FI83423B - Foerfarande foer framstaellning av gangliosidderivat. - Google Patents
Foerfarande foer framstaellning av gangliosidderivat. Download PDFInfo
- Publication number
- FI83423B FI83423B FI892587A FI892587A FI83423B FI 83423 B FI83423 B FI 83423B FI 892587 A FI892587 A FI 892587A FI 892587 A FI892587 A FI 892587A FI 83423 B FI83423 B FI 83423B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- mixture
- ganglioside
- ester
- alcohol
- methyl
- Prior art date
Links
Landscapes
- Saccharide Compounds (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
83423
Menetelmä gangliosidijohdannaisten valmistamiseksi
Esillä olevan keksinnön kohteena on patenttivaatimuksen 1 johdannon mukainen uusi menetelmä funktionaalisten gangliosidi johdannaisten, etenkin niiden estereiden, valmistamiseksi .
Gangliosidit ovat luonnontuotteita, joita sisältyy erilaisiin eläinten kudoksiin ja elimiin, ennen kaikkea keskushermostoon ja ääreishermostoon, mutta myös lisämunuaisten ytimeen, erytrosyytteihin, pernaan ja muuhun, mistä ne voidaan uuttaa puhdistetussa muodossa. On ollut mahdollista selvittää useimpien näin saatujen gangliosidien perusrakenne. Ne ovat glykosfingolipidejä, s.o. yhdisteitä, jotka muodostuvat oligosakkaridien ja sfingosinien ja sialihappo-jen määrätyn määrän yhteenliittymistä, ja joissa yksiköt liittyvät toisiinsa glukosidi- tai ketosidisidosten välityksellä. Tähän mennessä kirjallisuudessa esitetyt, puhtaassa muodossa saadut gangliosidit, eivät edusta yhtenäisiä kemiallisia yhdisteitä, lukuunottamatta mahdollisesti niiden sakkaridiosaa (oligosakkaridi), koska keramidi- ja sialikomponentit ovat melko vaihtelevia määrätyissä rajoissa. Vaikka viitataankin "puhtaisiin" gangliosideihin, tämä ilmaisu on siten tulkittava laajalti käsittämään gangliosi-dilajit, joissa vähintään yksi osa, esimerkiksi sakkaridiosa on yhtenäinen ja luonteenomainen kemialliselta kannalta. Otettaessa tämä huomioon, ennen kuin selitetään yksityiskohtaisemmin esillä olevan keksinnön taustaa, on hyödyllistä huomioida seuraava yleinen kaava, joka sisältää kaikkien niiden gangliosidien rakenteet, jotka on tähän asti saatu puhdistetussa muodossa, ja joka kaava esittää ne funktionaaliset ryhmät, jotka on funktionaalisesti modifioitu keksinnön mukaisesti(kaava I).
2 83423 HOOCmmm»/ siali— N miiiimiiOH /limuniOH happo , | | ........OH keramidi HOOC" Il Ö δ OH OH δ (X)
ÖH OLIGOSAKKARIDI OH
Tässä kaavassa oiigosakkariditähde, jonka muodostaa korkeintaan 5 monosakkaridia, on liitetty glukosidisidoksella kera-miditähteeseen ja yhteen tai useampaan sialihappotähteeseen, kumpikin yhtä monella suoralla glukosidisidoksella ja yhden tai useamman sellaisen sidoksen avulla, että jäljelle jäävät sialihappotähteet liittyvät yhteen ketosidisidoksilla. Kaava osoittaa sakkaridiosan, sialihappojen ja keramidin hydrok-syyliryhmät samoin kuin yllä mainitut glukosidisidokset sia-lihappojen ja keramidin kanssa ja sialihappojen karboksyyli-ryhmät. Sialihapoilla, jotka muodostavat osan kaavan I mukaisista gangliosideistä, on yleinen kaava II
H
λ- ° CH3OCNH /H—C—OH \ 1
/ %\ \ ,COOH
/ H—C-OH
x I jX di) JX ’CHjOH / Xh *1 3
OH
jossa yksi tai useampi primaarinen ja sekundaarinen hydrok-syyliryhmä voi olla myös asyloitu ja jossa asyyliryhmät johtuvat etikka- tai glykolihaposta. Gangliosideissä läsnä olevien sialihappojen määrä on tavallisesti 1-5.
Il 3 83423
Sialitähteet liittyvät oligosakkaridiin ketosidisidoksella, joka on muodostettu 2-asemassa olevalla hydroksyylillä oli-gosakkaridihydroksyylin kanssa. Kun useita sialihappoja liitetään yhteen, niiden molekyylit yhdistyvät ketosidisidok-silla, jotka on muodostettu kahden sialihappomolekyylin 2-ja 8-aseman hydroksyyleistä. Gangliosidien, mukaanlukien yllä esitettyjen puhdistettujen gangliosidien sialihapot ovat erilaisten kemiallisesti yhtenäisten happojen, kuten N-asetyylineuramiini- ja N-glykolyylineuramiinihappojen, joissa ensin mainittu on vallitseva ja yhden tai useamman niiden O-asyylijohdannaisen, kuten 8-0-asyylijohdannaisten seoksia.
Gangliosidejä on löydettävissä luonnossa metallisuoloina, kuten natriumsuoloina, ja tästä syystä sialihappojen karbok-syyli-funktio(t) on suolan muodossa. Gangliosidien vapaat muodot voidaan helposti saada käsittelemällä suoloja, kuten natriumsuoloja, happotyyppisellä ioninvaihtimella, käyttämällä esimerkiksi hartsia, kuten Dowex AG 50X8, H+-muotoa.
Kaavan I mukaisissa gangliosideissä oleva keramiditähde merkitsee yleensä erityistä N-asyylisfingosiniä, jonka kaava on ch2—o— ch2—o— CH—NH—asyyli CH—NH—asyyli
I I
CH—OH CH—OH
I I
CH CH2 % \ CH CH2
I I
(CH2)n—CH3 (CH2)n—CH} jossa n = 10 - 16 ja asyyli johtuu tyydyttynestä tai tyydyttymättömästä rasvahaposta, jossa on 16 - 22 hiiliatomia tai vastaavasta hydroksihaposta.
Oligosakkaridi koostuu korkeintaan 5 monosakkaridista tai niiden asyyliamiiniryhmä sisältävistä johdannaisista, etenkin heksooseista ja niiden yllä mainitun tyyppisistä johdan- 4 83423 naisista. Vähintään yksi glukoosi- tai galaktoosimolekyyli on kuitenkin aina läsnä oligosakkaridissa. Yleisin yllä mainittujen sokerien asyyliamiinijohdannaisena läsnä oleva tähde on N-asetyyligalaktoosiamiini tai N-asetyyliglukosamiini.
Kaavaan I sisältyvien gangliosidien rakenteen ja etenkin sakkaridiosien, sialihappojen ja keramidin välisten sidosten luonteen parempaa havainnollistamista varten on alla esitetty puhtaan Gi-gangliosidin kaava, joka sisältää vain yhden sialihapon (joka on esitetty N-asetyyliamiini- tai N-glykolyylineuramiinihapolla).
H
T v Jh-\
CM-CO-W/ CX> \COOM Y chqh N
h A
HO H /
CHpH OH J CHPH
\p-o-Jj/” \\ y* °\T°—ker“nidi h\oh h /ih h\ m /h h\ J h /h >sj\ oh h /h
m OH H M-CO-CH, H oh H OH
M V. M OH
On hyvin tunnettua, että gangliosidit ovat funktionaalisesti tärkeitä keskushermostossa ja äskettäin on osoitettu, että gangliosidit ovat käyttökelpoisia ääreishermostojärjestelmän patologioiden terapiassa. Gangliosidien terapeuttinen toiminta näyttää ennen kaikkea koostuvan hermosolun kehitysil-miön stimuloinnista ja niiden kalvoentsyymien aktivoinnista, jotka toimivat hermoärsykkeiden siirrossa, kuten entsyyminä +K+ )-ATPase . Gangliosidien stimuloima hermokehitys edistää vaurioituneen hermokudoksen toiminnallista toipumista.
Lisätutkimuksia on suoritettu sellaisten yhdisteiden löytämiseksi, jotka voisivat osoittautua tehokkaammiksi kuin gangliosidit hermojärjestelmän patologioiden terapiassa. Nämä tutkimukset ovat johtaneet siihen löytöön, että gangliosi-
II
5 83423 dien sisäiset esterit, joissa yksi tai useampi sakkaridi-osan hydroksyyli on esteröity yhdellä tai useammalla siali-happojen karboksyyliryhmillä (intramolekulaarinen reaktio), jolloin muodostuu yhtä monta laktonirengasta, ovat aktiivisempia kuin itse gangliosidit hermokehityksen edistämisessä ja kalvoentsyymien aktivoinnissa, jotka toimivat hermoärsyk-keiden siirrossa, kuten entsyymi Na+K+-ATPase (ks. US-patentti 4,476,119).
Nyt on löytetty gangliosidijohdannaisten toinen ryhmä, joKa merkitsee etuja verrattuna itse gangliosideihin sikäli, että niillä on pidentynyt aktiivisuusaika ("retard"-vaikutus”). Nämä yhdisteet ovat johdannaisia, joissa sialihappojen karboksyyliryhmä on funktionaalisesti modifioitu esteröimäl-lä tai muuntamalla ne amideiksi tai näiden estereiden ja amidien johdannaisiksi, joissa sakkaridiosan, sialihappojen ja keramidin hydroksyyliryhmät on myös esteröity orgaanisilla hapoilla, tai pikemmin asylaattijohdannaiset (joita yksinkertaisesti kutsutaan "asylaateiksi" tämän jälkeen ja etenkin "asetylaateiksi, pripionylaateiksi jne."). Näitä johdan-naisa on tarkemmin kuvattu kantahakemuksessa (FI-patentti-hakemus 852515) ja niihin kuuluvat myös gangliosidiyhdis-teet, joissa vain hydroksyyliryhmät on esteröity orgaanisilla hapoilla, s.o. ne sisältävät vapaita karboksyyliryhmiä.
Gangliosidien sialihapon karboksyylin kaksi metyyliesteriä on esitetty artikkelissa "Notes on improved procedures for the chemical modification and degradation of glycosphyngolipids" julkaisussa Journal of Lipid Research 21, 642-645 (1980), MacDonald et al. Nämä yhdisteet ovat ganglisiodien ja
Gm3 metyyliestereitä [(tässä käytetyt lyhenteet gangliosidien identifioimiseksi ovat niitä, joita on ehdottanut Sven-nerholm julkaisussa J. Neurochem. 1(), 613 (1963)]. Kuitenkaan MacDonald et ai. eivät mainitse mitään yhdisteiden biologisesta aktiivisuudesta. Gangliosidin Gm3 metyyliesteriä käytetään valmistettaessa sen yhtä perasylaattijohdannaista käytettäväksi reaktioiden erityisessä lohkomisessa tai yhdistelyssä. [Methods of Enzymology, 50, 137-140 (1978)].
6 83423
Yllä mainitussa artikkelissa julkaisussa Journal of Lipid Research MacDonald et ai. esittävät myös gangliosidien G^i ja Gj43 metyyliestereiden asetylointia, mutta eristämättä asy-loituja yhdisteitä.
Asetylointia, joka suoritetaan lipidien etikkahappoanhydridi-pyridiinillä, jotka on uutettu Buffalo-rottien pernasta, maksasta ja munuaisista, Morris-hepatoomista ja fibroblasti-soluista, ovat esittäneet Terunobo Saito ja Sen-Itiroh Hako-mari julkaisussa Journal of Lipid Research, 12, 257-259 (1971). Kirjoittajat ovat eristäneet kromatografoimalla näihin lipideihin sisältyvien gangliosidien asetyloidun seoksen asyloidusta tuotteesta, yhdessä muiden glykolipidien kanssa, mutta identifioimatta mitään erityistä gangliosidiä. Amideista gangliosidin Gm3 substituoimaton amidi on esitetty [Ad.Exp. Med. Biol. 19_, 95 (1972)], mutta myöskään tässä tapauksessa ei ole mainittu mitään biologisista ominaisuuksista .
Esillä olevan keksinnön tarkoituksena on saada aikaan uusi menetelmä yllä ja kantahakemuksessa 852515 esitettyjen uusien funktionaalisten gangliosidijohdannaisten, s.o. kaavassa I määriteltyjen gangliosidien tai niiden seosten karbok-syyliryhmien estereiden valmistamiseksi.
A. Gangliosidilähtöyhdisteet
Esillä olevan keksinnön avulla saadaan aikaan hyödyllisiä gangliosidijohdannaisia. Nämä uudet johdannaiset on johdettu modifioimalla funktionaalisesti karboksyyliryhmät, jotka ovat läsnä perusgangliosidirakenteessa. Tähän saakka saakka puhtaassa muodossa saadut gangliosidit voidaan esittää seu-raavalla kaavalla, joka korostaa myös esillä olevan keksinnön mukaisesti modifioituja funktionaalisia ryhmiä.
Il 7 83423 HOOCmmim/ siali- \uumuuiOH /muimiOH happo , 1 I ............ ( keramidi
HOOC’iniiiiii Ö Ö OH OH Ö (D
v_ s s = -OH OLIGOSAKKARIDI OH
Nämä gangliosidit, jotka muodostavat keksinnön mukaisten funktionaalisten johdannaisten lähtöaineet, ovat kaikki niitä, jotka voidaan uuttaa erilaisista eläinten elimistä ja kudoksista, etenkin keskus- ja ääreishermostojärjestelmän kudoksista, esimerkiksi aivoista, selkäydinnesteestä, lihaksista, plasmasta ja veriseerumista, munuaisista, lisämunuaisista, maksasta, pernasta, sulista ja erytrosyyteista tai leukosyyteistä. Lähtögangliosidit voivat myös olla kirjallisuudessa esitettyjä puhdistettuja, kuten sellaisia, jotka on uutettu selkärankaisten, etenkin nisäkkäiden, kuten ihmisen, nautakarjan, vasikan, rotan, hiiren kudoksista ja elimistä tai mikro-organismeista.
Esillä olevan keksinnön mukaisesti nämä gangliosidiyhdisteet modifioidaan käsittelemällä gangliosidin sisäistä esteriä alkoholilla vastaavan esterin muodostamiseksi gangliosidin sisäisen esterin tai sen seoksen sialihappotähteiden karbok-syyliryhmissä, jolloin käsittely suoritetaan alkoholia vastaavan metallialkoholaatin läsnäollessa.
Valmistettavat esterit ovat etenkin monoestereitä monosialo-gangliosidien kohdalla ja polyestereitä polysialogangliosi-dien kohdalla, jolloin niissä on yhtä monta esteriryhmää, kuin karboksyyliryhmiä on läsnä molekyylissä, ja siitä syystä yhtä monta sialihapporyhmää kuin on läsnä.
Keksinnön mukaan gangliosidijohdannaiset valmistetaan modifioimalla "puhdistetut" yksilöllisesti luonnehditut ganglio- 8 83423 sidit tai modifioimalla gangliosidien seos, kuten monosialo-gangliosidien ja polysialogangliosidien seos. Ne seokset, joita käytetään keksinnön mukaiseen esteröintiin, esimerkiksi alla esimerkissä 3 esitetyn seoksen valmistamiseksi, sisältävät sekä monosialogangliosidejä että polysialoganglio-sidejä ja näissä seoksissa esteröidään kaikki karboksyyli-ryhmät, jolloin saadaan gangliosidijohdannaisia, jotka on kokonaan esteröity. Tässä selityksessä samoin kuin kanta-hakemuksessa 852515 käytetty käsite "esterit" tulisi tästä syystä tulkita siten, että se merkitsee täysin esteröityjä johdannaisia. Tämä koskee myös etenkin alla esitettyjen havainnollistavien esimerkkien johdannaisia, joita kutsutaan "estereiksi". Nämä esitykset tarkoittavat seoksia, jotka sisältävät polysialogangliosidejä, jotka on täysin esteröity kaikissa karboksyyliryhmissä.
Siten esillä oleva keksintö sisältää gangliosidien johdannaiset, jotka on joko johdettu yksinkertaisesta "puhtaasta" gan-gliosidistä tai gangliosidien seoksesta. Keksintö käsittää myös johdannaiset, jotka on saatu erilaisista gangliosidira-kenteista, etenkin koska gangliosidin rakenne voi vaihdella suhteessa sialihappotähteen, keramiditähteet tai oligosakkari-ditähteen määrän ja laadun suhteen.
Mitä tulee gangliosidien rakenteeseen perusgangliosidit voivat olla monosialo-, disialo-, trisialo-, tetrasialo- tai
II
9 83423 pentasialogangliosi.dejä, jolloin etusijalla olevat sialihapot ovat N-asetyylineuramiini- ja N-glykolineuramiinihappo. Sialihapot voivat olla myös asyloituja yhdessä niiden lateraali-ketjun hydroksyyleistä, kuten asemassa 8 olevassa hydroksyy-lissä, jos tämä asema ei ole jo varattu ketosidisidoksella, joka sitoo sen toiseen vierekkäiseen sialitähteeseen.
Keramidiosa voi vaihdella, yllä esitetyllä tavalla, ja myös mitä tulee keramidin osan muodostavien sfingosiinien hiili-atomiketjun pituuteen, joka voi olla 16 - 22 hiiliatomia. Lisäksi minkä tahansa asyylitähteen pituus voi myös vaihdella, etenkin samoissa rajoissa, eli se voi olla 16 - 22 hiiliatomia. Tästä poiketen keramiditähde voi vaihdella siten, että kaksoissfingosiinisidos voi puuttua tai olla läsnä ja tavallisesti tämä tähde on pääasiassa muodostunut tyydytty-mättömästä N-asyloidusta sfingosiinistä ja alhaisesta prosenttimäärästä vastaavaa tyydyttynyttä yhdistettä (joka voi kuitenkin olla noin 10 %). Asyyliryhmä voi olla myös johdettu alifaattisistä hydroksihapoista, joilla on yllä mainittu määrä hiiliatomeja eli 16 - 20. Eräs erittäin tärkeä gangliosidien ryhmä sisältää keramiditähteessä asyloituja sfingosiinejä, joiden ketjuissa on 18 tai 20 hiiliatomia ja vastaavia tyydyttyneitä yhdisteitä, kun taas niiden hyd-roksyyleillä substituoitumaton tyydyttynyt tai tyydyttymätön asyyliryhmä sisältää saman määrän hiiliatomeja eli 18 tai 20.
Kuten yllä on esitetty tämän keksinnön avulla valmistetaan toisaalta kaavan I mukaisten "puhtaiden" gangliosidien esterit, eli yllä esitetyn yhdenmukaisen koostumuksen omaavat johdannaiset, ja toisaalta erilaisista eläinten kudoksista uutemuodossa saatavien gangliosidiseosten esterit. Ensimmäisessä tapauksessa perusgangliosidit valmistetaan sopivimmin sellaisista, joissa oligosakkaridi koostuu korkeintaan 4 heksoositähteestä tai N-asetyyliheksoamiinista, koska ainakin yksi heksoositähde on läsnä ja joissa tämä sakkaridiosa on kemiallisesti yhtenäinen. Heksoosit valitaan edullisesti 10 83423 ryhmästä, joka koostuu glukoosista ja galaktoosista ja N-asetyyliheksosamiinit valitaan edullisesti ryhmästä, johon kuuluvat N-asetyyliglukosamiini ja N-asetyyligalaktosamiini (gangliosidiryhmä A). Tämän ryhmän gangliosidit ovat esimerkiksi sellaisia, jotka on uutettu selkärankaisten aivoista, kuten sellaisia, joita on esitetty artikkelissa "Gangliosides of the Nervous System" julkaisussa Glycolipid Methodology, Lloyd A. Witting Fd., American Oil Chemists' Society, Champaign, 111. 187-214 (1976) (ks. etenkin liitekuva 1), esimerkiksi gangliosidit Gm4» GM3, gM2' gM1"g1cNAc' gD2' GDla“Ga^NAc'GTlc' gQ' GT1 3a etenkin sellaisia, joissa oligosakkaridi sisältää vähintään yhden glukoosi- tai galaktoosi-tähteen ja yhden N-asetyyliglukosamiini- tai N-asetyyligalak-tosamiinitähteen, etenkin seuraavat (gangliosidiryhmä B) GM1
Gal (l-?3) GalNACd —>4 )Gal (1 —» 4 ) Glc (1 1) keramidi ®
NANA
GDla
Ga 1(1 —"f 3 ) Ga 1NAC (1 *—* 4 ) Ga 1(1 ? 4 ) G1 c (1 ——> 1) keramidi & Φ
NANA NANA
GDlb
Gal (1 3) Ga lNAC (1 4) Gal (1 4 )Glc (1 «> 1) keramidi ©
NANA
(?)
NANA
II
11 83423 GTlb
Gal (1 —^3)GalNAC(1 4 ) Gal (1 —> 4 )Glc (1 —♦ 1) keramidi Φ · (?)
NANA NANA
©
NANA
missä Glc merkitsee glukoosia, GalNAc merkitsee N-asetyyli-galaktosamiinia, Gal merkitsee galaktoosia ja NANA merkitsee N-asetyylineuramiinihappoa.
Jos gangliosidiseoksia käytetään lähtöaineena, seokset voivat koostua sellaisista, jotka saadaan suoraan uuttamalla gangliosidejä erilaisista eläinten kudoksista "kokonais gangliosidtuutteina tai niiden erilaisina jakeina. Tällaisia uutteita on esitetty kirjallisuudessa esimerkiksi yllä mainituissa kirjoituksissa tai myös kirjoituksessa "Extraction and i2 83423 analysis of materials containing lipidbound sialic acids" julkaisussa Glycolipid Methodology, Lloyd A. Wittig Ed., American Oil Chemists' Society, Champaign, 111., 159-186 (1976) ja saman kirjan kirjoituksessa "Gangliosides of the Nervous System" ss. 187-214. Eräät tärkeimmistä seoksista, joita käytetään esillä olevan keksinnön mukaisesti ovat gangliosidiuutteet, jotka saadaan hermoston kudoksista, etenkin aivoista ja jotka sisältävät gangliosidejä GM^, GDla, GDib ja GT^/ jotka mainittiin jo yllä. Tämän tyypin seoksia ovat esimerkiksi ne, jotka on esitetty esimerkissä 2.
B. Esterit
Uusien gangliosidijohdannaisten esteriryhmät ovat johdetut alifaattisista alkoholeista, etenkin sellaisista, joissa on korkeintaan 12 ja etenkin 6 hiiliatomia, tai aralifaattisis-ta alkoholeista, joissa on sopivimmin ainoastaan yksi bent-seenirengas, joka mahdollisesti on substituoitu 1-3 alemmalla alkyyliryhmällä (Ci_4), esimerkiksi metyyliryhmällä ja joissa on korkeintaan 4 hiiliatomia alifaattisessa ketjussa, tai alisyklisistä tai alifaattis-alisyklisistä alkoholeista, joissa on vain yksi sykloalifaattinen rengas ja korkeintaan 14 hiiliatomia, tai heterosyklisistä alkoholeista, joissa on korkeintaan 12 ja etenkin 6 hiiliatomia ja joissa on vain yksi heterosyklinen rengas, joka sisältää typpi-, happi- tai rikkiheteroatomin.
Yllä mainitut alkoholit voivat olla substituoituja tai subs-tituoitumattomia, etenkin funktioilla, jotka on valittu ryhmästä, jonka muodostavat hydroksyyli-, amiini-, alkoksyyli-ryhmät, joissa on korkeintaan 4 hiiliatomia alkyyli-, karb-oksyyli- tai karbyylioksi- (kuten karbonyylimetoksi tai karbonyylietoksi)-ryhmissä, joissa on korkeintaan 4 atomia alkyyli-, alkyyliamiini- tai dialkyyliamiinitähteessä, jossa on korkeintaan 4 hiiliatomia alkyyleissä, ja jotka voivat olla tyydyttyneitä tai tyydyttymättömiä, etenkin niissä on ainoastaan yksi kaksoissidos. Alkoholit, jotka esteröivät esillä olevan keksinnön mukaisten gangliosidien karboksyyli- li i3 83423 funktiot, voivat olla monovalenttisia tai polyvalenttisia, etenkin bivalenttisia. Alifaattisista alkoholeista etusijalla ovat sellaiset alemmat alkoholit, joissa on korkeintaan 6 hiiliatomia, kuten metyylialkoholi, etyylialkoholi, propyy-li- ja isopropyylialkoholi, n-butyylialkoholi, isobutyyli-alkoholi, tert-butyylialkoholi ja kahdenarvoisista alkoholeista etyleeniglykoli ja propyleeniglykoli. Aralifaattisis-ta alkoholeista etusijalla ovat sellaiset, joissa on ainoastaan yksi bentseenitähde, kuten bentsyylialkoholi ja fen-etyylialkoholi, alisyklisistä alkoholeista etusijalla ovat sellaiset, joissa on vain yksi sykloalifaattinen rengas, kuten sykloheksyylialkoholi (sykloheksanoli) tai terpeeni-alkoholit, kuten metanoli, karvometanoli tai jokin terpineo-leista tai piperitoleista. Heterosyklisistä alkoholeista etusijalla ovat tetrahydrofuranoli ja tetrahydropyranoli. karboksyyligangliosidiryhmien esteröintiin voidaan käyttää myös substituoituja alifaattisia alkoholeja, esimerkiksi sellaisia, joissa on amiinifunktioita, kuten aminoalkohole-ja, kuten sellaisia, joissa on korkeintaan 4 hiiliatomia, ja etenkin aminoalkoholeja, joissa on dialkyyli-(Ci_4)-amiinryhmä, kuten dietyyliaminoetanolia.
Esillä olevan keksinnön mukaan valmistettavista uusista esterijohdannaisista erityisen tärkeitä farmaseuttisten valmisteiden kannalta ovat mm. seuraavat: - gangliosidin Gmi etyyliesteri - gangliosidin Gmi propyyliesteri - gangliosidin Gmi isopropyyliesteri - gangliosidin Gmi normaali butyyliesteri - gangliosidin Gmi isobutyyliesteri - gangliosidin Gmi tert-butyyliesteri - gangliosidin Gmi sykloheksyyliesteri - esterit, jotka vastaavat tässä esitettyjä ja jotka sisältävät gangliosidin G^ib gangliosidin Gmi sijasta, - yllä esitetyn esterit, jotka sisältävät gangliosidin Gpia gangliosidin Gmi sijasta, - tässä esitetyt esterit, jotka sisältävät gangliosidin G-rib gangliosidin Gmi sijasta, sekä i4 83423 perusgangliosideinä G^i^tä, Gpiita, G^ieitä ja G<pib:^^ sisältävien gangliosidiseosten ja etenkin esimerkissä 2 esitetyn seoksen metyyli-, etyyli-, propyyli-, isopropyyli-, tert-butyyll-, bentsyyli-, allyyli, etoksikarbonyylimetyyli-esterit.
Valmistettavien yhdisteiden ominaisuuksien osalta viitattakoon kantahakemukseen 852515, jossa niitä on täsmällisemmin kuvattu.
C. Estereiden valmistus
Uudessa menetelmässä, joka on tunnusomainen esillä olevalle keksinnölle gangliosidiestereiden valmistamiseksi ja jota voidaan käyttää sekä uuisen kantahakemuksessa 852515 esitettyjen johdannaisten että jo tunnettujen estereiden valmistukseen, käsitellään, kuten yllä mainittiin, sisäinen gang-liosidiesteri halutun alkoholin ja sen johnkin vastaavan al-koholaatin seoksella. Reaktio voidaan suorittaa alkoholin kiehumispistettä vastaavassa lämpötilassa. Voidaan käyttää myös alhaisempia lämpötiloja, mutta siinä tapauksessa reaktioajat ovat pitempiä. On myös mahdollista, mikä kuitenkin haittaa erittäin hyvää saantoa ja lyhyitä reaktioaikoja, käsitellä sisäinen esteri vain vastaavalla alkoholilla edullisesti sen kiehumispistettä vastaavassa lämpötilassa.
Sisäisiä estereitä on esimerkiksi selitetty BE-patenttijulkaisussa 894025 sekä US-patenttijulkaisussa 4.476.119.
Alkoholaatteina keksinnön mukaisessa menetelmässä käytetään alkalimetallialkoholaatteja, etenkin natriumalkoholaattia.
Il 15 83423
Keksintöä ryhdytään seuraavassa lähemmin tarkastelemaan ei-rajoittavien suoritusmerkkien avulla.
Esimerkki 1: Gangliosidin G^i metyyliesteri 5 g gangliosidin G^l sisäinen esteri (3,27 mmoolia) liuotetaan 200 ml:aan vedetöntä seosta, jossa on metyleenikloridia ja metanolia suhteessa 4:1. Lisätään 176 mg (3,27 mmoolia) natriummetylaattia, joka on liuotettu 50 ml:aan vedetöntä metanolia ja seosta kuumennetaan palautusjäähdyttäen 2 tunnin ajan. Reaktion loputtua seos neutraloidaan vedettömällä Dowex AG 50x8-hartsilla (H+-muoto), hartsi erotetaan suodattamalla ja pestään metanolilla ja liuos haihdutetaan kuivaten. Jäännös otetaan 50 ml:aan metyleenikloridi/metanolia 1:1 ja reaktiotuote saostetaan kaatamalla se 250 ml:aan asetonia. Raaka tuote (4,9 g) puhdistetaan preparatiivisella korkeapainekromatografiällä 60 H Merck-silikageelillä käyttämällä liuottimena kloroformi/metanoli/isopropanoli/am-moniumkarbonaatti-seosta (2 %) 1140:820:180:140. Puhtaat fraktiot kerätään, haihdutetaan kuiviin, liuotetaan uudelleen 15 ml:aan kloroformi/metanolia 1:1 ja tuote saostetaan 75 ml :11a asetonia. Tämä tuote on gangliosidin Gm metyyli-esteri. Saanto 4,2 g.
KBr-tableteilla suoritettu IR-spektroskopia osoittaa tyypillisen esterisidoksen 1750 cm~^:ssä. Silikageelilevyillä suoritettu kromatograf ia kloroformi/metanoli/CaCl2 J Ha 0,3 %:ssa 55:45:10 ja määritetty Ehrlich-reagenssilla (Rf 0,72) osoitti tuotteen olevan yhtenäinen tuote ja vapaa lähtötuotteena käytetystä sisäisestä esteristä (Rf 0,75) ja gangliosidistä GMi (Rf 0,65). Käsittelemällä Na2C03:n 0,lN-liuoksella 60°:ssa tunnin ajan esterisidos lohkeaa, jolloin saadaan alkutuote, Gjji.
* ♦ · I *· * ie 83423
Esimerkki 2: Gangliosidi-seoksen (GA-seoksen) valmistus uuttamalla naudan aivokudoksesta ja sisäisten estereiden vastaavan seoksen valmistus (jota käytetään useissa seuraavissa esimerkeissä
Naudan aivokuori, joka on poistettu eläimestä, homogenisoidaan fosfaattipuskurissa, pH 6,8; 6 tilavuusosaa tetrahydro-furaania lisätään ja muodostunut seos sentrifugoidaan. Emä-liuosta uutetaan uudelleen kaksi kertaa tetrahydrofuraanilla. Sentrifugoinnin jälkeen ei-polaariset aineet poistetaan erottamalla ne etyylieetterin avulla ja vesipitoinen tetrahydrof uraanikerros johdetaan ioninvaihtopylväälle, joka on tasapainotettu 50 %:lla etanolia. Bariumhydroksidia ja neljä tilavuusosaa jääkylmää etanolia lisätään pylväästä peräisin olevaan poisteeseen.
18 tunnin jälkeen kylmissä olosuhteissa sakka kerätään ja sitten se tehdään hieman happamaksi kloorivetyhapolla, kun se on liuotettu veteen. Näin saatu liuos dialysoidaan ja pakastekuivataan. Saanto on tässä kohdassa noin 0,6 mg raakaa gangliosidiseosta/g käytettyä hermokudosta. Pakastekui-vatettu jauhe dispergoidaan 20 tilavuusosaan kloroformin ja metanolin 2:l-seosta, saatu liuos suodatetaan, kunnes se on täysin kirkas, ja sitten se erotetaan lisäämällä 0,2 tilavuusosaa kaliumkloridin vedessä olevaa liuosta 0,88 %:ssa.
Ylempi kerros erotetaan, dialysoidaan ja pakastekuivatetaan. Lopullinen saanto on 0,3 mg puhdistettua gangliosidisuolojen seosta/g aivokudosta.
5 g yllä esitetyn menetelmän mukaisesti saatua seosta liuotetaan 50 ml:aan DMSOrta. 4 g styreenityyppistä vedetöntä hartsia (sulfonihappoa) (50-100 mesh H+-muoto) lisätään seokseen ja muodostunutta järjestelmää sekoitetaan 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Tämä käsittely ioninvaihtohartsilla muuntaa kaikki suolaksi muodostetut karboksyyliryhmät. Täydellinen muunto suoritetaan sopivalla fysikaalisella analyysimenetelmällä, kuten atomiabsorptiolla. Hartsi suodatetaan
II
n 83423 sitten imulla ja liuosta käsitellään 1,5 g:lla disyklo-heksyylikarbodi-imidiä ja jätetään seisomaan tunnin ajaksi. Saostunut disykloheksyyliurea poistetaan suodattamalla ja muodostuva liuos käsitellään 100 ml :11a 0:ta, mikä saostaa valmistetut sisäiset gangliosidiesterit.
Saanto on 4,6 g sisäisten estereiden seosta (noin 90-95 % teoreettisesta arvosta). Sisäisten esteri johdannaisten läsnäolo vahvistetaan infrapunaspektroskopialla ja ohutkerros-kromatografiällä. KBr-tableteilla suoritettu IR-spektro-metria: esteröivä laktonisidos antaa vyön 1750 cm_1:ssä. Ohutkerroskromatografia: silikageelilevyllä, kehitysliuotin: CHCl3/MeOH/CaCl2 0,3 % (55:45:10, t/t/t), sisäisen esteri-seoksen Rf on 0,7 - 0,85. Lopullisten tuotteiden Rf on suurempi kuin lähtöaineen seoksen Rf; siten kromatografia osoittaa lähtöaineen poissaolon. Käsittelemällä Na2C03:n 0,1 N-liuoksella 60°:ssa tunnin ajan esterisidokset lohkaistaan ja on mahdollista saada lähtögangliosidien alkuseos.
Saatu gangliosidiseos voidaan fraktioida erillisiin osiin, jotka edustavat olennaisesti puhtaita gangliosidejä (yleisessä selityksessä käytetyssä mielessä), käyttämällä piihappopylväitä ja eluoimalla metanoli-kloroformi-seoksel-la. Tällä tavalla saadaan koostumus, joka sisältää keskimäärin noin 40 % gangliosidiä GDia, 21 % gangliosidiä GMl/ 19 % gangliosidiä G<pib ja ig % gangliosidiä Gon,.
Esimerkki 3: Gangliosidiseoksen metyyliestereiden seos 5 g gangliosidien (saatu uuttamalla naudan aivokudosta esimerkissä 3 esitetyllä tavalla) seoksen sisäisten este-reiden seosta liuotetaan 200 ml:aan vedetöntä metyleeniklo-ridin ja metanolin 4:l-seosta. Lisätään 318 mg (5,86 mmoo-lia) natriummetylaattia, joka on liuotettu 50 ml:aan vedetöntä metanolia ja seosta kuumennetaan palautusjäähdyttäen 2 tunnin ajan. Reaktion raakatuote eristetään sitten esimerkissä 1 esitetyllä tavalla (4,9 g). Raakatuote puhdistetaan sitten kromatografoimalla Sephadex-DEAE-asetaatti- ia 83423 muodossa A-25 käyttämällä liuottimena kloroformin, metanolin ja veden 30:60:8-seosta. Sekoitetut neutraalit fraktiot haihdutetaan, dialysoidaan vedessä, haihdutetaan jälleen kuiviin, jäännökset liuotetaan 15 ml:aan kloroformin ja metanolin l:l-seosta ja tuote saostetaan 75 ml :11a asetonia. Saanto: 4,3 g. KBr-tableteilla suoritettu IR-spektroskopia osoittaa tyypillisen esterisidoksen 1750 cm_l;ssä. Kroma-tografia, joka suoritetaan esimerkissä 1 esitetyllä tavalla, osoitti tuotteen, joka on gangliosidien metyyliestereiden seos ja jonka Rf on 0,72-0,85 gangliosidien seoksen Rf 0. 2-0,70).
Täydellinen muuntoesteröinti voidaan suorittaa määrittämällä molekyyliosuudet alkoksi- ja sialiryhmien välillä, jotka saadaan suorittamalla metyylialkoholin kvantitatiivinen "head space"-kaasukromatografia sen jälkeen kun ne on käsitelty Na2CC>3:n 0,1 N-liuoksella tunnin ajan, jolloin kaikki esterisidokset lohkeavat, ja Svennerholmin menetelmällä N-asetyylineuramiinihapon määrittämiseksi.
Esimerkki 4: Gangliosidin G^i etyyliesteri
Gangliosidin Gjyji etyyliesteri valmistetaan ja eristetään samalla tavalla kuin esimerkin 1 metyyliesteri käyttämällä kuitenkin etyylialkoholia ja natriumetylaattia metyylialkoholin ja natriummetylaatin sijasta ja käyttämällä samoja moolimääriä sisäistä esteriä ja etylaattia kuin esimerkissä 1. Dowex-hartsin pesu suoritetaan etyylialkoholilla ja jäännös, joka on saatu haihduttamalla suodatettu aine, liuotetaan 50 ml:aan metyleenikloridin ja etanolin l:l-seosta. Raakatuotteen saanto on 4,9 g. Puhdistus suoritetaan samoin esimerkissä 1 esitetyllä tavalla. Puhdistetun Gm-gangliosi-din etyyliesterin saanto: 4,3 g. Tuotteen kromatografinen analyysi, joka suoritetaan samalla tavalla kuin esimerkissä 1, osoittaa yhtenäisen yhdisteen läsnäolon, jonka Rf on 0,80, ja Gjii-gangliosidin ja sen sisäisen esterin puuttumisen (Rf 0,65 ja vastaavasti 0,75). Hydrolyysi NaCC>3:lla esimerkissä 1 esitetyllä tavalla tuottaa gangliosidin Gjm.
Il 19 83423 IR-spektri, joka suoritetaan KBr-tableteilla, osoittaa tyypillisen esterisidoksen 1750 cm“l:ssä.
Esimerkki 5: Gangliosidien seoksen etyyliestereiden seos
Etyyliestereiden seos valmistetaan ja eristetään samalla tavalla kuin esimerkin 3 metyyliestereiden seoksen yhteydessä käyttämällä kuitenkin etyylialkoholia ja natriumetylaattia metyylialkoholin ja natriummetylaatin sijasta ja käyttämällä 5 g sisäisten estereiden seosta ja 318 mg (5,86 mmoolia) natriumetylaattia.
Dowex-hartsin pesu suoritetaan etyylialkoholilla ja saatu jäännös, joka on saatu haihduttamalla suodatettu aine, liuotetaan 50 ml:aan kloroformin ja etanolin l:l-seosta.
Raakatuotteen saanto on 4,9 g. Puhdistus suoritetaan samoin esimerkissä 3 esitetyllä tavalla. Puhdistetun etyyliesteri-seoksen saanto: 4,5 g. IR-spektri, joka suoritetaan KBr-tableteilla, osoittaa tyypillisen esterisidoksen 1750 emeissä. Kun se kromatografoidaan silikageelilevyillä juuri valmistetulla kloroformin, metanolinja tetrametyyliammoniu-min hydroksidin IM 55:45:10-liuoksella ja määritetään Ehrlich-reagenssilla, tuote omaa Rf-arvona 0,50-0,75 (gangliosidi-seos 0,20-0,60).
Täydellinen muuntoesteröinti suoritetaan samalla tavalla kuin esimerkissä 3.
Esimerkki 6: Gangliosidin Gjm isopropyyliesteri Tämä johdannainen valmistetaan ja eristetään samalla tavalla kuin esimerkin 1 metyyliesteri käyttämällä kuitenkin isopro-pyylialkoholia ja natriumisopropylaattia metyylialkoholin ja natriummetylaatin sijasta ja käyttämällä samoja moolimääriä sisäistä esteriä ja isopropylaattia kuin esimerkissä 1. Dowex-hartsin pesu suoritetaan isopropyylialkoholilla ja jäännös, joka on saatu haihduttamalla suodatettu aine, liuotetaan 50 ml:aan metyleenikloridin ja isopropanolin 1:1- 20 83423 seosta. Raakatuotteen saanto on 4,9 g. Puhdistus suoritetaan samoin esimerkissä 1 esitetyllä tavalla. Puhdistetun G^i" gangliosidin isopropyyliesterin saanto: 4,2 g.
Tuotteen kromatografinen analyysi, joka suoritetaan samalla tavalla kuin esimerkissä 1, osoittaa yhtenäisen yhdisteen läsnäolon, jonka Rf on 0,85 ja Gm-gangliosidin tai sen sisäisen esterin puuttumisen. Hydrolyysi Na203:lla esimerkissä 1 esitetyllä tavalla tuottaa gangliosidin GmI. IR-spektri, joka suoritetaan KBr-tableteilla, osoittaa tyypillisen este-risidoksen 1750 cm”^:ssä.
Esimerkki 7: Gangliosidiseoksen isopropyyliestereiden seos Tämä johdannaisseos valmistetaan ja eristetään samalla tavalla kuin esimerkin 3 metyyliestereiden seoksen yhteydessä käyttämällä kuitenkin isopropyylialkoholia ja natriumisopro-pylaattia metyylialkoholin ja natriummetylaatin sijasta ja käyttämällä 5 g sisäisten estereiden seosta ja 537 mg (6,52 mmoolia) natriumisopropylaattia. Dowex-hartsin pesu suoritetaan isopropyylialkoholilla ja saatu jäännös, joka on saatu haihduttamalla suodatettu aine, liuotetaan 50 ml:aan kloroformin ja isopropanolin l:l-seosta. Raakatuotteen saanto on 4,9 g. Puhdistus suoritetaan samoin esimerkissä 3 esitetyllä tavalla käyttämällä kuitenkin kromatografisena eluenttina kloroformin, isopropyylialkoholin ja veden 20:60:8-seosta. Puhdistettujen isopropyyliestereiden seoksen saanto: 4,3 g.
Kromatografoimalla esimerkissä 5 esitetyllä tavalla tuotteen Rf on 0,40-0,80 (ganliosidiseoksen 0,20-0,60). IR-spektri, joka suoritetaan KBr-tableteilla, osoittaa tyypillisen este-rivyön 1750 cm--^:ssä. Täydellinen muuntoesteröinti suoritetaan esimerkissä 3 esitetyllä tavalla.
li
Esimerkki 8: Gangliosidin G^l tert-butyyliesteri 21 83423 Tämä johdannainen valmistetaan ja eristetään samalla tavalla kuin esimerkin 1 metyyliesteri käyttämällä kuitenkin tert-butyylialkoholia ja natrium-tert-butylaattia metyyli-alkoholin ja natriummetylaatin sijasta ja käyttämällä samoja moolimääriä sisäistä esteriä ja tert-butylaattia esimerkissä 1. Dowex-hartsin pesu suoritetaan tert-butyylialkoholilla ja jäännös, joka on saatu haihduttamalla suodatettu aine, liuotetaan 50 ml:aan metyleenikloridin ja tert-butanolin 1:1-seosta. Raakatuotteen saanto on 4,9 g. Puhdistetun G^-gang-liosidin tert-butyyliesterin saanto: 4,1 g.
Tuotteen kromatografinen analyysi, joka suoritetaan samalla tavalla kuin esimerkissä 1, osoittaa yhtenäisen yhdisteen läsnäolon, jonka Rf on 0,71 ja Gwi-gangliosidin ja sen si_ säisen esterin puuttumisen. Hydrolyysi Na2C03:lla esimerkissä 1 esitetyllä tavalla tuottaa gangliosidin GmI. IR-spektri, joka suoritetaan KBr-tableteilla, osoittaa tyypillisen esterinvyön 1750 cm~l:ssä.
Esimerkki 9: Ganqliosidien seoksen tert-butyyliestereiden seos Tämä seos valmistetaan ja eristetään samalla tavalla kuin esimerkin 3 metyyliestereiden seoksen yhteydessä käyttämällä kuitenkin tert-butyylialkoholia ja natrium-tert-butylaattia metyylialkoholin ja natriummetylaatin sijasta ja käyttämällä 5 g sisäisten estereiden seosta ja 628,6 mg natrium-tert-butylaattia. Dowex-hartsin pesu suoritetaan tert-butyyli-alkoholilla ja saatu jäännös, joka on saatu haihduttamalla suodatettu aine, liuotetaan 50 ml:aan kloroformin ja tert-butanolin l:l-seosta. Raakatuotteen saanto on 4,9 g. Puhdistus suoritetaan samoin esimerkissä 3 esitetyllä tavalla käyttämällä kuitenkin kromatografisena eluenttina kloroformin ja tert-butyylialkoholin l:l-seosta. Puhdistettujen tert-butyyliestereiden saanto: 4,1 g. IR-spektri, joka suoritetaan KBr-tableteilla, osoittaa tyypillisen esterisidok- 22 8 3 4 2 3 sen 1750 cm“^:ssä. Kromatografoituna esimerkissä 5 esitetyllä tavalla tuotteen Rf on 0,25-0,70. Täydellinen reaktio suoritetaan esimerkissä 3 esitetyllä tavalla.
Esimerkki 10: Gangliosidin G^i bentsyyliesteri 5 g gangliosidin G^i kaliumsuolaa (3,14 mmoolia) liuotetaan 50 ml:aan DMSO:ta ja liuokseen lisätään 1,58 g (12,5 mmoolia) bentsyylikloridia ja 2,08 g (12,5 mmoolia) KI:tä. Tämän annetaan reagoida typessä 24 tunnin ajan 25°C:ssa. Reaktion loputtua liuos jaetaan n-butanolin ja veden (2:1) välillä DMSO:n ja suolojen eliminoimiseksi. Butanoliliuos haihdutetaan kuiviin ja jäännös otetaan 50 ml:aan kloroformin ja bentsyylialkoholin l:l-seosta ja reaktiotuote saostetaan 250 ml :11a asetonia.
Näin saatu raakatuote (5,3 g) puhdistetaan sitten prepara-tiivisella kromatografiällä silikageelilevyillä käyttämällä liuottimena kloroformin, metanolin ja veden 65:32:7-seosta.
Puhtaat fraktiot sekoitetaan, haihdutetaan, liuotetaan uudelleen 15 ml:aan klorformin ja isopropanolin l:l-seosta ja tuote saostetaan 75 ml :11a asetonia. Puhtaan bentsyylieste-rin saanto: 4,8 g.
KBr-tableteilla suoritettu IR-spektri osoittaa tyypillisen esterivyön 1750 cm-1:ssä ja UV-spektroskopia, joka suoritetaan absoluuttisessa etyylialkoholissa osoittaa kolme maksimia 250, 255 ja 261 nm:ssä.
Kromatografoituna silikageelilevyillä kloroformin, metanolin ja CaCl2:n (0,3 %) 60:35:8-seoksella ja kloroformin/metanolin ja ammoniakin 2,5 N 55:45:12-seoksella ja määritettynä Ehrlich-reagenssilla tuote osoittautuu yhtenäiseksi ja sen Rf on 0,65 ja vastaavasti 0,53 ja se on vapaa GMl"lähtÖtuot-teesta (Rf 0,40 ja vastaavasti 0,45).
Käsittely Na2C03:n 0,1N liuoksella 60°:ssa tunnin ajan saa aikaan esterisidoksen lohkaisun ja tuottaa lähtötuotteet (GM^ ja bentsyylialkoholi ).
Esimerkki 11: Ganqliosidien seoksen bentsyyliestereiden seos 23 83423 5 g suoloiksi muodostettujen gangliosidien (kaliumsuolojen) seosta, joka on saatu uuttamalla naudan aivokudosta esimerkissä 2 esitetyllä tavalla vaihtamalla tämän jälkeen natrium kaliumilla (ioninvaihto), liuotetaan 100 ml:aan DMSOrta ja liuokseen lisätään 3,3 g (26,0 mmoolia) bentsyylikloridia ja 216 g (13,0 mmoolia) KI:tä. Seos jätetään reagoimaan typessä 48 tunnin ajaksi 25°:ssa. Reaktion lopussa liuos jaetaan n-butanolin/H20:n välillä (2:1) DMSO:n ja suolojen eliminoimiseksi. Butanoliliuos haihdutetaan kuiviin ja jäännös otetaan 50 ml:aan kloroformin ja bentsyylialkoholin l:l-seosta ja tuote saostetaan 250 ml :11a asetonia. Näin saatu raaka-tuote puhdistetaan asetaattimuodossa olevalla Sephadex-DEAE-kromatografiällä käyttämällä liuottimena kloroformin, meta-nolin ja veden 30:60:8-seosta.
Eluoidut neutraalit fraktiot sekoitetaan, vapautetaan liu-ottimesta haihduttamalla ja jäännös otetaan 15 ml :11a kloroformin ja isopropanolin l:l-seosta ja puhdistettujen bentsyyliestereiden seos saostetaan 75 ml:lla asetonia. Saanto: 4,9 g.
KBr-tableteilla suoritettu IR-spektrometria osoittaa tyypillisen esterisidoksen 1750 cm“^:ssä ja UV-spektroskopia, joka suoritetaan absoluuttisessa etyylialkoholissa, osoittaa kolme maksimia 250, 255 ja 261 nm:ssä.
Kromatografoituna silikageelilevyillä kloroformin, metanolin ja CaCl3:n seoksella (0,3 %, 60:25:8) ja kloroformin, metanolin ja ammoniakin 2,5N 55:45:10-seoksella ja määriteltynä Ehlich-reagenssilla tuotteen Rf-arvoksi osoittautuu 0,40 -0,70 ja vastaavasti 0,29 - 0,53 (alkuperäiselle gangliosi-diseokselle 0,05 - 0,40 ja vastaavasti 0,12 - 0,46).
Täydellinen reaktio suoritetaan esimerkissä 3 esitetyllä tavalla.
Esimerkki 12: Gangliosidin G^i allyyliesteri 24 83423 5 g gangliosidin G^i kaliumsuolaa (3,14 mmoolia) liuotetaan 50 ml:aan DMSO:ta ja liuokseen lisätään 453,7 g (3,75 mmoolia) allyylibromidia ja 625 mg (3,75 mmoolia) Kiitä. Tämän annetaan reagoida 48 tunnin ajan 25°C:ssa.
Reaktion loputtua liuos jaetaan n-butanolin/f^Oin (2:1) välillä DMSO:n ja suolojen eliminoimiseksi. Butanoliliuos haihdutetaan kuiviin ja jäännös otetaan 50 mliaan kloroformin ja metanolin l:l-seosta ja reaktiotuote saostetaan 250 ml :11a asetonia.
Näin saatu raakatuote (5,1 g) puhdistetaan sitten prepara-tiivisella kromatografiällä silikageelilevyillä käyttämällä liuottimena kloroformin, metanolin ja veden 60:35:8-seosta.
Puhtaat fraktiot sekoitetaan, haihdutetaan, liuotetaan uudelleen 15 mliaan klorformin ja isopropanolin l:l-seosta ja tuote saostetaan 75 ml :11a asetonia. Puhtaan allyyliesterin saanto: 4,5 g.
KBr-tableteilla suoritettu IR-spektrometria osoittaa tyypillisen esterivyön 1750 cm“^:ssä.
Kromatografoituna silikageelilevyillä kloroformin, metanolin ja CaCl2:n (0,3 %) 60:40:9-seoksella ja kloroformin/metanolin ja ammoniakin 2,5N 55 :45 :10-seoksella ja määritettynä Ehrlich-reagenssilla tuote osoittautuu yhtenäiseksi yhdisteeksi, jonka Rf on 0,56 ja vastaavasti 0,39 ja se on vapaa Gf4i-lähtötuotteesta (Rf 0,40 ja vastaavasti 0,42).
Käsittely Na2C03:n 0,1 N liuoksella öO^issa tunnin ajan saa aikaan esterisidoksen lohkaisun ja tuottaa lähtötuotteet gangliosidin G^i ja allyylialkoholin.
Il
Esimerkki 13: Gangliosidin Gmi etoksikarbonyylimetyyliesteri 25 83423 5 g gangliosidin Gmi kaliumsuolaa (3,14 mmoolia) liuotetaan 50 ml:aan DMSOrta ja liuokseen lisätään 2,12 g (12,5 mmoo-lia) etyylimonobromiasetaattia ja 2,08 g (12,5 mmoolia) KI:tä. Se jätetään reagoimaan typessä 24 tunnin ajan 25eC:ssa. Liuos jaetaan n-butanolin ja veden (2:1) välillä DMSO:n ja suolojen eliminoimiseksi. Butanoliliuos haihdutetaan kuiviin ja jäännös otetaan 50 ml:aan kloroformin ja me-tanolin l:l-seosta ja tuote saostetaan 250 ml:lla asetonia. Saanto 4,8 g.
Raakatuote puhdistetaan sitten preparatiivisella pylväskro-matografiällä silikageelilevyillä käyttämällä liuottimena kloroformin, metanolin ja veden 60:32:7-seosta. Puhtaat fraktiot sekoitetaan, haihdutetaan, liuotetaan 15 ml:aan kloroformin ja metanolin l:l-seosta ja tuote saostetaan 75 ml :11a asetonia. Saanto: 2,4 g.
KBr-tableteilla suoritettu IR-spektrometria osoittaa tyypillisen esterivyön 1750 cm-1:ssä.
Kromatografoituna silikageelilevyillä kloroformin, metanolin ja CaCl2sn (0,3 %) 60:35 :8-seoksella ja määritettynä Ehrlich-reagenssilla tuote osoittautuu yhtenäiseksi yhdisteeksi, jonka Rf on 0,64, ja se on vapaa Gj^-lähtötuotteesta (Rf 0,40).
Käsittely Na2C03:n 0,1N liuoksella 60°:ssa tunnin ajan saa aikaan esterisidoksen lohkaisun ja tuottaa alkuperäisen gangliosidin Gmi ·
Esimerkki 14: Gangliosidin Gmi amidi 5 g gangliosidin Gmi sisäistä esteriä (3,27 mmoolia) suspen-doidaan 100 ml:aan vedetöntä isopropyylialkoholia. Suspensiota sekoitetaan alhaisessa lämpötilassa (-5°) ja kuivaa ammoniakkia kuplitetaan sitten sen läpi vedettömissä olosuhteissa 3 tunnin ajan.
26 83 423
Reaktion lopussa liuotin eliminoidaan haihduttamalla ja jäännös otetaan 50 mitään kloroformin ja metanolin 1:1-seosta ja tuote saostetaan 250 ml :11a asetonia.
Raaka tuote (4,9 g) käsitellään 100 ml:11a Na2CC>3:a (1 %) 30 minuutin ajan 25°C:ssa jäännösesteriryhmien hydrolysoimi-seksi, dialysoidaan vedessä, haihdutetaan kuiviin tyhjössä ja sitten se puhdistetaan preparatiivisella pylväskroma-tografialla silikageelillä käyttämällä liuottimena ensin kloroformin, metanolin ja H20:n 60:40:9-seosta ja toisena liuottimena kloroformin, metanolin ja H20*n 55:45:10-seosta. Puhtaat, eluoidut fraktiot haihdutetaan kuluviin, jäännös liuotetaan 15 ml:aan kloroformi/metanolia 1:1 ja amidi saostetaan 75 ml :11a asetonia. Saanto: 4,8 g.
Kromatografoituna silikageelilevyillä kloroformin, metanolin ja ammoniakin 4N 55:45:10-seoksella ja määritettynä resorsi-noli-reagenssilla tuote osoittautuu yhtenäiseksi yhdisteeksi (Rf 0,10 ja vastaavasti 0,32) ja vapaaksi G^l^stä (Rf 0,35 ja vastaavasti 0,65).
Il
Esimerkki 15: Gangliosidin fenyylietyyliesteri 27 83423 GMl:n fenyylietyyliesteri valmistetaan ja eristetään samalla tavalla kuin esimerkin 1 metyyliesteri käyttämällä kuitenkin fenetyylialkoholia ja natriumetylaattia metyylialkoholin ja natriummetylaatin sijasta ja kuumentamalla vesihauteen päällä ja käyttämällä samanlaisia moolimääriä sisäistä esteriä ja natriumfenyylietylaattia kuin esimerkissä 1. Dowex-hartsin pesu fenyylietyylialkoholilla ja jäännös, joka on saatu haihduttamalla suodatettu aine, liuotetaan 50 ml:aan metyleenikloridin ja fenyylialkoholin l:l-seosta. Raakatuotteen saanto on 5,1 g. Puhdistus suoritetaan samoin esimerkissä 1 esitetyllä tavalla. Puhdistetun GMi~gangliosi-din fenyylietyyliesterin saanto: 4,3 g.
IR-spektroskopinen tutkimus, joka suoritetaan KBr-table-teilla osoittaa tyypillisen esterisidoksen 1750 cm“^:ssä. Tuotteen kromatografinen analyysi, joka suoritetaan esimerkissä 1 esitetyllä tavalla, osoittaa yhtenäisen yhdisteen läsnäolon, jonka Rf on 0,90 ja GMi~gangliosidin ja sen sisäisen esterin puuttumisen (Rf 0,65 ja vastaavasti 0,75). Hydrolyysi Na2C03:lla esimerkissä 1 esitetyllä tavalla tuottaen gangliosidin GmI- 28 83423
Esimerkki T6; Gangliosidiseoksen fenyylietyyliestereiden seos
Fenyylietyyliestereiden seos valmistetaan ja eristetään samalla tavalla kuin esimerkin 2 mukainen metyyliestereiden seos käyttämällä kuitenkin fenetyylialkoholia ja natriumfe-nyylietylaattia metyylialkoholin ja natriummetylaatin sijasta ja kuumentamalla vesihauteen päällä ja käyttämällä 5 g sisäisten estereiden seosta ja 844,8 mg (5,86 mmoolia) nat-riumfenyylietylaattia. Dowex-hartsin pesu suoritetaan fenyy-lietyylialkoholilla ja saatu jäännös, joka on saatu haihduttamalla suodatettu aine, liuotetaan 50 ml:aan kloroformin ja fenyylietyylialkoholin l:l-seosta. Raakatuotteen saanto on 5,3 g. Puhdistus suoritetaan samoin esimerkissä 3 esitetyllä tavalla. Puhdistetun esteriseoksen saanto: 4,4 g.
KBr-tableteilla suoritettu IR-spektroskopia osoittaa tyypillisen esterovyön 1750 cm“^:ssä. Kun se kromatografoidaan silikageelilevyillä juuri valmistetulla kloroformin, metano-lin ja tetrametyyliammoniumin hydroksidin IM 55:45:10-seok-sella ja määritetään Ehrlich-reagenssilla, tuote omaa Rf-arvoina 0,65 - 0,887 (gangliosidiseos 0,2 - 0,60). Täydellinen muuntoesteröinti suoritetaan esimerkissä 2 esitetyllä tavalla.
Esimerkki 17; Gangliosidin G^i 2-sykloheksyylietyyliesteri G^iin 2-sykloheksyyliesteri valmistetaan ja eristetään samalla tavalla kuin esimerkin 1 metyyliesteri käyttämällä kuitenkin 2-sykloheksyylietanolia ja natrium-2-sykloheksyyli-etylaattia metyylialkoholin ja natriummetylaatin sijasta ja kuumentamalla vesihauteen päällä ja käyttämällä samoja moolimääriä sisäistä esteriä ja 2-sykloheksyylietylaattia kuin esimerkissä 1. Dowex-hartsin pesu suoritetaan 2-syklo-heksyylietyylialkoholilla ja jäännös, joka on saatu haihduttamalla suodatettu aine, liuotetaan 50 ml:aan metyleeniklo-ridin ja 2-sykloheksyylietanolin l:l-seosta. Raakatuotteen saanto on 5,1 g. Puhdistus suoritetaan esimerkissä 1 esi 29 83423 tetyllä tavalla. Puhdistetun G^i-gangliosidin 2-syklohek-syylietyyliesterin saanto: 4,3 g.
KBr-tableteilla suoritettu IR-spektroskopinen tutkimus osoittaa tyypillisen esterivyön 1750 cm-l;ssä. Tuotteen kromatografinen analyysi, joka suoritetaan esimerkissä 1 esitetyllä tavalla, osoittaa yhtenäisen yhdisteen läsnäolon, Rf 0,92, ja G^i-gangliosidin ja sen sisäisen esterin puuttumisen (Rf 0,65 ja vastaavasti 0,75). Hydrolyysi Na203:lla esimerkissä 1 esitetyllä tavalla tuottaa gangliosidin GmI.
Esimerkki Ί8: Gangliosidien seoksen 2-sykloheksyylietyyli-esteriseos 2-sykloheksyylietyyliestereiden seos valmistetaan ja eristetään samalla tavalla kuin esimerkin 2 metyyliestereiden seos käyttämällä kuitenkin 2-sykloheksyylietanolia ja natrium- 2-sykloheksyylietylaattia metyylialkoholin ja natriummety-laatin sijasta ja kuumentamalla vesihauteen päällä ja käyttämällä 5 g sisäisten estereiden seosta ja 880,3 mg (5,86 mmoolia) natrium-2-sykloheksyylietylaattia. Dowex-hartsin pesu suoritetaan 2-sykloheksyylietyylialkoholilla ja jäännös, joka on saatu haihduttamalla suodatettu aine, liuotetaan 50 ml:aan kloroformin ja etanolin l:l-seosta. Raaka-tuotteen saanto on 5,3 g. Puhdistus suoritetaan samoin esimerkissä 3 esitetyllä tavalla. Puhdistetun esteriseoksen saanto: 4,3 g.
KBr-tableteilla suoritettu IR-spektroskopia osoittaa tyypillisen esterivyön 1750 cm“-*-:ssä. Kun se kromatografoidaan silikageelilevyillä juuri valmistetulla kloroformin, metano-lin ja tetrametyyliammoniumin IM 55:45:10-liuoksella ja määritetään Ehrlich-reagenssilla, tuotteen Rf-arvoina on 0,67 - 0,90 (gangliosidiseos 0,20 - 0,60). Täydellinen muuntoesteröinti suoritetaan esimerkissä 2 esitetyllä tavalla.
Esimerkki 19: Gangliosidin G^l mentyyliesteri 30 83423
Gmijo mentyyliesteri valmistetaan ja eristetään samalla tavalla kuin esimerkin 1 metyyliesteri käyttämällä kuitenkin mentolia ja natriummetylaattia metyylialkoholin ja natrium-metylaatin sijasta ja kuumentamalla vesihauteen päällä ja käyttämällä samanlaisia moolimääriä sisäistä esteriä ja nat-riummentylaattia kuin esimerkissä 1. Dowex-hartsin pesu suoritetaan mentyylialkoholin ja metyleeniklordin 1:1-seoksella ja jäännös, joka on saatu haihduttamalla suodatettu aine, liuotetaan 50 ml:aan metyleenikloridin ja mentolin l:l-seosta. Raakatuotteen saanto on 3,9 g. Puhdistus suoritetaan samoin esimerkissä 1 esitetyllä tavalla. Puhdistetun GMl”9an9li°sidin mentyyliesterin saanto: 4,2 g.
KBr-tableteilla suoritettu IR-spektroskopinen tutkimus osoittaa tyypillisen esterivyön 1750 cm”l;ssä. Tuotteen kromatografinen analyysi, joka suoritetaan esimerkissä 1 esitetyllä tavalla, osoittaa yhtenäisen yhdisteen läsnäolon, jonka Rf on 0,93 ja Gfli-gangliosidin ja sen sisäisen esterin puuttumisen (Rf 0,65 ja vastaavasti 0,75). Hydrolyysi Na2CC>3:lla esimerkissä 1 esitetyllä tavalla tuottaa gangliosidin Gmi ·
Esimerkki 20. Gangliosidiseoksen mentyyliesterien seos
Mentyyliestereiden seos valmistetaan ja eristetään samalla tavalla kuin esimerkin 2 mukainen metyyliestereiden seos käyttämällä kuitenkin mentolia ja natriummentylaattia metyylialkoholin ja natriummetylaatin sijasta ja kuumentamalla vesihauteen päällä ja käyttämällä 5 g sisäisten estereiden seosta ja 1038,8 mg (5,86 mmoolia) natriummentylaattia. Dowex-hartsin pesu suoritetaan mentyylialkoholin ja metyleenikloridin 1:l-seoksella ja jäännös, joka on saatu haihduttamalla suodatettu aine, liuotetaan 50 ml:aan kloroformin ja etanolin l:l-seosta. Raakatuotteen saanto on 5,2 g. Puhdistus suoritetaan samoin esimerkissä 3 esitetyllä tavalla. Puhdistetun esteriseoksen saanto: 4,3 g.
Il 31 83423 KBr-tableteilla suoritettu IR-spektroskopia osoittaa tyypillisen esterivyön 1750 cm-l;ssä. Kun se kromatografoidaan silikageelilevyillä juuri valmistetulla kloroformin, metano-lin ja tetrametyyliammoniumin hydroksidin IM 55:45:10-seoksella ja määritetään Ehrlich-reagenssilla, tuote omaa Rf-arvoina 0,70 - 0,93 (gangliosidiseos 0,20 - 0,60). Täydellinen muuntoesteröinti suoritetaan esimerkissä 2 esitetyllä tavalla.
Esimerkki 21: Gangliosidin G^i tetrahydrofurfuryyliesteri G^m tetrahydrofurfuryyliesteri valmistetaan ja eristetään samalla tavalla kuin esimerkin 1 metyyliesteri käyttämällä kuitenkin tetrahydrofurfuryyliä ja natriumtetrahydrofury-laattia metyylialkoholin ja natriummetylaatin sijasta ja kuumentamalla vesihauteen päällä ja käyttämällä samoja moolimääriä sisäistä esteriä ja natriumtetrahydrofurfyry-laattia kuin esimerkissä 1. Dowex-hartsin pesu suoritetaan tetrahydrofurfuryylialkoholilla ja jäännös, joka saadaan haihduttamalla suodatettu aine, liuotetaan 50 ml:aan mety-leenikloridin ja tetrahydrofurfuryylialkoholin l:l-seosta. Raakatuotteen saanto on 5,0 g. Puhdistus suoritetaan esimerkissä 1 esitetyllä tavalla. Puhdistetun Gni~gangliosidin tetrahydrofurfuryyliesterin saanto: 4,2 g.
KBr-tableteilla suoritettu IR-spektroskopinen tutkimus osoittaa tyypillisen esterivyön 1750 cm~^-:ssä. Tuotteen kromatografinen analyysi, joka suoritetaan esimerkissä 1 esitetyllä tavalla, osoittaa yhtenäisen yhdisteen läsnäolon, Rf 0,72, ja G^^-gangliosidin ja sen sisäisen esterin puuttumisen (Rf 0,65 ja vastaavasti 0,75). Hydrolyysi Na2C>3:lla esimerkissä 1 esitetyllä tavalla tuottaa gangliosidin GmI.
Esimerkki 22: Gangliosidien seoksen tetrahydrofurfuryyli-esteriseos
Tetrahydrofurfuryyliestereiden seos valmistetaan ja eristetään samalla tavalla kuin esimerkin 2 metyyliestereiden seos käyttämällä kuitenkin tetrahydrofurfuryylialkoholia ja nat- 32 83423 riumtetrahydrofurfurylaattia metyylialkoholin ja natriumme-tylaatin sijasta ja kuumentamalla vesihauteen päällä ja käyttämällä 5 g sisäisten estereiden seosta ja 727,5 mg (5,86 mmoolia) natriumtetrahydrofurfurylaattia. Dowex-hartsin pesu suoritetaan tetrahydrofurfuryylialkoholilla ja jäännös, joka saadaan haihduttamalla suodatettu aine, liuotetaan 50 ml jaan kloroformin ja etanolin l:l-seosta. Raaka-tuotteen saanto on 5,2 g. Puhdistus suoritetaan samoin esimerkissä 2 esitetyllä tavalla. Puhdistetun esteriseoksen saanto: 4,2 g.
KBr-tableteilla suoritettu IR-spektroskopia osoittaa tyypillisen esterivyön 1750 cm-ljssä. Kun se kromatografoidaan silikageelilevyillä juuri valmistetulla kloroformin, metano-lin ja tetrametyyliammoniumin IM 55 :45 :10-liuoksella ja määritetään Ehrlich-reagenssilla, tuotteen Rf-arvoina on 0,45 -0,68 (gangliosidiseos 0,20 - 0,60). Täydellinen muuntoeste-röinti suoritetaan esimerkissä 2 esitetyllä tavalla.
Esimerkki 23; Gangliosidin Gmi tetrahydro-2H-pyran-4-yyli-esteri GMl:n tetrahydro-2H-pyran-4-yyliesteri valmistetaan ja eristetään samalla tavalla kuin esimerkin 1 metyyliesteri käyttämällä kuitenkin tetrahydro-2H-pyran-4-olia ja natrium-tetrahydro-2H-pyran-4-ylaattia metyylialkoholin ja natrium-metylaatin sijasta ja kuumentamalla vesihauteen päällä ja käyttämällä samanlaisia moolimääriä sisäistä esteriä ja natrium-tetrahydro-2H-pyran-4-ylaattia kuin esimerkissä 1. Dowex-hartsin pesu suoritetaan tetrahydro-2H-pyran-4-olilla ja jäännös, joka on saatu haihduttamalla suodatettu aine, liuotetaan 50 mitään metyleenikloridialkoholia 1:1. Raaka-tuotteen saanto on 5,1. Puhdistus suoritetaan samoin esimerkissä 1 esitetyllä tavalla. Puhdistetun Gm-gangliosidin tetrahydro-2H-pyran-4-yyliesterin saanto: 4,3 g.
KBr-tableteilla suoritettu IR-spektroskopinen tutkimus osoittaa tyypillisen esterivyön 1750 cm”^:ssä. Tuotteen kro-
II
33 83423 matografinen analyysi, joka suoritetaan esimerkissä 1 esitetyllä tavalla, osoittaa yhtenäisen yhdisteen läsnäolon, jonka Rf on 0,73, ja G^i-gangliosidin ja sen sisäisen esterin puuttumisen (Rf 0,65 ja vastaavasti 0,75). Hydrolyysi Na2C03:lla esimerkissä 1 esitetyllä tavalla tuottaa ganglio-sidin Gmi·
Esimerkki 24; Ganqliosidien seoksen tetrahydro-2H-pyran-4-yyliestereiden seos
Tetrahydro-2H-pyran-4-yyliestereiden seos valmistetaan ja eristetään samalla tavalla kuin esimerkin 2 mukainen metyy-liestereiden seos käyttämällä kuitenkin tetrahydro-2H-pyran- 4-olia ja natrium-tetrahydro-2H-pyran-4-ylaattia metyylialkoholin ja natriummetylaatin sijasta ja kuumentamalla vesi-hauteen päällä ja käyttämällä 5 g sisäisten estereiden seosta ja 727,5 mg (5,86 mmoolia) natrium-tetrahydro-2H-pyran- 4-ylaattia. Dowex-hartsin pesu suoritetaan tetrahydro-2H-py-ran-4-yylillä ja jäännös, joka on saatu haihduttamalla suodatettu aine, liuotetaan 50 ml:aan kloroformin ja etanolin l:l-seosta. Raakatuotteen saanto on 5,3 g. Puhdistus suoritetaan samoin esimerkissä 3 esitetyllä tavalla. Puhdistetun raakatuotteen saanto: 5,3 g. Puhdistus suoritetaan samoin esimerkissä 3 esitetyllä tavalla. Puhdistetun esteriseoksen saanto: 4,5 g.
KBr-tableteilla suoritettu IR-spektroskopia osoittaa tyypillisen esterivyön 1750 cm"^:ssä. Kun se kromatografoidaan silikageelilevyillä juuri valmistetulla kloroformin, metano-lin ja tetrametyyliammoniumin hydroksidin IM 55:45:10-seok-sella ja määritetään Ehrlich-reagenssilla, tuote omaa Rf-arvoina 0,48 - 0,72 (gangliosidiseos 0,20 - 0,60). Täydellinen muuntoesteröinti suoritetaan esimerkissä 2 esitetyllä tavalla.
Esimerkki 25: Gangliosidin Gmi 1-heptyyliesteri 34 83423
Gmi: n 1-heptyyliesteri valmistetaan ja eristetään samalla tavalla kuin esimerkin 1 metyyliesteri käyttämällä kuitenkin 1-heptanolia ja natrium-l-heptylaattia metyylialkoholin ja natriummetylaatin sijasta ja kuumentamalla vesihauteen päällä ja käyttämällä samoja moolimääriä sisäistä esteriä ja natrium-l-heptylaattia kuin esimerkissä 1. Dowex-hartsin pesu suoritetaan 1-heptyylialkoholilla ja jäännös, joka on saatu haihduttamalla suodatettu aine, liuotetaan 50 ml:aan metyleenikloridin ja 1-heptanolian l:l-seosta. Raakatuotteen saanto on 3,9 g. Puhdistus suoritetaan esimerkissä 1 esitetyllä tavalla. Puhdistetun Gwi-gangliosidin 1-heptyylieste-rin saanto: 4,3 g.
KBr-tableteilla suoritettu IR-spektroskopinen tutkimus osoittaa tyypillisen esterivyön 1750 cm“^:ssä. Tuotteen kromatografinen analyysi, joka suoritetaan esimerkissä 1 esitetyllä tavalla, osoittaa yhtenäisen yhdisteen läsnäolon, Rf 0,89, ja G^i-gangliosidin ja sen sisäisen esterin puuttumisen (Rf 0,65 ja vastaavasti 0,75). Hydrolyysi Na203*Ha esimerkissä 1 esitetyllä tavalla tuottaa gangliosidin Gmi.
Esimerkki 26; Gangliosidien seoksen 1-heptyyliestereiden seos 1-heptyyliestereiden seos valmistetaan ja eristetään samalla tavalla kuin esimerkin 2 metyyliestereiden seos käyttämällä kuitenkin 1-heptanolia ja natrium-l-heptylaattia metyylialkoholin ja natriummetylaatin sijasta ja kuumentamalla vesi-hauteen päällä ja käyttämällä 5 g sisäisten estereiden seosta ja 809,8 mg (5,86 mmoolia) natrium-l-heptylaattia. Dowex-hartsin pesu suoritetaan 1-heptyylialkoholilla ja jäännös, joka on saatu haihduttamalla suodatettu aine, liuotetaan 50 ml:aan kloroformin ja etanolin l:l-seosta. Raakatuotteen saanto on 5,2 g. Puhdistus suoritetaan samoin esimerkissä 2 esitetyllä tavalla. Puhdistetun esteriseoksen saanto: 4,3 g.
Il 35 83423 KBr-tableteilla suoritettu IR-spektroskopia osoittaa tyypillisen esterivyön 1750 cm“3-:ssä. Kun se kromatografoidaan silikageelilevyillä juuri valmistetulla kloroformin, metano-lin ja tetrametyyliammoniumin IM 55 :45:10-liuoksella ja määritetään Ehrlich-reagenssilla, tuotteen Rf-arvoina on 0,68 -0,90 (gangliosidiseos 0,20 - 0,60). Täydellinen muuntoeste-röinti suoritetaan esimerkissä 2 esitetyllä tavalla.
Esimerkki 27. Gangliosidin G^i 2-metyyli-l-pentyyliesteri
GmI:n 2-metyyli-l-pentyyliesteri valmistetaan ja eristetään samalla tavalla kuin esimerkin 1 metyyliesteri käyttämällä kuitenkin 2-metyyli-l-pentanolia ja natrium-2-metyyli-l-pen-tylaattia metyylialkoholin ja natriummetylaatin sijasta ja kuumentamalla vesihauteen päällä ja käyttämällä samanlaisia moolimääriä sisäistä esteriä ja natrium-2-metyyli-l-penty-laattia kuin esimerkissä 1. Dowex-hartsin pesu suoritetaan 2-metyyli-l-pentyyli-alkoholilla ja jäännös, joka on saatu haihduttamalla suodatettu aine, liuotetaan 50 ml:aan mety-leenikloridin ja 2-metyyli-l-pentanolin l:l-seosta. Raaka-tuotteen saanto on 5,1 g. Puhdistus suoritetaan samoin esimerkissä 1 esitetyllä tavalla. Puhdistetun Gfli-gangliosi-din 2-metyyli-l-pentyyliesterin saanto: 4,4 g.
KBr-tableteilla suoritettu IR-spektroskopinen tutkimus osoittaa tyypillisen esterivyön 1750 cm"^:ssä. Tuotteen kromatografinen analyysi, joka suoritetaan esimerkissä 1 esitetyllä tavalla, osoittaa yhtenäisen yhdisteen läsnäolon, jonka Rf on 0,90,ja Gwi-gangliosidin ja sen sisäisen esterin puuttumisen (Rf 0,65 ja vastaavasti 0,75). Hydrolyysi Na2C03illa esimerkissä 1 esitetyllä tavalla tuottaan gangliosidin Gjkji ·
Esimerkki 28; Ganqliosidien seoksen 2-metyyli-l-pentyyli-estereiden seos 2-metyyli-l-pentyyliestereiden seos valmistetaan ja eristetään samalla tavalla kuin esimerkin 2 mukainen metyylieste-reiden seos käyttämällä kuitenkin 2-metyyli-l-pentanolia ja 36 83423 natrium-2-metyyli-l-pentylaattia metyylialkoholin ja nat-riummetylaatin sijasta ja kuumentamalla vesihauteen päällä ja käyttämällä 5 g sisäisten estereiden seosta ja 727,7 mg (5,86 mmoolia) natrium-2-metyyli-l-pentylaattia. Dowex-hartsin pesu suoritetaan 2-metyyli-l-pentyylialkoholilla ja jäännös, joka on saatu haihduttamalla suodatettu aine, liuotetaan 50 ml:aan kloroformin ja etanolin l:l-seosta. Raaka-tuotteen saanto on 5,3 g. Puhdistus suoritetaan samoin esimerkissä 2 esitetyllä tavalla. Puhdistetun esteriseoksen saanto: 4,4 g.
KBr-tableteilla suoritettu IR-spektroskopia osoittaa tyypillisen esterivyön 1750 cm”^:ssä. Kun se kromatografoidaan silikageelilevyillä juuri valmistetulla kloroformin, metano-lin ja tetrametyyliammoniumin hydroksidin IM 55:45:10-seok-sella ja määritetään Ehrlich-reagenssilla, tuote omaa Rf-arvoina 0,70 - 0,93 (gangliosidiseos 0,20 - 0,60). Täydellinen muuntoesteröinti suoritetaan esimerkissä 2 esitetyllä tavalla.
Esimerkki 29: Gangliosidin Gmi 3-metyyli-2-pentyyliesteri GMl:n 3-metyyli-2-pentyyliesteri valmistetaan ja eristetään samalla tavalla kuin esimerkin 1 metyyliesteri käyttämällä kuitenkin 3-metyyli-2-pentanolia ja natrium-3-metyyli-2-pen-tylaaattia metyylialkoholin ja natriummetylaatin sijasta ja kuumentamalla vesihauteen päällä ja käyttämällä samoja moolimääriä sisäistä esteriä ja natrium-3-metyyli-2-penty-laattia kuin esimerkissä 1. Dowex-hartsin pesu suoritetaan 3-metyyli-2-pentyylialkoholilla ja jäännös, joka on saatu haihduttamalla suodatettu aine, liuotetaan 50 ml:aan mety-leenikloridin ja 3-metyyli-2-pentanolin l:l-seosta. Raaka-tuotteen saanto on 5,1 g. Puhdistus suoritetaan esimerkissä 1 esitetyllä tavalla. Puhdistetun Gjm-gangliosidin 3-metyyli-2-pentyyliesterin saanto: 4,2 g.
KBr-tableteilla suoritettu IR-spektroskopinen tutkimus osoittaa tyypillisen esterivyön 1750 cm“^:ssä. Tuotteen kro 37 83423 matografinen analyysi, joka suoritetaan esimerkissä 1 esitetyllä tavalla, osoittaa yhtenäisen yhdisteen läsnäolon, Rf 0,92, ja GMi-gangliosidin ja sen sisäisen esterin puuttumisen (Rf 0,65 ja vastaavasti 0,75). Hydrolyysi ^203:11a esimerkissä 1 esitetyllä tavalla tuottaa gangliosidin Gmi.
Esimerkki 30,: Gangliosidien seoksen 3-metyyli-2-pentyyli-estereiden seos 3-metyyli-2-pentyyliestereiden seos valmistetaan ja eristetään samalla tavalla kuin esimerkin 2 metyyliestereiden seos käyttämällä kuitenkin 3-metyyli-2-pentanolia ja natrium--3-metyyli-2-pentanolia ja natrium-3-metyyli-2-pentylaattia metyylialkoholin ja natriummetylaatin sijasta ja kuumentamalla vesihauteen päällä ja käyttämällä 5 g sisäisten estereiden seosta ja 727,7 mg (5,86 mmoolia) natrium-3-metyyli-2-pentylaattia. Dowex-hartsin pesu suoritetaan 3-metyyli-2-pentyylialkoholilla ja jäännös, joka on saatu haihduttamalla suodatettu aine, liuotetaan 50 ml:aan kloroformin ja etanolin l:l-seosta. Raakatuotteen saanto on 5,3 g. Puhdistus suoritetaan samoin esimerkissä 2 esitetyllä tavalla. Puhdistetun esteriseoksen saanto: 4,4 g.
KBr-tableteilla suoritettu IR-spektroskopia osoittaa tyypillisen esterivyön 1750 cm-1:ssä. Kun se kromatografoidaan silikageelilevyillä juuri valmistetulla kloroformin, metano-lin ja tetrametyyliammoniumin hydroksidin IM 55:45:10-liuok-sella ja määritetään Ehrlich-reagenssilla, tuotteen Rf-arvoina on 0,72 - 0,95 (gangliosidiseos 0,20 - 0,60). Täydellinen muuntoesteröinti suoritetaan esimerkissä 2 esitetyllä tavalla.
Esimerkki 31: Gangliosidin Gjh 3-metoksietyyliesteri
Gulin 2-metoksietyyliesteri valmistetaan ja eristetään samalla tavalla kuin esimerkin 1 metyyliesteri käyttämällä kuitenkin 2-metoksietanolia ja natrium-2-metoksietylaattia metyylialkoholin ja natriummetylaatin sijasta ja kuumentamalla vesihauteen päällä ja käyttämällä samanlaisia mooli- 38 83423 määriä sisäistä esteriä ja natrium-2-metoksietylaattia kuin esimerkissä 1. Dowex-hartsin pesu suoritetaan 2-metoksi-etyylialkoholilla ja jäännös, joka on saatu haihduttamalla suodatettu aine, liuotetaan 50 ml:aan metyleenikloridin ja 2-metoksietanolin l:l-seosta. Raakatuotteen saanto on 4,9 g. Puhdistus suoritetaan samoin esimerkissä 1 esitetyllä tavalla. Puhdistetun G^i-gangliosidin 2-metoksietyyliesterin saanto: 4,3 g.
KBr-tableteilla suoritettu IR-spektroskopinen tutkimus osoittaa tyypillisen esterivyön 1750 cm“^:ssä. Tuotteen kromatografinen analyysi, joka suoritetaan esimerkissä 1 esitetyllä tavalla, osoittaa yhtenäisen yhdisteen läsnäolon, jonka Rf on 0,77 ja GMi"<?angliosidin ja sen sisäisen esterin puuttumisen (Rf 0,65 ja vastaavasti 0,75). Hydrolyysi Na2C03:lla esimerkissä 1 esitetyllä tavalla tuottaa ganglio-sidin GmI·
Esimerkki 32; Ganqliosidien seoksen 2-metoksietyylieste-reiden seos 2-metoksietyyliestereiden seos valmistetaan ja eristetään samalla tavalla kuin esimerkin 2 mukainen metyyliestereiden seos käyttämällä kuitenkin 2-metoksietanolia ja natrium-2-metoksietylaattia metyylialkoholin ja natriummetylaatin sijasta ja kuumentamalla vesihauteen päällä ja käyttämällä 5 g sisäisten estereiden seosta ja 574,9 mg (5,86 mmoolia) nat-rium-2-metoksietylaattia. Dowex-hartsin pesu suoritetaan 2-metoksietyylialkoholilla ja jäännös, joka on saatu haihduttamalla suodatettu aine, liuotetaan 50 ml:aan kloroformin ja etanolin l:l-seosta. Raakatuotteen saanto on 5,2 g. Puhdistus suoritetaan samoin KBr-pelleteillä ja se osoittaa tyypillisen esterivyön 1750 cm“^-:ssä. Kun se kromatografoi-daan silikageelilevyillä juuri valmistetulla kloroformin, metanolin ja tetrametyyliammoniumin hydroksidin IM 55:45:10-seoksella ja määritetään Ehrlich-reagenssilla, tuote omaa Rf-arvoina 0,51-0,78 (gangliosidiseos 0,20-0,60). Täydellinen muuntoesteröinti suoritetaan esimerkissä 2 esitetyllä tavalla.
li
Esimerkki 33: Gangliosidin Gjm l-metoksi-2-propyyliesteri 39 8 3 4 2 3
Gmi:n l-metoksi-2-propyyliesteri valmistetaan ja eristetään samalla tavalla kuin esimerkin 1 metyyliesteri käyttämällä kuitenkin l-metoksi-2-propanolia ja natrium-l-metoksi-2-pro-pylaattia metyylialkoholin ja natriummetylaatin sijasta ja kuumentamalla vesihauteen päällä ja käyttämällä samoja moolimääriä sisäistä esteriä ja natrium-l-metoksi-2-propy-laattia kuin esimerkissä 1. Dowex-hartsin pesu suoritetaan 1- metoksi-2-propyylialkoholilla ja jäännös, joka on saatu haihduttamalla suodatettu aine, liuotetaan 50 ml:aan mety-leenikloridin ja l-metoksi-2-propanolin l:l-seosta. Raaka-tuotteen saanto on 4,9 g. Puhdistus suoritetaan esimerkissä 1 esitetyllä tavalla. Puhdistetun Gjm-gangliosidin 2- metoksietyyliesterin saanto: 4,2 g.
KBr-tableteilla suoritettu IR-spektroskopinen tutkimus osoittaa tyypillisen esterivyön 1750 cm“^:ssä. Tuotteen kromatografinen analyysi, joka suoritetaan esimerkissä 1 esitetyllä tavalla, osoittaa yhtenäisen yhdisteen läsnäolon, Rf 0,81, ja GjKji_gangliosidin ja sen sisäisen esterin puuttumisen (Rf 0,65 ja vastaavasti 0,75). Hydrolyysi Na2C>3:lla esimerkissä 1 esitetyllä tavalla tuottaa gangliosidin Gmi.
Esimerkki 34. Gangliosidien seoksen l-metoksi-2-propyylies-tereiden seos l-metoksi-2-propyyliestereiden seos valmistetaan ja eristetään samalla tavalla kuin esimerkin 2 metyyliestereiden seos käyttämällä kuitenkin l-metoksi-2-propanolia ja natrium-1-metoksi-2-propylaattia metyylialkoholin ja natriummetylaatin sijasta ja kuumentamalla vesihauteen päällä ja käyttämällä 5 g sisäisten estereiden seosta ja 657,0 mg (5,86 mmoolia) natrium-l-metoksi-2-propylaattia. Dowex-hartsin pesu suoritetaan l-metoksi-2-propyylialkoholilla ja jäännös, joka on saatu haihduttamalla suodatettu aine, liuotetaan 50 ml:aan kloroformin ja etanolin l:l-seosta. Raakatuotteen saanto on 5,2 g. Puhdistus suoritetaan samoin esimerkissä 2 esitetyllä tavalla. Puhdistetun esteriseoksen saanto: 4,3 g.
40 83423 KBr-tableteilla suoritettu IR-spektroskopia osoittaa tyypillisen esterivyön 1750 cm“l:ssä. Kun se kromatografoidaan silikageelilevyillä juuri valmistetulla kloroformin, metano-lin ja tetrametyyliammoniumin IM 55:45:10-liuoksella ja määritetään Ehrlich-reagenssilla, tuotteen Rf-arvoina on 0,52 -0,80 (gangliosidiseos 0,20 - 0,60). Täydellinen muuntoeste-röinti suoritetaan esimerkissä 2 esitetyllä tavalla.
Esimerkki 35: Gangliosidin G^i sykloheksyyliesteri 5g gangliosidin kaliumsuolaa (3,4 mmoolia) liuotetaan 50 ml saan DMSOsta ja liuokseen lisätään 661,5 mg (3,75 mmoolia) bromisykloheksaania ja 625 mg (3,75 mmoolia) KIstä. Tämän annetaan reagoida 48 tunnin ajan 25°C:ssa. Reaktion lopussa liuos jaetaan n-butanolin ja I^Osn välillä (2:1) DMSOsn ja suolojen eliminoimiseksi. Butanoliliuos haihdutetaan kuiviin ja jäännös otetaan 50 ml saan kloroformin ja me-tanolin lsl-seosta ja tuote saostetaan 250 ml :11a asetonia. Näin saatu raakatuote (5,2 g) puhdistetaan sitten prepara-tiivisella pylväskromatografiällä silikageelillä käyttämällä liuottimena kloroformin, metanolin ja veden 60s35 s8-seosta. Puhtaat fraktiot sekoitetaan, haihdutetaan, liuotetaan uudelleen 15 ml saan klorformin ja isopropanolin lsl-seosta ja tuote saostetaan 75 ml s 11a asetonia. Puhtaan sykloheksyy-liesterin saanto: 4,4 g.
KBr-tableteilla suoritettu IR-spekroskopia osoittaa tyypillisen esterivyön 1750 cm-l:ssä. Kromatografoituna silikageelilevyillä kloroformin, metanolina ja ja CaCl2:n (0,3 %) 60:40:9-seoksella ja kloroformin, metanolin ja ammoniakin 2,5 N 55:45:10-seoksella ja määritettynä Ehrlich-reagenssilla tuote osoittautuu yhtenäiseksi yhdisteeksi ja sen Rf on 0,70 ja vastaavasti 0,58 ja se on vapaa Gf4i“lähtötuotteesta (Rf 0,40 ja vastaavasti 0,45). Käsittely Na2C03:n 0,1 N liuoksella 60°:ssa tunnin ajan saa aikaan esterisidoksen lohkaisun ja tuottaa lähtögangliosidin G^i·
II
Esimerkki 36: Gangliosidin G^i undekyyliesteri 4i 83423 5 g gangliosidin G^i kaliumsuolaa (3,14 mmoolia) liuotetaan 50 ml:aan DMSOrta ja liuokseen lisätään 882,1 mg (3,75 mmoolia) 1-bromiundekaania ja 625 mg (3,75 mmoolia) KI:tä. Tämän annetaan reagoida 48 tunnin ajan 25°C:ssa. Reaktion loputtua liuos jaetaan n-butanolin/H20:n (2:1) välillä DMSO:n ja suolojen eliminoimiseksi. Butanoliliuos haihdutetaan kuiviin ja jäännös otetaan 50 ml:aan kloroformin ja metanolin 1^-seosta ja reaktiotuote saostetaan 250 ml:11a asetonia. Näin saatu raakatuote (5,3 g) puhdistetaan sitten preparatiivisella pyiväskromatografiällä silikageelillä käyttämällä liuottimena kloroformin, metanolin ja veden 60:35 :8-seosta . Puhtaat fraktiot sekoitetaan, haihdutetaan, liuotetaan uudelleen 15 ml:aan klorformin ja isopropanolin l:l-seosta ja tuote saostetaan 75 ml :11a asetonia. Puhtaan undekyyliesterin saanto: 4,9 g.
KBr-tableteilla suoritettu IR-spektroskopia osoittaa tyypillisen esterivyön 1750 cm-1:ssä. Kromatografoituna silika-geelilevyillä kloroformin, metanolin ja CaC^sn (0,3 %) 60:40:9-seoksella ja kloroformin/metanolin ja ammoniakin 2,5N 55 :45 :10-seoksella ja määritettynä Ehrlich-reagenssil-la tuote osoittautuu yhtenäiseksi yhdisteeksi, jonka Rf on 0,68 ja vastaavasti 0,56 ja se on vapaa GMi"lähtötuotteesta (Rf 0,40 ja vastaavasti 0,45). Käsittely Na2CC>3:n 0,1 N liuoksella 60°:ssa tunnin ajan saa aikaan esterisidoksen lohkaisun ja tuottaa lähtögangliosidin Gmi.
Esimerkki 37: Gangliosidin Gmi 1-hydroksiundekan-ll-yyli-esteri 5 9 gangliosidin G^i kaliumsuolaa (3,14 mmoolia) liuotetaan 50 ml:aan DMSO:ta ja liuokseen lisätään 0,42 mg (3,75 mmoolia) 11-bromi-l-undekanolia ja 625 mg (3,75 mmoolia) KI:tä. Tämän annetaan reagoida 48 tunnin ajan 25°C:ssa. Reaktion loputtua liuos jaetaan n-butanolin/H20:n (2:1) välillä DMSO:n ja suolojen eliminoimiseksi. Butanoliliuos haihdute- 42 83423 taan kuiviin ja jäännös otetaan 50 mlraan kloroformin ja me-tanolin l:l-seosta ja reaktiotuote saostetaan 250 ml :11a asetonia. Näin saatu raakatuote (5,3 g) puhdistetaan sitten preparatiivisella pylväskromatografiällä silikageelillä käyttämällä liuottimena kloroformin, metanolin ja veden 60:35:8-seosta. Puhtaat fraktiot sekoitetaan, haihdutetaan, liuotetaan uudelleen 15 ml:aan klorformin ja isopropanolin l:l-seosta ja tuote saostetaan 75 ml :11a asetonia. Puhtaan 11-hydroksiundekan-ll-yliesterin saanto: 4,8 g.
KBr-tableteilla suoritettu IR-spektroskopia osoittaa tyypillisen esterivyön 1750 cm~^-:ssä. Kromatografoituna silika-geelilevyillä kloroformin, metanolin ja CaCl2:n (0,3 %) 60:40:9-seoksella ja kloroformin/metanolin ja ammoniakin 2,5N 55:45:10-seoksella ja määritettynä Ehrlich-reagenssil-la tuote osoittautuu yhtenäiseksi yhdisteeksi, jonka Rf on 0,65 ja vastaavasti 0,52 ja se on vapaa Gjnn-lähtöganglio-sidista (Rf 0,40 ja vastaavasti 0,45). Käsittely Na2C03:n 0,1 N liuoksella 60°:ssa tunnin ajan saa aikaan esterisidok-sen lohkaisun ja tuottaa alkugangliosidin G^i.
Esimerkki 38: Gangliosidin G^i syanobutyr-4-yyliesteri 5 g gangliosidin G^i kaliumsuolaa (3,14 mmoolia) liuotetaan 50 ml:aan DMSO:ta ja liuokseen lisätään 550 mg (3,75 mmoolia) 4-bromibutyronitriiliä ja 625 mg (3,75 mmoolia) KI:tä. Jätetään reagoimaan 48 tunniksi 25eC:ssa. Reaktion loputtua liuos jaetaan n-butanolin ja H20:n (2:1) välillä DMSO:n ja suolojen eliminoimiseksi. Butanoliliuos haihdutetaan kuiviin ja jäännös otetaan 50 ml:aan kloroformin ja metanolin l:l-seosta ja tuote saostetaan 250 ml:lla asetonia. Näin saatu raakatuote (5,1 g) puhdistetaan sitten preparatiivisella pylväskromatografiällä silikageelillä käyttämällä liuottimena kloroformin, metanolin ja veden 60:35:8-seosta.
Puhtaat fraktiot sekoitetaan, haihdutetaan, liuotetaan uudelleen 15 ml:aan kloroformin ja isopropanolin l:l-seosta ja tuote saostetaan 75 ml :11a asetonia. Puhtaan syanobutyr-4-yyliesterin saanto 4,6 g.
Il 43 83423 KBr-tableteilla suoritettu IR-spektroskopia osoittaa tyypillisen esterivyön 1750 cm”l:ssä. Kromatografoituna silika-geelilevyillä kloroformin, metanolin ja CaCl2:n (0,3 %) 60:40:9-seoksella ja kloroformin, metanolin ja ammoniakin 2,5N 55 :45 :10-seoksella ja määritettynä Ehrlich-reagenssilla tuote osoittautuu yhtenäiseksi yhdisteeksi ja sen Rf on 0,42 ja vastaavasti 0,45 ja se on vapaa Gj^j-lähtögangliosidistä (Rf 0,40 ja vastaavasti 0,45). Käsittely Na2C03:n 0,1 N liuoksella 60°:ssa tunnin ajan saa aikaan esterisidoksen lohkaisun ja tuottaa lähtögangliosidin Gmj_ .
Esimerkki 39: Gangliosidin GmI pyrrolidiiniamiini Tämä johdannainen valmistetaan 5 g:sta gangliosidin G^i sisäistä esteriä (3,27 mmoolia) ja 25 ml:sta pyrrolidiiniä samalla tavalla kuin esimerkissä 16 ja noudatetaan samaa puhdistusmenetelmää. Saadaan saantona 5,1 g puhdasta gangliosidin Gmi pyrrolidiiniamiinia.
IR-spektroskooppiset arvot ovat samat kuin esimerkin 16 me-tyyliamidin kohdalla ja kromatografinen tutkimus samoissa olosuhteissa kuin siinä esimerkissä osoittaa tuotteen olevan yhtenäinen ja vapaa Gni:stä ja sen Rf on 0,29 ja vastaavasti 0,46 (GMi:n Rf 0,35 ja vastaavasti 0,40).
Esimerkki 40; Gangliosidiseoksen pyrrolidiiniamidien seos Tämä johdannaisseos valmistetaan 5 g:sta esimerkissä 17 käytettyjen gangliosidien sisäisten esterien seosta ja 25 ml:sta pyrrolidiiniä samalla tavalla kuin esimerkissä 17, samoin käytetään samaa puhdistusmenetelmää. Saadaan saantona 4,9 g gangliosidiseoksen pyrroliidiniamidien seosta.
Rf-arvot, määritettynä kromatografoimalla silikageeli-levyillä kloroformin, metanolin ja ammoniakin 4N 55:45:10-seoksella ja kloroformin, metanolin ja CaCl2:n (0,3 %) 60:35:8-seoksella ja määritettynä resorsinolireagenssilla, osoittivat arvoja 0,08 - 0,40 ja vastaavasti 0,35 - 0,48 (gangliosidien alkuperäisseoksen Rf 0,15 - 0,70 ja vastaavasti 0,05 - 0,40).
Esimerkki 41: Gangliosidin Gjji piperidiiniamidi 44 83423 Tämä johdannainen valmistetaan 5 g:sta gangliosidin G^l sisäistä esteriä (3,27 mmoolia) ja 25 ml:sta piperidiiniä samalla tavalla kuin esimerkissä 16 ja samaa puhdistusmenetelmää noudatetaan myös. Saadaan saantona 5,2 g puhdasta gangliosidin G^i piperidiiniamidia.
IR-spektroskooppiset arvot ovat samat kuin esimerkin 16 me-tyyliamidin kohdalla ja kromatografinen tutkimus samoissa olosuhteissa kuin siinä esimerkissä osoittaa tuotteen olevan yhtenäinen ja vapaa G^itstä ja sen Rf on 0,30 ja vastaavasti 0,50 (GMl:n 0,35 ja vastaavasti 0,40).
Esimerkki 42: Gangliosidiseoksen piperidiiniamidien seos Tämä johdannaisseos valmistetaan 5 g:sta esimerkissä 17 käytettyjen gangliosidien sisäisten esterien seosta ja 25 ml:sta piperidiiniä samalla tavalla kuin esimerkissä 17, samoin käytetään samaa puhdistusmenetelmää. Saadaan saantona 5,1 g gangliosidiseoksen piperidiiniamidien seosta. Rf-arvot, määritettynä kromatografoimalla silikageelilevyillä kloroformin, metanolin ja ammoniakin 4N 55:45:10-seoksella ja kloroformin, metanolin ja CaCl2:n (0,3 %) 60:35 :8-seok-sella ja määritettynä resorsinolireagenssilla, osoittivat arvoja 0,10 - 0,42 ja vastaavasti 0,37 - 0,50 (gangliosidien alkuperäisseoksen Rf 0,15 - 0,70 ja vastaavasti 0,05 -0,40).
Esimerkki 43. Gangliosidin G^l tetrahydrofurfuryyliamidi Tämä johdannainen valmistetaan 5 grsta gangliosidin Gmi sisäistä esteriä (3,27 mmoolia) ja 25 ml:sta tetrahydrofur-furyyliamiinia samalla tavalla kuin esimerkissä 16 ja samaa puhdistusmenetelmää noudatetaan myös. Saadaan saantona 5,3 g puhdasta gangliosidin Gmi tetrahydrofurfuryyliamidia.
IR-spektroskooppiset arvot ovat samat kuin esimerkin 16 me-tyyliamidin kohdalla ja kromatografinen tutkimus samoissa
II
45 83423 olosuhteissa kuin siinä esimerkissä osoittaa tuotteen olevan yhtenäinen ja vapaa G^tstä ja sen Rf on 0,33 ja vastaavasti 0,52 (GMl^n Rf 0,35 ja vastaavasti 0,40).
Esimerkki 44: Gangliosidiseoksen tetrahydrofurfuryyliamidien seos Tämä johdannaisseos valmistetaan 5 g:sta esimerkissä 17 käytettyjen gangliosidien sisäisten esterien seosta ja 25 mlrsta tetrahydrofurfuryyliamiinia samalla tavalla kuin esimerkissä 17, samoin käytetään samaa puhdistusmenetelmää. Saadaan saantona 5,2 g gangliosidiseoksen tetrahydrofurfu-ryyliamidien seosta.
Rf-arvot, määritettynä kromatografoimalla silikageelilevyillä kloroformin, metanolin ja ammoniakin 4N 55:45:10-seoksella ja kloroformin, metanolin ja CaCl2:n (0,3 %) 60:35:8-seok-sella ja määritettynä resorsinolireagenssilla, osoittivat arvoja 0,12 - 0,45 ja vastaavasti 0,40 - 0,57 (gangliosidien alkuperäisseoksen Rf 0,15 - 0,70 ja vastaavasti 0,05 -0,40).
Esimerkki 45: Gangliosidin G^i 2-metyylipiperidiiniamidi Tämä johdannainen valmistetaan 5 g:sta gangliosidin G^i sisäistä esteriä (3,27 mmoolia) ja 25 mlrsta 2-metyylipipe-ridiiniamiinia saunalla tavalla kuin esimerkissä 16 ja samaa puhdistusmenetelmää noudatetaan myös. Saadaan saantona 5,2 g 1 puhdasta gangliosidin G^i 2-metyylipiperidiiniamidia.
IR-spektroskooppiset arvot ovat saunat kuin esimerkin 16 me-tyyliamidin kohdalla ja kromatografinen tutkimus samoissa olosuhteissa kuin siinä esimerkissä osoittaa tuotteen olevan yhtenäinen ja vapaa G^tstä ja sen Rf on 0,33 ja vastaavasti 0,54 (G(4i:n Rf 0,35 ja vastaavasti 0,40).
« 83423
Esimerkki 46: Ganqliosidiseoksen 2-metyylipiperidiiniamidien seos Tämä johdannaisseos valmistetaan 5 g:sta esimerkissä 17 käytettyjen gangliosidien sisäisten esterien seosta ja 25 ml:sta 2-metyylipiperidiiniä samalla tavalla kuin esimerkissä 17, samoin käytetään samaa puhdistusmenetelmää. Saadaan saantona 5,4 g gangliosidiseoksen 2-metyylipiperidiiniamidien seosta.
Rf-arvot, määritettynä kromatografoinaalla silikageelilevyil-lä kloroformin, metanolin ja ammoniakin 4N 55:45:10-seoksel-la ja kloroformin, metanolin ja CaC^sn (0,3 %) 60:35:8-seoksella ja määritettynä resorsinolireagenssilla, osoittivat arvoja 0,14 - 0,46 ja vastaavasti 0,39 - 0,59 (gangliosidien alkuperäisseoksen Rf 0,15 - 0,70 ja vastaavasti 0,05 -0,40).
Esimerkki 47: Gangliosidin G^i 1-metyylipiperatsiiniamidi Tämä johdannainen valmistetaan 5 g:sta gangliosidin G^i sisäistä esteriä (3,27 mmoolia) ja 25 ml:sta 1-metyyli-pi-peratsiinia samalla tavalla kuin esimerkissä 16 ja noudatetaan samaa puhdistusmenetelmää. Saadaan saantona 5,1 g puhdasta gangliosidin G^i 1-metyylipiperatsiiniamidia. IR-spektroskooppiset arvot ovat samat kuin esimerkin 16 metyy-liamidin kohdalla ja kromatografinen tutkimus samoissa olosuhteissa kuin siinä esimerkissä osoittaa tuotteen olevan yhtenäinen ja vapaa G^iistä ja sen Rf on 0,04 ja vastaavasti 0,08 (GMl:n 0,35 ja vastaavasti 0,40).
Esimerkki 48; Ganqliosidiseoksen 1-metyylipiperatsiini-amidien seos Tämä johdannaisseos valmistetaan 5 g:sta esimerkissä 17 käytettyjen gangliosidien sisäisten esterien seosta ja 25 ml:sta 1-metyylipiperatsiinia samalla tavalla kuin esimerkissä 17, samoin käytetään samaa puhdistusmenetelmää. Saadaan saantona 5,5 g gangliosidiseoksen 1-metyylipiperatsiini-amidien seosta.
47 83423
Rf-arvot, määritettynä kromatografoimalla silikageeli-levyillä kloroformin, metanolin ja CaCl2:n (0,3 %) 60:35:8-seoksella ja määritettynä resorsinolireagenssilla, osoittivat arvoja 0,01 - 0,06 ja vastaavasti 0,01 - 0,12 (ganglio-sidien alkuperäisseoksen Rf 0,15 - 0,70 ja vastaavasti 0,05-0,40).
Esimerkki 49: Gangliosidin G^i 2-fenyylietyyliamidi Tämä valmistetaan 5 g:sta gangliosidin sisäistä esteriä (3,27 mmoolia) ja 25 ml:sta 2-fenyylietyyliamiinia samalla tavalla kuin esimerkissä 16 ja samaa puhdistusmenetelmää noudatetaan myös. Saadaan saantona 5,3 g puhdasta gangliosidin Gjuji 2-fenyylietyyliamidia.
IR-spektroskooppiset arvot ovat samat kuin esimerkin 16 me-tyyliamidin kohdalla ja kromatografinen tutkimus samoissa olosuhteissa kuin siinä esimerkissä osoittaa tuotteen olevan yhtenäinen ja vapaa Gm:stä ja sen Rf on 0,33 ja vastaavasti 0,73 (GmI:n 0,35 ja vastaavasti 0,40).
Esimerkki 50: Ganqliosidiseoksen 2-fenyylietyyliamidien seos Tämä johdannaisseos valmistetaan 5 g:sta esimerkissä 17 käytettyjen gangliosidien sisäisten esterien seosta ja 25 ml:sta 2-fenyylietyyliamiinia samalla tavalla kuin esimerkissä 17, samoin käytetään samaa puhdistusmenetelmää. Saadaan saantona 5,5 g gangliosidiseoksen 2-fenyylietyyliamidien seosta.
Rf-arvot, määritettynä kromatografoimalla silikageelilevyil-lä kloroformin, metanolin ja ammoniakin 4N 55:45:10-seoksel-la ja kloroformin, metanolin ja CaC^sn (0,3 %) 60:35:8-seoksella ja määritettynä resorsinolireagenssilla, osoittivat arvoja 0,12 - 0,44 ja vastaavasti 0,60 - 0,78 (gangliosidien alkuperäisseoksen Rf 0,15 - 0,70 ja vastaavasti 0,05-0,40).
Claims (3)
1. Menetelmä yleiskaavan (ia) ROOCiiinimi/'siali-v itmimiiiOH /'imimiiOH happo E e luumun OH keramidi ..... ‘«H 5 Ö OH OH Ö ( J) OH OLIGOSAKKARIDI OH mukaisten gangliosidien esterijohdannaisten valmistamiseksi, jossa kaavassa R on korkeintaan 12 hiiliatomia sisältävän alifaattisen alkoholin tähde, korkeintaan 12 hiiliatomia sisältävän aralifaattisen alkoholin tähde, jossa on vain yksi bentseenirengas, korkeintaan 12 hiiliatomia sisältävän heterosyklisen alkoholin tähde, jossa on typpi-, rikki- tai happiheteroatomin sisältävä heterosyklinen rengas, korkeintaan 14 hiiliatomia sisältävän alisyklisen alkoholin tähde, tai korkeintaan 14 hiiliatomia sisältävän alifaattis-alisykli-sen alkoholin tähde, joka sisältää vain yhden syklo-alifaattisen renkaan, jolloin edellä mainitut tähteet voivat olla valinnanvaraisesti substituoidut, tunnettu siitä, että käsitellään gangliosidin sisäistä esteriä alkoholilla vastaavan esterin muodostamiseksi gangliosidin sisäisen esterin tai sen seoksen siali-happotähteiden karboksyyliryhmissä, jolloin käsittely suoritetaan alkoholia vastaavan metallialkoholaatin läsnäollessa.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että alkoholina käytetään alifaattista alkoholia, jossa on korkeintaan 12 hiiliatomia; aralifaattista alkoholia, jossa on ainoastaan yksi bentseenirengas, joka on mah- II « 83423 dollisesti substituoitu 1-3 Ci_4-alkyyliryhmällä ja jossa on korkeintaan 4 hiiliatomia alifaattisessa ketjussa; heterosyklistä alkoholia, jossa on korkeintaan 12 hiiliatomia ja ainoastaan yksi heterosyklinen rengas, joka sisältää heteroatomin, joka on N, S, tai O; tai Ci_i4-alisyklista tai alifaattis-alisyklistä alkoholia.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnet-t u siitä, että alkoholina käytetään metyyli-, etyyli-, propyyli-, isopropyyli-, n-butyyli-, isobutyyli-, tert-butyyli-, undekyyli-, hydroksidekyyli-, heptyyli-, 2-metyyli-l-pentyyli-, allyyli-, etoksikarbonyylimetyyli-, metoksietyyli-, l-metoksi-2-propyyli-, bentsyyli-, fen-etyyli-, sykloheksyyli-, mentyyli-, tetrahydrofurfuryyli-, tetrahydropyranyyli- tai syanobutyryylialkoholia. so 83423
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
IT48492/84A IT1199116B (it) | 1984-07-03 | 1984-07-03 | Derivati di gangliosidi |
IT4849284 | 1984-07-03 | ||
FI852515 | 1985-06-26 | ||
FI852515A FI84074C (fi) | 1984-07-03 | 1985-06-26 | Foerfarande foer framstaellning av nya terapeutiskt anvaendbara gangliosidderivat. |
Publications (4)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
FI892587A0 FI892587A0 (fi) | 1989-05-26 |
FI892587A FI892587A (fi) | 1989-05-26 |
FI83423B true FI83423B (fi) | 1991-03-28 |
FI83423C FI83423C (fi) | 1991-07-10 |
Family
ID=26157779
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
FI892587A FI83423C (fi) | 1984-07-03 | 1989-05-26 | Foerfarande foer framstaellning av gangliosidderivat. |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
FI (1) | FI83423C (fi) |
-
1989
- 1989-05-26 FI FI892587A patent/FI83423C/fi not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
FI83423C (fi) | 1991-07-10 |
FI892587A0 (fi) | 1989-05-26 |
FI892587A (fi) | 1989-05-26 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
FI84074B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av nya terapeutiskt anvaendbara gangliosidderivat. | |
DE69228692T2 (de) | Methode zur enzymatischen synthese von kohlenhydraten | |
US4868292A (en) | Preparation of monosialoganglioside | |
DE69523889T2 (de) | Gangliosid gm3 analog mit einem an der position 9 fluorierten sialinsäurerest und zwischenstufe dafür | |
DE3789043T2 (de) | N-Glykoneuraminsäure enthaltendes Glykolipid und Verfahren zu dessen Herstellung. | |
EP0373039B1 (en) | New lysoganglioside derivatives | |
FI83423B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av gangliosidderivat. | |
US4785084A (en) | Method of preparing peracetyl oxazolines | |
US5220008A (en) | Oligosaccharide inhibitors for influenza virus | |
EP0410883B1 (en) | Di-lysogangliosides derivatives | |
US6245902B1 (en) | C-glycoside analogs and methods for their preparation and use | |
Compostella et al. | The mammalian sulfated glycolipid sulfatide: Synthesis and biological implications | |
US6407072B1 (en) | Lysoganglioside derivatives | |
EP0540790B1 (en) | Method of obtaining monosialogangliosides | |
Tsuchihashi et al. | Synthesis of a glioma-related ganglioside, O-Ac GM3 having 3-O-Ac ceramide and its substrate property toward hydrolases | |
AU1060200A (en) | Carbohydrates and methods for their synthesis | |
Le Blayb et al. | Synthesis and In Vitro Activities of a Spacer-containing Glycophospholipid Ligand of a Lipopolysaccharide Receptor Involved in Endotoxin Tolerance | |
CA2433856A1 (en) | Alkylated inositolglycans and their use | |
JPH0136833B2 (fi) |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM | Patent lapsed | ||
MM | Patent lapsed |
Owner name: FIDIA S.P.A. |