DE1228375B - Verfahren zur Herstellung von chlortetracyclinfreiem Tetracyclin - Google Patents

Description

BUNDESREPUBLIK DEUTSCHLAND

DEUTSCHES

PATENTAMT

AUSLEGESCHRIFT

Int. CL:

C12d

Deutsche Kl.: 30h-6

Nummer: 1228 375

Aktenzeichen: J18289IV a/30 h

Anmeldetag: 15. Juni 1960

Auslegetag: 10. November 1966

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Tetracyclin mittels des bisher unbekannten, aus dem Erdboden in Polen isolierten Stammes Streptomyces Species 88.

Das Antibioticum Tetracyclin wird von Stämmen der Gattung Streptomyces hergestellt, z. B. Streptomycesstämme ATCC 11652, 11653 und 11654 (schweizerische Patentschrift 317 698), Streptomyces Viridifaciens ATCC11989 (schweizerische Patentschrift 322 069), Streptomyces Aurefaciens NRRL 2209 (USA.-Patentschrift 2 776 243) und Streptomyces Fuscofaciens ATCC12061 (deutsche Auslegeschrift 1 028 744). Bei diesen Methoden wird das Tetracyclin auf dem Wege einer 2 bis 6 Tage dauernden Fermentation bei einer Temperatur von 25 bis 30° C erhalten, wobei das entstandene Antibiotikum heterogen ist, da es bedeutende Chlortetracyclinmengen enthält, die man durch Zugabe von blockierenden Substanzen verringern kann. Außerdem enthalten die bei der Fermentation bei Anwendung der obenerwähnten Stämme erhaltenen Würzen nicht näher bestimmte, infolge des Metabolismus entstandene Produkte, die im Laufe der weiteren Aufarbeitung Schwierigkeiten bereiten, da in den Zwischenphasen Emulsionen und Niederschläge auftreten. Dies erfordert die Anwendung einer komplizierten Trennungsapparatur und vergrößert die Anzahl der Arbeitsgänge, die zur Erlangung des fertigen Produktes erforderlich sind.

Die Erfindung bezweckt eine bedeutende Verkürzung der Fermentationszeit, die Gewinnung einer praktisch ausschließlich Tetracyclin enthaltenden Fermentationsbrühe, ohne daß es notwendig wäre, die Entstehung des Chlortetracyclins hemmende, spezielle Inhibitoren zuzugeben sowie die Eliminierung von in bisher durchgeführten Prozessen entstehenden, nicht näher bestimmten Nebenprodukten des Metabolismus, die die erwähnten Schwierigkeiten im Verarbeitungsprozeß der Fermentationsbrühe hervorrufen.

Verfahren zur Herstellung

von chlortetracyclinfreiem Tetracyclin

Anmelder:

Instytut Antybiotykow, Warschau

Vertreter:

Dipl.-Ing. Dr.-Ing. R. Poschenrieder,
Patentanwalt, München 8, Lucile-Grahn-Str. 38

Beanspruchte Priorität:
Polen vom 20. Juni 1959

Dieses Ziel wurde erfindungsgemäß dadurch erreicht, daß im Produktionsprozeß der aus dem Erdboden in Polen isolierte Stamm Streptomyces Species 88 angewendet wurde und die Bedingungen bestimmt worden sind, unter denen dieser Stamm die größte Menge des Antibiotikums herstellt. Dieser Stamm ist unter der Nummer IV S/8 bei der Polska Akademia Nauk Konntet Mikrobiologiczny Komisja Naukowa do Spraw Kolekcji Drobnoustrojow Osrodek Kultur Drobnoustrojow Przemyslowych Instytucie Przemyslu Fermentacyjnego, Warszawa, ul. Rakowiecka 8 (deutsch: Polnische Akademie der Wissenschaften Komitee für Mikrobiologie Wissenschaftliche Kommission für Angelegenheiten der Mikroorganismen-Kollektion Zentralstelle für Kulturen von industriellen Mikroorganismen im Institut der Fermentationsindustrie, Warszawa, Rakowiecka Straße 8) und unter der Nummer 15393 bei der American Type Culture Collektion, Washington (ATCC) hinterlegt worden und unterscheidet sich von bisher beschriebenen Tetracyclinproduzenten, wie dies aus den nachstehend angegebenen Tabellen hervorgeht.

Die Charakteristik des Stammes auf Agar l°/o Glycerin, 0,05% Asparagin, 0,2 °/o Fleischextrakt, 0,05«/» K₂HPO₄, 1,5 »/0 Agar; pH-Wert 7,2

Stamm	gut	Stamm	gut
Streptomyces	gut	Streptomyces	gut
Aureofaciens	fehlt	Species 88	bränlichgrün
Fiedern gerade,	Fidern gerade,
Mizelle grau	Mizelle schmutzigrosa
	609 710/276

Wuchs

Sporenbildung

Lösliches Pigment
Luftmizelle

3 4

Die Charakteristik des Stammes auf Czapek-Dox-Agar

1% Dextrin, 0,2% NaNO₃, 0,1WK₂HPO₄, 0,05% MgSO₄, 0,05% KCL, Spuren FeSO₄, 1,5% Agar;

pH-Wert 7,2

Stamm	mäßig	Stamm	mäßig
Streptomyces	schwach	Streptomyces	schwach
Aureofaciens	fehlt	Species 88	goldorange
sehr geringe Anzahl	Spuren
lederbraunfarbig	intensiv orange

Wuchs

Sporenbildung
Lösliches Pigment

Luftmizelle

Substratmizelle ...

Die Charakteristik des Stammes auf anderen Nähnnedien

	Stamm Streptomyces Aureofaciens	Stamm Streptomyces Species 88
Gelatinelöslichkeit Koagulierung von Lackmusmilch Hydrolyse der Stärke Wuchs und Farbe auf Kartoffelnährstoff Nitratreduktion	löst nicht auf koaguliert nicht schwach gut, dunkelgrau reduziert nicht Spuren von Tetracyclin Chlortetracyclin, Spuren von Tetracyclin Rrl Chlortetracyclin Rf-0,4 Tetracyclin	löst nicht auf koaguliert schwach gut, dunkelgrau reduziert nicht Spuren von Chlortetracyclin, Spuren von nicht identi fizierten Antibiotika χ und y Spuren von Chlortetracyclin, Tetracylin, Antibiotikum x, Antibiotikum y Rf-I Chlortetracyclin Rf-0,4 Tetracyclin Rj-0,26 Antibiotikum χ R,-0,15 Antibiotikum y
Produktionsnährstoff mit Natriumchlorid Chromatographie System wassergesättigtes Äthylazetat R£ im Verhältnis zu Chlortetracyclin

Der isolierte Stamm diente zur Erlangung von Produktionsmutationen auf dem Wege der Selektion unter Anwendung von einleitenden Mutationsfaktoren, wie z. B. Ultraviolettstrahlen, X-Strahlen, Diäthylimin und anderen bekannten Faktoren.

Der Stamm kann im Lyophilzustand 2 Jahre lang aufbewahrt werden, ohne seine Aktivität zu verlieren.

Wie festgestellt worden ist, wirkt die Anwesenheit von Haferprodukten, besonders Haferflocken, im Produktionssubstrat stimulierend auf den Mizellenwuchs und auf die Ausbeute des Antibiotikums ein.

Charakteristisch für den neuen Stamm Streptomyces Species 88 ist, daß auf einem Substrat von Haferprodukten praktisch nur Tetracyclin gebildet wird und keine unerwünschten Nebenprodukte.

Zur submersen Fermentation werden als assimilierbare Kohlenstoffquelle Nährstoffe enthaltende Haferprodukte, z. B. Haferflocken, sowie Stärke, Dextrin, Glukose, Saccharose, Melasse usw. verwendet.

Als assimilierbare Stickstoffquelle wird ein Auszug aus eingeweichtem Mais, Arachismehl, Sojamehl, Hefe u. dgl. und als Mineralsalzquelle NaCl, (NHJ₂SO₄, NH₄,NO₃, NH₄Cl u. dgl. angewandt.

Die entsprechende Wasserstoffionenkonzentration wird durch Zugabe von CaCO₃ reguliert.

Zur Verhinderung der Schaumbildung werden pflanzliche Öle angewandt.

Erfindungsgemäß wird die Fermentation des Stammes Streptomyces species 88, ζ. B. in Eisenfässern, vorzugsweise bei einer Temperatur von 30 bis 32° C in einem Zeitraum von weniger als 48 Stunden, vorzugsweise 30 bis 42 Stunden, bei einem pH-Wert von 5,0 bis 7,2 durchgeführt. Die Fermentation wird unter aeroben Bedingungen durchgeführt unter Zuführung von 0,5 bis 0,75 Luftvolumen pro Substratvolumen pro Minute und es werden 1 bis 10,0 % vegetatives Inoculum angewandt.

Die Bestimmung der Aktivität der Fermentationsflüssigkeiten wird mittels allgemein bekannter biologischer und physikochemischer Methoden geführt. Sehr wichtig ist die Anwendung verschiedener Nährstoffe für die Saatstadien und für das Produktionsstadium.

Die kurze Fermentationszeit verhindert die Autolyse der Mizelle und trägt zur Zeitabkürzung sowie zur Vermeidung der mit der Filtrierung verbundenen

Schwierigkeiten bei. Beim erfindungsgemäßen Verfahren erreicht man trotz der kurzen Fermentationszeit einen Antibiotikumgehalt der Brühe von 3000 bis 4000 Einheiten/ml, was bei bisher bekannten Methoden in diesem Zeitraum nicht möglich war.

Das erhaltene Antibiotikum wird aus der Brühe auf bekannte Weise isoliert, und zwar durch Ausfällen in Form eines komplexen Salzes oder mittels Extraktion aus der Brühe mit organischen Lösungsmitteln in einem alkalischen Medium mit Anwendung von Überträgern, Reextraktionen in Wasser und Aussalzung. Während der Isolierung des Antibiotikums entstehen in den Zwischenphasen keine Emulsionen und keine Niederschläge sowohl beim Übergang des Antibiotikums in die organischen Lösungsmittel als auch bei der Reextraktion in die Wasserphase.

Nachstehend sind Beispiele angegeben, die das erfindungsgemäße Verfahren näher erläutern.

Beispiel 1

Der Stamm Streptomyces species 88 wird auf einem Substrat von nachstehender Zusammensetzung gezüchtet:

5,00% Weizenkleie,
2,00% Agar-Agar.

Die Sporen werden auf ein Saatsubstrat von folgender Zusammensetzung inokuliert:

3,00% Glukose,

0,50% Hefe,

1,25 % Extrakt aus eingeweichtem Mais,

0,50% NH₄NO₃,

0,20% NaCl,

0,40% CaCO₃.

pH-Wert vor der Sterilisierung: 7,0.

Das Substrat wird bei einer Temperatur von 110 bis 115° C 30 Minuten lang sterilisiert und dann bei einer Temperatur von 30 bis 32° C 12 bis 24 Stunden lang inkubiert.

Das so vorbereitete Saatmaterial wird auf ein Produktionssubstrat von folgender Zusammensetzung inokuliert:

2,00 % Mehl aus Arachispulpe,
2,00% Kartoffelmehl,
2,00% Hafermehl,

1,25 % Auszug aus eingeweichtem Mais,
0,50% NH₄NO₃,
0,20% NaCl,
0,40% CaCO₃,
0,75%Arachisöl.
pH-Wert vor der Sterilisierung: 6,5.

Die Fermentation wird 42 Stunden lang bei einer Temperatur von 30 bis 32° C geführt.

Brühe aus den Kolben in einer Menge von 2,5 1, die 3040 mcg/ml (umgerechnet in Tetracyclinhydrochlorid) Antibiotikum enthält, wird mittels Oxalsäure zu einem pH-Wert von 2,0 angesäuert und dann mit Kieselgur filtriert. Dem Filtrat werden 0,1% Dimethyllaurylbenzylammoniumchlorid und 20% eines Gemisches von Butylazetat und Butanol im Verhältnis wie 4:1 zugegeben und der pH-Wert mittels NaOH auf 8,0 gebracht. Nach 30 Minuten Rühren wird die klare organische Phase abgetrennt. Die Extraktion wird zweimal durchgeführt. Die vereinigten

ίο klaren organischen Phasen werden unter vermindertem Druck bis zur Hälfte ihres Volumens eingedickt, und danach werden 10% Wasser zugegeben und der pH-Wert des Gemisches unter Anwendung von H₂SO₄ (1:3) auf 2,8 gebracht. Nach zweifacher Extraktion wird die klare Wasserphase zusammengebracht und ihr 15 % NaCl zugegeben, wonach sie zwecks Kristallisierung abgestellt wird. Nach dem Filtrieren erhält man 4,0 g Tetracyclinhydrochlorid von einer Stärke, die 950 mcg/mg beträgt.

Beispiel 2

Brühe aus den Kolben in einer Menge von 21 wird mittels Oxalsäure zu einem pH-Wert von 2,5 angesäuert, danach wird Dimethyllaurylbenzylammoniumchlorid in einer Menge von 0,1 % zugegeben und der pH-Wert auf 8,0 gebracht, wonach nach Zugabe von 0,3% Kieselgur und nach 30 Minuten Rühren, filtriert wird. Das trockene Gemisch mit einer Aktivität von etwa 300 mcg/mg wird mit 10% CaCl₂ enthal-

tendem Methanol extrahiert. Die Extraktion wird dreifach, je 1 Stunde lang, durchgeführt. Die Extrakte werden vereinigt, eingedickt zwecks Erlangung von etwa 100000 mcg/ml und danach mittels konzentrierter HCl bis zum Ausfällen der Kristalle des Tetrazyklin-Hydrochlorids angesäuert. Man erhält 3,52 g einer kristallinen Abscheidung von einer Stärke, die 945 mcg/mg beträgt.

Claims (1)

1. Patentanspruch:

   Terf ahren zur Herstellung von chlortetracyclinfreiem Tetracyclin ohne Anwendung von Chlorinhibitoren durch aerobe Submerskultur von Streptomyceten, dadurch gekennzeichnet, daß man den Stamm Streptomyces sp. 88 (ATCC 15393) in einem Nährmedium, welches neben den üblichen Nährstoffen noch Haferprodukte, insbesondere Haferflocken enthält, bei einem pH-Wert von 5 bis 7,2 kultiviert und das Antibiotikum in bekannter Weise aus der Kulturflüssigkeit isoliert.

   In Betracht gezogene Druckschriften:
   Deutsche Auslegeschrift Nr. 1 028 744;
   schweizerische Patentschriften Nr. 317 698,
   322 069;
   USA.-Patentschrift Nr. 2 776 243.

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