BRPI0709059A2 - métodos para redução de agregação de proteìna - Google Patents

Abstract

MéTODOS PARA REDUçãO DE AGREGAçãO DE PROTEìNA. Métodos de redução de agregação de uma proteína ou proteínas em uma formulação, e formulação de proteínas tendo propriedades de agregação reduzida, são providos. Os métodos e formulações aqui descritas mantêm a atividade biológica de uma proteína, e aumenta a vida útil das formulações de proteína.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOSPARA REDUÇÃO DE AGREGAÇÃO DE PROTEÍNA".

REFERÊNCIA CRUZADA A PEDIDOS RELACIONADOS

Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório dos Es-tados Unidos No. 60/784.130, depositado em 20 de março de 2006, intitula-do "Métodos para Redução de Agregação de Proteína," os conteúdos doqual são, desse modo, incorporados por referência em sua totalidade.

CAMPO TÉCNICO

O campo se refere a métodos de redução de agregação de pro-teínas e formulação de proteínas que têm níveis reduzidos de agregação.

ANTECEDENTES

A completação do projeto de genoma humano, acoplado com aodesenvolvimento de métodos aperfeiçoados para isolamento e purificaçãode proteína, tem tornado a produção em larga escala de formulação de pro-teínas uma realidade. De fato, existe mais do que uma centena de proteínasrecombinantes em ensaios clínicos de Fase I, ou, mais, várias delas recebeuaprovação da Administração de Alimento em Fármaco. As formulações queasseguram uma distribuição eficiente e segura de proteínas ou peptídeos emuma forma biologicamente ativa são chaves para o sucesso comercial deprodutos atuais e futuros de biotecnologia.

Infelizmente, as proteínas possuem propriedades físicas e quí-micas únicas, que criam dificuldades na formulação e desenvolvimento. Asinstabilidades físicas e químicas de proteínas propõem desafios significantesno desenvolvimento de formulação adequada de proteínas. A instabilidadefísica mais comum de proteínas é a agregação de proteína e sua precipita-ção equivalente macroscópica. A tendência das proteínas se agregarem éum problema especialmente desafiante na indústria de biotecnologia e far-macêutica onde é desejado sintetizar, processar e armazenar proteínas nasconcentrações mais altas possíveis, e sobre longos períodos de tempo.

Enquanto os mecanismos de acionamento de agregação de pro-teína não são completamente compreendidos, os resultados finais são, nãoobstante, indesejáveis. A formação de agregado por um polipeptídeo emuma composição farmacêutica pode afetar adversamente a atividade bioló-gica deste polipeptídeo, resultando em perda de eficiência terapêutica dacomposição farmacêutica. Em adição, proteínas em um estado agregadopode ser imunogênicas e podem ainda ter efeitos tóxicos agudos in vivo.

Além disso, a formação de agregado pode causar outros problemas duranteadministração da formulação de proteína, tal como bloqueio de seringas,tubos, membranas, ou bombas. Conseqüentemente, existe uma necessida-de na técnica de métodos de redução de agregação de proteína e de desen-volvimento de formulação de proteínas que exibe níveis reduzidos de agre-gação.

SUMÁRIO

Este pedido se refere a formulações de proteínas que exibempropriedades reduzidas de agregação e métodos de produção de tais formu-lações.

Em um aspecto, o pedido se refere a um método para reduçãode agregação de uma proteína ou proteínas em uma formulação pela adiçãode metionina à formulação em uma concentração de cerca de 0,5 mM a cer-ca de 145 mM. O método reduz a agregação da proteína ou proteínas naformulação, comparado com o nível de agregação da mesma proteína ouproteínas formuladas em uma formulação idêntica, exceto carecendo de me-tionina. Em uma concretização específica, o método de adição de metioninaa uma formulação em uma concentração de cerca de 0,5 mM a cerca de 145mM reduz a agregação da proteína ou proteínas na formulação quando aformulação é submetida às condições que promovem ou facilitam agregaçãode proteína, comparado com o nível de agregação da mesma proteína ouproteínas formuladas em uma formulação idêntica, exceto carecendo de me-tionina, e submetida às mesmas condições que promovem agregação deproteína.

Em certas concretizações, a metionina é adicionada à formula-ção a uma concentração final de entre cerca de 0,5 mM e cerca de 50 mM.Em concretizações específicas, a metionina é adicionada à formulação auma concentração final de 0,5 mM, 1 mM, 2,5 mM, 5 mM, 7,5 mM, 10 mM,12,5 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, e 45 mM. Em cer-tas concretizações, o método de adição de metionina a uma formulação deproteína em uma concentração de cerca de 0,5 mM a cerca de 145 mM, noqual a formulação de proteína é para ser submetida às condições que con-duzem à agregação de proteína, resulta em uma formulação tendo ao me-nos cerca de 5%, ao menos cerca de 4%, ao menos cerca de 3%, ao menoscerca de 2%, ao menos cerca de 1%, ou ao menos cerca de 0,5% de espé-cies de peso molecular alto (HMW) conforme medido por cromatografia deexclusão de tamanho-cromatografia líquida de alto desempenho (SEC-HPLC), após a formulação ser submetida às condições que promovem agre-gação de proteína.

Em algumas concretizações, o método de adição de metioninaa uma formulação de proteína a uma concentração de cerca de 0,5 mM acerca de 145 mM aumenta a vida útil da formulação de proteína comparadacom a formulação que carece de metionina. Em outras concretizações, ométodo de adição de metionina a uma formulação de proteína a uma con-centração de cerca de 0,5 mM a cerca de 145 mM mantém a potência daformulação de proteína comparada com uma formulação que carece de me-tionina. Em certas concretizações, o método de adição de metionina a umaformulação de proteína a uma concentração de cerca de 0,5 mM a cerca de145 mM (por exemplo, cerca de 1 mM a cerca de 145 mM) reduz a imuno-genicidade da formulação de proteína comparada com a formulação quecarece de metionina.

O método é mais útil para proteínas conhecidas para agregar,ou consideradas similarmente para agregar, baseada na homologia às prote-ínas que agregam, ou baseadas nos dados experimentais que sugerem aprobabilidade de agregação. Em uma concretização, a proteína dentro deuma formulação se agrega durante armazenamento. Em algumas concreti-zações, a proteína dentro de uma formulação se agrega como um resultadode tensão de cisalhamento. Em outras concretizações, a proteína dentro deuma formulação se agrega como um resultado de temperatura elevada. Emoutras concretizações, a proteína dentro de uma formulação se agrega comoum resultado de exposição à luz. Em ainda outras concretizações, a proteínadentro de uma formulação se agrega como um resultado da presença decertos açúcares, ou tensoativos, na formulação. A adição de metionina àsformulações que são expostas, ou similarmente a serem expostas a taiscondições, é efetiva na redução de formação de agregado, mantendo, dessemodo, a atividade biológica e potência da proteína ou proteínas dentro deuma formulação.

Em algumas concretizações, a agregação da proteína ou proteínas da formulação é determinada antes da adição de metionina à formula-ção. Em outras concretizações, a agregação da proteína ou proteínas daformulação é determinada após adição de metionina à formulação. Em aindaconcretizações adicionais, a agregação da proteína ou proteínas da formula-ção é determinada antes e após adição de metionina à formulação. A agre-gação da proteína ou proteínas de uma formulação pode ser determinadapor qualquer método conhecido a um técnico no assunto, incluindo, mas nãolimitado a, cromatografia de exclusão de tamanho-cromatografia líquida dealto desempenho (SEC-HPLC), cromatografia líquida de fase reversa-cromatografia líquida de alto desempenho (RP-HPLC), absorvância de UV,medições de velocidade de sedimentação, e combinações destas. Em con-cretizações específicas, a percentagem de espécies de peso molecular alto(% HMW) em uma formulação compreendendo cerca de 1 mM a cerca de145 mM de metionina é reduzida por pelo menos cerca de 5%, 10%, 15%,20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, ou 75%,comparada com % de espécies de HMW na formulação idêntica, exceto ca-recendo de metionina. Em outras concretizações específicas, uma formula-ção compreendendo cerca de 1 mM a cerca de 145 mM de metionina tem aomenos cerca de 5%, ao menos cerca de 4%, ao menos cerca de 3%, aomenos cerca de 2%, ao menos cerca de 1%, ou ao menos cerca de 0,5% deespécies de peso molecular alto (HMW). A agregação de uma proteína ouproteínas em uma formulação pode ser medida em qualquer tempo após aformulação ser preparada, ou com ou sem metionina. Em certas concretiza-ções, a agregação é medida um dia após formulação da proteína, entre 1semana e 12 semanas, ou entre 1 mês e 36 meses após formulação da pro-teína de interesse.

Em algumas concretizações, a proteína da formulação é um an-ticorpo, uma proteína de fusão (Ig) de imunoglobulina, um fator de coagula-ção, um receptor, um ligante, uma enzima, um fator de transcrição, ou umfragmento biologicamente ativo de qualquer destas proteínas. Em concreti-zações específicas, a proteína é um anticorpo anti-B7. 1, um anticorpo anti-B7.2, um anticorpo anti-CD22, uma proteína de fusão PSGL-lg, Fator Vila,Fator VIII, Fator IX, Fator X, Fator XI, Fator XII, Fator XIII, ou um fragmentobiologicamente ativo de qualquer destas proteínas. Em algumas concretiza-ções, a proteína é formulada a uma concentração de cerca de 0,1 mg/ml acerca de 250 mg/ml na formulação. Em algumas concretizações, a proteínaé formulada a uma concentração de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 200mg/ml na formulação. Em outras concretizações, a proteína é formulada auma concentração de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 100 mg/ml na formula-ção. Em algumas concretizações, a proteína é formulada a uma concentra-ção de cerca de 0,1 mg/ml a cerca de 10 mg/ml na formulação. Em certasconcretizações, a proteína é formulada como um líquido ou pó seco congelado.

Em certas concretizações, a formulação de proteína compreen-de um tensoativo. Em concretizações específicas, o tensoativo é polissorba-to-20 ou polissorbato-80. Em certas outras concretizações, a formulação deproteína carece de um tensoativo. Em certas concretizações, a formulaçãode proteína compreende um modificador de tonicidade. Em concretizaçõesespecíficas, o modificador de tonicidade é cloreto de sódio, manitol, ou sorbi-tol. Em certas outras concretizações, a formulação de proteína compreendeum açúcar. Em concretizações específicas, o açúcar é sacarose, trehalose,manitol, sorbitol, ou xilitol. Em certas outras concretizações, a formulação deproteína carece de um açúcar. Em algumas concretizações, o pH da formu-lação é entre cerca de 5,0 e 8,0. Em algumas outras concretizações, o pH daformulação é entre cerca de 5,8 e 6,6.

Em outras concretizações, a formulação de proteína compreen-de adicionalmente um ou mais agentes que reduz agregação da proteína daformulação. Em algumas concretizações, o agente que reduz agregação daproteína da formulação é um aminoácido. Em concretizações específicas, oaminoácido é arginina, lisina, glicina, ácido glutâmico, ou ácido aspártico. Emalgumas concretizações, o aminoácido é adicionado a uma formulação deproteína a uma concentração de cerca de 1 mM a cerca de 300 mM. Em al-gumas outras concretizações, o aminoácido é adicionado a uma formulaçãode proteína a uma concentração de cerca de 5 mM a cerca de 150 mM. Emoutras concretizações, o agente que reduz agregação da proteína da formu-lação é uma combinação de quelatores de metal. Em concretizações especí-ficas, os quelatores de metal são DTPA, EGTA, e DEF. Em algumas concre-tizações, a concentração de DTPA ou EGTA na formulação de proteína é decerca de 1 μΜ a cerca de 5 mM. Em algumas concretizações, a concentra-ção de DEF na formulação de proteína é de cerca de 1 μΜ a cerca de 10mM. Em outras concretizações, o agente que reduz agregação da proteínada formulação é um purificador de radical livre, especialmente um purificadorde radicais oxigênio. Em concretizações específicas, o purificador de radicallivre é manitol ou histidina. Em algumas concretizações, a concentração demanitol na formulação de proteína é de cerca de 0,01% a cerca de 25%. Emalgumas concretizações, a concentração de histidina na formulação de pro-teína é de cerca de 100 μΜ a cerca de 200 mM. Em outras concretizações, oagente que reduz agregação da proteína da formulação é uma combinaçãode um quelator de metal e um purificador de radical livre. Em certas outrasconcretizações, o agente que reduz agregação é citrato. Em certas concreti-zações, a concentração de citrato na formulação de proteína é de cerca de0,5 mM a cerca de 25 mM.

Em outro aspecto, o pedido proporciona um método para redu-ção de agregação de uma proteína em uma formulação de proteína, em quea proteína não contém um resíduo de metionina, ou contém menos do que10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, ou 2 de resíduos de metionina, pela adição de metioni-na à formulação a uma concentração de cerca de 0,5 mM a cerca de 145mM. O método resulta na agregação reduzida da proteína na formulaçãocomparada com a mesma proteína na formulação idêntica, exceto carecen-do de metionina. Em certas concretizações, a metionina é adicionada à for-mulação a uma concentração final de entre cerca de 0,5 mM e cerca de 50mM. Em concretizações específicas, a metionina é adicionada à formulaçãoa uma concentração final de 0,5 mM, 1 mM, 2,5 mM, 5 mM, 7,5 mM, 10 mM,12,5 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, e 45 mM. Em ou-tras concretizações, o método de adicionar cerca de 0,5 mM a cerca de 145mM de metionina a uma formulação de proteína no qual a proteína não con-tém um resíduo de metionina, ou contém menos do que 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, ou 2 resíduos de metionina, resulta em üma formulação tendo ao menoscerca de 5%, ao menos cerca de 4%, ao menos cerca de 3%, ao menos cer-ca de 2%, ao menos cerca de 1%, ou ao menos cerca de 0,5% de espéciesde peso molecular alto (HMW).

Em outro aspecto, o pedido proporciona um método para redu- ção de agregação de uma proteína em uma formulação de proteína, no quala agregação não é causada por oxidação de metionina. O método envolveadicionar metionina à formulação a uma concentração de cerca de 0,5 mM acerca de 145 mM. O método resulta na agregação reduzida da proteína naformulação comparada com a mesma proteína na formulação idêntica, exce-to carecendo de metionina. Em certas concretizações, a metionina é adicio-nada à formulação a uma concentração final de entre cerca de 0,5 mM ecerca de 50 mM. Em concretizações específicas, a metionina é adicionada àformulação a uma concentração final de 0,5 mM, 1 mM, 2,5 mM, 5 mM, 7,5mM, 10 mM, 12,5 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, e 45mM. Em outras concretizações, o método de adicionar cerca de 0,5 mM acerca de 145 mM de metionina a uma formulação resulta em uma formula-ção tendo ao menos cerca de 5%, ao menos cerca de 4%, ao menos cercade 3%, ao menos cerca de 2%, ao menos cerca de 1%, ou ao menos cercade 0,5% de espécies de peso molecular alto (HMW).

Em ainda outro aspecto, um método para redução de agregaçãode uma proteína formulada com um tensoativo é provido. Em certas concre-tizações, o tensoativo faz com que a proteína se agregue. O método envolveadição de metionina à formulação a uma concentração de cerca de 0,5 mMa cerca de 145 mM. O método resulta em agregação reduzida da proteínana formulação comparada com a mesma proteína na formulação idêntica,exceto carecendo de metionina. Em certas concretizações, metionina é adi-cionada à formulação a uma concentração final de entre cerca de 0,5 mM ecerca de 50 mM. Em outras concretizações, metionina é adicionada à formu-lação a uma concentração final de 0,5 mM, 1 mM, 2,5 mM, 5 mM, 7,5 mM,10 mM, 12,5 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, e 45 mM.

Em concretizações específicas, o método de adicionar cerca de 0,5 mM acerca de 145 mM de metionina a uma formulação formulada com um tensoa-tivo resulta em uma formulação tendo ao menos cerca de 5%, ao menoscerca de 4%, ao menos cerca de 3%, ao menos cerca de 2%, ao menos cer-ca de 1%, ou ao menos cerca de 0,5% de espécies de alto peso molecular(HMW).

Em um aspecto adicional, um método de adicionar metionina auma formulação a uma concentração de cerca de 0,5 mM a cerca de 145mM reduz agregação de uma proteína submetida à tensão de cisalhamento.

O método envolve adição da metionina antes, ao mesmo tempo, ou após aformulação ser submetida à tensão de cisalhamento. O método resulta naredução da agregação da proteína na formulação comparada com a mesmaproteína na formulação idêntica, exceto carecendo de metionina. Em certasconcretizações, metionina é adicionada à formulação a uma concentraçãofinal de entre cerca de 0,5 mM e cerca de 50 mM. Em concretizações espe-cíficas, metionina é adicionada à formulação a uma concentração final de 0,5mM, 1 mM, 2,5 mM, 5 mM, 7,5 mM, 10 mM, 12,5 mM, 15 mM, 20 mM, 25mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, e 45 mM. Em algumas concretizações, tensãode cisalhamento é causada por procedimentos de agitação, sacudimento,degelo, transporte, retirada em uma seringa, ou purificação. Em concretiza-ções específicas, o método de adicionar cerca de 0,5 mM a cerca de 145mM metionina a uma formulação submetida à tensão de cisalhamento resul-ta em uma formulação tendo ao menos cerca de 5%, ao menos cerca de4%, ao menos cerca de 3%, ao menos cerca de 2%, ao menos cerca de 1%,ou ao menos cerca de 0,5% de espécies de alto peso molecular (HNW).

Em um ainda outro aspecto, um método de adicionar metioninaa uma formulação a uma concentração de cerca de 0,5 mM a cerca de 145mM reduz agregação de uma proteína exposta à luz. Em certas concretiza-ções, metionina é adicionada à formulação a uma concentração final de en-tre cerca de 0,5 mM e cerca de 50 mM. Em concretizações específicas, me-tionina é adicionada à formulação a uma concentração final de 0,5 mM, 1mM, 2,5 mM, 5 mM, 7,5 mM, 10 mM, 12,5 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30mM, 35 mM, 40 mM, e 45 mM. Em algumas concretizações, a luz é luz fluo-rescente. Em outras concretizações, a luz é luz solar. Em outras concretiza-ções, a luz é luz UV. O método envolve adição de metionina antes de, aomesmo tempo, ou após a formulação ser exposta à luz. Em certas concreti-zações, metionina é adicionada antes de, ao mesmo tempo, ou após exposi-ção da formulação à luz. O método de adicionar metionina a uma formulaçãoa uma concentração de cerca de 0,5 mM a cerca de 145 mM resulta na re-dução da agregação da proteína na formulação comparada com a mesmaproteína na formulação idêntica, exceto carecendo de metionina. Em concre-tizações específicas, o método de adicionar cerca de 0,5 mM a cerca de 145mM de metionina a uma formulação exposta à luz resulta em uma formula-ção tendo ao menos cerca de 5%, ao menos cerca de 4%, ao menos cercade 3%, ao menos cerca de 2%, ao menos cerca de 1%, ou ao menos cercade 0,5% de espécies de alto peso molecular (HNW).

Em outro aspecto, um método de adicionar metionina a umaformulação a uma concentração de cerca de 0,5 mM a cerca de 145 mMdiminui uma perda na potência ou atividade biológica de uma proteína emuma formulação de proteína. Este método resulta na redução da agregaçãoda proteína na formulação, mantendo, desse modo, a potência ou atividadefuncional da proteína. Em certas concretizações, metionina é adicionada àformulação a uma concentração final de entre cerca de 0,5 mM e cerca de50 mM. Em concretizações específicas, metionina é adicionada à formulaçãoa uma concentração final de 0,5 mM, 1 mM, 2,5 mM, 5 mM, 7,5 mM, 10 mM,12,5 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, e 45 mM. Emconcretizações específicas, o método de adicionar cerca de 0,5 mM a cercade 145 mM de metionina a uma formulação resulta em uma formulação ten-do ao menos cerca de 5%, ao menos cerca de 4%, ao menos cerca de 3%,ao menos cerca de 2%, ao menos cerca de 1%, ou ao menos cerca de 0,5%de espécies de alto peso molecular (HNW).

Em um aspecto diferente, o pedido envolve proporcionar for-mulação de proteínas compreendendo um peptídeo/peptídeos, uma proteí-na/proteínas, ou um peptídeo/peptídeos e uma proteína/proteínas, e cercade 0,5 mM a cerca de 50 mM de metionina. Em concretizações específicas,metionina é adicionada à formulação a uma concentração final de 0,5 mM, 1mM, 2,5 mM, 5 mM, 7,5 mM, 10 mM, 12,5 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30mM, 35 mM, 40 mM, e 45 mM. Em algumas concretizações deste aspecto, aproteína da formulação é um anticorpo, uma proteína de fusão Ig, um fatorde coagulação, um receptor, um ligante, uma enzima, um fator de transcri-ção, ou um fragmento biologicamente ativo destas proteínas. Em concretiza-ções específicas, a proteína é um anticorpo anti-B7. 1, um anticorpo anti-B7.2, um anticorpo anti-CD22, uma proteína de fusão PSGL-lg, Fator Vila, FatorVIII, Fator IX, Fator X, Fator XI, Fator XII, Fator XIII, ou um fragmento biolo-gicamente ativo destas proteínas. Em outras concretizações, a proteína tempelo menos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de95%, pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cer-ca de 98%, pelo menos cerca de 99% de identidade de seqüência de ami-noácido para um anticorpo anti-B7. 1, um anticorpo anti-B7.2, um anticorpoanti-CD22, uma proteína de fusão PSGL-lg, Fator Vila, Fator VIII, Fator IX,Fator X, Fator XI, Fator XII, ou Fator XIII. Em algumas concretizações, aformulação compreende um tampão. Em concretizações específicas, o tam-pão é um tampão de histidina, um tampão de citrato, um tampão de succina-to, ou um tampão Tris. Em certas concretizações, a formulação tem um pHde cerca de 5,0 a cerca de 8,0. Em outras concretizações, a formulação temum pH de cerca de 6,0 a cerca de 7,5. Em algumas concretizações, a formu-lação compreende outro agente que pode reduzir agregação de proteínas. Aformulação pode compreender adicionalmente um açúcar, um tensoativo,um agente de volume, um crioprotetor, um agente de estabilização, um anti-oxidante, ou uma combinação destes. Em algumas concretizações, o(s) pep-tídeo(s)/proteína(s) da formulação está em uma concentração de cerca de0,1 mg/ml e cerca de 300 mg/ml na formulação. Em outras concretizações,o(s) peptídeo(s)/proteína(s) da formulação está a uma concentração de cer-ca de 0,1 mg/ml e cerca de 10 mg/ml na formulação. Em certas concretiza-ções, a proteína é formulada como um líquido, ou como um pó seco conge-lado. Em certas concretizações, as formulações de proteína são providascomo kits. Tais kits podem incluir tampões, excipientes, e instruções parauso da formulação de proteína.

Em outro aspecto, o pedido proporciona métodos de tratamento,prevenção, e/ou de diagnóstico usando as formulações de proteína aquidescritas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1a é um gráfico de barras representando a percenta-gem inicial de espécies de alto peso molecular (% HMW) em uma formula-ção anti-B7. 2 formulada na presença e ausência de 10 mM de metionina(Met) e 0,01% de polissorbato-80 (PS) nos níveis de pH indicados.

A Figura 1 b é um gráfico de barras representando as espéciesde % HMW em uma formulação anti-B7. 2 formulada na presença e ausên-cia de 10 mM de metionina (Met), e 0,01% de polissorbato-80 (PS) nos ní-veis de pH indicados, após 6 semanas de armazenamento a 40°C.

A Figura 1c é um gráfico de barras representando as espéciesde % HMW em uma formulação anti-B7. 2 formulada na presença e ausên-cia de 10 mM de metionina (Met), e 0,01% de polissorbato-80 (PS) nos ní-veis de pH indicados, após 12 semanas de armazenamento a 40°C.

A Figura 2a é um gráfico de barras representando as espéciesde % HMW iniciais em uma formulação de anticorpo anti-B7. 2 formulada emtampões de citrato, succinato, e histidina (sobre várias faixas de pH) na pre- sença e ausência de 10 mM de metionina (Met), e 0,01% de polissorbato-80(PS).

A Figura 2b é um gráfico de barras representando as espéciesde % HMW em uma formulação de anticorpo anti-B7. 2 formulada em tam-pões de citrato, succinato, e histidina (sobre várias faixas de pH) na presen-ça e ausência de 10 mM de metionina (Met), e 0,01% de polissorbato-80(PS), após 12 semanas de armazenamento a 40°C.

A Figura 3a é um gráfico de barras representando % de espé-cies de HMW em uma formulação de anticorpo anti-CD22 após armazena-mento por 1 mês a 36 meses a -80°C.

A Figura 3b é um gráfico de barras representando % de espé-cies de HMW em uma formulação de anticorpo anti-CD22 após armazena-mento por 1 mês a 36 meses a 25°C.

A Figura 4 é um gráfico de barras representando a % de espé-cies de HMW presentes em uma formulação de proteína PSGL-lg, formuladacom ou sem metionina, após armazenamento por até 4 semanas a -80°C,25°C, e 40°C.

A Figura 5 é um gráfico de barras representando a % de espé-cies de HMW em uma formulação de proteína PSGL-Ig submetida à tensãode cisalhamento na presença (S-1 e S-2) ou ausência (C) de metionina.

A Figura 6 é um gráfico de barras representando a potência deREFACTO® formulada em tampões de histidina ou succinato, com ou semmetionina, após exposição à luz e condições escuras por um período de 1 mês.

A Figura 7 é um representação esquemática mostrando a corre-lação entre oxidação de rhlL-11 e multimerização.

A Figura 8 proporciona as seqüências de aminoácido das ca-deias leves e pesadas de um anticorpo anti-B7.1. As ligações de dissulfetointramoleculares diagnosticadas são ilustradas por conexões dos resíduosde cisteína envolvidos. As cisteínas esperadas para formarem ligações dedissulfeto intermoleculares são sublinhadas, e a conectividade indicada. Osdois resíduos alterados na porção Fc que reduz a função influenciadora sãocolocados em caixa. O local de consenso de glicosilação N-Iigada está emitálicos em negrito.

A Figura 9 proporciona as seqüências de aminoácido das cadei-as leves e pesadas de um anticorpo anti-B7. 2. As ligações de dissulfeto in-tramoleculares diagnosticadas são ilustradas por conexões dos resíduos decisteína envolvidos. As cisteínas esperadas para formarem ligações de dis-sulfeto intermoleculares são sublinhadas, e a conectividade indicada. Osdois resíduos alterados na porção Fc que reduz a função influenciadora sãocolocados em caixa. O local de consenso de glicosilação N-Iigada está emitálicos em negrito.

A Figura 10 proporciona as seqüências de aminoácido das ca-deias leves e pesadas de um anticorpo anti-CD22. A seqüência sublinhada éa seqüência de sinal, e a complementaridade que determina as regiões émostrada em letras em negrito. Um local potencial para glicosilação N-Iigadaé sublinhado.

A Figura 11 proporciona a seqüência de aminoácido de RE-FACTO®(ver, Sandberg H. et al., Structural e Functional Characterization ofB-Domain Deleted Recombinant Fator VIII, Seminars in Hematology, Vol. 38,No. 2, Suppl. 4, pp 4-12, April 2001).

DESCRIÇÃO DETALHADA

Os avanços recentes na biotecnologia têm proporcionado umaampla variedade de formulações de proteína biologicamente ativas para usono diagnóstico e terapia. Contudo, o desenvolvimento, produção, distribui-ção, segurança e estabilidade de tais formulações de proteína impõem desa-fios significantes. Um problema maior com formulações de proteína é queelas podem perder sua atividade biológica como um resultado da formaçãode agregados solúveis e insolúveis. A agregação é um estado de proteínadegradado e, portanto, a minimização da mesma resulta em vida útil aumen-tada, potência, ou atividade de uma formulação de proteína.

Este pedido geralmente se refere à descoberta que a adição doaminoácido metionina a uma formulação de proteína a uma concentraçãofinal de entre cerca de 0,5 mM a cerca de 145 mM, reduz a agregação daproteína ou proteínas na formulação, aumentando, desse modo, a vida útil, emantendo a atividade biológica da formulação em relação à formulação deproteínas preparada sem metionina.Fatores que Afetam a Agregação de proteínaAs proteínas têm uma ampla variedade de usos farmacêuticos,biotécnicos, e de pesguisa. Em vários estágios em quaisquer destes usos,as proteínas podem ser agregar. Por "agregado" é significativo uma intera- ção física entre moléculas de proteína que resulta na formação de dímerosou oligômeros covalentes ou não-covalentes, que podem permanecer solú-veis, ou formar agregados insolúveis que precipitam da solução. O termo"proteína," conforme aqui usado, envolve um peptídeo, um polipeptídeo,uma proteína, e um proteína de fusão. As proteínas podem ser produzidas por métodos recombinantes ou sintéticos.

Muitos fatores diferentes podem causar a agregação de umaproteína em uma formulação de proteína. Procedimentos típicos de purifica-ção e armazenamento podem expor a formulação de proteínas a condiçõese componentes que fazem com que a proteína se agregue. Por exemplo, as proteínas em uma formulação de proteína podem se agregar como um resul-tado de qualquer um ou mais dos seguintes: armazenamento, exposição atemperaturas elevadas, o pH da formulação, a resistência iônica da formula-ção, e a presença de certos tensoativos (por exemplo, polissorbato-20 e po-lissorbato-80), e agentes emulsificantes. O termo "durante armazenamento,"conforme aqui usado, significa uma formulação que uma vez preparada, nãoé imediatamente usada; preferivelmente, em seguida a sua preparação, elaé acondicionada para armazenamento, ou em uma forma líquida, em umestado congelado, ou em uma forma seca para reconstituição posterior emuma forma líquida ou outra forma. Por "temperatura elevada" é significativoqualquer temperatura acima da temperatura na qual a proteína é normal-mente armazenada.

Similarmente, as proteínas podem se agregar quando expostasa tensão de cisalhamento, tais como, reconstituição de uma massa de prote-ína Iiofilizada em solução, purificação em filtro de uma amostra de proteína,congelamento em freezer, agitação, ou transferência de uma solução de pro-teína via seringa. A agregação pode também ocorrer como um resultado deinterações de moléculas de polipeptídeo em solução, e nas interfaces líqui-do-ar dentro de frascos de armazenamento. Mudanças conformacionais po-dem ocorrer em polipeptídeos adsorvidos em interfaces ar-líquido e sólido-líquido durante compressão ou extensão das interfaces, resultante da agita-ção durante transporte. Tal agitação pode fazer com que a proteína de umaformulação se agregue e finalmente se precipite com outras proteínas ad-sorvidas.

Em adição, a exposição de uma formulação de proteína à luzpode fazer com que a proteína se agregue. A exposição à luz pode criar es-pécies reativas que facilitam agregação. Em algumas concretizações, a luz éluz fluorescente. Em outras concretizações, a luz é luz solar. Em outras con-cretizações, a luz é luz UV.

Além disso, o acondicionamento da formulação de proteína po-de impactar a agregação de proteína. Níveis de traço de metais (níveis deppm de cobre, ferro, cobalto, manganês) podem sair do acondicionamentode recipiente, promovendo hidrólise da ligação amida, e por último, resultan-do na agregação de proteína.

O presente pedido proporciona métodos e composições quereduzem agregação de proteínas pelo controle de um ou mais dos meca-nismos de agregação acima mencionados. Isto pode resultar em, por exem-plo, estabilidade aperfeiçoada do produto, uma maior flexibilidade nos pro-cessos de fabricaçãomento, e condições de armazenamento.

Métodos de Redução de agregação de uma Proteína em umaFormulação de proteína

Este pedido geralmente se refere a descoberta que a adição doaminoácido metionina a uma formulação pode reduzir agregação de umaproteína ou proteínas na formulação. A redução na agregação é relativa auma formulação idêntica, exceto carecendo de metionina. Para reduzir agre-gação, metionina é adicionada à formulação a uma concentração final deentre cerca de 0,5 mM a cerca de 145 mM. Conforme usado neste pedido,"cerca de" significa um valor numérico tendo uma faixa de ± 25% ao redor dovalor citado. Em algumas concretizações, metionina é adicionada a umaconcentração final de entre cerca de 0,5 mM a cerca de 10 mM. Em outrasconcretizações, metionina é adicionada a uma concentração final de entrecerca de 0,5 mM a cerca de 15 mM. Em algumas concretizações, metioninaé adicionada a uma concentração final de entre cerca de 2,5 mM a cerca de10 mM. Em algumas concretizações, metionina é adicionada a uma concen-tração final de entre cerca de 2,5 mM a cerca de 15 mM. Em outras concreti-zações, metionina é adicionada a uma concentração final de entre cerca de5 mM a cerca de 15 mM. Em algumas concretizações, metionina é adiciona-da a uma concentração final de entre cerca de 5 mM a cerca de 25 mM. Emalgumas outras concretizações, metionina é adicionada a uma concentraçãofinal de entre cerca de 0,5 mM a cerca de 25 mM. Em certas concretizações,metionina é adicionada a uma concentração final de entre cerca de 0,5 mM acerca de 50 mM. Em outras concretizações, metionina é adicionada a umaconcentração final de entre cerca de 50 mM a cerca de 100 mM. Em certasoutras concretizações, metionina é adicionada a uma concentração final deentre cerca de 100 mM a cerca de 145 mM. Em ainda outras concretizações,metionina é adicionada a uma concentração final de entre cerca de 100 mMa cerca de 140 mM. Em ainda outras concretizações, metionina é adicionadaa uma concentração final de entre cerca de 100 mM a cerca de 135 mM. Emainda outras concretizações, metionina é adicionada a uma concentraçãofinal de entre cerca de 100 mM a cerca de 125 mM. Em outras concretiza-ções, metionina é adicionada a uma concentração final de entre cerca de 5mM a cerca de 50 mM. Em algumas concretizações, metionina é adicionadaa uma concentração final de entre cerca de 5 mM a cerca de 25 mM. Emconcretizações específicas, metionina é adicionada a uma formulação deproteína a uma concentração final de cerca de 0,5 mM, cerca de 1 mM, cercade 2 mM, cerca de 3 mM, cerca de 4 mM, cerca de 5 mM, cerca de 6 mM,cerca de 7 mM, cerca de 8 mM, cerca de 9 mM, cerca de 10 mM, cerca de11 mM, cerca de 12 mM, cerca de 13 mM, cerca de 14 mM, cerca de 15 mM,cerca de 16 mM, cerca de 17 mM, cerca de 18 mM, cerca de 19 mM, cercade 20 mM, cerca de 21 mM, cerca de 22 mM, cerca de 23 mM, cerca de 24mM, cerca de 25 mM, cerca de 26 mM, cerca de 27 mM, cerca de 28 mM,cerca de 29 mM, cerca de 30 mM,.cerca de 31 mM, cerca de 32 mM, cercade 33 mM, cerca de 34 mM, cerca de 35 mM, cerca de 36 mM, cerca de 37mM, cerca de 38 mM, cerca de 39 mM, cerca de 40 mM, cerca de 41 mM,cerca de 42 mM, cerca de 43 mM, cerca de 44 mM, cerca de 45 mM, cercade 46 mM, cerca de 47 mM, cerca de 48 mM, cerca de 49 mM, ou cerca de50 mM.

Indiferente de o que faz com que uma proteína de uma formula-ção se agregue, a adição de metionina reduz agregação da proteína ou pro-teínas na formulação. Em certas concretizações, a adição de metionina re-duz a agregação em uma formulação causada por armazenamento, exposi-ção a temperaturas elevadas, exposição à luz, exposição a tensão de cisa-Ihamento, a presença de tensoativos, pH e condições iônicas, e quaisquercombinações destas.

O método acima descrito pode ser usado para diminuir agrega-ção de proteínas formuladas em uma forma líquida ou forma seca. A agre-gação reduzida é observada em uma formulação líquida, se armazenadadiretamente naquela forma para uso posterior, armazenada em um estadocongelado e descongelada antes do uso, ou preparada em uma forma seca,tal como uma forma liofilizada, secada a ar, ou secada por atomização, parareconstituição posterior em uma forma líquida ou outra forma anterior para uso.

O nível de agregação de proteína em uma formulação pode sermedido antes, substancialmente ao mesmo tempo, ou após a adição de me-tionina à formulação. Em certas concretizações, o nível de agregação é me-dido pelo menos uma vez entre cerca de 1 dia e cerca de 12 semanas apósa adição de metionina à formulação. Em outras concretizações, o nível deagregação é medido pelo menos uma vez entre cerca de 1 mês e 36 mesesapós a adição de metionina à formulação. Em certas concretizações, os mé-todos descritos aqui resultam em uma redução de cerca de 5%, cerca de10%, cerca de 15%, cerca de 20%, cerca de 25%, cerca de 30%, cerca de35%, cerca de 40%, cerca de 45%, cerca de 50%, cerca de 55%, cerca de60%, cerca de 65%, cerca de 70%, cerca de 75%, cerca de 80%, cerca de85%, ou cerca-.de 90% de % de espécies de HMW comparadas com formu-lações carecendo de metionina. Em concretizações específicas, o método deadicionar entre cerca de 1 mM a cerca de 145 mM metionina a uma formula-ção de proteína resulta na formulação tendo ao menos cerca de 5%, ao me-nos cerca de 4%, ao menos cerca de 3%, ao menos cerca de 2%, ao menoscerca de 1%, ou ao menos cerca de 0,5% de espécies de HMW. Em outrasconcretizações específicas, o método de adicionar entre cerca de 1 mM acerca de 145 mM de metionina a uma formulação de proteína resulta naformulação tendo cerca de 5%, cerca de 4%, cerca de 3%, cerca de 2%,cerca de 1%, ou cerca de 0,5% de espécies de HMW. Em outras concretiza- ções, o método de adicionar entre cerca de 1 mM a cerca de 145 mM metio-nina a uma formulação de proteína resulta na formulação tendo entre cercade 0,5% a cerca de 5% de espécies de HMW.

A formulação de proteína pode adicionalmente compreenderum ou mais agentes que reduzem agregação da proteína da formulação. Emalgumas concretizações, o agente que reduz agregação da proteína da for-mulação é um aminoácido. Em concretizações específicas, o aminoácido éarginina, lisina, glicina, ácido glutâmico, ou ácido aspártico. Em algumasconcretizações, o aminoácido é adicionado a uma formulação de proteína auma concentração de cerca de 0,5 mM a cerca de 200 mM. Em algumasconcretizações, o aminoácido é adicionado a uma formulação de proteína auma concentração de cerca de 5 mM a cerca de 100 mM. Em algumas ou-tras concretizações, o aminoácido é adicionado a uma formulação de proteí-na a uma concentração de cerca de 5 mM a cerca de 125 mM. Em certasoutras concretizações, o aminoácido é adicionado a uma formulação de pro-teína a uma concentração de cerca de 0,5 mM a cerca de 50 mM. Em aindaoutras concretizações, o aminoácido é adicionado a uma formulação de pro-teína a uma concentração de cerca de 0,5 mM a cerca de 25 mM. O agenteque reduz agregação da proteína da formulação pode também ser umacombinação de quelatores de metal. Em concretizações específicas, os que-latores de metal são DTPA, EGTA e DEF. Em algumas concretizações, aconcentração de DTPA ou EGTA na formulação de proteína é de cerca de 1- μΜ a cerca de 10 mM, de cerca de 1 μΜ a cerca de 5 mM, de cerca de 10μΜ a cerca de 10 mM, 50 μΜ a cerca de 5 mM, ou de cerca de 75 μΜ a cer-ca de 2,5 mM. Em algumas concretizações, a concentração de DEF na for-mulação de proteína é de cerca de 1 μΜ a cerca de 10 mM, de cerca de 1μΜ a cerca de 5 mM, de cerca de 10 μΜ a cerca de 1 mM, ou de cerca de20 μΜ a cerca de 250 μΜ. O agente que reduz a agregação da proteína daformulação pode também ser um purificador de radical livre, especialmenteum purificador de radicais oxigênio. Em concretizações específicas, o purifi-cador de radical livre é manitol ou histidina. Em algumas concretizações, aconcentração de manitol na formulação de proteína é de cerca de 0,01% acerca de 25%, de cerca de 0,1% a cerca de 25%, de cerca de 0,5% a cercade 15%, ou de cerca de 1% a cerca de 5%. Em algumas concretizações, aconcentração de histidina na formulação de proteína é de cerca de 10 μΜ acerca de 200 mM, de cerca de 100 μΜ a cerca de 200 mM, de cerca de 500μΜ a cerca de 100 mM, ou de cerca de 15 mM a cerca de 35 mM. Em outrasconcretizações, o agente que reduz a agregação da proteína da formulaçãoé uma combinação de um quelator de metal e um purificador de radical livre.Em algumas concretizações, o agente que reduz a agregação de uma prote-ína ou proteínas em uma formulação é citrato. Em certas concretizações, aconcentração de citrato na formulação de proteína é de cerca de 0,5 mM acerca de 50 mM, de cerca de 0,5 mM a cerca de 25 mM, de cerca de 1 mM acerca de 35 mM, de cerca de 5 mM a cerca de 25 mM, ou de cerca de 5 mMa cerca de 10 mM.

Métodos para Avaliar Níveis de Agregação de proteína

Um número de métodos analíticos diferentes pode ser usadopara detectar a presença e níveis de agregados em uma formulação de pro-teína. Estes incluem, mas não estão limitados a, eletroforese de gel de poli-acrilamida nativa (PAGE), eletroforese de gel de sódio dodecil sulfato-poliacrilamida (SDS-PAGE), eletroforese de gel capilar (CGE), cromatografiade exclusão de tamanho (SEC), ultracentrifugação analítica (AUC), fracio-namento de fluxo de campo (FFF), detecção de difusão de luz, velocidadede sedimentação, espectroscopia de UV, calorimetria de varredura diferenci-al, turbidimetria, nefelometria, microscopia, cromatografia de exclusão detamanho-cromatografia líquida de alto desempenho (SEC-HPLC), cromato-grafia líquida de fase reversa-cromatografia líquida de alto desempenho (RP-HPLC), espectroscopia de massa em tandem de ionização de e Ietroatomiza-ção (ESI-MS), e tandem RP-HPLC/ESI-MS. Estes métodos podem ser usa-dos ou sozinhos, ou em combinação.

Um problema comum com formulação de proteínas é o acúmuloirreversível de agregados com tempo, calor, ou tensão de cisalhamento. Ti-picamente, quando os agregados precipitam, eles formam grandes partícu-las que são fáceis de detectar. Agregados solúveis não-covalentes menores,contudo, que são freqüentemente precursores para precipitação de partícu-las grandes, são mais difíceis de detectar e quantificar. Desse modo, méto-dos para detectar e quantificar agregação de proteína em uma formulaçãode proteína necessita serem baseados no tipo de agregado sendo avaliado.

Entre os métodos acima, os métodos sugeridos para determinara presença e/ou quantidades de agregados covalentes solúveis em uma for-mulação de proteína são: SEC/difusão de luz, SDS-PAGE, CGE, RP-HPLC/ESI-MS, FFF e AUC. Os métodos sugeridos para determinar a pre-sença e/ou quantidades de agregados não-covalentes solúveis em uma for-mulação de proteína são: SEC, PAGE, SDS-PAGE, CGE, FFF, AUC, e difu-são de luz dinâmica. Os métodos sugeridos para determinar a presença e/ouquantidades de agregados não-covalentes solúveis em uma formulação deproteína são: espectroscopia de UV, turbidimetria, nefelometria, microscopia,AUC, e difusão de luz dinâmica.

Proteínas

Qualquer proteína susceptível a agregação, incluindo anticor-pos, proteínas de fusão de imunoglobulina, fatores de coagulação, recepto-res, ligantes, enzimas, fatores de transcrição, ou fragmento biologicamenteativos destes, pode ser protegida pelos métodos e composições deste pedi-do. A fonte ou maneira na qual a proteína é obtida ou produzida (por exem-pio, se isolada de fontes de células ou tecido por um esquema de purificaçãoapropriado, produzida por técnicas de DNA recombinante, ou sintetizadaquimicamente usando-se síntese de peptídeo padrão) é imaterial ao métodoensinado por este pedido. Conseqüentemente, uma ampla variedade de pro-teínas nativa, sintética, e/ou recombinante, incluindo proteínas quiméricase/ou proteínas de fusão, pode ser protegida de agregação pelos métodos ecomposições do pedido.

A proteína de interesse a ser formulada inclui, mas não está li-mitada a, proteínas tais como, PSGL-lg; GPIb-lg; GPIIbIIIa-Ig; IL-13R-lg; IL-21 R-Ig; Fator Vila; Fator VIII; Fator VIIIC; Fator IX; Fator X; Fator XI; FatorXII; Fator XIII; fator de tecido; fator de von Willebrands; fatores de anti-coagulação tais como Proteína C; fator natriurético atrial; miostatina/GDF-8;interleukins (ILs), por exemplo, IL-1 a IL-15; hormônio de crescimento huma-no e hormônio de crescimento bovino; fator de liberação de hormônio decrescimento; hormônio de paratireóide; hormônio de estimulação de tireóide;uricase; bikunina; bilirrubina oxidase; subtilisina; Iipoprote ínas; a-1-antitripsina; cadeia A de insulina; cadeia B de insulina; pró-insulina; hormô-nio de estimulação de folículo; calcitonina; hormônio de luteinização; gluca-gon; tensoativo de pulmão; um ativador de plasminogênio, tais como uroqui-nase ou ativador de plasminogênio tipo tecido (t-PA); bombazina; trombina;plasmina, miniplasmina; microplasmina; factor-α e -β de necrose de tumor;enkefalinase; RANTES (célula T expressa e secretada, regulada normalmen-te em ativação); proteína inflamatória de microfago humano (ΜΙΡ-1-α); al-bumina de soro, tal como albumina de soro humana; substância de inibiçãode mullerian; cadeia A de relaxina; cadeia B de relaxina; prorrelaxina; peptí-deo associado a gonadotropina de camundongo; DNase; inibina; activina;fator de crescimento endotelial vascular (VEGF); fator de crescimento pla-cental (PIGF); receptores para hormônios ou fatores de crescimento; um in-tegrin; proteína A ou D; fatores de reumatóide; um fator neurotrófico, tal co-mo fator neurotrófico derivado de osso (BDNF), neurotrofin-3, -4, -5, ou -6(NT-3, NT-4, NT-5, ou NT-6), ou um fator de crescimento de nervo, tal comoNGF-β; fator de crescimento derivado de plaqueta (PDGF); fator de cresci-mento de fibroblasto, tais como aFGF e bFGF; fator de crescimento epider-mal (EGF); fator de crescimento de transformação (TGF), tais como TGF-α eTGF-β, incluindo TGF-β 1, TGF-β 2, TGF-β 3, TGF-β 4, ou TGF-β 5; fator decrescimento similar a insulina-l e -II (IGF-I e IGF-II); des(1-3)-IGF-l (cérebroIGF-I); proteínas de ligação de fator de crescimento similar a insulina; proteí-nas CD, tais como: CD2, CD3, CD4, CD8, CD9, CD19, CD20, CD22, CD28,CD34, e CD45; eritropoietina (EPO); trombopoietina (TPO); fatores osteoin- dutivos; imunotoxinas; uma proteína morfogenética de osso (BMP); um inter-feron, tal como interferon-α, -β, e -γ; fatores de estimulação de colônia(CSFs)1 por exemplo, M-CSF1 GM-CSF1 e G-CSF; superóxido dismutase;receptores de célula T; membros da família de receptor HER, tais como oreceptor EGF1 HER2, HER3 ou receptor HER4; moléculas de adesão de cé-lula, tais como LFA-1, VLA-4, ICAM-1, e VCAM; IgE; antígenos de grupo desangue; receptor flk2/flt3; receptor de obesidade (OB); fator de aceleraçãode queda (DAF); um antígeno viral, tais como HIV gag, env, pol, tat, ou pro-teínas rev; receptores auto-direcionais; adressinas; imunoadesinas; e frag-mentos biologicamente ativos ou variantes de qualquer dos polipeptídeos acima listados.

O termo "fragmento biologicamente ativo" significa um frag-mento de uma proteína que retém pelo menos uma das funções da proteínada qual ele é derivado. Um fragmento biologicamente ativo de um anticorpoinclui um fragmento de ligação de antígeno do anticorpo; um fragmento bio- logicamente ativo de um receptor inclui um fragmento do receptor que podeainda ligar seu ligante; um fragmento biologicamente ativo de um Iigante in-clui aquela porção de um ligante que pode ainda ligar seu receptor; e umfragmento biologicamente ativo de uma enzima inclui aquela porção da en-zima que pode ainda catalisar uma reação catalisada pela enzima de com-primento total. Em certas concretizações, um fragmento biologicamente ativoretém pelo menos cerca de 25%, 50%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, ou 95%da função da proteína da qual ele é derivado. A função de uma proteína po-de ser ensaiada por métodos bem conhecidos (por exemplo, interações testede anticorpo-antígeno, interações teste de ligante-receptor, atividade enzi-mática de teste, atividade transcricional de teste, ou interações de testeDNA-proteína).

Em certas concretizações, a proteína a ser formulada é um anti-corpo. O anticorpo pode ser elevado a, e ligar-se a, quaisquer das proteínasacima mencionadas. Em certas concretizações específicas, os anticorposincluem um anticorpo anti-B7.1, um anticorpo anti-B7.2, um anticorpo anti-CD22, um anticorpo anti-miostatin (por exemplo, Pedido dos Estados UnidosNo. 60/752.660), um anticorpo anti-IL-11, um anticorpo anti-IL-12 (por exem-plo, Pedido dos Estados Unidos No. 60/752.660), e um anticorpo anti-IL-13(por exemplo, Pedido dos Estados Unidos No. 60/752.660). Em outras con-cretizações específicas, os anticorpos incluem um anticorpo tendo pelo me-nos cerca de 85%, pelo menos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%,pelo menos cerca de 96%, pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de98%, ou pelo menos cerca de 99% de identidade de seqüência de aminoáci-do para um anticorpo anti-B7.1, um anticorpo anti-B7.2, um anticorpo anti-CD22, um anticorpo anti-miostatin (por exemplo, Pedido dos Estados UnidosNo. 60/752.660), um anticorpo anti-IL-11, um anticorpo anti-IL-12 (por exem-pio, Pedido dos Estados Unidos No. 60/752.660), ou um anticorpo anti-IL-13(por exemplo, Pedido dos Estados Unidos No. 60/752.660), e retêm a capa-cidade de ligar seus respectivos antígenos. A identidade de seqüência deaminoácido entre duas proteínas pode ser medida de acordo com os méto-dos padrões (ver, por exemplo, Pearson e Lipman, Proc. NatL Acad. Sei.USA 85:2444-2448, 1998; George, D.G. et ai, em Macromolecular Seauen-cinq e Synthesis, Selected Métodos e Applications, pps. 127-149, Alan R.Liss, Inc. 1988; Feng e Doolittle, Journal of Molecular Evolution 25:351 -360,1987; Higgins e Sharp, CABIOS 5:151-153, 1989; e os vários programasBLAST programs do NCBI, NLM, Bethesda, MD).

O termo "anticorpo", conforme aqui usado, inclui anticorpos po-liclonais, anticorpos monoclonais, composições de anticorpo com especifici-dades de poliepitopo, anticorpos biespecíficos, diacorpos, ou outras prepa-rações purificadas de anticorpos e anticorpos recombinantes. Os anticorpospodem ser anticorpos totais, por exemplo, de qualquer isotipo (IgG, IgA, IgE1IgM, etc.), ou fragmentos destes, que se ligam ao antígeno de interesse. Emcertas concretizações, o anticorpo a ser formulado é um anticorpo tendo oisotipo IgG.Anticorpos recombinantes incluem, mas não estão limitados a,anticorpos quiméricos e humanizados monoclonais, compreendendo por-ções ambas humanas e não-humanas, anticorpos de cadeia simples e anti-corpos multiespecíficos. Um anticorpo quimérico é uma molécula em queporções diferentes são derivadas de espécies de animal diferentes, tais co-mo aquelas tendo uma região variável derivada de um anticorpo monoclonalmurina, e uma região constante de imunoglobulina humana. Anticorpos decadeia simples têm um local de ligação de antígeno, e consistem de um po-lipeptídeo simples. Anticorpos multi-específicos são moléculas de anticorpotendo pelo menos dois locais de ligação de antígeno que ligam especifica-mente antígenos diferentes. Os anticorpos podem ser fragmentados usando-se técnicas convencionais e os fragmentos classificados para ligação ao an-tígeno de interesse. Preferivelmente, um fragmento de anticorpo compreen-de região de ligação de antígeno e/ou variável de um anticorpo intacto. Des-se modo, o termo fragmento de anticorpo inclui segmentos de porções pro-teoliticamente clivadas ou recombinantemente preparadas de uma moléculade anticorpo que são capazes de se ligar seletivamente a uma certa proteí-na. Exemplos não-limitativos de tais fragmentos proteolíticos e/ou recombi-nantes incluem Fab, F(ab')2, Fab1, Fd, Fv, dAb, uma CDR isolada, e anticor-pos de cadeia simples (scFv) contendo um domínio Vl e/ou Vh unido por umligador de peptídeo. O scFv's pode ser covalentemente ou não-covalentemente ligado para formar anticorpos tendo dois ou mais locais deligação.

Em algumas concretizações, o anticorpo é um anticorpo mono-clonal humanizado. O termo "anticorpo monoclonal humanizado", conformeaqui usado, é um anticorpo monoclonal de uma fonte não-humana (recipien-te) que foi alterado para conter pelo menos um ou mais dos resíduos de a-minoácido encontrados no anticorpo monoclonal humano equivalente (doa-dor). Em certas concretizações, os anticorpos humanizados têm uma oumais regiões determinantes de complementaridade (CDRs) a partir das es-pécies não-humanas, e uma região de estrutura de uma molécula de imuno-globulina humana. Um "anticorpo monoclonal totalmente humanizado" é umanticorpo monoclonal de uma fonte não-humana que foi alterado para contertodos os resíduos de aminoácido encontrados na região de ligação de antí-geno do anticorpo monoclonal humano equivalente. Os anticorpos humani-zados podem também compreender resíduos que não são encontrados, ouno anticorpo recipiente, ou no anticorpo doador. Estas modificações podemser produzidas adicionalmente para refinar uma funcionalidade de anticorpootimizada. O anticorpo humanizado pode também compreender opcional-mente pelo menos uma porção de uma região constante de imunoglobulinahumana (Fc).

Em algumas concretizações, a proteína a ser formulada é umaproteína de fusão. Em uma concretização, a proteína de fusão é uma proteí-na de fusão de imunoglobulina (Ig). Uma proteína de fusão Ig é uma proteínaque compreende uma porção não-lg ligada a uma porção Ig que é derivadaa partir da região constante de uma imunoglobulina. Em uma concretização específica, a proteína de fusão compreende a região constante de cadeiapesada IgG. Em outra concretização, a proteína de fusão compreende umaseqüência de aminoácido correspondente a ligação, regiões CH2 e CH3 deimunoglobulina humana Cy1. Exemplos não-limitativos de proteínas de fusãoIg incluem PSGL-Ig (ver, Patente dos Estados Unidos No. 5.827.817), GPIb-Ig (ver, WO 02/063003), GPIIbIIIa-Ig, IL-13R-lg (ver, Patente dos EstadosUnidos No. 6.268.480), TNFR-Ig (ver, WO 04/008100), IL-21 R-Ig, CTLA4-lge VCAM2D-lgG. Métodos de produção de proteínas de fusão são bem-conhecidos na técnica (por exemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos.5.516.964; 5.225.538; 5.428.130; 5.514.582; 5.714.147; 6.136.310;6.887.471; e 6.482.409). Em algumas concretizações, as proteínas da for-mulação incluem proteínas de fusão tendo pelo menos cerca de 85%, pelomenos cerca de 90%, pelo menos cerca de 95%, pelo menos cerca de 96%,pelo menos cerca de 97%, pelo menos cerca de 98%, ou pelo menos cercade 99% de identidade de seqüência de aminoácido para PSGL-Ig (ver, Pa-tente dos Estados Unidos No. 5.827.817), GPIb-Ig (ver, WO 02/063003),GPIIbIIIa-Ig, IL-13R-lg (ver, Patente dos Estados Unidos No. 6.268.480),TNFR-Ig (ver, WO 04/008100), IL-21 R-Ig, CTLA4-lg e VCAM2D-lgG, e queretêm sua capacidade de ligar seus respectivos ligantes.

A formulação pode conter mais do que uma proteína conformenecessário para o tratamento, ou diagnose de uma doença ou enfermidadeparticular. Proteína(s) adicional(is) são escolhidas porque elas têm ativida-des complementares para a(s) outra(s) proteína(s) na formulação, e não afe-tam adversamente a(s) outra(s) proteína(s) na formulação. Em adição, aformulação de proteína pode também conter substâncias de não-proteínaque são de uso na última utilidade da formulação de proteína. Por exemplo,sacarose pode ser adicionada para aumentar estabilidade e solubilidade daproteína na solução; e histidina pode ser adicionada para proporcionar capa-cidade de tampão apropriada.

Em certas concretizações, a proteína a ser formulada é essenci-almente pura e/ou essencialmente homogênea (isto é, substancialmente li-vre de proteínas contaminantes, etc). O termo proteína "essencialmente pu-ra" significa uma composição compreendendo pelo menos cerca de 90% porpeso da fração de proteína, preferivelmente pelo menos cerca de 95% porpeso da fração de proteína. O termo proteína "essencialmente homogênea"significa uma composição compreendendo pelo menos cerca de 99% porpeso da fração de proteína, excluindo a massa de vários estabilizantes eágua em solução.

As proteínas a serem formuladas podem também serem conju-gadas com uma citotoxina, um agente terapêutico, ou um íon de metal ra-dioativo. Em uma concretização, a proteína que é conjugada é um anticorpoou fragmento deste. Uma citotoxina ou um agente citotóxico inclui qualqueragente que é prejudicial às células. Exemplos não-limitativos incluem cali-cheamicina, taxol, citochalasin B, gramicidina D, brometo de etidium, emeti-na, mitomicina, etoposídeo, tenoposídeo, vincristina, vinblastina, colchicina,doxorubicina, daunorubicina, dihidróxi anthracina diona, mitoxantrona, mi-tramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticóides, procaina,tetracaina, lidocaina, propranolol, puromicina, e análogos, ou homólogosdestes. Agentes terapêuticos incluem, mas não estão limitados a, antimeta-bólitos (por exemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabi-na, e 5-fluorouracil decarbazina), agentes de alquilação (por exemplo, me-cloretamina, tioepa clorambucil, melfalan, carmustina (BSNU) e Iomustina(CCNU), ciclotosdamídeo, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mito-micina C, e cis-diclorodiamina platina (II) (DDP)1 cisplatina), antraciclinas(por exemplo, daunorubicina e doxorubicina), antibióticos (por exemplo, dac-tinomicina, bleomicina, mitramicina, e antramicina), e agentes anti-mitóticos(por exemplo, vincristina e vinblastina). Técnicas para conjugação de taisporções para proteínas são bem conhecidas na técnica.

Formulações

A composição de uma formulação é determinada pela conside-ração de vários fatores incluindo, mas não limitados a: a natureza da(s) pro-teína^) (por exemplo, receptor, anticorpo, proteínas de fusão Ig, enzima,etc.y, a concentração da proteína; a faixa de pH desejada; como a formula-ção de proteína é para ser armazenada; o período que a formulação de pro-teína é para ser armazenada; e se e como a formulação de proteína é paraser administrada a um paciente.

Concentração da Proteína na FormulaçãoA concentração da proteína na formulação é dependente do úl-timo uso da formulação de proteína. As concentrações de proteína nas for-mulações aqui descritas estão geralmente entre cerca de 0,5 mg/ml e cercade 300 mg/ml, por exemplo, entre cerca de 0,5 mg/ml e cerca de 25 mg/ml,entre cerca de 5 mg/ml e cerca de 25 mg/ml, entre cerca de 10 mg/ml e cer-ca de 100 mg/ml, entre cerca de 25 mg/ml e cerca de 100 mg/ml, entre cercade 50 mg/ml e cerca de 100 mg/ml, entre cerca de 75 mg/ml e cerca de 100mg/ml, entre cerca de 100 mg/ml e cerca de 200 mg/ml, entre cerca de 125mg/ml e cerca de 200 mg/ml, entre cerca de 150 mg/ml e cerca de 200mg/ml, entre cerca de 200 mg/ml e cerca de 300 mg/ml, e entre cerca de 250mg/ml e cerca de 300 mg/ml.

As formulações de proteína podem ser usadas para propostasterapêuticas. Conseqüentemente, a concentração da proteína em uma for-mulação é determinada baseada na provisão da proteína em uma dosagem_ e volume que é tolerado pelo e de valor terapêutico ao paciente. Se a formu-lação de proteína é para ser administrada por pequena injeção de volume, aconcentração de proteína será dependente do volume de injeção (usualmen-te 1,0-1,2 ml_). As terapias baseadas em proteína requerem usualmente vá-rios mg/kg de dosagem por semana, por mês, ou por vários meses. Conse-qüentemente, se uma proteína é para ser provida em 2-3 mg/kg de pesocorpóreo do paciente, e pesos médios de paciente de 75 kg, 150-225 mg daproteína necessitarão ser distribuídos em um volume de injeção de 1,0-1,2mL, ou o volume necessitará ser aumentado para acomodar uma concentra-ção de proteína inferior.

Tampões

O termo "tampão", conforme aqui usado, inclui aqueles agentesque mantêm o pH da solução em uma faixa desejada. O pH de uma formu-lação conforme descrita aqui é geralmente entre cerca de pH 5,0 a cerca de9,0, por exemplo, cerca de pH 5,5 a cerca de 6,5, cerca de pH 5,5 a cerca de6,0, cerca de pH 6,0 a cerca de 6,5, pH 5,5, pH 6,0, ou pH 6,5. Em geral, umtampão que pode manter uma solução em pH 5,5 a 6.5 é usado. Exemplosnão-limitativos de tampões que podem ser usados em uma formulação aquidescrita incluem histidina, succinato, gluconato, tris (trometamol), Bis-Tris,MOPS, ACES, BES, TES, HEPES, EPPS, etilenodiamina, ácido fosfórico,ácido maléico, fosfato, citrato, 2-ácido morfolinoetanossulfônico (MES), fos-fato de sódio, acetato de sódio, e cacodilato. A histidina é um tampão que épreferido em formulações que são para serem administradas por injeção in-tramuscular ou peritoneal. A concentração do tampão é entre cerca de 5 mMe 30 mM. Em uma concretização, o tampão de uma formulação é histidina auma concentração de cerca de 5 mM a cerca de 20 mM.

Excipientes

Em adição à proteína, metionina, e tampão, uma formulaçãoconforme aqui descrita pode também conter outras substâncias. Estas subs-tâncias incluem, mas não estão limitadas a, crioprotetores, lioprotetores, ten-soativos, agentes de massa, antioxidantes, e agentes de estabilização. Emuma concretização, uma formulação de proteína aqui descrita inclui um exci-piente selecionado a partir do grupo consistindo em a crioprotetor, um Iiopro-tetor, um tensoativo, um agente de massa, um antioxidante, um agente deestabilização, e combinações destes.

o termo "crioprotetor", conforme aqui usado, inclui agentes queproporcionam estabilidade à proteína contra tensões induzidas por congela-5 mento, por serem preferencialmente excluídos da superfície da proteína.Crioprotetores podem também oferecer proteção durante secagem primáriae secundária, e armazenamento de produto de longo prazo. Exemplos não-limitativos de crioprotetores incluem açúcares, tais como sacarose, glicose,trehalose, manitol, manose, e lactose; polímeros, tais como dextran, hidroxi-etil amido e polietileno glicol; tensoativos, tais como polissorbatos (por e-xemplo, PS-20 ou PS-80); e aminoácidos, tais como glicina, arginina, Ieuci-na, e serina. Um crioprotetor que exibe baixa toxicidade em sistemas bioló-gicos é geralmente usado. O crioprotetor, se incluído na formulação, é adi-cionado a uma concentração final de entre cerca de 1% e cerca de 10% (pe-so/volume). Em uma concretização, o crioprotetor é sacarose a uma concen-tração de entre cerca de 0,5% e cerca de 10% (peso/volume).

Em uma concretização, um Iioprotetor é adicionado a uma for-mulação aqui descrita. O termo "lioprotetor", conforme aqui usado, inclui a-gentes que proporcionam estabilidade à proteína durante processos de se-cagem-congelamento ou desidratação (ciclos de secagem-congelamentoprimários e secundários), pela provisão de uma matriz de vidro amorfa, e porligação com a proteína através da ligação de hidrogênio, substituição dasmoléculas de água que são removidas durante processo de secagem. Istoajuda a manter a conformação da proteína, minimiza a degradação da prote-ína durante o ciclo de liofilização, e aperfeiçoa a estabilidade de produto delongo prazo. Exemplos não-limitativos de Iioprotetores incluem açúcares, taiscomo sacarose ou trehalose; um aminoácido, tal como monossódio glutama-to, glicina não-cristalina ou histidina; uma metilamina, tal como betaína; umsal liotrópico, tal como sulfato de magnésio; um poliol, tais como álcoois tri-hídricos ou de açúcar mais altos, por exemplo, glicerina, eritritol, glicerol,arabitol, xilitol, sorbitol, e manitol; propileno glicol; polietileno glicol; plurôni-cos; e combinações destes. A quantidade- de lioprotetor adicionada a umaformulação é geralmente uma quantidade que não conduz a uma quantidadeinaceitável de degradação/agregação da proteína quando a formulação deproteína é liofilizada. Onde o Iioprotetor é um açúcar (tal como sacarose outrehalose), e a proteína é um anticorpo, exemplos não-limitativos de concen-trações de Iioprotetor na formulação de proteína são de cerca de 10 mM acerca de 400 mM, e, preferivelmente, de cerca de 30 mM a cerca de 300mM, e, mais preferivelmente, de cerca de 50 mM a cerca de 100 mM.

Em certas concretizações, um tensoativo pode ser incluído naformulação. O termo "tensoativo", conforme aqui usado, inclui agentes quereduzem a tensão superficial de um líquido por adsorção na interface ar-líquido. Exemplos de tensoativos incluem, sem limitação, tensoativos não-iônicos, tais como polissorbatos (por exemplo, polissorbato 80 ou polissorba-to 20); poloxâmeros {por exemplo, poloxâmero 188); Triton™; dodecil sulfatode sódio (SDS); Iauril sulfato de sódio; octil glicosídeo de sódio; Iauril-sulfobetaína, miristil-sulfobetaína, linoleil-sulfobetaína, estearil-sulfobetaína,lauril-sarcosina, miristil-sarcosina, linoleil-sarcosina, estearil-sarcosina, Iino-leil-betaína, miristil- betaína, cetil-betaína, lauroamidopropil-betaína, cocami-dopropil-betaína, linoleamidopropil-betaína, miristamidopropil-betaína, palmi-dopropil-betaína, isostearamidopropil-betaína (por exemplo, Iauroamidopro-pil), miristarnidopropil-, palmidopropil-, ou isostearamidopropil-dimetilamina;metil cocoil de sódio ou metil ofeil-taurato dissódio; e a série Monaquat™(Mona Industries, Inc., Paterson, N.J.), polietil glicol, polipropil glicol, e copo-límeros de etileno e propileno glicol (por exemplo, plurônicos, PF68). A quan-tidade de tensoativo adicionada é tal que ela mantém agregação da proteínareconstituída em um nível aceitável conforme ensaiado usando-se, por e-xemplo, SEC-HPLC para determinar a percentagem de espécies de HMWou espécies de LMW, e minimiza a formação de particulados após reconsti-tuição de um Iiofilato de uma formulação de proteína aqui descrita. Por e-xemplo, o tensoativo pode estar presente em uma formulação (líquida, ouantes da reconstituição de um liofilato) em uma quantidade de cerca de0,001 a cerca de 0,5%, por exemplo, de cerca de 0,05 a cerca de 0,3%.

Em algumas concretizações, um agente de massa é incluído naformulação. O termo "agente de massa", conforme aqui usado, inclui agen-tes que proporcionam a estrutura do produto congelado-seco sem interagirdiretamente com o produto farmacêutico. Em adição a provisão de umamassa farmaceuticamente fina, agentes de massa podem também concederqualidades úteis em relação a modificação da temperatura de colapso, pro-porcionando proteção de congelamento-descongelamento, e aumentando aestabilidade da proteína sobre armazenamento de longo prazo. Exemplosnão-limitativos de agentes de massa incluem manitol, glicina, lactose, e sa-carose. Agentes de massa podem ser cristalinos (tais como glicina, manitol,ou cloreto de sódio), ou amorfos (tais como dextran, hidroxietil amido), e sãogeralmente usados nas formulações de proteína em uma quantidade de0,5% a 10%.

Outros transportadores farmaceuticamente aceitáveis, excipien-tes, ou estabilizadores, tais como aqueles descritos em Remington1S Phar-maceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980), podem também seremincluídos em uma formulação de proteína aqui descrita, provido que eles nãoafetem adversamente as características desejadas da formulação. Conformeaqui usado, "transportador farmaceuticamente aceitável" significa quaisquere todos os solventes, meio de dispersão, revestimentos, agentes antibacteri-al e antifungal, agentes isotônicos e de retardo de absorção, compatíveiscom administração farmacêutica. O uso de tais meios e agentes para subs-tâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecido na técnica. Transporta-dores aceitáveis, excipientes, ou estabilizadores são não-tóxicos a recipien-tes nas dosagens e concentrações empregadas e incluem: agentes de tam-ponamento adicionais; conservantes; co-solventes; antioxidantes, incluindoácido ascórbico e metionina; agentes de quelatação, tal como EDTA; com-plexos de metal (por exemplo, complexos de Zn-proteína); polímeros biode-gradáveis, tais como poliésteres; contra-íons de formação de sal, tais comosódio, álcoois de açúcar polihídricos; aminoácidos, tais como alanina, glicina,glutamina, asparagina, histidina, arginina, lisina, ornitina, leucina, 2-fenilalanina, ácido glutâmico, e treonina; açúcares orgânicos ou álcoois deaçúcar, tais como lactitol, estachilose, manose, sorbose, xilose, ribose, ribi-tol, mioinisitose, mioinisitol, galactose, galactitol, glicerol, ciclitóis (por exem-plo, inositol), polietileno glicol; reagentes de redução contendo enxofre, taiscomo uréia, glutationa, ácido tioctico, tioglicolato de sódio, tioglicerol, a-monotioglicerol, e tiossulfato de sódio; proteínas de baixo peso molecular,tais como albumina de soro humano, albumina de soro bovino, gelatina, ououtras imunoglobulinas; e polímeros hidrofílicos, tal como polivinilpirrolidona.

Métodos de Armazenamento

A formulação de proteína aqui descrita pode ser armazenadapor qualquer método conhecido a um técnico no assunto. Exemplos não-Iimitativos incluem congelamento, liofilização, e secagem por atomização daformulação de proteína.

Em alguns casos, as formulações de proteína são congeladaspara armazenamento. Conseqüentemente, é desejável que a formulaçãoseja relativamente estável sob tais condições, incluindo sob ciclos de conge-lamento-descongelamento. Um método de determinar a adequabilidade deuma formulação é submeter uma formulação de amostra a pelo menos dois,por exemplo, três a dez ciclos de congelamento (a, por exemplo, -20°C ou -80°C), e descongelamento (por exemplo, por descongelamento rápido àtemperatura ambiente, ou descongelamento lento em gelo), determinando aquantidade de espécies de baixo peso molecular (LMW) e/ou espécies dealto peso molecular que se acumulam após os ciclos de congelamento-descongelamento, e comparando-a à quantidade de espécies de baixo pelomolecular ou espécies de alto peso molecular na amostra antes do procedi-mento de congelamento-descongelamento. Um aumento nas espécies debaixo peso molecular ou alto peso molecular indica estabilidade diminuídade uma proteína armazenada como parte da formulação. Cromatografia lí-quida de alto desempenho de exclusão de tamanho (SEC-HPLC) pode serusada para determinar a presença de espécies de baixo peso molecular ealto peso molecular.

Em alguns casos, as formulações de proteína podem ser arma-zenadas como um líquido. Conseqüentemente, é desejável que a formula-ção líquida seja relativamente estável sob tais condições, incluindo em vá-rias temperaturas. Um método de determinar a adequabilidade de uma for-mulação é armazenar a formulação de amostra em várias temperaturas (taiscomo 2-8, 15, 20, 25, 30, 35, 40, e 50°C), e monitorar a quantidade de espé-cies de alto peso molecular e/ou baixo peso molecular que se acumula como tempo. Quanto menor as quantidades de espécies de alto peso moleculare/ou baixo peso molecular que se acumulam com o tempo, melhor a condi-ção de armazenamento para a formulação. Adicionalmente, o perfil de cargada proteína pode ser monitorado por cromatografia líquida de alto desempe-nho de troca de cátion (CEX-HPLC).

Alternativamente, formulações podem ser armazenadas após Ii-ofilização. O termo "liofilização", conforme aqui usado, se refere a um pro-cesso pelo qual o material a ser secado é primeiro congelado, seguido porremoção do gelo ou solvente congelado por sublimação em um ambiente devácuo. Um excipiente (por exemplo, lioprotetor) pode ser incluído em formu-lações que são para serem Iiofilizadas de modo a aumentar a estabilidadedo produto Iiofilizado após armazenamento. O termo "formulação reconstitu-ída", conforme aqui usado, se refere a uma formulação que foi preparadapor dissolução de uma formulação de proteína Iiofilizada em um diluente, talque a proteína é dispersa no diluente. O termo "diluente", conforme aqui u-sado, é uma substância que é farmaceuticamente aceitável (segura e não-tóxica para administração a um humano), e é útil para a preparação de umaformulação líquida, tal como uma formulação reconstituída após liofilização.Exemplos não-limitativos de diluentes incluem água estéril, água bacterioes-tática para injeção (BWFI), uma solução tamponada de pH (por exemplo,salina tamponada com fosfato), solução salina estéril, solução de Ringer,solução de dextrose, ou soluções aquosas de sais e/ou tampões.

O teste de uma formulação para a estabilidade do componentede proteína da formulação após liofilização é útil para determinar a adequa-bilidade de uma formulação. O método é similar àquele acima descrito paracongelamento, exceto que a formulação de amostra é Iiofilizada ao invés decongelada, reconstituída usando-se um diluente, e a formulação reconstituí-da é testada para a presença de espécies de baixo peso molecular LMWe/ou espécies de alto peso molecular. Um aumento nas espécies de LMWou HMW na amostra Iiofilizada comparado a uma formulação de amostracorrespondente que não foi Iiofilizada indica estabilidade diminuída na amos-tra liofilizada.

Em alguns casos, uma formulação é secada por atomização e,em seguida, armazenada. Para secagem por atomização, uma formulaçãolíquida é aerossolizada na presença de uma corrente de gás seco. A água éremovida das gotículas da formulação na corrente de gás, resultando empartículas secas da formulação de fármaco. Excipientes podem ser incluídosna formulação para (i) proteger a proteína durante a desidratação de seca-gem por atomização, (ii) proteger a proteína durante armazenamento apóssecagem por atomização, e/ou (iii) dar a solução propriedades adequadaspara aerossolização. O método é similar àquele acima descrito para conge-lamento, exceto que a formulação de amostra é secada por atomização aoinvés de congelada, reconstituída em um diluente, e a formulação reconstitu-ída é testada para a presença de espécies de LMW e/ou espécies de HMW.Um aumento nas espécies de LMW ou HMW na amostra secada por atomi-zação comparada a uma formulação de amostra correspondente que não foiliofilizada indica estabilidade diminuída na amostra secada por atomização.

Métodos de Tratamento

As formulações aqui descritas são úteis como composições far-macêuticas no tratamento e/ou prevenção de uma doença ou enfermidadeem um paciente em necessidade deste. O termo "tratamento" se refere aambos tratamento terapêutico e profilático, ou medidas preventivas. Trata-mento inclui a aplicação ou administração da formulação de proteína ao cor-po, a um tecido isolado, ou a uma célula de um paciente que tem uma doen-ça/enfermidade, um sintoma de uma doença/enfermidade, ou uma predispo-sição a doença/enfermidade, com a proposta de cura, cicatrização, alívio,socorro, alteração, remediação, melhora, restabelecimento, ou influência dadoença, o sintoma da doença, ou a predisposição a doença. Aqueles "emnecessidade de tratamento" incluem aqueles já com a enfermidade, bemcomo aqueles em que a enfermidade é para ser prevenida. O termo "enfer-midade" é qualquer condição que se beneficiaria de tratamento com a formu-lação de proteína aqui descrita. Isto inclui enfermidades ou doenças crônicasou agudas, incluindo aquelas condições patológicas que predispõem o ma-mífero à enfermidade em questão. Exemplos não limitativos de enfermida-des a serem tratadas aqui incluem enfermidades de hemorragia, trombose,leucemia, linfoma, Iinfoma de não-Hodgkin, enfermidades auto-imunes, en-fermidades de coagulação, hemofilia, rejeição de enxerto, enfermidades in-flamatórias, doença do coração, enfermidades de debilitação do músculo,alergias, cânceres, distrofia muscular, sarcopenia, caquexia, diabetes Tipo II,artrite reumatóide, doença de Crohn, psoríase, artrite psoriática, asma, der-matite, rinite alérgica, doença pulmonar obstrutiva crônica, eosinofilia, fibro-se, e produção de muco em excesso.

Administração

As formulações de proteína aqui descritas podem ser adminis-tradas a um indivíduo em necessidade de tratamento usando-se métodosconhecidos na técnica, tais como pílula simples ou múltiplas, ou infusão so-bre um longo período de tempo em uma maneira adequada, por exemplo,injeção ou infusão por rotas subcutânea, intravenosa, intraperitoneal, intra-muscular, intra-arterial, intralesional ou intra-articular, administração tópica,transmucosal, transdermal, retal, inalação, ou por meios de liberação susten-tada ou estendida. Se a formulação de proteína foi liofilizada, o material Iiofi-lizado é primeiro reconstituído em um líquido apropriado antes da adminis-tração. O material Iiofilizado pode ser reconstituído em, por exemplo, águabacteriostática para injeção (BWFI), salina fisiológica, salina tamponada defosfato (PBS), ou na mesma formulação de proteína antes da liofilização.

Composições parenterais podem ser preparadas em forma uni-tária de dosagem para facilidade de administração e uniformidade de dosa-gem. "Forma unitária de dosagem", conforme aqui usado, se refere a unida-des fisicamente distintas adequadas como dosagens unitárias para o indiví-duo a ser tratado; cada unidade contendo uma quantidade predeterminadade composto ativo calculada para produzir o efeito terapêutico desejado emassociação com~o transportador farmacêutico selecionado.No caso de um método de inalação, tal como inalador de dosemedida, o dispositivo é designado para distribuir uma quantidade apropriadada formulação. Para administração por inalação, os compostos são distribuí-dos na forma de um spray de aerosol de um recipiente pressurizado, ou dis-pensador que contém um propelente adequado, por exemplo, um gás, talcomo dióxido de carbono, ou um nebulizador. Alternativamente, uma formade dosagem inalada pode ser provida como um pó seco usando um inaladorde pó seco.

A formulação de proteína pode também ser retida em microcáp-sulas preparadas, por exemplo, por técnicas de coacervação, ou por polime-rização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou microcápsulas degelatina e microcápsulas de poli-(metilmetacilato), respectivamente, em sis-temas de distribuição de fármaco coloidal (por exemplo, lipossomas, micro-esferas de albumina, microemulsões, nano-partículas, e nanocápsulas), ouem macroemulsões. Tais técnicas são reveladas em Remington1S Pharma-ceutical Sciences 18th edition.

Preparações de liberação sustentada das formulações de prote-ína aqui descritas podem também ser preparadas. Exemplos adequados depreparações de liberação sustentada incluem matrizes semipermeáveis depolímeros hidrofóbicos sólidos contendo a formulação de proteína. Exemplosde matrizes de liberação sustentada incluem poliésteres, hidrogéis (por e-xemplo, poli(2-hidroxietil-metacrilato), ou poli(vinilálcool)), polilactídeos, co-polímeros de L-ácido glutâmico e γ-etil-L-glutamato, etileno-vinil acetato não-degradável, copolímeros de ácido láctico-glicólico degradáveis, e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. As formulações de liberação sustentada das proteínasaqui descritas podem ser desenvolvidas usando-se polímero de ácido poli-láctico-coglicólico (PLGA) devido a sua biocompatibilidade e ampla faixa depropriedades biodegradáveis. Os produtos de degradação de PLGA, ácidosláctico e glicólico, podem ser rapidamente despejados dentro do corpo hu-mano. Além disso, a degradabilidade deste polímero pode ser ajustada demeses a anos, dependendo de seu peso molecular e composição. Composi-~ ções Iipossomais podem também serem usadas para formular as proteínasou anticorpos aqui revelados.

Dosagem

A toxicidade e eficiência terapêutica de uma formulação podemser determinadas por procedimentos farmacêuticos conhecidos na técnicausando-se, por exemplo, culturas de célula ou animais experimentais, porexemplo, para determinar a LD50 (a dose letal para 50% da população) e aED50 (a dose terapeuticamente efetiva em 50% da população). A razão dedose entre efeitos tóxicos e terapêuticos é o índice terapêutico, e pode serexpresso como a razão LD50ZED50.

Os dados obtidos a partir dos ensaios de cultura de célula e es-tudos de animais podem ser usados na formulação de uma faixa de dosa-gem para uso em seres humanos. A dosagem de tais formulações geralmen-te está dentro de uma faixa de concentrações de circulação que inclui a ED50com pouca ou nenhuma toxicidade. A dosagem pode variar dentro destafaixa, dependendo da forma de dosagem empregada e da via de administra-ção utilizada. Para qualquer formulação usada no método da invenção, adose terapeuticamente efetiva pode ser estimada inicialmente de ensaios decultura de célula. Uma dose pode ser formulada em modelos de animal paraalcançar uma faixa de concentração de plasma de circulação que inclui aIC50 (isto é., a concentração do composto de teste que alcança uma inibiçãomeio-máxima de sintomas), conforme determinado na cultura de célula. Talinformação pode ser usada para determinar mais precisamente doses úteisem seres humanos. Os níveis no plasma podem ser medidos, por exemplo,por cromatografia líquida de alto desempenho.

A dosagem apropriada da proteína da formulação dependerá dotipo de doença a ser tratada, da severidade e do curso da doença, se o a-gente é administrado para proposta preventiva ou terapêutica, da terapiaprévia, da história clínica do paciente, e da resposta ao agente, e da discri-ção do médico atendente. Uma formulação é geralmente distribuída tal que adosagem é entre cerca de 0,1 mg de proteína/kg de peso corpóreo a 1000mg de proteína/kg de peso corpóreo.

De modo que as formulações sejam usadas para administraçãoin vivo, elas devem ser estéreis. A formulação pode ser tornada estéril porfiltração através de membranas de íiltração estéreis, antes de, ou em segui-da a formulação de um líquido ou liofilização e reconstituição. As composi-ções terapêuticas aqui descritas são geralmente colocadas em um recipientetendo um orifício de acesso estéril, por exemplo, um saco de inalação intra-venosa, ou frasco tendo um obturador perfurável por uma agulha de injeçãohipodérmica.

Artigos de Fabricação

Em outra concretização, um artigo de fabricação é provido, quecontém uma formulação aqui descrita e, preferivelmente, proporciona instru-ções para seu uso. O artigo de fabricação compreende um recipiente ade-quado para contenção da formulação. Recipientes adequados incluem, semlimitação, garrafas, frascos (por exemplo, frascos de câmara dupla), seringas(por exemplo, seringas de câmara simples ou dupla), tubos de teste, nebuli-zadores, inaladores (por exemplo, inaladores de dose medida ou inaladoresde pó seco), ou depósitos. O recipiente pode ser formado de uma variedadede materiais, tais como vidro, metal ou plástico (por exemplo, policarbonato,poliestireno, polipropileno). O recipiente que contém a formulação e o rótuloem ou associado com o recipiente pode indicar direções para reconstituiçãoe/ou uso. O rótulo pode adicionalmente indicar que a formulação é útil oupretendida para administração subcutânea. O recipiente que retém a formu-lação pode ser um frasco multi-uso, que permite administrações repetidas(por exemplo, de 2-6 administrações) da formulação. O artigo de fabricaçãopode compreender adicionalmente um segundo recipiente compreendendoum diluente adequado (por exemplo, WFI, 0,9% de NaCI, BWFI, sílica tam-ponada com fosfato). Quando o artigo de fabricação compreende uma ver-são Iiofilizada de uma formulação de proteína, a mistura de um diluente coma formulação Iiofilizada proporcionará uma concentração de proteína final naformulação reconstituída de geralmente pelo menos 20 mg/ml. O artigo defabricação pode adicionalmente incluir outros materiais desejáveis de umponto de vista comercial e do usuário, incluindo outros tampões, diluentes,filtros, agulhas, seringas, e insertos de acondicionamento com instruçõespara uso.

Todos os artigos de jornal, patentes, pedidos de patente, e ou-tras publicações referenciadas neste pedido são incorporados por referênciaem sua totalidade. Se existe qualquer conflito entre os conteúdos do presen-te pedido e qualquer do material incorporado por referência, é para ser com-preendido que este pedido restringe.

A invenção será mais completamente compreendida por refe-rência aos exemplos seguintes. Eles não devem, contudo, serem construí-dos como limitando o escopo da invenção.

EXEMPLOS

Exemplo 1

Efeito da Metionina na Agregação de proteína em uma Formula-ção de Anticorpo anti- B7.2 Submetida a Armazenamento em Temperatura

Elevada

Este exemplo ilustra a capacidade da metionina reduzir agrega-ção de uma proteína em uma formulação de proteína. Especificamente, osexperimentos descritos abaixo foram direcionados no teste dos efeitos demetionina na agregação de anticorpos anti-B7.2 (IgG2, κ cadeia leve, ver,Fig. 9) em uma formulação de anticorpo anti-B7.2 submetida a armazena-mento a 40°C. B7.2 é um Iigante co-estimulatório que é expresso em célulasB, que pode interagir nas moléculas de superfície de célula T, CD28 e CTLA- 4.

O efeito de adicionar metionina na agregação de anticorpo anti-B7.2 formulado como um líquido em vários níveis de pH foi examinado sobreum período de 12 semanas durante o qual a formulação foi armazenada a40°C. O anticorpo anti-B7.2 foi formulado em 1 mg/ml em vários níveis de pHna presença e ausência de 10 mM de metionina e 0,01% de polissorbato-80.Os níveis de agregação foram medidos inicialmente, na semana 6, e na se-mana 12, pela medição da percentagem de espécies de alto peso molecular(% HMW) nas formulações nestes pontos de tempo por SEC-HPLC. Umaumento na % HMW é indicativo de agregação.

Os níveis iniciais de %HMW de cada formulação foram aproxi-madamente o mesmo (-1-2% ver, Fig. 1a). Após 6 e 12 semanas de arma-zenamento a 40°C, contudo, a %HMW aumentou em formulações carecendode metionina, especialmente nas amostras contendo polissorbato-80, e ca-recendo de metionina, e formulada em níveis de pH variando de 6,0 a 6,6(ver, Figuras 1b e 1c). A presença de metionina na formulação mantém a%HMW perto dos níveis iniciais em amostras sem polissorbato-80. Emboraexista um aumento na agregação de proteína em amostras contendo ambospolissorbato-80 e metionina, comparado com amostras contendo metionina,mas carecendo de polissorbato-80, os níveis de agregação de proteína fo-ram significantemente mais baixos do que nas amostras contendo polissor-bato-80, mas carecendo de metionina (ver, Figuras 1b e 1c).

Em suma, estes experimentos mostram que a metionina reduza agregação de anticorpo anti-B7.2 em uma formulação submetida a tempe-raturas elevadas ambos na presença e ausência de polissorbato-80.

Exemplo 2

Efeito da Metionina na Agregação de proteína em uma Formula-ção de Anticorpo anti- B7.1 Submetida a Temperatura Elevada

Este exemplo adicionalmente ilustra a capacidade da metioninareduzir a agregação de uma proteína em uma formulação de proteína. Osexperimentos descritos abaixo foram dirigidos no teste dos efeitos de metio-nina na agregação de anticorpos anti-B7.1 (IgG2, κ cadeia leve, ver, Fig. 8)em uma formulação de anticorpo anti-B7.1 submetida a armazenamento a40°C. B7.1 é um Iigante co-estimulatório que é expresso nas células B, quepode interagir com as moléculas de superfície de célula T, CD28 e CTLA-4.

O efeito de adicionar metionina na agregação de anticorpo anti-B7.1 formulado como um líquido em vários níveis de pH foi examinado sobreum período de 12 semanas durante o qual as amostras foram armazenadasa 40°C. O anticorpo anti-B7.1 foi formulado em 1 mg/ml em vários níveis depH na presença e ausência de 10 mM de metionina e 0,01% de polissorbato-80. Os níveis de agregação foram medidos inicialmente, e na semana 12,pela medição da percentagem de espécies de alto peso molecular (% HMW)nas formulações nestes pontos de tempo por SEC-HPLC.Os níveis iniciais de %HMW de cada formulação foram aproxi-madamente o mesmo (-1% ver, Fig. 2a). O armazenamento da formulaçãode anticorpo anti-B7.1 por 12 semanas a 40°C na presença de polissorbato-80 e carecendo de metionina, resultou em um menor aumento na %HMW nafaixa de pH de 4,7-6,3 em tampões de citrato e succinato (ver, Fig. 2b). Umaumento mais significante na %HMW resultou na faixa de pH de 6-6,6 emtampão histidina (ver, Fig. 2b). A adição de metionina às formulações de pro-teína diminuiu os níveis de %HMW. Isto foi mais claramente visto no caso deanticorpo anti-B7.1 formulado em tampão histidina e polissorbato-80; a meti- onina mantém os níveis de %HMW a um mínimo de 1,2% após 12 semanasa 40°C.

Em resumo, estes experimentos mostram que a metionina reduza agregação de anticorpo anti-B7.1 em uma formulação armazenada a 40°C,ambos na presença e ausência de polissorbato-80.

Exemplo 3

Efeito de Metionina na Agregação de proteína em uma Formula-ção de Anticorpo anti-CD22 Submetida a Armazenamento de Longo Prazo

Este experimento foi dirigido para testar o efeito de adicionarmetionina na agregação de proteína em uma formulação de anticorpo anti-CD22 (ver, Fig. 10). CD22 é uma sialoglicoproteína restrita de 135 kD decélula B que se liga a oligossacarídeos contendo 2-6-resíduos de ácido siáli-co ligados, e é expresa na superfície de células B durante estágios posterio-res de diferenciação. Ela parece desempenhar um papel na ativação de cé-lula B e agir como uma molécula de adesão. CD22 e anti-CD22 são conside-rados úteis no tratamento de leucemia, linfoma, Iinfoma de não-Hodgkin, ecertas condições auto-imunes.

25-26 mg/ml de anti-CD22 (IgG4, κ cadeia leve) foi formuladocomo um líquido em 10 mM de tampão dé succinato, pH 6. Estas formula-ções também contêm ou um ou ambos de 10 mM de metionina e 0,01% depolissorbato-80. As formulações anti-CD22 resultantes foram armazenadas a25°C ou -80°C por entre 1 mês a 36 meses, e os níveis de %HMW nas for-mulações foram avaliados por SEC-HPLC.Os níveis de %HMW de todas as formulações armazenadas a -80°C foram aproximadamente o mesmo (-0.5%) (ver, Fig. 3a). Em contraste,o armazenamento com o tempo a 25°C resultou em um aumento mos níveisde %HMW (ver, Fig. 3b). Este aumento foi substancialmente diminuído semetionina estava presente na formulação. De nota, formulações de anti-CD22 formuladas com polissorbato-80 e metionina geraram aproximada-mente as mesmas % de espécies de alto peso molecular (HMW) como a-mostras formuladas com metionina, mas carecendo de polissorbato-80.

Estes dados indicam que a metionina diminui a agregação deproteína de uma formulação de anticorpo anti-CD22 em armazenamento delongo prazo, ambos na presença ou ausência de polissorbato-80.

Exemplo 4

Efeito de Metionina na Agregação de proteína em uma Formula-ção de PSGL-Iq Submetida a Armazenamento em Altas Temperaturas

Este exemplo proporciona outra ilustração da capacidade da me-tionina impedir agregação em proteínas e, particularmente, em proteínas defusão. Este experimento foi dirigido a testar o efeito de adicionar metioninana agregação de proteína em uma formulação de proteína de fusão de P-selectin glicoproteína ligante-1-imunoglobulina (PSGL-lg). PSGL-1 é um ho-modímero de 240 kDa consistindo em duas cadeias de polipeptídeo de120kDa, que é constitutivamente expresso em todos os leucócitos. PSGL-1é principalmente encontrado nas pontas do microvilli. PSGL-1 pode se ligara P-selectin no endotélio quando decorado com açúcares apropriados.

Os efeitos da metionina na agregação de proteína de fusão deP-selectin glicoproteína Iigante-Ig (PSGL-Ig) foram examinados em váriastemperaturas. PSGL-Ig foi formulado como uma formulação líquida em 10mM de Tris, 150 mM de NaCI, 0,005% de polissorbato-80, pH 7,5 na presen-ça e ausência de 10 mM de metionina. As amostras foram armazenadas a -80°C, 25°C, e 40°C, e foram avaliadas para % de HMW sobre um período de4 semanas por SEC-HPLC.

Os níveis iniciais de %HMW em todas as amostras foram simila-res e permaneceram não mudados nas amostras armazenadas a -80°C, in-diferente da presença ou ausência de metionina (ver, Fig. 4). O armazena-mento a 25°C e 40°C resulta em agregação aumentada com o tempo; con-tudo, esta agregação foi reduzida em amostras formuladas com metionina.

Exemplo 5

Efeito de Metionina na Agregação de proteína em uma Formula-ção de PSGL-Iq Submetida a Tensão de cisalhamento

Este exemplo ilustra que a metionina reduz a agregação de pro-teínas submetidas a tensão de cisalhamento.

A proteína de fusão PSGL-Ig foi formulada como um líquido em10 mM de Tris, 150 mM de NaCI1 0,005% de polissorbato-80, pH 7,5, na pre-sença e ausência de 10 mM de metionina. As formulações resultantes foramou deixadas não-sacudidas ou submetidas a sacudimento a 250 rpm por 96horas.

As amostras não-sacudidas contendo ou carecendo de metioni-na tinham níveis de % HMW muito similares (0,6 e 0,7%) (ver, Fig. 5). Emcontraste, as amostras sacudidas carecendo de metionina continham %HMW elevada (4,2% e 4,4%). A adição de metionina às formulações queforam submetidas a sacudimento resultou em uma diminuição nos níveis de% HMW para 1,0 e 2,2%.

Estes dados mostram que a metionina reduz a agregação deproteínas submetidas a tensão de cisalhamento .

Exemplo 6

Efeito da Metionina na Agregação de proteína de uma Formula-ção de proteína REFACTO® Armazenada no Escuro

Este experimento proporciona ainda outro exemplo da capacida-de da metionina impedir agregação em proteínas e, particularmente, em pro-teínas recombinantes. Para ilustrar adicionalmente, REFACTO® (ver, Fig.11), uma proteína de fator Vlll recombinante que é usada para corrigir defici-ências de fator VIII, foi usada neste experimento.

Os efeitos da metionina na estabilidade de REFACTO® foramexaminados sobre um estudo de estabilidade de 1 mês. REFACTO® foi for-mulado como um líquido a cerca de 250 lU/ml em 20 mM de tampão de his-tidina. Algumas destas formulações também continham 10 mM de metioninae 10 mM de citrato. Todas as formulações continham 4 mM de cloreto decálcio e 310 mM de cloreto de sódio, e 0,02% de Tween-80. O pH das for-mulações foi 6,5. As amostras foram armazenadas no escuro à temperaturaambiente por aproximadamente 1 mês. As amostras de controle foram for-muladas conforme acima e armazenadas a -80°C. A formação de agregadofoi avaliada por SEC-HPLC.

Nas amostras de controle, indiferente da presença de metioninae citrato, os níveis de % HMW permaneceram os mesmos (ver, Tabela 1).

Em formulações de tampão de histidina sem metionina e citrato, % HMW foi26-27% após 1 mês de armazenamento no escuro, indicando um alto nívelde agregação. Em formulações de tampão de histidina contendo metionina ecitrato, contudo, a agregação foi reduzida sobre o mesmo período de tempo,com uma % HMW de somente 7-8%.

Tabela 1

<table>table see original document page 45</column></row><table>continuação

<table>table see original document page 46</column></row><table>

Exemplo 7

Efeito da Metionina na Agregação de proteína de uma Formula-ção de proteína REFACTO® Armazenada Sob Luz Fluorescente

Neste conjunto de experimentos, os efeitos de metionina nafragmentação de REFACTO® que foi exposto a luz fluorescente foram exa-minados sobre um período de 1 mês.

REFACTO® foi formulado como um líquido a cerca de 250 lU/mlem 20 mM de histidina, ou 20 mM de tampão de succinato. Algumas destasformulações também continham 10 mM de metionina e 10 mM de citrato.Todas as formulações continham 4 mM de cloreto de cálcio e 310 mM decloreto de sódio, e 0,02% de Tween-80. O pH das formulações foi 6,5. Asamostras foram armazenadas à temperatura ambiente por aproximadamente1 mês sob luz fluorescente, e formação de agregado foi avaliada por SEC-HPLC. As amostras de controle foram formuladas conforme acima e arma-zenadas a -80°C.

Nas amostras de controle, indiferente da presença de metioni-na e citrato, os níveis de % HMW permaneceram inalterados a 0% HMW(ver, Tabela 2). Nas formulações tamponadas de histidina de grau USP semmetionina e citrato, % HMW foi 21% após 1 mês de armazenamento sob luzfluorescente, indicando um alto nível de agregação. Nas formulações tam-ponadas de histidina de grau USP contendo metionina e citrato, contudo, aagregação foi reduzida sobre o mesmo período de tempo, com uma % HMWde somente cerca de 2%.

Similarmente, em formulações tamponadas de succinato care-cendo de metionina e citrato, a % HMW foi 25%, pelo que s formulaçõestamponadas de succinato contendo metionina e citrato tinham somente 9%HMW (ver, Tabela 3).

Desse modo, metionina e citrato diminuem a agregação de RE-FACTO® formulado em tampões de histidina ou succinato e armazenado sobluz fluorescente, comparada com REFACTO® formulado sem metionina ecitrato.

Tabela 2

<table>table see original document page 47</column></row><table>

Tabela 3

<table>table see original document page 47</column></row><table>

Exemplo 8

Efeito de Metionina na Potência de REFACTO®

Os efeitos de metionina na potência de REFACTO® que foi oumantido no escuro ou exposto a luz fluorescente foram examinados sobreum período de 1 mês. REFACTO® foi formulado como um líquido-a cerca de250 lU/ml em 20 mM de histidina ou 20 mM de tampão de succinato. Algu-mas destas formulações também contêm 10 mM de metionina e 10 mM decitrato. As amostras foram expostas a luz fluorescente ou condições de es-curo por 1 mês à temperatura ambiente.

REFACTO® sofreu uma grande perda de pertencia nas soluçõestamponadas formuladas sem metionina e citrato após 1 mês de armazena-mento à temperatura ambiente em quaisquer amostras expostas a luz fluo-rescente (ver, Fig. 6). O REFACTO® armazenado no escuro na presença demetionina não sofreu efeitos nocivos na potência, pelo que REFACTO® ar-mazenado sob luz fluorescente na presença de metionina sofreu algumaperda na potência, mas ainda reteve uma potência mais alta do que as a-mostras armazenadas sem metionina, que resultaram em perda completa depotência.

Exemplo 9

Oxidação Diminui a Multimerização de rhlL-11

Este experimento foi dirigido a teste do efeito de adição de meti-onina na multimerização IL-11.

Quatrocentos frascos foram enchidos com a mão a 0,1 mg/mlcom substância de fármaco humano recombinante IL-11 (rhlL-11) (1,0 mlcheio em um frasco de tubo de 5 ml) e Iiofilizados usando-se um ciclo deliofilização padrão para rhlL-11. Duzentos frascos continham rhlL-11 formu-lado com 10 mM de NaPO4, 300 mM de glicina, pH 7,0, e os restantes foramformulados com 10 mM de NaPO4, 300 mM de glicina, 10 mM de metionina,pH 7,0. Quatro obturadores de 13 mm diferentes foram usados como enchi-mentos de recipiente. Cada tipo de obturador foi usado em 100 frascos. Osobturadores foram enxaguados, fervidos, e, em seguida, autoclavados. Me-tade dos obturadores foi, em seguida, secado por 16 horas a 100°C. Osfrascos foram colocados em estabilidade acelerada de curto tempo a 4°C,40°C, e 50°C por duas e quatro semanas. Os frascos foram ensaiados emT=O e em 2 e 4 semanas para oxidação de Met58 e formação de multímero.RP-HPLC (baixa carga) foi usada para determinar o grau de oxidação deMet58 em rhlL-11, pelo que SEC-HPLC foi usada para monitorar a geraçãode multímero de rhlL-11.

Um gráfico inicial foi construído para testar qualquer correlaçãodireta entre oxidação e multimerização (ver, Fig. 7). Os dados mostram quequando níveis de oxidação são altos, os níveis de multímero são baixos, eque quando os níveis de oxidação são baixos, os níveis de multímero sãoaltos.

Estes dados indicam que oxidação e multimerização de rhlL-11parecem ocorrer sob circunstâncias opostas. Quando os parâmetros sãootimizados para maximizar a oxidação de rhlL-11, a multimerização aumen-ta.Seqüência de Listagem

<110> WARNE, NICHOLAS WILLIAMKANTOR, ANGELACROWLEY, THOMAS JOSEPHSOLEY1 ERIN CHRISTINELI, LI

LUKSHA, NICHOLAS GARYNEIDHARDT, EDIE ANNA

<120> Métodos para Redução de Agregação de Proteína

<130> 36119.249WO/AM101947

<140> PCT/US2007/006787<141> 2007-03-19

<150> 60/784,130<151> 2006-03-20

<160> 7

<170> PatentIn versão 3.3

<210> 1<211> 237<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Constructo de Cadeia Leve Sintética<400> 1

Met Asp Phe His Val Gln Il e Phe Ser phe Met Leu Ile Ser Val Thr1 5 10 15

Val Ile Leu ser Ser Gly Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro ser ser20 25 30

Leu ser Ala ser Val Gly Asp Arg vai Thr Ile Thr Cys Ser vai ser35 40 45

Ser Ser Ile Ser Ser Ser Asn Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly50 55 60

Lys Ala Pro Lys Pro Leu lie Tyr Gly Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly65 70 75 80

vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu85 90 95

Thr Ile ser ser Leu Gln Pro Glu Asp vai Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln100 105 UO

Gln Trp Ser ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lyis Val Glu115 120 125

Ile Lys Arg Thr vai Ala Ala Pro Ser vai Phe Ile Phe Pro Pro ser130 135 140

Asp Glu Gln Leu Lys ser Gly Thr Ala Ser Val vai Cys Leu Leu Asn145 150 155 160

Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys vai Gln Trp Lys vai Asp Asn Ala165 170 175Leu Gln Ser Gly Asn ser Gln Glu ser vai Thr Glu Glrt Asp ser Lys180 185 190

Asp ser Thr Tyr ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp195 200 205

Tyr Glu Lys His Lys vai Tyr Ala Cys Glu vai Thr His Gln Gly Leu210 215 220

Ser ser Pro vai Thr Lys ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys225 230 235

<210> 2<211> 461<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Constructo Pesado Sintético<400> 2

Met Lys Cys ser Trp vai Ile Phe Phe Leu Met Ala vai Val Thr. Gly1 5 10 15

vai Asn Ser Glu vai Gln Leu vai Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys20 25 30

Pro Gly Ala Ser vai Lys Val Ser Cys Lys Pro ser Gly Phe Asn Ile35 40 45

Lys Asp Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu50 55 60

Glu Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asn Thr Leu Tyr Asp65 70 75 80

Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Ile Thr Ala Asp Thr Ser Thr ser85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Leu Phe Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly115 120 125

Thr Leu Val Thr vai ser ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe130 135 140

Pro Leu Ala Pro Cys ser Arg Ser Thr ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu145 150 155 160

Gly Cys Leu vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro vai Thr Val Ser Trp165 170 175

Asn Ser Gly Ala Leu Thr ser Gly vai His Thr Phe Pro Ala vai Leu180 185 190

Gln ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser vai vai Thr vai Pro ser195 200 205

Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn vai Asp His Lys Pro210 215 220

Ser Asn Thr Lys vai Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys vai Glu225 230 235 240Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Ala Ala Ala Pro Ser Val Phe Leu245 250 255

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu260 265 270

Val Thr Cys Val vai Val Asp vai Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln275 280 285

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys290 295 300

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg vai Val Ser Val Leu305 310 315 320

Thr Val Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys325 330 335

vai Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile ser Lys340 345 350

Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser355 360 365

Arq Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys 370 375 380

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln385 390 395 400

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly 405 410 415

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln420 425 430

Gln Gly Asa Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn435 440 445

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys450 455 460

<210> 3<211> 239<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Constructo de Cadeia Leve Sintética<400> 3

Met Asp Ser Gln Ala Gln vai Leu Ile Leu Leu Leu Leu Trp vai Ser1 5 10 15

Glv Thr Cys Gly Asp Ile vai Leu Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala20 25 30

vai Ser Leu Gly Glu Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys ser Ser Gln Ser35 40 45

Leu Leu Asn Ser Arg Thr Arg Glu Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln50 55 60

Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg65 70 75 80

Glu ser Gly vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp85 90 95

Phe Thr Leu Thr Ile Ser ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr100 105 110

Tyr Cys Thr Gln Ser Tyr Asn Leu Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys115 120 125

vai Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro1B0 135 140

Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val vai Cys Leu145 150 155 160

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp165 170 175

Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn ser Gln Glu Ser vai Thr Glu Gln Asp180 185 190

Ser Lys Asp Ser Thr Tyr ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys195 200 205

Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Va7 Thr His G7n210 215 220

Gly Leu ser ser pro vai Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys225 230 235

<210> 4<211> 461<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Constructo Pesado Sintético<400> 4

Met Gly Trp Asn Cys Ile Ile Phe Phe Leu Val Thr Thr Ala Thr Gly15 10 15

Val His ser Gln vai Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys20 25 30

Pro Gly Ser Ser vai Lys vai Ser Cys Lys Ala ser Gly Tyr Thr Phe35 40 45

Thr Asp Tyr Ala Ile Gln Trp vai Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu50 55 60

Glu Trp lie Gly Val Ile Asn Ile Tyr Tyr Asp Asn Thr Asn Tyr Asn65 70 75 80

Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Met Thr Val Asp Lys ser Thr Ser85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu ser ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Ala Trp Tyr Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly115 120 125Thr Leu vai Thr vai Ser ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser vai Phe130 135 140

Pro Leu Ala Pro Cys ser Arg Ser Thr Ser Glu ser Thr Ala Ala Leu145 150 155 160

Gly Cys Leu vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro vai Thr vai Ser Trp165 170 175

Asn Ser Gly Ala Leu Thr ser Gly vai His Thr Phe Pro Ala Val Leu180 185 190

Gln Ser ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser ser Val vai Thr Val Pro Ser195 200 205

ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn vai Asp His Lys Pro210 215 220

Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu225 230 235 240

Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Pro Ala Ala Ala Pro Ser Val Phe Leu245 250 255

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu260 265 270

Val Thr Cys vai Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln275 280 285

Phe Asn Trp Tyr vai Asp Gly Val Glu vai His Asn Ala Lys Thr Lys290 295 300

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg vai Val Ser Val Leu305 310 315 320

Thr vai Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys325 330 335

vai Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr Ile ser Lys340 345 350

Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser355 360 365

Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys370 375 380

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala vai Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln385 390 395 400

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly405 410 415

Ser Phe Phe Leu Tyr ser Lys Leu Thr vai Asp Lys Ser Arg Trp Gln420 425 430

Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser vai Met His Glu Ala Leu His Asn435 440 445

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu ser Leu ser Pro Gly Lys450 455 460

<210> 5<211> 467<212> PRT<213> Seqüência artificial<220>

<22B> Descrição de Seqüência Artificial: Constructo de Cadeia Pesada Sintética<400> 5

Met Asp Phe Gly Phe Ser Leu vai Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly1 5 10 15

Val Gln Cys Glu· Val Gln Leu vai Gln Ser Gly Ala Glu vai Lys Lys20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys vai Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Arg Phe35 40 45

Thr Asn Tyr Trp Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu50 55 60

Glu Trp Ile Gly Gly Ile Asn Pro Gly Asn Asn Tyr Ala Thr Tyr Arg65 70 75 80

Arg Lys Phe Gln Gly Arg vai Thr Met Thr Ala Asp Thr ser Thr Ser85 90 95

Thr vai Tyr Met Glu Leu ser ser Leu Arg ser Glu Asp Thr Ala Val100 105 110

Tyr Tyr Cys Thr Arg Glu Gly Tyr Gly Asn Tyr Gly Ala Trp Phe Ala115 120 125

Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr vai Ser Ser Ala ser Thr Lys130 135 140

I

Gly Pro ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys ser Arg Ser Thr ser Glu145 150 155 160

Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu vai Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro165 170 175

vai Thr vai ser Trp Asn ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr180 185 190

Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser ser Val195 200 205

vai Thr vai Pro ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr Tyr Thr Cys Asn210 215 220

Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys vai Asp Lys Arg Val Glu Ser225 230 235 240

Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly245 250 255

Gly Pro ser vai Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met260 265 270

Ile Ser Arg Thr Pro Glu vai Thr Cys Val Val Val Asp Val ser Gln275 280 285

Glu Asp Pro Glu vai Gln Phe Asn Trp Tyr vai Asp Gly Val Glu vai290 295 300

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr305 310 315 320Arg vai Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Glv325 330 335

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys vai ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile340. 345 350

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val355 360 365

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser370 375 380

Leu Thr Cys Leu vai Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu385 390 395 400

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro405 410 415

vai Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr vai420 425 430

Asp Lys ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met435 440 445

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu ser Leu ser450 455 460

Leu Gly Lys, 465

<210> 6<211> 239<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Constructo de Cadeia Kappa Sintética<400> 6

Met Lys Leu Pro Val Arg Leu Leu vai Leu Leu Leu Phe Trp Ile Pro1 5 10 15

Ala Ser Arg Gly Asp Val Gln vai Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser20 25 30

Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser35 40 45

Leu Ala Asn Ser Tyr Gly Asn Thr Phe Leu Ser Trp Tyr Leu His Lys50 55 60

Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gly Ile Ser Asn Arg Phe65 70 75 80

Ser Gly vai Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe85 90 95

Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr100 105 110

Cys Leu Gln Gly Thr His Gln Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys115 120 125

Val Glu Ile Lys Arg Thr vai Ala Ala Pro ser Val Phe Ile Phe Pro130 135 140Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu145 150 155 160

Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp165 170 175

Asn Ala Leu Gln ser Gly Asn ser Gln Glu Ser vai Thr Glu Gln Asp180 185 190

Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu ser ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys195 200 205

Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys vai Tyr Ala Cys Glu vai Thr His Gln210 215 220

Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys225 230 235

<210> 7<211> 1438<212> PRT

<213> Seqüência artificial<220>

<223> Descrição de Seqüência Artificial: Constructo Sintético<400> 7

Ala Thr Arg Arg Tyr Tyr Leu Gly Ala vai Glu Leu ser Trp Asp Tyr15 10 15

Met Gln ser Asp Leu Gly Glu Leu Pro vai Asp Ala Arg Phe Pro Pro20 25 30

Ara vai Pro Lys Ser Phe Pro Phe Asn Thr Ser vai Val Tyr Lys Lysy 35 40 45

Thr Leu Phe Val Glu Phe Thr Asp His Leu Phe Asn Ile Ala Lys Pro50 55 60

Arq Pro Pro Trp Met Gly Leu Leu Gly Pro Thr Ile Gln Ala Glu vai65 70 75 80

Tvr Asp Thr vai vai lie Thr Leu Lys Asn Met Ala Ser His Pro vaiy 85 90 95

Ser Leu His Ala vai Gly vai Ser Tyr Trp Lys Ala Ser Glu Gly Ala100 105 110

Glu Tyr Asp Asp Gln Thr Ser Gln Arg Glu Lys Glu Asp Asp Lys vai115 120 125

Phe Pro Gly Gly ser His Thr Tyr vai Trp Gln Val Leu Lys Glu Asn130 135 140

Glv Pro Met Ala Ser Asp Pro Leu Cys Leu Thr Tyr ser Tyr Leu ser145 150 155 160

His vai Asp Leu vai Lys Asp Leu Asn Ser Gly Leu Ile Gly Ala Leu165 170 175

Leu Val Cys Arg Glu Gly ser Leu Ala Lys Glu Lys Thr Gln Thr Leu180 185 190

His Lys Phe Ile Leu Leu Phe Ala vai Phe Asp Glu Gly Lys Ser Trp195

200

205

His ser Glu Thr Lys Asn ser Leu Met Gln Asp Arg Asp Ala Ala Ser210 215 220

Ala Arg Ala Trpi Pro Lys Met His Thr Val Asn Gly Tyr Val Asn Arq225 230 235 240

Ser Leu Pro Gly Leu Ile Gly Cys His Arg Lys Ser Val Tyr Trp His245 250 255

vai Ile Gly Met Gly Thr Thr Pro Glu Val His Ser Ile Phe Leu Glu260 265 270

Gly His Thr Phe Leu Val Arg Asn His Arg Gln Ala Ser Leu Glu Ile275 280 285

Ser Pro Ile Thr Phe Leu Thr Ala Gln Thr Leu Leu Met Asp Leu Gly290 295 300

Gln Phe Leu Leu Phe Cys His Ile ser Ser His Gln His Asp Gly Met305 310 315 320

Glu Ala Tyr vai Lys Val Asp Ser Cys Pro Glu Glu Pro Gln Leu Arg325 330 335

Met Lys Asn Asn Glu Glu Ala Glu Asp Tyr Asp Asp Asp Leu Thr Asp340 345 350

Ser Glu Met Asp Val Val Arg Phe Asp Asp Asp Asn ser Pro ser Phe355 360 365

Ile Gln Ile Ár§ ser vai Ala Lys Lys His Pro Lys Thr Trp vai His370 375 380

Tyr Ile Ala Ala Glu Glu Glu Asp Trp Asp Tyr Ala Pro Leu vai Leu385 390 395 400

Ala Pro Asp Asp Arg Ser Tyr Lys Ser Gln Tyr Leu Asn Asn Gly Pro405 410 415

Gln Arg Ile Gly Arg Lys Tyr Lys Lys Val Arg Phe Met Ala Tyr Thr420 425 430

Asp Glu Thr Phe Lys Thr Arg Glu Ala Ile Gln His Glu Ser Gly Ile435 440 445

Leu Gly Pro Leu Leu Tyr Gly Glu Val Gly Asp Thr Leu Leu Ile Ile450 455 460

Phe Lys Asn Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Asn Ile Tyr Pro His Gly Ile465 470 475 480

Thr Asp vai Arg Pro Leu Tyr Ser Arg Arg Leu Pro Lys Gly Val Lys485 490 495

His Leu Lys Asp Phe Pro Ile Leu Pro Gly Glu Ile Phe Lys Tyr Lys500 505 510

Trp Thr vai Thr Val Glu Asp Gly Pro Thr Lys Ser Asp Pro Arg Cys515 520 525

Leu Thr Arg Tyr Tyr Ser Ser Phe vai Asn Met Glu Arg Asp Leu Ala530 . 535 540

ser Gly Leu Ile Gly Pro Leu Leu Ile Cys Tyr Lys Glu Ser vai Asp545 550 555 560Gln Arg Gly

Ser vai Phe

Arg Phe Leu595

Gln Ala Ser610

Leu Gln Leu625

Ser Ile Gly

Thr Phe Lys

Phe Ser Gly675

Ile Leu Gly690

Leu Leu Lys705

Asp ser TyrIle Glu Pro

Gln Arg Glu755

Asp Tyr Asp770

Ile Tyr Asp785

Asn Gln lie Met ser Asp Lys Arg Asn Val Ile Leu Phe565 570 575

Asp Glu Asn Arg ser Trp Tyr Leu Thr Glu Asn Ile Gln580 585 590

Pro Asn Pro Ala Gly vai Gln Leu Glu Asp Pro Glu Phe600 . 605

Asn Ile Met His ser Ile Asn Gly Tyr vai Phe Asp Ser615 620

ser vai Cys Leu His Glu Val Ala Tyr Trp Tyr Ile Leu630 635 640

Ala Gln Thr Asp Phe Leu ser Val Phe Phe Ser Gly Tyr645 650 655

His Lys ,Met vai Tyr Glu Asp Thr Leu Thr Leu Phe Pro660 ' 665 670

Glu Thr vai Phe Met Ser Met Glu Asn Pro Gly Leu Trp680 685

Cys His Asn Ser Asp Phe Arg Asn Arg Gly Met Thr Ala695 700

vai Ser Ser cys Asp Lys Asn Thr Gly Asp Tyr Tyr Glu710 715 720

Glu Asp Ile Ser Ala Tyr Leu Leu Ser Lys Asn Asn Ala725 730 735

Arg Ser Phe Ser Gln Asn Pro Pro Val Leu Lys Arg His740 745 750

Ile Thr Arg Thr Thr Leu Gln Ser Asp Gln Glu Glu Ile760 765

Asp Thr Ile Ser vai Glu Met Lys Lys Glu Asp Phe Asp775 780

Glu Asp Glu Asn Gln Ser Pro Arg ser Phe Gln Lys Lys790 795 800

Thr Arq His Tyr Phe Ile Ala Ala Val Glu Arg Leu Trp Asp Tyr Gly805 810 815

Met Ser Ser ser Pro His vai Leu Arg Asn Arg Ala Gln Ser Gly ser820 825 830

vai Pro Gln835

Phe Thr Gln850

Leu Gly Pro865

Phe Arg Asnser Tyr Glu

Phe Lys Lys Val vai Phe Gln Glu Phe Thr Asp Gly ser840 845

Pro Leu Tyr Arg Gly Glu Leu Asn Glu His Leu Gly Leu855 860

Tyr Ile Arg Ala Glu Val Glu Asp Asn Ile Met Val Thr870 875 880

Gln Ala Ser Arg Pro Tyr Ser Phe Tyr Ser Ser Leu Ile885 890 895

Glu Asp Gln Arg Gln Gly Ala Glu Pro Arg Lys Asn Phe900 905 910Val Lys Pro Asn Glu Thr Lys Thr Tyr Phe Trp Lys Val Gln His His915 920 925

Met Ala Pro Thr Lys Asp Glu Phe Asp Cys Lys Ala Trp Ala Tyr Phe930 935 940

Ser Asp vai Asp Leu Glu Lys Asp vai His ser Gly Leu Ile Gly Pro945 950 955 960

Leu Leu vai Cys His Thr Asn Thr Leu Asn Pro Ala His Gly Arg Gln965 970 975

Val Thr vai Gln Glu Phe Ala Leu Phe Leu Thr Ile Phe Asp Glu Thr980 985 990

Lys ser Trp Tyr Phe Thr Glu Asn Met Glu Arg Asn Cys Arg Ala Pro995 1000 1005

Cys Asn Ile Gln Met Glu Asp Pro Thr Phe Lys Glu Asn Tyr Ara Phe1010 1015 1020

His Ala lie Asn Gly Tyr Ile Met Asp Thr Leu Pro Gly Leu Val Met1025 1030 1035 1040

Ala Gln Asp Gln Arg Ile Arg Trp Tyr Leu Leu ser Met Gly ser Asn1045 1050 1055

Glu Asn Ile His ser Ile His Phe ser Gly His Val Phe Thr vai Ara1060 1065 1070

Lys Lys Glu Glu Tyr Lys Met Ala Leu Tyr Asn Leu Tyr Pro Gly Val1075 1080 1085

-5 · ·.>.

Phe Glu Thr Val Glu Met Leu Pro Ser Lys Ala Gly Ile Trp Ara Val1090 1095 1100

Glu Cys Leu Ile Gly Glu His Leu His Ala Gly Met Ser Thr Leu Phe1105 1110 1115 1120

Leu vai Tyr ser Asn Lys Cys Gln Thr Pro Leu Gly Met Ala Ser Gly1125 1130 1135

His Ile Arg Asp Phe Gln Ile Thr Ala Ser Gly Gln Tyr Gly Gln Trp1140 1145 1150

Ala Pro Lys Leu Ala Arg Leu His Tyr Ser Gly ser Ile Asn Ala Trp1155 1160 1165

Ser Thr Lys Glu Pro Phe ser Trp Ile Lys Val Asp Leu Leu Ala Pro1170 1175 1180

Met Ile Ile His Gly Ile Lys Thr Gln Gly Ala Arg Gln Lys Phe Ser1185 1190 1195 1200

Ser Leu Tyr Ile ser Gln Phe Ile Ile Met Tyr ser Leu Asp Gly Lvs1205 1210 1215

Lys Trp Gln Thr Tyr Arg Gly Asn ser Thr Gly Thr Leu Met Val Phe1220 1225 1230

Phe Gly Asn vai Asp Ser ser Gly Ile Lys His Asn Ile Phe Asn Pro1235 1240 1245

Pro Ile Ile Ala Arg Tyr Ile Arg Leu His Pro Thr His Tyr ser Ile1250 1255 1260

Arg ser Thr Leu Arg Met Glu Leu Met Gly Cys Asp Leu Asn Ser Cys1265 1270 1275 1280

Ser Met Pro Leu Gly Met Glu Ser Lys Ala Ile ser Asp Ala Gln Ile1285 1290 1295

Thr Ala ser Ser Tyr Phe Thr Asn Met Phe Ala Thr Trp Ser Pro Ser1300 1305 1310

Lys Ala Arg Leu His Leu Gln Gly Arg Ser Asn Ala Trp Arg Pro Gln1315 1320 1325

vai Asn Asn Pro Lys Glu Trp Leu Gln Val Asp Phe Gln Lys Thr Met1330 1335 1340

Lys vai Thr Gly vai Thr Thr Gln Gly Val Lys ser Leu Leu Thr Ser1345 1350 1355 1360

Met Tyr vai Lys Glu Phe Leu Ile Ser Ser Ser Gln Asp Gly His Gln1365 1370 1375

Trp Thr Leu Phe Phe.1161 η Asn Gly Lys Val Lys vai Phe Gln Gly Asn1380 1385 1390

Gln Asp Ser Phe Thr Pro Val vai Asn Ser Leu Asp Pro Pro Leu Leu1395 1400 1405

Thr Arg Tyr Leu Arg Ile His Pro Gln Ser Trp vai His Gln Ile Ala1410 1415 1420

Leu Arg Met Glu vai Leu Gly Cys Glu Ala Gln Asp Leu Tyr1425 1430 1435

Claims (30)

1. Método para redução de agregação de uma proteína em umaformulação de proteína, compreendendo adicionar metionina à formulação auma concentração de cerca de 0,5 mM a cerca de 145 mM, no qual o méto-do resulta em agregação reduzida da proteína na formulação comparadacom a proteína em uma formulação carecendo de metionina.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual a formula-çãoo de proteína é uma formulação líquida ou um pó seco congelado.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual a proteínaestá em uma concentração de entre cerca de 0,1 mg/ml e cerca de 300mg/ml.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual a formula-çãoo de proteína compreende um tensoativo.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual a formula-çãoo de proteína compreende um aminoácido selecionado a partir do grupoconsistindo em arginina, lisina, ácido aspártico, glicina, e ácido glutâmico.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual a formula-çãoo de proteína compreende um modificador de tonicidade.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual a formula-çãoo de proteína compreende um açúcar.

8. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual a formula-çãoo de proteína compreende adicionalmente um agente que reduz agrega-ção da proteína da formulação.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual a agrega-ção da proteína não é o resultado de oxidação de metionina.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual a agrega-ção da proteína da formulação is avaliada antes e/ou após adição de metio-nina à formulação.

11. Método, de acordo com a reivindicação 10, no qual a agre-gação is avaliada por SEC-HPLC, AUC, difusão de luz, e absorvância deUV.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual a agrega-ção é avaliada por % de espécie HMW1 e a % de espécie HMW é reduzidapor cerca de 30% comparado com % de espécie HMW em uma formulaçãoque carece de metionina.

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual a agrega-ção da proteína da formulação é avaliada entre 1 semana e 12 semanas a-pós adição de metionina à formulação de proteína, ou entre 1 mês e 36 me-ses após adição de metionina à formulação de proteína.

14. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual a agrega-ção da proteína da formulação é avaliada após armazenamento da formula-ção de proteína a uma temperatura entre 4°C e 50°C por cerca de 1 semanaa cerca de 12 semanas após formulação da formulação de proteína com me-tionina.

15. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual a agrega-ção da proteína da formulação é avaliada após armazenamento da formula-ção de proteína a uma temperatura entre 4°C e 30°C por cerca de 1 mês acerca de 36 meses após formulação da formulação de proteína com metio-nina.

16. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual a agrega-ção da proteína da formulação é um resultado de tensão de cisalhamento,armazenamento, armazenamento à temperatura elevada, exposição à luz,pH, presença de tensoativos, e combinações destes.

17. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual a metioni-na é adicionada à formulação a uma concentração final de entre cerca de 1mM e 25 mM.

18. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual a formula-çãoo tem um pH de entre cerca de 5,0 e 7,0.

19. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual a formula-çãoo de proteína compreende um tampão selecionado a partir do grupo con-sistindo em citrato, succinato, histidina, Tris, e combinações destes.

20. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual o métodoaumenta a vida útil da formulação, ou mantém a potência da formulação.

21. Método, de acordo com a reivindicação 1, no qual a proteínacarece de resíduos de metionina, ou contém menos do que 5 resíduos demetionina.

22. Método para redução de agregação de uma proteína emuma formulação de proteína sujeita a tensão de cisalhamento, compreen-dendo adição de metionina à formulação a uma concentração de cerca de-0,5 mM a cerca de 145 rriM, no qual o método resulta em agregação reduzi-da de proteína na formulação comparada com a proteína em uma formula-ção carecendo de metionina.

23. Método, de acordo com a reivindicação 22, no qual a tensãode cisalhamento é o resultado de sacudimento, estiramento em uma seringae procedimentos de purificação, e combinações destes.

24. Método de redução de uma perda na potência ou atividadebiológica de uma proteína em uma formulação de proteína após armazena-mento da formulação à temperatura ambiente por mais do que um dia, com-preendendo adição de metionina à formulação a uma concentração de cercade 0,5 mM a cerca de 145 mM, reduzindo, desse modo, a perda na potênciaou atividade biológica da proteína na formulação comparada com a proteínaem uma formulação que carece de metionina.

25. Método, de acordo com a reivindicação 24, no qual a formu-laçãoo de proteína é armazenada sob luz fluorescente.

26. Método, de acordo com a reivindicação 24, no qual a formu-laçãoo de proteína é armazenada no escuro por cerca de 1 mês.

27. Método para redução de agregação de uma proteína emuma formulação de proteína, compreendendo:(i) adição de metionina à formulação a uma concentraçãode cerca de 0,5 mM a cerca de 145 mM; e(ii) determinação da % de níveis de HMW da proteína daformulação por SEC-HPLC;no qual o método resulta na agregação reduzida da proteína naformulação comparada com a proteína em uma formulação que carece demetionina.

28. Método, de acordo com a reivindicação 27, no qual o métodoresulta em uma formulação de proteína tendo menos do que cerca de 5% deespécie de HMW conforme determinado por SEC-HPLC.

29. Formulação de proteína compreendendo um de um anticor-po anti-B7.1, um anticorpo anti-B7.2, um anticorpo anti-CD22, PSGL-Ig eFator VIII, ou um fragmento biologicamente ativo deste, e cerca de 0,5 mM a 50 mM de metionina.

30. Formulação de acordo com a reivindicação 29, compreen-dendo adicionalmente 1-150 mM de um aminoácido selecionado a partir dogrupo consistindo em arginina, lisina, ácido aspártico, e ácido glutâmico.