PL151289B1 - New ganglioside derivatives - Google Patents

Description

RZECZPOSPOLITA OPIS PATENTOWY 151 289

POLSKA

Patent dodatkowy do patentu nr-Zgłoszono: 85 06 27 (P. 254207)

Int. Cl.⁵ C07H 3/06 //A61K 37/22

Pierwszeństwo: 84 07 03 Włochy

URZĄD

PATENTOWY

RP

Zgłoszenie ogłoszono: 87 02 09

Opis patentowy opublikowano: 1990 12 31

CZ * LNI A

Twórca wynalazku--Uprawniony z patentu: FIDIA S.p.A.,

Abano Terme (Włochy)

Sposób wytwarzania nowych estrów gangliozydów

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych estrów gangliozydów.

Gangliozydy są produktami naturalnymi, zawartymi w różnych tkankach lub narządach zwierzęcych, przede wszystkim w tkance ośrodkowego układu nerwowego i obwodowego układu nerwowego, ale także w rdzeniu nadnerczy, w erytrocytach, w śledzionie i tam wszędzie, skąd można je wyekstrahować w postaci oczyszczonej. Jest możliwe ustalenie podstawowej struktury większości tak otrzymanych gangliozydów. Są to glikosfingolipidy, to znaczy związki powstałe w wyniku połączenia oligosacharydu ze sfingozyną i pewną ilością kwasów sjalowych, związanych ze sobą wiązaniami glikozydowymi lub ketozydowymi. Gangliozydy, dotychczas opisane w piśmiennictwie i otrzymane w postaci oczyszczonej, nie przedstawiają sobą jednolitych związków chemicznych, z wyjątkiem, prawdopodobnie, ich części sacharydowej /oligosacharyd/, ponieważ składniki ceramidowe i sjalowe są w pewnych granicach całkowicie zmienne. Toteż, nawet wtedy, kiedy określa się je mianem „czystych gangliozydów, wyrażenie to należy interpretować w sposób szeroki i rozumieć przez to związki typu gangliozydu, w których co najmniej część związku, na przykład część sacharydowa, jest jednolita i charakterystyczna z chemicznego punktu widzenia.

Załączony wzór ogólny 1 przedstawia w sposób ogólny wszystkie struktury gangliozydów dotychczas otrzymywanych w postaci oczyszczonej i który uwydatnia grupy funkcyjne, modyfikowane pod względem ich funkcjonalności, sposobem według wynalazku. We wzorze tym, reszta oligosacharydowa, utworzona przez najwyżej 5 monosacharydów, jest połączona wiązaniem glikozydowym i resztą ceramidową, oraz z jedną, lub więcej niż jedną, resztą kwasu sjalowego, przy czym reszty te przyłączone są taką samą ilością bezpośrednich wiązań glikozydowych, jak i jednym, lub więcej niż jednym wiązaniem tego rodzaju, gdy pozostałe reszty połączone są między sobą wiązaniami ketozydowymi. Wzór 1 pokazuje grupy hydroksylowe w części sacharydowej, oraz grupy hydroksylowe kwasów sjalowych i ceramidu, jak również wyżej wspomniane wiązania glikozydowe z kwasami sjalowymi i ceramidem, a także grupy karboksylowe kwasów sjalowych. Kwasy sjalowe, które tworzą część gangliozydów o wzorze 1 mają wzór ogólny 2, w którym jedna, lub więcej pierwszorzędowych i drugorzędowych grup hydroksylowych może być także zacylowa2

151 289 nych, i w którym grupy acylowe pochodzą od kwasu octowego lub kwasu glikolowego. Ilość kwasów sjalowych występujących w gangliozydach zazwyczaj waha się od 1 do 5.

Reszty kwasu sjalowego związane są z oligosacharydem wiązaniem ketozydowym utworzonym między grupą hydroksylową oligosacharydu. Gdy związanych ze sobą jest kilka kwasów sjalowych, cząsteczki ich połączone są ze sobą za pomocą wiązań ketozydowych, utworzonych między dwiema grupami hydroksy- w pozycjach 2 i 8 dwóch cząsteczek kwasu sjalowego. Kwasy sjalowe występujące w gangliozydach, włączając w to gangliozydy oczyszczone jak wyżej opisano, stanowią mieszaniny różnych chemicznie jednolitych kwasów, takich jak kwas N-acetyloneuraminowy i N-glikoliloneuraminowy, w których pierwszy przeważa, oraz, przypuszczalnie, jednej, lub więcej pochodnych O-acylowych tych kwasów, takich jak pochodna 8-0-acylowa.

Gangliozydy znajdują się w naturze w postaci soli metali, takich jak sole sodu, a to w rezultacie utworzenia soli przez karboksylową grupę funkcyjną /karboksylowe grupy funkcyjne/ kwasów sjalowych. Gangliozydy w postaci wolnej można łatwo otrzymać za pomocą podziałania na sole, takie jak sole sodu, kwaśnym jonitem, używając np. żywicy takiej jak Dowex AG 50x8 forma H⁺.

Reszta ceramidowa w gangliozydach o wzorze 1 na ogół stanowi resztę jednej z Nacylosfingozyn o wzorze 3 lub 4, w których to wzorach n oznacza liczbę całkowitą od 10 do 16, a reszta acylowa pochodzi od nasyconego lub nienasyconego kwasu tłuszczowego o 16-22 atomach węgla, albo odpowiedniego hydroksykwasu.

Oligosacharyd zbudowany jest z nie więcej niż 5 monosacharydów lub ich pochodnych z grupą acyloaminową, a zwłaszcza z heksoz i ich pochodnych wyżej wspomnianego typu. W oligosacharydzie obecna jest jednakże co najmniej jedna cząsteczka glukozy lub galaktozy. Resztą najczęściej występującą w acyloaminowej pochodnej wspomnianych cukrów jest N-aetylogalaktozamina lub N-acetyloglukozamina.

Wzór 5, podany w celu lepszego zilustrowania struktury gangliozydów objętych wzorem 1, a zwłaszcza charakteru wiązań między częściami sacharydowymi, kwasami sjalowymi i ceramidem, przedstawia „czysty gangliozyd Gmi zawierający tylko jeden kwas sjalowy, pokazany tu jako kwas N-acetyloneuraminowy względnie kwas N-glikoliloneuraminowy.

Jest rzeczą dobrze znaną, że gangliozydy pełnią ważną funkcję w układzie nerwowym. Ostatnio wykazano, że są one użyteczne w leczeniu stanów patologicznych obwodowego układu nerwowego. Jak się wydaje, terapeutyczne działanie gangliozydów przede wszystkim związane jet ze stymulowaniem tworzenia przez komórkę nerwową wypustek oraz zaktywowaniem enzymów błon, zaangażowanych w przewodzeniu impulsów nerwowych, takich jak enzym /Na⁺, K⁺/ ATPaza. Tworzenie wypustek przez neurony, pobudzane przez gangliozydy, sprzyja odzyskaniu funkcji przez uszkodzoną tkankę nerwową.

Prowadząc badania działania terapeutycznego gangliozydów i ich pochodnych dla leczenia stanów patologicznych układu nerwowego stwierdzono, że estry wewnętrzne gangliozydów, w których jedną, lub więcej grup hydroksylowych zestryfikowano jedną, lub większą ilością grup karboksylowych kwasów sjalowych /reakcja wewnątrzcząsteczkowa/ z utworzeniem odpowiedniej ilości pierścieni laktonowych, wykazują aktywność wyższą od aktywności samych gangliozydów, jeśli chodzi o pobudzanie tworzenia wypustek przez neurony oraz aktywowanie enzymów błon zaangażowanych w przewodzeniu impulsów nerwowych, takich jak enzym /Na⁺, K⁺/ ATPaza /związki te są opisane w opisie patentowym St. Zjedn. Am. nr 4 476 119/.

Sposobem według wynalazku otrzymuje się inne, nowe estry gangliozydów, które są korzystniejsze od gangliozydów jako takich, a to dlatego, że pochodne te wykazują aktywność przedłużoną w czasie /efekt „opóźnienia/. Związki te stanowią pochodne, w których grupy karboksylowe kwasów sjalowych są zmodyfikowane pod względem ich funkcjonalności przez ich zestryfikowanie.

Dwa estry metylowe z grupą karboksylową kwasu sjalowego gangliozydów opisali Mac Donald i wsp. w artykule „Notes on improved procedures for the Chemical modification and degradation of glycosphyngolipids w Journal of Lipid Research, 21,642-645 /1980/. Związki te są estrami metylowymi gangliozydów Gmi i Gm3 [skróty używane w niniejszym opisie do identyfikowania gangliozydów są skrótami zaproponowanymi przez Svennerholma w J. Neurochem., 10,610 /1963/]. Jednakże, Mac Donald i wsp. nie donieśli o jakiejkolwiek biologicznej aktywności tych związków.

151 289

Spośród znanych sposobów wytwarzania estrów kwasów karboksylowych można wspomnieć o takich, których używa się do otrzymania już znanych estrów metylowych gangliozydów Gmi i Gm3, opisanych w wyżej wspomnianym artykule zamieszczonym w Lipid Research, 21, 642-645 /1980/. Zgodnie z tym artykułem, możliwe jest zestryfikowanie grup karboksylowych gangliozydów za pomocą poddania ich reakcji z alkoholem, którego ester ma być wytworzony, w obecności jonitu, np. żywicy takiej jak Dowex 50. Wydajność ogranicza jednoznaczne tworzenie się estrów wewnętrznych, a także dłuższy czas reakcji /2-3 dni/.

Tego samego sposobu używa się np. także w powyżej wspomnianym artykule zamieszczonym w Methods of Enzymology, 50, 137-140 /1978/ w celu wytworzenia estrów metylowych gangliozydu Gm3. Tego rodzaju częściową estryfikację można także łatwo uzyskać, aczkolwiek z odpowiednio niższą wydajność, w nieobecności żywicy. Niezależnie od żywicy Dowex 50, można także zastosować i inne kwaśne jonity, wykazujące czynność przekształcania gangliozydów, które, jak to stwierdzono w powyższej części niniejszego opsiu, występują na ogół, a zwłaszcza w ekstraktach, w postaci soli, w szczególności soli sodowych, w gangliozydy wolne.

Najkorzystniejszy z powyższych sposobów polega na zestryfikowaniu grupy karboksylowej, lub grup karboksylowych, obecnych w gangliozydach za pomocą przepuszczania alkoholowego roztworu pożądanego alkoholu przez złoże żywicy, takiej jak Dowex 50-W-8 /100-200 mesh /forma H⁺/, a następnie poddania eluatu, rozpuszczonego w takim samym alkoholu, działaniu odpowiedniego diazometanu. W szczególnym, opisanym przypadku, estry gangliozydów Gmi i Gm3 otrzymano z zastosowaniem do tego procesu metanolu i dwuazometanu, z uzyskaniem bardzo dobrej wydajności.

Inny sposób wytwarzania gangliozydów o zestryfikowanych grupach karboksylowych polega na poddaniu metalicznych soli gangliozydów działaniu środka eteryfikującego. Używa się tu soli metali alkalicznych lub metali ziem alkalicznych,a także soli z jakimkolwiek innym metalem. Jako środka eteryfikującego można użyć dowolnego środka eteryfikującego znanego z tej aktywności i opisanego w piśmiennictwie, w szczególności użyć można estrów różnych kwasów nieorganicznych lub organicznych kwasów sulfonowych, takich jak kwasy beztlenowe, innymi słowy, mogą to być chlorowcopochodne węglowodorów, takie jak jodek metylu lub jodek etylu itd., obojętne lub kwaśne siarczany węglowodorów, siarczyny, węglany, krzemiany, fosforyny lub sulfoniany węglowodorów, takie jak benzo- lub p- toluenosulfonian metylu albo chlorosulfonian metylu lub etylu. Reakcję prowadzić można w środowisku odpowiedniego rozpuszczalnika, takiego jak alkohol, korzystnie w środowisku rozpuszczalnika, który odpowiada grupie alkilowej wprowadzonej do grupy karboksylowej. Jednakże, można tu użyć także rozpuszczalników niepolarnych, takich jak ketony i etery/ takie, jak dioksan czy dwumetylosulfotlenek/.

Sposobem według wynalazku wytwarza się nowy ester gangliozydu, w którym grupy karboksylowe reszt kwasu sjalowego są zestryfikowane resztami alkoholowymi, przedstawiony wzorem 10, w którym n oznacza liczbę całkowitą 1-5, a R oznacza rodnik alkilowy o 1-13 atomach C, ewentualnie podstawiony rodnikiem alkoksylowym o 1-4 atomach C, hydroksylowym, cyjanowym, fenylowym, cykloalkilowym o 3-6 atomach C, alkoksykarbonylowym o 1-4 atomach C, tienylowym lub dimetylofenylowym, rodnik alkenylowy o 2-10 atomach C, -alkinylowy o 2-6 atomach C, fenylowy, -cykloalkilowy o 3-8 atoamch C, nikotynylowy, izobornylowy, mentylowy, tetrahydrofurfurylowy, tetrahydropiranylowy lub cyjanobutyrylowy z wyjątkiem estru metylowego gangliozydu Gmi, G_M2, G_M3 lub G_Di_a.

Sposób ten polega na tym, że poddaje się ester wewnętrzny wyżej wymienionego gangliozydu lub mieszaninę estrów wewnętrznych gangliozydów, ewentualnie w postaci ich soli z metalami alkalicznymi, reakcji z alkoholem o wzorze ROH, w którym R ma wyżej podane znaczenie, ewentualnie w obecności alkoholanu metylu, odpowiadającemu temu alkoholowi.

Jako alkohol stosuje się korzystnie alkohol metylowy, etylowy, propylowy, izopropylowy, n-butylowy, izobutylowy, III-rzęd. butylowy, undecylowy, hydroksydecylowy, heptylowy, 2-metylo-l-pentylowy, allilowy, etoksykarbonylometylowy, etoksykarbonyletylowy, metoksyetylowy, l-metoksy-2-propylowy, benzylowy, fenetylowy, cykloheksylowy, cykloheksyloetylowy, hydrofurfurylowy, tetrahydropiranylowy i cyjanobutyrylowy.

Reakcję powyższą można prowadzić w temperaturze odpowiadającej temperaturze wrzenia alkoholu. Można zastosować także niższą temperaturę, ale w tym przypadku czas reakcji jest

151 289 dłuższy. Można także, jednak rezygnując z bardzo dobrej wydajności i krótkiego czasu reakcji, poddać ester wewnętrzny działaniu dopiero co wymienionego alkoholu, korzystnie w temperaturze odpowiadającej temperaturze wrzenia tego alkoholu.

Estry wewnętrzne zastosowane jako substraty opisane są w wyżej wspomnianym belgijskim opisie patentowym nr894024 i opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr4476 119.

Jako alkoholany stosuje się korzystnie alkoholany alkaliczne, zwłaszcza alkoholany sodowe.

Poniżej przedstawiono wyjaśnienia dotyczące gangliozydów stosowanych jako związki wyjściowe w sposobie według wynalazku.

A. Gangliozydowe związki wyjściowe.

Wszystkie gangliozydy, które stanowią materiały wyjściowe dla czynnych pochodnych wytwarzanych sposobem według wynalazku, można wyekstrahować z różnych narządów i tkanek zwierzęcych, a w szczególności tkanki ośrodkowego układu nerwowego i obwodowego układu nerwowego, np. mózgu, płynu mózgowo-rdzeniowego, mięśni, osocza i surowicy krwi, nerek, nadnerczy, wątroby, śledziony, jelita oraz erytrocytów lub leukocytów. Wyjściowymi gangliozydami mogą być również oczyszczone gangliozydy opisane w piśmiennictwie, np. gangliozydy ekstrahowane z tkanek i narządów kręgowców, w szczególności ssaków, takich jak człowiek, bydło cielę, szczur, mysz, względnie z drobnoustrojów.

Sposobem według wynalazku, tego rodzaju związki gangliozydowe modyfikuje się w drodze ich estryfikacji.

Estry stanowiące nowe pochodne wytwarzane sposobem według wynalazku, są to, w szczególności, jednoestry w przypadku jednosjalogangliozydów, oraz wieloestry w przypadku wielosjalogangliozydów, z tyloma grupami estrowymi, ile grup karboksylowych występuje w cząsteczce, a więc ile reszt kwasu sjalowego jest obecnych.

Estry gangliozydów można wytwarzać sposobem według wynalazku za pomocą estryfikacji „oczyszczonych, indywidualnie scharakteryzowanych gangliozydów, albo na drodze estryfikacji mieszaniny gangliozydów, takiej jak mieszanina jednosjalogangliozydów i wielosjalogangliozydów. W przypadku mieszanin, które stosuje się jako substancje wyjściowe w sposobie według wynalazku, takie jak mieszanina opisana w poniższym przykładzie III, zawierająca tak jednosjalogangliozydy jak i wielosjalogangliozydy, modyfikacji ulegają wszystkie grupy karboksylowe, w wyniku czego uzyskuje się pochodne całkowicie zestryfikowane. Toteż określenie „estry stosowane w niniejszym opisie należy interpretować w ten sposób, że chodzi tu o substancje całkowicie zestryfikowane. Znajduje to szczególne zastosowanie w przypadku pochodnych z poniżej podanych przykładów objaśniających, gdzie określa się je po prostu jako „estry. Określenie to oznacza mieszaniny zawierające wielosjalogangliozydy, których wszystkie grupy karboksylowe zostały całkowicie zestryfikowane.

Wynalazek obejmuje swym zakresem sposób wytwarzania estrów gangliozydów, czy to wywodzących się z pojedynczego „oczyszczonego gangliozydu, czy też z mieszaniny gangliozydów. Dalej, wynalazek obejmuje swym zakresem sposób wytwarzania estrów, otrzymanych z gangliozydów o różnych strukturach, zwłaszcza, że struktura gangliozydu może się zmieniać pod względem ilości i rodzaju reszt kwasu sjalowego, reszty ceramidowej lub reszty oligosacharydowej.

Co się tyczy ich budowy, podstawowe wyjściowe gangliozydy mogą to być jednosjalo-, dwusjalo-, trójsjalo-, czterosjalo-, lub pięciosjalogangliozydy, przy czym korzystnymi kwasami sjalowymi są: kwas N-acetyloneuraminowy i kwas N-glikoliloneuraminowy.

Część ceramidowa może się zmieniać w sposób omówiony w powyższej części niniejszego opisu, ale także pod względem długości łańcuchów węglowych sfingozyn, stanowiących część ceramidu i zmiany te sięgają od 16 do 22 atomów węgla. Poza tym, długość którejkolwiek z reszt acylowych także może się zmieniać, w szczególności w tym samym zakresie, od 16 do 22 atomów węgla. Niezależnie od tego, reszta ceramiczna może być zmienna pod tym względem, że może zawierać, albo nie zawierać podwójnego wiązania sfingozyny i zazwyczaj reszta ta przeważnie jest złożona z nienasyconej N-acylowanej sfingozyny z niewielkim procentowym udziałem odpowiedniego związku nasyconego, którego zawartość może jednak sięgać około 10%. Grupa acylowa może także pochodzić od alifatycznych hydroksykwasów, o wyżej wspomnianej ilości atomów węgla, wahającej się od 16 do 22. Szczególnie ważną grupę tworzą gangliozydy zawierające, w reszcie ceramidowej, zacylowane sfingozydy o 18 lub 20 atomach węgla w swych łańcuchach, oraz

151 289 5 odpowiednie związki nasycone, podczas gdy ich nasycona lub nienasycona grupa acylowa, nie podstawiona grupami hydroksylowymi, zawiera tę samą, 18-20, ilość atomów węgla.

Jak to przedyskutowano w powyższej części niniejszego opisu, niniejszy wynalazek dotyczy z jednej strony czynnych estrów „czystych gangliozydów o wzorze ogólnym 1, to jest gangliozydów o jednolitym składzie, jak wyżej opisano, a z drugiej strony czynnych estrów mieszanin gangliozydów, np. w postaci ekstraktu, tak jak zostały one otrzymane z różnych tkanek zwierzęcych. W pierwszym przypadku, podstawowymi gangliozydami są korzystnie takie gangliozydy, w których oligosacharyd utworzony jest przez co najwyżej 4 reszty heksozy lub N-acetyloheksozamin, z tym, że obecna jest co najmniej jedna reszta heksozy, oraz w których ta część sacharydowa jest chemicznie jednolita. Korzystnie, heksozy wybiera się z grupy złożonej z glukozy i galaktozy, a N-acetyloheksozaminy z grupy złożonej z N-acetyloglukozaminy i N-acetylogalaktozaminy /gangliozydy grupy A/. Gangliozydami z tej grupy są np. te gangliozydy, które zostały wyekstrahowane z mózgu kręgowców, takie jak gangliozydy opisane w artykule „Gangliosides of the Nervous System, w Glycolipid Methodology, Lloyd A. Witting Fd. American Oil Chemists Society, Champaign, 111, 187-214 /1976/, patrz zwłaszcza, tablica 1, np. gangliozydy Gm4, Gm3, Gm2, Gmi-GIc Nac, Gd2, Goia-GalNac, Gtic, Gq, Gti , zwłaszcza te, w których oligosacharyd zawiera co najmniej jedną resztę glukozy lub galaktozy oraz jedną resztę N-acetylogalaktozaminylub Nfacetylogalaktozaminy,w szczególności następujące /gangliozydy grupy B/: Gmi /o wzorze 6/, Gdł>i i a /o wzorze 7/, Gdi b /o wzorze 8/ i Gti b /o wzorze 9/, w których to wzorach 6-9 Gic oznacza glukozę, GalNac oznacza N-acetylogalaktozaminę, Gal oznacza galaktozę, a NANA oznacza kwas N-acetyloneuraminowy.

W przypadku użycia mieszanin gangliozydów jako materiału wyjściowego do reakcji według wynalazku, mogą stanowić one mieszaniny bezpośrednio otrzymywane z różnych tkanek zwierzęcych jako „całkowite ekstrakty gangliozydów, albo jako ich różne frakcje. Tego rodzaju ekstrakty są opisane w literaturze, np. w wyżej wspomnianym artykule, albo też w pracy „Extraction and analysis of materials containing lipidbound sialic acids w Glycolipid Methodology, Lloyd A. Witting Fd., American Oil Chemists Society, Champaign, III, 159-186 /1976/ i w pracy „Gangliosides of the Nervous System, zamieszczonej w tej samej książce na str. 187-214. Niektórymi najważniejszymi mieszaninami, których można użyć w sposobie według wynalazku, są gangliozydy w postaci ekstraktów otrzymanych z tkanek układu nerwowego, w szczególności z mózgu, zawierających gangliozydy Gmi, Gdis, Goib i Gtw, już powyżej wspomniane. Mieszaninami tego typu są np. mieszaniny opisane w poniższym przykładzie II.

Spośród nowych związków wytwarzanych sposobem według wynalazku szczególnie ważne, jeśli chodzi o preparaty farmaceutyczne, są następujące pochodne: ester etylowy gangliozydu Gmi , ester propylowy gangliozydu Gmi , ester izopropylowy gangliozydu Gmi , ester n-butylowy gangliozydu Gmi , ester izobutylowy gangliozydu Gmi , ester III-rzęd. butylowy gangliozydu Gmi , ester cykloheksylowy gangliozydu Gmi , estry odpowiadające estrom tu wymienionym zawierające zamiast gangliozydu Gmi gangliozyd Gdw, estry wyszczególnione w powyższej części niniejszego opisu, ale zawierające zamiast gangliozydu Gmi gangliozyd Gdis, estry tu wyszczególnione, ale zawierające zamiast gangliozydu Gmi gangliozyd G-rib, ester metylowy, ester etylowy, ester propylowy, ester izopropylowy, ester IILrzęd.-butylowy, ester benzylowy, ester allilowy i ester etoksykarbonylometylowy mieszaniny gangliozydów zawierającej, jako zasadnicze gangliozydy, gangliozydy Gmi, Gdi₃, Gdw, Gtw, a zwłaszcza mieszaniny wytworzonej sposobem opisanym w poniższym przykładzie II.

Wyżej stosowane skróty dotyczące nomenklatury gangliozydów zostały zaproponowane przez Svennerholma w J. Neurochem. 10, 613 /1963/. Znaczenie tych skrótów jest następujące: -pierwsza litera G - oznacza gangliozyd, druga litera M, D, T, Q lub P - oznacza liczbę grup kwasu sjalowego /M = monosjalo, D = disjalo, T = trisjalo, Q = czterosjalo i P — pięciosjalo/. Oznaczenie n oznacza liczbę obojętnych reszt cukrowych. Tak więc np. GMI oznacza monosjalogangliozyd z obojętnymi resztami cukrowymi /czyli 5-4= 1/.

Nowe estry gangliozydów wytworzone sposobem według wynalazku występują na ogół w postaci bezbarwnych lub szarawych proszków. Są one bezpostaciowe i dają się łatwo rozpuścić całkowicie w wodzie i rozpuszczalnikach polarnych, takich jak niższe alkohole alifatyczne, np.

151 289 alkohol metylowy, alkohol etylowy lub alkohol propylowy, a także w ketonach, takich jak aceton, lub w amidach, takich jak dwumetyloformamid lub w sulfotlenkach, takich jak dwumetylosulfotlenek lub eterach, takich jak dioksan lub tetrahydrofuran. Przy wytwarzaniu preparatów farmaceutycznych w postaci roztworów do wprowadzania pozajelitowego, za każdym razem należy dobrać najstosowniejszy rozpuszczalnik, zgodnie z bardziej lub mniej hydrofitowym lub lipofilowym charakterem nowych pochodnych.

Aktywność terapeutyczna. Wszystkie spośród nowych pochodnych gangliozydów omówionych w powyższej części niniejszego opisu, a w szczególności gangliozydy grupy A i B oraz wyżej wyliczone związki specyficzne stosowane są jako składniki czynne preparatów farmaceutycznych. Ponadto tego rodzaju preparaty farmaceutyczne mogą zawierać także niektóre pochodne gangliozydów typu wyżej opisanego i znane już z piśmiennictwa, takie jak ester metylowy gangliozydu Gmi lub jego nadacetylowana pochodna.

Jak to przedyskutowano w powyższej części niniejszego opisu, terapeutyczne działanie gangliozydów i ich niektórych pochodnych, takich jak pochodne wytworzone spsoobem według wynalazku, zawdzięczać należy zjawisku stymulowania przez te substancje tworzenia przez komórkę nerwową wypustek, wskutek czego staje się możliwe odzyskanie przewodnictwa nerwowego. I tak np., podanie in vivo mieszaniny gangliozydów otrzymywanych z mózgu bydlęcego, jak opisano w powyższym przykładzie II /mieszanina GA/, pobudza tworzenie wypustek przez nerw kulszowy u szczura po zmiażdżeniu tego nerwu i może pomóc w odzyskaniu aktwności elektrycznej nerwu na poziomie złączenia nerwowo-mięśniowego.

Ponieważ tworzenie wypustek osiowych można uważać za umiejscowione różnicowanie są neuronu, mechanizm biochemiczny, na zasadzie którego cząsteczki gangliozydu wywołują ten efekt badano w oparciu o ich wpływ na komórkowe różnicowanie się in vitro stosując hodowle komórkowe pochodzące z nowotworu z komórek chromochłonnych PC12. Dodanie gangliozydów do czynnika wzrostu nerwów /NGF/, który jest induktorem różnicowania się komórek PC12, w płynie do hodowli P12 stymuluje tworzenie wypustek przez neurony. Efekt ten można przypisać włączeniu gangliozydu do błony neuronu, co modyfikuje jego właściwości czynnościowe, to jest aktywność enzymów. I rzeczywiście, włączenie gangliozydów do błony neuronu umożliwia stymulowanie aktywności /Na⁺, K⁺/ ATP-azy. Dla podkreślenia znaczenia aktywacji tego enzymu zespolonego z błoną należy zauważyć, że niektórzy autorzy wywodzą przeżycie, i konsekwentnie, różnicowanie się neutronów w hodowli, z aktywacji tego enzymu przez NGF. Z drugiej strony dobrze znana jest kluczowa rola tego enzymu, jeśli chodzi o aktywność elektryczną. Działanie to związane jest z mechanizmem zaangażowanym w przewodzeniu impulsów nerwowych wzdłuż błony wypustki osiowej.

Z wykorzystaniem metod opisanych w powyższej części niniejszego opisu określa się aktywność farmakologiczną nowych pochodnych gangliozydów wytwarzanych sposobem według wynalazku wyrażoną tworzeniem wypustek osiowych przez komórki PC12. Również przytoczone są wyniki otrzymane in vitro w odniesieniu do /Na⁺, K⁺/ ATP-azy dla niektórych pochodnych.

Wpływ pochodnych gangliozydów na tworzenie wypustek osiowych w komórkach PC12. Materiały i metody.

Linię komórkową PC12, pochodzącą z podklonu 1A, otrzymano od dr P. Calissano /C.N.R. Laboratory of Cellular Biology, Rzym/.

Komórki /100000/płytkę /przetrzymuje się w inkubatorze Heraeus, w temperaturze 37°C, przy 5% CO2 i 95% nawilżonego powietrza i ponownie wysiewa na płytki Falcon Integrid, na podłoże kolagenowe w obecności następującego płynu hodowli: 85% RPM 1640 /Gibco/, 10% surowicy końskiej inaktywowanej termicznie, 5% płodowej surowicy cielęcej /Gibco/, 50 U/ml penicyliny i 25 mg/ml streptomycyny. Następnie komórki trzykrotnie przemywa się nośnikiem bez surowicy. Po dokonaniu trzykrotnego przemycia komórki inkubuje się w nośniku bez surowicy z 50 ng/ml NGF i pochodną gangliozydu wytworzoną sposobem według wynalazku albo z mieszaniną gangliozydów użytą do porównania w stężeniu 10^_6M. Dodanie nośnika bez surowicy z NGF /50 ng/ml/ powoduje przerwanie proliferacji komórek, tworzenie wypustek osiwoych i doprowadzenie do różnicowania się już na trzeci dzień. Efekt ten ocenia się przez policzenie trzeciego dnia komórek z wypustkami osiowymi.

151 289

Wyniki. Otrzymane wyniki zamieszczone są w następującej tabeli 1 przy zastosowaniu jako wartości porównawczych wartości odpowiadających mieszaninie gangliozydów wytworzonej sposobem opisanym w powyższym przykładzie II i pojedynczej jednosjalogangliozydowej frakcji Gmi .

Tabela 1

Wpływ gangliozydów i ich pochodnych wytwarzanych sposobem według wynalazku na tworzenie wypustek osiowych przez komórki PC12

Związek	Stężenie	Ilość komórek z wypustkami osiowymi /trzeciego dnia/ %
Kontrole		21,5
Mieszanina gangliozydów GA	10·μ	39,5
/patrz przykład 3/
Jednosjalogangliozyd Gmi		34,8
Ester metylowy GA	w	32,8
Ester metylowy Gmi		35,7
Ester etylowy GA		34,9
Ester etylowy Gmi		37,1
Ester izopropylowy GA		37,3
Ester izopropylowy Gmi	w	37,0
Ester III-rzęd.butylowy GA		29,5
Ester III-rzęd.butylowy Gmi	*	32,3
Ester benzylowy GA		31,4
Ester benzylowy Gmi		28,3
Ester allilowy GA		34,1
Ester allilowy Gmi	**	31,5
Ester etoksykarbonylometylowy Gmi		27,3 * ·

Wpływ pochodnych gangliozydów na /Na⁺, K⁺/ ATP-azę błony neuronu. Materiały i metody, a/ Otrzymywanie surowej frakcji mitochondrialnej z mózgu szczura /frakcja P2/. Przy otrzymywaniu frakcji P2 stosuje się sposób postępowania podany przez Morgana i wsp., Bioch. Bioph. Acta, 241,37 /1971/. Poszczególne operacje prowadzi się w temperaturze 0°C do 4°C. Wartości x g odnoszą się do średnich wielkości siły odśrodkowej.

Dorosłe szczury samce Spraque Dawley, otrzymane z Charles River, o wadze ciała 150-175 g, dekapituje się, natychmiast pobiera mózgi i przemywa je roztworem izotonicznym o temperaturze lodu. Po oddzieleniu móżdżków, mózgi homogenizuje się za pomocą wykonania 12 ruchów w górę i w dół w szklano-teflonowym homogenizatorze napędzanym silniczkiem /deklarowany luz promieniowy 0,25 mm, 800 obr/min/, przy użyciu roztworu homogenizującego /4 objętości/, składającego się z 0,32 M roztworu sacharozy zawierającego 1 milimolowy bufor fosforanowy oraz 0,1 nM sól dwusodową EDTA, pH 7,27. Zhomogenizowany materiał, przesączony przez cztery warstwy cienkiej gazy, odwirowuje się przy 1000 obr/min., w ciągu 15 minut. Utworzony osad przemywa się tą samą ilością co początkowa roztworu homogenizującego i wiruje w sposób jak wyżej opisano. Zebrane supematanty wiruje się przy 17500 obr/min. w ciągu 25 minut /te warunki odnoszące się do grawitacyjnej siły odśrodkowej stosuje się w celu osiągnięcia maksymalnego wzbogacenia frakcji w zakończenia nerwowe/. Osad przemywa się czterokrotnie, za każdym razem używając 9 objętości roztworu homogenizującego z odwirowaniem /przy 17500 obr/min., w ciągu 25 minut/.

Końcowy osad, znany jako „frakcja P2^U zawiera jako składnik zasadniczy całe mitochondria i zakończenia nerwowe. Osad ten zawiesza się w odpowiedniej ilości roztworu homogenizującego w homogenizatorze szklano-teflonowym, z utworzeniem jednorodnej zawiesiny i używa bezpośrednio w teście. Aby uniknąć niezgodności wynikającej z konserwacji materiału, przed każdym zastosowaniem przygotowuje się świeżą frakcję P2. Preparaty frakcji P2 wykazują zawartość gangliozydów odpowiadającą 33,9±2,8 /odchylenie standardowe/ nanomola związanego kwasu sjalowego na mg białka.

b/ Aktywacja enzymu ATP-azy. Aktywność ATP-azy mierzy się metodą spektrofotometryczną wg Wallick'a i wsp. [J. Pharm. Exptl. Therap., 189,434 /1974/]. Mieszanina reakcyjna, jeżeli

151 289 tego inaczej nie wskazano, składa się z 50 milimoli sacharozy, 0,2 milimoli soli dwusodowej EDTA /doprowadzonej do pH 7,4/, 100 milimoli NaCl, 5 milimoli MgClz, 10 milimoli KC1, 2 milimoli tosfo/enolo/-pirogronianu jednopotasowego /PEP“ doprowadzonego do pH 7,4/, 3 milimoli ATP, 50 milimoli TRIS—HCl /pH 7,4/, 0,33 milimola NADH, kinazy pirogronianowej /PK/ 30g/ml/ i dehydrogenazy mleczanowej /LDH/ lOg/ml, w końcowej objętości 3 ml i z końcową wartością pH 7,2. Reakcja zaczyna się od dodania 50-75pg /w przeliczeniu na białko/ frakcji P2. Aktywność /Na⁺, K⁺/ ATP-azy oznacza się na podstawie różnicy między całkowitą aktywnością ATP-azy z aktywnością ATP-azy zależnej od Mg²⁺ mierzoną w obecności 3 · 10⁵M strofantyny. Czas przyjęty dla każdego pojedynczego testu wynosi 3-5 minut. Aktywność ATP—azy wyraża się w jednostkach międzynarodowych /j.m./ /mikromole zhydrolizowanego ATP/mg białka/ min./. Aktywność pochodnych gangliozydów z błonami neuronów w temperaturze 37°C w ciągu 2 godzin.

Otrzymane wyniki badań porównawczych nad aktywnością ATP-azy przedstawione są w tabeli 2.

Tabela 2

Wpływ gangliozydów i ich pochodnych na aktywność /Na⁺, K⁺/ ATP-azy w błonie neuronów

Produkt	Stężenie	Wzrost aktywności /Na+, Κ7 ATP-azy %
Kontrole	50	100
Mieszanina gangliozydów GA
/patrz przykład 11/	50	142
Gmi	50	133
Ester metylowy GA	50	128
Ester metylowy Gmi	50	132

Należy zauważyć, że pochodne gangliozydów wytwarzane sposobem według wynalazku wykazują dłuższy czas działania w porównaniu z gangliozydami, stąd też są użyteczne jako leki o działaniu przedłużonym. Zjawisko to objaśniają np. następujące eksperymenty dotyczące kinetyki wchłaniania estrów gangliozydów.

Rozmieszczenie we krwi, in vivo, pochodnych gangliozydów.

1. Wytwarzanie produktów znakowanych. Znakowany gangliozyd wytwarza się sposobem opisanym przez Suzuki i wsp. [J. Lipid Res., 13,687-690 /1972/] w modyfikacji Ghidoni'ego i wsp. [Ital. J. Biochem., 23,320-328/1974/]. Ester etylowy i ester izopropylowy wytwarza się zapomocą zestryfikowania tak otrzymanego znakowanego gangliozydu. Radioaktywność właściwą mierzy się zarówno dla gangliozydu jak i dla estrów.

2. Sposób postępowania ze zwierzętami. Myszom Swiss otrzymanym z Charles River /Calco/, o wadze około 20-25 g, podaje się drogą dożylną produkty w ilości odpowiadającej lOmikrocurie. Zwierzęta dekapituje się po upływie, kolejno, 2, 4, 8, 12 i 16 godzin od podania i krew ich zbiera się do heparynizowanych buteleczek. Radioaktywność nielotną oznacza się w próbkach krwi przy użyciu scyntylatora Packard TRICARB i identyfikuje w odniesieniu do ³H-gangliozydu i estrów za pomocą chromatografii cienkowarstwowej.

3. Wyniki. Po domięśniowym podaniu irytowanego gangliozydu krzywa kinetyki jest dwufazowa, opadająca z okresem półtrwania około 3 godzin, z następującą potem fazą powolnej eliminacji, która pozostaje stała do 16 godziny. W przypadku estru etylowego i estru izopropylowego gangliozydu Gmi poziom produktu identyfikowany po raz pierwszy nie osiąga maksimum obserwowanego przy produkcie normalnym, ale po upływie pewnego czasu estry osiągają poziom maksymalny, wyższy i pozostają na tym poziomie dłużej /fig. 1/. Tak więc, obserwuje się większy zakres rozmieszczenia i dłuższy czas utrzymywania się dawek terapeutycznych.

W rezultacie wykazywania wyżej opisanych właściwości farmakologicznych przez pochodne gangliozydów wytwarzane sposobem według wynalazku, mogą one być użyte jako leki i to w

151 289 różnych sposobach terapii, do leczenia stanów patologiczynch układu nerwowego, w szczególności w pewnych sposobach leczenia stanów patologicznych nerwów obwodowych i ośrodkowego układu nerwowego.

Zwłaszcza użyteczne są pochodne gangliozydów grupy A i B oraz te pochodne, które zostały wyliczone specjalnie, oraz podawanie wszystkich tych pochodnych w dawkach, które zostały wymienione poniżej. Mówiąc bardziej szczegółowo, wspomnianych tu pochodnych gangliozydów użyć można w terapii stanów patologicznych obwodowego układu nerwowego, takich jak stany patologiczne pochodzenia urazowego, uciskowego, rozrostowego lub toksyczno-infekcyjnego, gdy niezbędne jest stymulowanie regeneracji nerwów i odzyskania funkcji nerwowo-mięśniowej, a także w stanach patologicznych ośrodkowego układu nerwowego pochodzenia urazowego lub toksyczno-infekcyjnego, względnie będącym wynikiem niedotlenienia lub degeneracji, w których niezbędne jest stymulowanie tworzenia wypustek przez neutrony w celu spowodowania odzyskania funkcji. Pochodne gangliozydów wytwarzane sposobem według wynalazku, w powodu wykazywanego przez nie efektu opóźnienia, są wyraźnie korzystniejsze od samych gangliozydów, które dotychczas były lekami używanymi w podanych wyżej przypadkach.

Dawkowanie przyjęte przy podawaniu zależeć będzie od pożądanego skutku i wybranej drogi podawania. Zazwyczaj stosuje się podawanie drogą domięśniową, podskórną, dożylną, śródskórną lub dopłucną, korzystnie w odpowiednio buforowanym nośniku wodnym. Postacią farmaceutyczną zabezpieczającą substancję mogą być w tym przypadku fiolki zawierające roztwory pochodnych, ewentualnie razem z innymi składnikami pomocniczymi, jak to opisano odnośnie do preparatów farmaceutycznych według wynalazku w powyższej części niniejszego opisu. Do terapeutycznego lub ewentualnie także profilaktycznego zastosowania przy podawaniu wyżej wspomnianą drogą pozajelitową, wielkość dawkowania korzystnie może zawierać się w zakresie od 0,05 mg do 5 mg substancji czynnej /kg wagi ciała/dzień, a zwłaszcza w zakresie od 0,05 mg do 2 mg substancji czynnej/kg wagi ciała/dzień.

Aczkolwiek nowe zastosowania terapeutyczne, na ogół nadają się do wykorzystania we wszystkich rodzajach stanów patologicznych związanych z przewodzeniem impulsów w ośrodkowym układzie nerwowym i obwodowym układzie nerwowym, szczególnie interesujące w tym przypadku są następujące, specyficzne stany patologiczne: zapalenie nerwu pozagałkowe, porażenie nerwów okołoruchowych, zapalenie nerwu trójdzielnego, porażenie Bella, /porażenie nerwu twarzowego/, zespół Garoina, zapalenie korzonków nerwowych, uszkodzenie urazowe nerwów obwodowych, cukrzycowe i alkoholowe zapalenie wielonerwowe, porażenie porodowe, porażenna rwa kulszowa, choroby neuronów ruchowych, stwardnienie boczne zanikowe z atrofią mięśni pochodzenia rdzeniowego, postępujące porażenie opuszkowe, miastenia, zespół Lamberta Eatona, dystrofia mięśni, pogorszenie synaptycznego przekazywania między neuronami w ośrodkowym układzie nerwowymi i obwodowym układzie nerwowym, oraz osłabienie świadomości, takie jak stany dezorientacji, a także wstrząs mózgu, zakrzepica i zator.

Preparaty farmaceutyczne zawierają jako substancję czynną jedną, lub więcej nowych estrów gangliozydów opisanych w powyższej części niniejszego opisu, a w szczególności pochodnych gangliozydów wytworzonych z gangliozydów grupy A i B, jak również specyficznych gangliozydów uprzednio wyliczonych, ponadto i ich zacylowane pochodne również specyficznych gangliozydów uprzednio wyliczonych, ponadto i ich zacylowane pochodne.

Preparaty farmaceutyczne zawierające związki wytworzone według wynalazku mogą to być preparaty nadające się do stosowania doustnego, doodbytniczego, pozajelitowego, miejscowego lub śródskórnego. Występują one w postaci stałej lub półstałej, takiej jak pigułki, tabletki, kapsułki powlekane żelatyną, kapsułki, czopki lub kapsułki żelatynowe miękkie. Do użycia pozajelitowego można tu zastosować formy przeznaczone do podawania domięśniowego, podskórnego lub śródskórnego, albo przeznaczone do infuzji lub wstrzykiwań dożylnych, występujące więc jako roztwory związków czynnych lub liofilizatory stanowiące sproszkowane związki czynne, do dodawania do jednej lub więcej farmaceutycznie dozwolonych zarobek lub rozcieńczalników, odpowiednich do wyżej wspomnianych sposobów stosowania i o osmolarności zgodnej z płynami fizjologicznymi. Do stosowania miejscowego można użyć preparatów w postaci aerozoli natryskowych, takich jak aerozole natryskowe do nosa, kremów i maści. Do stosowania miejscowego można także

151 289 użyć odpowiednio przygotowanych plastrów do wprowadzania do skóry. Preparaty według wynalazku można podawać ludziom lub zwierzętom. Korzystnie, preparaty powinny zawierać 0,01-10% składnika czynnego w przypadku roztworów, aerozoli natryskowych, maści i kremów, a 1-100%, korzystnie 5-50%, związku czynnego w przypadku preparatów stałych. Zalecone dawkowanie zależy od wskazań medycznych, pożądanego skutku i wybranego sposobu postępowania.

Poniższe przykłady bliżej wyjaśniają wynalazek bez ograniczania jego zakresu.

Przykład I. Ester metylowy gangliozydu Gmi /dla celów porównawczych/. 5 g estru wewnętrznego gangliozydu Gmi /3,27 milimola/ rozpuszcza się w 200 ml bezwodnej mieszaniny chlorku metylenu/ metanol 4:1. Dodaje się 176 mg /3,27 milimola/ metanolanu sodowego rozpuszczonego w 50 ml bezwodnego metanolu, po czym otrzymaną mieszaninę ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną w ciągu 2 godzin. Pod koniec reakcji mieszaninę zobojętnia się bezwodną żywicą Dowex AG 50x8 /forma H⁺/, po czym żywicę oddziela się za pomocą odsączenia i przemywa metanolem, a roztwór odparowuje się za pomocą suszenia. Otrzymaną pozostałość zbiera się w 50 ml mieszaniny chlorek metylenu/metanol 1:1, po czym wytrąca się produkt za pomocą wlania otrzymanego roztworu do 250 ml acetonu. 4,9 g surowego produktu poddaje się oczyszczaniu preparatywną metodą cieczowej chromatografii ciśnieniowej przy użyciu żelu krzemionkowego 60 H Mercks, z zastosowaniem jako rozpuszczalnika mieszaniny chloroform/metanol /izopropanol/ 2% węglan amonowy 1140:820:180:140. Frakcje czyste zbiera się, odparowuje za pomocą suszenia, ponownie rozpuszcza w 15 ml mieszaniny chloroform/metanol 1:1 i wytrąca produkt przy użyciu 75 ml acetonu. Produkt ten stanowi ester metylowy gangliozydu Gmi . Wydajność 4,2 g.

Analiza spektroskopowa IR prowadzona przy użyciu pastylek KBr wykazuje typowe pasmo estru przy 1750 cm^-1. Chromatografia na płytkach z żelem krzemionkowym przy użyciu układu chloroform/metanol /0,3% CaCb 55:45:10 i odczynnika Ehrlicha do określania /Rf 0,72/ wykazuje, że produkt jest jednolitym związkiem, nie zawierającym estru wewnętrznego stosowanego jako związek wyjściowy /Rf 0,75/, a także gangliozydu Gmi /Rf 0,65/. Po podziałaniu w ciągu godziny, w temperaturze 60°C, 0,1 N roztworem NasCCh, wiązanie estrowe ulega rozszczepieniu, w wyniku czego otrzymuje się pierwotny związek Gmi.

Przykład II. Otrzymywanie mieszaniny gangliozydów /mieszaniny GA/ na drodze ekstrakcji z tkanki mózgu bydlęcego oraz odpowiedniej mieszaniny estrów wewnętrznych /do użycia w różnych następujących przykładach/. Korę mózgu bydlęcego pobranego od zwierzęcia homogenizuje się w buforze fosforanowym o pH 6,8. Dodaje się 6 objętości tetrahydrofuranu i otrzymaną mieszaninę wiruje się. Supernatant poddaje się 2 razy ekstrakcji tetrahydrofuranem. Po wirowaniu, substancje niepolarne usuwa się z pomocą oddzielenia przy użyciu eteru etylowego i warstwę wodno- tetrahydrofuranową wprowadza się na kolumnę jonitową zrównoważoną 50% etanolem. Do wycieku z kolumny dodaje się wodorotlenek barowy i 4 objętości etanolu o temperaturze lodu.

Po upływie 18 godzin utrzymywania niskiej temperatury, wydzielony osad zbiera się, a następnie po rozpuszczeniu w wodzie, lekko zakwasza kwasem solnym. Tak otrzymany roztwór poddaje się dializie, a następnie liofilizuje. W tym momencie wydajność surowej mieszaniny gangliozydów wynosi około 0,6 mg na gram użytej tkanki nerwowej. Otrzymany liofilizat w postaci proszku rozprasza się w 20 ml mieszaniny chloroform/metanol 2:1 i otrzymany w ten sposób roztwór sączy się aż do uzyskania całkowicie klarownego przesączu, a następnie rozdziela za pomocą dodania 0,2 objętości 0,88% roztworu chlorku potasowego w wodzie.

Warstwę górną oddziela się, poddaje dializie i liofilizuje. Końcowa wydajność wynosi około 0,3 mg oczyszczonej mieszaniny gangliozydów w postaci soli na gram tkanki mózgowej.

g mieszaniny otrzymanej sposobem wyżej opisanym rozpuszcza się w 50 ml DMSO. Do otrzymanego roztworu dodaje się 4 g bezwodnej żywicy typu styrenu z resztami kwasu sulfonowego /50-100 mesh, forma H⁵/ i całość miesza się w ciągu 30 minut w temperaturze pokojowej. Tego rodzaju postępowanie z zastosowaniem żywicy jonowymiennej doprowadza do przekształcenia wszystkich grup karboksylowych, które posłużyły do utworzenia soli. Całkowitość tego przekształcenia potwierdza się stosowaną metodą analizy fizycznej, taką jak absorpcja atomowa. Następnie odsącza się żywicę z zastosowaniem odsysania i otrzymany roztwór zadaje się 1,5 g dwucykloheksylokarbodwuimidu, po czym odstawia na godzinę. Wytrącony dwucykloheksylomocznik usuwa się za pomocą odsączenia i otrzymany roztwór zadaje się 100 ml powodując w ten sposób wytrącenie się utworzonych estrów wewnętrznych gangliozydów.

151 289

Mieszaninę estrów wewnętrznych otrzymuje się w ilości 4,6 g, co stanowi 90-95% wydajności teoretycznej. Obecność pochodnych w postaci estru wewnętrznego potwierdza się metodą spektroskopii IR, jak również metodą chromatografii cienkowarstwowej. Analiza spektroskopowa IR przy użyciu pastylek KBr wykazuje pasmo estryfikującego wiązania laktonowego przy 1750 cm^-1. Analiza metodą chromatografii cienkowarstwowej na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym, przy użyciu do rozwijania układu rozpuszczalników CHCI3/CH3OH/ 0,3% CaCU 55:45:10 /obj/obj/obj/, wykazuje wartość Rf mieszaniny estrów wewnętrznych w zakresie od 0,7 do 0,85. Wartość Rf produktów końcowych jest większa od wartości Rf substancji wyjściowych. W rezultacie chromatografia nie wykazuje obecności materiału wyjściowego. Za pomocą działania w ciągu godziny, w temperaturze 60°C 0,1 N roztworem NazCCh, wiązania estrowe ulegają rozszczepieniu, dzięki czemu jest rzeczą możliwą otrzymanie pierwotnej mieszaniny wyjściowych gangliozydów.

Otrzymaną mieszaninę gangliozydów można rozdzielić na różne frakcje, stanowiące zasadniczo czyste gangliozydy /w znaczeniu użytym w powyżej podanym opisie/ z zastosowaniem kolumn Goia, z kwasem krzemowym, przy użyciu do elucji mieszaniny metanol/chl21% gangliozydu Gmi , 19% oroform. W ten sposób otrzymuje się kompozycję złożoną średnio z 40% gangliozydu gangliozydu Gub i 16% gangliozydu Gdw.

Przykład III. Mieszanina estrów metylowych mieszaniny gangliozydów. 5g mieszaniny estrów wewnętrznych mieszaniny gangliozydów, otrzymanych w drodze ekstrakcji z tkanki mózgu bydlęcego sposobem opisanym w powyższym przykładzie II, rozpuszcza się w 200 ml bezwodnej mieszaniny chlorek metylenu/ metanol 4:1. Dodaje się 318 mg /5,86 milimola/ metanolanu sodowego rozpuszczonego w 50 ml bezwodnego metanolu, po czym otrzymaną mieszaninę ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną w ciągu 2 godzin. Następnie, sposobem opisanym w powyższym przykładzie I wyodrębnia się 4,9 g surowego produktu reakcji, który w dalszym ciągu poddaje się oczyszczaniu metodą chromatografii na Sephadex-DEAE A 25 /forma octanowa/, przy użyciu jako rozpuszczalnika układu chloroform/metanol/woda 30:60:8. Mieszane frakcje obojętne odparowuje się, dializuje z użyciem wody, ponownie odparowuje za pomocą suszenia, po czym otrzymane pozostałości rozpuszcza się w 15 ml mieszaniny chloroform/metanol 1:1 i wytrąca się produkt za pomocą dodania 75 ml acetonu. Wydajność 4,3 g. Analiza spektroskopowa IR, przeprowadzona przy użyciu pastylek KBr, wykazuje typowe wiązanie estrowe przy 1750 cm”¹. Badanie metodą chromatograficzną wykonane sposobem opisanym w powyższym przykładzie I wyodrębnia się 4,9 g surowego produktu reakcji i, który w dalszym ciągu poddaje się oczyszczaniu metodą chromatografii na Sephadex - DEAE A 25 /forma octanowa/, przy użyciu jako rozpuszczalnika układu chloroform/metanol/woda 30:60:8. Mieszane frakcje obojętne odparowuje się, dializuje z użyciem wody, ponownie odparowuje za pomocą suszenia, po czym otrzymane pozostałości rozpuszcza się w 15 ml mieszaniny chloroform/metanol 1:1 i wytrąca się produkt za pomocą dodania 75 ml acetonu. Wydajność 4,3 g. Analiza spektroskopowa IR, przeprowadzona przy użyciu pastylek KBr, wykazuje typowe wiązanie estrowe przy 1750 cm”¹. Badanie metodą chromatograficzną wykonane sposobem opisanym w powyższym przykładzie I, wykazało obecność produktu stanowiącego mieszaninę estrów metylowych gangliozydów, o wartości Rf 0,72-0,85 /wartość Rf mieszaniny gangliozydów wynosi 0,2-0,70/.

Zajście transestryfikacji w stopniu całkowitym potwierdzić można za pomocą oznaczenia stosunku cząsteczkowego między grupami alkoksylowymi i sjalowymi, w rezultacie oznaczenia ilościową metodą chromatografii gazowej typu „Head space alkoholu metylowego uwolnionego w wyniku podziałania, w ciągu godziny, w temperaturze 60°C 0,1 N roztworem NazCOe, powodującego rozszczepienie wszystkich wiązań estrowych, oraz oznaczania metodą Svennerholma kwasu N-acetyloneuraminowego.

Przykład IV. Ester etylowy gangliozydu Gmi . Ester etylowy gangliozydu Gmi wytwarza się i wyodrębnia takim samym sposobem, jaki w przypadku estru metylowego opisany został w powyższym przykładzie I, jednakże przy użyciu zamiast alkoholu metylowego i metanolanu sodowego, odpowiednio, alkoholu etylowego i etanolanu sodowego, natomiast z zastosowaniem takich samych, jakie podano w powyższym przykładzie I molowych ilości estru wewnętrznego i etanolanu. Przemycia żywicy Dowex dokonuje się przy użyciu alkoholu etylowego, a pozostałość otrzymaną w wyniku odparowania przesączu rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny chlorek metylenu/etanol 1:1. Wydajność surowego produktu wynosi 4,9 g. Operację oczyszczania prowadzi się w

151 289 taki sam sposób, jaki opisano w powyższym przykładzie I. Ester metylowy oczyszczonego gangliozydu Gmi otrzymuje się z wydajnością 4,3 g. Analiza chromatograficzna otrzymanego produktu wykonana w taki sam sposób, jaki opisano w powyższym przykładzie I wykazuje obecność jednolitego związku o Rf 0,80 i nie wykazuje obecności gangliozydu Gmi oraz jego wewnętrznego /o Rf, odpowiednio, 0,65 i 0,75/. W wyniku hydrolizy przeprowadzonej sposobem opisanym w powyższym przykładzie I z użyciem NaCCh, otrzymuje się gangliozyd Gmi. Analiza spektroskopowa IR przy użyciu pastylek KBr wykazuje typowe pasmo estru przy 1750 cm^-1.

Przykład V. Mieszanina estrów etylowych mieszaniny gangliozydów. Mieszaninę estrów etylowych wytwarza się i wyodrębnia takim samym sposobem, jaki w przypadku estrów metylowych opisany został w powyższym przykładzie III, jednakże przy użyciu w tym przypadku, zamiast alkoholu metylowego i metanolanu sodowego, alkoholu etylowego i etanolanu sodowego. Stosuje się 5g mieszaniny estrów wewnętrznych i 318 mg/5,86milimola/ etanolanu sodowego.

Przemycia żywicy Dowex dokonuje się przy użyciu alkoholu etylowego i pozostałość otrzymana w wyniku odparowania przesączu rozpuszcza sią w 50 ml mieszaniny chloroform/etanol 1:1. Wydajność produktu surowego wynosi 4,9 g. Oczyszczenia dokonuje się również tak, jak to opisano w powyższym przykładzie III. Oczyszczoną mieszaninę estrów etylowych otrzymuje się z wydajnością 4,5 g. Analiza spektroskopowa IR przeprowadzona przy użyciu pastylek KBr wykazuje typowe pasmo estru przy 1750 cm^-1. Produkt ten poddany chromatografii na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym, z użyciem świeżo przygotowanego układu chloroform/metanol/1 M wodorotlenek czterometyloamoniowy 55:45:10 i przy zastosowaniu odczynnika Ehrlicha do określania, wykazuje wartość Rf 0,50-0,75 /mieszanina gangliozydów wykazuje wartość Rf 0,20-1,60/.

Zajście transestryfkacji w stopniu całkowitym wykazuje się w taki sam sposób, jaki opisano w powyższym przykładzie III.

Przykład VI. Ester izopropylowy gangliozydu Gmi . Pochodną tę wytwarza się i wyodrębnia takim samym sposobem, jaki w przypadku estru metylowego opisano w powyższym przykładzie I, jednakże przy użyciu zamiast alkoholu metylowego i metanolu sodowego, alkoholu izopropylowego i izopropylanu sodowego, natomiast z zastosowaniem estru wewnętrznego i izopropanolu w takich samych ilościach molowych, jakie podano w powyższym przykładzie I. Przemycia żywicy Dowex dokonuje się przy użyciu alkoholu izopropylowego, a pozostałość otrzymaną w wyniku odparowania przesączu rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny chlorek metylenu/izopropanol 1:1. Wydajność surowego produktu wynosi 4,9. Oczyszczenia dokonuje się również tak, jak to opisano w powyższym przykładzie I. Ester izopropylowy oczyszczonego gangliozydu Gmi otrzymuje się z wydajnością 4,2 g.

Analiza chromatograficzna otrzymanego produktu, wykonana w taki sam sposób jaki opisano w powyższym przykładzie I, wykazuje obecność jednolitego związku o Rf 0,85 i nie wykazuje obecności gangliozydu Gmi lub jego estru wewnętrznego. W rezultacie hydrolizy przeprowadzonej z udziałem NazCCh sposobem opisanym w powyższym przykładzie I, otrzymuje się gangliozyd Gmi. Analiza spektroskopowa IR przeprowadzona przy użyciu pastylek KBr wykazuje typowe pasmo estru przy 1750 cm^-1.

Przykład VII. Mieszanina estrów izopropylowych mieszaniny gangliozydów. Tę mieszaninę pochodnych wytwarza się i wyodrębnia takim samym sposobem jak w przypadku estrów metylowych opisano w powyższym przykładzie III, jednakże przy użyciu zamiast alkoholu metylowego i metanolanu sodowego, alkoholu izopropylowego i izopropanolu sodowego, oraz z zastosowaniem 5 g mieszaniny estrów wewnętrznych i 537 mg /6,52 milimola/ izopropanolu sodowego. Przemycia żywicy Dowex dokonuje się przy użyciu alkoholu izopropylowego i pozostałość otrzymaną w wyniku odparowania przesączu, rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny chloroform/izopropanol 1:1. Wydajność surowego produktu wynosi 4,9 g. Oczyszczanie przeprowadza się również tak, jak to opisano w powyższym przykładzie III, z tą jednakże różnicą, że jako eluentu w chromatografii używa się mieszaniny chloroform/alkohol izopropylowy/woda 20:60:8. Mieszaninę oczyszczonych estrów izopropylowych otrzymuje się z wydajnością 4,2 g.

Otrzymany produkt, poddany chromatografii sposobem opisanym w powyższym przykładzie V, wykazuje wartość Rf 0,40-0,78 /mieszanina gangliozydów wykazuje wartość Rf 0,20-0,60/. Analiza spektroskopowa IR przeprowadzona przy użyciu pastylek KBr wykazuje typowe pasmo

151 289 estru przy 1750 cm^-1. Zajście transestryfikacji w stopniu całkowitym wykazuje się w taki sam sposób, jaki opisano w powyższym przykładzie III.

Przykład VIII. Ester III-rzęd. butylowy gangliozydu Gmi. Pochodną tę wytwarza się i wyodrębnia takim samym sposobem, jaki w przypadku estru metylowego opisano w powyższym przykładzie I, jednakże przy użyciu zamiast alkoholu metylowego i metanolanu sodowego, alkoholu III-rzęd. butylowego i III-rzęd. butanolanu sodowego, natomiast z zastosowaniem estrów wewnętrznych i III-rzęd. butanolanu w takich samych ilościach molowych, jakie podano w powyższym przykładzie I. Przemycia żywicy Dowex dokonuje się przy użyciu alkoholu III-rzęd. butylowego i pozostałość otrzymaną w wyniku odparowania przesączu rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny chlorek metylenu/III-rzęd. butanol 1:1. Wydajność surowego produktu wynosi 4,9. Wydajność estru III-rzęd. butylowego oczyszczonego gangliozydu Gmi wynosi 4,1 g.

Analiza chromatograficzna otrzymanego produktu, wykonana w taki sam sposób jaki opisano w powyższym przykładzie I, wykazuje obecność jednolitego związku o Rf 0,71 i nie wykazuje obecności gangliozydu Gmi ani jego estru wewnętrznego. W rezultacie hydrolizy wykonanej z udziałem NaaCOe, sposobem opisanym w powyższym przykładzie I, otrzymuje się gangliozyd Gmi · Analiza spektroskopowa IR przy użyciu pastylek KBr wykazuje typowe pasmo estru przy 1750 cm¹.

Przykład IX. Mieszanina estrów III-rzęd. butylowych mieszaniny gangliozydów. Mieszaninę tę wytwarza się i wyodrębnia takim samym sposobem, jaki w przypadku mieszaniny estrów metylowych został opisany w powyższym przykładzie III, jednakże przy użyciu, zamiast alkoholu metylowego i metanolanu sodowego, odpowiednio alkoholu III-rzęd. butylowego i III-rzęd. butanolanu sodowego, oraz z zastosowaniem 5g mieszaniny estrów wewnętrznych i 628,6 mg /6,52 milimola/ III-rzęd. butanolanu sodowego. Przemycia żywicy Dowex dokonuje się przy użyciu alkoholu III-rzęd. butylowego, a pozostałość otrzymaną w wyniku odparowania przesączu rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny chloroform/III-rzęd. butanol 1:1. Wydajność surowego produktu wynosi 4,9 g. Oczyszczanie przeprowadza się również tak, jak to opisano w powyższym przykładzie III, z tą różnicą, że jako eluentu używa się w chromatografii mieszaninę chloroform /alkohol III-rzęd. butylowy 1:1. Oczyszczone estry III-rzęd. butylowe otrzymuje się z wydajnością 4,1 g. Analiza spektroskopowa IR przeprowadzona przy użyciu pastylek KBr wykazuje typowe pasmo estru przy 1750 cm¹. Produkt ten poddany chromatografii sposobem opisanym w powyższym przykładzie V, wykazuje wartość Rf 0,25-0,70. Zajście reakcji w stopniu całkowitym wykazuje się sposobem opisanym w powyższym przykładzie III.

Przykład X. Ester fenyloetylowy gangliozydu Gmi . Ester fenyloetylowy gangliozydu Gmi wytwarza się i wyodrębnia takim sposobem, jaki w przypadku estru metylowego opisano w powyższym przykładzie I, jednakże przy użyciu zamiast alkoholu metylowego i metanolanu sodowego, alkoholu fenyloetylowego i fenyloetanoalnu sodowego oraz przy ogrzewaniu z użyciem łaźni wodnej i z zastosowaniem takich samych ilości molowych estru wewnętrznego i fenyloetanolanu sodowego jakie podano w powyższym przykładzie I. Przemycia żywicy Dowex dokonuje się przy użyciu alkoholu fenyloetylowego, a pozostałość otrzymaną w wyniku odparowania przesączu rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny chlorek metylenu/alkohol fenyloetylowy 1:1. Wydajność surowego produktu wynosi 5,1 g. Oczyszczenia dokonuje się również tak, jak to opisano w powyższym przykładzie I. Oczyszczony ester fenyloetylowy gangliozydu Gmi otrzymuje się z wydajnością 4,3 g.

Analiza spektroskopowa IR przeprowadzona przy użyciu pastylek KBr wykazuje typowe pasmo estru przy 1750 cm¹. Analiza chromatograficzna otrzymanego produktu, wykonana w taki sposób, jaki opisano w powyższym przykładzie I, wykazuje obecność jednolitego związku o Rf 0,90 i nie wykazuje obecności gangliozydu Gmi i jego estru wewnętrznego /o Rf, odpowiednio, 0,65 i 0,75/. W wyniku hydrolizy przeprowadzonej sposobem opisanym w powyższym przykładzie I z użyciem NazCOe otrzymuje się gangliozyd Gmi.

Przykład XI. Mieszanina estrów fenyloetylowych mieszaniny gangliozydów. Mieszaninę estrów fenyloetylowych wytwarza się i wyodrębnia takim samym sposobem, jaki w przypadku mieszaniny estrów metylowych opisany został w powyższym przykładzie II, jednakże przy użyciu w tym przypadku zamiast alkoholu metylowego i metanolanu sodowego, alkoholu fenyloetylowego i

151 289 fenyloetanolanu sodowego, oraz przy ogrzewaniu z użyciem łaźni wodnej i z zastosowaniem 5 g mieszaniny estrów wewnętrznych i 844,8 mg/5,86 milimola/ fenyloetanolanu sodowego.

Przemycia żywicy Dowex dokonuje się przy użyciu alkoholanu fenyloetylowego i pozostałość otrzymana w wyniku odparowania przesączu rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny chloroform/alkohol fenyloetylowy 1:1. Wydajność produktu surowego wynosi 5,3 g. Oczyszczenia dokonuje się również tak, jak to opisano w powyższym przykładzie III. Oczyszczoną mieszaninę estrów otrzymuje się z wydajnością 4,4 g.

Analiza spektroskopowa IR przeprowadzona przy użyciu pastylek KBr wykazuje typowe pasmo estru 1750 cm^-1. Produkt ten poddany chromatografii na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym, z użyciem świeżo przygotowanego układu chloroform/metanol/ IM wodorotlenek czterometyloamoniowy 55:45:10, przy zastosowaniu odczynnika Ehrlicha do określania, wykazuje Rf 0,65-0,887 /mieszanina gangliozydów wykazuje wartość Rf 0,2-0,60/. Zajście transestryfikacji w stopniu całkowitym wykazuje się w taki sam sposób, jaki opisano w powyższym przykładzie II.

Przykład XII. Ester 2-cykloheksyloetylowy gangliozydu Gmi. Ester 2-cykloheksyloetylowy gangliozydu Gmi wytwarza się i wyodrębnia takim samym sposobem, jaki w przypadku estru metylowego opisano w powyższym przykładzie I, jednakże przy użyciu zamiast alkoholu metylowego i metanolanu sodowego, 2-cykloheksyloetanolu i 2-cykloheksyloetanolanu sodowego, oraz przy ogrzewaniu z użyciem łaźni wodnej i z zastosowaniem estru wewnętrznego i 2-cykloheksyloetanolanu sodowego w ilościach takich samych, jaki poddano /w wartościach molowych/ w powyższym przykładzie I. Przemycia żywicy Dowex dokonuje się przy użyciu alkoholu 2cykloheksyloetylowego, a pozostałość otrzymaną w wyniku odparowania przesączu rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny chlorek metylenu /2-cykloheksyloetanol 1:1. Wydajność surowego produktu wynosi 5:1 g. Oczyszczenia dokonuje się również tak, jak opisano w powyższym przykładzie I. Oczyszczony ester 2-cykloheksyloetylowy gangliozydu Gmi, otrzymuje się z wydajnością 4,3g.

Analiza spektroskopowa IR przeprowadzona przy użyciu pastylek KBr wykazuje typowe pasmo estru przy 1750 cm^-1. Analiza chromatograficzna otrzymanego produktu, wykonana w taki sposób, jaki opisano w powyższym przykładzie I, wykazuje obecność jednolitego związku o Rf 0,92 i nie wykazuje obecności gangliozydu Gmi i jego estru wewnętrznego /o Rf, odpowiednio, 0,65 i 0,75/. W rezultacie hydrolizy przeprowadzonej z udziałem NaaCCh sposobem opisanym w powyższym przykładzie I, otrzymuje się gangliozyd Gmi.

Przykład XIII. Mieszanina estrów 2-cykloheksyloetylowych mieszaniny gangliozydów. Mieszaninę estrów 2-cykloheksyloetylowych wytwarza się i wyodrębnia takim samym sposobem, jaki w przypadku mieszaniny estrów metylowych opisano w powyższym przykładzie II, jednakże przy użyciu zamiast alkoholu metylowego i metanolanu sodowego, alkoholu 2-cykloheksyloetylowego i 2-cykloheksyloetanolanu sodowego, oraz przy ogrzewaniu z użyciem łaźni wodnej i z zastosowaniem 5g mieszaniny estrów wewnętrznych i 880,3 mg /5,86 milimola/ 2-cykloheksyloetanolanu sodowego. Przemycia żywicy Dowex dokonuje się przy użyciu alkoholu 2-cykloheksyloetylowego i pozostałość otrzymaną w wyniku odparowania przesączu rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny chloroform/alkohol etylowy 1:1. Wydajność surowego produktu wynosi 5,3 g. Oczyszczenia dokonuje się również tak, jak to opisano w powyższym przykładzie III. Oczyszczoną mieszaninę estrów otrzymuje się z wydajnością 4,3 g.

Analiza spektroskopowa IR przeprowadzona przy użyciu pastylek KBr wykazuje typowe pasmo estru 1750 cm^-1. Produkt ten poddany chromatografii na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym, z użyciem świeżo przygotowanego układu chloroform/alkohol metylowy/ 1 M wodorotlenek czterometyloamoniowy 55:45:10, przy zastosowaniu odczynnika Ehrlicha do określania, wykazuje Rf 0,67-0,90 /mieszanina gangliozydów wykazuje wartość Rf 0,20-0,60/. Zajście transestryfikacji w stopniu całkowitym wykazuje się w taki sam sposób, jaki opisano w powyższym przykładzie II.

Przykład XIV. Ester metylowy gangliozydu Gmi (dla celów porównawczych). Ester metylowy gangliozylu Gmi wytwarza się i wyodrębnia takim samym sposobem, jaki w przypadku estru metylowego opisany został w powyższym przykładzie I, jednakże przy użyciu zamiast alkoholu metylowego i metanolanu sodowego, mentolu i metanolanu sodowego, oraz przy ogrzewaniu z użyciem łaźni wodnej i z zastosowaniem estru wewnętrznego i metanolanu sodowego w takich samych ilościach molowych, jakie podano w powyższym przykładzie I. Przemycia żywicy Dowex

151 289 dokonuje się przy użyciu mieszaniny alkohol metylowy/chlorek metylenu 1:1, a pozostałość otrzymaną w wyniku odparowania przesączu rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny chlorek metylenu/mentol 1:1. Wydajność surowego produktu wynosi 3,9 g. Oczyszczenia dokonuje się również tak, jak to opisano w powyższym przykładzie I. Oczyszczony ester mentylowy gangliozydu Gmi otrzymuje się z wydajnością 4,2 g.

Analiza spektroskopowa IR przeprowadzona przy użyciu pastylek KBr wykazuje typowe pasmo estru przy 1750 cm^-1. Analiza chromatograficzna otrzymanego produktu, wykonana w taki sposób, jak opisano w powyższym przykładzie I, wykazuje obecność jednolitego związku o Rf 0,93 i nie wykazuje obecności gangliozydu Gmi i jego estru wewnętrznego /o Rf, odpowiednio, 0,65 i 0,75/. W rezultacie hydrolizy przeprowadzonej z udziałem Na2CC>3 sposobem opisanym w powyższym przykładzie I otrzymuje się gangliozyd Gmi.

Przykład XV. Mieszanina estrów mentylowych mieszaniny gangliozydów. Mieszaninę estrów mentylowych wytwarza się i wyodrębnia takim samym sposobem, jaki w przypadku mieszaniny estrów metylowych opisano w powyższym przykładzie II, jednakże przy użyciu zamiast alkoholu metylowego i metanolanu sodowego, mentolu i mentalonalu sodowego, oraz przy ogrzewaniu z użyciem łaźni wodnej i z zastosowaniem 5g mieszaniny estrów wewnętrznych i 1038,8 mg/5,6 milimola/ mentanolanu sodowego. Przemycia żywicy Dowex dokonuje się przy użyciu mieszaniny alkohol mentylowy/ chlorek metylenu 1:1 i pozostałość otrzymaną w wyniku odparowania przesączu rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny chloroform/etanol 1:1. Wydajność surowego produktu wynosi 5,2 g. Oczyszczenia dokonuje się również tak, jak to opisano w przykładzie III. Oczyszczoną mieszaninę estrów otrzymuje się z wydajnością 4,3 g.

Analiza spektroskopowa IR przeprowadzona przy użyciu pastylek KBr wykazuje typowe pasmo estru 1750 cm^-1. Produkt ten poddany chromatografii na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym, z użyciem świeżo przygotowanego układu chloroform/metanol/ IM wodorotlenek czterometyloamoniowy 55:45:10, przy zastosowaniu odczynnika Ehrlicha do określania, wykazuje Rf 0,20-0,60. Zajście transestryfikacji w stopniu całkowitym wykazuje się w taki sam sposób, jaki opisano w powyższym przykładzie II.

Przykład XVI. Ester tetrahydrofurfurylowy gangliozydu Gmi. Ester tetrahydrofurfurylowy gangliozydu Gmi wytwrza się i wyodrębnia takim samym sposobem, jaki w przypadku estru metylowego opisano w poprzednim przykładzie I, jednakże przy użyciu zamiast alkoholu metylowego i metanolanu sodowego, alkoholu tetrahydrofurfurylowego i tetrahydrofurfuranolanu sodowego, oraz przy ogrzewaniu z użyciem łaźni wodnej i z zastosowaniem estru wewnętrznego i tetrahydrofurfuranolanu sodowego w takich samych ilościach molowych, jakie podano w powyższym przykładzie I. Przemycia żywicy Dowex dokonuje się przy użyciu alkoholu tetrahydrofurfurylowego, a pozostałość otrzymaną w wyniku odparowania przesączu rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny chlorek metylenu/alkohol tetrahydrofurfurylowy 1:1. Wydajność surowego produktu wynosi 5,9 g. Oczyszczenia dokonuje się również tak, jak to opisano w powyższym przykładzie I. Oczyszczony ester tetrahydrofurfurylowy gangliozydu Gmi otrzymuje się z wydajnością 4,2 g.

Analiza spektroskopowa IR przeprowadzona przy użyciu pastylek KBr wykazuje typowe pasmo estru przy 1750 cm^-1. Analiza chromatograficzna otrzymanego produktu, wykonana w taki sposób, jaki opisano w powyższym przykładzie I, wykazuje obecność jednolitego związku o Rf 0,72 i nie wykazuje obecności gangliozydu Gmi i jego estru wewnętrznego /o Rf, odpowiednio, 0,65 i 0,75/. W rezultacie hydrolizy przeprowadzonej z udziałem NazCCh sposobem opisanym w powyższym przykładzie otrzymuje się gangliozyd Gmi

Przykład XVII. Mieszanina estrów tetrahydrofurfurylowych mieszaniny gangliozydów. Mieszaninę estrów tetrahydrofurfurylowych wytwarza się i wyodrębnia takim samym sposobem jaki w przypadku mieszaniny estrów metylowych opisano w powyższym przykładzie II, jednakże przy użyciu zamiast alkoholu metylowego i metanolanu sodowego, alkoholu tetrahydrofurfurylowego i tetrahydrofurfuranolanu sodowego, oraz przy ogrzewaniu z użyciem łaźni wodnej i z zastosowaniem 5 g mieszaniny estrów wewnętrznych i 727,5 mg /5,86 milimola/ tetrahydrofurfuranolanu sodowego. Przemycia żywicy Dowex dokonuje się przy użyciu alkoholu tetrahydrofurfurylowego i pozostałość otrzymaną w wyniku odparowania przesączu rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny chloroform/alkohol etylowy 1:1. Wydajność surowego produktu wynosi 5,2 g. Oczyszczenia dokonuje się również tak, jak to opisano w powyższym przykładzie II. Oczyszczoną mieszaninę estrów otrzymuje się z wydajnością 4,2 g.

151 289

Analiza spektroskopowa IR przeprowadzona przy użyciu pastylek KBr wykazuje typowe pasmo estru 1750 cm¹. Produkt ten poddany chromatografii na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym, z użyciem świeżo przygotowanego układu chloroform/alkohol metylowy/ IM wodorotlenek czterometyloamoniowy 55:45:10 i przy zastosowaniu odczynnika Ehrlicha do określania, wykazuje Rf 0,45-0,68 /mieszanina gangliozydów wykazuje wartość Rf 0,20-0,60/. Zajście transestryfikacji w stopniu całkowitym wykazuje się w taki sam sposób, jaki opisano w powyższym przykładzie II.

Przykład XVIII. Ester tetrahydro-2H-piran-4-ylowy gangliozydu Gmi. Ester tetrahydro2H-piran-4-ylowy gangliozydu Gmi wytwarza się i wyodrębnia takim samym sposobem, jaki w przypadku estru metylowego opisano w powyższym przykładzie I, jednakże przy użyciu zamiast alkoholu metylowego i metanolanu sodowego, alkoholu tetrahydro-2H-piranylowego i tetrahydro2H-piran-4-olanu sodowego, oraz przy ogrzewaniu z użyciem łaźni wodnej i z zastosowaniem estrów wewnętrznego i tetrahydro-2H-piran-4-olanu sodowego w takich samych ilościach molowych, jakie podano w powyższym przykładzie I. Przemycia żywicy Dowex dokonuje się przy użyciu alkoholu tetrahydro-2H-piran-4-ylowego i pozostałość otrzymaną w wyniku odparowania przesączu rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny chlorek metylenu/alkohol 1:1. Wydajność produktu surowego wynosi 5,1 g. Oczyszczenia dokonuje się również tak, jak to opisano w powyższym przykładzie I. Oczyszczony ester tetrahydro-2H-piran-4-ylowy gangliozydu Gmi otrzymuje się z wydajnością 4,3 g.

Analiza spektroskopowa IR przeprowadzona z użyciem pastylek KBr wykazuje typowe pasmo estru przy 1750 cm^-1. Analiza chromatograficzna otrzymanego produktu, wykonana w taki sposób, jak to opisano w powyższym przykładzie I, wykazuje obecność jednolitego związku o Rf 0,73 i nie wykazuje obecności gangliozydu Gmi i jego estru wewnętrznego /o Rf, odpowiednio, 0,65 i 0,75/. W rezultacie hydrolizy przeprowadzonej z udziałem NaaCCb sposobem opisanym w powyższym przykładzie I, otrzymuje się gangliozyd Gmi.

Przykład XIX. Mieszanina estrów tetrahydro-2H-piran-4-ylowych mieszaniny gangliozydów. Mieszaninę estrów tetrahydro-2H-piran-4-ylowych wytwarza się i wyodrębnia takim samym sposobem, jaki w przypadku mieszaniny estrów metylowych opisano w powyższym przykładzie II, jednakże przy użyciu zamiast alkoholu metylowego i metanolanu sodowego, alkoholu tetrahydro2H-piran-4-ylowego i tetrahydro-2H-piran-4-olanu sodowego, oraz przy ogrzewaniu z użyciem łaźni wodnej i z zastosowaniem 5 g mieszaniny estrów wewnętrznych i 727,5 mg /5,86 milimola/ tetrahydro-2H-piran-4-olanu sodowego. Przemycia żywicy Dowex dokonuje się przy użyciu alkoholu tetrahydro-2H-piran-4-ylowego i pozostałość otrzymaną w wyniku odparowania przesączu rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny chloroform/alkohol etylowy 1:1. Wydajność produktu surowego wynosi 5,3 g. Oczyszczenia dokonuje się również tak, jak to opisano w powyższym przykładzie III. Oczyszczoną mieszaninę estrów otrzymuje się z wydajnością 4,5 g.

Analiza spektroskopowa IR przeprowadzona przy użyciu pastylek KBr wykazuje typowe pasmo estru 1750 cm”¹. Produkt ten poddany chromatografii na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym, z użyciem świeżo przygotowanego układu chloroform/alkohol metylowy/ IM wodorotlenek czterometyloamoniowy 55:45:10, przy zastosowaniu odczynnika Ehrlicha do określania, wykazuje Rf 0,48-0,72 /mieszanina gangliozydów wykazuje wartość Rf 0,20-0,60/. Zajście transestryfikacji w stopniu całkowitym wykazuje się w taki sam sposób, jaki opisano w powyższym przykładzie II.

Przykład XX. Ester 1-heptylowy gangliozydu Gmi. Ester 1-heptylowy gangliozydu Gmi wytwarza się i wyodrębnia takim samym sposobem, jaki w przypadku estru metylowego opisano w powyższym przykładzie I, jednakże przy użyciu zamiast alkoholu metylowego i metanolanu sodowego, alkoholu 1-heptylowego i 1-heptanolanu sodowego, oraz przy ogrzewaniu z użyciem łaźni wodnej i z zastosowaniem estru wewnętrznego i 1-heptanolanu sodowego w takich samych ilościach molowych, jakie podano w powyższym przykładzie I. Przemycia żywicy Dowex dokonuje się przy użyciu alkoholu 1-heptylowego i pozostałość otrzymaną w wyniku odparowania przesączu rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny chlorek metylenu/alkohol 1-heptylowy 1:1. Wydajność produktu surowego wynosi 3,9 g. Oczyszczenia dokonuje się również tak, jak to opisano w powyższym przykładzie I. Oczyszczony ester 1-heptylowy gangliozydu Gmi otrzymuje się z wydajnością 4,3 g.

151 289

Analiza spektroskopowa IR przeprowadzona przy użyciu pastylek KBr wykazuje typowe pasmo estru przy 1750 cm^-1. Analiza chromatograficzna otrzymanego produktu, wykonana w taki sposób, jaki opisano w powyższym przykładzie I, wykazuje obecność jednolitego związku o Rf 0,89 i nie wykazuje obecności gangliozydu Gmi i jego estru wewnętrznego /o Rf, odpowiednio, 0,65 i 0,75/. W rezultacie hydrolizy przeprowadzonej z udziałem Na2CC>3 sposobem opisanym w powyższym przykładzie I otrzymuje się gangliozyd Gmi .

Przykład XI. Mieszanina estrów 1-heptylowych mieszaniny gangliozydów. Mieszaninę estrów 1-heptylowych wytwarza się i wyodrębnia takim samym sposobem, jaki w przypadku mieszaniny estrów metylowych opisany został w powyższym przykładzie II, jednakże przy użyciu w tym przypadku zamiast alkoholu metylowego i metanolanu sodowego, alkoholu 1-heptylowego i

1- heptanolanu sodowego, oraz przy ogrzewaniu z użyciem łaźni wodnej i z zastosowaniem 5g mieszaniny estrów wewnętrznych i 809,8 mg/5,86 milimola/ 1-heptanolanu sodowego. Przemycia żywicy Dowex dokonuje się przy użyciu alkoholu 1-heptylowego i pozostałość otrzymaną w wyniku odparowania przesączu rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny chloroform/alkohol etylowy 1:1. Wydajność produktu surowego wynosi 5,2 g. Oczyszczenia dokonuje się również tak, jak to opisano w powyższym przykładzie II. Oczyszczoną mieszaninę estrów otrzymuje się z wydajnością 4,3 g.

Analiza spektroskopowa IR przeprowadzona przy użyciu pastylek KBr wykazuje typowe pasmo estru 1750 cm^-1. Produkt ten poddany chromatografii na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym, z użyciem świeżo przygotowanego układu chloroform/alkohol metylowy/ IM wodorotlenek czterometyloamoniowy 55:45:10, przy zastosowaniu odczynnika Ehrlicha do określania, wykazuje Rf 0,68-0,90. Mieszanina gangliozydów wykazuje wartość Rf 0,20-0,60. Zajście transestryfikacji w stopniu całkowitym wykazuje się w taki sam sposób, jaki opisano w powyższym przykładzie II.

Przykład XXII. Ester 2-metylo-1-pentyIowy gangliozydu Gmi. Ester 2-metylo-1-pentylowy gangliozydu Gmi wytwarza się i wyodrębnia takim samym sposobem, jaki w przypadku estru metylowego opisano w powyższym przykładzie I, jednakże przy użyciu zamiast alkoholu metylowego i metanolanu sodowego, alkoholu 2-metylo-1-pentylowego i 2-metylo-l-pentanolanu sodowego, oraz przy ogrzewaniu z użyciem łaźni wodnej i z zastosowaniem estru wewnętrznego i

2- metylo-l-pentanolanu sodowego w takich samych ilościach molowych, jakie podano w powyższym przykładzie I. Przemycia żywicy Dowex dokonuje się przy użyciu alkoholu 2-metylo-lpentylowego i pozostałość otrzymaną w wyniku odparowania przesączu rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny chlorek metylenu/alkohol 2-metylo-1-pentylo wy 1:1. Wydajność produktu surowego wynosi 5,3 g. Oczyszczenia dokonuje się również tak, jak to opisano w powyższym przykładzie I. Oczyszczony ester 2-metylo-1-pentylo wy gangliozydu Gmi otrzymuje się z wydajnością 4,4 g.

Analiza spektroskopowa IR przeprowadzona przy użyciu pastylek KBr wykazuje typowe pasmo estru przy 1750 cm^-1. Analiza chromatograficzna otrzymanego produktu, wykonana w taki sposób, jaki opisano w powyższym przykładzie I, wykazuje obecność jednolitego związku o Rf 0,90 i nie wykazuje obecności gangliozydu Gmi i jego estru wewnętrznego /o Rf, odpowiednio, 0,65 i 0,75/. W rezultacie hydrolizy przeprowadzonej z udziałem Na2CC>3 sposobem opisanym w powyższym przykładzie I otrzymuje się gangliozyd Gmi .

Przykład XXIII. Mieszanina estrów 2-metylo-1-pentyłowych mieszaniny gangliozydów. Mieszaninę estrów 2-metylo-1-pentylo wy ch wytwarza się i wyodrębnia takim samym sposobem, jaki w przypadku mieszaniny estrów metylowych opisano w powyższym przykładzie II, jednakże przy użyciu zamiast alkoholu metylowego i metanolanu sodowego, alkoholu 2-metylo-lpentylowego i 2-metylo-l-pentanolanu sodowego, oraz przy ogrzewaniu z użyciem łaźni wodnej i z zastosowaniem 5g mieszaniny estrów wewnętrznych i 727,7 mg/5,86 milimola/ 2-metylo-lpentanolanu sodowego. Przemycia żywicy Dowex dokonuje się przy użyciu alkoholu 2-metylo-lpentylowego i pozostałość otrzymaną w wyniku odparowania przesączu rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny chloroform/alkohol etylowy 1:1. Wydajność produktu surowego wynosi 5,3 g. Oczyszczenia dokonuje się również tak, jak to opisano w powyższym przykładzie II. Oczyszczoną mieszaninę estrów otrzymuje się z wydajnością 4,4 g.

151 289

Analiza spektroskopowa IR przeprowadzona przy użyciu pastylek KBr wykazuje typowe pasmo estru przy 1750 cm^-1. Produkt ten poddany chromatografii na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym, z użyciem świeżo przygotowanego układu chloroform/alkohol metylowy/ 1 M wodorotlenek czterometyloamoniowy 55:45:10, przy zastosowaniu odczynnika Ehrlicha do określania, wykazuje wartość Rf 0,70-0,93 /mieszanina gangliozydów wykazuje wartość Rf 0,20-0,60/, zajście transestryfikacji w stopniu całkowitym wykazuje się w taki sam sposób, jaki opisano w powyższym przykładzie II.

Przykład XXIV. Ester 3-metylo-2-pentylowy gangliozydu Gmi. Ester 3-metylo-2-pentylowy gangliozydu Gmi wytwarza się i wyodrębnia takim samym sposobem, jaki w przypadku estru metylowego opisano w powyższym przykładzie I, jednakże przy użyciu zamiast alkoholu metylowego i metanolanu sodowego, alkoholu 3-metylo-2-pentylowego i 3-metylo-2-pentanolanu sodowego, oraz przy ogrzewaniu z użyciem łaźni wodnej i z zastosowaniem estru wewnętrznego i

3-metylo-2-pentanolanu sodowego w takich samych ilościach molowych, jakie podano w powyższym przykładzie I. Przemycia żywicy Dowex dokonuje się przy użyciu alkoholu 3-metylo-2pentylowy i pozostałość otrzymaną w wyniku odparowania przesączu rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny chlorek metylenu/alkohol 3-metylo-2-pentylowy 1:1. Wydajność produktu surowego wynosi 5,1 g. Oczyszczenia dokonuje się również tak, jak to opisano w powyższym przykładzie I. Oczyszczony ester 3-metylo-2-pentylowy gangliozydu Gmi otrzymuje się z wydajnością 4,2 g.

Analiza spektroskopowa IR przeprowadzona przy użyciu pastylek KBr wykazuje typowe pasmo estru przy 1750 cm'¹. Analiza chromatograficzna otrzymanego produktu, wykonana w taki sposób, jaki opisano w powyższym przykładzie I, wykazuje obecność jednolitego związku o Rf 0,92 i nie wykazuje obecności gangliozydu Gmi i jego estru wewnętrznego /o Rf, odpowiednio, 0,65 i 0,75/. W rezultacie hydrolizy przeprowadzonej z udziałem Na2CC>3 sposobem opisanym w powyższym przykładzie I otrzymuje się gangliozyd Gmi .

Przykład XXV. Mieszanina estrów 3-metylo-2-pentylowych mieszaniny gangliozydów. Mieszaninę estrów 3-metylo-2-pentylowych wytwarza się i wyodrębnia takim samym sposobem, jak w przypadku mieszaniny estrów metylowych opisano w powyższym przykładzie II, jednakże przy użyciu zamiast alkoholu metylowego i metanolanu sodowego, alkoholu 3-metylo-2pentylowego i 3-metylo-2-pentanolanu sodowego, oraz przy ogrzewaniu z użyciem łaźni wodnej i z zastosowaniem 5g mieszaniny estrów wewnętrznych i 727,7 mg/5,86 milimola/ 3-metylo-2pentanolanu sodowego. Przemycia żywicy Dowex dokonuje się przy użyciu alkoholu 3-metylo-2pentylowego i pozostałość otrzymaną w wyniku odparowania przesączu rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny chloroform/etanol 1:1. Wydajność produktu surowego wynosi 5,5g. Oczyszczenia dokonuje się również tak, jak to opisano w powyższym przykładzie II. Oczyszczoną mieszaninę estrów otrzymuje się z wydajnością 4,4 g.

Analiza spektroskopowa IR przeprowadzona przy użyciu pastylek KBr wykazuje typowe pasmo estru 1750 cm'¹. Produkt ten poddany chromatografii na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym, z użyciem świeżo przygotowanego układu chloroform/metanol/ IM wodorotlenek czterometyloamoniowy i przy zastosowaniu odczynnika Ehrlicha do określania, wykazuje wartość Rf 0,72-0,95 /mieszanina gangliozydów wykazuje wartość Rf 0,20-0,60/. Zajście transestryfikacji w stopniu całkowitym wykazuje się w taki sam sposób, jaki opisano w powyższym przykładzie II.

Przykład XXVI. Ester 2-metoksyetylowy gangliozydu Gmi . Ester 2-metoksyetylowy gangliozydu Gmi wytwarza się i wyodrębnia takim samym sposobem, jaki w przypadku estru metylowego opisano w powyższym przykładzie I, jednakże przy użyciu zamiast alkoholu metylowego i metanolanu sodowego, alkoholu 2-metoksyetylowego i 2-metoksyetylowego sodowego, oraz przy ogrzewaniu z użyciem łaźni wodnej i z zastosowaniem estru wewnętrznego i 2-metoksyetanolanu sodowego w takich samych ilościach molowych, jakie podano w powyższym przykładzie I. Przemycia żywicy Dowex dokonuje się przy użyciu alkoholu 2-metoksyetylowego i pozostałość otrzymaną w wyniku odparowania przesączu rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny chlorek metylenu/alkohol 2-metoksyetylowy 1:1. Wydajność surowego produktu wynosi 4,9 g. Oczyszczenia dokonuje się również tak, jak to opisano w powyższym przykładzie I. Oczyszczony ester 2-metoksyetylowy gangliozydu Gmi otrzymuje się z wydajnością 4,3 g.

Analiza spektroskopowa IR przeprowadzona przy użyciu pastylek KBr wykazuje typowe pasmo estru przy 1750 cm'¹. Analiza chromatograficzna produktu przeprowadzona w taki sam sposób, jaki opisano w powyższym przykładzie I, wykazuje obecność jednolitego związku o Rf 0,77

151 289 i nie wykazuje obecności gangliozydu Gmi i jego estru wewnętrznego /o Rf, odpowiednio, 0,65 i 0,75/. W rezultacie hydrolizy przeprowadzonej z udziałem NasCCh sposobem opisanym w powyższym przykładzie I otrzymuje się gangliozyd Gmi.

Przykład XXVII. Mieszanina estrów 2-metoksyetylowych mieszaniny gangliozydów. Mieszaninę estrów 2-metoksyetylowych wytwarza się i wyodrębnia takim samym sposobem, jaki w przypadku mieszaniny estrów metylowych opisano w powyższym przykładzie II, jednakże przy użyciu zamiast alkoholu etylowego i metanolanu sodowego, alkoholu 2-metoksyetylowego i 2-metoksyetanolanu sodowego, oraz przy ogrzewaniu z użyciem łaźni wodnej i z zastosowaniem 5 g mieszaniny estrów wewnętrznych i 574,9 mg /5,86 milimola/ 2-metoksyetanolanu sodowego. Przemycia żywicy Dowex dokonuje się przy użyciu alkoholu 2-metoksyetylowego i pozostałość otrzymaną w wyniku odparowania przesączu rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny chloroform/alkohol etylowy 1:1. Wydajność surowego produktu wynosi 5,2 g. Oczyszczenia dokonuje się również tak, jak to opisano w powyższym przykładzie I. Oczyszczony ester 2-metoksyetylowy gangliozydu Gmi otrzymuje się z wydajnością 4,2 g.

Analiza spektroskopowa IR przeprowadzona przy użyciu pastylek KBr wykazuje typowe pasmo estru przy 1750 cm^-1. Analiza chromatograficzna otrzymanegao produktu, wykonana w taki sposób, jaki opisano w powyższym przykładzie I, wykazuje obecność jednolitego związku o Rf 0,81 i nie wykazuje obecności gangliozydu Gmi i jego estru wewnętrznego /o Rf, odpowiednio, 0,65 i 0,75/. W rezultacie hydrolizy przeprowadzonej z udziałem NazCCh sposobem opisanym w powyższym przykładzie I otrzymuje się gangliozyd Gmi.

Przykład XXIX. Mieszanina estrów l-metoksy-2-propylowych mieszaniny gangliozydów. Mieszaninę estrów l-metoksy-2-propylowych wytwarza się i wyodrębnia takim samym sposobem, jaki w przypadku mieszaniny estrów metylowych opisano w powyższym przykładzie II, jednakże przy użyciu zamiast alkoholu metylowego i metanolanu sodowego, alkoholu l-metoksy-2propylowego i l-metoksy-2-propanolanu sodowego, oraz przy ogrzewaniu z użyciem łaźni wodnej i z zastosowaniem 5g mieszaniny estrów wewnętrznych i 659,0 mg /5,86 milimola/ l-metoksy-2propanolanu sodowego. Przemycia żywicy Dowex dokonuje się przy użyciu alkoholu l-metoksy-2propylowego i pozostałość otrzymaną w wyniku odparowania przesączu rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny chloroform/alkohol etylowy 1:1. Wydajność produktu surowego wynosi 5,2 g. Oczyszczania dokonuje się również tak, jak to opisano w powyższym przykładzie II. Oczyszczoną mieszaninę estrów otrzymuje się z wydajnością 4,3 g.

Analiza spektroskopowa IR przeprowadzona przy użyciu pastylek KBr wykazuje typowe pasmo estru przy 1750 cm”¹. Produkt ten poddany chromatografii na płytkach pokrytych żelem krzemionkowym, z użyciem świeżo przygotowanego układu chloroform/alkohol metylowy/ 1 M wodorotlenek czterometyloamoniowy 55:45:10 i przy zastosowaniu odczynnika Ehrlicha do określania, wykazuje wartość Rf 0,52-0,80 /mieszanina gangliozydów wykazuje wartość Rf 0,20-0,60/. Zajście transestryfikacji w stopniu całkowitym wykazuje się w taki sam sposób, jaki opisano w powyższym przykładzie II.

Przykład XXX. Ester 1-hydroksyundec-ll-ylowy gangliozydu Gmi. 5g/3,14mmilimola/ soli potasowej gangliozydu Gmi rozpuszcza się w 50 ml dwumetylosulfotlenku i do otrzymanego roztworu dodaje się 0,42 mg /3,75 milimola/ alkoholu 11-bromo-l-undecylowego i 625 mg /3,75milimola/KJ. Całość pozostawia się w celu przereagowania na 48 godzin w temperaturze 25°C. Pod koniec reakcji otrzymany roztwór poddaje się ekstrakcji mieszaniną alkohol n- butylowy /woda 2:1 w celu usunięcia dwumetylosulfotlenku i soli. Roztwór butanolowy odparowuje się za pomocą suszenia i otrzymaną pozostałość zbiera się w 50 ml mieszaniny chloroform/alkohol metylowy 1:1, po czym wytrąca się produkt przy użyciu 250 ml acetonu.

W ten sposób otrzymuje się 5,3 produktu surowego, który następnie poddaje się oczyszczaniu preparatywną metodą chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym, przy użyciu jako rozpuszczalnika mieszaniny chloroform/alkohol metylowy/woda 60:35:8. Czyste frakcje miesza się, odparowuje i ponownie rozpuszcza w 15 ml chloroformu i izopropanolu 1:1, po czym wytrąca się produkt przy użyciu 75ml acetonu. Czysty ester 1-hydroksyundec-ll-ylowy otrzymuje się z wydajnością 4,8 g.

Analiza spektroskopowa IR przeprowadzona przy użyciu pastylek KBr wykazuje typowe pasmo estru przy 1750 cm”¹. Otrzymany produkt, poddany badaniu metodą chromatograficzną na

151 289 płytkach pokrytych żelem krzemionkowym, przy użyciu układu chloroform/alkohol metylowy /0,3% CaCk 60:40:9, oraz układu chloroform/alkohol metylowy/2,5 N amoniak 55:45:10, a także odczynnika Ehrlicha do określania, okazuje się związkiem jednolitym, wykazującym wartość Rf, odpowiednio, 0,65 i 0,52. Nie zawiera on wyjściwoego gangliozydu Gi^i/Rf, odpowiednio, 0,40 i 0,45/.

Działanie 0,1 N roztworem NaaCCb w temperaturze 60°C w ciągu godziny powoduje rozszczepienie wiązania estrowego, w wyniku czego otrzymuje się pierwotny gangliozyd Gmi.

Przykład XXXI. Ester cyklobutylowy Gmi. Ester cyklobutylowy Gmi wytwarza się i wyodrębnia w taki sposób jak ester metylowy w przykładzie I, stosując cyklobutanol i cyklobutanolan sodu zamiast alkoholu metylowego i metanolanu sodu i ogrzewając na łaźni wodnej, przy czym stosuje się te same ilości molowe estru wewnętrznego i cyklobutanolanu sodu, jak w przykładzie I.

Żywicę Dowex przemywa się mieszaniną chlorek metylenu/cyklobutanol 1:1, po czym pozostałość otrzymaną po odparowaniu przesączu rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny chlorek metylenu/cyklobutanol 1:1. Wydajność surowego produktu wynosi 4,6 g. Oczyszcza się jak przykładzie I. Wydajność oczyszczonego estru cyklobutylowego gangliozydu Gmi 3,8 g.

Analiza spektroskopowa IR przeprowadzona przy użyciu pastylek KBr wykazuje typowe pasmo estru przy 1750 cm”¹. Analiza chromatograficzna otrzymanego produktu przeprowadzona na płytkach z żelem krzemionkowym z użyciem mieszaniny chloroform/metanol /0,3% CaCk 60:35:8 i oznaczona odczynnikiem Ehrlicha wykazuje obecność jednolitego związku o Rf 0,61 i nie wykazuje obecności gangliozydu Gmi i jego estru wewnętrznego /o Rf, odpowiednio, 0,40 i 0,50/. Hydroliza z użyciem Na2Co3 według przykładu I daje gangliozyd Gmi.

Przykład XXXII. Ester cyklopropanometylowy Gmi. Cyklopropanometylowy ester Gmi wytwarza się i wyodrębnia w taki sposób jak ester metylowy w przykładzie I, stosując karbinol cyklopropylowy i cyklopropanometanolan sodu oraz ogrzewając na łaźni wodnej, przy użyciu takich samych ilości molowych estru wewnętrznego i cyklopropanometanolanu sodu, jak w przykładzie I.

Żywicę Dowex przemywa się mieszaniną chlorek metylenu/karbinol cyklopropylowy 1:1, po czym pozostałość otrzymaną przez odparowanie przesączu rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny chlorek metylenu/karbinol cyklopropylowy 1:1.

Wydajność surowego produktu wynosi 4,7 g. Oczyszcza się jak przykładzie I, otrzymując 3,7 g oczyszczonego estru cyklopropanometylowego gangliozydu Gmi.

Analiza spektroskopowa IR przeprowadzona przy użyciu pastylek KBr wykazuje typowe pasmo estru przy 1750 cm^-1. Analiza chromatograficzna produktu wykonana na na płytkach z żelem krzemionkowym z użyciem mieszaniny chloroform/metanol /0,3% CaCk 60:35:8 i oznaczona odczynnikiem Ehrlicha wykazuje obecność jednolitego związku o Rf 0,62 i nie wykazuje obecności gangliozydu Gmi i jego estru wewnętrznego /o Rf, odpowiednio, 0,40 i 0,50/. Hydroliza z użyciem NasCCh według przykładu I daje gangliozyd Gmi .

Przykład XXXIII. Ester cykloheptylowy Gmi. Cykloheptylowy ester Gmi wytwarza się i wyodrębnia jak ester metylowy w przykładzie I, stosując jednak cykloheptanol i cykloheptanolan sodu zamiast alkoholu metylowego i metanolanu sodu i ogrzewając na łaźni wodnej, przy czym stosuje się te same ilości molowe estru wewnętrznego i cykloheptanolu sodu, jak w przykładzie I.

Żywicę Dowex przemywa się mieszaniną chlorek metylenu/cykloheptanol 1:1, po czym pozostałość otrzymaną po odparowaniu przesączu rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny chlorek metylenu/cykloheptanol 1:1. Wydajność surowego produktu wynosi 4,8g.Po oczyszczeniu jak przykładzie I otrzymuje się 3,6 g oczyszczonego estru cykloheptylwoego gangliozydu Gmi .

Analiza spektroskopowa IR przeprowadzona przy użyciu pastylek KBr wykazuje typowe pasmo estru przy 1750 cm^-1. Analiza chromatograficzna produktu wykonana na płytkach z żelem krzemionkowym z użyciem mieszaniny chloroform/metanol /0,3% CaCb 60:35:8 i oznaczona odczynnikiem Ehrlicha wykazuje obecność jednolitego związku o Rf 0,67 i nie wykazuje obecności gangliozydu Gmi i jego estru wewnętrznego /o Rf, odpowiednio, 0,40 i 0,50/. Hydroliza z użyciem Na2CC>3 według przykładu I daje gangliozyd Gm-i.

Przykład XXXIV. Ester cyklohektylowy Gmi. Cyklohektylowy ester Gmi wytwarza się i wyodrębnia jak ester metylowy w przykładzie I, stosując cyklooktanol i cyklooktanolan sodu

151 289 zamiast alkoholu metylowego i metanolanu sodu i ogrzewając na łaźni wodnej, przy czym stosuje się te same ilości molowe estru wewnętrznego i cyklooktanolanu sodu, jak w przykładzie I.

Żywicę Dowex przemywa się mieszaniną chlorek metylenu/cyklooktanol 1:1, po czym pozostałość otrzymaną przez odparowanie przesączu rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny chlorek metylenu/cyklooktanol 1:1. Wydajność surowego produktu wynosi 4,9 g. Po oczyszczeniu jak w przykładzie I otrzymuje się 3,5g oczyszczonego estru cyklooktylowego gangliozydu Gmi.

Analiza spektroskopowa IR przeprowadzona przy użyciu pastylek KBr wykazuje typowe pasmo estru przy 1750 cm^-1. Analiza chromatograficzna produktu wykonana na płytkach z żelem krzemionkowym z użyciem mieszaniny chloroform/metanol /0,3% CaCk 60:35:8, oznaczona odczynnikiem Ehrlicha wykazuje obecność jednolitego związku o Rf 0,71 i nie wykazuje obecności gangliozydu Gmi i jego estru wewnętrznego /o Rf, odpowiednio, 0,40 i 0,50/. Hydroliza z użyciem Na2CC>3 według przykładu I daje gangliozyd Gmi.

Przykład XXXV. Ester 4-penten-l-ylowy Gmi. 4-penten-l-ylowy ester Gmi wytwarza się i wyodrębnia jak ester metylowy w przykładzie I, stosując 4-penten-l-ol i 4-penten-l-olan sodu zamiast alkoholu metylowego i metanolanu sodu i ogrzewając na łaźni wodnej, przy czym stosuje się te same ilości molowe estru wewnętrznego i 4-penten-l-olanu sodu, jak w przykładzie I.

Żywicę Dowex przemywa się mieszaniną chlorek metylenu/4-penten-l-ol 1:1, po czym pozostałość otrzymaną przez odparowanie przesączu rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny chlorek metylenu/4-penten-l-ol 1:1.

Wydajność surowego produktu wynosi 4,3 g. Po oczyszczeniu jak przykładzie I, otrzymuje się 3,8g oczyszczonego estru 4-penten-l-ylowego gangliozydu Gmi.

Analiza spektroskopowa produktu przeprowadzona przy użyciu pastylek KBr wykazuje typowe pasmo estru przy 1750 cm^-1. Analiza chromatograficzna produktu wykonana na płytkach z żelem krzemionkowym z użyciem mieszaniny chloroform/metanol /0,3% CaCk 60:35:8 i oznaczona odczynnikiem Ehrlicha wykazuje obecność jednolitego związku o Rf 0,62 i nie wykazuje obecności gangliozydu Gmi i jego estru wewnętrznego /o Rf, odpowiednio, 0,40 i 0,50/. Hydroliza z użyciem Na2CCk według przykładu I daje gangliozyd Gmi.

Przykład XXXVI. Ester 3-pentyn-l-ylowy Gmi. 3-pentyn-l-ylowy ester Gmi wytwarza się i wyodrębnia jak ester metylowy w przykładzie I, stosując 3-pentyn-l-ol i 3-pentyn-l-olanu sodu zamiast alkoholu metylowego i metanolanu sodu i ogrzewając na łaźni wodnej, przy czym stosuje się te same ilości molowe estru wewnętrznego i 3-pentyn-l-olanu sodu, jak w przykładzie I.

Żywicę Dowex przemywa się mieszaniną chlorek metylenu/3-pentyn-l-ol 1:1, po czym pozostałość otrzymaną po odparowaniu przesączu rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny chlorek metylenu/3-pentyn-l-ol 1:1.

Wydajność surowego produktu wynosi 4,3 g. Po oczyszczeniu jak w przykładzie I, otrzymuje się 3,7g oczyszczonego estru 3-pentyn-l-ylowego gangliozydu Gmi.

Analiza spektroskopowa IR przeprowadzona przy użyciu pastylek KBr wykazuje typowe pasmo estru przy 1750 cm^-1. Analiza chromatograficzna produktu wykonana na płytkach z żelem krzemionkowym z użyciem mieszaniny chloroform/metanol /0,3% CaCk 60:35:8, oznaczona odczynnikiem Ehrlicha wykazuje obecność jednolitego związku o Rf 0,63 i nie wykazuje obecności gangliozydu Gmi i jego estru wewnętrznego /o Rf, odpowiednio, 0,40 i 0,50/. Hydroliza z użyciem Na2CO3 według przykładu I daje gangliozyd Gmi.

Przykład XXXVII. Ester l-okten-3-ylowy Gmi . l-okten-3-ylowy ester Gmi wytwarza się i wyodrębnia jak ester metylowy w przykładzie I, stosując l-okten-3-ol i l-okten-3-olan sodu zamiast alkoholu metylowego i metanolanu sodu i ogrzewając na łaźni wodnej, przy czym stosuje się takie same ilości molowe estru wewnętrznego i l-okten-3-olanu sodu, jak w przykładzie I.

Żywicę Dowex przemywa się mieszaniną chlorek metylenu/l-okten-3-ol 1:1, po czym pozostałość otrzymaną przez odparowanie przesączu rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny chlorek metylenu/l-okten-3-ol 1:1.

Wydajność surowego produktu wynosi 4,7 g. Po oczyszczeniu jak przykładzie I otrzymuje się 3,8g oczyszczonego estru l-okten-3-ylowego gangliozydu Gmi.

Analiza spektroskopowa produktu przeprowadzona przy użyciu pastylek KBr wykazuje typowe pasmo estru przy 1750 cm^-1. Analiza chromatograficzna produktu wykonana na płytkach

151 289 z żelem krzemionkowym z użyciem mieszaniny chloroform/metanol /0,3% CaCk 60:35:8, oznaczona odczynnikiem Ehrlicha wykazuje obecność jednoli go związku o Rf 0,66 i nie wykazuje obecności gangliozydu Gmi i jego estru wewnętrznego /o Rf, odpowxednio, 0,40 i 0,50/. Hydroliza z użyciem Na2CO3 według przykładu I daje gangliozyd Gmi.

Przykład XXXVIII. Ester izobornylowy Gmi. Izobornylowy ester Gmi wytwarza się i wyodrębnia jak ester metylowy w przykładzie I, stosując izoborneol i izoborneolan sodu zamiast metanolu i metanolanu sodu i ogrzewając na łaźni wodnej, przy czym stosuje się te same ilości molowe estru wewnętrznego i izoborneolanu sodu, jak w przykładzie I.

Żywicę Dowex przemywa się mieszaniną chlorek metylenu/izoborneol 1:1, po czym pozostałość otrzymaną przez odparowanie przesączu rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny chlorek metylenu/izoborneol 1:1.

Wydajność surowego produktu wynosi 1,5 g. Po oczyszczeniu jak przykładzie I otrzymuje się 3,9 g oczyszczonego estru izobornylowego gangliozydu Gm-i.

Analiza spektroskopowa produktu przeprowadzona przy użyciu pastylek KBr wykazuje typowe pasmo estru przy 1750 cm”¹. Analiza chromatograficzna produktu wykonana na płytkach z żelem krzemionkowym z użyciem mieszaniny chloroform/metanol /0,3% CaCk 60:35:8, oznaczona odczynnikiem Ehrlicha wykazuje obecność jednolitego związku o Rf 0,76 i nie wykazuje obecności gangliozydu Gmi i jego estru wewnętrznego /o Rf, odpowiednio, 0,40 i 0,50/. Hydroliza z użyciem Na2CO3 według przykładu I daje gangliozyd Gmi.

Przykład XXXIX. Ester nikotynylowy Gmi . Nikotynylowy ester Gmi wytwarza się i wyodrębnia jak ester metylowy w przykładzie I, stosując 3-pirydylokarbinol i nikotynolan sodu zamiast metanolu i metanolanu sodu i ogrzewając na łaźni wodnej, przy czym stosuje się te same ilości molowe estru wewnętrznego i nikotynolanu sodu, jak w przykładzie I.

Żywicę Dowex przemywa się mieszaniną chlorek metylenu/3-pirydylokarbinol 1:1, po czym pozostałość otrzymaną przez odparowanie przesączu rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny chlorek metylenu/3-pirydylokarbinol 1:1.

Wydajność surowego produktu wynosi 5,1 g. Po oczyszczeniu jak przykładzie I otrzymuje się 3,6g estru nikotynylowego gangliozydu GmiAnaliza spektroskopowa produktu przeprowadzona przy użyciu pastylek KBr wykazuje typowe pasmo estru przy 1750 cm”¹. Analiza chromatograficzna produktu wykonana na płytkach z żelem krzemionkowym z użyciem mieszaniny chloroform/metanol /0,3% CaCk 60:35:8, oznaczona odczynnikiem Ehrlicha wykazuje obecność jednolitego związku o Rf 0,62 i nie wykazuje obecności gangliozydu Gmi i jego estru wewnętrznego /o Rf, odpowiednio, 0,40 i 0,50/. Hydroliza z użyciem Na2CC>3 według przykładu I daje gangliozyd Gmi .

Przykład XL. Ester 2-/2-tienylo/etylowy Gmi. 2-/2-tienylo/etylowy ester Gmi wytwarza się i wyodrębnia jak ester metylowy w przykładzie I, stosując 2-/2-tienylo/etanol i 2-/2tienylo/etanolan sodu zamiast metanolu i metanolanu sodu i ogrzewając na łaźni wodnej, przy czym stosuje się te same ilości molowe estru wewnętrznego i 2-/2-tienylo/etanolanu sodu, jak w przykładzie I.

Żywicę Dowex przemywa się mieszaniną chlorek metylenu/2-/2-tienylo/etanol 1:1, po czym pozostałość otrzymaną po odparowaniu przesączu rozpuszcza się w 50 ml mieszaniny chlorek metylenu/2-/2-tienylo/etanol 1:1.

Wydajność surowego produktu wynosi 4,9 g. Po oczyszczeniu jak przykładzie I otrzymuje się 3,5g oczyszczonego estru 2-/2-tienylo/etylowego gangliozydu Gmi.

Analiza spektroskopowa produktu przeprowadzona przy użyciu pastylek KBr wykazuje typowe pasmo estru przy 1750 cm”¹. Analiza chromatograficzna produktu wykonana na płytkach z żelem krzemionkowym z użyciem mieszaniny chloroform/metanol /0,3% CaCk 60:35:8, oznaczona odczynnikiem Ehrlicha wykazuje obecność jednolitego związku o Rf 0,59 i nie wykazuje obecności gangliozydu Gmi i jego estru wewnętrznego / o Rf, odpowiednio, 0,40 i 0,50/. Hydroliza z użyciem Na2CO3 według przykładu I daje gangliozyd Gmi .

Przykład XLI. Ester metylowy Gdit>. 500mg /0,28mM/estru wewnętrznego gangliozydu Gdió rozpuszcza się w 5 ml bezwodnej mieszaniny N-metylopirolidonu /NMP/ i metanolu 4:1.

Dodaje się 15,1 mg /0,28 mM/ metanolanu sodu rozpuszczonego w bezwodnym NMP i mieszaninę ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną w ciągu 2 godz. Pod koniec reakcji mieszaninę

151 289 23 zobojętnia się bezwodną żywicą Dowex AG 50x8/ postać H⁺/, żywicę odsącza się i przemywa metanolem i wreszcie dodaje się 100 ml acetonu w celu wytrącenia produktu.

440 mg surowej pochodnej oczyszcza się za pomocą chromatografii na żelu krzemionkowym stosując jako rozpuszczalnik mieszaninę chloroform/metanol/woda 65:32:7.

Czyste frakcje zbiera się, odparowuje przez wysuszenie, rozpuszcza ponownie w 1,5 ml mieszaniny chloroform/metanol 1:1 i wytrąca się za pomocą 7,5 ml acetonu 390 mg produktu, stanowiącego ester metylowy gangliozydu GDit>.

Analiza spektroskopowa przeprowadzona przy użyciu pastylek KBr wykazuje typowe pasmo estru przy 1750 cm^-1. Chromatografia na płytkach z żelem krzemionkowym z użyciem mieszaniny chloroform/metanol /0,3% CaCk 60:35:8 i oznaczona czynnikiem Ehrlicha /Rf 0,52/wykazała, że produkt stanowi związek, wolny od estru wewnętrznego stosowanego jako substrat /o Rf — 0,55/ i od gangliozydu Gdw /o Rf = 0,19/.

Przez potraktowanie 0,1 N roztworem NaaCCk w temperaturze 60°C w ciągu 1 godz. rozszczepia się wiązanie wyjściowe i otrzymuje się wyjściowy gangliozyd Gduj.

Przykład XLII. Ester etylowy Gnt>. 500mg /0,24mM/ estru wewnętrznego gangliozydu Gtw rozpuszcza się w 5 ml bezwodnej mieszaniny N-metylopirolidonu /NMP/ i metanolu 4:1.

Dodaje się 13,0 mg /0,24 mM/ metanolanu sodu rozpuszczonego w bezwodnym NMP i mieszaninę ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną w ciągu 2 godz. Pod koniec reakcji mieszaninę zobojętnia się bezwodną żywicą Dowex AG 50x8/ postać H⁺/, żywicę odsącza się i przemywa metanolem i wreszcie dodaje się 100 ml acetonu w celu wytrącenia produktu.

425 mg surowej pochodnej oczyszcza się za pomocą chromatografii na żelu krzemionkowym stosując jako rozpuszczalnik mieszaninę chloroform/metanol/woda 65:32:7.

Zbiera się czyste frakcje, odparowuje przez wysuszenie, rozpuszcza ponownie w 1,5 ml mieszaniny chloroform/metanol 1:1 i wytrąca się za pomocą 7,5 ml acetonu 380 mg produktu, stanowiącego ester metylowy gangliozydu Gti b.

Analiza spektroskopowa przeprowadzona przy użyciu pastylek KBr wykazuje typowe pasmo estru przy 1750 cm^-1. Chromatografia na płytkach z żelem krzemionkowym z użyciem mieszaniny chloroform/metanol /0,3% CaCk 60:35:8, oznaczona czynnikiem Ehrlicha /Rf 0,60/ wykazuje, że produkt stanowi jednolity związek, wolny od estru wewnętrznego zastosowanego jako substrat /o Rf = 0,65/ i od gangliozydu Gtw /o Rf = 0,13/.

Przez potraktowanie 0,1 N roztworem NazCCk w temperaturze 60°C w ciągu 1 godz. rozszczepia się wiązanie estrowe i otrzymuje się wyjściowy gangliozyd Gtw.

Przykład XLIII. Ester pentylowy Gti b- 500 mg /0,228 mM/ soli sodowej Gti b rozpuszcza się w 5 ml bezwodnej mieszaniny N-metylopirolidonu i 309,5 mg /2,05 mM/ 1-bromopentanolu i dodaje się do roztworu 340 mg /2,05 mM/ jodku ptasu. Pozostawia się do przereagowania na 24 godzin w temperaturze 25°C. Pod koniec reakcji dodaje się powoli 50 ml acetonu w celu wytrącenia produktu. 475 mg surowej pochodnej oczyszcza się za pomocą chromatografii na żelu krzemionkowym stosując jako rozpuszczalnik mieszaninę chloroform/metanol/woda 65:32:7.

Zbiera się czyste frakcje, odparowuje przez wysuszenie, ponownie rozpuszcza w 1,5 ml mieszaniny chloroform/metanol 1:1 i wytrąca się za pomocą 7,5 ml acetonu.

Wydajność czystego estru pentylowego: 390 mg.

Analiza spektroskopowa przeprowadzona przy użyciu pastylek KBr wykazuje typowe pasmo estru przy 1750 cm^-1. Chromatografia na płytkach z żelem krzemionkowym z użyciem mieszaniny chloroform/metanol /0,3% CaCk 60:35:8, oznaczona odczynnikiem Ehrlicha wykazuje jednolity produkt /Rf = 0,71/ wolny od estru wewnętrznego zastosowanego jako substrat gangliozydu Gti b /R_f = 0,13/.

Przez potraktowanie 0,1 N roztworem NazCCh w temperaturze 60°C w ciągu 1 godz. rozszczepia się wiązanie estrowe i otrzymuje się wyjściowy gangliozyd Gtw i alkohol pentylowy.

Przykład XLIV. Ester dodecylowy Gtw. 500mg /0,228mM/ soli sodowej Gtw rozpuszcza się w 5 ml bezwodnego N-metylopirolidonu i dodaje się do roztworu 607 mg /2,05 mM/ 1-jodododekanolu. Pozostawia się do przereagowania na 24 godz. w temperaturze 25°C. Pod koniec reakcji dodaje się powoli 500 ml acetonu w celu wytrącenia produktu.

510 mg surowej pochodnej oczyszcza się za pomocą chromatografii na żelu krzemionkowym stosując jako rozpuszczalnik mieszaninę chloroform/metanol/woda 65:32:1.

151 289

Zbiera się czyste frakcje, odparowuje przez wysuszenie, rozpuszcza ponownie w 1,5 ml mieszaniny chloroform/metanol 1:1 i wytrąca się za pomocą 7,5 ml acetonu. Wydajność czystego estru dodecylowego: 395 mg.

Analiza spektroskopowa przeprowadzona przy użyciu pastylek KBr wykazuje typowe pasmo estru przy 1750 cm^-1. Chromatografia na płytkach z żelem krzemionkowym z użyciem mieszaniny chloroform/metanol /0,3% CaCb 60:35:8, oznaczona czynnikiem Ehrlicha wykazuje jednolity produkt /Rf = 0,79/, wolny od estru wewnętrznego zastosowanego jako substrat gangliozydu G-rib /R_f = 0,13/.

Przez potraktowanie 0,1 N roztworem Na2CC>3 w temperaturze 60°C w ciągu 1 godz. rozszczepia się wiązanie estrowe i otrzymuje się wyjściowy gangliozyd Gub i alkohol dodecylowy.

Claims (4)

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania nowych estrów gangliozydów, w których grupy karboksylowe reszt kwasu sjalowego są zestryfikowane resztami alkoholowymi, przedstawionych wzorem 10, w którym n oznacza liczbę całkowitą 1-5, a R oznacza rodnik alkilowy o 1-13 atomach C, ewentualnie podstawiony rodnikiem alkoksylowym o 1-4 atomach C, hydroksylowym, cyjanowym, fenylowym, cykloalkilowym o 3-6 atomach C, alkoksykarbonylowym o 1-4 atomach C, tienylowym lub dimetylofenylowym, dalej rodnik alkenylowy o 2-10 atomach C, alkinylowy o 2-6 atomach C, fenylowy, cykloalkilowy o 3-8 atomach C, nikotynylowy, izobornylowy, mentylowy, tetrahydrofurfurylowy, tetrahydropiranylowy lub cyjanobutyrylowy z wyjątkiem estru metylowego gangliozydu Gmi , Gm2, Gm3 lub Goia, znamienny tym, że poddaje się ester wewnętrzny wyżej wymienionego gangliozydu lub mieszaninę estrów wewnętrznych gangliozydów, ewentualnie w postaci ich soli z metalem alkalicznym, reakcji z alkoholem o wzorze ROH, w którym R ma wyżej podane znaczenie, ewentualnie w obecności alkoholanu metalu, odpowiadającego temu alkoholowi.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako alkohol stosuje się alkohol metylowy, etylowy, propylowy, izopropylowy, n-butylowy, izobutylowy, Ill-rzęd. butylowy, undecylowy, hydroksydecylowy, heptylowy, 2-metylo-1-pentylowy, allilowy, etoksykarbonylometylowy, etoksykarbonyloetylowy, metoksyetylowy, l-metoksy-2-propylowy, benzylowy, fenetylowy, cykloheksylowy lub cykloheksyloetylowy.

3. Sposób według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że jako alkoholan metalu stosuje się alkoholan metalu alkalicznego, pochodzący od wspomnianego alkoholu.

WZÓR 1

CH_?-OI ^Z .

CH - NH - acyl

CH-OH

I

CH (CH₂)n-CH₃ WZOR 3

CH₉-0I ^z

CH-NH - acyl I

CH -OH I

CH₉ ^z\ ch₂ (CH2)n-CH3

WZOR 4

WZOR 5

Gal(1—3)GalNAC(1—4)Gal(1—4)Glc(1—*Ί ) Ceramid

NA NA

WZÓR 6

Gal(l —*3) GalNAC(1—4)Gal (1

—4)Glc (1 —► !) Ceramid

NANA

WZÓR 7

Gal(1 — 3)GalNZC (1 —A) Gal(1 )Glc(l —1 )Ceramid

Φ

NANA m

NANA

WZÓR β

Galii— 3)GalNAC (1—4) Gal(1—4) Gic (1 —1) Ceramid

NANA NANA

NANA

WZÓR 9

rooc nim kwas sjalowy nim oh nim oh ΊΙΙΙΟΗ ^3 ~~~ *- «< ceramid rooc nim olllll olllll _ J OH OH n — = Ó ł

OH oligosacharyd OH

WZÓR 10 •θΜΙ ester

FIG.