Verfahren zur Herstellung von Tetrazyklin Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstel lung von Tetrazyklin mittels des bisher unbekannten, in Polen aus Erdboden isolierten Stammes Strepto- myces species 88, der in der American Type Culture Collection unter der Nr. 15393 deponiert ist.
Das Antibiotikum Tetrazyklin wird von Stämmen der Gattung Streptomyces hergestellt. Bisher wird das Tetrazyklin auf dem Wege einer 48 Stunden dauern den Fermentation bei einer Temperatur von 25-30 C erhalten, wobei das entstandene Antibiotikum hetero gen ist, da es bedeutende Chlorotetrazyklinmengen enthält, die man durch Zugabe von blockierenden Substanzen verringern kann. Ausserdem enthalten die bei der Fermentation bei Anwendung der oben er wähnten Stämme erhaltenen Würzen nicht näher be stimmte, infolge des Metabolismus entstandene Pro dukte, die im Laufe der weiteren Umarbeitung Schwierigkeiten bereiten, da in den Zwischenphasen Emulsionen und Niederschläge auftreten.
Dies erfor dert die Anwendung einer komplizierten Trennungs apparatur und vergrössert die Anzahl der Operatio nen, die zur Erlangung des fertigen Produktes erfor derlich sind.
Die Erfindung bezweckt eine bedeutende Ver kürzung der Fermentationszeit, die Gewinnung einer ausschliesslich Tetrazyklin enthaltenden Fermenta- tionsbrühe, ohne dass es notwendig wäre, die Ent stehung des Chlortetrazyklins hemmende Inhibitoren zuzugeben, sowie die Eliminierung von in bisher an gewandten Prozessen entstehenden, nicht näher be stimmten Nebenprodukten, die die erwähnten Schwierigkeiten bei der Aufarbeitung der Fermenta- tionsbrühe hervorrufen.
Dieses Ziel wurde erfindungsgemäss durch ein Verfahren erreicht, das dadurch gekennzeichnet ist, dass bei einer Temperatur von 30-320 C, in einem Zeitraum von 30-42 Std. der Stamm Streptomyces species 88 ATCC 15393 auf einem Substrat mit einem pH-Wert von 5,0-7,2, welches Quellen von assimilierbarem Kohlenstoff und Stickstoff, wobei mindestens ein Teil in Form von Haferprodukten vorliegen muss, und Mineralsalze enthält,
kultiviert wird und das entstandene Tetrazyklin aus dem gegär- ten Substrat isoliert wird. Der erfindungsgemäss ein gesetzte Mikroorganismus unterscheidet sich von bis her beschriebenen Tetrazyklinproduzenten, wie dies aus den nachstehend angegebenen Tabellen hervor geht:
Die Charakteristik des Stammes auf Agar : Gly- cerin - 1 %, Aspargin - 0,05 %, Fleischextrakt - 0,2 %, K2HP04 - 0,05 %, Agar - 1,5 %, pH-Wert 7,
2
EMI0001.0058
Stamm <SEP> Stamm
<tb> Streptomyces <SEP> Streptomyces
<tb> aureofaciens <SEP> species
<tb> Wuchs <SEP> gut <SEP> gut
<tb> Sporenbildung <SEP> gut <SEP> gut
<tb> Lösliches <SEP> Pig- <SEP> fehlt <SEP> bräunlich <SEP> grün
<tb> ment
<tb> Luftmizelle <SEP> Fiedern <SEP> ge- <SEP> Fiedern <SEP> gerade
<tb> rade <SEP> Mizelle <SEP> Mizelle <SEP> schmut grau <SEP> zigrosa Auf Czapek-Dox Agar, Dextrin - 1 %, NaN03 - 0,2 %, K2HP04 - 0,
1 0/0, M9S04 - 0,05 %, KCl - 0,05 %, FeS04 - Spuren, Agar - 1,5 %, pH 7,
2
EMI0002.0001
Wuchs <SEP> mässig <SEP> mässig
<tb> Sporenbildung <SEP> schwach <SEP> schwach
<tb> Lösliches <SEP> Pig- <SEP> fehlt <SEP> 5 <SEP> Qold-orange
<tb> ment
<tb> Luftmizelle <SEP> lederbraun- <SEP> intensiv <SEP> orange
<tb> farbig <SEP> Fiedern
<tb> dünn <SEP> in <SEP> sehr
<tb> weniger <SEP> An zahl
<tb> Gelatinelöslich- <SEP> löst <SEP> nicht <SEP> auf <SEP> löst <SEP> nicht <SEP> auf
<tb> keit
<tb> Koagulierung <SEP> koaguliert <SEP> koaguliert
<tb> von <SEP> nicht
<tb> Lackmusmilch
<tb> Hydrolyse <SEP> schwach <SEP> schwach
<tb> der <SEP> Stärke
<tb> Wuchs <SEP> und <SEP> gut, <SEP> dunkel- <SEP> gut,
<SEP> dunkelgrau
<tb> Farbe <SEP> auf <SEP> Kar- <SEP> grau
<tb> toffelnährstoff
<tb> Nitratenreduk- <SEP> reduziert <SEP> reduziert <SEP> nicht
<tb> tion <SEP> nicht
<tb> Produktions- <SEP> Spuren <SEP> von <SEP> Spuren <SEP> von
<tb> nährstoff <SEP> mit <SEP> Tetrazyklin <SEP> Chlorotetrazy Natriumchlorid <SEP> klirr, <SEP> Spuren <SEP> von
<tb> nicht <SEP> identifi zierten <SEP> Antibio tika <SEP> x <SEP> und <SEP> y
<tb> Chromatographie <SEP> Chlorotetra- <SEP> Spuren <SEP> von
<tb> System <SEP> wasser- <SEP> zyklin, <SEP> Spuren <SEP> Chlorotetrazy gesättigtes <SEP> von <SEP> Tetra- <SEP> klirr, <SEP> Tetrazy Äthylazetat <SEP> zyklin <SEP> klirr, <SEP> Antibioti kum <SEP> x,
<SEP> Antibio tikum <SEP> y
<tb> RF <SEP> im <SEP> Verhältnis <SEP> Rr-1 <SEP> Chloro- <SEP> RF <SEP> - <SEP> 1 <SEP> Chloro zu <SEP> Chlorotetra- <SEP> tetrazyklin <SEP> tetrazyklin
<tb> zyklin <SEP> RF <SEP> - <SEP> 0,4 <SEP> Te- <SEP> RF <SEP> - <SEP> 0,4 <SEP> Tetra trazyklin <SEP> zyklin
<tb> RF <SEP> - <SEP> 0,26 <SEP> Anti biotikum <SEP> x
<tb> RF <SEP> - <SEP> 0,15 <SEP> Anti biotikum <SEP> y Der isolierte Stamm diente zur Erlangung von Produktionsmutationen auf dem Wege der Selektion unter Anwendung von einleitenden Mutationsfakto- ren wie z. B. Ultraviolett-Strahlen, X-Strahlen, Di- methylimin und anderen bekannten Faktoren.
Der Stamm kann im Lyophilzustand zwei Jahre lang aufbewahrt werden, ohne seine Aktivität zu ver lieren.
Wie festgestellt worden ist, wirkt die Anwesen heit von Haferprodukten im Produktionssubstrat sti- mulierend auf den Mizellenwuchs und auf die Aus beute des Antibiotikums sowie hemmend auf die Schaumbildung.
Zur submersen Fermentation werden als assimi- lierbare Kohlenstoffquelle enthaltender Nährstoff Haferprodukte, z. B. Haferflocken, sowie gegebenen falls Stärke, Dextrin, Glukose, Saccharose, Melasse usw. verwendet.
Als assimilierbare Stickstoffquelle wird ein Aus zug aus eingeweichtem Mais, Arachismehl, Sojamehl, Hefe und dergleichen und als Mineralsalzquelle NaCl, (NH4)2S0" NHINO;;, NH@CI und dergleichen angewandt.
Die entsprechende Wasserstoffionenkonzentration kann durch Zugabe von CaCO.j reguliert werden. Zur Verhinderung der Schaumbildung werden zweckmässig vegetabilische Öle angewandt.
Die Fermentation des Stammes Streptomyces species 88 kann z. B. in Eisenfässern erfolgen, in der Regel unter Zuführung von 0,5 bis 0,75 Luftvolu- men/Substratvolumen pro Minute und wird 1-10,0 % vegetatives Inoculum angewandt.
Die Bestimmung der Aktivität der Fermentations- flüssigkeit wird mittels allgemein bekannter biolo gischer und physikochemischer Methoden geführt. Sehr wichtig ist die Anwendung verschiedener Nähr stoffe für die Saatstadien und für das Produktions stadium.
Die kurze Fermentationszeit verhindert die Auto lyse der Mizelle und trägt zur Zeitabkürzung sowie zur Vermeidung der mit der Filtrierung verbundenen Schwierigkeiten bei. Beim erfindungsmässigen Ver fahren erreicht man trotz der kurzen Fermentations- zeit einen Antibiotikumgehalt der Brühe von 3000 4000 Einheiten/ml, was bei bisher bekannten Me thoden in diesem Zeitraum zu erreichen nicht mög lich war.
Das erhaltene Antibiotikum wird aus der Brühe z. B. auf bekannte Weise isoliert, und zwar am besten durch Ausfällen in Form eines komplexen Salzes oder mittels Extraktion aus der Brühe in organische Lösungsmittel in einem alkalischen Medium mit An wendung von Überträgern, Reextraktion in Wasser und Aussalzung. Während der Isolierung des Anti biotikums entstehen in den Zwischenphasen keine Emulsionen und keine Niederschläge,
sowohl beim übergang des Antibiotikums in die organischen Lö sungsmittel als auch bei der Reextraktion in die Wasserphase.
<I>Beispiel 1</I> Der Stamm Streptomyces species 88 wird auf einem Substrat von nachstehender Zusammensetzung gezüchtet: 5,0 % - Weizenkleie 2,0 % - Agar-Agar Die Sporen werden auf ein Saatsubstrat von fol gender Zusammensetzung inokuliert 3,0 % - Glukose 0,5 % - Hefe 1,25% - Extrakt aus eingeweichtem Mais 0,5 0/0 - NH4N03 0,2 0/0 - NaCl 0,
4 0/0 - CaC03 pH-Wert vor der Sterilisierung - 7,0.
Das Substrat wird bei einer Temperatur von 110-115C 30 Minuten lang sterilisiert und dann bei einer Temperatur von 30-32 C 12-24 Stunden lang inkubiert.
Das so vorbereitete Saatmaterial wird auf ein Produktionssubstrat von folgender Zusammensetzung inokuliert 2,0 0/0 - Mehl aus Arachispülpe 2,0 % - Kartoffelmehl 2,0 0/0 - Hafermehl 1,25% - Auszug aus eingeweichtem Mais 0,5 % - NH4N03 0,2 % - NaCI 0,
4 0/0 - CaC0" 0,75% - Arachisöl pH-Wert vor der Sterilisierung - 6,5.
Die Fermentation wird 42 Stunden lang unter Sauerstoffzufuhr bei einer Temperatur von 30-320 C geführt.
Gärbrühe aus den Kolben in einer Menge von 2,51 wird mittels Oxalsäure auf einen pH-Wert von 2,0 angesäuert und dann mit Kieselgar filtriert. Dem Filtrat werden 0,1% Dimethyllaurylbenzylamrno- niumchlorid und 20 0/a eines Gemisches von Butyl- azetat und Butanol im Verhältnis 4 : 1 zugegeben, und der pH-Wert wird mittels NaOH auf 8,0 ge bracht.
Nach 30 Minuten Rühren wird die klare or- organische Phase abgetrennt. Die Extraktion wird zweimal durchgeführt. Die vereinigten klaren orga nischen Phasen werden unter vermindertem Druck bis zur Hälfte ihres Volumens eingedickt und danach wird 10 % Wasser zugegeben und der pH-Wert des Gemisches unter Anwendung von H,S04/1 : 3/ auf 2,8 gebracht.
Nach zweifacher Extraktion wird die klare wässrige Phase vereinigt und mit 15 % NaCl versetzt, wonach sie zum Kristallisieren abgestellt wird.
Nach dem Filtrieren erhält man 4,0 g Tetrazy- klin-Hydrochlorid von der Reinheit 950 mcg/mg. <I>Beispiel 2</I> 21 Gärbrühe werden mittels Oxalsäure auf einen pH-Wert von 2,5 angesäuert, danach wird Dime- thyllaurylbenzylammoniumchlorid in einer Menge von 0,
1 % zugegeben und der pH-Wert auf 8,0 ge- bracht, wonach nach Zugabe von. 0,3 % Kieselgar und nach 30 Minuten Rühren filtriert wird.
Das trockene Gemisch mit einer Aktivität von etwa 300 mcg/mg wird mit 10 % CaCl, enthaltendem Methanol extrahiert. Es wird dreimal je eine Stunde lang extrahiert. Die Extrakte werden vereinigt, ein gedickt zwecks Erlangung von etwa 100. 000 mcg/ml, und danach mit konzentrierter HCl bis zum Ausfäl len des kristallinen Tetrazyklin-Hydrochlorids ange säuert.
Man erhält 0,52 g einer kristallinen Abschei- dung von der Reinheit 945 mcg/mg.