0,50, respectivement (Rf du GMi: 0,42 et 0,40, respectivement).
Exemple 21
Benzylamide du ganglioside GMI
On dissout 5 g de l'ester interne (3,27 mM) du ganglioside Gmi dans 20 ml de pyridine anhydre et l'on ajoute 396 mg (3,27 mM) de benzylamide à la solution que l'on maintient alors sous agitation dans des conditions anhydres pendant 24 heures à la température ambiante.
A la fin de la réaction, on élimine le solvant par évaporation, on recueille le résidu avec 50 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 1/1 et l'on précipite le produit avec 250 ml d'acétone.
On purifie le produit brut ainsi obtenu (5,1 g) conformément au mode opératoire décrit dans l'exemple 16, ce qui donne un rendement de 4,6 g du ganglioside de benzylamide pur.
Une spectroscopie IR ne montre plus la raie typique de l'ester à 1750 cm-1.
Par Chromatographie sur plaques de gel de silice avec un mélange chloroforme/méthanol/ammoniac 4N 55/45/10 et chloro-forme/méthanol/CaCl2 à 0,3% 60/35/8, on constate que le produit est unitaire et exempt de GMi et qu'il présente un Rf de 0,32 et 0,69 (Rf de Gm1 : 0,35 et 0,40, respectivement).
Exemple 22
Mélange de benzylamides d'un mélange de gangliosides
On prépare ce mélange à partir de 5 g du mélange de gangliosides utilisé dans l'exemple 2 et de 792 mg (7,4 mM) de benzylamine selon le mode opératoire dans les exemples précédents pour la préparation du benzylamide du ganglioside GM1. La purification du produit brut obtenu s'effectue également comme dans l'exemple précédent. Le rendement est de 4,8 g.
On effectue une spectroscopie IR et une Chromatographie sur des plaques de gel de silice comme dans l'exemple précédent. Les valeurs de Rf sont de 0,10-0,42 et 0,55-0,71, respectivement (mélange de gangliosides primaires: 0,01-0,15 et 0,05-0,40, respectivement).
Une spectroscopie IR ne montre plus la raie typique de l'ester à 1750 cm-1.
Exemple 23
Isopropylamide du ganglioside &M!
On dissout 5 g de l'ester interne du ganglioside GM1 (3,27 mM) dans 25 ml d'isopropylamine anhydre et Ton maintient le mélange sous agitation dans des conditions anhydres pendant 24 heures.
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A la fin de la réaction, on évapore le solvant, on recueille le résidu dans 50 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 1/1 et l'on précipite le produit avec 250 ml d'acétone.
On traite le produit brut (4,8 g) avec 100 ml d'une solution de Na2C03 à 1% pendant 30 minutes à 25° C pour hydrolyser les liaisons esters résiduelles et ensuite on dialyse dans l'eau. On évapore la solution dialysée à siccité et on purifie par Chromatographie préparatìve sur gel de silice en utilisant comme solvant un mélange chloroforme/méthanol/ammoniac 2,5N 60/40/9. On mélange les fractions éluées pures, on dissout dans 15 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 1/1 et l'on précipite le produit dans 75 ml d'acétone. Par Chromatographie sur plaques de gel de silice, en utilisant comme solvant un mélange chloroforme/méthanol/ammoniac 2,5N 60/40/9 et chloroforme/méthanol/CaCl2 à 0,3% 60/35/8 et détermination avec du résorcinol comme réactif, on constate que l'isopropylamide (4,2 g) est unitaire et exempt de GMi et présente des valeurs de Rf de 0,25 et 0,66, respectivement (Rf du GM1 : 0,42 et 0,40, respectivement).
Une spectroscopie IR ne montre plus la raie typique de l'ester à 1750 cm-1.
Exemple 24
Diméthylamide du ganglioside Gmi
On dissout 5 g de l'ester interne du ganglioside GM1 (3,27 mM) dans 25 ml de diméthylamine. On maintient le mélange sous agitation dans des conditions anhydres à basse température (—5° C) pendant 24 heures. A la fin de la réaction, on traite le mélange avec Na2C03 et on purifie comme décrit dans l'exemple précédent en utilisant toutefois comme premier solvant pour la Chromatographie un mélange chloroforme/méthanol/ammoniac 2,5N 60/40/9 et comme second solvant un mélange chloroforme/méthanol/eau 60/40/9. Le rendement en diméthylamide est de 4,6 g.
Les examens par spectroscopie et Chromatographie s'effectuent comme décrit dans l'exemple précédent. On constate que le produit est unitaire, ses valeurs de Rf étant de 0,20 et 0,46, respectivement, et qu'il est exempt de Gmi (Rf 0,42 et 0,40, respectivement). Une spectroscopie IR ne présente pas de raie de l'ester à 1750 cm-1.
Exemple 25
Mélange de dimêthylamides d'un mélange de gangliosides
On prépare ce mélange à partir de 5 g du mélange des esters internes des gangliosides décrit dans l'exemple 2 et avec 20 ml de diméthylamine anhydre selon la méthode de l'exemple précédent. Le traitement ultérieur est mis en œuvre comme dans l'exemple précédent, sauf pour la Chromatographie préparatìve que l'on effectue sur Sephadex A-25, forme acétate, en utilisant comme solvant un mélange chloroforme/méthanol/eau 30/60/8. Le rendement du produit pur est de 4,9 g.
Une spectroscopie IR et une Chromatographie sont effectuées comme dans les exemples précédents.
Les valeurs de Rf sont de 0,15 à 0,50 et 0,40 à 0,56, respectivement (mélange de gangliosides initial: 0,15 à 0,60 et 0,05-0,40, respectivement).
Exemple 26
Diéthylamide du ganglioside GMI
Ce composé est préparé de la même façon que le diméthylamide de l'exemple 24, à partir de 5 g d'ester interne du ganglioside GMI et de 25 ml de diméthylamine anhydre. On effectue la purification de la même façon que dans l'exemple 23. Le rendement est de 4,7 g. Un examen par chomatographie effectué comme dans l'exemple 23 montre que le produit est unitaire, ses valeurs de Rf étant de 0,29 et 0,50, respectivement, et qu'il est exempt de GM1. Une spectroscopie IR ne montre pas la raie typique de l'ester à 1750 cm-1.
Exemple 27
Mélange de diéthylamides d'un mélange de gangliosides
Ce mélange est préparé à partir de 5 g d'un mélange de gangliosides des esters internes utilisés dans l'exemple 2 et de 20 ml de di-
éthylamine anhydre selon le procédé de l'exemple précédent. On effectue la purification comme pour le diméthylamide du mélange de l'exemple 25. Le rendement est de 5,0 g.
Les valeurs de Rf (déterminées comme dans l'exemple précédent) sont de 0,18 à 0,55 et 0,43 à 0,60, respectivement. Une spectroscopie IR ne montre pas de raie typique de l'ester à 1750 cm-1.
Exemple 28
Ethylméthylamide du ganglioside GMI
On prépare ce composé de la même façon que dans l'exemple 24, à partir de 5 g de gangliosides de Gmi et de 25 ml d'éthylméthyl-amine. On effectue également la purification comme dans l'exemple ci-dessus. Le rendement est de 4,7 g.
On effectue une Chromatographie sur plaques de gel de silice comme dans l'exemple 24 et l'on constate que le produit est unitaire et exempt de GM1 (Rf 0,25 et 0,48, respectivement). Une spectroscopie IR ne montre pas de raie typique de l'ester à 1750 cm-1.
Exemple 29
3-Diméthylaminopropyl-l-amide du ganglioside GM1
On dissout 5 g de l'ester interne du ganglioside GMI (3,27 mM) dans 20 ml de pyridine anhydre et l'on ajoute à la solution 675 mg (6,6 mM) de 3-diméthylaminopropyl-l-amine. On agite le mélange à la température ambiante pendant 24 heures. On isole le produit comme dans l'exemple précédent et on le purifie comme dans l'exemple 28. Le rendement en 3-diméthylaminopropyl-l-amide est de 4,9 g.
Par Chromatographie sur plaques de gel de silice, en utilisant comme solvant un mélange chloroforme/méthanol/ammoniac 2,5N 55/45/10 et chloroforme/méthanol/CaCl2 à 0,3% 55/45/10, et détermination avec du résorcinol comme réactif, on constate que le produit est unitaire et exempt de GM1 et qu'il a des valeurs de Rf de 0,02 et 0,06, respectivement (Rf du Gm1: 0 ,45 et 0,65, respectivement).
Exemple 30
Maléate du 3-diméthylaminopropyl-l-amide du ganglioside Gmi
On dissout 5 g du 2-diméthylaminopropy 1-1-amide du ganglioside GMi obtenu par exemple comme dans l'exemple précédent, dans 100 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 1/1 et on ajoute 400 mg (3,44 mM) d'acide maléique à la solution.
Après 1 heure d'agitation à la température ambiante, on évapore la solution sous vide, on recueille le résidu dans 25 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 1/1 et l'on précipite le produit dans 200 ml d'acétone. Le rendement en maléate de 3-diméthylaminopropyl-l-amide est de 5,2 g.
Exemple 31
Mélange de 3-diméthylaminopropyl-l-amides du mélange de gangliosides
On dissout 5 g d'un mélange des esters internes de gangliosides tel que décrit dans l'exemple 2 dans 20 ml de pyridine anhydre, on ajoute 1,51 g (14,8 mM) de 3-diméthylaminopropyl-l-amine à la solution et l'on agite le mélange dans des conditions anhydres pendant 24 heures à la température ambiante. On effectue le traitement ultérieur comme dans l'exemple 29. Le rendement en 3-dimêthylamino-propyl-l-amide du mélange de gangliosides purifiés est de 5,1 g.
Une Chromatographie sur plaques de gel de silice effectuée comme dans l'exemple 29 donne les valeurs de Rf suivantes: 0,01 à 0,05 et 0,01 à 0,10, respectivement (mélange primaire de gangliosides: Rf 0,15 à 0,70 et 0,20 à 0,70, respectivement).
Exemple 32
Maléate du mélange de 3-dimêthylaminopropyl-l-amides du mélange de gangliosides
On dissout 5 g du mélange de 3-diméthylaminopropyl-l-amides du mélange de gangliosides préparé comme dans l'exemple précé5
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dent dans 6 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 1/1 et l'on ajoute 697 mg (6 mM) d'acide maléique à la solution. Après 1 heure de réaction sous agitation à la température ambiante, on évapore la solution sous vide à siccité et l'on recueille le résidu avec 25 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 1/1 et l'on précipite le produit dans 200 ml d'acétone. Le rendement en sel maléique est de 5,3 g.
Exemple 33
Diméthylaminoéthylamide du ganglioside Gm
On dissout 5 g de l'ester interne du ganglioside GM1 (3,27 mM) dans 50 ml d'une solution anhydre de chloroforme/isopropanol 1/1 et l'on ajoute ensuite 537 mg (6,5 mM) de diméthylaminoéthyl-amine.
On agite la solution dans des conditions anhydres pendant 24 heures à la température ambiante. On effectue l'isolation et la purification du produit brut ainsi obtenu comme dans l'exemple 31, ce qui donne un rendement de 4,9 g.
Le produit, traité par Chromatographie dans les conditions décrites dans les exemples précédents, se révèle unitaire, et ses valeurs de Rf sont respectivement de 0,11 et 0,14. Une spectroscopie IR ne donne pas de raie typique à 1750 cm-1-.
Exemple 34
Maléate de diméthylaminoéthylamide du ganglioside Gmi
On dissout 5 g de diméthylaminoéthylamide du ganglioside Gmi obtenu comme décrit dans l'exemple précédent dans 100 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 1/1 et on ajoute 400 mg (3,44 mM) d'acide maléique à la solution. Après 1 heure à la température ambiante sous agitation, on évapore la solution sous vide, on recueille le résidu avec 25 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 1/1 et l'on précipite le produit dans 200 ml d'acétone. Le rendement est de 5,2 g.
Exemple 35
Mélange de diméthylaminoéthylamides d'un mélange de gangliosides On dissout 5 g d'un mélange d'esters internes d'un mélange de gangliosides comme décrit dans l'exemple 2 dans 50 ml d'une solution anhydre de chloroforme/isopropanol 1/1 et on ajoute 955 mg (0,8 mM) de diméthylaminoéthylamine à la solution. On maintient le résultat à la température ambiante sous agitation dans des conditions anhydres pendant 24 heures.
Une séparation et une purification ultérieures du produit brut sont effectuées comme décrit dans l'exemple 33. Une Chromatographie sur plaques de gel de silice effectuée comme dans l'exemple 33 donne des valeurs de Rf de 0,01 à 0,14 et 0,01 à 0,16, respectivement (mélange de gangliosides initial: 0,15-0,70 et 0,20-0,70, respectivement).
Une spectroscopie IR ne donne pas la raie de l'ester à 1750 cm-1. Exemple 36
Maléate du mélange de diméthylaminoéthylamides du mélange de gangliosides
On dissout 5 g du mélange de diméthylaminoéthylamides des gangliosides décrit dans l'exemple précédent dans 100 ml d'un mélange de chloroforme/méthanol 1/1 et on ajoute 697 mm (6 mM) d'acide maléique à la solution.
Après 1 heure, pendant laquelle on a agité la solution à la température ambiante, on évacue le mélange sous vide jusqu'à siccité, on recueille le résidu dans 25 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 1/1 et l'on précipite le produit avec 200 ml d'éthanol. Le rendement est de 5,3 g de maléate.
Exemple 37
Ethanolamide du ganglioside Gmi
On dissout 5 g de l'ester interne de ganglioside GM1 (3,27 mM) dans 50 ml d'une solution anhydre de chloroforme/isopropanol 1/1 et on ajoute 397,2 mg (6,5 mM) d'éthanolamine à la solution. On maintient le mélange dans des conditions anhydres sous agitation à la température ambiante.
Une séparation et une purification du produit sont effectuées comme dans l'exemple 23, ce qui donne 4,9 g de produit pur.
Par Chromatographie sur plaques de gel de silice avec un mélange chloroforme/méthanol/ammoniac 4N 55/45/10 et chloro-forme/méthanol/CaCl2 à 0,3% 60/35/8 et détermination avec du résorcinol comme réactif, on constate que le produit est unitaire et exempt de GMi, ses valeurs de Rf étant de 0,12 et 0,49, respectivement.
Exemple 38
Mélange d'éthanolamides d'un mélange de gangliosides
On prépare ce mélange avec 5 g du mélange d'esters internes du mélange de gangliosides décrit dans l'exemple 2, on dissout dans 20 ml de pyridine anhydre et avec 671 mg (10,8 mM) d'éthanolamine. On agite le mélange pendant 24 heures à la température ambiante.
La séparation du produit brut de la réaction et sa purification sont effectuées comme dans l'exemple précédent, ce qui donne un rendement de 5,2 g.
Une Chromatographie sur plaques de gel de silice effectuée comme dans l'exemple 33 donne des valeurs de Rf de 0,09 à 0,56 et 0,25 à 0,55, respectivement. Une spectroscopie IR ne donne aucune raie typique d'un ester.
Exemple 39
6-Hydroxyhexyl-l-amide du ganglioside Gm
On dissout 5 g d'ester interne du ganglioside GM1 (3,27 mM)
dans 20 ml de pyridine anhydre et 762 mg (6,5 mM) de 6-hydroxy-hexyl-l-amide. On laisse la réaction se poursuivre sous agitation pendant 24 heures à la température ambiante dans des conditions anhydres. On effectue une séparation du produit brut de la réaction comme dans l'exemple 28. Une hydrolyse des groupes esters résiduels et une dialyse sont également effectuées comme dans l'exemple 12, et l'on précipite le produit purifié avec de l'acétone comme dans les exemples précédents. Le rendement est de 4,3 g.
Par Chromatographie sur plaques de gel de silice en utilisant comme solvant un mélange chloroforme/méthanol/ammoniac 2,5N 60/40/9 et chloroforme/méthanol/CaCl2 à 0,3% 60/35/8 et détermination avec du résorcinol comme réactif, on constate que le produit est unitaire et exempt de GM1, ses valeurs de Rf étant de 0,40 et 0,80, respectivement (Rf de GM1 : 0,42 et 0,40, respectivement).
Exemple 40
Dérivé peracylé du ganglioside GMI
On dissout 5 g du sel de sodium (3,19 mM) du ganglioside GMI dans 50 ml de pyridine anhydre et l'on ajoute 25 ml d'anhydride acétique fraîchement distillé à la solution à 25° C.
On maintient ensuite la solution sous agitation pendant 72 heures à la température ambiante. A la fin de la réaction, on évapore la solution sous vide jusqu'à siccité et l'on procède à la partition du résidu avec 100 ml d'eau glacée et 200 ml d'acétate d'éthyle.
L'acétate d'éthyle est ensuite lavé avec du HCl froid 1,0M, avec de l'eau et les solutions de NaHC03 1,0M. Les couches organiques sont ensuite déshydratées avec du sulfate de sodium, on évapore sous vide et l'on purifie le résidu par Chromatographie préparative sur colonne de gel de silice en utilisant comme solvant d'élution un mélange dichlorométhane/acétate d'éthyle/isopropanol 70/30/7. On mélange les fractions pures. On évapore jusqu'à siccité, on redissout dans 20 ml d'acétate d'éthyle et l'on précipite le produit dans 100 ml d'hexane normal.
Par Chromatographie sur plaques de gel de silice en utilisant un mélange dichlorométhane/acétate d'éthyle/méthanol 70/30/10 et acétate d'éthyle/isopropanol 95/5 et détermination avec du réactif d'Ehrlich, on constate que le produit est unitaire, ses valeurs de Rf étant de 0,47 et 0,28, respectivement.
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Exemple 41
Dérivé de peracétylate d'un mélange de gangliosides
On dissout 5 g du mélange de gangliosides décrit dans l'exemple 2 sous la forme de leurs sels de sodium dans 25 ml de pyridine anhydre, et l'on ajoute à la solution 25 ml d'anhydride acétique. On maintient le mélange sous agitation pendant 72 heures à la température ambiante. A la fin de la réaction, on évapore la solution sous vide jusqu'à siccité, on divise le résidu entre 100 ml d'eau glacée et 200 ml d'acétate d'éthyle, et on lave l'acétate d'éthyle avec du HCl froid 1,0N, avec de l'eau et avec une solution de NaHC03 1,0M.
Les couches organiques sont ensuite séchées avec du sulfate de sodium, on évapore sous vide, on recueille le résidu dans 20 ml d'acétate d'éthyle et l'on précipite le produit dans 100 ml d'hexane normal. Le rendement est de 4,4 g. 15
Une Chromatographie effectuée comme dans l'exemple précédent donne au mélange des valeurs de Rf de 0,01 à 0,46 et 0,01 à 0,36, respectivement.
Exemple 42 20
Dérivé peracétylé de l'ester méthylique du ganglioside GM1
On dissout 5 g (3,17 mM) de l'ester méthylique du ganglioside Gmi dans 50 ml de pyridine anhydre à 25° C, on ajoute à la solution 25 ml d'anhydride acétique fraîchement distillé et l'on maintient le 25 mélange sous agitation pendant 72 heures à la température ambiante. A la fin de la réaction, on évapore la solution sous vide et l'on divise le résidu entre 100 ml d'eau glacée et 200 ml d'acétate d'éthyle. On lave l'acétate d'éthyle avec du HCl froid 1,0M, avec de l'eau et avec une solution de NaHC03 1M. On sèche les couches or- so ganiques avec du sulfate de sodium, on évapore sous vide et l'on purifie le résidu par Chromatographie préparatìve sur colonne de gel de silice en utilisant comme solvant un mélange dichlorométhane/ acétate d'éthyle/isopropanol 70/30/45.
On mélange les fractions pures, on évapore, on redissout dans 35 20 ml d'éther éthylique et on précipite dans 100 ml d'hexane normal. Le rendement est de 4,5 g de dérivé peracétylé de l'ester méthylique du ganglioside GM1. Par Chromatographie sur plaques de gel de silice avec un mélange dichlorométhane/acétate d'éthyle/méthanol 70/30/10 et acétate d'éthyle/isopropanol 95/5 et détermination par du réactif 40 d'Ehrlich, on constate que le produit est unitaire, ses valeurs de Rf étant de 0,47 et 0,28, respectivement.
Exemple 43
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Dérivé peracylé du mélange des esters méthyliques d'un mélange de gangliosides
On acétyle 5 g du mélange des esters méthyliques du mélange de gangliosides décrit dans l'exemple 2 (voir aussi l'exemple 3) comme décrit dans l'exemple 40. Une purification du produit de l'acétyla- 50 tion est également effectuée comme dans l'exemple 40, ce qui donne un rendement de 5,4 g en dérivé peracétylé du mélange d'esters méthyliques de l'exemple 3.
Une Chromatographie effectuée comme dans l'exemple précédent donne des valeurs de Rf de 0,23 à 0,54 et 0,01 à 0,52, respectivement. 55
Exemple 44
Dérivé peracétylé de l'amide du ganglioside Gmi
En partant de 5 g (3,20 mM) de l'amide du ganglioside GM1 dans 60 50 ml de pyridine anhydre, on prépare le dérivé acétylé comme dans l'exemple 42. On effectue une purification comme dans l'exemple 41, en utilisant toutefois comme solvant pour la Chromatographie un mélange dichlorométhane/isopropanol 95/5. Le rendement est de 4,4 g de dérivé peracétylé pur de l'amide du ganglioside GM1. 65
On constate que le produit est unitaire lorsque l'on en fait la Chromatographie comme dans l'exemple précédent, ses valeurs de Rf étant de 0,43 et 0,48, respectivement.
Exemple 45
Dérivé peracétylé du mélange d'amides d'un mélange de gangliosides
On dissout 5 g du mélange d'amides de gangliosides décrit dans l'exemple 15 dans 50 ml de pyridine anhydre et on acétyle avec 25 ml d'anhydre acétique comme dans l'exemple précédent. On effectue une purification comme dans l'exemple 42, ce qui donne 4,9 g de dérivé peracétylé d'amides de gangliosides de l'exemple 15.
Par Chromatographie dans les mêmes conditions que dans l'exemple précédent, on voit que le composé a des valeurs de Rf de 0,11 à 0,45 et 0,01 à 0,50, respectivement.
Exemple 46
Phényléthylester du ganglioside GMi
Le phényléthylester du GM1 est préparé et isolé de la même façon que l'ester méthylique de l'exemple 1 ; on utilise cependant de l'alcool phénéthylique et du phénéthylate de sodium à la place d'alcool méthylique et de méthylate de sodium. On chauffe au bain-marie et l'on utilise les mêmes quantités molaires d'ester interne et de phényléthylate de sodium que dans l'exemple 1. Un lavage de la résine Dowex est effectué avec de l'alcool phényléthylique et le résidu obtenu par évaporation de la substance filtrée est dissous dans 50 ml d'un mélange chlorure de méthylène/alcool phénéthylique 1/1. Le rendement en produit brut est de 5,1 g. On effectue également une purification comme dans l'exemple 1. Le rendement en ester phényléthylique du ganglioside GM1 purifié est de 4,3 g.
Un examen par spectroscopie IR sur des pellets de KBr montre la raie typique de l'ester à 1750 cm-1. Une analyse chromatographique du produit, effectuée de la même façon que dans l'exemple 1, montre la présence d'un composé unitaire ayant un Rf de 0,90 et l'absence du ganglioside GM1 et de son ester interne (Rf 0,65 et 0,75, respectivement). Une hydrolyse par Na2C03, telle que décrite dans l'exemple 1, donne le ganglioside GMI.
Exemple 47
Mélange d'esters phényléthyliques d'un mélange de gangliosides
On prépare le mélange d'esters phényléthyliques et on l'isole de la même façon que le mélange des esters méthyliques de l'exemple 2 en utilisant cependant de l'alcool phénéthylique et du phényléthylate de sodium au lieu d'alcool méthylique et de méthylate de sodium et en utilisant 5 g de mélange d'ester interne et 844,8 mg (5,86 nM) de phényléthylate de sodium.
On lave la résine Dowex avec de l'alcool phényléthylique et l'on dissout le résidu obtenu par évaporation de la substance filtrée dans 50 ml d'un mélange chloroforme/alcool phényléthylique 1/1. Le rendement en produit brut est de 5,3 g. On effectue également une purification comme dans l'exemple 3. Le rendement en mélange d'esters purifiés est de 4,4 g.
Un examen par spectroscopie IR sur des pellets de KBr montre la raie typique de l'ester à 1750 cm-1. Lorsque l'on procède à une Chromatographie sur plaques de gel de silice avec une solution fraîchement préparée d'un mélange chloroforme/méthanol/hydroxyde de trétraméthylammonium 1M 55/45/10 et à une détermination avec un réactif d'Ehrlich, le produit présente un Rf de 0,65 à 0,887 (mélange de gangliosides: 0,2 à 0,60). Une transestérification complète est démontrée de la même façon que décrit dans l'exemple 2.
Exemple 48
Ester 2-cyclohexyléthylique du ganglioside Gm1
L'ester 2-cyclohexyléthylique du GM1 est préparé et isolé de la même façon que l'ester méthylique de l'exemple 1 ; on utilise cependant du 2-cyclohexyléthanol et du 2-cyclohexyléthylate de sodium à la place d'alcool méthylique et de méthylate de sodium, on chauffe au bain-marie et on utilise les mêmes quantités molaires d'ester interne et de 2-cyclohexyléthylate de sodium que dans l'exemple 1. Un lavage de la résine Dowex est effectué avec de l'alcool 2-cyclohexyléthylique et le résidu obtenu par évaporation de la substance
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filtrée est dissous dans 50 ml d'un mélange chlorure de méthylène/2-cyclohexyléthanol 1/1. Le rendement en produit brut est de 5,1 g. On effectue également une purification comme dans l'exemple 1. Le rendement en ester 2-cyclohexyléthylique du ganglioside GMI purifié est de 4,3 g.
Un examen par spectroscopie IR sur des pellets de KBr montre la raie typique de l'ester à 1750 cm-1. Une analyse chromatographique du produit, effectuée de la même façon que dans l'exemple 1, montre la présence d'un composé unitaire ayant un Rf de 0,92 et l'absence du ganglioside GMi et de son ester interne (Rf 0,65 et 0,75, respectivement). Une hydrolyse par Na2C03, telle que décrite dans l'exemple 1, donne le ganglioside GM1.
Exemple 49
Mélange d'esters 2-cyclohexyléthylique d'un mélange de gangliosides
On prépare le mélange des esters 2-cyclohexyléthyliques et on l'isole de la même façon que le mélange des esters méthyliques de l'exemple 2 en utilisant cependant du 2-cyclohexyléthanol et du 2-cyclohexyléthylate de sodium au lieu d'alcool méthylique et de méthylate de sodium, on chauffe au bain-marie et on utilise 5 g de mélange d'ester interne et 880,3 mg (5,86 mM) de 2-cyclohexyléthy-late de sodium.
On lave la résine Dowex avec de l'alcool 2-cyclohexyléthylique et l'on dissout le résidu obtenu par évaporation de la substance filtrée dans 50 ml d'un mélange chloroforme/éthanol 1/1. Le rendement en produit brut est de 5,3 g. On effectue également une purification comme dans l'exemple 3. Le rendement en mélange d'esters purifiés est de 4,3 g.
Un examen par spectroscopie IR sur des pellets de KBr montre la raie typique de l'ester à 1750 cm-1. Lorsque l'on procède à une Chromatographie sur plaques de gel de silice avec une solution fraîchement préparée d'un mélange chloroforme/méthanol/hydroxyde de tétraméthylammonium 1M 55/45/10 et à une détermination avec un réactif d'Ehrlich, le produit présente un Rf de 0,67 à 0,90 (mélange de gangliosides: 0,20 à 0,60). Une transestérification complète est démontrée de la même façon que décrit dans l'exemple 2.
Exemple 50
Ester de menthyle du ganglioside GMI
L'ester de menthyle du GM1 est préparé et isolé de la même façon que l'ester méthylique de l'exemple 1 ; on utilise cependant du menthol et du menthylate de sodium à la place d'alcool méthylique et de méthylate de sodium; on chauffe au bain-marie et on utilise les mêmes quantités molaires d'ester interne et de menthylate de sodium que dans l'exemple 1. Un lavage de la résine Dowex est effectué avec de l'alcool menthylique/chlorure de méthylène 1/1, et le résidu obtenu par évaporation de la substance filtrée est dissous dans 50 ml d'un mélange chlorure de méthylène/menthol 1/1. Le rendement en produit brut est de 3,9 g. On effectue également une purification comme dans l'exemple 1. Le rendement en ester menthylique du ganglioside GM1 purifié est de 4,2 g.
Un examen par spectroscopie IR sur des pellets de KBr montre la raie typique de l'ester à 1750 cm-1. Une analyse chromatographique du produit, effectuée de la même façon que dans l'exemple 1, montre la présence d'un composé unitaire ayant un Rf de 0,93 et l'absence du ganglioside GMi et de son ester interne (Rf 0,65 et 0,75, respectivement). Une hydrolyse par Na2C03, telle que décrite dans l'exemple 1, donne le ganglioside GMI.
Exemple 51
Mélange d'esters menthyliques d'un mélange de gangliosides
On prépare le mélange des esters menthyliques et on l'isole de la même façon que le mélange des esters méthyliques de l'exemple 2 en utilisant cependant du menthol et du menthylate de sodium au lieu d'alcool méthylique et de méthylate de sodium, on chauffe au bain-marie et on utilise 5 g de mélange d'ester interne et 1038,8 mg (5,86 mM) de menthylate de sodium.
On lave la résine Dowex avec un mélange alcool menthylique/ chlorure de méthylène 1/1 et l'on dissout le résidu obtenu par évaporation de la substance filtrée dans 50 ml d'un mélange chloroforme/ éthanol 1/1. Le rendement en produit brut est de 5,2 g. On effectue également une purification comme dans l'exemple 3. Le rendement en mélange d'esters purifiés est de 4,3 g.
Un examen par spectroscopie IR sur des pellets de KBr montre la raie typique de l'ester à 1750 cm-1. Lorsque l'on procède à une Chromatographie sur plaques de gel de silice avec une solution fraîchement préparée d'un mélange chloroforme/méthanol/hydroxyde de tétraméthylammonium 1M 55/45/10 et à une détermination avec un réactif d'Ehrlich, le produit présente un Rf de 0,70 à 0,93 (mélange de gangliosides: 0,20 à 0,60). Une transestérification complète est démontrée de la même façon que décrit dans l'exemple 2.
Exemple 52
Ester tétrahydrofurfurylique du ganglioside GMI
L'ester tétrahydrofurfurylique du GM1 est préparé et isolé de la même façon que l'ester méthylique de l'exemple 1 ; on utilise cependant du tétrahydrofurfuryle et du tétrahydrofurfurylate de sodium à la place d'alcool méthylique et de méthylate de sodium; on chauffe au bain-marie et on utilise les mêmes quantités molaires d'ester interne et de tétrahydrofurfurylate de sodium que dans l'exemple 1. Un lavage de la résine Dowex est effectué avec de l'alcool tétrahydrofurfurylique et le résidu obtenu par évaporation de la substance filtrée est dissous dans 50 ml d'un mélange chlorure de méthylène/ alcool tétrahydrofurfurylique 1/1. Le rendement en produit brut est de 5,0 g. On effectue également une purification comme dans l'exemple 1. Le rendement en ester tétrahydrofurfurylique du ganglioside Gmi purifié est de 4,2 g.
Un examen par spectroscopie IR sur des pellets de KBr montre la raie typique de l'ester à 1750 cm"1. Une analyse chromatographique du produit, effectuée de la même façon que dans l'exemple 1, montre la présence d'un composé unitaire ayant un Rf de 0,72 et l'absence du ganglioside GM1 et de son ester interne (Rf 0,65 et 0,75, respectivement). Une hydrolyse par Na2C03, telle que décrite dans l'exemple 1, donne le ganglioside GM1.
Exemple 53
Mélange d'esters tétrahydrofurfuryliques d'un mélange de gangliosides
On prépare le mélange des esters tétrahydrofurfuryliques et on l'isole de la même façon que le mélange des esters méthyliques de l'exemple 2 en utilisant cependant de l'alcool tétrahydrofurfurylique et du tétrahydrofurfurylate de sodium au lieu d'alcool méthylique et de méthylate de sodium, on chauffe au bain-marie et on utilise 5 g de mélange d'ester interne et 727,5 mg (5,86 mM) de tétrahydrofurfurylate de sodium.
On lave la résine Dowex avec de l'alcool tétrahydrofurfurylique et l'on dissout le résidu obtenu par évaporation de la substance filtrée dans 50 ml d'un mélange chloroforme/éthanol 1/1. Le rendement en produit brut est de 5,2 g. On effectue également une purification comme dans l'exemple 2. Le rendement en mélange d'esters purifiés est de 4,2 g.
Un examen par spectroscopie IR sur des pellets de KBr montre la raie typique de l'ester à 1750 cm"1. Lorsque l'on procède à une Chromatographie sur plaques de gel de silice avec une solution fraîchement préparée d'un mélange chloroforme/méthanol/hydroxyde de tétraméthylammonium 1M 55/45/10 et à une détermination avec un réactif d'Ehrlich, le produit présente un Rf de 0,45 à 0,68 (mélange de gangliosides: 0,20 à 0,60). Une transestérification complète est démontrée de la même façon que décrit dans l'exemple 2.
Exemple 54
Ester tétrahydro-2H-pyran-4-ylique du ganglioside GMl
L'ester tétrahydro-2H-pyran-4-ylique du GM1 est préparé et isolé de la même façon que l'ester méthylique de l'exemple 1 en utilisant cependant du tétrahydro-2H-pyran-4-ol et du tétrahydro-2H-pyran-
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4-ylate de sodium à la place d'alcool méthylique et de méthylate de sodium, on chauffe au bain-marie et on utilise les mêmes quantités molaires d'ester interne et de tétrahydro-2H-pyran-4-ylate de sodium que dans l'exemple 1. Un lavage de la résine Dowex est effectué avec du tétrahydro-2H-pyran-4-ol et le résidu obtenu par évaporation de la substance filtrée est dissous dans 50 ml d'un mélange chlorure de méthylène 1/1. Le rendement en produit brut est de 5,1 g. On effectue également une purification comme dans l'exemple 1. Le rendement en ester tétrahydro-2H-pyran-4-ylique du ganglioside Gm) purifié est de 4,3 g.
Un examen par spectroscopie IR sur des pellets de KBr montre la raie typique de l'ester à 1750 cm"1. Une analyse chromatographique du produit, effectuée de la même façon que dans l'exemple 1, montre la présence d'un composé unitaire ayant un Rf de 0,73 et l'absence du ganglioside Gmi et de son ester interne (Rf 0,65 et 0,75, respectivement). Une hydrolyse par Na2C03, telle que décrite dans l'exemple 1, donne le ganglioside Gmi-
Exemple 55
Mélange d'esters tétrahydro-2H-pyran-4-yliques d'un mélange de gangliosides
On prépare le mélange des esters tétrahydro-2H-pyran-4-yliques et on l'isole de la même façon que le mélange des esters méthyliques de l'exemple 2 en utilisant cependant du tétrahydro-2H-pyran-4-ol et du tétrahydro-2H-pyran-4-ylate de sodium au lieu d'alcool méthylique et de méthylate de sodium, on chauffe au bain-marie et on utilise 5 g de mélange d'ester interne et 727,5 mg (5,86 mM) de tétra-hydro-2H-pyran-4-ylate de sodium.
On lave la résine Dowex avec de l'alcool tétrahydro-2H-pyran-4-ylique et l'on dissout le résidu obtenu par évaporation de la substance filtrée dans 50 ml d'un mélange chloroforme/éthanol 1/1. Le rendement en produit brut est de 5,3 g. On effectue également une purification comme dans l'exemple 3. Le rendement en mélange d'esters purifiés est de 4,5 g.
Un examen par spectroscopie IR sur des pellets de KBr montre la raie typique de l'ester à 1750 cm-1. Lorsque l'on procède à une Chromatographie sur plaques de gel de silice avec une solution fraîchement préparée d'un mélange chloroforme/méthanol/hydroxyde de tétraméthylammonium 1M 55/45/10 et à une détermination avec un réactif d'Ehrlich, le produit présente un Rf de 0,48 à 0,72 (mélange de gangliosides: 0,20 à 0,60). Une transestérification complète est démontrée de la même façon que décrit dans l'exemple 2.
Exemple 56
Ester 1-heptylique du ganglioside Gm
L'ester 1-heptylique du GM! est préparé et isolé de la même façon que l'ester méthylique de l'exemple 1 ; on utilise cependant du 1-hep-tanol et du 1-heptylate de sodium à la place d'alcool méthylique et de méthylate de sodium; on chauffe au bain-marie et on utilise les mêmes quantités molaires d'ester interne et de 1-heptylàte de sodium que dans l'exemple 1. Un lavage de la résine Dowex est effectué avec de l'alcool 1-heptylique, et le résidu obtenu par évaporation de la substance filtrée est dissous dans 50 ml d'un mélange chlorure de méthylène/l-heptanol 1/1. Le rendement en produit brut est de 3,9 g. On effectue également une purification comme dans l'exemple 1. Le rendement en ester 1-heptylique du ganglioside GMi purifié est de 4,3 g.
Un examen par spectroscopie IR sur des pellets de KBr montre la raie typique de l'ester à 1750 cm-1. Une analyse chromatographique du produit, effectuée de la même façon que dans l'exemple 1, montre la présence d'un composé unitaire ayant un Rf de 0,89 et l'absence du ganglioside GM1 et de son ester interne (Rf 0,65 et 0,75, respectivement). Une hydrolyse par Na2C03, telle que décrite dans l'exemple 1, donne le ganglioside GM1.
Exemple 57
Mélange d'esters 1-heptyliques d'un mélange de gangliosides
On prépare le mélange des esters 1-heptyliques et on l'isole de la même façon que le mélange d'esters méthyliques de l'exemple 2 en utilisant cependant du 1-heptanol et du 1-heptylate de sodium au lieu d'alcool méthylique et de méthylate de sodium, on chauffe au bain-marie et on utilise 5 g de mélange d'ester interne et 809,8 mg (5,86 mM) de 1-heptylate de sodium.
On lave la résine Dowex avec de l'alcool 1-heptylique et l'on dissout le résidu obtenu par évaporation de la substance filtrée dans 50 ml d'un mélange chloroforme/éthanol 1/1. Le rendement en produit brut est de 5,2 g. On effectue également une purification comme dans l'exemple 2. Le rendement en produit brut est de 5,2 g. Une purification est également effectuée comme dans l'exemple 2. Le rendement en mélange d'esters purifiés est de 4,3 g.
Un examen par spectroscopie IR sur des pellets de KBr montre la raie typique de l'ester à 1750 cm-1. Lorsque l'on procède à une Chromatographie sur plaques de gel de silice avec une solution fraîchement préparée d'un mélange chloroforme/méthanol/hydroxyde de tétraméthylammonium 1M 55/45/10 et à une détermination avec un réactif d'Ehrlich, le produit présente un Rf de 0,68 à 0,90 (mélange de gangliosides: 0,20 à 0,60). Une transestérification complète est démontrée de la même façon que décrit dans l'exemple 2.
Exemple 58
Ester 2-méthyl-l-pentylique du ganglioside Gmi
L'ester 2-mêthyl-l-pentylique du GM1 est préparé et isolé de la même façon que l'ester méthylique de l'exemple 1 ; on utilise cependant du 2-méthyl-l-pentanol et du 2-méthyl-l-pentylate de sodium à la place d'alcool méthylique et de méthylate de sodium; on chauffe au bain-marie et on utilise les mêmes quantités molaires d'ester interne et de 2-méthyl-l-pentylate de sodium que dans l'exemple 1. Un lavage de la résine Dowex est effectué avec de l'alcool 2-méthyl-l-pentylique, et le résidu obtenu par évaporation de la substance filtrée est dissous dans 50 ml d'un mélange chlorure de méthylène/2-méthyl-l -pentanol 1/1. Le rendement en produit brut est de 5,1 g. On effectue également une purification comme dans l'exemple 1. Le rendement en ester 2-méthyl-l-pentylique du ganglioside GMi purifié est de 4,4 g.
Un examen par spectroscopie IR sur des pellets de KBr montre la raie typique de l'ester à 1750 cm-1. Une analyse chromatographique du produit, effectuée de la même façon que dans l'exemple 1, montre la présence d'un composé unitaire ayant un Rf de 0,90 et l'absence du ganglioside GM1 et de son ester interne (Rf 0,65 et 0,75, respectivement). Une hydrolyse par Na2C03, telle que décrite dans l'exemple 1, donne le ganglioside GM1.
Exemple 59
Mélange d'esters 2-méthyl-l-pentyligues d'un mélange de gangliosides
On prépare le mélange d'esters 2-méthyl-l-pentyliques et on l'isole de la même façon que le mélange d'esters méthyliques de l'exemple 2 en utilisant cependant du 2-méthyl-l-pentanol et du 2-méthyl-l-pentylate de sodium au lieu d'alcool méthylique et de méthylate de sodium, on chauffe au bain-marie et on utilise 5 g de mélange d'ester interne et 727,7 mg (5,86 mM) de 2-méthyl-l-penty-late de sodium.
On lave la résine Dowex avec de l'alcool 2-méthyl-l-pentylique et l'on dissout le résidu obtenu par évaporation de la substance filtrée dans 50 ml d'un mélange chloroforme/éthanol 1/1. Le rendement en produit brut est de 5,3 g. On effectue également une purification comme dans l'exemple 2. Le rendement en mélange d'esters purifiés est de 4,4 g.
Un examen par spectroscopie IR sur des pellets de KBr montre la raie typique de l'ester à 1750 cm-1. Lorsque l'on procède à une Chromatographie sur plaques de gel de silice avec une solution fraîchement préparée d'un mélange chloroforme/méthanol/hydroxyde de tétraméthylammonium 1M 55/45/10 et à une détermination avec un réactif d'Ehrlich, le produit présente un Rf de 0,70 à 0,93 (mélange de gangliosides: 0,20 à 0,60). Une transestérification complète est démontrée de la même façon que décrit dans l'exemple 2.
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Exemple 60
Ester 3-méthyl-2-pentylique du ganglioside GMI
L'ester 3-méthyl-2-pentylique du GMI est préparé et isolé de la même façon que l'ester méthylique de l'exemple 1 ; on utilise cependant du 3-méthyl-2-pentanol et du 3-méthyl-2-pentylate de sodium à la place d'alcool méthylique et de méthylate de sodium; on chauffe au bain-marie et on utilise les mêmes quantités molaires d'ester interne et de 3-méthyl-2-pentylate de sodium que dans l'exemple 1. Un lavage de la résine Dowex est effectué avec de l'alcool 3-méthyl-
2-pentylique, et le résidu obtenu par évaporation de la substance filtrée est dissous dans 50 ml d'un mélange chlorure de méthylène/
3-méthyl-2-pentanol 1/1. Le rendement en produit brut est de 5,1 g. On effectue également une purification comme dans l'exemple 1. Le rendement en ester 3-méthyl-2-pentylique du ganglioside Gmi purifié est de 4,2 g.
Un examen par spectroscopie IR sur des pellets de KBr montre la raie typique de l'ester à 1750 cm-1. Une analyse chromatographique du produit, effectuée de la même façon que dans l'exemple 1, montre la présence d'un composé unitaire ayant un Rf de 0,92 et l'absence du ganglioside GMi et de son ester interne (Rf 0,65 et 0,75, respectivement). Une hydrolyse par Na2C03, telle que décrite dans l'exemple 1, donne le ganglioside GM1.
Exemple 61
Mélange d'esters 3-méthyl-2-pentyliques d'un mélange de gangliosides
On prépare le mélange des esters 3-méthyl-2-pentyliques et on l'isole de la même façon que le mélange d'esters méthyliques de l'exemple 2 en utilisant cependant du 3-méthyl-2-pentanol et du 3-méthyl-2-pentylate de sodium au lieu d'alcool méthylique et de méthylate de sodium, on chauffe au bain-marie et on utilise 5 g de mélange d'ester interne et 727,7 mg (5,86 mM) de 3-méthyl-2-penty-late de sodium.
On lave la résine Dowex avec de l'alcool 3-méthyl-2-pentylique et l'on dissout le résidu obtenu par évaporation de la substance filtrée dans 50 ml d'un mélange chloroforme/éthanol 1/1. Le rendement en produit brut est de 5,3 g. On effectue également une purification comme dans l'exemple 2. Le rendement en mélange d'esters purifiés est de 4,4 g.
Un examen par spectroscopie IR sur des pellets de KBr montre la raie typique de l'ester à 1750 cm-1. Lorsque l'on procède à une Chromatographie sur plaques de gel de silice avec une solution fraîchement préparée d'un mélange chloroforme/méthanol/hydroxyde de tétraméthylammonium 1M 55/45/10 et à une détermination avec un réactif d'Ehrlich, le produit présente un Rf de 0,72 à 0,95 (mélange de gangliosides: 0,20 à 0,60). Une transestérification complète est démontrée de la même façon que décrit dans l'exemple 2.
Exemple 62
Ester-2-méthoxyéthylique du ganglioside GM1
L'ester 2-méthoxyéthylique du GM1 est préparé et isolé de la même façon que l'ester méthylique de l'exemple 1 ; on utilise cependant du 2-méthoxyéthanol et du 2-méthoxyéthylate de sodium à la place d'alcool méthylique et de méthylate de sodium, on chauffe au bain-marie et on utilise les mêmes quantités molaires d'ester interne et de 2-méthoxyéthylate de sodium que dans l'exemple 1. Un lavage de la résine Dowex est effectué avec de l'alcool 2-méthoxyéthylique, et le résidu obtenu par évaporation de la substance filtrée est dissous dans 50 ml d'un mélange chlorure de méthylène/2-méthoxyéthanol 1/1. Le rendement en produit brut est de 4,9 g. On effectue également une purification comme dans l'exemple 1. Le rendement en ester 2-méthoxyéthylique du ganglioside GMI purifié est de 4,3 g.
Un examen par spectroscopie IR sur des pellets de KBr montre la raie typique de l'ester à 1750 cm-1. Une analyse chromatographique du produit, effectuée de la même façon que dans l'exemple 1, montre la présence d'un composé unitaire ayant un Rf de 0,77 et l'absence du ganglioside GM1 et de son ester interne (Rf 0,65 et 0,75,
respectivement). Une hydrolyse par Na2C03, telle que décrite dans l'exemple 1, donne le ganglioside GMI.
Exemple 63
Mélange d'esters 2-méthoxyéthyliques d'un mélange de gangliosides
On prépare le mélange d'esters 2-méthoxyéthyliques et on l'isole de la même façon que le mélange d'esters méthyliques de l'exemple 2 en utilisant cependant du 2-méthoxyéthanol et du 2-méthoxyéthylate de sodium au lieu d'alcool méthylique et de méthylate de sodium, on chauffe au bain-marie et on utilise 5 g de mélange d'ester interne et 574,9 mg (5,86 mM) de 2-méthoxyéthylate de sodium.
On lave la résine Dowex avec de l'alcool 2-méthoxyéthylique et l'on dissout le résidu obtenu par évaporation de la substance filtrée dans 50 ml d'un mélange chloroforme/éthanol 1/1. Le rendement en produit brut est de 5,2 g. On effectue également une purification sur des pellets de KBr, qui montre la raie typique de l'ester à 1750 cm-1. Lorsque l'on procède à une Chromatographie sur plaques de gel de silice avec une solution fraîchement préparée d'un mélange chloroforme/méthanol/hydroxyde de tétraméthylammonium 1M 55/45/10 et à une détermination avec un réactif d'Ehrlich, le produit présente un Rf de 0,51 à 0,78 (mélange de gangliosides: 0,20 à 0,60). Une transestérification complète est démontrée de la même façon que décrit dans l'exemple 2.
Exemple 64
Ester l-méthoxy-2-propylique du ganglioside Gmi
L'ester l-méthoxy-2-propylique du Gmi est préparé et isolé de la même façon que l'ester méthylique de l'exemple 1 en utilisant cependant du l-méthoxy-2-propanol et du l-méthoxy-2-propylate de sodium à la place d'alcool méthylique et de méthylate de sodium, on chauffe au bain-marie et on utilise les mêmes quantités molaires d'ester interne et de l-méthoxy-2-propylate de sodium que dans l'exemple 1. Un lavage de la résine Dowex est effectué avec de l'alcool l-méthoxy-2-propylique, et le résidu obtenu par évaporation de la substance filtrée est dissous dans 50 ml d'un mélange chlorure de méthylène/l-méthoxy-2-propanol 1/1. Le rendement en produit brut est de 4,9 g. On effectue également une purification comme dans l'exemple 1. Le rendement en ester 2-méthoxyéthylique du ganglioside Gmi purifié est de 4,2 g.
Un examen par spectroscopie IR sur des pellets de KBr montre la raie typique de l'ester à 1750 cm-1. Une analyse chromatographique du produit, effectuée de la même façon que dans l'exemple 1, montre la présence d'un composé unitaire ayant un Rf de 0,81 et l'absence du ganglioside Gmi et de son ester interne (Rf 0,65 et 0,75, respectivement). Une hydrolyse par Na2C03, telle que décrite dans l'exemple 1, donne le ganglioside GMi-
Exemple 65
Mélange d'esters l-méthoxy-2-propyliques d'un mélange de gangliosides
On prépare le mélange d'esters l-méthoxy-2-propyliques et on l'isole de la même façon que le mélange d'esters méthyliques de l'exemple 2 en utilisant cependant du l-méthoxy-2-propanol et du l-méthoxy-2-propylate de sodium au heu d'alcool méthylique et de méthylate de sodium, on chauffe au bain-marie et on utilise 5 g de mélange d'ester interne et 657,0 mg (5,86 mM) de l-méthoxy-2-propylate de sodium.
On lave la résine Dowex avec de l'alcool l-méthoxy-2-propylique et l'on dissout le résidu obtenu par évaporation de la substance filtrée dans 50 ml d'un mélange chloroforme/éthanol 1/1. Le rendement en produit brut est de 5,2 g. On effectue également une purification comme dans l'exemple 2. Le rendement en mélange d'esters purifiés est de 4,3 g.
Un examen par spectroscopie IR sur des pellets de KBr montre la raie typique de l'ester à 1750 cm-1. Lorsque l'on procède à une Chromatographie sur plaques de gel de silice avec une solution fraîchement préparée d'un mélange chloroforme/méthanol/hydroxyde
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20
de tétraméthylammonium IM 55/45/10 et à une détermination avec un réactif d'Ehrlich, le produit présente un Rf de 0,52 à 0,80 (mélange de gangliosides: 0,20 à 0,60). Une transestérification complète est démontrée de la même façon que décrit dans l'exemple 2.
Exemple 66
Ester cyclohexylique du ganglioside GMi
5 g de sel de potassium du ganglioside GM1 (3,14 mM) sont dissous dans 50 ml de DMSO et 661,5 mg (3,75 mM) de bromocy-clohexane et 625 mg (3,75 mM) de Kl sont ajoutés à la solution. On laisse réagir pendant 48 heures à 25° C. A l'achèvement de la réaction, on procède à la partition de la solution avec un mélange n-butanol/H20 2/1 pour éliminer le DMSO et les sels. On évapore la solution de butanol par séchage et l'on rassemble le résidu dans 50 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 1/1 et l'on précipite le produit avec 250 ml d'acétone.
Le produit brut ainsi obtenu (5,2 g) est ensuite purifié par Chromatographie préparatìve sur colonne de gel de silice en utilisant comme solvant un mélange chloroforme/méthanol/eau 60/35/8.
On mélange les fractions pures, on les évapore, on redissout dans 15 ml d'un mélange chloroforme/isopropanol 1/1 et l'on précipite le produit avec 75 ml d'acétone. Le rendement en ester cyclohexylique pur est de 4,4 g.
Une spectroscopie IR, effectuée sur des pellets de KBr, montre la raie typique de l'ester à 1750 cm"1. Par Chromatographie sur plaques de gel de silice avec un mélange chloroforme/méthanol/ CaCl2 à 0,3% 60/40/9 et avec un mélange chloroforme/méthanol/ ammoniac 2,5N 55/45/10 et détermination avec du réactif d'Ehrlich, on constate que le produit est unitaire et présente un Rf de 0,70 et 0,58, respectivement, et qu'il est exempt du ganglioside GM! de départ (Rf 0,40 et 0,45, respectivement).
Le traitement avec une solution 0,1N de Na2C03 à 60° C pendant 1 heure occasionne la rupture de la liaison ester en redonnant le ganglioside GMI de départ.
Exemple 67
Ester undècylique du ganglioside GMl
5 g de sel de potassium du ganglioside GMi (3,14 mM) sont dissous dans 50 ml de DMSO et 882,1 mg (3,75 mM) de 1-bromo-undécane et 625 mg (3,75 mM) de ICI sont ajoutés à la solution. On laisse réagir pendant 48 heures à 25° C. A l'achèvement de la réaction, on procède à la partition de la solution avec un mélange n-butanol/H20 2/1 pour éliminer le DMSO et les sels. On évapore la solution de butanol par séchage et l'on rassemble le résidu dans 50 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 1/1 et l'on précipite le produit avec 250 ml d'acétone.
Le produit brut ainsi obtenu (5,3 g) est ensuite purifié par Chromatographie préparatìve sur colonne de gel de silice en utilisant comme solvant un mélange chloroforme/méthanol/eau 60/35/8.
On mélange les fractions pures, on les évapore, on redissout dans 15 ml d'un mélange chloroforme/isopropanol 1/1 et l'on précipite le produit avec 75 ml d'acétone. Le rendement en ester undècylique pur est de 4,9 g.
Une spectroscopie IR, effectuée sur des pellets de KBr, montre la raie typique de l'ester à 1750 cm-1. Par Chromatographie sur plaques de gel de silice avec un mélange chloroforme/méthanol/ CaCl2 à 0,3% 60/40/9 et avec un mélange chloroforme/méthanol/ ammoniac 2,5N 55/45/10 et détermination avec du réactif d'Ehrlich, on constate que le produit est unitaire et présente un Rf de 0,69 et 0,56, respectivement, et qu'il est exempt du ganglioside GM, de départ (Rf 0,40 et 0,45, respectivement).
Le traitement avec une solution 0,1N de Na2C03 à 60° C pendant 1 heure occasionne la rupture de la liaison ester en redonnant le ganglioside Gmi de départ.
Exemple 68
Ester 1-hydroxyundécan-ll-ylique du ganglioside GMI
5 g de sel de potassium du ganglioside GMi (3,14 mM) sont dissous dans 50 ml de DMSO et 0,42 mg (3,75 mM) de 11-bromo-l-undécanol et 625 mg (3,75 mM) de Kl sont ajoutés à la solution. On laisse réagir pendant 48 heures à 25° C. A l'achèvement de la réaction, on procède à la partition de la solution avec un mélange n-butanol/H20 2/1 pour éliminer le DMSO et les sels. On évapore la solution de butanol par séchage et l'on rassemble le résidu dans 50 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 1/1 et l'on précipite le produit avec 250 ml d'acétone.
Le produit brut ainsi obtenu (5,3 g) est ensuite purifié par Chromatographie préparatìve sur colonne de gel de silice en utilisant comme solvant un mélange chloroforme/méthanol/eau 60/35/8.
On mélange les fractions pures, on les évapore, on redissout dans 15 ml d'un mélange chloroforme/isopropanol 1/1 et l'on précipite le produit avec 75 ml d'acétone. Le rendement en ester 11-hydroxy-undécan-11-ylique pur est de 4,8 g.
Une spectroscopie IR, effectuée sur des pellets de KBr, montre la raie typique de l'ester à 1750 cm"1. Par Chromatographie sur plaques de gel de silice avec un mélange chloroforme/méthanol/ CaCl2 à 0,3% 60/40/9 et avec un mélange chloroforme/méthanol/ ammoniac 2,5N 55/45/10 et après détermination avec du réactif d'Ehrlich, on constate que le produit est unitaire et présente un Rf de 0,65 et 0,52, respectivement, et qu'il est exempt du ganglioside Gm) de départ (Rf 0,40 et 0,45, respectivement).
Le traitement avec une solution 0,1N de Na2C03 à 60° C pendant 1 heure occasionne la rupture de la liaison ester en redonnant le ganglioside GMi de départ.
Exemple 69
Ester cyanobutyr-4-ylique du ganglioside GMI
5 g de sel de potassium du ganglioside GM1 (3,14 mM) sont dissous dans 50 ml de DMSO et 550 mg (3,75 mM) de 4-bromobuty-ronitrile et 625 mg (3,75 mM) de Kl sont ajoutés à la solution. On laisse réagir pendant 48 heures à 25° C. A l'achèvement de la réaction, on procède à la partition de la solution avec un mélange n-butanol/H20 2/1 pour éliminer le DMSO et les sels. On évapore la solution de butanol par séchage, on rassemble le résidu dans 50 ml d'un mélange chloroforme/méthanol 1/1 et l'on précipite le produit avec 250 ml d'acétone.
Le produit brut ainsi obtenu (5,1 g) est ensuite purifié par Chromatographie préparatìve sur colonne de gel de silice en utilisant comme solvant un mélange chloroforme/méthanol/eau 60/35/8.
On mélange les fractions pures, on les évapore, on redissout dans 15 ml d'un mélange chloroforme/isopropanol 1/1 et l'on précipite le produit avec 75 ml d'acétone. Le rendement en ester cyanobutyr-4-ylique pur est de 4,6 g.
Une spectroscopie IR, effectuée sur des pellets de KBr, montre la raie typique de l'ester à 1750 cm"1. Par Chromatographie sur plaques de gel de silice avec un mélange chloroforme/méthanol/ CaCl2 à 0,3% 60/40/9 et avec un mélange chloroforme/méthanol/ ammoniac 2,5N 55/45/10 et après détermination avec du réactif d'Ehrlich, on constate que le produit est unitaire et présente un Rf de 0,42 et 0,45, respectivement, et qu'il est exempt du ganglioside Gmi de départ (Rf 0,40 et 0,45, respectivement).
Le traitement avec une solution 0,1N de Na2C03 à 60° C pendant 1 heure occasionne la rupture de la liaison ester en redonnant le ganglioside GMi original.
Exemple 70
Pyrrolidine amide du ganglioside Gmi
Ce dérivé est préparé à partir de 5 g d'ester interne du ganglioside Gmi (3,27 mM) et de 25 ml de Pyrrolidine de la même façon que dans l'exemple 16 et l'on suit également la même méthode de purification. On obtient un rendement en Pyrrolidine amide pure du ganglioside GM1 de 5,1 g.
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Les données spectroscopiques IR sont les mêmes que pour le méthylamide de l'exemple 16, et un examen par Chromatographie dans les mêmes conditions que dans cet exemple démontre que le produit est unitaire et exempt de GM[, ses valeurs Rf étant de 0,29 et 0,46, respectivement (Rf de GM1 : 0,35 et 0,40, respectivement). 5
Exemple 71
Mélange de Pyrrolidines amides d'un mélange de gangliosides
Ce mélange de dérivés est préparé avec 5 g du mélange des esters internes de gangliosides utilisé dans l'exemple 17 et de 25 ml de pyr- io rolidine, de la même façon que dans l'exemple 17, et l'on utilise la même méthode de purification. On obtient un rendement de 4,9 g du mélange de Pyrrolidines amides du mélange de gangliosides.
Les valeurs Rf déterminées par Chromatographie sur plaques de gel de silice avec un mélange chloroforme/méthanol/ammoniac 4N is 55/45/10 et un mélange chloroforme/méthanol/CaCl2 à 0,3%
60/35/8, et après détermination avec du résorcinol comme réactif,
sont de 0,08 à 0,40 et 0,35 à 0,48, respectivement (Rf du mélange initial de gangliosides : 0,15 à 0,70 et 0,05 à 0,40, respectivement).
Exemple 72 20
Pipéridine amide du ganglioside GM,
Ce dérivé est préparé à partir de 5 g d'ester interne du ganglioside GM1 (3,27 mM) et de 25 ml de pipéridine de la même façon que dans l'exemple 16 et l'on suit la même méthode de purification. On 25 obtient un rendement en pipéridine amide pure du ganglioside GM1 de 5,2 g.
Les données spectroscopiques IR sont les mêmes que pour le mé-thylamine de l'exemple 16, et un examen par Chromatographie dans les mêmes conditions que dans cet exemple démontre que le produit 30 est unitaire et exempt de GM1, ses valeurs Rf étant de 0,30 et 0,50, respectivement (Rf de GM1 : 0,35 et 0,40, respectivement).
Exemple 73
Mélange de pipéridines amides d'un mélange de gangliosides 35
Ce mélange de dérivés est préparé avec 5 g du mélange des esters internes de gangliosides utilisé dans l'exemple 17 et de 25 ml de pipéridine de la même façon que dans l'exemple 17, et l'on utilise la même méthode de purification. On obtient un rendement de 5,1 g du mélange de pipéridines amides du mélange de gangliosides. *>
Les valeurs Rf déterminées par Chromatographie sur plaques de gel de silice avec un mélange chloroforme/méthanol/ammoniac 4N 55/45/10 et un mélange chloroforme/méthanol/CaCl2 à 0,3% 60/35/8, et après détermination avec du résorcinol comme réactif,
sont de 0,10 à 0,42 et 0,37 à 0,50, respectivement (Rf du mélange 45 original de gangliosides: 0,15 à 0,70 et 0,05 à 0,40, respectivement).
Exemple 74
Tétrahydrofurfurylamide du ganglioside Gm
Ce dérivé est préparé à partir de 5 g d'ester interne du ganglio- 50 side GMi (3,27 mM) et de 25 ml de tétrahydrofurfurylamine de la même façon que dans l'exemple 16, et l'on suit la même méthode de purification. On obtient un rendement en tétrahydrofurfurylamide pur du ganglioside GMi de 5,3 g.
Les données spectroscopiques IR sont les mêmes que pour le mé- 55 thylamide de l'exemple 16, et un examen par Chromatographie dans les mêmes conditions que dans cet exemple démontre que le produit est unitaire et exempt de GM1, ses valeurs Rf étant de 0,33 et 0,52, respectivement (Rf de GM1 : 0,35 et 0,40, respectivement).
60
Exemple 75
Mélange de tétrahydrofurfurylamides d'un mélange de gangliosides
Ce mélange de dérivés est préparé avec 5 g du mélange des esters internes de gangliosides utilisé dans l'exemple 17 et 25 ml de tétrahydrofurfurylamine de la même façon que dans l'exemple 17, et l'on 65 utilise également la même méthode de purification. On obtient un ■rendement de 5,2 g du mélange de tétrahydrofurfurylamides du mélange de gangliosides.
Les valeurs Rf déterminées par Chromatographie sur plaques de gel de silice avec un mélange chloroforme/méthanol/ammoniac 4N 55/45/10 et un mélange chloroforme/méthanol/CaCl2 à 0,3% 60/35/8, et après détermination avec du résorcinol comme réactif, sont de 0,12 à 0,45 et 0,40 à 0,57, respectivement (Rf du mélange original de gangliosides: 0,15 à 0,70 et 0,05 à 0,40, respectivement).
Exemple 76
2-Méthylpipéridine amide du ganglioside GMI
Ce dérivé est préparé à partir de 5 g d'ester interne du ganglioside GMi (3,27 mM) et de 25 ml de 2-méthylpipéridine amine de la même façon que dans l'exemple 16, et l'on suit également la même méthode de purification. On obtient un rendement en 2-méthylpipéridine amide pure du ganglioside GMi de 5,2 g.
Les données spectroscopiques IR sont les mêmes que pour le méthylamide de l'exemple 16, et un examen par Chromatographie dans les mêmes conditions que dans cet exemple démontre que le produit est unitaire et exempt de GMi, ses valeurs Rf étant de 0,33 et 0,54, respectivement (Rf de GMi : 0,35 et 0,40, respectivement).
Exemple 77
Mélange de 2-méthylpipéridines amides d'un mélange de gangliosides Ce mélange de dérivés est préparé avec 5 g du mélange des esters internes de gangliosides utilisé dans l'exemple 17 et 25 ml de 2-mé-thylpipéridine de la même façon que dans l'exemple 17, et l'on utilise la même méthode de purification. On obtient un rendement de 5,4 g du mélange de 2-méthylpipéridines amides du mélange de gangliosides.
Les valeurs Rf déterminées par Chromatographie sur plaques de gel de silice avec un mélange chloroforme/méthanol/ammoniac 4N 55/45/10 et un mélange chloroforme/méthanol/CaCl2 à 0,3% 60/35/8, et après détermination avec du résorcinol comme réactif, sont de 0,14 à 0,46 et 0,39 à 0,59, respectivement (Rf du mélange original de gangliosides: 0,15 à 0,70 et 0,05 à 0,40, respectivement).
Exemple 78
1-Méthylpipérazine amide du ganglioside GM,
Ce dérivé est préparé à partir de 5 g d'ester interne du ganglioside GM1 (3,27 mM) et de 25 ml de 1-méthylpipérazine de la même façon que dans l'exemple 16, et l'on suit la même méthode de purification. On obtient un rendement en 1-méthylpipérazine amide pure du ganglioside GMi de 5,1 g.
Les données spectroscopiques IR sont les mêmes que pour le méthylamide de l'exemple 16, et un examen par Chromatographie dans les mêmes conditions que dans cet exemple démontre que le produit est unitaire et exempt de GMi, ses valeurs Rf étant de 0,04 et 0,08, respectivement (Rf de GM1 :0,35 et 0,40, respectivement).
Exemple 79
Mélange de 1-méthylpipérazines amides d'un mélange de gangliosides
Ce mélange de dérivés est préparé avec 5 g du mélange des esters internes de gangliosides utilisé dans l'exemple 17 et 25 ml de 1-méthyl-pipérazine de la même façon que dans l'exemple 17, et l'on utilise la même méthode de purification. On obtient un rendement de 5,5 g du mélange de 1-méthylpipérazine du mélange de gangliosides.
Les valeurs Rf déterminées par Chromatographie sur plaques de gel de silice avec un mélange chloroforme/méthanol/ammoniac 4N 55/45/10 et un mélange chloroforme/méthanol/CaCl2 à 0,3% 60/35/8, et après détermination avec du résorcinol comme réactif, sont de 0,01 à 0,06 et 0,01 à 0,12, respectivement (Rf du mélange original de gangliosides: 0,15 à 0,70 et 0,05 à 0,40, respectivement.
Exemple 80
2-Phényléthylamide du ganglioside GM,
Ce dérivé est préparé à partir de 5 g d'ester interne du ganglioside Gmi (3,27 mM) et de 25 ml de 2-phényléthylamide de la même
670 645
22
30
façon que dans l'exemple 16, et l'on suit la même méthode de purification. On obtient un rendement en 2-phényléthylamide pur du ganglioside Gmi de 5,3 g.
Les données spectroscopiques IR sont les mêmes que pour le méthylamide de l'exemple 16, et un examen par Chromatographie dans s les mêmes conditions que dans cet exemple démontre que le produit est unitaire et exempt de GM1, ses valeurs Rf étant de 0,33 et 0,73, respectivement (Rf de GM1 : 0,35 et 0,40, respectivement).
Exemple 81 io
Mélange de 2-phènyléthylamides d'un mélange de gangliosides
Ce mélange de dérivés est préparé avec 5 g du mélange des esters internes de gangliosides utilisé dans l'exemple 17 et 25 ml de 2-phényléthylamide de la même façon que dans l'exemple 17, et l'on utilise la même méthode de purification. On obtient un rendement de 5,5 g du mélange de 2-phényléthylamides du mélange de gangliosides.
Les valeurs Rf déterminées par Chromatographie sur plaques de gel de silice avec un mélange chloroforme/méthanol/ammoniac 4N 55/45/10 et un mélange chloroforme/méthanol/CaCl2 à 0,3% 60/35/8, et après détermination avec du résorcinol comme réactif,
sont de 0,12 à 0,44 et 0,60 à 0,78, respectivement (Rf du mélange original de gangliosides: 0,15 à 0,70 et 0,05 à 0,40, respectivement).
Préparation pharmaceutique: 25
Comme on l'a discuté ci-dessus, l'un des objets de la présente invention réside dans des préparations pharmaceutiques qui contiennent comme substances actives un ou plusieurs des nouveaux dérivés gangliosides ici décrits et, en particulier, ceux qui dérivent des groupes de gangliosides A et B, aussi bien que les produits spécifiques énumérés auparavant. En outre, les préparations pharmaceutiques selon la présente invention comprennent les dérivés estérifiés ou les amides et leurs dérivés acylés, y compris ceux déjà connus, et les nouveaux dérivés décrits ci-dessus. Ceux que l'on préfère particulièrement sont les esters méthyliques des gangliosides GMi et GM3 et leurs dérivés peracylés aussi bien que l'amide du ganglioside GM3.
Les préparations pharmaceutiques selon l'invention peuvent être des préparations pour utilisation orale, rectale, parentêrale, locale ou intradermique. Elles se présentent donc sous forme solide ou semi-solide, telle que pilules, comprimés, cachets recouverts de gélatine, capsules, suppositoires ou cachets de gélatine molle. Pour utilisation par voie parentêrale, il est possible d'utiliser ces formes destinées à l'administration intramusculaire, sous-cutanée ou intradermique ou destinées à des perfusions ou injections intraveineuses; elles peuvent donc se présenter comme des solutions des composés actifs ou de poudres lyophilisées des composés actifs que l'on ajoute à un ou plusieurs excipients ou diluants pharmaceutiquement acceptables convenant aux usages ci-dessus et dont la molaritê osmotique est compatible avec celle des liquides physiologiques. Des préparations sous forme de pulvérisations telles que pulvérisation nasale, des crèmes ou des onguents pour usage topique de pansements préparés de façon convenable pour administration intradermique peuvent s'utiliser pour une application locale. Les préparations selon l'invention peuvent s'administrer à des hommes ou à des animaux. De préférence, elles doivent contenir entre 0,01 et 10% du composé actif pour les solutions, les pulvérisations, les onguents et les crèmes, et entre 1% et 100%, de préférence entre 5 et 50%, du composé actif pour les préparations solides. La dose à administrer dépend de l'indication du médecin, de l'effet recherché et de la voie d'administration choisie. Les exemples 82 et 83 illustrent les préparations pharmaceutiques selon l'invention.
40
50
60
Exemple 82
Préparations pharmaceutiques en solution pour injection
Préparation N° 1 : une ampoule de 2 ml contient: substance active chlorure de sodium
65
5 mg 16 mg tampon de citrate à pH 6 dans de l'eau distillée apyrogène q.s. pour 2 ml
La substance active peut être choisie dans le groupe constitué par les dérivés de gangliosides décrits dans l'un quelconque des exemples 14, 15, 16, 17,18,19, 20, 21, 22, 23 et 24.
Préparation N° 2: une ampoule de 2 ml contient:
substance active 50 mg chlorure de sodium 16 mg tampon de citrate à pH 6 dans de l'eau distillée apyrogène q.s. pour 2 ml
La substance active peut être choisie dans le groupe constitué par les dérivés de gangliosides décrits dans l'un quelconque des exemples 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38 et 39.
Préparation N° 3: une ampoule de 4 ml contient:
substance active 100 mg chlorure de sodium 32 mg tampon de citrate à pH 6 dans de l'eau distillée apyrogène q.s. pour 4 ml
La substance active peut être choisie dans le groupe constitué par les dérivés de gangliosides décrits dans l'un quelconque des exemples 20 à 39.
Les préparations N°s 1,2' et 3 peuvent s'administrer directement aux animaux et aux hommes par l'une des voies décrites ci-dessus. Les composés peuvent également contenir une autre substance active.
Exemple 83
Compositions pharmaceutiques préparées dans des flacons doubles
Les préparations illustrées dans cet exemple s'obtiennent avec un double flacon. Le premier flacon contient la substance active sous la forme d'une poudre lyophilisée, en quantités qui peuvent varier entre 10 et 90% en poids, en même temps-qu'un excipient pharmaceutiquement acceptable, glycine ou mannitoL Le deuxième flacon contient le solvant, par exemple une solution de chlorure de sodium et un tampon de citrate.
On mélange le contenu des deux flacons immédiatement avant usage, et la poudre lyophilisée de la substance active se dissout rapidement, ce qui donne une solution injectable. Les flacons contenant la poudre lyophilisée de la substance active représentent la forme pharmaceutique préférée de la présente invention.
Système N° 1
a) un flacon de 2 ml lyophilisé contient:
substance active 5 mg glycine 30 mg b) une ampoule de 2 ml de solvant contient:
chlorure de sodium 16 mg tampon de citrate dans une eau apyrogène q.s. pour 2 ml
La substance active peut être choisie dans le groupe constitué par les dérivés de gangliosides décrits dans l'un quelconque des exemples 14,15,16,17,18,19, 20, 21, 22, 23 et 24.
Système N° 2
a) une ampoule lyophilisée de 3 ml contient:
substance active 5 mg mannitol 40 mg b) une ampoule de 2 ml de solvant contient:
chlorure de sodium 16 mg tampon de citrate dans une eau apyrogène q.s. pour 2 ml
La substance active peut être choisie dans le groupe constitué par les dérivés de gangliosides décrits dans l'un quelconque des exemples 1,2,4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12 et 13.
23
670 645
Système N° 3
a) une ampoule lyophilisée de 3 ml contient:
substance active 50 mg glycine 25 mg
5
b) une ampoule de 3 ml de solvant contient:
chlorure de sodium 24 mg tampon de citrate dans une eau apyrogène q.s. pour 3 ml
La substance active peut être choisie dans le groupe constitué par les dérivés de gangliosides décrits dans l'un quelconque des exemples 10 14, 15, 16, 17,21, 37, 38 et 39.
Système N° 4
a) une ampoule lyophilisée de 3 ml contient:
substance active 50 mg 15
mannitol 20 mg b) une ampoule de 3 ml de solvant contient:
chlorure de sodium 24 mg tampon de citrate dans une eau apyrogène q.s. pour 3 ml20
La substance active peut être choisie dans le groupe constitué par les dérivés de gangliosides décrits dans l'un quelconque des exemples 10 à 13,66 et 67.
Système N° 5 25
a) une ampoule lyophilisée de 5 ml contient:
substance active 150 mg glycine 50 mg b) une ampoule de 4 ml de solvant contient: 30
chlorure de sodium 32 mg tampon de citrate dans une eau apyrogène q.s. pour 4 ml
La substance active peut être choisie dans le groupe constitué par les dérivés de gangliosides décrits dans l'un quelconque des exemples 35 14 à 39.
Système N° 6
a) une ampoule lyophilisée de 5 ml contient:
substance active 100 mg 40
mannitol 40 mg b) une ampoule de 4 ml de solvant contient:
chlorure de sodium 32 mg tampon de citrate dans une eau apyrogène q.s. pour 4 ml 4S
La substance active peut être choisie dans le groupe constitué par les dérivés de gangliosides décrits dans l'un quelconque des exemples 5 à 9.
Système N° 7 50
a) un flacon de 3 ml contient:
substance active micronisée stérile 40 mg
Système N° 8
a) un flacon de 5 ml contient:
substance active micronisée stérile b) une ampoule de 4 ml de solvant contient:
Tween 80 lécithine de soja chlorure de sodium 36 mg tampon de citrate dans une eau apyrogène q.s. pour 4 ml
La substance active peut être choisie dans le groupe constitué par les dérivés de gangliosides décrits dans l'un quelconque des exemples 40 à 45.
Activité thérapeutique
Tous les nouveaux dérivés de gangliosides discutés ci-dessus, et en particulier ceux des groupes A et B, ainsi que les composés spécifiques énumérés ci-dessus, contiennent les ingrédients actifs des préparations pharmaceutiques de la présente invention. En outre, ces préparations pharmaceutiques peuvent contenir quelques dérivés de gangliosides du type décrit ci-dessus et déjà connus dans la littérature, tels que l'ester méthylique du ganglioside GM1 ou son dérivé peracétylé.
Comme on l'a discuté ci-dessus, l'action thérapeutique des gangliosides et de quelques dérivés, par exemple ceux de la présente invention, est due à une stimulation du phénomène de bourgeonnement de la cellule nerveuse grâce auquel il est possible d'obtenir une récupération de la conduction de l'influx nerveux. Par exemple, l'administration in vivo d'un mélange de gangliosides obtenu à partir de cerveau de bovin, comme décrit dans l'exemple 2 (mélange GA), provoque le bourgeonnement du nerf sciatique chez les rats après écrasement et peut donc aider à la récupération de l'activité électrique du nerf au niveau du point de contact neuromusculaire.
Etant donné qu'un bourgeonnement nerveux peut être considéré comme une différenciation locale du neurone, les mécanismes biochimiques par lesquels les molécules du ganglioside produisent cet effet ont été étudiés sur la base de leur effet sur la différenciation cellulaire en utilisant des cultures cellulaires in vitro de phéocromocy-tome PC12. L'addition de gangliosides au facteur de croissance du nerf (NGF), qui est un inducteur de la différenciation des cellules de PC12 dans le milieu de culture du PC12, stimule le bourgeonnement des neurones. Cet effet peut être attribué à l'incorporation de gangliosides dans la membrane du neurone, ce qui induit une modification de ses propriétés fonctionnelles, c'est-à-dire de ses activités en-zymatiques. En fait, l'incorporation de gangliosides dans la membrane du neurone est apte à stimuler l'activité de la (Na+, K+)-ATPase. Pour mettre l'accent sur l'importance de l'activation de cet enzyme relié à la membrane, il faut se rappeler que quelques auteurs attribuent la survie, et par conséquent la différenciation des cellules ■des neurones dans une culture, à une activation de cet enzyme par le NGF. D'autre part, le rôle clé joué par cet enzyme dans l'activité électrique est bien connu, puisqu'elle est appliquée dans le mécanisme ionique de propagation des impulsions nerveuses le long de la membrane de l'axone.
Sur la base des méthodes décrites ci-dessus, on a effectué des déterminations des activités pharmacologiques exprimées en bourgeonnement de neurone dans les cellules de PC12 pour les nouveaux dérivés de gangliosides selon la présente invention. Des résultats obtenus avec la (Na+, K+)-ATPase in vitro de quelques dérivés sont également indiqués.
b) une ampoule de 3 ml de solvant contient:
Tween 80 10 mg chlorure de sodium 24 mg tampon de phosphate dans une eau apyrogène q.s. pour 3 ml La substance active peut être choisie dans le groupe constitué par les dérivés de gangliosides décrits dans l'un quelconque des exemples 40 à 45.
100 mg
15 mg 5 mg
Effets des dérivés de gangliosides sur le bourgeonnement du neurone dans les cellules de PC,2
55
Produits et méthodes:
La souche de cellules de PC12 (dérivée d'un sous-clone 1A) est fournie par le Dr P. Calissano (Laboratoire C.N.R. de Biologie cellulaire, Rome).
60 Les cellules (100 000/plaque) sont maintenues à 37° C dans un incubateur Heraeus (C02 5% et air humidifié à 95%), et on les resème sur des plaques Falcon Integrid de 60 mm sur un support de colla-gène en présence du milieu de culture suivant: RPM 1640 à 85% (Gibco), sérum équin inactivé à la chaleur 10%, sérum de fœtus de
65 veau 5% (Gibco), pénicilline 50 U/ml et streptomycine 25 mg/ml. Les cellules sont alors lavées trois fois à l'aide d'un véhicule exempt de sérum. Après trois lavages, les cellules sont incubées dans un véhicule exempt de sérum avec 50 mg/ml de NGF et en présence du
670 645
24
dérivé de ganglioside selon l'invention ou du mélange de gangliosides utilisé à titre de comparaison à des concentrations de 10-6M. L'addition au véhicule exempt de sérum de NGF (50 mg/ml) a pour effet d'interrompre la prolifération des cellules, de former des neuri-tes et d'obtenir une différenciation dès le troisième jour. Cet effet est évalué par comptage du nombre de cellules comportant des neurites le troisième jour.
Résultats
Les résultats sont indiqués sur le tableau 1 suivant. On a utilisé comme valeurs de comparaison celles obtenues avec un mélange de gangliosides obtenu selon le mode opératoire décrit dans l'exemple 2 et la fraction GMi de monosialoganglioside unique.
Tableau 1
Effets des gangliosides et de leurs dérivés selon la présente invention sur le bourgeonnement des neurites dans les cellules de PCI2
% du nombre de
Composé
Concen cellules présen tration tant des neurites le 3e jour
Contrôles
21,5
Mélange de gangliosides GA
10~'M
39,5
(voir exemple 2)
Monosialoganglioside GM)
io_6m
34,8
Ester méthylique de GA
io_6m
32,8
Ester méthylique de GM,
io_6m
35,7
Ester éthylique de GA
!0"6M
34,9
Ester éthylique de GH,
IO_6M
37,1
Ester isopropylique de GA
io_6m
37,3
Ester isopropylique de GM|
io_6m
37,0
Ester tertiobutylique de GA
io~6m
29,5
Ester tertiobutylique de GM|
10"6M
32,3
Ester benzylique de GA
io~6m
31,4
Ester benzylique de GMI
10~6M
28,3
Ester allylique de GA
io~'m
34,1
Ester allylique de GMi io_6m
31,5
Ester éthoxycarbonylmelhyli-
que de GM,
10"6M
27,3
Amide de GA
10~6M
36,3
Amide de GMI
io_6m
33,3
Méthylamide de GA
10"6M
40,0
Ethylamide de GA
I0~6M
35,0
Ethylamide de GM,
10"6M
32,2
Benzylamide de GA
10"6M
26,7
Benzylamide de GM,
10"6M
30,8
Isopropylamide de GM|
io_6m
31,4
Diméthylamide de GA
io_6m
29,3
Diméthylamide de GMl io_6m
34,3
Diéthylamide de GA
10"6M
25,0
Diélhylamide de GMi io_6m
28,5
Ethylméthylamide de GM,
io_6m
35,3
3-diméthyIaminopropyl-1 -
amide de GA
10"6m
32,9
3-diméthy laminopropy 1-1 -
amide de GM|
io~6m
37,3
Diméthylaminoéthylamide
de G„,
1(T6M
34,8
Ethanolamide de GA
io_6m
38,3
Ethanolamide de GMi
10_(1M
41,2
6-hydroxyhexyl-1 -amide
de Gm)
10"6M
36,4
Mélange de GA peracétylé
IO_6M
28,5
Gm1 peracétylé
io_6m
30,2
Ester méthylique de GA
peracétylé
I0"6M
33,6
Ester méthylique de GM,
peracétylé
io~6m
29,4
Amide de GA pcracélylc
1(t6m
25,3
Amide de GM| pcracctylc
10~fiM
31,4
Effets des dérivés de gangliosides sur la (Na+, K+)-ATPase de la membrane du neurone
Produits et méthodes a) Préparation de la fraction brute de mitochondries de cerveaux de rats (fraction P2):
Le mode opératoire de la préparation de la fraction de P2 est repris dans Morgan et coll., Biochem. Biophys. Acta, 241, 37 (1971). (Les diverses opérations sont effectuées à une température de 0 à jo 4° C; les valeurs xg représentent les forces centrifuges moyennes.)
Des rats Sprague Dawley mâles adultes (fournis par Charles River) (poids du corps: 150 à 175 g) sont décapités, et leurs cerveaux sont immédiatement enlevés et lavés dans une solution isotonique glacée. Après excision du cervelet, on homogénéise les cerveaux en 15 leur faisant effectuer 12 mouvements de haut en bas dans un homo-généiseur en verre et téflon entraîné par un moteur (jeu radial indiqué: 0,25 mm; 800 tr/min) en utilisant 4 vol. de solution d'homogénéisation (saccharose 0,32M contenant 1 mM de tampon de phosphate de potassium et d'EDTA disodique 0,1 nM, pH 7,27). La 20 substance homogénéisée, filtrée à travers quatre couches de gaze fine, est centrifugée à 1000 tr/min pendant 15 minutes. Les pellets qui en résultent sont lavés avec le même volume initial de solution d'homogénéisation et centrifugés comme décrit ci-dessus. Ce qui surnage est recueilli et centrifugé à 17 500 tr/min pendant 25 minutes 25 (ces conditions de force centrifuge gravitationnelle sont utilisées pour obtenir l'enrichissement maximum en terminaisons nerveuses dans la fraction), et les pellets sont lavés quatre fois avec 9 vol. chaque fois de solution d'homogénéisation et centrifugés (17 500 tr/min pendant 25 minutes).
30 Les pellets finals, désignés sous le nom de «fraction P2 », contiennent comme composant principal les mitochondries entières et les terminaisons nerveuses. Les pellets finals sont remis en suspension de façon homogène dans un volume convenable de solution d'homogénéisation à l'aide d'un homogénéiseur en verre et en téflon, et on 35 les utilise immédiatement pour le test. Pour éviter des incohérences dues à la conservation du produit, on prépare des fractions neuves de P2 avant chaque utilisation. Les préparations des fractions P2 ont une teneur en ganglioside de 33,9 ± 2,8 (S.D.) n moles d'acide sialique liées par milligramme de protéine.
40 b) Activation de l'enzyme ATPase:
L'activité de 1'ATPase est mesurée par spectrophotométrie selon Wallick et coll. [/. Pharm. Exptl. Therap., 189,434 (1974)]. Le mélange réactionnel, à moins que cela ne soit indiqué autrement, est 4J composé de: 50 mM de saccharose, 0,2 mM d'EDTA disodique (porté à pH 7,4), 100 mM de NaCl, 5 mM de MgCl2,100 mM de KCl, 2 mM de sel monopotassique de phospho(énol)pyruvate (PEP) (porté à pH 7,4), 3 mM d'ATP, 50 mM de Tris-HCl pH 7,4, 0,33 mM de NADH, de pyruvate kinase (PK) (30 g/ml) et de lactate 50 déhydrogénase (LDH) (10 g/ml) en volume final de 3 ml et avec un pH final de 7,2. On démarre la réaction par l'addition de 50 à 75 |j.g (comme protéine) de fraction de P2. L'activité de (Na+, K+)-ATPase est déterminée par différence entre l'activité ATPase totale et l'activité ATPase Mg2+ dépendante mesurée en présence de 3 x 55 10-5 M d'ouabaïne. Le temps pris pour chaque test simple est de 3 à 5 minutes. L'activité en ATPase est exprimée en unités internationales (LU.) (p.M d'ATP hydrolysé/mg de protéine/min). L'activité des dérivés de gangliosides (50 nM) est dosée en effectuant une incubation avec les membranes de neurones à 37° C pendant 2 heures.
60 Résultats
Les résultats des études comparatives sur l'activité de 1'ATPase sont consignés dans le tableau 2.
(Tableau en tête de la colonne suivante)
65
Il faut noter que les dérivés de gangliosides selon la présente invention ont une action plus prolongée dans le temps que celle des gangliosides et sont donc utiles comme médicaments «retard». Ce
25
670645
Tableau 2
Effets des gangliosides et de leurs dérivés sur la (Na+, K+ )-ATPase de la membrane des neurones
5
10
15
phénomène est illustré par exemple par les expériences suivantes sur la cinétique d'absorption des esters de gangliosides. 20
Distribution dans le sang in vivo des dérivés de gangliosides 1. Préparation des produits marqués
Le ganglioside marqué est préparé comme décrit par Suzuki et coll. [/. Lipid Res., 13, 687-690 (1972)] et modifié par Ghidoni et 25 coll. [Ital. J. Biochem., 23, 320-328 (1974)]. Les esters éthylique et isopropylique sont préparés par estérification de ce ganglioside marqué. La radioactivité spécifique est mesurée à la fois pour les gangliosides et les esters.
2. Traitement des animaux
Des souris suisses obtenues chez Charles River (Calco) pesant environ 20 à 25 g sont traitées par voie intraveineuse avec 10 p.C des produits. 2, 4, 8, 12,16 heures après l'administration, on sacrifie les animaux par décapitation et l'on recueille leur sang dans des flacons traités à l'héparine. La radioactivité non volatile est déterminée sur des échantillons de sang à l'aide d'un scintillate®: Packard Tricard et on les identifie ensuite par référence au ganglioside 3H et aux esters par TLC (Chromatographie en couches minces).
3. Résultats
Après administration intraveineuse du ganglioside tritié, la courbe de cinétique est biphasique et décroît avec un t/2 d'environ 3 heures, suivi par une phase lente d'élimination qui reste constante jusqu'à la 16e heure. Avec l'ester éthylique et isopropylique du ganglioside GMi, les niveaux de produits tout d'abord identifiés n'atteignent pas le maximum observé avec le produit naturel mais, avec le temps, ils atteignent des maxima plus élevés et restent à ces niveaux pendant plus longtemps. De cette façon, il y a une augmentation dans le volume de distribution et une augmentation dans le temps pendant lequel se maintiennent les doses thérapeutiques.
Produit
Concentration
% d'augmentation de l'activité de (Na+, K+)-ATPase
Contrôles
50
100
Mélange de ganglioside GA
50
(voir exemple 2)
142
Gmi
50
133
Ester méthylique de GA
50
128
Amide de GA
50
139
Ester méthylique de GM1
50
132
Amide de GMi
50
128
En raison de leurs propriétés pharmacologiques décrites ci-dessus, les dérivés de gangliosides selon la présente invention peuvent s'utiliser comme médicaments dans diverses thérapeutiques de traitement des pathologies du système nerveux, en particulier les thérapeutiques des nerfs périphériques et celles du système nerveux central.
L'utilisation thérapeutique concerne particulièrement des dérivés de gangliosides spécifiquement mentionnés ci-dessus, par exemple les groupes de dérivés de gangliosides A et B et ceux spécifiés en détail, ainsi que l'administration de tous ces dérivés aux doses indiquées ci-après. Plus particulièrement, on peut utiliser ces dérivés de gangliosides pour la thérapeutique des maladies du système nerveux périphérique d'origine traumatique, compressive, dégénérative ou toxico-infectieuse, dans lesquelles il est nécessaire de stimuler la régénération nerveuse et la récupération de la fonction neuromusculaire, de même que dans les pathologies du système nerveux central d'origine traumatique, anoxique, dégénérative ou toxico-infectieuse, dans lesquelles il est nécessaire de stimuler le phénomène de bourgeonnement des neurones en vue d'obtenir une récupération fonctionnelle. Par suite de leur effet retard, les dérivés de gangliosides selon la présente invention présentent un net avantage sur les gangliosides eux-50 mêmes que l'on a jusqu'à maintenant utilisés comme médicaments dans les cas indiqués ci-dessus.
Les doses à administrer dépendent de l'effet recherché et de la voie d'administration choisie. Cette administration s'effectue habituellement par voie intramusculaire, sous-cutanée, intraveineuse, intradermique ou pulmonaire, de préférence dans un véhicule aqueux convenablement tamponné. La forme pharmaceutique de conservation de la substance peut dans ce cas être une ampoule qui contient les solutions du dérivé et éventuellement en présence d'autres ingrédients auxiliaires tels que ceux décrits pour les préparations pharmaceutiques selon la présente invention. Pour une application thérapeutique, ou éventuellement aussi pour une application prophylactique par la voie parentêrale mentionnée ci-dessus, on peut faire varier la dose, de préférence entre 0,05 mg et 5 mg de substance active par kilo de poids du corps et par jour, et notamment entre 0,05 mg et 65 2 mg par kilo de poids du corps et par jour.
Bien que les nouvelles applications thérapeutiques conviennent généralement à toutes les pathologies liées à la conduction du stimulus nerveux dans les systèmes nerveux central et périphérique, les pa-
55
60
670 645
26
thologies spécifiques suivantes sont particulièrement intéressantes: névrites optiques rétrobulbaires, paralysie des nerfs oculomoteurs, névrites du trijumeau, paralysie de Bell et paralysie du nerf facial, syndrome de Garcin, radiculite, lésions traumatiques des nerfs périphériques, polynévrites diabétiques et alcooliques, paralysie obstétrique, sciatique paralysante, maladies des motoneurones, sclérose latérale amyotrophique-atrophique musculaire myélopathique, paralysie bulbaire progressive, myasthénie sévère, syndrome de Lambert Eaton, dystrophie musculaire, détérioration de la transmission nerveuse synaptique dans le CNS et le PNS, et détériorations des états 5 de conscience, par exemple état de confusion, confusion cérébrale, thrombose, embolisme.
R
Claims (33)
- 670 6452REVENDICATIONS1. Composition pharmaceutique comprenant en tant qu'ingrédient actif une quantité efficace pour le traitement des maladies nerveuses d'un dérivé de ganglioside, ce ganglioside comprenant line portion Oligosaccharide, au moins un reste céramide et au moins un reste d'acide sialique, le dérivé étant choisi dans le groupe comprenant: a) les esters des groupes carboxyliques des restes d'acide sialique dans lesquels les groupes hydroxyles de la portion Oligosaccharide, du reste céramide et des restes d'acide sialique sont éventuellement peracylés; b) les amides des groupes carboxyliques des restes d'acide sialique dans lesquels les groupes hydroxyles de la portion Oligosaccharide, du reste céramide et des restes d'acide sialique sont éventuellement peracylés, et c) les dérivés peracylés des groupes hydroxyles de la portion Oligosaccharide dans lesquels les restes d'acide sialique comportent des groupes carboxyliques libres.
- 2. Composition pharmaceutique selon la revendication 1, dans laquelle les gangliosides de base sont choisis dans le groupe constitué par GMi, GDia, Gdh et Gnb.
- 3. Dérivé de ganglioside, ce ganglioside étant formé d'une portion Oligosaccharide, d'au moins un reste de céramide et d'au moins un reste d'acide sialique, le dérivé étant choisi dans le groupe comprenant: a) les esters des groupes carboxyliques des restes d'acide sialique, dans lesquels les groupes hydroxyles de la portion Oligosaccharide, du reste céramide et des restes d'acide sialique sont éventuellement peracylés; b) les amides des groupes carboxyliques des restes d'acide sialique dans lesquels les groupes hydroxyles de la portion Oligosaccharide, du reste céramide et des restes d'acide sialique sont éventuellement peracylés, et c) les dérivés peracylés des groupes hydroxyles de la portion Oligosaccharide dans lesquels les restes d'acide sialique comportent des groupes carboxyliques libres, sous réserve que ce dérivé de ganglioside ne soit pas l'ester méthyli-que du ganglioside GM1 ou de ses dérivés peracylés, l'ester méthyli-que du ganglioside GM3 ni son dérivé peracylé.
- 4. Dérivé de ganglioside selon la revendication 3, dans lequel l'oligosaccharide est formé d'un maximum de quatre hexoses choisis dans le groupe constitué par le glucose et le galactose ou de N-acétylhexosamines choisies dans le groupe constitué de la N-acétyl-glucosamine et de la N-acétylgalactosamine, au moins un reste hexose étant présent, et dans lequel l'oligosaccharide est unitaire quant à sa structure chimique et dans lequel le reste céramide est dérivé d'acylsphingosines qui sont saturés ou qui présentent une double liaison et une chaîne de 16 à 22 atomes de carbone et dans lequel les restes d'acide sialique sont choisis dans le groupe constitué par l'acide N-acétylneuraminique, l'acide N-glycolylneuraminique et les acides correspondants acylés sur l'un des groupes hydroxy.
- 5. Dérivé de ganglioside selon la revendication 4, dans lequel le reste de céramide comporte des chaînes sphingosines de 18 à20 atomes de carbone et des groupes acylés de 18 à 20 atomes de carbone.
- 6. Dérivé de ganglioside selon l'une des revendications 3 à 5, dans lequel les gangliosides de base sont choisis dans le groupe constitué par Gm„ GDla, GDh, et GTib.
- 7. Dérivé de ganglioside selon l'une des revendications 3 à 6, dans lequel les groupes d'estérification carboxylique dérivent des alcools aliphatiques comportant un maximum de 12 atomes de carbone ou des alcools araliphatiques comportant un seul cycle ben-zénique éventuellement substitué par 1 à 3 groupes alkyliques en Cj à C+ et un maximum de 4 atomes de carbone dans la chaîne aliphati-que ou par des alcools hétérocycliques comprenant au maximum12 atomes de carbone et uniquement un cycle hétérocyclique contenant un hétéroâtome choisi dans le groupe constitué par N, S et O ou par des alcools alicycliques ou aliphatiques alicycliques en Ct àC14..
- 8. Dérivé de ganglioside selon l'une des revendications 3 à 6, dans lequel les groupes formant un amide dérivent des aminés aliphatiques comportant un maximum de 12 atomes de carbone et comportant des chaînes ouvertes ou cycliques, d'amines araliphatiques comportant un seul cycle benzénique éventuellement substitué par 1 à 3 groupes alkyliques en Cj à C4 et un maximum de 4 atomes de carbone dans la partie aliphatique ou d'ammoniac.
- 9. Dérivé de ganglioside selon l'une des revendications 3 à 8,s dans lequel les groupes hydroxyles desdites portions Oligosaccharides, ledit reste céramide et lesdits restes d'acide sialique sont peracylés à l'aide d'un acide carboxylique aliphatique en Cj à Ci0 ou à l'aide d'un acide carboxylique aromatique choisi dans le groupe comprenant l'acide benzoïque et ses dérivés substitués par des10 groupes méthyle, hydroxyle, amine ou carboxyle.
- 10. Dérivé de ganglioside selon la revendication 3, choisi dans le groupe constitué par les esters méthylique, éthylique, propylique, isopropylique, N-butylique, isobutylique, butylique tertiaire, undé-cylique, hydroxydécylique, heptylique, 2-méthyl-l-pentylique, allyli-15 que, éthoxycarbonylméthylique, méthoxyéthylique, l-méthoxy-2-propylique, benzylique, phénéthylique, cyclohexylique, menthylique, tétrahydrofurfurylique, tétrahydropyranylique et cyanobutyrylique des gangliosides GMh GDlb, GDla et GTIb.
- 11. Dérivé de ganglioside selon la revendication 3, choisi dans le20 groupe des dérivés non substitués constitué par le méthylamide,l'éthylamide, le propylamide, le diméthylamide, le diéthylamide, le butylamide, le pyrrolidinamide, le pipéridinamide, le 2-méthylpipéri-dinamide, la pipérazinamide, le 1-méthylpipérazinamide, le morpho-linamide, le thiomorphilinamide, l'éthanolamide, le benzylamide,25 l'éthylméthylamide, le diméthylamino-propyl-l-amide, le diméthyl-amino-éthylamide, le 6-hydroxyhexyl-l-amide, le tétrahydrofur-furylamide et le phényléthylamide des gangliosides GMi, GDIb, GD!a et GTib-
- 12. Dérivé de ganglioside selon la revendication 10 ou 11, choisi dans le groupe constitué par les peracétylates, perpropionylates, per-butyrylates, maléinylates et succinylates ou lesdits esters ou amides.
- 13. Dérivé de ganglioside selon la revendication 3, choisi dans le groupe constitué par les. peracétylates, perpropionylates, perbutyry-lates, maléinylates et succinylates des gangliosides GMI, GDlb, GDla et35"Tlb-
- 14. Procédé de préparation des dérivés de gangliosides selon la revendication 3, consistant:a) à traiter, par une résine échangeuse d'ions de type acide, un ganglioside, un mélange de gangliosides ou un de leurs dérivés peracylés dans lequel les groupes hydroxyles du ganglioside sont peracylés, pour produire un sel métallique de ce ganglioside, des mélanges de gangliosides ou de leurs dérivés peracylés, et b) à traiter le sel métallique ainsi préparé de ce ganglioside, du mélange de gangliosides ou de leurs dérivés peracylés par un diazoal-45 kane.
- 15. Procédé de préparation d'un dérivé de ganglioside selon la revendication 3, consistant:a) à traiter, par une résine échangeuse d'ions de type acide, un50 ganglioside, un mélange de gangliosides ou un de leurs dérivés peracylés, dans lequel les groupes hydroxyles de ce ganglioside sont peracylés, pour produire un sel métallique du ganglioside, des mélanges de gangliosides ou de leurs dérivés peracylés, et b) à traiter le sel métallique ainsi préparé du ganglioside, du ss mélange de gangliosides ou de leurs dérivés peracylés avec un agent d'éthérification contenant un hydrocarbure devant être lié par une liaison ester aux groupes carboxyliques des résidus acides sialiques de ces gangliosides.
- 16. Procédé selon la revendication 15, dans lequel l'agent d'éthé-60 rification est un halogénure d'hydrocarbure.
- 17. Procédé selon l'une des revendications 14 à 16, dans lequel le sel métallique est un sel de sodium ou de potassium.
- 18. Procédé selon l'une des revendications 15 à 17, dans lequel le traitement du sel métallique du ganglioside, du mélange de ganglio-65 sides ou de leurs dérivés peracylés est conduit dans un solvant apro-tique à une température de 20 à 120° C.
- 19. Procédé selon la revendication 18, dans lequel le solvant est le dioxanne ou le diméthylsulfoxyde.3670 645
- 20. Procédé de préparation d'un dérivé de ganglioside selon la revendication 3, consistant à traiter un ester interne d'un ganglioside ou d'un mélange avec un alcool pour produire l'ester correspondant des groupes carboxyliques des résidus acides sialiques de cet ester interne de ganglioside ou de leurs mélanges.
- 21. Procédé selon la revendication 20, dans lequel ce traitement est effectué en présence d'un alcoolate métallique correspondant à cet alcool.
- 22. Procédé selon la revendication 21, dans lequel l'alcool est un alcool aliphatique comportant un maximum de 12 atomes de carbone ou un alcool araliphatique comportant un seul cycle benzé-nique éventuellement substitué par un nombre de groupes d'alkyles en C! à C4 compris entre 1 et 3 et un maximum de 4 atomes de carbone dans la chaîne aliphatique, ou un alcool hétérocyclique comportant un maximum de 12 atomes de carbone et seulement un cycle hétérocyclique contenant un hétéroatome choisi dans le groupe constitué par N, S et O ou un alcool alicyclique ou aliphatique-alicy-clique en Ci à C14.
- 23. Procédé selon la revendication 21, dans lequel l'alcool est choisi dans le groupe constitué par les alcools méthylique, éthylique, propylique, isopropylique, n-butylique, isobutylique, butylique tertiaire, undécylique, hydroxydécylique, 2-méthyl-l-pentylique, allyli-que, éthoxycarbonylméthylique, méthoxyéthylique, l-méthoxy-2-propylique, benzylique, phénéthylique, cyclohexylique, menthylique, tétrahydrofurfurylique, tétrahydropyrannylique et cyanobutyrylique.
- 24. Procédé selon la revendication 16, dans lequel le groupe hydrocarbure de l'halogénure d'hydrocarbure est le groupe méthyle, éthyle, propyle, isopropyle, n-butyle, isobutyle, butyle tertiaire, un-décyle, hydroxydécyle, heptyle, 2-méthyl-l-pentyle, allyle, éthoxy-carbonylméthyle, méthoxyéthyle, l-méthoxy-2-propyle, benzyle, phénétyle, cyclohexyle, menthyle, tétrahydrofurfuryle, tétrahydro-propyrannyle ou cyanobutyryle.
- 25. Procédé selon la revendication 23, dans lequel l'alcoolate est un alcoolate de métal alcalin de cet alcool.
- 26. Procédé de préparation d'un dérivé de ganglioside selon la revendication 3, consistant à traiter un ganglioside ou un mélange de gangliosides, un ester interne de ganglioside ou un mélange d'esters internes de gangliosides, ou un ester carboxylique de ganglioside ou de mélange de gangliosides par l'ammoniac ou par une amine.
- 27. Procédé selon la revendication 26, dans lequel l'amine est une amine aliphatique comportant un maximum de 12 atomes de carbone et des chaînes ouvertes ou cycliques, une amine araliphatique ne comportant qu'un seul cycle benzénique éventuellement substitué par 1 à 3 groupes alkyles en Q à C4 et un maximum de4 atomes de carbone dans la partie aliphatique.
- 28. Procédé selon la revendication 27, dans lequel l'amine est choisie dans le groupe constitué par la méthylamine, l'éthylamine, la propylamine, l'isopropylamine, la diméthylamine, la diéthylamine, la butylamine, la Pyrrolidine, la pipéridine, la 2-méthyl-pipéridine, la pipérazine, la 1-méthyl-pipérazine, l'éthanolamine, la benzylamine, l'éthyhnéthylamine, la diméthylaminopropyl-1-amine, la diméthyl-amino-éthylamine, la 6-hydroxyhexyl-l-amine, la tétrahydrofur-furylamine et la 2-phényléthylamine.
- 29. Procédé se préparation d'un dérivé de ganglioside selon la revendication 3, consistant à traiter un ganglioside ou un mélange de gangliosides ou un ester ou un de leurs dérivés amides avec un agent d'acylation en présence d'une base.
- 30. Procédé selon la revendication 29, dans lequel l'agent d'acylation est un acide carboxylique aliphatique en Ct à C10 ou un acide carboxylique aromatique choisi dans le groupe constitué par l'acide benzoïque et ses dérivés substitués par des groupes méthyle, hydr-oxyle, amine ou carboxy.
- 31. Procédé selon la revendication 30, dans lequel'l'agent d'acylation est un élément choisi dans le groupe constitué par l'acide acétique, l'acide propionique, l'acide butyrique, l'acide maléique et l'acide succinique.
- 32. Procédé selon la revendication 31, dans lequel la base est une amine tertiaire.
- 33. Procédé selon la revendication 29, dans lequel l'agent d'acylation est un anhydride et la base est une amine tertiaire.s DESCRIPTION
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