NO164545B

NO164545B - Fremgangsmaate for fremstilling av en gangliosid-ester eller en acylert gangliosid-ester.

Info

Publication number: NO164545B
Application number: NO852565A
Authority: NO
Inventors: Francesco Della Valle; Aurelio Romeo
Original assignee: Fidia Spa
Priority date: 1984-07-03
Filing date: 1985-06-26
Publication date: 1990-07-09
Also published as: IE851608L; ES544574A0; CN1055741A; BE902750A; PL151289B1; IN164786B; ES8801925A1; CH670645A5; YU46603B; FI852515A0; FI84074C; FR2567131B1; PL254207A1; GR851573B; AU4420885A; YU107285A; ES552826A0; ES8706711A1; DK78592D0; DK78592A

Description

Den foreliggende oppfinnelse angår fremstiling av

nye funksjonelle gangliosid-derivater og mer nøyaktig nye estere.

Gangliosider er naturlige produkter som finnes i forskjellige dyrevev eller -organer, fremfor alt i vevet i det sentrale og perifere nervesystem, men også i binyremargen, i erytro-cyttene, i mildten og ellers, hvorfra de kan ekstraheres i renset form. Det har vært mulig å fastslå grunnstrukturen hos de fleste således oppnådde gangliosider. De er glykosfingolipider, dvs. forbindelser som fremkommer ved forening av et oligosakkarid med et sfingosin og et visst antall sialinsyrer sammenbundet med glykosid- eller ketosid-bindinger. De gangliosider som hittil er beskrevet i litteraturen og som er oppnådd i renset form, representerer ikke enhetlige kjemiske forbindelser, eventuelt bortsett fra når det gjelder sakkarid-delen av dem (oligosakkarid), siden ceramid- og sialinsyre-bestanddelene er meget variable innenfor visse grenser. Selv når man omtaler "rene" gangliosider, må derfor dette uttrykk i det store og hele tolkes som en gangliosid-type hvor i det minste en del, for eksempel sakkarid-delen, er enhetlig og karakteristisk ut fra et kjemisk synspunkt. Når dette er nevnt, er det, før bakgrunnen for den foreliggende oppfinnelse beskrives mer detaljert, nyttig å merke seg den følgende generelle formel som innbefatter alle struktur-ene i de gangliosider som hittil er oppnådd i renset form, og som fremhever de funksjoner som er funksjonelt modifisert ifølge oppfinnelsen (formel I).

I denne formel er en oligosakkarid-rest som er dannet av maksimalt 5-monosakkarider, bundet med en glykosid-binding til en ceramid-rest og til én eller flere sialinsyre-rester, begge ved hjelp av så mange direkte glykosid-bindinger, og ved hjelp av én eller flere slike bindinger, som de gjenværende sialinsyre-rester er bundet sammen med av ketosid-bindinger. Formelen viser hydroksylgruppene i sakkarid-delen, i sialinsyrene og i ceramidet, såvel som de ovennevnte glykosid-bindinger med sialinsyrer og ceramid og karboksylgruppene i sialinsyrene. De sialinsyrer som danner en del av gangliosidene ifølge formel I, har den generelle struktur II

hvor én eller flere av de primære og sekundære hydroksylgrupper også kan være acylert og hvor acylgruppene stammer fra eddiksyre eller glykolsyre. Antallet sialinsyrer som er til stede i gangliosider, varierer vanligvis fra 1 til 5.

Sialinsyre-restene er bundet til oligosakkaridet med en ketosid-binding dannet av hydroksylgruppen i stilling 2 med en oligosakkarid-hydroksylgruppe. Når flere sialinsyrer er bundet sammen, er molekylene sammenbundet ved hjelp av ketosid-bindinger dannet mellom hydroksylgruppene i stilling 2 og 8 hos to sialinsyre-molekyler. Sialinsyrene i gangliosider, innbefattende rensede gangliosider som beskrevet ovenfor, er blandinger av forskjellige kjemisk enhetlige syrer såsom N-acetylneuraminsyre og N-glykolylneuraminsyre, hvor den første er fremherskende, og eventuelt av én eller flere av deres O-acylderivater, såsom 8-0-acylderivater.

Gangliosider finnes i naturen som metallsalter, såsom natriumsalter, og det er derfor sialinsyrenes karboksylsyre-funksjon(er) som er omdannet til salt. De frie former av gangliosider kan lett oppnåes ved behandling av saltene, såsom natriumsaltene, med en ionebytter av sur type, idet man for eksempel anvender en harpiks såsom "Dowex" AG 50x8, H+<->formen.

Ceramid-resten i gangliosidene ifølge formel I representerer generelt flere N-acyl-sfingosiner med én av formlene

hvor n = 10-16 og acylet stammer fra en mettet eller umettet fettsyre med 16-22 karbonatomer eller fra en korresponderende hydroksysyre.

Oligosakkaridet er dannet av maksimalt 5 monosakkarider eller deres derivater med en acylamin-gruppe, særlig av heksoser og deres derivater av ovennevnte type. Minst ett glukose- eller galaktose-molekyl er imidlertid alltid til stede i oligosakkaridet. Den mest hyppige rest som er til stede som acylamin-derivat av ovennevnte sukkerarter, er N-acetylgalaktosamin eller N-acetylglukosamin.

For bedre å illustrere strukturen av de gangliosider som er innbefattet i formel I og spesielt karakteren av bindingene mellom sakkarid-delene, sialinsyrene og ceramidet, er formelen for et "rent" GM1-gangliosid som bare inneholder én sialinsyre (representert ved N-acetylaminsyre eller N-glykolylneuraminsyre), gjengitt nedenfor.

Det er velkjent at gangliosider er funksjonelt viktig i nervesystemet, og det er nylig blitt vist at gangliosider er nyttige ved behandling av sykdommer i det perifere nervesystem. Den terapeutiske virkning av gangliosider synes fremfor alt å bestå i stimulering av nervecellens utskytning og i aktivering av de membranenzymer som deltar i ledningen av nervestimuli, såsom enzymet (Na<+->, K<+->) ATPase. Neuronal utskytning stimulert av gangliosider hjelper på funksjonell bedring av det ødelagte nervevev.

Det har vært utført ytterligere undersøkelser for å finne forbindelser som kunne vise seg mer effektiv enn gangliosider ved behandling av sykdommer i nervesystemet. Disse undersøkelser har for eksempel ført til den oppdagelse at indre estere i ganglio-. sider hvor én eller flere hydroksylgrupper i sakkarid-delen er forestret med én eller flere karboksylsyregrupper i sialinsyrene (intramolekylær reaksjon) med dannelse av like mange lakton-ringer, er mer aktiv enn gangliosidene selv når det gjelder å hjelpe på neuronal utskytning og ved aktivering av membranenzymer som deltar i ledning av nervestimuli, såsom enzymet (Na<+->, K<+->) ATPase (se US-patent 4 476 119).

Vi har nå oppdaget en annen gruppe gangliosid-derivater som representerer fordeler fremfor gangliosidene selv, ettersom de har forlenget aktivitet når det gjelder tiden ("retard"-effekt). Disse forbindelser er derivater hvor karboksylgruppen i sialinsyrene er funksjonelt modifisert ved forestring og derivater av slike estere hvor hydroksylgruppene i sakkarid-delen, i sialinsyrene og i ceramidet også er forestret med organiske syrer, eller heller acylat-derivater (som i det følgende ganske enkelt vil bli kalt "acylatér", og spesifikt "acylater, propion-ylater osv."). De derivater som fremstilles ifølge oppfinnelsen, innbefatter også gangliosid-derivater hvor bare hydroksylgruppene er forestret med organiske syrer, dvs. at de inneholder frie karboksylsyregrupper.

To metylestere av karboksylgruppene i en sialinsyre i gangliosider er beskrevet i artikkelen "Notes on improved procedures for the chemical modification and degradation of glycosphyngolipids" i Journal of Lipid Research 21, 642-645

(1980) av MacDonald et al. Disse forbindelser er metylesterne av gangliosidene GM1 og GM3 (de forkortelser som er anvendt i det foreliggende for identifikasjon av gangliosider, er de som er foreslått av Svennerholm i J. Neurochem. 10, 613 (1963)). Imidlertid beskriver ikke MacDonald et al. noen biologisk aktivitet for forbindelsene. Metylesteren av gangliosidet GM3 anvendes også ved fremstilling av ett av dets peracylat-derivater for anvendelse i flere nedbrytnings- eller koplingsreaksjoner

(Methods of Enzymology, 50, 137-140 (1978)). Ovennevnte artikkel i Journal of Lipid Research av MacDonald et al. beskriver også en acetylering av metylestrene av gangliosidene GM1 og GM3, men uten isolering av de acylerte forbindelser.

Acetylering med eddiksyre-anhydrid/pyridin av lipider ekstrahert fra mildten, leveren og nyrene hos Buffalo-rotter, fra Morris-hepatomer og fra fibroblast-celler er beskrevet av Terunobo Saito og Sen-Itiroh Hakomori i Journal of Lipid Research, 12, 257-259, (1971). Forfatterne isolerte ved hjelp av kromatografi den acetylerte blanding av de gangliosider som fantes i slike lipider, fra det acylerte produkt, sammen med andre glykolipider, uten at noe spesifikt gangliosid imidlertid ble identifisert. Blant amidene er det usubstituerte amid av gangliosidet GM3 beskrevet (Ad. Exp. Med. Biol. 19, 95 (1972)), men selv i dette tilfelle ble det ikke nevnt noen biologiske egenskaper.

Ett av de første formål med den foreliggende oppfinnelse består derfor i fremstilling av de nye funksjonelle gangliosid-derivater som er omtalt ovenfor, dvs. esterne på karboksylgruppene i gangliosider definert i formel I, eller i blandinger av dem, de peracylerte derivater av disse estere på hydroksylgruppene i oligosakkaridet, sialinsyrene og ceramidet i gangliosidene ifølge formel I eller i blandinger av dem med frie karboksylsyre-funksjoner, og salter derav.

Den foreliggende oppfinnelse omfatter fremstilling av nye, nyttige gangliosid-derivater. Disse nye derivater fåes spesielt ved at man funksjonelt modifiserer karboksyl- og/eller hydroksylgruppene som er til stede i grunn-gangliosid-strukturen. Gangliosider som inntil nå er oppnådd i renset form, kan re-presenteres ved følgende formel (I), som også fremhever de funksjonelle grupper som er modifisert ifølge den foreliggende oppfinnelse :

Disse gangliosider, som danner utgangsmaterialene for de funksjonelle derivater fremstilt ifølge oppfinnelsen, er alle slike som kan ekstraheres fra forskjellige dyreorganer og -vev, særlig fra vevet i det sentrale og perifere nervesystem, for eksempel fra hjernen, cerebrospinalvæsken, muskler, plasma og blodserum, nyrer, binyrer, lever, mildt, tarmer og erytrocytter eller leukocytter. Utgangs-gangliosidene kan også være de rensede gangliosider som er beskrevet i litteraturen, såsom slike som ekstraheres fra vev og organer hos virveldyr, særlig pattedyr såsom mennesker, kveg, kalver, rotter, mus eller fra mikro-organismer .

Ifølge den foreliggende oppfinnelse modifiseres disse gangliosid-forbindelser ved at man funksjonelt modifiserer hydroksyl- og/eller karboksylgruppene i utgangs-gangliosid-molekylet under dannelse av nye gangliosid-derivater. De nye derivater ifølge oppfinnelsen oppnåes spesielt ved at man (a) underkaster karboksylgruppene forestring og eventuelt (b) acylerer de hydroksylgrupper som er til stede i gangliosidet.

De estere som er de nye derivater fremstilt ifølge oppfinnelsen, er spesielt monoestere når det dreier seg om monosialogangliosider og polyester når det dreier seg om polysialogangliosider, med like mange estergrupper som det er karboksylgrupper til stede i molekylet og derfor like mange sialinsyregrupper som det som er til stede.

Gangliosid-derivater fremstilt ifølge oppfinnelsen kan fremstilles ved at man modifiserer "rensede" individuelt karak-teriserte gangliosider eller ved at man modifiserer en blanding av gangliosider såsom en blanding av monosialogangliosider og polysialogangliosider. I de blandinger som anvendes for forestring eller omdannelse til amider for fremstilling av aktive forbindelser, såsom for eksempel den blanding som er beskrevet i eksempel 3 nedenfor og som inneholder både monosialogangliosider og polysialogangliosider, som modifiseres alle karboksylgruppene, og det oppnåes derivater som er fullstendig forestret. Betegnelsen "estere" anvendt i det foreliggende må tolkes i denne forbindelse som fullstendig forestret.

Dette gjelder særlig også derivatene ifølge de illustrerende eksempler som er gitt nedenfor, som ganske enkelt er omtalt som "estere". Disse betegnelser betyr blandinger som inneholder polysialogangliosider som er totalt forestret når det gjelder alle karboksylgruppene.

Den foreliggende oppfinnelse omfatter således fremstilling av derivater av gangliosider enten de stammer fra et enkelt "renset" gangliosid eller fra en blanding av gangliosider. Oppfinnelsen omfatter videre fremstilling av derivater oppnådd ut fra forskjellige gangliosidstrukturer, spesielt siden ganglio-sidets struktur kan variere med hensyn til antallet og typen sialinsyre-rest, ceramid-rest eller oligosakkarid-rest.

Når det gjelder strukturen kan basis-utgangsgangliosidene være monosialo-, disialo-, trisialo-, tetrasialo-, eller penta-sialogangliosider, idet de foretrukkede sialinsyrer er N-acetyl-neuraminsyre og N-glykolylneuraminsyre. Sialinsyrene kan også være acylert ved én av hydroksylgruppene i sin sidekjede, såsom hydroksylgruppen i stilling 8, hvis ikke denne stilling allerede er opptatt av en ketosid-binding som binder den til en annen til-støtende sialinsyre-rest.

Ceramid-delen kan variere på den måte som er omtalt ovenfor og dessuten når det gjelder lengden av karbonatomkjedene i de sfingosinene som omfatter en del av ceramidet som kan variere fra 16 til 22 karbonatomer. Dessuten kan også lengden av eventuelle acylrester også variere, spesielt innenfor de samme grenser på 16-22 karbonatomer. Ved siden av dette kan ceramid-resten variere på den måte at den doble sfingosin-binding kan være fraværende eller til stede, og vanligvis består denne rest av umettet N-acylert sfingosin og en lav prosentandel av den korresponderende mettede forbindelse (som imidlertid kan være opp til ca. 10 %). Acylgruppen kan også stamme fra alifatiske hydroksysyrer hvor ovennevnte antall karbonatomer varierer fra 16 til 22. En spesielt viktig gruppe gangliosider inneholder i ceramid-resten acylerte sfingosiner med 18 eller 20 karbonatomer i sine kjeder og korresponderende mettede forbindelser, mens deres mettede eller umettede acylgruppe, usubstituert med hydroksylgrupper, har det samme antall på 18 eller 20 karbonatomer .

Som omtalt ovenfor angår den foreliggende oppfinnelse på den ene side fremstilling av funksjonelle derivater av "rene" gangliosider ifølge formel I, dvs. med en enhetlig sammensetning som beskrevet ovenfor, og på den annen side fremstilling av de funksjonelle derivater av gangliosid-blandinger for eksempel i ekstrahert form slik som de som fåes fra forskjellige dyrevev. I det første tilfelle er basis-gangliosidene fortrinnsvis slike hvor oligosakkaridet er dannet av maksimalt 4 heksose-rester eller N-acetylheksosamin, siden det er til stede minst én heksose-rest, og hvor denne sakkarid-del er kjemisk enhetlig. Heksosene er fortrinnsvis valgt fra gruppen bestående av glukose og galaktose og N-acetylheksosaminene fra gruppen omfattende N-acetylglukosamin og N-acetylgalaktosamin (gangliosid-gruppe A). Gangliosidene i denne gruppe er for eksempel slike som er ekstrahert fra hjernen hos virveldyr, såsom slike som er beskrevet i artikkelen "Gangliosides of the Nervous System" i Glycolipid Methodology, Lloyd A. Witting Fd., American Oil Chemists' Society, Champaign, 111. 187-214 (1976) (se særlig plansje 1), for eksempel gangliosidene GM., <G>„<,>,<G>M<_>, G„.-GlcNAc,

MJ mt. Ml

<G>D2' <G>D1a~GalNAc' GTlc' GQ'<G>T1 og særli9 slike hvor oligosakkaridet inneholder minst én glukose-eller galaktose-rest og én N-acetylglukosamin- eller N-acetylgalaktosamin-rest, særlig følgende (gangliosid-gruppe B) hvor Glk står for glukose, GaINAC står for N-acetylgalaktosamin, Gal står for galaktose og NANA står for N-acetylneuraminsyre.

Hvis gangliosidblandinger anvendes som utgangsmateriale for funksjonelle omdannelser som foretaes ifølge den foreliggende oppfinnelse, kan blandingene bestå av slike som direkte fåes ved ekstraksjon av gangliosider fra forskjellige dyrevev som "full-stendige" gangliosid-ekstrakter eller som forskjellige fraksjoner av disse. Slike ekstrakter er beskrevet i litteraturen, for eksempel i de artikler som er nevnt ovenfor eller også i "Extrac-tion and analysis of materials containing lipidbound sialic acids" i Glycolipid Methodology, Lloyd A. Witting Fd., American Oil Chemists' Society, Champaign, 111. 159-186 (1976) og "Gangliosides of the Nervéus System" fra»den samme bok, sider 187-214. Noen av de viktigste blandinger som anvendes ifølge den foreliggende oppfinnelse, er gangliosid-ekstrakter som fåes fra vev fra nervesystemet, spesielt fra hjernen, og som inneholder gangliosiden<e><G>M1,<G>D^a<»><G>oib09 GTlb' som a^-^ere^e er nevnt ovenfor. Blandinger av denne type er for eksempel slike som er beskrevet i eksempel 2.

I det følgende er de spesifikke alkohol- og acyl-funksjoner som er særlig egnet for oppnåelse av spesielt interes-sante nye forbindelser fremstilt ifølge oppfinnelsen, nærmere beskrevet, og disse funksjonelle grupper må taes i betraktning både når det gjelder "rene" enhetlige gangliosider og blandinger, særlig slike som er oppregnet her.

I hver av de gangliosid-grupper som er nevnt ovenfor, er karboksylgruppene i sialinsyre-restene i forbindelsene fremstilt

ifølge oppfinnelsen, til stede i forestret form.

Estergruppene i de nye gangliosid-derivater stammer spesielt fra alkoholer i den alifatiske rekke og særlig fra slike som har maksimalt 12 og særlig 6 karbonatomer, eller fra alkoholer i den aralifatiske rekke med fortrinnsvis bare én benzenring, eventuelt substituert med 1-3 lavere-alkyl-grupper (C^_4), for eksempel metylgrupper, og med maksimalt 4 karbonatomer i den alifatiske kjede, eller alkoholer i den alicykliske eller alifatisk alicykliske rekke med bare én cykloalifatisk ring og maksimalt 14 karbonatomer eller i den heterocykliske rekke med maksimalt 12 og særlig 6 karbonatomer og bare én heterocyklisk ring som inneholder et atom valgt fra gruppen som utgjøres av N, 0 og S.

De alkoholer som er nevnt ovenfor, kan være substi-

tuert eller usubstituert, særlig med funksjoner valgt fra gruppen som utgjøres av hydroksyl, amin, alkoksylgrupper med maksimalt 4 karbonatomer i alkyl-, Tcarboksyl- eller karbyloksy (såsom karbonylmetoksy- og karbonyletoksy-)grupper med maksimalt 4 atomer i alkyl-, alkylamin- eller dialkylamin-resten med maksimalt 4 karbonatomer i alkylgruppene., og kan være mettet eller umettet, særlig med bare én dobbeltbinding. De alkoholer som forestrer karboksylsyrefunksjonene hos gangliosidene ved fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse, kan være monovalent eller polyvalent, særlig bivalent. Blant alkoholene i den alifatiske rekke foretrekkes lavere alkoholer med maksimalt 6 karbonatomer, såsom metylalkohol, etylalkohol, propyl- og isopropylalkohol, normal butylalkohol, isobutylalkohol, tertiær butylalkohol, og blant de bivalente alkoholer foretrekkes etylenglykol og propylenglykol. Blant alkoholene i den aralifatiske rekke foretrekkes alkoholer med bare én benzen-rest, såsom benzylalkohol og fenetylalkohol; blant alkoholene i den alicykliske rekke foretrekkes alkoholer med bare én cykloalifatisk ring, såsom cykloheksylalkohol (cykloheksanol), eller terpen-alkoholer, såsom metanol, carvomentol eller én av terpi-

neolene eller terpinenolene eller piperitolene. Blant alkoholene i den heterocykliske rekke foretrekkes tetrahydrofuranol eller tetrahydropyranol. Til forestring av karboksylsyregruppene i gangliosidene kan det også anvendes substituerte alifatiske alkoholer, for eksempel med amin-funksjoner, som for eksempel aminoalkoholer, såsom slike som har maksimalt 4 karbonatomer, og særlig aminoalkoholer med en dialkyl-(C1_4)-amin-grupper såsom dietylaminoetanol.

Oppfinnelsen innbefatter også fremstilling av peracylerte derivater på hydroksylgruppene i sakkarid-delen, i sialinsyrene og ceramidet i de estere og' amider som er beskrevet i det foreliggende. I disse derivater kan acylgruppene stamme fra syrer i den alifatiske, aromatiske, aralifatiske, alicykliske eller heterocykliske rekke; fortrinnsvis fra syrer i den alifatiske, aromatiske, aralifatiske, alicykliske eller heterocykliske rekke med maksimalt 10 karbonatomer og særlig 6 karbonatomer, såsom maursyre, eddiksyre, propionsyre, smørsyre og valeriansyrer og kapron- eller kaprinsyre. De kan også stamme fra syrer for eksempel med det samme antall karbonatomer, men spesielt substituert med hydroksysyrer såsom melkesyre, amino-syrer såsom glycin, eller divalente syrer såsom ravsyre, malon-eller maleinsyrer. Blant de aromatiske syrer foretrekkes slike som bare har én benzenring, spesielt benzosyre og dens derivater med metyl-, hydroksyl-, amin- eller karboksylgrupper, såsom p-aminobenzosyre, salicylsyre eller ftalsyre. Ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen omsettes disse syrer i form av et anhydrid av dem for reaksjon med hydroksylgruppen i et forestret gangliosid eller i et gangliosid med fri(e) karboksylgruppe(r).

Oppfinnelsen innbefatter også fremstilling av peracylerte derivater av gangliosider og blandinger av dem beskrevet ovenfor, men med frie karboksylfunksjoner. Også når det gjelder disse derivater er de acylerte derivater som stammer fra de syrer som er beskrevet ovenfor, spesielt viktig. Også når det gjelder peracylerte derivater med frie eller forestrede karboksylsyre-funksjoner eller i form av amider, er gangliosid-derivatene i gruppe A og B spesielt viktig, likesom blandinger av dem, spesielt derivater med acylgrupper og derivater av de estere og amider som er nevnt tidligere. En gruppe nye gangliosid-derivater som spesielt foretrekkes, er derfor den som omfatter gangliosid-estere og deres peracylerte derivater på hydroksylgruppene såvel som slike peracylerte derivater med karboksylfunksjonene i nevnte gangliosider i fri form. I disse derivater stammer ester-gruppene fra alkoholer som utgjør gruppen bestående av alifatiske alkoholer med maksimalt 6 mettede karbonatomer, usubstituert eller substituert med hydroksyl, alkoksylgrupper med maksimalt 4 karbonatomer, amino-, alkylamino- eller dialkylaminogrupper med maksimalt 4 karbonatomer i alkylgruppene, karboksylsyregrupper, karbalkoksylsyregrupper med maksimalt 4 karbonatomer i alkylresten, og de korresponderende alkoholer med høyst én dobbeltbinding, og aralifatiske alkoholer med bare én benzenring, usubstituert eller substituert med 1-3 metylgrupper, cykloalifatiske eller alifatisk-cykloalifatiske alkoholer med en cykloheksanring, usubstituert eller substituert med 1-3 metylgrupper og maksimalt 4 karbonatomer i den alifatiske del, og tetrahydrofuranol og tetrahydropyranol.

De acylgrupper som forestrer hydroksylgruppene i disse mest foretrukkede derivater, stammer fra alifatiske syrer, mettet eller umettet med maksimalt 6 karbonatomer, som også kan være substituert med en funksjon valgt fra gruppene omfattende hydroksyl-, amino- og karboksylgrupper, og salter av dem. Denne gruppe av mest foretrukkede derivater og særlig av gangliosidene i gruppe A og B nevnt ovenfor og også derivatene av blandinger av gangliosider fra for eksempel gruppene A og B (med de funksjonelle grupper som er spesifisert her) er av spesiell intresse som bestanddeler i de farmasøytiske preparater fremstilt ifølge den foreliggende oppfinnelse. Blant de spesifikke nye forbindelser fremstilt ifølge den foreliggende oppfinnelse og som er spesielt viktig for farmasøytiske preparater er de følgende derivater viktig:

etylesteren av gangliosid GM1

- propylesteren av gangliosid GM1

- isopropylesteren av gangliosid GM1

- normal-butylesteren av gangliosid GM1

- isobutylesteren av gangliosid G^

- tert.-butylesteren av gangliosid G^

- cykloheksylesteren av gangliosid GM1

- de estere som svarer til de som er oppregnet her og som inneholder gangliosidet GDlb i stedet for gangliosid GM1 - de estere som er oppregnet ovenfor og som inneholder gangliosidet GD^a i stedet for gangliosid GM1 - de estere som er oppregnet her og som inneholder gangliosidet GT^k i stedet for gangliosid GM1

- peracetylatene av de estere som er angitt ovenfor

- perpropionylatene av de estere som er angitt ovenfor

- per-n-butyrrylatene av de estere som er angitt ovenfor

- permaleinylatene av de estere som er angitt ovenfor

- permalonylatene av de estere som er angitt ovenfor

- persuksinylatene av de estere som er angitt ovenfor

- peracetylatene av gangliosiden<e><G>M1,<G>Dlb,<G>Dla,GTlb

- og perpropionylatene, per-n-butyrrylatene, permalonylatene, persuksinylatene og permaleinylatene av de samme gangliosider

Ut fra de nye forbindelser fremstilt ifølge den foreliggende oppfinnelse med frie karboksyl-funksjoner, så som peracylater av gangliosider, for eksempel gangliosider fra gruppene A og B, kan det fremstilles metallsalter. Metallsalter kan også fremstilles ut fra andre derivater fremstilt ifølge oppfinnelsen og som inneholder en fri syrefunksjon, så som peracylerte estere med divalente syrer. Videre utgjør fremstilling av salter ved syreaddisjon til gangliosid-derivater som inneholder en fri amin-funksjon, også en del av oppfinnelsen, så som estere med aminoalkoholer. Blant metallsaltene er slike som kan anvendes i terapi, spesielt foretrukket, så som saltene av alkalimetaller og jordalkalimetaller så som kalium-, natrium-, ammonium-, kalsium- og magnesiumsalter, eller salter av jordmetaller så

som aluminium, men også saltene med organiske baser så som primære, sekundære eller alifatiske, aromatiske eller heterocykliske aminer så som metylamin, etylamin, propylamin, piperidin, morfolin, efedrin, furfurylamin, kolin, etylendiamin, aminoetanol.

Blant de syrer som er i stand til å gi salter med gangliosid-derivater ved syretilsetning ifølge oppfinnelsen er følgende syrer spesielt foretrukket: Hydrogensyrene såsom saltsyre og hydrogenbromid, fosforsyrene, svovelsyre, de lavere alifatiske syrer med maksimalt 7 karbonatomer, såsom maursyre, eddiksyre eller propionsyre, ravsyre eller maleinsyre. Ubrukbare terapeutiske syrer eller baser såsom pikrinsyre kan anvendes for rensning av de nye gangliosid-derivater. På grunn av den nære sammenheng mellom de nye derivater i fri form og i form av deres salter må denne beskrivelse av oppfinnelsen betraktes som omfattende fremstilling av begge former, dersom ikke det motsatte er uttrykkelig angitt.

De nye gangliosidestere fremstilt ifølge denne

oppfinnelse representerer generelt amorfe, fargeløse eller grålige pulvere som med stort hell kan oppløses i vann og polare løsningsmidler såsom lavere alifatiske alkoholer, for eksempel metyl-, etyl- eller propylalkohol, eller også i ketoner, såsom aceton, eller i amider, såsom dimetylformamid, eller i sulf-oksyder, såsom dimetylsulfoksyd, eller etere såsom dioksan eller tetrahydrofuran. Løseligheten i vann er imidlertid betraktelig redusert i de derivater som er acylert véd hydroksylgruppene, mens den er øket i de organiske løsningsmidler nevnt ovenfor.

For fremstilling av de farmasøytiske preparater i form av oppløsninger for parenteral anvendelse vil de mest egnede løsningsmidler velges hver gang ifølge den mer eller mindre hydrofile eller lipofile karakter hos de nye derivater.

Den foreliggende oppfinnelse innbefatter fremgangsmåter

for fremstilling av de nye gangliosid-derivater beskrevet ovenfor eller for slike som allerede er kjent. Slike gangliosid-derivater kan også fremstilles ved konvensjonelle, allerede kjente fremgangsmåter for fremstilling av de nye estere og amider av karboksylsyrer og for acylering av hydroksylgrupper for fremstilling av de nye acylderivater, bortsett fra de fremgangsmåter som ville ha den virkning at basis-gangliosidet ble forandret, så som slike som gjør bruk av sterkt sure agenser eller slike som under alle omstendigheter utføres ved

ved alkaliske eller sure hydrolysebetingelser, eller også

slike fremgangsmåter som kan forårsake uønsket alkylering av hydroksylgruppene i sakkarid-delen. Foreliggende oppfinnelse er imidlertid rettet mot en ny fremgangsmåte til fremstilling av både nye og kjente estere, idet man starter med de indre estere i gangliosider som beskrevet i det følgende.

Fremgangsmåten karakteriseres ved de i krav 1 angitte trekk.

Siden oppfinnelsen innbefatter fremstilling av gangliosid-derivater med forestrede karboksyl-funksjonelle grupper og dessuten de acylerte derivater på hydroksylgruppene hos disse derivater, er det på den ene side på denne måte mulig å modifisere karboksyl-funksjonene både hos frie gangliosider, dvs. med frie hydroksyl-fuhksjoner, og hos gangliosider med allerede acylerte hydroksyl-funksjoner. På den annen side er det mulig å acylere hydroksyl-funksjonene i allerede forestrede derivater eller i amid-derivatene. Det er også mulig ifølge oppfinnelsen å acylere hydroksy-funksjonene alene, idet karboksyl-funksjonene forblir frie.

Ifølge oppfinnelsen forestres derfor et gangliosid eller

ett av dets peracylerte derivater i karboksylgruppene, eller man acylerer hydroksylgruppene i disse gangliosid-derivater eller gangliosidene med frie karboksylfunksjoner. Skulle det være ønskelig, omdannes oppnådde saltdannende forbindelser til sine salter.

Blant de fremgangsmåter som er kjent' for fremstilling av karboksylsyreestere, kan man nevne slike som anvendes for fremstilling av de allerede kjente metylestere av gangliosidene <G>M1 og GM3 beskrevet i ovennevnte artikkel i Journal of Lipid Research, 21, 642-645 (1980). Ifølge denne artikkel er det mulig å oppnå esterne av karboksylgruppene i gangliosider ved at sistnevnte omsettes med en alkohol hvorav man kan få esteren i nærvær av en ionebytter, for eksempel en harpiks såsom "Dowex" 50. Utbyttet er begrenset på grunn av den samtidige dannelse av interne estere og de lengre reaksjonstider (2-3 dager).

Den samme fremgangsmåte er for eksempel også anvendt i ovennevnte artikkel i Methods of Enzymology, 50, 137-140 (1978) for fremstilling av metylesterne av gangliosidet GM3. Denne type delvise forestring kan tydeligvis også oppnåes, om enn med et enda lavere utbytte, i fravær av harpikser. Bortsett fra harpiksen "Dowex" 50 kan det også anvendes andre sure ionebyttere som har den funksjon at de omdanner gangliosider som, som allerede angitt, vanligvis er til stede og særlig i ekstrakter i form av salter, spesielt natriumsalter, til frie gangliosider. Denne operasjon hvor gangliosid-salter omdannes til frie gangliosider, er også egnet ved alle de andre konvensjonelle fremgangsmåter som er beskrevet i det foreliggende, for funksjonell modifikasjon av karboksylsyrefunksjonen, såsom ved fremgangsmåter for fremstilling av amider. Den beste fremgangsmåte som er beskrevet i ovennevnte artikkel, består imidlertid av forestring av den karboksylgruppe eller de karboksylgrupper som er til stede i gangliosider, ved at man leder en alkoholisk oppløsning av den ønskede alkohol på en harpiks såsom "Dowex"-50Wx8 (100-200 mesh H-form) og behandler eluatet oppløst i den samme alkohol med det korresponderende diazometan. I det spesielle tilfelle som er beskrevet, ble esterne av gangliosidene GM1 og GM3 fremstilt ved behandling på denne måte med metanol og diazometan, hvilket ga et meget godt utbytte.

En annen god fremgangsmåte til fremstilling av estere av gangliosid-karboksylgrupper består av at man behandler et gangliosid-metallsalt med et foretringsmiddel. Salter av alkalimetaller eller jordalkalimetaller anvendes, eller også et hvilket som helst annet metallsalt. Som foretringsmiddel kan anvendes slike som i og for seg er kjent'i litteraturen, særlig esterne av forskjellige uorganiske syrer, eller organiske sulfonsyrer, såsom hydrogensyrene, med andre ord hydrokarbon-halogenidene såsom metyl-, etyljodid osv., eller de nøytrale eller sure sulfater av hydrokarboner, sulfitter, karbonater, silikater, fosfitter eller hydrokarbonsulfonater, såsom benzo-eller p-toluen-sulfonat av metyl eller klorsulfonat av metyl eller etyl. Reaksjonen kan utføres i et egnet løsningsmiddel såsom en alkohol, fortrinnsvis den som svarer til den alkylgruppe som skal innføres i karboksylgruppen, men ikke-polare løsnings-midler kan også anvendes, såsom ketoner, og etere, såsom dioksan eller dimetylsulfoksyd.

Fremgangsmåten som er karakteristisk for den foreliggende oppfinnelse for fremstilling av gangliosid-estere og som kan anvendes både for fremstilling av de nye gangliosider og også for fremstilling av de allerede kjente estere, består av at man behandler et internt gangliosid-ester med en blanding av den ønskede alkohol og ett av dens korresponderende alkoholat. Reaksjonen kan utføres ved en temperatur som svarer til alkoholens kokepunkt. Lavere temperaturer kan også anvendes, men i dette tilfelle er reaksjonstidene lengre. Det er også mulig, idet man imidlertid gir avkall på det meget gode utbytte og de korte reaksjonstider, å behandle den indre ester med nettopp den aktueile alkohol, fortrinnsvis ved en temperatur som svarer til dens kokepunkt. De indre estere er for eksempel beskrevet i ovennevnte belgiske patent nr. 894024 og US-patent 4 476 119.

Som alkoholater er det foretrukket å anvende alkalimetall-alkoholater, særlig natriumalkoholat.

Acylering av hydroksylgruppene i sakkaridet, i sialinsyre-delen og i ceramidet skjer også på en måte som i og for seg allerede er kjent, for eksempel ved acylering med et halogenid eller et anhydrid av den syre som anvendes for acylering, fortrinnsvis i nærvær av en tertiær base såsom pyridin eller collidin. Reaksjonen kan finne sted ved lav temperatur såsom romtemperatur, idet syrederivatet, såsom anhydrid, blir tilbake for reaksjon i ganske lang"tid, for eksempel 12-24 timer, eller ved en litt høyere temperatur såsom 50-100°C i noen få timer.

Oppfinnelsen innbefatter også modifikasjoner i fremgangs-måtene til fremstilling av de nye derivater, hvor en fremgangsmåte avbrytes ved ett eller annet nærmere angitt punkt eller hvor fremstillingen startes med en intermediær forbindelse og de gjenværende trinn utføres, eller hvor utgangsproduktene dannes in situ.

Eksempel 1: Metvlester av gangliosidet GM1

5 g av den indre ester av gangliosidet GM1 (3,27 mM) oppløses i 200 ml av en vannfri blanding av metylenklorid og metanol i forholdet 4:1. 176 mg (3,27 mM) natriummetylat oppløst i 50 ml vannfri metanol tilsettes og blandingen kokes under tilbakeløp i 2 timer. Ved slutten av reaksjonen nøytraliseres blandingen med vannfri harpiks av typen Dowex AG 50x8 (H+<->formen), harpiksen fraskilles ved filtrering og vaskes med metanol, og oppløsningen inndampes til tørrhet. Residuet oppsamles i 50 ml metylenklorid/metanol i forholdet 1:1, og reaksjonsproduktet utfelles ved at det helles i 250 ml aceton. Råproduktet (4,9 g) renses ved preparativ høytrykkskromatografi med silikagel av typen 60 H Merck under anvendelse av en blanding av kloroform/metanol/isopropanol/ammoniumkarbonat, 2 %, 1140:820:180:140 som løsningsmiddel. De rene fraksjoner oppsamles, inndampes til tørrhet, oppløses på nytt i 15 ml kloroform/metanol 1:1, og produktet utfelles med 75 ml aceton. Dette produkt representerer metylesteren av gangliosidet GM1. Utbytte 4,2 g.

IR-spektroskopi utført på KBr-pellets viser det typiske ester-bånd med 1750 cm _ i Kromatografi på silikagel-plater med kloroform/metanol/CaCl2 0,3 % 55:45:10 og bestemmelse med Ehrlich-reagens (Rf-verdi 0,72) viste at produktet var en enhetlig forbindelse og at det var fritt for den indre ester som ble anvendt som utgangsprodukt (Rf-verdi 0,75) og for gangliosidet GM1 (Rf-verdi 0,65). Ved behandling med en 0,1N oppløsning av ^£00^ ved 60° i 1 time spaltes esterbindingen, idet man får det primære produkt, GM1.

Eksempel 2: Fremstilling av en gangliosid- blanding ( GA- blandinq) ved ekstraksion fra bovint hjernevev og av den tilsvarende blanding av indre estere ( som skal anvendes i de forskjellige etterfølgende eksempler).

Bovin hjernebark, fjernet fra dyret, homogeniseres i fosfat-buffer ved pH 6,8; 6 volumdeler tetrahydrofuran tilsettes og den resulterende blanding sentrifugeres. Supernatanten re-ekstraheres to ganger med tetrahydrofuran. E^ter sentrifugering fjernes de ikke-polare materialer ved separasjon med etyletér, og det vandige-tetrahydrofuranholdige sjikt innføres på en ionebytter-kolonne brakt i likevekt med 50 % etanol. Bariumhydroksyd og 4 volumandeler iskald etanol tilsettes til utløpsvæsken fra kolonnen.

Etter 18 timer ved kalde betingelser oppsamles det utfelte materiale og surgjøres lett med saltsyre etter oppløsning i vann. Den således oppnådde oppløsning dialyseres og frysetørkes. Utbyttet på dette punkt er ca. 0,6 mg rå gangliosid-blanding pr. gram anvendt nervevev. Det frysetørkede pulver dispergeres i 20 volumdeler kloroform/metanol i forholdet 2:1, den oppnådde oppløsning filtreres inntil den er fullstendig klar og separeres deretter ved at man tilsetter 0,2 volumdeler av en oppløsning av 0,88 % kaliumklorid i vann.

Det øvre lag fraskilles, dialyseres og frysetørkes. Slutt-utbyttet er ca. 0,3 mg renset blanding av gangliosid-salter pr. gram hjernevev.

5 gram av en blanding oppnådd ifølge den fremgangsmåte som er beskrevet ovenfor, oppløses i 50 ml DMS0. 4 gram vannfri harpiks av styrentypen (sulfonsyre) (50-100 mesh, H+<->formen) tilsettes til blandingen, og det resulterende system agiteres i 30 minutter ved romtemperatur. Denne behandling med ionebytter-harpiks omdanner alle karboksylgrupper som er i saltform. Fullstendig omdanning bekreftes ved en egnet metode til fysisk

analyse såsom atomabsorpsjon. Harpiksen filtreres deretter under sug, og oppløsningen behandles med 1,5 g dicykloheksylkarbodiimid og får stå i 1 time. Det utfelte dicykloheksylurea fjernes ved filtrering, og den resulterende oppløsning behandles med 100 ml 0 , hvilket bevirker utfelling av det dannede indre gangliosid-ester.

Utbyttet er 4,6 g av en blanding av indre estere (ca.

90-95 % av den teoretiske verdi). Tilstedeværelsen av derivater som inneholder indre estere, bekreftes ved infrarød spektroskopi og ved tynnsjiktskromatografi. IR-spektroskopi på KBr-pellet: den forestrede laktonbinding danner et bånd ved 1750 cm 1. Tynnsjiktskromatografi: på silikagel-plate, fremkallings-løsningsmiddel: CHC13/Me0H/CaCl2 0,3 % (volumforhold 55:45:10), Rf-verdien for blandingen av de indre estere er mellom 0,7 og 0,85. Rf-verdien for sluttproduktene er større enn Rf-verdien for blandingen av utgangssubstans: følgelig viser kromatografien fravær av utgangsmateriale. Ved behandling med en oppløsning på 0,1N Na2C03 ved 60° i 1 time spaltes esterbindingene og det er mulig å oppnå primærblandingen av utgangsgangliosidene.

Den oppnådde gangliosid-blanding kan fraksjoneres i forskjellige porsjoner som i det vesentlige representerer rene gangliosider (i den betydning som er anvendt i den generelle beskrivelse) under anvendelse av kiselsyrekolonner og under eluering med en blanding av metanol og kloroform. På denne måte oppnåes en gjennomsnittlig sammensetning på ca. 40 % av gangliosidet GDla, 21 % av gangliosidet GM1, 19 % av gangliosidet GTlb og 16 % av gangliosidet GDlb-

Eksempel 3: Blanding av metvleste re av en gangliosidblanding

5 g av en blanding av indre estere av en blanding av gangliosider (oppnådd ved ekstraksjon fra bovint hjernevev som beskrevet i eksempel 2) oppløses i 200 ml av en vannfri blanding av metylenklorid og metanol i forholdet 4:1. 318 mg (5,86 mM) natriummetylat oppløst i 50 ml vannfri metanol tilsettes og blandingen kokes under tilbakeløp i 2 timer. Råproduktet fra reaksjonen isoleres deretter som beskrevet i eksempel 1 (4,9 g). Råproduktet renses så ved kromatografi på Sephadex-DEAE acetat-form A-25 under anvendelse en blanding av kloroform, metanol og vann i forholdet 30:60:8 som løsningsmiddel. De blandede nøytrale fraksjoner inndampes, dialyseres i vann, inndampes igjen til tørrhet, residuene oppløses i 15 ml kloroform/metanol i forholdet 1:1, og produktet utfelles med 75 ml aceton. Utbytte: 4,3 g. IR-spektroskopi utført på KBr-pellets viste det typiske ester-bånd ved 1750 cm _ i. Kromatografi utført som beskrevet i eksempel 1, viste at det produkt som representerer blandingen av metylestere av gangliosidene, hadde en Rf-verdi på 0,72-0,85 (Rf-verdien for gangliosid-blandingen var 0,2-0,70).

Fullstendig transforestring kan bekreftes ved at man bestemmer molekyl-forholdet mellom alkoksy- og sialinsyregrupper, hvilket oppnåes ved kvantitativ "topproms-" ("head space") gass-kromatografi av den metylalkohol som frigis etter behandling med 0,1N oppløsning av Na2C03 ved 60° i 1 t.j,me, som gir spaltning av alle esterbindingene, og med Svennerholms metode for bestemmelse av N-acetyl-neuraminsyre.

Eksempel 4: Etvlester av gan<g>liosidet

Etylesteren av Gu1 fremstilles og isoleres på samme måte som for metylesteren i eksempel 1, idet man imidlertid anvender etylalkohol og natriumetylat i stedet for metylalkohol og natrium-metylat, og man anvender de samme molare mengder av den indre ester og etylat som i eksempel 1. Vasking av Dowex-harpiksen utføres med etylalkohol, og det residuum som oppnåes ved fordampning av den filtrerte substans, oppløses i 50 ml metylenklorid/etanol i forholdet 1:1. Utbyttet av råprodukt er 4,9 g. Rensning utføres også som i eksempel 1. Utbyttet av etylesteren av renset G^-gangliosid: 4,3 g. Kromatografiske analyser av produktet utført på samme måte som i eksempel 1, viser tilstedeværelse av en enhetlig forbindelse med en Rf-verdi på 0,80 og fravær av GM1-gangliosid og dets interne ester (Rf-verdier henholdsvis 0,65 og 0,75). Hydrolyse med Na2C03 som beskrevet i eksempel 1, gir gangliosidet GM1. IR-spektroskopisk undersøkelse på KBr-pellets viser det typiske esterbånd ved 1750 cm-1

Eksempel 5: Blanding av etvlestere av en blanding av gangliosider

Blandingen av etylestere fremstilles og isoleres på samme måte som for blandingen av metylestere i eksempel 3, idet man imidlertid anvender etylalkohol og natriumetylat i stedet for metylalkohol og natrium-metylat, og anvender 5 g av en blanding av indre estere og 318 mg (5,86 mM) natriumetylat.

Vasking av Dowex-harpiksen utføres med etylalkohol, og det residuum som oppnåes ved inndampning av den filtrerte substans, oppløses i 50 ml kloroform/etanol 1:1. Utbyttet av råprodukt er 4,9 g. Rensning utføres også som i eksempel 3. Utbyttet av renset etylester-blanding: 4,5 g. IR-spektroskopi utført på KBr-pellets viser det typiske esterbånd ved 1750 cm 1. Når produktet kromatograferes på silikagelplater med en nylig tillaget oppløsning av kloroform/metanol/hydroksyd av tetrametyl-ammonium 1M 55:45:10 og bestemmes med Ehrlich-reagens, viser det en Rf-verdi på 0,50-0,75 (gangliosid-blanding 0,20-0,60).

Fullstendig transforestring vises på samme måte som beskrevet i eksempel 3.

Eksempel 6: Isopropvlester av gangliosidet ^

Dette derivat fremstilles og isoleres på samme måte som for metylesteren i eksempel 1, idet man imidlertid anvender isopropylalkohol og natriumisopropylat i stedet for metylalkohol og natrium-metylat, og anvender de samme molare mengder av indre ester og isopropylat som i eksempel 1. Vasking av Dowex-harpiksen utføres med isopropylalkohol, og det residuum som oppnåes ved inndampning av den filtrerte substans, oppløses i 50 ml metylenklorid/isopropanol 1:1. Utbyttet av råprodukt er 4,9 g.

Rensning utføres også som i eksempel 1. Utbytte av isopropyl-ester av renset G^-gangliosid: 4,2 g.

Kromatografisk analyse av produktet, utført på samme måte som i eksempel 1, viser tilstedeværelse av en enhetlig forbindelse med en Rf-verdi på 0,85 og fravær av G^-gangliosid eller dets indre ester. Hydrolyse med Na2C03 som beskrevet i eksempel 1, gir gangliosidet GM1. IR-spektroskopi på KBr-pellets viser det typiske ester-bånd ved 1750 cm

Eksempel 7: Blanding av isopropvlestere av en gangliosid-blanding

Denne derivat-blanding fremstilles og isoleres på samme måte som for blandingen av metylestere i eksempel 3, idet man imidlertid anvender isopropylalkohol og natriumisopropylat i stedet for metylalkohol og natrium-metylat, og anvender 5 g av en blanding av indre estere og 537 mg (6,52 mM) natriumisopropylat. Vasking av Dowex-harpiksen utføres med isopropylalkohol, og det residuum som oppnåes ved inndampning av den filtrerte substans, oppløses i 50 ml kloroform/isopropanol 1:1. Utbytte av råprodukt er 4,9 g. Rensning utføres også som i eksempel 3, idet man imidlertid som kromatografi-elueringsmiddel anvender en blanding av klorform/- isopropylalkohol/vann i forholdet 20:60:8. Utbytte av blanding av rensede isopropylestere: 4,3 g.

Produktet viser ved kromatografi ifølge den fremgangsmåte som er beskrevet i eksempel 5, en Rf-verdi på 0,40-0,78 (gangliosid-blanding 0,20-0,60). IR-spektroskopi' utført på KBr-pellets viser det typiske ester-bånd ved 1750 cm . Fullstendig transforestring vises som beskrevet i eksempel 3.

Eksempel 8: Tertiær butvlester av gangliosidet G...

NI

Dette derivat fremstilles og isoleres på samme måte som for metylesteren i eksempel 1, idet man imidlertid anvender tert.-butylalkohol og natrium-tert.-butylat i stedet for metylalkohol og natrium-metylat, og anvender de samme molare mengder av indre estere og tert.-butylat som i eksempel 1. Vasking av Dowex-harpiksen utføres med tert.-butylalkohol, og det residuum som oppnåes ved inndampning av den filtrerte substans, oppløses i 50 ml metylenklorid/tert.-butanol 1:1. Utbyttet av råprodukt er 4,9 g. Utbyttet av tert.-butylester av renset GM1-gangliosid: 4,1 g.

Kromatografiske analyser av produktet utført på samme måte som i eksempel 1 viser tilstedeværelsen av en enhetlig forbindelse med en Rf-verdi på 0,71 og fravær av GM1-gangliosid og av dets indre ester. Hydrolyse med Na^co^ som beskrevet i eksempel 1, gir gangliosidet G .. IR-spektroskopi i KBr-pellets

Ml _ 1

viser det typiske esterbånd ved 1750 cm

Eksempel 9: Blanding av tert.- butvlestere av en blanding av gangliosider

Denne blanding fremstilles og isoleres på samme måte som for blandingen av metylestere i eksempel 3, idet man imidlertid anvender tert.-butylalkohol og natrium-tert.-butylat i stedet for metylalkohol og natrium-metylat, og anvender 5 g av en blanding av indre estere og 628,6 mg (6,52 mM) natrium-tert.-butylat. Vasking av Dowex-harpiksen utføres med tert.-butylalkohol, og det residuum som oppnåes ved inndampning av den filtrerte substans, oppløses i 50 ml kloroform/tert.-butanol 1:1. Utbyttet av råprodukt er 4,9 g. Rensning utføres også som i eksempel 3, idet man imidlertid som kromatografi-elueringsmiddel anvender en blanding av kloroform og tert.-butylalkohol i forholdet 1:1. Utbytte av rensede tert.-butylestere: 4,1 g. IR-spektroskopi utført på KBr-pellets viser det typiske ester-bånd ved 1750 cm<-1 >Produktet viser ved kromatografi ifølge den fremgangsmåte som er beskrevet i eksempel 5, en Rf-verdi på 0,25-0,70. Fullstendig reaksjon vises som beskrevet i eksempel 3.

Eksempel 10: Fenvletvlester av gangliosidet GM1

Fenyletylesteren av GM1 fremstilles og isoleres på samme måte som for metylesteren i eksempel 1, idet man imidlertid anvender fenetylalkohol og natriumfenyletylat i stedet for metylalkohol og natrium-metylat og oppvarmer på et vannbad, og anvender de samme molare mengder av indre ester og natriumfenyletylat som i eksempel 1. Vasking av Dowex-harpiksen utføres med fenyletylalkohol, og det residuum som oppnåes ved fordampning av den filtrerte substans, oppløses i 50 ml metylenklorid/fenetylalkohol 1:1. Utbyttet av råprodukt er 5,1 g. Rensning utføres også som i eksempel 1. Utbytte av den rensede fenyletylester av GM1-gangliosid: 4,3 g.

IR-spektroskopi-undersøkelse på KBr-pellets viser det typiske ester-bånd ved 1750 cm" . Kromatografisk analyse av produktet utført på samme måte som i eksempel 1 viser tilstedeværelsen av en enhetlig forbindelse med en Rf-verdi på 0,90 og fravær av GM1-gangliosid og dets indre ester (Rf-verdier henholdsvis 0,65 og 0,75). Hydrolysen med Na2C03 som beskrevet i eksempel 1, gir gangliosidet GM1.

Eksempel Blanding av fenvletvlestere av en blanding av gangliosid

Blandingen av fenyletylestere fremstilles og isoleres på samme måte som for blandingen av metylestere ifølge eksempel 2, idet man imidlertid anvender fenetylalkohol og natriumfenyletylat i stedet for metylalkohol og natrium-metylat og oppvarmer på et vannbad, og anvender 5 g av en blanding av indre estere og 844,8 mg (5,86 mM) natriumfenyletylat. Vasking av Dowex-harpiksen utføres med fenyletylalkohol, og det residuum som oppnåes ved inndampning av den filtrerte substans, oppløses i 50 ml kloroform/fenyletylalkohol 1:1. Utbyttet av råprodukt er 5,3 g. Rensning utføres også som i eksempel 3. Utbyttet av blanding av rensede estere: 4,4 g.

IR-spektroskopi utført på KBr-pellets viser det typiske ester-bånd ved 1750 cm<-1>. Ved kromatografi på silikagel-plater med en nylig fremstilt oppløsning av kloroform/metanol/hydroksyd av tetrametylammonium 1M 55:45:10 og bestemmelse med Ehrlich-reagens viser produktet en Rf-verdi på 0,65-0,887 (gangliosid-blanding 0,2-0,60). Fullstendig transforestring vises på samme måte som beskrevet i eksempel 2.

Eksempel 12: 2- cvkloheksvletvlester av gangliosidet GM1

2-cykloheksyletylesteren av G^ fremstilles og isoleres på samme måte som for metylesteren i eksempel 1 , idet. man imidlertid anvender 2-cykloheksyletanol og natriura-2-cykloheksyletylat i stedet for metylalkohol og natrium-metylat og oppvarmer på et vannbad, og anvender de samme molare mengder av indre ester og natrium-2-cykloheksyletylat som i eksempel 1. Vasking av Dowex-harpiksen utføres med 2-cykloheksyletylalkohol, og det residuum som oppnåes ved inndampning av den filtrerte substans, oppløses i 50 ml metylenklorid/2-cykloheksyletanol 1:1. Utbyttet av råprodukt er 5,1 g. Rensning utføres også som i eksempel 1. Utbytte av den rensede 2-cykloheksyletylester av G^-gangliosid: 4,3 g.

IR-spektroskopi-undersøkelse på KBr-pellets viser det typiske ester-bånd ved 1750 cm . Kromatografisk analyse av produktet utført på samme måte som i eksempel 1, viser tilstedeværelsen av en enhetlig forbindelse med en Rf-verdi på 0,92 og fravær av GM1-gangliosid og dets indre ester (Rf-verdier henholdsvis 0,65 og 0,75). Hydrolyse med Nd2C03 som beskrevet i eksempel 1, gir gangliosidet G^.

Eksempel 13: Blanding av 2- cvkloheksvletvlestere av en blanding av gangliosider

Blandingen av 2-cykloheksyletylestere fremstilles og isoleres på samme måte som for blandingen av metylestere ifølge eksempel 2, idet man imidlertid anvender 2-cykloheksyletanol og natrium-2-cykloheksyletylat. i stedet for metylalkohol og natrium-metylat og oppvarmer på et vannbad, og anvender 5 g av en blanding av indre estere og 880,3 mg (5,86 mM) natrium-2-cyklo-heksyletylat. Vasking av Dowex-harpiksen utføres med 2-cykloheksyletylalkohol, og det residuum som oppnåes ved inndampning av den filtrerte substans, oppløses i 50 ml kloroform/etanol 1:1. Utbyttet av råprodukt er 5,3 g. Rensning utføres også som i eksempel 3. Utbyttet av blanding av rensede estere: 4,3 g.

IR-spektroskopi utført på KBr-pellets viser det typiske ester-bånd ved 1750 cm <1>. Ved kromatografi på silikagel-plater med en nylig tillaget oppløsning av kloroform/metanol/hydroksyd av tetrametylammonium 1M 55:45:10 og bestemmelse med Ehrlich-reagens, viser produktet en Rf-verdi på 0,67-0,90 (gangliosid-blanding 0,20-0,60). Fullstendig transforestring vises på samme måte som beskrevet i eksempel 2.

Eksempel 14^ Mentvlester av gangliosidet

Mentylesteren av G^ fremstilles og isoleres på samme måte som for metylesteren i eksempel 1, idet man imidlertid anvender mentol og natrium-mentylat i stedet for metylalkohol og natrium-metylat og oppvarmer på et vannbad, og anvender de samme molare mengder av indre ester og natrium-mentylat som i eksempel 1. Vasking av Dowex-harpiksen utføres med mentylalkohol/metylenklorid 1:1, og det residuum som oppnåes ved inndampning av den filtrerte substans, oppløses i 50 ml metylenklorid/mentol 1:1. Utbyttet av råprodukt er 3,9 g. Rensning utføres også som i eksempel 1. Utbytte av den rensede mentylester av GM1-gangliosid: 4,2 g.

IR-spektroskopi-undersøkelse på KBr-pellets viser det typiske ester-bånd ved 1750 cm 1 . Kromatografisk analyse av produktet utført på samme måte som i eksempel 1, viser tilstedeværelse av en enhetlig forbindelse med en Rf-verdi på 0,93 og fravær av -gangliosidet og dens indre ester (Rf-verdier henholdsvis 0,65 og 0,75). Hydrolyse med Na^CO^ som beskrevet i eksempel 1, gir gangliosidet G^.

Eksempel 1. 5. ; Blanding av mentvlestere av en blanding av gangliosider

Blandingen av mentylestere fremstilles og isoleres på samme måte som for blandingen av metylestere ifølge eksempel 2, idet man imidlertid anvender mentol og natrium-mentylat i stedet for metylalkohol og natrium-metylat og oppvarmer på et vannbad, og anvender 5 g av en blanding av indre estere og 1038,8 mg (5,86 mM) natrium-mentylat. Vasking av Dowex-harpiksen utføres med mentylalkohol/metylenklorid 1:1, og det residuum som oppnåes ved inndampning av den filtrerte substans, oppløses i 50 ml kloroform/etanol 1:1. Utbyttet av råprodukt er 5,2 g. Rensning utføres også som i eksempel 3. Utbytte av blanding av rensede estere: 4,3 g.

IR-spektroskopi utført på KBr-pellets viser det typiske ester-bånd ved 1750 cm<-1>. Ved kromatografi på silikagel-plater med en nylig tillaget oppløsning av kloroform/metanol/hydroksyd av tetrametylammonium 1M 55:45:10 og bestemmelse med Ehrlich-reagens viser produktet en Rf-verdi på 0,70-0,93 (gangliosid-blanding 0,20-0,60). Fullstendig transforestring vises på samme måte som beskrevet i eksempel 2.

Eksempel 16; Tetrahydrofurfurvlester av gangliosidet GM1

Tetrahydrofurfurylesteren av GM1 fremstilles og isoleres på samme måte som for metylesteren i eksempel 1, idet man imidlertid anvender tetrahydrofurfuryl og natriumtetrahydrofurfurylat i stedet for metylalkohol og natrium-metylat og oppvarmer på et vannbad, og anvender de samme molare mengder av indre ester og natriumtetrahydrofurfurylat som i eksempel 1. Vasking av Dowex-harpiksen utføres med tetrahydrofurfuryl-alkohol, og det residuum som oppnåes ved inndampning av den filtrerte substans, oppløses i 50 ml metylenkorid/tetrahydrofurfurylalkohol 1:1. Utbyttet av råprodukt er 5,0 g. Rensning utføres også som i eksempel 1. Utbytte av den rensede tetrahydrofurfurylester av GM1-gangliosid-. 4,2 g.

IR-spektroskopi-undersøkelse på KBr-pellets viser det typiske ester-bånd ved 1750 cm Kromatografisk analyse av produktet utført på samme måte som i eksempel 1, viser tilstedeværelsen av en enhetlig forbindelse med en Rf-verdi på 0,72 og fravær av GM1-gangliosid og dens indre ester (Rf-verdier henholdsvis 0,65 og 0,75). Hydrolyse med ^£00^ som beskrevet i eksempel 1, gir gangliosidet GM1.

Eksempel 17: Blanding av tetrahydrofurfurvlestere av en blanding av gangliosider

Blandingen av tetrahydrofurfurylestere fremstilles og isoleres på samme måte som for blandingen av metylestere i eksempel 2, idet man imidlertid anvender tetrahydrofurfuryl-alkohol og natriumtetrahydrofurfurylat i stedet for metylalkohol og natrium-metylat og oppvarmer på et vannbad,og anvender 5 g av en blanding av indre estere og 727,5 mg (5,86 mM) natriumtetra-hydrof urf urylat . Vasking av Dowex-harpiksen utføres med tetra-hydrof urf uryl-alkohol , og det residuum som oppnåes ved inndampning av den filtrerte substans, oppløses i 50 ml kloroform/- etanol 1:1. Utbyttet av råprodukt er 5,2 g. Rensning utføres også som i eksempel 2. Utbytte av blanding av rensede estere: 4,2 g.

IR-spektroskopi utført på KBr-pellets viser det typiske ester-bånd ved 1750 cm<-1>. Ved kromatografi på silikagel-plater med en nylig tillaget oppløsning av kloroform/metanol/hydroksyd av tetrametylammonium 1M 55:45:10 og bestemmelse med Ehrlich-reagens viser produktet en Rf-verdi på 0,45-0,68 (gangliosid-blanding 0,20-0,60). Fullstendig transforestring vises på samme måte som beskrevet i eksempel 2.

Eksempel IS; Tetrahvdro- 2H- Pvran- 4- vl- ester av gangliosidet GM1

Tetrahydro-2H-pyran-4-yl-esteren av GM1 fremstilles og isoleres på samme måte som for metylesteren i eksempel 1, idet man imidlertid anvender tetrahydro-2H-pyran-4-ol og natrium-tetrahydro-2H-pyran-4-ylat i stedet for metylalkohol og natrium-metylat og oppvarmer på et vannbad, og anvender de samme molare mengder av indre ester og natrium-tetrahydro-2H-pyran-4-ylat som i eksempel 1. Vasking av Dowex-harpiksen utføres med tetrahydro-2H-pyran-4-ol, og det residuum som oppnåes ved inndampning av den filtrerte substans, oppløses i 50 ml metylenklorid/alkohol 1:1. Utbyttet av råprodukt er 5,1 g. Rensning utføres også som i eksempel 1. Utbytte av den rensede tetrahydro-2H-pyran-4-yl-ester av G^-gangliosid: 4,3 g.

IR-spektroskopi-undersøkelse på KBr-pellets viser det typiske ester-bånd ved 1750 cm 1 . Kromatografisk analyse av produktet utført på samme måte som i eksempel 1, viser tilstedeværelse av en enhetlig forbindelse med en Rf-verdi på 0,73 og fravær av GM1-gangliosid og dets indre ester (Rf-verdier henholdsvis 0,65 og 0,75). Hydrolyse med ^£00^ som beskrevet i eksempel 1 gir gangliosidet GM^.

Eksempel 19.- Blanding av tetrahvdro- 2H- pvran- 4- vl- estere av en blanding av gangliosider

Blandingen av tetrahydro-2H-pyran-4-yl-estere fremstilles og isoleres på samme måte som for blandingen av metylestere i eksempel 2, idet man imidlertid anvender tetrahydro-2H-pyran-4-ol og natrium-tetrahydro-2H-pyran-4-ylat i stedet for metylalkohol og natrium-metylat og oppvarmer på et vannbad, og anvender 5 g av en blanding av indre estere og 727,5 mg (5,86 mM) natriumtetra-hydro-2H-pyran-4-ylat. Vasking av Dowex-harpiksen utføres med tetrahydro-2H-pyran-4-yl-alkohol, og det residuum som opnåes ved inndampning av den filtrerte substans, oppløses i 50 ml kloroform/etanol 1:1. Utbyttet av råprodukt er 5,3 g! Rensning utføres også som i eksempel 3. Utbyttet av blanding av rensede estere: 4,5 g.

IR-spektroskopi utført på KBr-pellets viser det typiske ester-bånd ved 1750 cm 1. Ved kromatografi på silikagel-plater med en nylig tillaget oppløsning av kloroform/metanol/hydroksyd av tetrametylammonium 1M 55:45:10 og bestemmelse med Ehrlich-reagens viser produktet en Rf-verdi på 0,48-0,72 (gangliosid-blanding 0,20-0,60). Fullstendig transforestring vises på samme måte som beskrevet i eksempel 2.

Eksempel 20. : 1- heptvlester av gangliosidet GM1

1-heptylesteren av G^ fremstilles t>g isoleres på samme måte som for metylesteren i eksempel 1, idet man imidlertid anvender 1-heptanol og natrium-1-heptylat i stedet for metylalkohol og natrium-metylat og oppvarmer på et vannbad, og anvender de samme molare mengder av indre ester og natrium-1-heptylat som i eksempel 1. Vasking av Dowex-harpiksen utføres med 1-heptyl-alkohol, og det residuum som oppnåes ved inndampning av den filtrerte substans, oppløses i 50 ml metylenklorid/1-heptanol 1:1. Utbyttet av råprodukt er 3,9 g. Rensning utføres også som i eksempel 1. Utbytte av den rensede 1-heptylester av GM1~ gangliosid: 4,3 g.

IR-spektroskopi-undersøkelse på KBr-pellets viser det typiske ester-bånd ved 1750 cm<-1>. Kromatografisk analyse av produktet utført på samme måte som i eksempel 1, viser tilstedeværelse av en enhetlig forbindelse med en Rf-verdi på 0,89 og fravær av -gangliosid og dets indre ester (Rf-verdier henholdsvis 0,65 og 0,75). Hydrolyse med Na2C03 som beskrevet i eksempel 1, gir gangliosidet GM1.

Eksempel <21:> Blanding av 1- heptvlestere av en blanding av gangliosider

Blandingen av 1-heptylestere fremstilles og isoleres på samme måte som for blandingen av metylestere i eksempel 2, idet man imidlertid anvender 1-heptanol og natrium-1-heptylat i stedet for metylalkohol og natrium-metylat og oppvarmer på et vannbad, og anvender 5 g av en blanding av indre estere og 809,8 mg

(5,86 mM) natrium-1-heptylat. Vasking av Dowex-harpiksen utføres med 1-heptyl-alkohol, og det residuum som oppnåes ved inndampning av den filtrerte substans, oppløses i 50 ml kloroform/etanol 1:1. Utbyttet av råprodukt er 5,3 g. Rensning utføres også som i

eksempel 2. Utbyttet av blanding av rensede estere: 4,3 g.

IR-spektroskopi utført på KBr-pellets viser det typiske ester-bånd ved 1750 cm <1>. Ved kromatografi på silikagel-plater med en nylig tillaget oppløsning av kloroform/metanol/hydroksyd av tetrametylammonium 1M 55:45:10 og bestemmelse med Ehrlich-reagens viser produktet en Rf-verdi på 0,68-0,90 (gangliosid-blanding 0,20-0,60). Fullstendig transforestring vises på samme måte som beskrevet i eksempel 2.

Eksempel 22: 2- metyl- 1- pentvlester av gangliosidet G^^

2-metyl-1-pentylesteren av GM1 fremstilles og isoleres på samme måte som for metylesteren i eksempel 1, idet man imidlertid anvender 2-metyl-1-pentanol og natrium-2-metyl-1-pentylat i stedet for metylalkohol og natrium-metylat og oppvarmer på et vannbad, og anvender de samme molare mengder av indre ester og natrium-2-metyl-1-pentylat som i eksempel 1. Vasking av Dowex-harpiksen utføres med 2-metyl-1-pentylalkohol, og det residuum som oppnåes ved inndampning av den filtrerte substans, oppløses i 50 ml metylenklorid/2-metyl-1-pentanol 1:1. Utbyttet av råprodukt er 5,1 g. Rensning utføres også som i eksempel 1. Utbytte av den rensede 2-metyl-1-pentylester av GM1-gangliosid: 4,4 g.

IR-spektroskopi-undersøkelse på KBr-pellets viser det typiske ester-bånd ved 1750 cm 1. Kromatografisk analyse av produktet utført på samme måte som i eksempel 1, viser tilstedeværelse av en enhetlig forbindelse med en Rf-verdi på 0,90 og fravær av GM1-gangliosid og dets indre ester (Rf-verdier henholdsvis 0,65 og 0,75). Hydrolyse med N& 2C02 som t,eSKrevet i eksempel 1, gir gangliosidet GM1.

Eksempel <23:> Blanding av 2- metvl- 1- pentvlestere av en blanding av gangliosider

Blandingen av 2-metyl-1-pentylestere fremstilles og isoleres på samme måte som for blandingen av metylestere i eksempel 2, idet man imidlertid anvender 2-metyl-1-pentanol og natrium-2-metyl-1-pentylat i stedet for metylalkohol og natrium-metylat og oppvarmer på et vannbad, og anvender 5 g av en blanding av indre estere og 727,7 mg (5,86 mM) natrium-2-metyl-1-pentylat. Vasking av Dowex-harpiksen utføres med 2-metyl-1-pentylalkohol, og det residuum som oppnåes ved inndampning av den filtrerte substans, oppløses i 50 ml kloroform/etanol 1:1. Utbyttet av råprodukt er 5,3 g. Rensning utføres også som i eksempel 2. Utbytte av blanding av rensede estere: 4,4 g.

IR-spektroskopi utført på KBr-pellets viser det typiske ester-bånd ved 1750 cm 1. Ved kromatografi på silikagel-plater med en nylig tillaget oppløsning av kloroform/metanol/hydroksyd av tetraammonium 1M 55:45:10 og bestemmelse med Ehrlich-reagens viser produktet en Rf-verdi på 0,70-0,93«- (gangliosid-blanding 0,20-0,60). Fullstendig transforestring vises på samme måte som beskrevet i eksempel 2.

Eksempel 24: 3- metvl- 2- pentvlester av gangliosidet GM1

3-metyl-2-pentylesteren av GM1 fremstilles og isoleres på samme måte som for metylesteren i eksempel 1, idet man imidlertid anvender 3-metyl-2-pentanol og natrium-3-metyl-2-pentylat i stedet for metylalkohol og natrium-metylat og oppvarmer på et vannbad, og anvender de samme molare mengder av indre ester og natrium-3-metyl-2-pentylat som i eksempel 1. Vasking av Dowex-harpiksen utføres med 3-metyl-2-pentylalkohol, og det residuum som oppnåes ved inndampning av den filtrerte substans, oppløses i 50 ml metylenklorid/3-metyl-2-pentanol 1:1. Utbyttet av råprodukt er 5,1 g. Rensning utføres også som i eksempel 1.

Utbytte av den rensede 3-metyl-2-pentylester av G^ - gangliosid:

4.2 g.

IR-spektroskopi-undersøkelse på KBr-pellets viser det

typiske ester-bånd ved 1750 cm<-1>. Kromatografisk analyse av produktet utført på samme måte som i eksempel 1, viser tilstedeværelse av en enhetlig forbindelse med en Rf-verdi på 0,92 og fravær av -gangliosid og dets indre ester (Rf-verdier henholdsvis 0,65 og 0,75). Hydrolyse med Na,>C03 som beskrevet i eksempel 1, gir gangliosidet GM1.

Eksempel 25: Blanding av 3- metvl- 2- pentvlestere av en blanding

av gangliosider

Blandingen av 3-metyl-2-pentylestere fremstilles og isoleres

på samme måte som for blandingen av metylestere i eksempel 2,

idet man imidlertid anvender 3-metyl-2-pentanol og natrium-3-metyl-2-pentylat i stedet for metylalkohol og natrium-metylat og oppvarmer på vannbad, og anvender 5 g av en blanding av indre estere og 727,7 mg (5,86 mM) natrium-3-metyl-2-pentylat. Vasking av Dowex-harpiksen utføres med 3-metyl-2-pentyl-alkohol, og det residuum som oppnåes ved inndampning av den filtrerte substans, oppløses i 50 ml kloroform/etanol 1:1. Utbytte av råprodukt er 5.3 g. Rensning utføres også som i eksempel 2. Utbytte av blanding av rensede estere: 4,4 g.

IR-spektroskopi utført på KBr-pell*ets viser det typiske ester-bånd ved 1750 cm _ i Ved kromatografi på silikagel-plater med en nylig tillaget oppløsning av kloroform/metanol/hydroksyd av tetrametylammonium 1M 55:45:10 og bestemmelse med Ehrlich-reagens viser produktet en Rf-verdi på 0,72-0,95 (gangliosid-blanding 0,20-0,60). Fullstendig transforestring vises på samme måte som beskrevet i eksempel 2. ;Eksempel 26: 3- metoksvetvlester av gangliosidet G^ ;2-metoksyetylesteren av GM1 fremstilles og isoleres på samme måte som for metylesteren i eksempel 1, idet man imidlertid anvender 2-metoksyetanol og natrium-2-metoksyetylat i stedet for metylalkohol og natrium-metylat og oppvarmer på vannbad, og anvender de samme molare mengder av indre ester og natrium-2-metoksyetylat som i eksempel 1. Vasking av Dowex-harpiksen ;utføres med 2-metoksyetyl-alkohol, og det residuum som oppnåes ved inndampning av den filtrerte substans, oppløses i 50 ml metylenklorid/2-metoksyetanol 1:1. Utbytte av råprodukt er 4,9 g. Rensning utføres også som i eksempel 1. Utbytte av den rensede 2-metoksyetylester av -gangliosid: 4,3 g. ;IR-spektroskopi-undersøkelse på KBr-pellets viser det typiske ester-bånd ved 1750 cm _ i Kromatografisk analyse av produktet utført på samme måte som i eksempel 1, viser tilstedeværelse av en enhetlig forbindelse med en Rf-verdi på 0,77 og fravær av G^-gangliosidet og dets indre ester (Rf-verdier henholdsvis 0,65 og 0,75). Hydrolyse med ^£00^. som beskrevet i eksempel 1, gir gangliosidet GM1. ;Eksempel 27:. Blanding av 2- metoksvetvlestere av en blanding av gangliosider ;Blandingen av 2-metoksyet.ylestere fremstilles og isoleres på samme måte som for blandingen av metylestere i eksempel 2, idet man imidlertid anvender 2-metoksyetanol og natrium-2-metoksy-etylat i stedet for etylalkohol og natrium-metylat og oppvarmer på vannbad, og anvender 5 g av en blanding av indre estere og 574,9 mg (5,86 mM) natrium-2-metoksyetylat. Vasking av Dowex-harpiksen utføres med 2-metoksyetylalkohol, og det residuum som oppnåes ved inndampning av den filtrerte substans, oppløses i 50 ml kloroform/etanol 1:1. Utbytte av råprodukt er 5,2 g. Rensning utføres også som i eksempel 2. ;IR-spektroskopi-undersøkelse på KBr-pellets viser det typiske ester-bånd ved 1750 cm 1. Ved kromatografi på silikagel-plater med en nylig tillaget oppløsning av kloroform/metanol/- hydroksyd av tetrametylammonium 1M 55:45:10 og bestemmelse med Ehrlich-reagens viser produktet en Rf-verdi på 0,51-0,7.8 (gangliosid-blanding 0,20-0,60). Fullstendig transforestring vises på samme måte som beskrevet i eksempel 2. ;Eksempel 28: 1- metoksy- 2- propvlester av gangliosidet G^^ ;1-metoksy-2-propyl-esteren av G^ fremstilles og isoleres på samme måte som for metylesteren i eksempel 1, idet man imidlertid anvender 1-metoksy-2-propanol og natrium-1-metoksy-2-propylat i stedet for metylalkohol og natrium-metylat og oppvarmer på ;vannbad, og anvender de samme molare mengder av indre ester og natrium-1-metoksy-2-propylat som i eksempel 1. Vasking av Dowex-harpiksen utføres med 1-metoksy-2-propylalkohol, og det residuum som oppnåes ved inndampning av den filtrerte substans, oppløses i 50 ml metylenklorid/1-metoksy-2-propanol 1:1. Utbytte av råprodukt er 4,9 g. Rensning utføres også som i eksempel 1. Utbytte av den rensede 2-metoksyetylester av -gangliosid: 4,2 g. ;IR-spektroskopi-undersøkelse på KBr-pellets viser det typiske ester-bånd ved 1750 cm<-1>. Kromatografisk analyse av produktet utført på samme måte som i eksempel 1, viser tilstedeværelse av en enhetlig forbindelse med en Rf-verdi på 0,81 og fravær av GM1-gangliosid og dets indre ester (Rf-verdier henholdsvis 0,65 og 0,75). Hydrolyse med Na2C03 som beskrevet i eksempel 1, gir gangliosidet GM1. ;Eksempel 29: Blanding av 1- metoksv- 2- propvlestere av en blanding av gangliosider ;Blandingen av 1-metoksy-2-propylestere fremstilles og isoleres på samme måte som for blandingen av metylestere ifølge eksempel 2, idet man imidlertid anvender 1-metoksy-2-propanol og natrium-1-metoksy-2-propylat i stedet for metylalkohol og natrium-metylat og oppvarmer på vannbad, og anvender 5 g av en blanding av indre estere og 657,0 mg (5;86 mM) natrium-1-metoksy-2-propylat. Vasking av Dowex-harpiksen utføres med 1-metoksy-2-propylalkohol, og.det residuum som oppnåes ved inndampning av den filtrerte substans, oppløses i 50 ml koroform/etanol 1:1. Utbytte av råprodukt er 5,2 g. Rensning utføres også som i eksempel 2. Utbytte av blanding av rensede estere: 4,3 g. ;IR-spektroskopi utført på KBr-pellets viser det typiske ester-bånd ved 1750 cm 1. Ved kromatografi på silikagel-plater med en nylig tillaget oppløsning av kloroform/metanol/hydroksyd av tetrametylammonium 1M 55:45:10 og bestemmelse med Ehrlich-reagens viser produktet en Rf-verdi på 0,52-0,80 (gangliosid-blanding 0,20-0,60). Fullstendig transforestring vises på samme måte som beskrevet i eksempel 2. ;Som omtalt ovenfor skyldes den terapeutiske virkning av gangliosider og noen derivater, såsom derivatene fremstilt ifølge den foreliggende oppfinnelse, en stimulering av nervecellens utskytningsfenomen, og på grunn av dette er det mulig å oppnå en bedring av nerveimpuls-ledning. For eksempel forårsaker admini-strasjon in vivo av en gangliosid-blanding som fåes fra bovin hjerne som beskrevet i eksempel 2 (GA-blanding), utskytning av isjias-nerven hos rotter etter knusning, og kan derfor hjelpe på bedringen av nervens elektriske aktivitet på det neuromuskulære forbindelsesplan. ;Siden neuritt-utskytning kan betraktes som en lokalisert neuronal differensiering, ble de biokjemiske mekanismer ved hvilke gangliosid-molekyler frembringer denne virkning, undersøkt på basis av deres virkning på cellulær differensiering, idet man anvendte cellekulturer in vitro av pheocromocytoma PC^-Tilsetning av gangliosider til nervevekst-faktor (NGF), som frembringer differensiering hos PC12-celler, i PCj2_kultur-mediet stimulerer neuronal-utskytning. Denne virkning kan skyldes inkorporering av gangliosider i neuron-membranen, som frembringer en modifikasjon av dens funksjonelle egenskaper, dvs. de enzymatiske aktiviteter. Inkorporering av gangliosider i neuron-membranen kan faktisk stimulere aktiviteten av (Na<+>, K<+>)-ATPase. For fremhevelse av betydningen av aktiveringen av dette enzym forbundet med membranen, bør man huske at noen forfattere fører neuron-cellers overlevelse og følgelig deres differensiering i kultur tilbake på en aktivering av dette enzym med NGF. På den annen side er den nøkkelrolle som dette enzym stiller når det gjelder elektrisk aktivitet, velkjent, siden det medvirker i den ionemekanisme som inngår ved forplantning av nerveimpulser langs axon-mcmbranen. ;På basis av de fremgangsmåter som er beskrevet ovenfor, ble det utført bestemmelser av de farmakologiske aktiviteter uttrykt ved neuritt-utskytning i PC^2~cellene for de nye gangliosid-derivater fremstilt ifølge den foreliggende oppfinnelse. Oppnådde resultater med (Na<+>, K<+>)-ATPase in vitro for noen derivater er også rapportert. ;Virkninger av gangliosid- derivater på neuribt— utskytning i PC1^-celler ;PC12-celle-linjen (som stammet fra en subklon 1A) ble levert av Dr. P. Calissano (C.N.R. Laboratory of Cellular Biology - Rome). ;Cellene (100 000 pr. plate) holdes ved 37°C i en inkubator av typen "Heraeus" (5 % C02 og 95 % fuktig luft) og utsåes på nytt på 60 mm plater av typen "Falcon Integrid" på en kollagen-bærer i nærvær av det følgende virkningsmedium: 85 % RPM 1640 ("Gibco"), 10 % varme-inaktivert hesteserum, 5 % føtalt kalve-serum ("Gibco"), 50 U/ml penicillin og 25 mg/ml streptomycin. Cellene vaskes deretter tre ganger i en serumfri bærervæske. Etter tre vaskinger inkuberes cellene i en serumfri bærervæske med 50 ng/ml NGF og med gangliosid-derivatet fremstilt ifølge oppfinnelsen eller med gangliosid-blandingen som anvendes som sammenligning ved konsentrasjoner på 10 *M. Tilsetningen av den serumfrie bærervæske med NGF (50 ng/ml) har den virkning at cellenes formering avbrytes, det dannes neuritter og man oppnår differensieringen så tidlig som den tredje dag. Denne virkning vurderes ved at man teller antallet celler med neuritter på den tredje dag.

Resultatene er oppført i den følgende tabell 1, idet man som sammenligningsverdier anvender verdier oppnådd med gangliosid-blanding oppnådd ifølge den fremgangsmåte som er beskrevet i eksempel 2 og enkelt-monosialogangliosid-fraksjonen GM1. Virkninger av gangliosid- derivater på ( Na—, K~)- ATPase hos neuron- membranen a. Fremstilling av. rå-mitokondrie fraksjonen av rottehjerne (fraks jon P2): Den fremgangsmåte som ble anvendt ved fremstilling av P2~ fraksjoner, ble tatt fra Morgan e coil., Biochem. Biophys. Acta 241, 37 (1971). (De forskjellige operasjoner ble utført ved 0-4°C; xg-verdiene er de gjennomsnittlige sentrifugal-krefter).

Voksne hannrotter av typen Sprague Dawley (levert av Charles River) (kroppsvekt 150-175 g) ble halshugget, og hjernene fra disse ble straks fjernet og vasket i en iskald isoton oppløsning. Etter fjerning av lillehjernen ble hjernene homogenisert ved at man utførte 12 opp-ned-bevegelser i en motordrevet homogenisator av glass og Teflon (erklært radial klaring 0,25 mm; 800 r.p.m.) ved anvendelse av 4 volumdeler homogeniseringsoppløsning (0,32M sakkarose inneholdende 1 mM kaliumfosfat-buffer og 0,1 nM dinatrium-EDTA, pH 7,27). Den homogeniserte substans, filtrert gjennom fire lag fin gas, ble sentrifugert ved 1000 r.p.m. i 15 minutter. Den resulterende pellet ble vasket med det samme begynnelsesvolum av homogeniseringsoppløsning og sentrifugert som beskrevet ovenfor. De samlede supernatanter ble sentrifugert ved 17 500 r.p.m. i 25 minutter (disse gravitasjons-sentrifugal-krafts-betingelser ble anvendt for oppnåelse av maksimal an-rikning av nerveender i fraksjonen), og pelleten ble vasket fire ganger i 9 volumdeler (hver gang) homogeniseringsoppløsning og sentrifugert (17 500 r.p.m. i 25 minutter).

Slutt-pelleten, kjent som "P2~fraksjon", inneholder som

sin hovedkomponent hele mitokondrier og nerveender. Slutt-pelleten ble homogent resuspendert med et passende volum homogeniseringsoppløsning med en homogenisator av glass og Teflon og anvendt straks for testen. For inngåelse av inkonsekvens som skyldes konservering av materialet ble friske P2~fraks joner fremstilt før hver bruk. Preparatene av ?2_fraks joner hadde et gangliosid-innhold på bundet 33,9±2,8 (S.D.) n-mol sialinsyre pr. mg protein.

b. Aktivering av ATPase-enzymet:

ATPase-aktiviteten ble målt ved spektrofotometri i henhold til Wallick and coil. [J. Pharm. Exptl. Therap. 189, 434, ( 1974)]. Dersom ikke annet.er angitt, består reaksjonsblandingen av: 50 mM sakkarose, 0,2 mM dinatrium-EDTA (regulert til pH 7,4), 100 mM NaCl, 5 mM MgCl0, 10 mM KC1, 2 mM monokaliumsalt f osf o (enol) pyruvat (PEP) (regulert, til pH 7,4), 3 mM ATP, 50 mM TRIS-HC1 pH 7,4, 0,33 mM NADH, pyruvat-kinase (PK) (30 g/ml) og laktat-dehydrogenase (LDH) (10 g/ml) i et sluttvolum på 3 ml og med en slutt-pH på 7,2. Reaksjonen startes ved tilsetning av 50-75 pg (som protein) av refraksjonen. (Na , K ^ATPase-aktiviteten bestemmes ved forskjellen mellom den totale ATPase-aktivitet og den underordnede ATPase-Mg^<+->aktivitet målt i nærvær av 3 x 10 _ 5M Ouabain. Den tid som trengtes for hver enkelt test, var 3-5 minutter. ATPase-aktiviteten ble uttrykt som International Unit (I.U.) (pmol hydrolysert ATP/mg protein/min.). Gangliosid-derivatenes (50 nM) aktivitet ble dosert ved at man utførte inkubering med neuron-membranene ved 37°C i 2 timer.

Resultatene av sammenlignings-undersøkelsene av ATPase-aktiviteten er oppført i tabell 2.

Det skal bemerkes at gangliosid-derivatene fremstilt ifølge

den foreliggende oppfinnelse har en mer langvarig virkning i tid sammenlignet med gangliosider og er derfor egnet som "retard"-medikamenter. Dette fenomen er for eksempel illustrert ved de følgende forsøk angående absorpsjons-kinetikken hos gangliosid-estere.

Gangliosid- derivaters fordeling i blod in vivo

Merket gangliosid fremstilles som beskrevet av Suzuki et al.

[J. Lipid Res. 13, 687-690 (1972)] og modifisert av Ghidoni et al. [Ital. J. Biochem. 23, 320-328 (1974)]. Etyl- og isopropyl-esterne fremstilles ved forestring av dette merkede gangliosid. Den spesifikke radioaktivitet måles både for gangliosidet og esterne.

Sveitsiske mus levert fra Charles River (Calco) som veide ca. 20-25 g, ble behandlet intravenøst med 10 pC av produktene. 2-4-8-12-16 timer etter innsprøytningen ble dyrene avlivet ved halshugging og blodet ble oppsamlet i hepariniserte kolber. Den ikke-flyktige radioaktivitet ble bestemt på blodprøver ved hjelp av en scintillator av typen "Packard TRICARB" og deretter identifisert under referanse til <3>H-gangliosid og til esterne ved

TLC.

Etter intravenøs innsprøytning av tritiert gangliosid var kinetikk-kurven bifasisk, idet den avtok med en halveringstid på ca. 3 timer fulgt av en fase med langsom eliminering som forblir konstant inntil den 16de time. Med etyl- og isopropyl-esteren av GM1~gangliosid når ikke de produktnivåer som identifiseres i begynnelsen, ikke det maksimum som observeres for naturproduktet, men med tiden når de høyere maksima og forblir lenger på disse nivåer. På denne måte er det en økning i fordelingsvolumet og en økning i opprettholdelsestiden for de terapeutiske doser.

På grunn av de farmakologiske egenskaper som er beskrevet ovenfor, kan gangliosid-derivatene fremstilt ifølge den foreliggende oppfinnelse anvendes som legemidler ved forskjellige terapier for behandling av nervesystem-sykdommer, spesielt terapier for de perifere nerver og sentralnervesystemet.

De gangliosid-derivater som er nevnt spesielt ovenfor, såsom gangliosid-derivat-gruppene A og B og slike som er spesifisert detaljert, og administrering av alle disse derivater i de doser som er angitt i det følgende, kan anvendes terapeutisk. Mer spesielt kan disse gangliosid-derivater anvendes i terapien av sykdommer i det perifere nervesystem av traumatisk, kompressiv, generativ eller toksisk-infeksiøs opprinnelse, hvor det er nødvendig å stimulere nerve-fornyelse og hellbredelse av neuro-muskulær funksjon og ved sykdommer i sentralnervesystemet av traumatisk, anoksisk, degenerativ eller toksisk-infeksiøs opprinnelse hvor det er nødvendig å stimulere neuron-utskytnings-forholdene for oppnåelse av funksjonell hellbredelse. Gangliosid-derivatene fremstilt ifølge den foreliggende oppfinnelse har på grunn av sin retard-effekt en klar fordel fremfor gangliosidene selv, som inntil nå har vært de legemidler som er anvendt i de tilfeller som er angitt ovenfor.

Administrerings-doseringen vil avhenge av den ønskede virkning og av den valgte administreringsmåte. Administreringen utføres vanligvis intramuskulart, subkutant, intravenøst, intradermalt eller pulmonalt, fortrinnsvis i en passende bufret vandig bærervæske. Den farmasøytiske form for konservering av substansen kan i dette tilfelle være ampuller som inneholder oppløsninger av derivatet, eventuelt med andre hjelpebestand-deler, som beskrevet for de farmasøytiske preparater fremstilt ifølge den foreliggende oppfinnelse. For terapeutisk eller eventuelt også profylaktisk anvendelse på den ovennevnte parenterale måte kan doseringen variere fortrinnsvis mellom 0,05 og 5 mg aktiv substans pr. kg kroppsvekt pr. dag og særlig mellom 0,05 og 2 mg pr. kg kroppsvekt pr. dag.

Skjønt de nye terapeutiske anvendelser er generelt egnet for alle sykdommer som er forbundet med ledning av nerve-stimuli i det sentrale og perifere nervesystem, er de følgende spesifikke sykdommer av spesiell interesse: retrobulbær optisk neuritt, paralyse av okulomotornervene, trigeminus-neuritt, Bells paralyse og paralyse av ansiktsnerven, Garcins syndrom, radiculitt, traumatiske skader på de perifere nerver, diabetisk og alkoholisk polyneuritt, obstetrisk paralyse, paralytisk isjias, motoneuron-sykdommer, myelopatisk muskulær amyotrofisk-atrofisk lateral sklerose, progressiv bulbær paralyse, alvorlig myasteni, Lambert Eatons syndrom, muskulær dystrofi, forringelse av synaptisk nerveimpuls-overføring i CNS og PNS og svekkelse i bevisstheten såsom forvirrings-tilstander, hjernerystelse, trombose og emboli.

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en gangliosid-ester eller en acylert gangliosid-ester, karakterisert ved at man behandler en indre ester av et gangliosid eller en blanding derav med en alkohol, under vannfrie betingelser i et inert løsningsmiddel, eventuelt i nærvær av et metallisk alkoholat, fortrinnsvis et alkalimetall-alkoholat, svarende til nevnte alkohol, for å danne den tilsvarende ester på karboksylsyre-gruppene i sialinsyre-restene i den indre gangliosid-ester eller blandingen derav, og eventuelt behandler man den fremstilte gangliosid-ester med et acyleringsmiddel, fortrinnsvis en alifatisk Ci_in-karboksylsyre eller en aromatisk karboksylsyre valgt fra gruppen bestående av benzosyre og dens derivater substituert med metyl-, hydroksyl-, amin- eller karboksy-grupper, spesielt et acyleringsmiddel valgt fra gruppen bestående av eddiksyre, propionsyre, smørsyre, maleinsyre og ravsyre, eller anhydrider derav, i nærvær av en base, fortrinnsvis et tertiært amin, for å danne en acylert gangliosid-ester.

2. Fremgangsmåte ifølge krav l, karakterisert ved at det som alkohol anvendes en alifatisk alkohol med maksimalt 12 karbonatomer, eller en aralifatisk alkohol med bare én benzenring og maksimalt 4 karbonatomer i den alifatiske kjede, eller en heterocyklisk alkohol med maksimalt 12 karbonatomer og bare én heterocyklisk ring som inneholder et heteroatom valgt fra gruppen bestående av N, S og 0 eller en alicyklisk eller alifatisk-alicyklisk C^. ^-alkohol, fortrinnsvis en alkohol som er valgt fra gruppen bestående av metyl-, etyl-, propyl-, isopropyl-, n-butyl-, isobutyl-, tert.-butyl-, undecyl-, hydroksydecyl-, heptyl-, 2-metyl-l-pentyl-, allyl-, etoksykarbonylmetyl-, metoksyetyl-, 1-metoksy-2-propyl-, benzyl-, fenetyl-, cykloheksyl-, mentyl-, tetrahydro-furfuryl- og tetrahydropyranyl-alkoholer.