Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibioticums, das nachstehend mit SL 21429 bezeichnet wird, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Stamm der Pilzspecies Chaetomium globosum Kunze ex Fries in einem Nährmedium züchtet und das Antibioticum aus dem Nährmedium isoliert und reinigt.
Ein neuer, erfindungsgemäss zu verwendender Stamm von Chaetomium globosum Kunze ex Fries wurde aus einer in Küsnacht in der Schweiz gefundenen Erdprobe isoliert und eine Probe davon beim United States Departement of Agriculture (Northern Utilization Research and Development Division), Peoria, Ill./USA, unter der Nummer NRRL 3877 deponiert.
Der neue Stamm der Pilzspecies Chaetomium globosum Kunze ex Fries wächst auf einem Malzextrakt-Hefeextrakt-Agar bei 12 bis 37 , vorzugsweise bei 27 9C, und bildet auf diesem Nährmedium ein weisses bis hellgraues Luftmycel und ein helles Substratmycel. Nach einigen Tagen der Inkubation werden dunkle, meist olive-braune Perithecien gebildet. Die Rückseite der Kolonie und das Substrat wird durch ein braunes Pigment verfärbt.
Der Pilz bildet in Reinkultur, z. B. auf Malzagar bei Temperaturen von 12 bis 30 C leicht Fruchtkörper, bei den höheren Temperaturen innert 8-10 Tagen. Sie sind je nach Kulturbedingungen grün bis olivgrün und zuletzt oft dunkelbraun. Die Fruchtkörper sind kugelig und haben einen Durchmesser von 200-300,u. Am Scheitel sind sie von einem rundlichen Porus durchbohrt. Ihre Peridie besteht aus mäandrisch zusammengewachsenen, braunen Zellen. Sie ist ziemlich derbhäutig. Aus der äussersten Zellschicht entspringen rund um den Porus zahlreiche, seitlich etwas weniger zahlreiche bräunlich-grüne Haare. An der Basis sind diese bis zu 4,5 M dick, verschmälern sich allmählich bis auf 3 M und verlaufen in deutlichen Wellen.
Oberflächlich sind sie von zahlreichen Dornen besetzt und in der ganzen Länge septiert. Die keuligen, 50-70 x 12-15 M grossen, gestielten Asci entspringen der inneren Perithecienbasis. Sie sind von einer zarten Wand umgeben, welche vor der Reife der je acht Ascosporen aufgelöst wird. Die Ascosporen sind einzellig, mehr oder weniger zitronenförmig mit etwas zugespitzten Enden, im Querschnitt aber nicht genau rund sondern elliptisch. Anfangs sind sie farblos, später rötlich und zuletzt dunkelbraun. An einem Ende sind sie mit einem deutlich wahrnehmbaren Keimporus versehen und messen 9-12 (meist 10-11) Min der Länge und 6-9 (meist 7,5-8,5) M in der Breite.
Der Stamm NRRL 3877 von Chaetomium globosum Kunze ex Fries entspricht in seiner Morphologie und Physiologie der Beschreibung von L.M. Ames in: A Monograph of the Chaetomiaceae , The United States Army Research and Development Series, No. 2, 1961, pp. 26-27. Er unterscheidet sich von dieser Beschreibung in der betont grünen Färbung der Fruchtkörper, die durch die Farbe derHaare verursacht wird.
Der neue Stamm NRRL 3877 lässt sich auf vielerlei Nährböden, die die üblichen Nährstoffe für Pilze enthalten, züchten. So verwendet dieser Stamm die für kohlenstoffheterotrophe Mikroorganismen üblicherweise benutzten Nährstoffe, beispielsweise Glucose, Saccharose, Stärke, Lactose, Dextrin usw. als Kohlenstoffquelle, organische und anorganische, stickstoffhaltige Verbindungen, wie Pepton, Hefe- oder Fleischextrakte, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Aminosäuren als Stickstoffquellen sowie die üblichen Mineralsalze und Spurenelemente.
Das neue Antibioticum SL 21429 kann man in der Weise herstellen, dass ein flüssiges Nährmedium mit einer Sporensuspension des neuen Stammes von Chaetomium globosum beimpft und die Kultur 612 Tage, vorzugsweise 10 Tage, bei 12 bis 37 , vorzugsweise bei 27"bei einem PH-Wert von 5,7-6,0 inkubiert wird. Die Züchtung kann unter aeroben Bedingungen in einer Oberflächenkultur oder submers unter Schütteln oder in Fermentern mit Begasung durch Luft oder Sauerstoff unter Rühren erfolgen. Sobald eine maximale Menge an Antibioticum produziert worden ist, wird filtriert und das Antibioticum durch extraktive und/oder adsorptive Arbeitsmethoden auf an sich bekannte Weise aus dem Kulturfiltrat bzw. aus dem Mycel gewonnen.
Das neue Antibioticum kann chromatographisch, durch Kristallisation oder mittels Gegenstromverteilung aus dem Rohextrakt isoliert werden.
Eine Methode, die sich als vorzugsweise geeignet erwiesen hat, ist die Extraktion des Filtrates mit Aethylenchlorid, jedoch können auch andere organische Lösungsmittel, wie z. B.
Benzol, Chloroform, Butylacetat, Methylenchlorid, Butanol oder Essigester verwendet werden.
Anschliessend werden die Extrakte vom Lösungsmittel befreit, z. B. durch Destillation, und der Rückstand zur Isolierung des Antibioticums auf chromatographischem Wege an adsorbierenden Mitteln, wie Tonerde, Kieselgel, Magnesiumsilikat und dergleichen, Gegenstromverteilung und/oder Kristallisation gereinigt.
Das neue Antibioticum SL 21429 zeichnet sich durch interessante pharmakologische Eigenschaften aus und kann daher als Heilmittel verwendet werden.
Das neue Antibioticum SL 21429 besitzt eine oedemhemmende Wirkung, wie sich durch Tierversuche (Bradykinin Pfotenoedem an der Ratte) zeigen lässt. Die zu verwendenden Dosen variieren naturgemäss je nach der Art der Administration und des zu behandelnden Zustandes. Im allgemeinen werden jedoch beiTesttieren befriedigende Resultate mit einer Dosis von 0,1-10 mg/kg i.p. erhalten. Diese Dosis kann nötigenfalls in 2 bis 3 Anteilen oder auch als Retardform verabreicht werden.
Weiterhin besitzt das neue Antibioticum SL 21429 ulcusprotektive Eigenschaften, wie die Ergebnisse am Phenylbutazon-Ulcus der Ratte sowie an der Shay-Ratte zeigen. Die zu verwendenden Dosen variieren naturgemäss je nach Art der Administration und des zu behandelnden Zustandes. Im allgemeinen werden jedoch bei Testtieren mit einer Dosis von 2,5 bis 10 mg/kg p. o. beim Phenylbutazon-Ulcus und mit einer Dosis von 0,1 bis 10 mg/kgp.o. bei der Shay-Ratte befriedigende Resultate erhalten. Diese Dosis kann nötigenfalls in 2 bis 3 Anteilen oder auch als Retardform verabreicht werden.
Weiterhin besitzt das neue Antibioticum SL 21429 eine immunosuppressive Wirkung auf die zelluläre Immunität. Im Target cell destruction-Test (Immunology 18, (1970)) hemmt das neue Antibioticum die Lyse der Target-Cells durch die sensibilisierten Milzzellen nach in-vitro-Zugabe. Bei einer Dosis von 1 mg/L tritt eine 100%ige Hemmung ein.
Für grössere Säugetiere liegt die Tagesdosis bei Verabreichung des neuen Antibioticums SL 21429 bei etwa 10 bis 100 mg. Für orale Applikation enthalten die Teildosen etwa 4 bis 50 mg des Antibioticums nebst festen oder flüssigen Trägersubstanzen.
Das erfindungsgemäss hergestellte Antibioticum SL 21429 kann als Arzneimittel allein, und zwar sowohl in reiner kristalliner oder amorpher Form als auch als Rohkonzentrat oder in entsprechenden Arzneiformen für orale, enterale oder parenterale Verabreichung verwendet werden.
In dem folgenden Beispiel, welches die Ausführung des Verfahrens erläutert, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken soll, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden. Die Schmelz- bzw. Zersetzungspunkte sind im Röhrchen bestimmt und nicht korrigiert.
Beispiel
In einem Fermenter werden 10 Liter einer Nährlösung, die pro Liter
50,0 g Maltose
10,0 g Bohnenmehl
1,0 g Pepton
0,5 Hefeextrakt
0,5 g KH2PO4
0,5 gMgSO4'7H2O
0,5 g Ca(NO3)2
0,1 g NaCl
0,05 gFeSO47H2O
0,01 g ZnCl2
0,01 gMnCl24H2O
0,005 gCuSO45H2O 0,005 g CoCI2 6 zu 6 H2O und entmineralisiertes Wasser enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes NRRL 3877 beimpft und unter Belüftung (1,0 L Luft/Min./L Nährlösung) und unter Rühren (300 U/Min.) 10 Tage bei 27 bei einem pH-Wert von 5,7 inkubiert. Die Brühe wird filtriert, wobei ca. 9 L Kulturfiltrat und ca. 1 kg Mycel erhalten werden. Das Kulturfiltrat wird dreimal mit 9 L Aethylenchlorid extrahiert.
Hierauf werden die organischen Phasen zweimal mit je 4 L Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft. Nach dem Entfetten mit Petroläther wird der Rohextrakt an Kieselgel Merck 0,05-0,2 mm chromatographiert und das neue Antibioticum SL 21429 mit Chloroform-Methanol-Gemisch (98:2) eluiert und zur Reinigung aus Aether, aus Essigester und 2 x aus Chloroform umkristallisiert.
Zusätzliches, reines Antibioticum SL 21429 lässt sich aus dem Mycel gewinnen. Dieses wird dreimal mit 1 L 90% Methanol mit dem Ultraturrax behandelt. Das so aufgeschlossene Mycel wird abfiltriert, das Methanol aus dem Filtrat abdestilliert und die wässrige Lösung dreimal mit 0,5 L Aethylenchlorid extrahiert. Die Aethylenchloridlösungen werden mit 0,3 L Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft. Der so erhaltene Rohextrakt wird - wie bei dem Kulturfiltrat beschrieben entfettet und anschliessend chromatographiert, wobei das neue Antibioticum SL 21429 erhalten wird.
Die als Ausgangsmaterial verwendete Sporensuspension wird wie folgt erhalten: Ein Nährboden, der pro Liter
20 g Cerelose
2 g Pepton
2 g Malzextrakt
2 g Hefeextrakt
2 g KH2PO4 2gMgSO4.7H2O
15 g Agar-Agar und entmineralisiertes Wasser enthält, wird mit dem Stamm NRRL 3877 beimpft und 12 Tage bei 27 C inkubiert. Der auf diesem Nährboden gewachsene Mycelrasen wird in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert.
Das neue Antibioticum SL 21429 hat die folgenden Charakteristika:
Gelbe Kristalle, die zwischen 172 und 182"schmelzen unter Bildung neuer Kristalle vom Schmelzpunkt 2380 (Zers.)
Spez. Drehung: [a] 20 = -376-(c=0,78 in Pyridin)
D
Elementaranalyse: C=73,1%, H = 6,8 %, N = 5,3 %, 0=15,1%
UV.-Spektrum: Maxima bei 221 nm (log E'= 1,96), 274 nm (log e'= 1,16), 280 nm (log e'= 1,16), 290 nm (log E'= 1,09) (in Methanol) (s. Fig. 1)
IR.-Spektrum: u. a.
Banden bei 3450,2920, 1695, 1620 cm-t (in KBr) (s. Fig. 2)
NMR.-Spektrum: (in Dimethylsulfoxyd) (siehe Fig. 3)