Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuen Antibioticums, das nachstehend mit SL 21429 bezeichnet wird, dadurch gekennzeichnet, dass man einen Stamm der Pilzspecies Chaetomium globosum Kunze ex Fries in einem Nährmedium züchtet und das Antibioticum aus dem Nährmedium isoliert und reinigt.
Ein neuer, erfindungsgemäss zu verwendender Stamm von Chaetomium globosum Kunze ex Fries wurde aus einer in Küsnacht in der Schweiz gefundenen Erdprobe isoliert und eine Probe davon beim United States Departement of Agriculture (Northern Utilization Research and Development Division), Peoria, Ill./USA, unter der Nummer NRRL 3877 deponiert.
Der neue Stamm der Pilzspecies Chaetomium globosum Kunze ex Fries wächst auf einem Malzextrakt-Hefeextrakt-Agar bei 12 bis 37 , vorzugsweise bei 27 9C, und bildet auf diesem Nährmedium ein weisses bis hellgraues Luftmycel und ein helles Substratmycel. Nach einigen Tagen der Inkubation werden dunkle, meist olive-braune Perithecien gebildet. Die Rückseite der Kolonie und das Substrat wird durch ein braunes Pigment verfärbt.
Der Pilz bildet in Reinkultur, z. B. auf Malzagar bei Temperaturen von 12 bis 30 C leicht Fruchtkörper, bei den höheren Temperaturen innert 8-10 Tagen. Sie sind je nach Kulturbedingungen grün bis olivgrün und zuletzt oft dunkelbraun. Die Fruchtkörper sind kugelig und haben einen Durchmesser von 200-300,u. Am Scheitel sind sie von einem rundlichen Porus durchbohrt. Ihre Peridie besteht aus mäandrisch zusammengewachsenen, braunen Zellen. Sie ist ziemlich derbhäutig. Aus der äussersten Zellschicht entspringen rund um den Porus zahlreiche, seitlich etwas weniger zahlreiche bräunlich-grüne Haare. An der Basis sind diese bis zu 4,5 M dick, verschmälern sich allmählich bis auf 3 M und verlaufen in deutlichen Wellen.
Oberflächlich sind sie von zahlreichen Dornen besetzt und in der ganzen Länge septiert. Die keuligen, 50-70 x 12-15 M grossen, gestielten Asci entspringen der inneren Perithecienbasis. Sie sind von einer zarten Wand umgeben, welche vor der Reife der je acht Ascosporen aufgelöst wird. Die Ascosporen sind einzellig, mehr oder weniger zitronenförmig mit etwas zugespitzten Enden, im Querschnitt aber nicht genau rund sondern elliptisch. Anfangs sind sie farblos, später rötlich und zuletzt dunkelbraun. An einem Ende sind sie mit einem deutlich wahrnehmbaren Keimporus versehen und messen 9-12 (meist 10-11) Min der Länge und 6-9 (meist 7,5-8,5) M in der Breite.
Der Stamm NRRL 3877 von Chaetomium globosum Kunze ex Fries entspricht in seiner Morphologie und Physiologie der Beschreibung von L.M. Ames in: A Monograph of the Chaetomiaceae , The United States Army Research and Development Series, No. 2, 1961, pp. 26-27. Er unterscheidet sich von dieser Beschreibung in der betont grünen Färbung der Fruchtkörper, die durch die Farbe derHaare verursacht wird.
Der neue Stamm NRRL 3877 lässt sich auf vielerlei Nährböden, die die üblichen Nährstoffe für Pilze enthalten, züchten. So verwendet dieser Stamm die für kohlenstoffheterotrophe Mikroorganismen üblicherweise benutzten Nährstoffe, beispielsweise Glucose, Saccharose, Stärke, Lactose, Dextrin usw. als Kohlenstoffquelle, organische und anorganische, stickstoffhaltige Verbindungen, wie Pepton, Hefe- oder Fleischextrakte, Ammoniumsulfat, Ammoniumnitrat, Aminosäuren als Stickstoffquellen sowie die üblichen Mineralsalze und Spurenelemente.
Das neue Antibioticum SL 21429 kann man in der Weise herstellen, dass ein flüssiges Nährmedium mit einer Sporensuspension des neuen Stammes von Chaetomium globosum beimpft und die Kultur 612 Tage, vorzugsweise 10 Tage, bei 12 bis 37 , vorzugsweise bei 27"bei einem PH-Wert von 5,7-6,0 inkubiert wird. Die Züchtung kann unter aeroben Bedingungen in einer Oberflächenkultur oder submers unter Schütteln oder in Fermentern mit Begasung durch Luft oder Sauerstoff unter Rühren erfolgen. Sobald eine maximale Menge an Antibioticum produziert worden ist, wird filtriert und das Antibioticum durch extraktive und/oder adsorptive Arbeitsmethoden auf an sich bekannte Weise aus dem Kulturfiltrat bzw. aus dem Mycel gewonnen.
Das neue Antibioticum kann chromatographisch, durch Kristallisation oder mittels Gegenstromverteilung aus dem Rohextrakt isoliert werden.
Eine Methode, die sich als vorzugsweise geeignet erwiesen hat, ist die Extraktion des Filtrates mit Aethylenchlorid, jedoch können auch andere organische Lösungsmittel, wie z. B.
Benzol, Chloroform, Butylacetat, Methylenchlorid, Butanol oder Essigester verwendet werden.
Anschliessend werden die Extrakte vom Lösungsmittel befreit, z. B. durch Destillation, und der Rückstand zur Isolierung des Antibioticums auf chromatographischem Wege an adsorbierenden Mitteln, wie Tonerde, Kieselgel, Magnesiumsilikat und dergleichen, Gegenstromverteilung und/oder Kristallisation gereinigt.
Das neue Antibioticum SL 21429 zeichnet sich durch interessante pharmakologische Eigenschaften aus und kann daher als Heilmittel verwendet werden.
Das neue Antibioticum SL 21429 besitzt eine oedemhemmende Wirkung, wie sich durch Tierversuche (Bradykinin Pfotenoedem an der Ratte) zeigen lässt. Die zu verwendenden Dosen variieren naturgemäss je nach der Art der Administration und des zu behandelnden Zustandes. Im allgemeinen werden jedoch beiTesttieren befriedigende Resultate mit einer Dosis von 0,1-10 mg/kg i.p. erhalten. Diese Dosis kann nötigenfalls in 2 bis 3 Anteilen oder auch als Retardform verabreicht werden.
Weiterhin besitzt das neue Antibioticum SL 21429 ulcusprotektive Eigenschaften, wie die Ergebnisse am Phenylbutazon-Ulcus der Ratte sowie an der Shay-Ratte zeigen. Die zu verwendenden Dosen variieren naturgemäss je nach Art der Administration und des zu behandelnden Zustandes. Im allgemeinen werden jedoch bei Testtieren mit einer Dosis von 2,5 bis 10 mg/kg p. o. beim Phenylbutazon-Ulcus und mit einer Dosis von 0,1 bis 10 mg/kgp.o. bei der Shay-Ratte befriedigende Resultate erhalten. Diese Dosis kann nötigenfalls in 2 bis 3 Anteilen oder auch als Retardform verabreicht werden.
Weiterhin besitzt das neue Antibioticum SL 21429 eine immunosuppressive Wirkung auf die zelluläre Immunität. Im Target cell destruction-Test (Immunology 18, (1970)) hemmt das neue Antibioticum die Lyse der Target-Cells durch die sensibilisierten Milzzellen nach in-vitro-Zugabe. Bei einer Dosis von 1 mg/L tritt eine 100%ige Hemmung ein.
Für grössere Säugetiere liegt die Tagesdosis bei Verabreichung des neuen Antibioticums SL 21429 bei etwa 10 bis 100 mg. Für orale Applikation enthalten die Teildosen etwa 4 bis 50 mg des Antibioticums nebst festen oder flüssigen Trägersubstanzen.
Das erfindungsgemäss hergestellte Antibioticum SL 21429 kann als Arzneimittel allein, und zwar sowohl in reiner kristalliner oder amorpher Form als auch als Rohkonzentrat oder in entsprechenden Arzneiformen für orale, enterale oder parenterale Verabreichung verwendet werden.
In dem folgenden Beispiel, welches die Ausführung des Verfahrens erläutert, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken soll, erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden. Die Schmelz- bzw. Zersetzungspunkte sind im Röhrchen bestimmt und nicht korrigiert.
Beispiel
In einem Fermenter werden 10 Liter einer Nährlösung, die pro Liter
50,0 g Maltose
10,0 g Bohnenmehl
1,0 g Pepton
0,5 Hefeextrakt
0,5 g KH2PO4
0,5 gMgSO4'7H2O
0,5 g Ca(NO3)2
0,1 g NaCl
0,05 gFeSO47H2O
0,01 g ZnCl2
0,01 gMnCl24H2O
0,005 gCuSO45H2O 0,005 g CoCI2 6 zu 6 H2O und entmineralisiertes Wasser enthält, mit einer Sporensuspension des Stammes NRRL 3877 beimpft und unter Belüftung (1,0 L Luft/Min./L Nährlösung) und unter Rühren (300 U/Min.) 10 Tage bei 27 bei einem pH-Wert von 5,7 inkubiert. Die Brühe wird filtriert, wobei ca. 9 L Kulturfiltrat und ca. 1 kg Mycel erhalten werden. Das Kulturfiltrat wird dreimal mit 9 L Aethylenchlorid extrahiert.
Hierauf werden die organischen Phasen zweimal mit je 4 L Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft. Nach dem Entfetten mit Petroläther wird der Rohextrakt an Kieselgel Merck 0,05-0,2 mm chromatographiert und das neue Antibioticum SL 21429 mit Chloroform-Methanol-Gemisch (98:2) eluiert und zur Reinigung aus Aether, aus Essigester und 2 x aus Chloroform umkristallisiert.
Zusätzliches, reines Antibioticum SL 21429 lässt sich aus dem Mycel gewinnen. Dieses wird dreimal mit 1 L 90% Methanol mit dem Ultraturrax behandelt. Das so aufgeschlossene Mycel wird abfiltriert, das Methanol aus dem Filtrat abdestilliert und die wässrige Lösung dreimal mit 0,5 L Aethylenchlorid extrahiert. Die Aethylenchloridlösungen werden mit 0,3 L Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne eingedampft. Der so erhaltene Rohextrakt wird - wie bei dem Kulturfiltrat beschrieben entfettet und anschliessend chromatographiert, wobei das neue Antibioticum SL 21429 erhalten wird.
Die als Ausgangsmaterial verwendete Sporensuspension wird wie folgt erhalten: Ein Nährboden, der pro Liter
20 g Cerelose
2 g Pepton
2 g Malzextrakt
2 g Hefeextrakt
2 g KH2PO4 2gMgSO4.7H2O
15 g Agar-Agar und entmineralisiertes Wasser enthält, wird mit dem Stamm NRRL 3877 beimpft und 12 Tage bei 27 C inkubiert. Der auf diesem Nährboden gewachsene Mycelrasen wird in physiologischer Kochsalzlösung suspendiert.
Das neue Antibioticum SL 21429 hat die folgenden Charakteristika:
Gelbe Kristalle, die zwischen 172 und 182"schmelzen unter Bildung neuer Kristalle vom Schmelzpunkt 2380 (Zers.)
Spez. Drehung: [a] 20 = -376-(c=0,78 in Pyridin)
D
Elementaranalyse: C=73,1%, H = 6,8 %, N = 5,3 %, 0=15,1%
UV.-Spektrum: Maxima bei 221 nm (log E'= 1,96), 274 nm (log e'= 1,16), 280 nm (log e'= 1,16), 290 nm (log E'= 1,09) (in Methanol) (s. Fig. 1)
IR.-Spektrum: u. a.
Banden bei 3450,2920, 1695, 1620 cm-t (in KBr) (s. Fig. 2)
NMR.-Spektrum: (in Dimethylsulfoxyd) (siehe Fig. 3)
The present invention relates to a method for producing a new antibiotic, which is referred to below as SL 21429, characterized in that a strain of the fungal species Chaetomium globosum Kunze ex Fries is grown in a nutrient medium and the antibiotic is isolated from the nutrient medium and purified.
A new strain of Chaetomium globosum Kunze ex Fries to be used according to the invention was isolated from a soil sample found in Küsnacht, Switzerland, and a sample of it was obtained from the United States Department of Agriculture (Northern Utilization Research and Development Division), Peoria, Ill./USA, deposited under number NRRL 3877.
The new strain of the fungal species Chaetomium globosum Kunze ex Fries grows on a malt extract-yeast extract agar at 12 to 37, preferably at 27 9C, and forms a white to light gray aerial mycelium and a light substrate mycelium on this nutrient medium. After a few days of incubation, dark, mostly olive-brown perithecia are formed. The back of the colony and the substrate are discolored by a brown pigment.
The fungus forms in pure culture, e.g. B. slightly fruiting bodies on malt agar at temperatures of 12 to 30 C, at higher temperatures within 8-10 days. Depending on the culture conditions, they are green to olive green and often dark brown in the end. The fruit bodies are spherical and have a diameter of 200-300, u. At the apex they are pierced by a rounded porus. Their peridia consists of brown cells that have grown together in a meandering manner. She's pretty tough. Numerous brownish-green hairs emerge from the outermost cell layer around the porus, slightly less numerous on the sides. At the base they are up to 4.5 m thick, gradually narrowing to 3 m and run in clear waves.
On the surface they are covered with numerous thorns and septate along their entire length. The clubbed, 50-70 x 12-15 m in size, stalked asci arise from the inner base of the perithecia. They are surrounded by a delicate wall, which is dissolved before the eight ascospores are ripe. The ascospores are unicellular, more or less lemon-shaped with slightly pointed ends, but not exactly round in cross-section but elliptical. At first they are colorless, later reddish and finally dark brown. At one end they have a clearly perceptible germ pore and measure 9-12 (mostly 10-11) minutes in length and 6-9 (mostly 7.5-8.5) sts in width.
The strain NRRL 3877 of Chaetomium globosum Kunze ex Fries corresponds in its morphology and physiology to the description of L.M. Ames in: A Monograph of the Chaetomiaceae, The United States Army Research and Development Series, No. 2, 1961, pp. 26-27. It differs from this description in the pronounced green coloring of the fruiting bodies, which is caused by the color of the hair.
The new strain NRRL 3877 can be grown on a variety of nutrient media containing the usual nutrients for fungi. So this strain uses the nutrients usually used for carbon heterotrophic microorganisms, for example glucose, sucrose, starch, lactose, dextrin, etc. as a carbon source, organic and inorganic, nitrogen-containing compounds such as peptone, yeast or meat extracts, ammonium sulfate, ammonium nitrate, amino acids as nitrogen sources and the usual mineral salts and trace elements.
The new antibiotic SL 21429 can be produced by inoculating a liquid nutrient medium with a spore suspension of the new strain of Chaetomium globosum and the culture for 612 days, preferably 10 days, at 12 to 37, preferably at 27 "at a pH value The cultivation can be carried out under aerobic conditions in a surface culture or submerged with shaking or in fermenters with aeration by air or oxygen with stirring.As soon as a maximum amount of antibiotic has been produced, it is filtered and the antibiotic obtained by extractive and / or adsorptive working methods in a manner known per se from the culture filtrate or from the mycelium.
The new antibiotic can be isolated from the crude extract by chromatography, crystallization or countercurrent distribution.
One method which has proven to be particularly suitable is the extraction of the filtrate with ethylene chloride, but other organic solvents such as. B.
Benzene, chloroform, butyl acetate, methylene chloride, butanol or ethyl acetate can be used.
The extracts are then freed from the solvent, e.g. B. by distillation, and the residue to isolate the antibiotic purified by chromatography on adsorbing agents such as clay, silica gel, magnesium silicate and the like, countercurrent distribution and / or crystallization.
The new antibiotic SL 21429 is characterized by interesting pharmacological properties and can therefore be used as a remedy.
The new antibiotic SL 21429 has an edema-inhibiting effect, as can be shown by animal experiments (bradykinin paw edema in rats). The doses to be used naturally vary depending on the type of administration and the condition to be treated. In general, however, satisfactory results are obtained in test animals at a dose of 0.1-10 mg / kg i.p. receive. If necessary, this dose can be administered in 2 to 3 parts or as a sustained release form.
The new antibiotic SL 21429 also has anti-ulcer properties, as the results on phenylbutazone ulcers in rats and Shay rats show. The doses to be used naturally vary depending on the type of administration and the condition to be treated. In general, however, in test animals with a dose of 2.5 to 10 mg / kg p. o. with phenylbutazone ulcer and with a dose of 0.1 to 10 mg / kgp.o. obtained satisfactory results in the Shay rat. If necessary, this dose can be administered in 2 to 3 parts or as a sustained release form.
The new antibiotic SL 21429 also has an immunosuppressive effect on cellular immunity. In the target cell destruction test (Immunology 18, (1970)) the new antibiotic inhibits the lysis of the target cells by the sensitized spleen cells after in vitro addition. A 100% inhibition occurs at a dose of 1 mg / L.
For larger mammals, the daily dose when the new antibiotic SL 21429 is administered is around 10 to 100 mg. For oral administration, the partial doses contain about 4 to 50 mg of the antibiotic along with solid or liquid carrier substances.
The antibiotic SL 21429 produced according to the invention can be used as a drug alone, both in pure crystalline or amorphous form and as a raw concentrate or in appropriate drug forms for oral, enteral or parenteral administration.
In the following example, which explains the implementation of the method but is not intended to restrict the scope of the invention in any way, all temperatures are given in degrees Celsius. The melting or decomposition points are determined in the tube and not corrected.
example
In a fermenter 10 liters of a nutrient solution per liter
50.0 grams of maltose
10.0 g of bean flour
1.0 g peptone
0.5 yeast extract
0.5 g of KH2PO4
0.5 gMgSO4'7H2O
0.5 g Ca (NO3) 2
0.1 g NaCl
0.05 g FeSO47H2O
0.01 g ZnCl2
0.01 gMnCl24H2O
0.005 gCuSO45H2O 0.005 g CoCI2 6 to 6 H2O and demineralized water, inoculated with a spore suspension of strain NRRL 3877 and with aeration (1.0 L air / min. / L nutrient solution) and with stirring (300 rpm) for 10 days incubated at 27 at pH 5.7. The broth is filtered, about 9 L of culture filtrate and about 1 kg of mycelium being obtained. The culture filtrate is extracted three times with 9 L of ethylene chloride.
The organic phases are then washed twice with 4 L of water each time, dried over sodium sulfate and evaporated to dryness. After degreasing with petroleum ether, the crude extract is chromatographed on Merck silica gel 0.05-0.2 mm and the new antibiotic SL 21429 is eluted with a chloroform-methanol mixture (98: 2) and for purification from ether, from ethyl acetate and twice Recrystallized chloroform.
Additional, pure antibiotic SL 21429 can be obtained from the mycelium. This is treated three times with 1 L of 90% methanol using the Ultraturrax. The mycelium disrupted in this way is filtered off, the methanol is distilled off from the filtrate and the aqueous solution is extracted three times with 0.5 L of ethylene chloride. The ethylene chloride solutions are washed with 0.3 L water, dried over sodium sulphate and evaporated to dryness. The crude extract obtained in this way is defatted as described for the culture filtrate and then chromatographed, the new antibiotic SL 21429 being obtained.
The spore suspension used as starting material is obtained as follows: A nutrient medium that per liter
20 g cerelose
2 g peptone
2 g of malt extract
2 g yeast extract
2 g KH2PO4 2gMgSO4.7H2O
Containing 15 g agar-agar and demineralized water, is inoculated with the strain NRRL 3877 and incubated at 27 ° C. for 12 days. The mycelial lawn that has grown on this nutrient medium is suspended in physiological saline solution.
The new antibiotic SL 21429 has the following characteristics:
Yellow crystals that melt between 172 and 182 "to form new crystals with a melting point of 2380 (dec.)
Specific rotation: [a] 20 = -376- (c = 0.78 in pyridine)
D.
Elemental analysis: C = 73.1%, H = 6.8%, N = 5.3%, 0 = 15.1%
UV spectrum: maxima at 221 nm (log E '= 1.96), 274 nm (log e' = 1.16), 280 nm (log e '= 1.16), 290 nm (log E' = 1.09) (in methanol) (see Fig. 1)
IR spectrum: u. a.
Bands at 3450, 2920, 1695, 1620 cm-t (in KBr) (see Fig. 2)
NMR spectrum: (in dimethyl sulfoxide) (see Fig. 3)