MX2008011888A

MX2008011888A - Metodos para la reduccion de la agregacion de proteinas.

Info

Publication number: MX2008011888A
Application number: MX2008011888A
Authority: MX
Inventors: Li Li; Angela Kantor; Nicholas William Warne; Thomas Joseph Crowley; Erin Christine Soley; Nicholas Gary Luksha; Edie Anna Neidhardt
Original assignee: Wyeth Corp
Priority date: 2006-03-20
Filing date: 2007-03-19
Publication date: 2008-09-29
Also published as: PE20080121A1; CA2646934A1; RU2008137634A; TW200806317A; EP1996221A2; NO20083940L; JP2009530380A; KR20080108554A; CR10290A; CA2646934C; WO2007109221A2; US20080064856A1; AU2007227408A1; WO2007109221A3; IL194123A0; ECSP088758A; AR059964A1; WO2007109221A9; CN101420972A; BRPI0709059A2

Abstract

Se proporcionan métodos para reducir la agregación de una proteína o proteínas en una formulación, y formulaciones de proteínas que tienen propiedades de agregación reducidas. Los métodos y formulaciones aquí descritos mantienen la actividad biológica de una proteína e incrementan el tiempo de conservación de formulaciones de proteínas.

Description

METODOS PARA LA REDUCCION DE LA AGREGACION DE PROTEINAS CAMPO DE LA INVENCION El campo se refiere un método de reducción de la agregación de proteínas y formulaciones de proteínas que tienen niveles reducidos de agregación.

ANTECEDENTES DE LA INVENCION La terminación del proyecto del genoma humano, junto con el desarrollo de métodos mejorados para el aislamiento y purificación de proteínas, han hecho una realidad la producción a gran escala de formulaciones de proteínas. De hecho, hay más de cien proteínas recombinantes en los ensayos clínicos de Fase I, o más allá, y varias docenas han recibido la aprobación de la Administración de Alimentos y Fármacos.

Las formulaciones que aseguran un suministro eficiente y seguro de proteínas o péptidos en una forma biológicamente activa, son clave para el éxito comercial de productos de biotecnología actuales y futuros. Desafortunadamente, las proteínas poseen propiedades físicas y químicas únicas, las cuales crean dificultades en la formulación y desarrollo. Las inestabilidades físicas y químicas de las proteínas plantean retos importantes en el desarrollo de formulaciones adecuadas de proteínas. La inestabilidad física más común de las proteínas es la Ref.: 196548 agregación de proteínas y su equivalente macroscópico, la precipitación. La tendencia de las proteínas a agregarse es un problema especialmente desafiante en la industria farmacéutica y de la biotecnología donde se desea sintetizar, procesar, y almacenar proteínas a las concentraciones más elevadas posibles, y durante periodos prolongados de tiempo.

Aunque los mecanismos que impulsan la agregación de proteínas no se entienden por completo, los resultados finales son sin embargo indeseables. La formación de agregados por un polipéptido en una composición farmacéutica puede afectar adversamente la actividad biológica de ese polipéptido, lo que resulta en una pérdida de eficacia terapéutica de la composición farmacéutica. Además, las proteínas en un estado agregado pueden ser inmunógenas y pueden tener incluso efectos tóxicos agudos in vivo. Adicionalmente , la formación de agregados puede provocar otros problemas durante la administración de la formulación de proteínas, tales como el bloqueo de jeringas, tuberías, membranas, o bombas. De esta manera, hay una necesidad en la técnica de métodos para reducir la agregación de proteínas y para desarrollar formulaciones de proteínas que muestren niveles reducidos de agregación.

BREVE DESCRIPCION DE LA INVENCION Esta solicitud se refiere a formulaciones de proteínas que muestran propiedades de agregación reducidas y métodos de elaboración de tales formulaciones. En un aspecto, la solicitud se refiere a un método para reducir la agregación de una proteina o proteínas en una formulación al añadir la metionina a la formulación hasta una concentración de alrededor de 0.5 m hasta alrededor de 145 mM. El método reduce la agregación de la proteína o proteínas en la formulación, comparado con el nivel de agregación de la misma proteína o proteínas formuladas en una formulación idéntica, excepto que carece de metionina. En una modalidad específica, el método de añadir la metionina a una formulación hasta una concentración de alrededor de 0.5 mM hasta alrededor de 145 mM reduce la agregación de la proteína o proteínas en la formulación cuando la formulación se somete a condiciones que promueven o facilitan la agregación de proteínas, comparado con el nivel de agregación de la misma proteína o proteínas formuladas en una formulación idéntica, excepto que carece de metionina/ y sometida a las mismas condiciones que promueven la agregación de proteínas. En determinadas modalidades, se añade la metionina a la formulación hasta una concentración final de entre alrededor de 0.5 mM y alrededor de 50 mM. En modalidades específicas, se añade la metionina a la formulación hasta una concentración final de 0.5 mM, 1 mM, 2.5 mM, 5 mM, 7.5 mM, 10 mM, 12.5 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, y 45 mM. En determinadas modalidades, el método de añadir la metionina a una formulación de proteínas hasta una concentración de alrededor de 0.5 mM hasta alrededor de 145 mM, en donde la formulación de proteínas se va a someter a condiciones que conducen a la agregación de proteínas, resulta en una formulación que tiene como máximo alrededor de 5%, como máximo alrededor de 4%, como máximo alrededor de 3%, como máximo alrededor de 2%, como máximo alrededor de 1%, o como máximo alrededor de 0.5% de especies de alto peso molecular (HMW) cuando se mide por cromatografía líquida de alta resolución-cromatografía de exclusión de tamaño (SEC-HPLC) , después de que la formulación se somete a condiciones que promueven la agregación de proteínas. En algunas modalidades, el método de añadir la metionina a una formulación de proteínas hasta una concentración de alrededor de 0.5 mM hasta alrededor de 145 mM incrementa el tiempo de conservación de la formulación de proteínas comparado con una formulación que carece de metionina. En otras modalidades, el método de añadir la metionina a una formulación de proteínas hasta una concentración de alrededor de 0.5 mM hasta alrededor de 145 mM conserva la potencia de la formulación de proteínas comparado con una formulación que carece de metionina. En determinadas modalidades, el método de añadir la metionina a una formulación de proteínas hasta una concentración de alrededor de 0.5 mM hasta alrededor de 145 mM (por ejemplo, alrededor de 1 mM hasta alrededor de 145 mM) reduce la inmunogenicidad de la formulación de proteínas comparado con una formulación que carece de metionina. El método es más útil para proteínas que se conoce que se agregan, o que se considera probable que se agreguen, con base en la homología para proteínas que se agregan, o con base en datos experimentales que sugieren la probabilidad de la agregación. En una modalidad, la proteína dentro de una formulación se agrega durante el almacenamiento. En algunas modalidades, la proteína dentro de una formulación se agrega como resultado del esfuerzo cortante. En otras modalidades, la proteína dentro de una formulación se agrega como resultado de temperatura elevada. En otras modalidades, la proteína dentro de una formulación se agrega como resultado de exposición a la luz. Todavía en otras modalidades, la proteína dentro de una formulación se agrega como resultado de la presencia de determinados azúcares, o tensoactivos , en la formulación. La adición de metionina a las formulaciones que se exponen, o que se exponen probablemente a tales condiciones, es efectiva en la reducción de la formación de agregados, con lo que se mantiene la actividad biológica y la potencia de la proteína o proteínas dentro de una formulación . En algunas modalidades, la agregación de la proteína o proteínas de la formulación se determina antes de añadir la metionina a la formulación. En otras modalidades, la agregación de la proteina o proteínas de la formulación se determina después de añadir la metionina a la formulación. Todavía en modalidades adicionales, la agregación de la proteína o proteínas de la formulación se determina antes y después de añadir la metionina a la formulación. La agregación de la proteína o proteínas de una formulación puede determinarse por cualquier método conocido por alguien experto ordinario en la técnica incluyendo, pero no limitado a, cromatografía líquida de alta resolución-cromatografía de exclusión de tamaño (SEC-HPLC), cromatografía líquida de alta resolución-fase inversa (RP-HPLC) , absorbancia UV, mediciones de velocidad de sedimentación, y combinaciones de los mismos. En modalidades específicas, el porcentaje de especies de alto peso molecular (% HM ) en una formulación que comprende alrededor de 1 mM hasta alrededor de 145 mM de metionina se reduce por al menos alrededor de 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, o 75% comparado con el % de especies de HMW en la formulación idéntica, excepto que carece de metionina. En otras modalidades específicas, una formulación que comprende alrededor de 1 mM hasta alrededor de 145 mM de metionina tiene como máximo alrededor de 5%, como máximo alrededor de 4%, como máximo alrededor de 3%, como máximo alrededor de 2%, como máximo alrededor de 1%, o como máximo alrededor de 0.5% de especies de alto peso molecular (HMW) . La agregación de una proteína o proteínas en una formulación se puede medir en cualquier momento después de que se prepara la formulación, ya sea con o sin metionina. En determinadas modalidades, la agregación se mide un día después de formular la proteína, entre 1 semana y 12 semanas, o entre 1 mes y 36 meses después de formular la proteína de interés . En algunas modalidades, la proteína de la formulación es un anticuerpo, una proteína de fusión de inmunoglobulina (Ig), un factor de coagulación, un receptor, un ligando, una enzima, un factor de transcripción, o un fragmento biológicamente activo de cualquiera de estas proteínas. En modalidades específicas, la proteína es un anticuerpo anti-B7.1, un anticuerpo anti-B7.2, un anticuerpo anti-CD22, una proteína de fusión de PSGL-Ig, Factor Vlla, Factor VIII, Factor IX, Factor X, Factor XI, Factor XII, Factor XIII, o un fragmento biológicamente activo de cualquiera de estas proteínas. En algunas modalidades, la proteína se formula a una concentración de desde alrededor de 0.1 mg/ml hasta alrededor de 250 mg/ml en la formulación. En algunas modalidades, la proteína se formula a una concentración de desde alrededor de 0.1 mg/ml hasta alrededor de 200 mg/ml en la formulación. En otras modalidades, la proteína se formula a una concentración de desde alrededor de 0.1 mg/ml hasta alrededor de 100 mg/ml en la formulación. En algunas modalidades, la protelna se formula a una concentración de desde alrededor de 0.1 mg/ml hasta alrededor de 10 mg/ml en la formulación. En determinadas modalidades, la proteina se formula como un liquido o un polvo secado por congelación. En determinadas modalidades, la formulación de proteínas comprende un tensoactivo. En modalidades específicas, el tensoactivo es polisorbato-20 o polisorbato 80. En otras determinadas modalidades, la formulación de proteínas carece de un tensoactivo. En determinadas modalidades, la formulación de proteínas comprende un modificador de la tonicidad. En modalidades específicas, el modificador de la tonicidad es cloruro de sodio, manitol, o sorbitol . En otras determinadas modalidades, la formulación de proteínas comprende un azúcar. En modalidades específicas, el azúcar es sacarosa, trehalosa, manitol, sorbitol, o xilitol. En otras determinadas modalidades, la formulación de proteínas carece de un azúcar. En algunas modalidades, el pH de la formulación está entre alrededor de 5.0 y 8.0. En algunas otras modalidades, el pH de la formulación está entre alrededor de 5.8 y 6.6. En otras modalidades, la formulación de proteínas comprende además uno o más agentes que reducen la agregación de la proteína de la formulación. En algunas modalidades, el agente que reduce la agregación de la proteína de la formulación es un aminoácido. En modalidades específicas, el aminoácido es arginina, lisina, glicina, ácido glutámico, o ácido aspártico. En algunas modalidades, el aminoácido se añade a una formulación de proteínas hasta una concentración de desde alrededor de 1 mM hasta alrededor de 300 mM. En algunas otras modalidades, el aminoácido se añade a una formulación de proteínas hasta una concentración de desde alrededor de 5 mM hasta alrededor de 150 mM. En otras modalidades, el agente que reduce la agregación de la proteína de la formulación es una combinación de agentes quelantes de metales. En modalidades específicas, los agentes quelantes de metales son DTPA, EGTA, y DEF. En algunas modalidades, la concentración de DTPA o EGTA en la formulación de proteínas es desde alrededor de 1 µ? hasta alrededor de 5 mM. En algunas modalidades, la concentración de DEF en la formulación de proteínas es desde alrededor de 1 µ? hasta alrededor de 10 mM. En otras modalidades, el agente que reduce la agregación de la proteína de la formulación es un secuestrante de radicales libres, especialmente un secuestrante de radicales de oxígeno. En modalidades específicas, el secuestrante de radicales libres es manitol o histidina. En algunas modalidades, la concentración de manitol en la formulación de proteínas es desde alrededor de 0.01% hasta alrededor de 25%. En algunas modalidades, la concentración de histidina en la formulación de proteínas es desde alrededor de 100 µ? hasta alrededor de 200 mM. En otras modalidades, el agente que reduce la agregación de la proteina de la formulación es una combinación de un agente quelante de metales y un secuestrante de radicales libres. En otras determinadas modalidades, el agente que reduce la agregación es citrato. En determinadas modalidades, la concentración de citrato en la formulación de proteínas es desde alrededor de 0.5 mM hasta alrededor de 25 mM. En otro aspecto, la solicitud proporciona un método para reducir la agregación de una proteína en una formulación de proteínas, en donde la proteína no contiene un residuo de metionina, o contiene menos de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, o 2 residuos de metionina, al añadir la metionina a la formulación hasta una concentración de alrededor de 0.5 mM hasta alrededor de 145 mM. El método resulta en agregación reducida de la proteína en la formulación comparado con la misma proteína en la formulación idéntica, excepto que carece de metionina. En determinadas modalidades, se añade la metionina a la formulación hasta una concentración final de entre alrededor de 0.5 mM y alrededor de 50 mM. En modalidades específicas, se añade la metionina a la formulación hasta una concentración final de 0.5 mM, 1 mM, 2.5 mM, 5 mM, 7.5 mM, 10 mM, 12.5 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, y 45 mM. En otras modalidades, el método de adición de alrededor de 0.5 mM hasta alrededor de 145 mM de metionina a una formulación de proteínas en donde la proteína no contiene un residuo de metionina, o contiene menos de 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, o 2 de residuos de metionina, resulta en una formulación que tiene como máximo alrededor de 5%, como máximo alrededor de 4%, como máximo alrededor de 3%, como máximo alrededor de 2%, como máximo alrededor de 1%, o como máximo alrededor de 0.5% de especies de alto peso molecular (HMW) . En otro aspecto, la solicitud proporciona un método para reducir la agregación de una proteina en una formulación de proteínas, en donde la agregación no se provoca por la oxidación de metionina. El método involucra añadir la metionina a la formulación hasta una concentración de alrededor de 0.5 mM hasta alrededor de 145 m . El método results en agregación reducida de la proteína en la formulación comparado con la misma proteína en la formulación idéntica, excepto que carece de metionina. En determinadas modalidades, se añade la metionina a la formulación hasta una concentración final de entre alrededor de 0.5 mM y alrededor de 50 mM. En modalidades específicas, se añade la metionina a la formulación hasta una concentración final de 0.5 mM, 1 mM, 2.5 mM, 5 mM, 7.5 mM, 10 mM, 12.5 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, y 45 mM. En otras modalidades, el método de adición de alrededor de 0.5 mM hasta alrededor de 145 mM de metionina a una formulación resulta en una formulación que tiene como máximo alrededor de 5%, como máximo alrededor de 4%, como máximo alrededor de 3%, como máximo alrededor de 2%, como máximo alrededor de 1%, o como máximo alrededor de 0.5% de especies de alto peso molecular (HMW) . Todavía en otro aspecto, se proporciona un método para reducir la agregación de una proteína con un tensoactivo. En determinadas modalidades, el tensoactivo provoca que se agregue la proteína. El método involucra añadir la metionina a la formulación hasta una concentración de alrededor de 0.5 mM hasta alrededor de 145 mM. El método resulta en agregación reducida de la proteína en la formulación comparado con la misma proteína en la formulación idéntica, excepto que carece de metionina. En determinadas modalidades, se añade la metionina a la formulación hasta una concentración final de entre alrededor de 0.5 mM y alrededor de 50 mM. En otras modalidades, se añade la metionina a la formulación hasta una concentración final de 0.5 mM, 1 mM, 2.5 mM, 5 mM, 7.5 mM, 10 mM, 12.5 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, y 45 mM. En modalidades específicas, el método de adición de alrededor de 0.5 mM hasta alrededor de 145 mM de metionina a una formulación formulada con un tensoactivo resulta en una formulación que tiene como máximo alrededor de 5%, como máximo alrededor de 4%, como máximo alrededor de 3%, como máximo alrededor de 2%, como máximo alrededor de 1%, o como máximo alrededor de 0.5% de especies de alto peso molecular (HMW) .

En un aspecto adicional, un método de adición de metionina a una formulación hasta una concentración de alrededor de 0.5 mM hasta alrededor de 145 mM reduce la agregación de una proteina sometida a esfuerzo cortante. El método involucra añadir la metionina previo a, al mismo tiempo que, o después de que la formulación se somete al esfuerzo cortante. El método resulta en una reducción de la agregación de la proteina en la formulación comparado con la misma proteina en la formulación idéntica, excepto que carece de metionina. En determinadas modalidades, se añade la metionina a la formulación hasta una concentración final de entre alrededor de 0.5 mM y alrededor de 50 mM . En modalidades especificas, se añade la metionina a la formulación hasta una concentración final de 0.5 mM, 1 mM, 2.5 mM, 5 mM, 7.5 mM, 10 mM, 12.5 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, y 45 mM. En algunas modalidades, el esfuerzo cortante se provoca por agitación, sacudida, congelación-deshielo, transporte, extracción en una jeringa, o procedimientos de purificación. En modalidades especificas, el método de adición de alrededor de 0.5 mM hasta alrededor de 145 mM de metionina a una formulación sometida a esfuerzo cortante resulta en una formulación que tiene como máximo alrededor de 5%, como máximo alrededor de 4%, como máximo alrededor de 3%, como máximo alrededor de 2%, como máximo alrededor de 1%, o como máximo alrededor de 0.5% de especies de alto peso molecular (HMW) . Todavía en un aspecto adicional, un método de adición de metionina a una formulación hasta una concentración de alrededor de 0.5 m hasta alrededor de 145 mM reduce la agregación de una proteína expuesta a la luz. En determinadas modalidades, se añade la metionina a la formulación hasta una concentración final de entre alrededor de 0.5 mM y alrededor de 50 mM. En modalidades específicas, se añade la metionina a la formulación hasta una concentración final de 0.5 mM, 1 mM, 2.5 mM, 5 mM, 7.5 mM, 10 mM, 12.5 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, y 45 mM. En algunas modalidades, la luz es luz fluorescente. En otras modalidades, la luz es luz solar. En modalidades adicionales, la luz es luz UV. El método involucra añadir la metionina previo a, al mismo tiempo que, o después de que la formulación se expone a la luz. En determinadas modalidades, la metionina se agrega previo a y al mismo tiempo que, o después de la exposición de la formulación a la luz. El método de añadir la metionina a una formulación hasta una concentración de alrededor de 0.5 mM hasta alrededor de 145 mM resulta en una reducción de la agregación de la proteína en la formulación comparado con la misma proteína en la formulación idéntica, excepto que carece de metionina. En modalidades específicas, el método de adición de alrededor de 0.5 mM hasta alrededor de 145 mM de metionina a una formulación expuesta a la luz resulta en una formulación que tiene como máximo alrededor de 5%, como máximo alrededor de 4%, como máximo alrededor de 3%, como máximo alrededor de 2%, como máximo alrededor de 1%, o como máximo alrededor de 0.5% de especies de alto peso molecular (HMW) . En otro aspecto, un método de adición de metionina a una formulación hasta una concentración de alrededor de 0.5 mM hasta alrededor de 145 mM disminuye una pérdida en potencia o actividad biológica de una proteina en una formulación de proteínas. Este método resulta en una reducción de la agregación de la proteína en la formulación, con lo que se conserva la potencia o actividad funcional de la proteína. En determinadas modalidades, se añade la metionina a la formulación hasta una concentración final de entre alrededor de 0.5 mM y alrededor de 50 mM. En modalidades específicas, se añade la metionina a la formulación hasta una concentración final de 0.5 mM, 1 mM, 2.5 mM, 5 mM, 7.5 mM, 10 mM, 12.5 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, y 45 mM. En modalidades específicas, el método de adición de alrededor de 0.5 mM hasta alrededor de 145 mM de metionina a una formulación resulta en una formulación que tiene como máximo alrededor de 5%, como máximo alrededor de 4%, como máximo alrededor de 3%, como máximo alrededor de 2%, como máximo alrededor de 1%, o como máximo alrededor de 0.5% de especies de alto peso molecular (HMW) .

En un aspecto diferente, la solicitud proporciona formulaciones de proteínas que comprenden un péptido/péptidos , una proteína/proteínas, o un péptido/péptidos y una proteína/proteínas, y alrededor de 0.5 mM hasta alrededor de 50 mM de metionina. En modalidades específicas, se añade la metionina a la formulación hasta una concentración final de 0.5 mM, 1 mM, 2.5 mM, 5 mM, 7.5 mM, 10 mM, 12.5 mM, 15 mM, 20 mM, 25 mM, 30 mM, 35 mM, 40 mM, y 45 mM. En algunas modalidades de este aspecto, la proteína de la formulación es un anticuerpo, una proteína de fusión Ig, un factor de coagulación, a receptor, un ligando, una enzima, un factor de transcripción, o un fragmento biológicamente activo de estas proteínas. En modalidades específicas, la proteína es un anticuerpo anti-B7.1, un anticuerpo anti-B7.2, un anticuerpo anti-CD22, una proteína de fusión PSGL-Ig, Factor VI la, Factor VIII, Factor IX, Factor X, Factor XI, Factor XII, Factor XIII, o un fragmento biológicamente activo de estas proteínas. En otras modalidades, la proteína tiene al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 96%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 98%, al menos alrededor de 99% identidad de secuencia de aminoácidos para un anticuerpo anti-B7.1, un anticuerpo anti-B7.2, un anticuerpo anti-CD22, una proteína de fusión PSGL-Ig, Factor Vlla, Factor VIII, Factor IX, Factor X, Factor XI, Factor XII, o Factor XIII. En algunas modalidades, la formulación comprende una solución amortiguadora. En modalidades especificas, la solución amortiguadora es una solución amortiguadora de histidina, una solución amortiguadora de citrato, una solución amortiguadora de succinato, o una solución amortiguadora Tris. En determinadas modalidades, la formulación tiene un pH de alrededor de 5.0 hasta alrededor de 8.0. En otras modalidades, la formulación tiene un pH de alrededor de 6.0 hasta alrededor de 7.5. En algunas modalidades, la formulación comprende otro agente que puede reducir la agregación de proteínas. La formulación puede comprender adicionalmente un azúcar, un tensoactivo, un agente de volumen, un crioprotector , un agente estabilizador, un anti-oxidante , o una combinación de estos. En algunas modalidades, el péptido ( s ) /proteína ( s ) de la formulación está a una concentración de alrededor de 0.1 mg/ml y alrededor de 300 mg/ml en la formulación. En otras modalidades, el péptido ( s ) /proteína ( s ) de la formulación está a una concentración de alrededor de 0.1 mg/ml y alrededor de 10 mg/ml en la formulación. En determinadas modalidades, la proteína se formula como un líquido, o un polvo secado por congelación. En determinadas modalidades, las formulaciones de proteínas se proporcionan como kits. Tales kits pueden incluir soluciones amortiguadoras, excipientes, e instrucciones para uso de la formulación de proteínas.

En otro aspecto, la solicitud proporciona métodos de tratamiento, prevención, y/o diagnóstico al usar las formulaciones de proteínas descritas en la presente.

BREVE DESCRIPCION DE LAS FIGURAS La Fig. la es una gráfica en barras que detalla el porcentaje inicial de especies de alto peso molecular (% HMW) en una formulación anti-B7.2 formulada en la presencia y ausencia de 10 mM de metionina (Met) y 0.01% polisorbato 80 (PS) a los niveles indicados de pH. La Fig. Ib es una gráfica en barras que detalla el % de especies de HMW en una formulación anti-B7.2 formulada en la presencia y ausencia de 10 mM de metionina (Met) y 0.01% polisorbato 80 (PS) a los niveles indicados de pH, después de 6 semanas de almacenamiento a 40°C. La Fig. le es una gráfica en barras que detalla el % de especies de HMW en una formulación anti-B7.2 formulada en la presencia y ausencia de 10 mM de metionina (Met) y 0.01% polisorbato 80 (PS) a los niveles indicados de pH, después de 12 semanas de almacenamiento a 40°C. La Fig. 2a es una gráfica en barras que detalla el % inicial de especies de HMW en una formulación de anticuerpo anti-B7.1 formulada en soluciones amortiguadoras de citrato, succinato e histidina (sobre diversos intervalos de pH) en la presencia y ausencia de 10 mM de metionina (Met) y 0.01% polisorbato 80 (PS) . La Fig. 2b es una gráfica en barras que detalla el % de especies de H W en una formulación de un anticuerpo anti-B7.1 formulada en soluciones amortiguadoras de citrato, succinato e histidina (sobre diversos intervalos de pH) en la presencia y ausencia de 10 mM de metionina (Met) y 0.01% polisorbato-80 (PS), después de 12 semanas de almacenamiento a 40°C. La Fig. 3a es una gráfica en barras que detalla el % de especies de HMW presentes en una formulación de un anticuerpo anti-CD22 después de almacenamiento por 1 mes a 36 meses a -80°C. La Fig. 3b es una gráfica en barras que detalla el % de especies de HMW presentes en una formulación de anticuerpo anti-CD22 después de almacenamiento por 1 mes a 36 meses a 25°C. La Fig. 4 es una gráfica que detalla el % de especies de HMW presentes en una formulación de proteínas PSGL-Ig, formuladas con o sin metionina, después de almacenamiento por hasta 4 semanas a - 80°C, 25°C, y 40°C. La Fig. 5 es una gráfica en barras que detalla el % de especies de HMW en una formulación de proteínas PSGL-Ig sometida a esfuerzo cortante en la presencia (S-I y S-2) o ausencia (C) de metionina. La Fig. 6 es una gráfica en barras que detalla la potencia de REFACTO® formulado en soluciones amortiguadoras de histidina o succinato, con o sin metionina, después de exposición a la luz y condiciones de obscuridad por un periodo de 1 mes. La Fig. 7 es una representación esquemática que muestra la correlación entre oxidación y multimerización de rhIL-11.

La Fig. 8 proporciona las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo anti-B7.1. Los enlaces bisulfuro intramoleculares predichos se ilustran por las conexiones de los residuos de cisteina involucrados. Las cisteinas esperadas para formar enlaces bisulfuro intermoleculares están subrayadas y se indica la conectividad . Los dos residuos alterados en la porción Fe que reducen la función del efector están en recuadros. El sitio de consenso de glicosilación ligado en N está en itálicas y negritas. La Fig. 9 proporciona las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo anti-B7.2. Los enlaces bisulfuro intramoleculares predichos se ilustran por las conexiones de los residuos de cisteina involucrados. Las cisteinas esperadas en formar enlaces bisulfuro intermoleculares están subrayadas y se indica la conectividad . Los dos residuos alterados en la porción Fe que reducen la función del efector están en recuadros. El sitio de consenso de glicosilación ligado en N está en itálicas y negritas.

La Fig. 10 proporciona las secuencias de aminoácidos de las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo anti-CD22. La secuencia subrayada es la secuencia de señal y las regiones determinantes de la complementariedad se muestran en negritas. Se subraya un sitio potencial para la glicosilación ligada en N. Las Figs. lla-llb proporcionan la secuencia del aminoácido de REFACTO® (ver, Sandberg H. et al., Structural and Functional Characterization of B-Domain Deleted Recombinant Factor VIII, Seminars in Hematology, Vol . 38, No. 2, Suppl. 4, pp 4-12, Abril 2001).

DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Los avances recientes en la biotecnología han proporcionado una amplia variedad de formulaciones de proteínas biológicamente activas para uso en el diagnóstico y terapia. Sin embargo, el desarrollo, producción, suministro, seguridad, y estabilidad de tales formulaciones de proteínas plantea desafíos importantes. Un problema principal con las formulaciones de proteínas es que pueden perder su actividad biológica como resultado de la formación de agregados solubles o insolubles. La agregación es un estado de proteína degradada y, por lo tanto, al minimizarlo resulta en una vida de anaquel, potencia, o actividad mejoradas de una formulación de proteínas.

Esta solicitud se refiere generalmente al descubrimiento de que la adición del aminoácido de metionina a una formulación de proteínas hasta una concentración final de entre alrededor de 0.5 mM hasta alrededor de 145 mM, reduce la agregación de la proteína o proteínas en la formulación, con lo que se incrementa el tiempo de conservación y se mantiene la actividad biológica de la formulación relativa a las formulaciones de proteínas preparadas sin metionina.

Factores que Afectan la Agregación de Proteínas Las proteínas tienen una amplia variedad de usos farmacéuticos, biotecnológicos y de investigación. En diversas etapas en cualquiera de estos usos, se pueden agregar las proteínas. Por "agregado" significa una interacción física entre moléculas de proteínas que resulta en la formación de dímeros u oligómeros covalentes o no covalentes, los cuales pueden permanecer solubles, o formar agregados insolubles que se precipiten de la solución. El término "proteína, " como se usa en la presente, abarca un péptido, un polipéptido, una proteína, y una proteína de fusión. Las proteínas se pueden hacer por métodos recombinantes o sintéticos. Muchos factores diferentes pueden provocar la agregación de una proteína en una formulación de proteínas. Los procedimientos típicos de purificación y almacenamiento pueden exponer a las formulaciones de proteínas a condiciones y componentes que provocan que se agregue la proteína. Por ejemplo, las proteínas en una formulación de proteínas se pueden agregar como resultado de alguno o más de los siguientes: almacenamiento, exposición a temperaturas elevadas, el pH de la formulación, la resistencia iónica de la formulación, y la presencia de determinados tensoactivos {por ejemplo, polisorbato 20 y polisorbato 80) y agentes emulsificantes . El término "durante almacenamiento," como se usa en la presente, significa una formulación que se prepara una vez, no se usa inmediatamente; más bien, después de su preparación, se empaca para almacenamiento, ya sea en una forma líquida, en un estado congelado, o en forma seca para reconstitución posterior en una forma líquida u otra forma. Por "temperatura elevada" significa cualquier temperatura arriba de la temperatura a la cual se almacena normalmente la proteína . Similarmente, las proteínas se pueden agregar cuando se exponen al esfuerzo cortante, tal como, reconstituir una torta de proteína liofilizada en solución, purificación por filtro de una muestra de proteínas, congelación-deshielo, sacudida, o transferencia de una solución de proteínas por medio de jeringa. La agregación también puede suceder como resultado de las interacciones de las moléculas de polipéptidos en solución y en las interfases de líquido-aire dentro de viales de almacenamiento. Los cambios en la conformación pueden presentarse en polipéptidos adsorbidos a las interfaes aire-liquido y sólido-l+iquido durante la compresión o extensión de las interfases que resultan de la agitación durante el transporte. Tal agitación puede provocar que se agregue la proteina de una formulación y finalmente precipite con otras proteínas adsorbidas. Además, la exposición de una formulación de proteínas a la luz puede provocar que se agregue la proteína. La exposición a la luz puede crear especies reactivas que faciliten la agregación. En algunas modalidades, la luz es luz fluorescente. En otras modalidades, la luz es luz solar. En modalidades adicionales, la luz es luz UV. Adicionalmente , el empaque de la formulación de proteínas puede impactar la agregación de proteínas. Los niveles de metales en trazas (niveles en ppm de cobre, hierro, cobalto, manganeso) pueden lixiviarse del recipiente de empaque, promoviendo la hidrólisis del enlace amida, y resultando finalmente en la agregación de proteínas. La presente solicitud proporciona métodos y composiciones que reducen la agregación de proteínas al controlar uno o más de los mecanismos de agregación antes mencionados. Este puede resultar en, por ejemplo, estabilidad mejorada del producto, y mayor flexibilidad en los procesos de manufactura y condiciones de almacenamiento.

Métodos de Reducción de la Agregación de una Proteína en una Formulación de Proteínas Esta solicitud se refiere generalmente al descubrimiento de que la adición del aminoácido de metionina a una formulación puede reducir la agregación de una proteína o proteínas en la formulación. La reducción en la agregación es relativa a una formulación idéntica, excepto la carencia de metionina. Para reducir la agregación, se añade la metionina a la formulación hasta una concentración final de entre alrededor de 0.5 mM hasta alrededor de 145 mM. Como se usa en esta solicitud, "alrededor de" significa un valor numérico que tiene un intervalo de + 25% alrededor del valor citado. En algunas modalidades, la metionina se añade hasta una concentración final de entre alrededor de 0.5 mM hasta alrededor de 10 mM. En otras modalidades, la metionina se añade hasta una concentración final de entre alrededor de 0.5 mM hasta alrededor de 15 mM. En algunas modalidades, la metionina se añade hasta una concentración final de entre alrededor de 2.5 mM hasta alrededor de 10 mM. En algunas modalidades, la metionina se añade hasta una concentración final de entre alrededor de 2.5 mM hasta alrededor de 15 mM. En otras modalidades, la metionina se añade hasta una concentración final de entre alrededor de 5 mM hasta alrededor de 15 mM. En algunas modalidades, la metionina se añade hasta una concentración final de entre alrededor de 5 mM hasta alrededor de 25 mM. En algunas otras modalidades, la metionina se añade hasta una concentración final de entre alrededor de 0.5 mM hasta alrededor de 25 mM. En determinadas modalidades, la metionina se añade hasta una concentración final de entre alrededor de 0.5 mM hasta alrededor de 50 mM . En otras modalidades, la metionina se añade hasta una concentración final de entre alrededor de 50 mM hasta alrededor de 100 mM. En otras determinadas modalidades, la metionina se añade hasta una concentración final de entre alrededor de 100 mM hasta alrededor de 145 mM. Todavía en otras modalidades, la metionina se añade hasta una concentración final de entre alrededor de 100 mM hasta alrededor de 140 mM. Todavía en otras modalidades, la metionina se añade hasta una concentración final de entre alrededor de 100 mM hasta alrededor de 135 mM. Todavía en modalidades adicionales, la metionina se añade hasta una concentración final de entre alrededor de 100 mM hasta alrededor de 125 mM. En otras modalidades, la metionina se añade hasta una concentración final de entre alrededor de 5 mM hasta alrededor de 50 mM. En algunas modalidades, la metionina se añade hasta una concentración final de entre alrededor de 5 mM hasta alrededor de 25 mM. En modalidades específicas, la metionina se añade a una formulación de proteínas hasta una concentración final de alrededor de 0.5 mM, alrededor de lmM, alrededor de 2 mM, alrededor de 3 mM, alrededor de 4 mM, alrededor de 5 mM, alrededor de 6 mM, alrededor de 7 mM, alrededor de 8 mM, alrededor de 9 mM, alrededor de 10 mM, alrededor de 11 mM, alrededor de 12 mM, alrededor de 13 mM, alrededor de 14 mM, alrededor de 15 mM, alrededor de 16 mM, alrededor de 17 mM, alrededor de 18 mM, alrededor de 19 mM, alrededor de 20 mM, alrededor de 21 mM, alrededor de 22 mM, alrededor de 23 mM, alrededor de 24 mM, alrededor de 25 mM, alrededor de 26 mM, alrededor de 27 mM, alrededor de 28 mM, alrededor de 29 mM, alrededor de 30 mM, alrededor de 31 mM, alrededor de 32 mM, alrededor de 33 mM, alrededor de 34 mM, alrededor de 35 mM, alrededor de 36 mM, alrededor de 37 mM, alrededor de 38 mM, alrededor de 39 mM, alrededor de 40 mM, alrededor de 41 mM, alrededor de 42 mM, alrededor de 43 mM, alrededor de 44 mM, alrededor de 45 mM, alrededor de 46 mM, alrededor de 47 mM, alrededor de 48 mM, alrededor de 49 mM, o alrededor de 50 mM . Independientemente de lo que provoca que se agregue una proteina de una formulación, la adición de metionina reduce la agregación de la proteina o proteínas en la formulación. En determinadas modalidades, la adición de metionina reduce la agregación en una formulación provocada por el almacenamiento, exposición a temperaturas elevadas, exposición a la luz, exposición al esfuerzo cortante, la presencia de tensoactivos, pH y condiciones iónicas, y algunas combinaciones de los mismos.

El método antes descrito se puede usar para disminuir la agregación de proteínas formuladas en una forma líquida o seca. La agregación reducida se observa en una formulación líquida, ya sea almacenada directamente en esa forma para uso posterior, almacenado en un estado congelado y deshielado previo al uso, o preparado en una forma seca, tal como una forma liofilizada, secada al aire o secada por rocío, para reconstitución posterior en una forma líquida u otra forma previo al uso. El nivel de agregación de proteínas en una formulación se puede medir antes, sustancialmente al mismo tiempo que, después de, la adición, de metionina a la formulación. En determinadas modalidades, el nivel de agregación se mide al menos una vez entre alrededor de 1 día y alrededor de 12 semanas después de la adición de metionina a la formulación. En otras modalidades, el nivel de agregación se mide al menos una vez entre alrededor de 1 mes y 36 meses después de la adición de metionina a la formulación. En determinadas modalidades, los métodos descritos en la presente resultan en una reducción de alrededor de 5%, alrededor de 10%, alrededor de 15%, alrededor de 20%, alrededor de 25%, alrededor de 30%, alrededor de 35%, alrededor de 40%, alrededor de 45%, alrededor de 50%, alrededor de 55%, alrededor de 60%, alrededor de 65%, alrededor de 70%, alrededor de 75%, alrededor de 80%, alrededor de 85%, o alrededor de 90% del % de especies de HMW comparado con formulaciones que carecen de metionina. En modalidades especificas, el método de adición de entre alrededor de 1 mM hasta alrededor de 145 mM de metionina a una formulación de proteínas resulta en la formulación que tiene como máximo alrededor de 5%, como máximo alrededor de 4%, como máximo alrededor de 3%, como máximo alrededor de 2%, como máximo alrededor de 1%, o como máximo alrededor de 0.5% de especies de HMW. En otras modalidades específicas, el método de adición de entre alrededor de 1 mM hasta alrededor de 145 mM de metionina a una formulación de proteínas resulta en la formulación que tiene alrededor de 5%, alrededor de 4%, alrededor de 3%, alrededor de 2%, alrededor de 1%, o alrededor de 0.5% de especies de HMW. En otras modalidades, el método de adición de entre alrededor de 1 mM a alrededor de 145 mM de metionina a una formulación de proteínas resulta en la formulación que tiene entre alrededor de 0.5% hasta alrededor de 5% de especies de HMW. La formulación de proteínas puede además comprender uno o más agentes que reducen la agregación de la proteína de la formulación. En algunas modalidades, el agente que reduce la agregación de la proteína de la formulación es un aminoácido. En modalidades específicas, el aminoácido es arginina, lisina, glicina, ácido glutámico, o ácido aspártico. En algunas modalidades, el aminoácido se añade a una formulación de proteínas hasta una concentración de desde alrededor de 0.5 mM hasta alrededor de 200 m . En algunas modalidades, el aminoácido se añade a una formulación de proteínas hasta una concentración de desde alrededor de 5 mM hasta alrededor de 100 mM. En algunas otras modalidades, el aminoácido se añade a una formulación de proteínas hasta una concentración de desde alrededor de 5 mM hasta alrededor de 125 mM. En otras determinadas modalidades, el aminoácido se añade a una formulación de proteínas hasta una concentración de desde alrededor de 0.5 mM hasta alrededor de 50 mM. Todavía en otras modalidades, el aminoácido se añade a una formulación de proteínas hasta una concentración de desde alrededor de 0.5 mM hasta alrededor de 25 mM. El agente que reduce la agregación de la proteína de la formulación también puede ser una combinación de agentes quelantes de metales. En modalidades específicas, los agentes quelantes de metales son DTFA, EGTA y DEF. En algunas modalidades, la concentración de DTPA o EGTA en la formulación de proteínas es desde alrededor de 1 µ? hasta alrededor de 10 mM, desde alrededor de 1 µ? hasta alrededor de 5 mM, desde alrededor de 10 µ? hasta alrededor de 10 mM, 50 µ? hasta alrededor de 5 mM, o desde alrededor de 75 µ? hasta alrededor de 2.5 mM. En algunas modalidades, la concentración de DEF en la formulación de proteínas es desde alrededor de 1 µ? hasta alrededor de 10 mM, desde alrededor de 1 µ? hasta alrededor de 5 mM, desde alrededor de 10 µ? hasta alrededor de 1 mM, o desde alrededor de 20 µ? hasta alrededor de 250 µ?. El agente que reduce la agregación de la proteina de la formulación también puede ser un secuestrante de radicales libres, especialmente un secuestrante de radicales de oxigeno. En modalidades especificas, el secuestrante de radicales libres es manitol o histidina. En algunas modalidades, la concentración de manitol en la formulación de proteínas es desde alrededor de 0.01% hasta alrededor de 25%, desde alrededor de 0.1% hasta alrededor de 25%, desde alrededor de 0.5% hasta alrededor de 15%, o desde alrededor de 1% hasta alrededor de 5%. En algunas modalidades, la concentración de histidina en la formulación de proteínas es desde alrededor de 10 µ? hasta alrededor de 200 mM, desde alrededor de 100 µ? hasta alrededor de 200 mM, desde alrededor de 500 µ? hasta alrededor de 100 mM, o desde alrededor de 15 mM hasta alrededor de 35 mM. En otras modalidades, el agente que reduce la agregación de la proteína de la formulación es una combinación de un agente quelante de metales y un secuestrante de radicales libres. En algunas modalidades, el agente que reduce la agregación de una proteína o proteínas en una formulación es citrato. En determinadas modalidades, la concentración de citrato en la formulación de proteínas es desde alrededor de 0.5 mM hasta alrededor de 50 mM, desde alrededor de 0.5 mM hasta alrededor de 25 mM, desde alrededor de 1 mM hasta alrededor de 35 mM, desde alrededor de 5 mM hasta alrededor de 25 mM, or desde alrededor de 5 mM hasta alrededor de 10 mM.

Métodos para Evaluar los Niveles de Agregación de Proteínas Se pueden usar diferentes métodos analíticos para detectar la presencia y los niveles de agregados en una formulación de proteínas. Estos incluyen, pero no se limitan a, electroforesis de gel de poliacrilamida nativo (PAGE), electroforesis de gel de poliacrilamida de dodecil sulfato de sodio (SDS-PAGE), electroforesis de gel capilar (CGE) , cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) , ultracentrifugación analítica (AUC) , fraccionamiento con flujo de campo (FFF), detección por dispersión de luz, velocidad de sedimentación, espectroscopia UV, calorimetría de barrido diferencial, turbidimetría , nefelometría, microscopía, cromatografía líquida de alta resolución-cromatografía de exclusión de tamaño (SEC-HPLC), cromatografía líquida de alta resolución-fase inversa (RP-HPLC) , espectroscopia de masas en tándem por ionización de electrorocío (ESI-MS), y RP-HPLC/ESI-MS en tándem. Estos métodos se pueden usar ya sea solos, o en combinación. Un problema común con las formulaciones de proteínas es la acumulación irreversible de agregados con el tiempo, factor térmico, o esfuerzo cortante. Típicamente, cuando se precipita el agregado, forma partículas grandes que son fáciles de detectar. Los agregados solubles no covalentes, más pequeños, sin embargo, que son a menudo precursores para precipitar partículas grandes son más difíciles de cuantificar y detectar. Así, los métodos para detectar y cuantificar la agregación de proteínas en una formulación de proteínas necesitan basarse en el tipo de agregado que se evalúe . Entre los métodos anteriores, los métodos sugeridos para determinar la presencia y/o cantidades de agregados solubles, covalentes en una formulación de proteínas son: SEC/dispersión de luz, SDS-PAGE, CGE, RP-HPLC/ESI-MS, FFF y AUC . Los métodos sugeridos para determinar la presencia y/o cantidades de agregados solubles, no covalentes en una formulación de proteínas son: SEC, PAGE, SDS-PAGE, CGE, FFF, AUC, y dispersión dinámica de luz. Los métodos sugeridos para determinar la presencia y/o cantidades de agregados insolubles, no covalentes en una formulación de proteínas son: espectroscopia UV, turbidimetría , nefelometría, microscopía, AUC, y dispersión dinámica de luz.

Proteínas Cualquier proteína susceptible a agregación, incluyendo anticuerpos, proteínas de fusión de inmunoglobulinas , factores de coagulación, receptores, ligandos, enzimas, factores de transcripción, o fragmentos biológicamente activos del mismo, se pueden proteger por los métodos y composiciones de esta solicitud. La fuente o manera en la cual se obtiene o produce la proteina (por ejemplo, ya sea aislada de células o fuentes de tejidos por un esquema de purificación apropiado, producido por técnicas recombinantes de ADN, o sintetizadas químicamente al usar técnicas estándar de síntesis de péptidos) no es material para el método enseñado por esta solicitud. De esta manera, una amplia variedad de proteínas nativas, sintéticas, y/o recombinantes, incluyendo proteínas de fusión y/o quiméricas, se puede proteger de la agregación por los métodos y composiciones de esta solicitud. La proteína de interés a formularse incluye, pero no se limita a, proteínas tales como, PSGL-Ig; GPIb-Ig; GPIIblIIa-Ig; IL-13R-Ig; IL-21R-Ig; Factor Vlla; Factor VIII; Factor VIIIC; Factor IX; Factor X; Factor XI; Factor XII; Factor XIII; factor de tejido; factor de von illebrands; factores anticoagulación tales como Proteína C; factor atrial natriurético ; miostatina/GDF-8; interleucinas (ILs), por ejemplo, IL-I a IL-15; hormona de crecimiento humana y hormona de crecimiento bovino; factor liberador de la hormona del crecimiento; paratirina; hormona estimuladora de la tiroides; uricasa; bikunina; bilirrubina oxidasa; subtilisina; lipoproteínas ; a-1-antitripsina; insulina de cadena A; insulina de cadena B; proinsulina; hormona estimuladora del folículo; calcitonina; hormona luteinizante; glucagón; tensoactivo del pulmón; un activador de plasminógeno, tal como urocinasa o activador de plasminógeno del tipo tejido (t-PA) ; bombazina; trombina; plasmina, miniplasmina ; microplasmina ; factor de necrosis de tumor y ß; encefalinasa; RANTES (regulado en la activación normalmente de células T expresadas y segregadas); proteína inflamatoria de macrófago humano (???-1-a) ; albúmina de suero tal como albúmina de suero humano; sustancia inhibidora muleriana; relaxina de cadena A; relaxina de cadena B; prorelaxina; péptido asociado con gonadotropina de ratón; DNasa; inhibina; activina; factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) ; factor de crecimiento de la placenta (P1GF); receptores para hormonas o factores de crecimiento; una integrina; proteína A o D; factores reumatoides; un factor neurotrófico tal como factor neurotrófico derivado de los huesos (BDNF), neurotrofina 3, 4, 5, o 6 (NT-3, NT-4, NT-5, o NT- 6) , o un factor de crecimiento de los nervios tal como NGF-ß; factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) ; factor de crecimiento de fibroblastos tal como aFGF y bFGF; factor (EGF) ; factor de crecimiento de transformación (TGF) tal como TGF-a y TGF-ß, incluyendo TGF- ß 1, TGF-ß 2, TGF-ß 3, TGF-ß 4, o TGF- ß 5; factor I y II de crecimiento de tipo insulina (IGF-I y IGF-II); des ( 1-3 ) -IGF-I (IGF-I de cerebro); proteínas de enlace del factor de crecimiento de tipo insulina; proteínas CD tales como: CD2 , CD3, CD4 , CD8, CD9, CD19, CD20, CD22, CD28, CD34, y CD45; eritropoietina (EPO) ; trombopoietina (TPO) ; factores osteoinductores ; immunotoxinas ; una proteína morfogenética del hueso (BMP); un interferón tal como interferón a, ß, y ?; factores estimuladores de las colonias (CSFs) , por ejemplo, M-CSF, GM-CSF, y G-CSF; superóxido dismutasa; receptores de células T; miembros de la familia del receptor HER tales como el receptor EGF, receptor HER2, HER3 o HER4 ; moléculas de adhesión celular tal como LFA-I, VLA-4, ICAM-I, y VCAM; IgE; antígenos del grupo sanguíneo; receptor flk2/flt3; receptor de la obesidad (OB) ; factor acelerador del decaimiento (DAF); un antígeno viral tal como, las proteínas gag, env, pol, tat, o rev del VIH; receptores de alojamiento; adresinas; inmunoadhesinas ; y fragmentos biológicamente activos o variantes de cualquiera de los polipéptidos antes listados. El término "fragmento biológicamente activo" significa un fragmento de una proteína que retiene al menos una de las funciones de la proteína a partir de la cual se deriva. Un fragmento biológicamente activo de un anticuerpo incluye un fragmento de enlace a antígenos del anticuerpo; un fragmento biológicamente activo de un receptor incluye un fragmento del receptor que se puede enlazar todavía a su ligando; un fragmento biológicamente activo de un ligando incluye esa porción de un ligando que puede enlazar todavía a su receptor; y un fragmento biológicamente activo de una enzima incluye esa porción de la enzima que puede catalizar todavía una reacción catalizada por la enzima de longitud completa. En determinadas modalidades, un fragmento biológicamente activo retiene al menos alrededor de 25%, 50%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, o 95% de la función de la proteína a partir de la cual se deriva. La función de una proteína se puede ensayar por métodos bien conocidos (por ejemplo, prueba de las interacciones de anticuerpo-antígeno, prueba de las interacciones de ligando-receptor, prueba de la actividad enzimática, prueba de la actividad de la transcripción, o prueba de las interacciones de ADN-proteína ) . En determinadas modalidades, la proteína a formularse es un anticuerpo. El anticuerpo se puede formular para, y enlazarse a, cualquiera de las proteínas antes mencionadas. En determinadas modalidades específicas, los anticuerpos incluyen un anticuerpo anti-B7.1, un anticuerpo anti-B7.2, un anticuerpo anti-CD22, un anticuerpos anti-miostatina (por ejemplo, solicitud E.U. No. 60/752,660), un anticuerpo anti-IL-11, un anticuerpo anti-IL-12 (por ejemplo, solicitud E.U. No. 60/752,660), y un anticuerpo anti-IL-13 (por ejemplo, solicitud E.U. No. 60/752,660). En otras modalidades específicas, los anticuerpos incluyen un anticuerpo que tiene al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 96%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 98%, o al menos alrededor de 99% de identidad de secuencia de aminoácidos para un anticuerpo anti-B7.1, un anticuerpo anti-B7.2, un anticuerpo anti-CD22, un anticuerpo ant i-miostatina (por ejemplo, solicitud E.U. No. 60/752,660), un anticuerpo anti-IL-11, un anticuerpo anti-IL-12 (por ejemplo, solicitud E.U. No. 60/752,660), o un anticuerpo anti-IL-13 (por ejemplo, solicitud E.U. No. 60/752,660), y mantener la capacidad de enlazar a los antigenos respectivos. La identidad de secuencia de aminoácidos entre dos proteínas se puede medir de acuerdo con métodos estándar (ver, por ejemplo, Pearson y Lipman, Proc. Nati. Acad. Sd. USA 85:244 -2448, 1998; George, D.G. et al, en Macromolecular Sequencing and Synthesis, Selected Methods and Applications, pps . 127-149, Alan R. Liss, Inc. 1988; Feng y Doolittle, Journal of Molecular Evolution 25:351-360, 1987; Higgins y Sharp, CABIOS 5:151-153, 1989; y los diversos programas BLAST de la NCBI, NLM, Bethesda, MD) . El término "anticuerpo" como se usa en la presente, incluye anticuerpos policlonales , anticuerpos monoclonales , composiciones de anticuerpos con especificidades de poliepítopos , anticuerpos biespecí fieos, diacuerpos, u otras preparaciones purificadas de anticuerpos y anticuerpos recombinantes . Los anticuerpos pueden ser anticuerpos completos, por ejemplo, de cualquier isotipo (IgG, IgA, IgE, IgM, etc.), o fragmentos de los mismos, los cuales se enlazan al antigeno de interés. En determinadas modalidades, el anticuerpo a formularse es un anticuerpo que tiene el isotipo IgG. Los anticuerpos recombinantes incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos monoclonales humanizados y quiméricos, que comprenden tanto porciones humanas como no humanas, anticuerpos de cadena sencilla y anticuerpos multi-específicos. Un anticuerpo quimérico es una molécula en la cual se derivan diferentes porciones de diferentes especies animales, tales como aquellas que tienen una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal murino y una región constante de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos de cadena sencilla tienen un sitio de enlace a antígenos y consisten de un polipéptido sencillo. Los anticuerpos multi-específicos son moléculas de anticuerpos que tienen al menos dos sitios de enlace a antígenos que enlazan específicamente a antígenos diferentes. Los anticuerpos se pueden fragmentar al usar técnicas convencionales y seleccionarse los fragmentos para enlace al antígeno de interés. Preferiblemente, un fragmento de anticuerpos comprende la región de enlace a antígenos y/o la región variable del anticuerpo intacto. Así, el término fragmento de anticuerpos incluye segmentos de porciones preparadas recombinantemente o escindidas proteoliticamente de una molécula de anticuerpos que pueden enlazar selectivamente a determinada proteina. Ejemplos no limitativos de tales fragmentos proteoliticos y/o recombinantes incluyen Fab, F(ab' )2/ Fab ' , Fd, Fv, dAb, un CDR aislado, y anticuerpos de cadena sencilla (scFv) que contienen un dominio VL y/o VH unido por una ligadura de péptidos. Los scFv se pueden ligar de forma covalente o no covalente para formar anticuerpos que tienen dos o más sitios de enlace. En algunas modalidades, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humanizado. El término "anticuerpo monoclonal humanizado" como se usa en la presente, es un anticuerpo monoclonal de una fuente no humana (receptor) que se ha alterado para contener al menos uno o más de los residuos del aminoácido encontrados en el anticuerpo monoclonal humano equivalente (donador). En determinadas modalidades, los anticuerpos humanizados tienen una o más regiones determinantes de la complementariedad (CDRs) de especies no humanas y una región de andamiaje de una molécula humana de inmunoglobulina . Un "anticuerpo monoclonal completamente humanizado" es un anticuerpo monoclonal a partir de una fuente no humana que se ha alterado para contener todos los residuos de aminoácido encontrados en la región de enlace a antigenos del anticuerpo monoclonal humano equivalente. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no se encuentra ya sea en el anticuerpo receptor o el anticuerpo donador. Estas modificaciones se pueden hacer para refinar además y optimizar la funcionalidad de los anticuerpos. El anticuerpo humanizado puede comprender también opcionalmente al menos una porción de una región constante de inmunoglobulina humana (Fe). En algunas modalidades, la proteina a formularse es una proteina de fusión. En una modalidad, la proteina de fusión es una proteina de fusión de inmunoglobulina (Ig) . Una proteina de fusión Ig es una proteina que comprende una porción sin Ig ligada a una porción Ig que se deriva de la región constante de una inmunoglobulina. En una modalidad especifica, la proteina de fusión comprende la región constante de cadena pesada IgG. En otra modalidad, la proteina de fusión comprende una secuencia de aminoácidos que corresponde a la articulación, regiones CH2 y CH3 de la inmunoglobulina humana Cyl . Ejemplos no limitativos de las proteínas de fusión Ig incluyen PSGL-Ig (ver, patente de E.U.A. No. 5,827,817), GPIb-Ig (ver, WO 02/063003), GPIIbIIIa-Ig, IL-13R-Ig (ver, patente de E.U.A. No. 6,268,480), TNFR-Ig (ver, WO 04/008100), IL-21R-Ig, CTLA4-Ig y VCAM2D-IgG. Los métodos de elaboración de las proteínas de fusión son bien conocidos en la técnica (por ejemplo, patentes de E.U.A. Nos. 5,516,964; 5,225,538; 5,428,130; 5,514,582; 5,714,147; 6,136,310; 6,887,471; y 6,482,409). En algunas modalidades, las proteínas de la formulación incluyen proteínas de fusión que tienen al menos alrededor de 85%, al menos alrededor de 90%, al menos alrededor de 95%, al menos alrededor de 96%, al menos alrededor de 97%, al menos alrededor de 98%, o al menos alrededor de 99% de identidad de secuencia de aminoácidos para PSGL-Ig (ver, patentes de E.U.A. No. 5,827,817), GPIb-Ig (ver, WO 02/063003), GPIIbIIIa-Ig, IL-13R-Ig (ver, patente de E.U. No. 6,268,480), TNFR-Ig (ver, WO 04/008100), IL-21R-Ig, CTLA4-Ig y VCAM2D-IgG, y las cuales conservan su capacidad para enlazar a los ligandos respectivos. La formulación puede contener más de una proteína necesaria para el tratamiento, o diagnóstico de, una enfermedad o trastorno en particular. Las proteínas adicionales se escogen debido a que tienen actividades complementarias con las otras proteínas en la formulación, y no afectan adversamente a las otras proteínas en la formulación. Además, la formulación de proteínas puede también contener sustancias que no son de proteínas que sonde uso en la utilidad final de la formulación de proteínas. Por ejemplo, se puede añadir sacarosa para potenciar la estabilidad y solubilidad de la proteína en solución; y se puede añadir histidina para proporcionar una capacidad apropiada de solución amortiguadora. En determinadas modalidades, la proteína a formularse es esencialmente pura y/o esencialmente homogénea (es decir, sustancialmente libre de proteínas contaminantes, etc) . El término proteína "esencialmente pura" significa una composición que comprende al menos alrededor de 90% en peso de la fracción de proteína, preferiblemente al menos alrededor de 95% en peso de la fracción de proteína. El término proteína "esencialmente homogénea" significa una composición que comprende al menos alrededor de 99% en peso de la fracción de proteína, excluir la masa de diversos estabilizadores y agua en solución. Las proteínas a formularse se pueden conjugar con una citotoxina, un agente terapéutico, o un ión de metal radioactivo. En una modalidad, la proteína que se conjuga es un anticuerpo o fragmento del mismo. Una citotoxina o agente citotóxico incluye cualquier agente que sea perjudicial para las células. Los ejemplos no limitativos incluyen, caliqueamicina , taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etopósido, tenopósido, vincristina, vinblastina, colquicina, doxorubicina , daunorubicina , dihidroxi antracin diona, mitoxantroña , mitramicina, actinomicina D, 1-deshidrotestosterona , glucocorticoides, procaina, tetracaina, lidocaina, propranolol, puromicina, y análogos, u homólogos de los mismos. Los agentes terapéuticos incluyen, pero no se limitan a, antimetabolitos (por ejemplo, metotrexato, 6-mercaptopurina , 6-tioguanina , citarabina, y 5-fIuorouracil decarbazina ) , agentes alquilantes (por ejemplo, mecloretamina , tioepa clorambucil, melfalan, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU) , ciclofosfamida , busulfan, dibromomanitol , estreptozotocina, mitomicina C, y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP), cisplatina), antraciclinas (por ejemplo, daunorubicina y doxorubicina) , antibióticos (por ejemplo, dactinomicina , bleomicina, mitramicina, y antramicina ) , y agentes anti-mitóticos (por ejemplo, vincristina y vinblastina ) . Las técnicas para conjugar tales porciones a las proteínas son bien conocidas en la técnica.

Formulaciones La composición de una formulación se determina por la consideración de diversos factores incluyendo, pero no limitado a: la naturaleza de la proteína (s) (por ejemplo, receptor, anticuerpo, proteínas de fusión de Ig, enzima, etc.); la concentración de la proteína; el intervalo deseado del pH; cómo se va a almacenar la formulación de proteínas; el periodo que se va a almacenar la formulación de proteínas; y si se va a administrar y cómo la formulación de proteínas a un paciente. Concentración de la proteína en la formulación La concentración de la proteína en la formulación depende del uso final de la formulación de proteínas. Las concentraciones de proteínas en las formulaciones descritas en la presente están generalmente entre alrededor de 0.5 mg/ml y alrededor de 300 mg/ml, por ejemplo, entre alrededor de 0.5 mg/ml y alrededor de 25 mg/ml, entre alrededor de 5 mg/ml y alrededor de 25 mg/ml, entre alrededor de 10 mg/ml y alrededor de 100 mg/ml , entre alrededor de 25 mg/ml y alrededor de 100 mg/ml , entre alrededor de 50 mg/ml y alrededor de 100 mg/ml , entre alrededor de 75 mg/ml y alrededor de 100 mg/ml , entre alrededor de 100 mg/ml y alrededor de 200 mg/ml , entre alrededor de 125 mg/ml y alrededor de 200 mg/ml , entre alrededor de 150 mg/ml y alrededor de 200 mg/ml , entre alrededor de 200 mg/ml y alrededor de 300 mg/ml , y entre alrededor de 250 mg/ml y alrededor de 300 mg/ml. Las formulaciones de proteínas se pueden usar para propósitos terapéuticos. De esta manera, la concentración de la proteína en una formulación se determina con base en suministrar la proteína en una dosificación y volumen que se tolere por, y de valor terapéutico para el paciente. Si la formulación de proteínas se va a administrar por una inyección de volumen pequeño, la concentración de la proteína dependerá del volumen de inyección (usualmente 1.0-1.2 mL) . Las terapias basadas en proteínas requieren usualmente de varios mg/kg de dosificación por semana, por mes, o por varios meses. De esta manera, si se va a suministrar una proteina a 2-3 mg/kg de peso corporal del paciente, y un paciente promedio pesa 75 kg, se necesitarán administrar 150-225 mg de la proteina en un volumen de inyección de 1.0-1.2 mL, o el volumen necesitará incrementarse para acomodar una concentración inferior de proteínas. Soluciones amortiguadoras El término "solución amortiguadora" como se usa en la presente, incluye aquellos agentes que mantienen el pH de la solución en un intervalo deseado. El pH de una formulación como se describe en la presente está generalmente entre alrededor de pH 5.0 hasta alrededor de 9.0, por ejemplo, alrededor de pH 5.5 hasta alrededor de 6.5, alrededor de pH 5.5 hasta alrededor de 6.0, alrededor de pH 6.0 hasta alrededor de 6.5, pH 5.5, pH 6.0, o pH 6.5. En general, se usa una solución amortiguadora que pueda mantener una solución a un pH de 5.5 a 6.5. Ejemplos no limitativos de soluciones amortiguadoras que se pueden usar en una formulación descrita en la presente incluyen, histidina, succinato, gluconato, tris ( trometamol ) , Bis-Tris, MOPS, ACES, BES, TES, HEPES, EPPS, etilendiamina , ácido fosfórico, ácido maleico, fosfato, citrato, ácido 2-morfolinoetansulfónico (MES), fosfato de sodio, acetato de sodio, y cacodilato. La histidina es una solución amortiguadora que se prefiere en formulaciones que se van a administrar por inyección subcutánea, intramuscular, o peritoneal. La concentración de la solución amortiguadora es entre alrededor de 5 mM y 30 mM. En una modalidad, la solución amortiguadora de una formulación es histidina a una concentración de alrededor de 5 mM hasta alrededor de 20 mM. Excipientes Además de la proteina, metionina, y solución amortiguadora, una formulación como se describe en la presente también puede contener otras sustancias. Estas sustancias incluyen, pero no se limitan a, crioprotectores , lioprotectores , tensoactivos , agentes de volumen, antioxidantes, y agentes estabilizadores. En una modalidad, una formulación de proteina como se describe en la presente incluye un excipiente seleccionado del grupo que consiste de un crioprotector , un lioprotector , un tensoactivo, un agente de volumen, un anti-oxidante , un agente estabilizador, y combinaciones de los mismos. El término "crioprotector" como se usa en la presente, incluye agentes que proporcionan estabilidad a la proteina contra tensiones inducidas por la congelación, al excluirse preferiblemente de la superficie de la proteina. Los crioprotectores también pueden ofrecer protección durante el secado primario y secundario y el almacenamiento de producto de largo plazo. Ejemplos no limitativos de crioprotectores incluyen azúcares, tal como sacarosa, glucosa, trehalosa, manitol, mannose, y lactosa; polímeros, tal como dextrano, almidón de hidroxietilo y polietilen glicol; tensoactivos , tal como polisorbatos (por ejemplo, PS-20 or PS-80) ; y aminoácidos, tal como glicina, arginina, leucina, y serina. Se usa generalmente un crioprotector que muestra una baja toxicidad en sistemas biológicos. El crioprotector, si se incluye en la formulación, se añade hasta una concentración final de entre alrededor de 1% y alrededor de 10% (peso/volumen). En una modalidad, el crioprotector es sacarosa a una concentración de entre alrededor de 0.5% y alrededor de 10% (peso/volumen) . En una modalidad, un lioprotector se añade a una formulación aquí descrita. El término "lioprotector" como se usa en la presente, incluye agentes que proporcionan estabilidad a la proteina durante el proceso de deshidratación o secado por congelación (ciclos primarios y secundarios de secado por congelación) , al suministrar una matriz vidriosa amorfa y al enlazar con la proteina a través de enlace de hidrógeno, reemplazando las moléculas de agua que se remueven durante el proceso de secado. Esto ayuda a mantener la conformación de la proteina, minimizar la degradación de la proteina durante el ciclo de liofilización, y mejorar la estabilidad del producto a largo plazo. Ejemplos no limitativos de lioprotectores incluyen azúcares, tal como sacarosa o trehalosa; un aminoácido, tal como glutamato de monosodio, glicina o histidina no cristalina; una metilamina, tal como betaina; una sal liotrópica, tal como sulfato de magnesio; un poliol, tal como alcoholes de azúcar superior o trihídricos, por ejemplo, glicerina, eritritol, glicerol, arabitol, xilitol, sorbitol, y manitol; propilen glicol; polietilen glicol; pluronics; y combinaciones de los mismos. La cantidad de lioprotector añadida a una formulación es generalmente una cantidad que no conduce a una cantidad inaceptable de degradación/agregación de la proteina cuando se liofiliza la formulación de proteínas. Donde el lioprotector es un azúcar (tal como sacarosa o trehalosa) y la proteína es un anticuerpo, ejemplos no limitativos de concentraciones de lioprotector en la formulación de proteínas son desde alrededor de 10 mM hasta alrededor de 400 mM, y preferiblemente desde alrededor de 30 mM hasta alrededor de 300 mM, y lo más preferiblemente desde alrededor de 50 mM hasta alrededor de 100 mM. En determinadas modalidades, se puede incluir un tensoactivo en la formulación. El término "tensoactivo" como se usa en la presente, incluye agentes que reducen la tensión superficial de un líquido por adsorción en la interfaz aire-líquido. Ejemplos de tensoactivos incluyen, sin limitación, tensoactivos no iónicos, tal como polisorbatos {por ejemplo, polisorbato 80 o polisorbato 20); poloxámeros (por ejemplo, poloxámero 188) ; Tritón™; dodecil sulfato de sodio (SDS) ; lauril sulfato de sodio; octil glicósido de sodio; lauril-sulfobetaina , miristil-sulfobetaina , linoleil-sulfobetaina, estearil-sulfobetaina , lauril-sarcosina , miristil-sarcosina , linoleil-sarcosina, estearil-sarcosina, linoleil-betaina, miristil-betaína, cetil-betaína , lauroamidopropil-betaina, cocamidopropil-betaína , linoleamidopropil-betaina, miristamidopropil-betaina , palmidopropi 1-betaina , isoestearamidopropil-betaina (por ejemplo, lauroamidopropil ) , miristamidopropil-, palmidopropil-, o isoestearamidopropil-dimetilamina ; sodio raetil cocool-, o disodio metil ofeil-taurato; y las series Monaquat™ (Mona Industries, Inc., Paterson, NJ.), polietil glicol, polipropil glicol, y copolimeros de etileno y propilen glicol (por ejemplo, pluronics, PF68). La cantidad de tensoactivo añadido es tal que mantiene la agregación de la proteina reconstituida a un nivel aceptable cuando se ensaya al usar, por ejemplo, SEC-HPLC para determinar el porcentaje de especies de HMW o especies de LMW, y minimiza la formación de materiales en partículas después de la reconstitución de un liofilizado de una formulación de proteína como se describe en la presente. Por ejemplo, el tensoactivo puede estar presente en una formulación (líquida, o previo a la reconstitución de un liofilizado) en una cantidad desde alrededor de 0.001 hasta alrededor de 0.5%, por ejemplo, desde alrededor de 0.05 hasta alrededor de 0.3%. En algunas modalidades, se incluye un agente de volumen en la formulación. El término "agente de volumen" como se usa en la presente, incluye agentes que proporcionan la estructura de un producto secado por congelación sin interactuar directamente con el producto farmacéutico. Además de proporcionar una torta farmacéuticamente precentable, los agentes de volumen también pueden impartir cualidades útiles respecto a la modificación de la temperatura de colapso, proporcionar protección de congelación-deshielo, y potenciar la estabilidad de la proteina durante un almacenamiento de largo plazo. Ejemplos no limitativos de agentes de volumen incluyen manitol, glicina, lactosa, y sacarosa. Los agentes de volumen pueden ser cristalinos (tal como glicina, manitol, o cloruro de sodio) o amorfos (tal como dextrano, hidroxietil almidón) y se usan generalmente en formulaciones de proteínas en una cantidad desde 0.5% a 10%. Otros portadores, excipientes, o estabilizadores farmacéuticamente aceptables, tales como aquellos descritos en Remington's Pharmaceut ical Sciences 16a. edición, Osol, A. Ed. (1980) también se pueden incluir en una formulación de proteína como se describe en la presente, con la condición de que no afecten adversamente las características deseadas de la formulación. Como se usa en la presente, "portador farmacéuticamente aceptable" significa algunos y todos los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y ant i fúngicos , agentes isotónicos y que retardan la absorción, compatibles con la administración farmacéutica. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas son bien conocidos en el arte. Los portadores, excipientes, o estabilizadores aceptables no son tóxicos a los receptores en las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen: agentes de solución amortiguadora adicionales; conservadores; co-solventes ; antioxidantes, incluyendo ácido ascórbico y metionina; agentes quelantes tal como EDTA; complejos de metal (por ejemplo, complejos Zn-proteinas ) ; polímeros biodegradables , tal como poliésteres; contrapones formadores de sales, tales como sodio, alcoholes de azúcar polihídricos ; aminoácidos, tales como alanina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, arginina, lisina, ornitina, leucina, 2 - feni lalanina , ácido glutámico, y treonina; azúcares orgánicos o alcoholes de azúcar, tales como lactitol, estaquiosa, mañosa, sorbosa, xilosa, ribosa, ribitol, mioini sit osa , mioinisitol, galactosa, galactitol, glicerol, ciclitoles (por ejemplo, inositol), polietilen glicol; agentes reductores que contienen azufre, tales como urea, glutatión, ácido tioctico, tioglicolato de sodio, tioglicerol, a-monot ioglicerol , y tio sulfato de sodio; proteínas de bajo peso molecular, tal como albúmina de suero humana, albúmina de suero de bovino, gelatina, u otras inmunoglobulinas ; y polímeros hidrofí lieos , tal como polivinilpirrolidona .

Métodos de Almacenamiento Una formulación de proteína como se describe en la presente se puede almacenar por cualquier método conocido por alguien experto en la técnica. Ejemplos no limitativos incluyen congelamiento, liofilizado, y secado por rocío de la formulación de proteínas. En algunos casos, las formulaciones de proteínas se congelan para almacenamiento. De esta manera, es deseable que la formulación sea relativamente estable bajo tales condiciones, incluyendo bajo los ciclos de congelación-deshielo. Un método para determinar la conveniencia de una formulación es someter una formulación de muestra a al menos dos, por ejemplo, tres a diez ciclos de congelación (a, por ejemplo -20°C u -80°C) y deshielo (por ejemplo por deshielo rápido a temperatura ambiente o deshielo lento sobre hielo) , determinar la cantidad de especies de bajo peso molecular (LMW) y/o especies HMW que se acumulan después de los ciclos de congelación-deshielo y compararlo con la cantidad de especies de LMW o especies de HMW presentes en la muestra previo al procedimiento de congelación-deshielo. Un incremento en las especies LMW o HMW indica una estabilidad disminuida de una proteína almacenada como parte de la formulación. La cromatografía liquida de alta resolución por exclusión de tamaño (SEC-HPLC) se puede usar para determinar la presencia de especies de LMW y HMW. En algunos casos, las formulaciones de proteínas se pueden almacenar como un líquido. De esta manera, es deseable que la formulación líquida sea relativamente estable bajo tales condiciones, incluyendo a diversas temperaturas. Un método para determinar la conveniencia de una formulación es almacenar la formulación de muestra a varias temperaturas (tal como 2-8, 15, 20, 25, 30, 35, 40, y 50°C) y monitorear la cantidad de especies HMW y/o LMW que se acumulan con el tiempo. Entre más pequeñas las cantidades de especies de HMW y/o LMW que se acumulan con el tiempo, mejor la condición de almacenamiento para la formulación. Adicionalmente, el perfil de carga de la proteína se puede monitorear por cromatografía líquida de alta resolución e intercambio de cationes (CEX-HPLC) . Alternativamente, las formulaciones se pueden almacenar después de la liofilización . El término "liofilización" como se usa en la presente, se refiere a un proceso por el cual el material a secarse se congela primero seguido por la remoción del hielo o solvente congelado por sublimación en un ambiente a vacío. Un excipiente (por ejemplo, lioprotector ) se puede incluir en las formulaciones que se vayan a liofilizar de manera de potenciar la estabilidad del producto liofilizado con el almacenamiento. El término "formulación reconstituida" como se usa en la presente, se refiere a una formulación que se ha preparado al disolver una formulación liofilizada de proteínas en un diluyente tal que la proteína se disperse en el diluyente. El término "diluyente" como se usa en la presente, es una sustancia que es farmacéuticamente aceptable (segura y no tóxica para administración a un humano) y es útil para la preparación de una formulación líquida, tal como una formulación reconstituida después de liofilización . Ejemplos no limitativos de diluyentes incluyen agua estéril, agua bacteriostática para inyección (B FI), una solución amortiguada en el pH {por ejemplo, solución salina amortiguada de fosfato) , solución salina estéril, solución de Ringer, solución de dextrosa, o soluciones acuosas de sales y/o soluciones amortiguadoras. La prueba de una formulación para la estabilidad del componente de la proteína de la formulación después de la liofilización es útil para determinar la conveniencia de una formulación. El método es similar a aquel antes descrito para congelamiento, excepto que la formulación de muestra se liofiliza en lugar de congelarse, se reconstituye al usar un diluyente, y se prueba la formulación reconstituida por la presencia de especies de LMW y/o especies de HMW. Un incremento en las especies de LMW o HMW en la muestra liofilizada comparado con la formulación de muestra correspondiente que no se liofilizó indica una estabilidad disminuida en la muestra liofilizada. En algunos casos, una formulación se seca por roció y luego se almacena. Para el secado por rocío, una formulación líquida se pone en aerosol en la presencia de una corriente de gas seco. Se remueve el agua de las gotas de la formulación dentro de la corriente de gas, lo que resulta en partículas secas de la formulación del fármaco. Se pueden incluir excipientes en la formulación para (i) proteger la proteína durante la deshidratación por secado por rocío, (ii) proteger la proteína durante el almacenamiento después del secado por rocío, y/o (i'ií) darle a la solución propiedades adecuadas para formación en aerosol. El método es similar a aquel antes descrito para congelamiento, excepto que la formulación de muestra se seca por rocío en lugar de congelarse, se reconstituye en un diluyente, y la formulación reconstituida se prueba por la presencia de especies LMW y/o especies HM . Un incremento en las especies LMW o HMW en la muestra secada por rocío comparado con la formulación de muestra correspondiente que no se liofilizó indica una estabilidad disminuida en la muestra secada por rocío.

Métodos de Tratamiento Las formulaciones descritas en la presente son útiles como composiciones farmacéuticas en el tratamiento y/o prevención de una enfermedad, o trastorno en un paciente que necesita de las mismas. El término "tratamiento" se refiere tanto a tratamiento terapéutico como profiláctico o medidas preventivas. El tratamiento incluye la aplicación o administración de la formulación de proteínas al cuerpo, un tejido aislado, o célula de un paciente que tenga un trastorno/enfermedad, un síntoma de un trastorno/enfermedad, o una predisposición hacia un trastorno/enfermedad, con el propósito de curar, sanar, aliviar, liberar, alterar, remediar, aminorar, mejorar o afectar la enfermedad, el síntoma de la enfermedad, o la predisposición hacia la enfermedad. Aquellos "que necesitan de tratamiento" incluyen aquellos que ya tienen el trastorno, así como aquellos en los cuales se va a evitar el trastorno. El término "trastorno" es cualquier condición que se beneficiaría del tratamiento con la formulación de proteína como se describe en la presente. Esto incluye trastornos o enfermedades crónicos y agudos incluyen aquellas codiciones patológicas que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. Ejemplos no limitativos de trastornos a tratarse en la presente incluyen, trastornos de sangrado, trombosis, leucemia, linfoma, linfoma no hodgkiniano, trastornos autoinmunitarios , trastornos de la coagulación, hemofilia, rechazo de injertos, trastornos inflamatorios, enfermedad del corazón, trastornos de desgaste muscular, alergias, cánceres, distrofia muscular, sarcopenia, caquexia, diabetes tipo II, artritis remuatoide, enfermedad de Crohn, psoriasis, artritis psoriática, asma, dermatitis, rinitis alérgica, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, eosinofilia, fibrosis, y producción de moco en exceso. Administración Las formulaciones de proteina como se describen en la presente se pueden administrar a un sujeto que necesite del tratamiento al usar los métodos conocidos en la técnica, tal como por bolo o infusión sencilla o múltiple durante un periodo largo de tiempo en una forma adecuada, por ejemplo, inyección o infusión por vías subcutáneas, intravenosas, intraperitoneales , intramusculares, intraarteriales , intralesionales o intraarticulares , administración tópica, transmucosa, transdérmica , rectal, inhalación, o por medios de liberación sostenida o liberación prolongada. Si la formulación de proteínas se ha liofilizado, el material liofilizado se reconstituye primero en un líquido apropiado previo a la administración. El material liofilizado se puede reconstituir en, por ejemplo, agua bacteriostática para inyección (BWFI), solución salina fisiológica, solución salina amortiguadora de fosfato (PBS), o la misma formulación en que la proteína haya estado previo a la liofilización . Las composiciones parenterales se pueden preparar en forma de dosificación unitaria para facilidad de administración y uniformidad de la dosificación. La "forma de dosificación unitaria" como se usa en la presente, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para el sujeto a tratarse; cada unidad contiene una cantidad predeterminada de compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el portador farmacéutico seleccionado. En el caso de un método de inhalación, tal como un inhalador de dosis medida, el dispositivo se diseña para suministrar una cantidad apropiada de la formulación. Para la administración por inhalación, se administran los compuestos en la forma de un rocío por aerosol a partir de un recipiente o dosificador presurizado que contenga un propelente adecuado, por ejemplo, un gas, tal como dióxido de carbono, o un nebulizador. Alternativamente, una forma de dosificación inhalada se puede suministrar como un polvo seco al usar un inhalador de polvo seco. La formulación de proteínas también se puede entrampar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, por técnicas de coacervación o por polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacrilato) , respectivamente, en sistemas de suministro de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nano-partículas, y nanocápsulas ) o en macroemulsiones . Tales técnicas se describen en Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a. edición . También se pueden preparar preparaciones de liberación sostenida de las formulaciones de proteina como se describe en la presente. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contienen la formulación de proteínas. Ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli (2-hydroxietil-metacrilato) / o poli ( vinilalcohol) ) , polilactidos, copolímeros de ácido L-glutámico y ?-etil-L-glutamato, acetato de etilen-vinilo no degradable, copolímeros degradables de ácido láctico-ácido glicólico, y ácido poli-D- ( - ) -3-hidroxibutirico . Las formulaciones de liberación sostenida de la proteína como se describe en la presente se puede desarrollar al usar polímero de ácido poliláctico-coglicólico (PLGA) debido a su biocompatibilidad y amplio intervalo de propiedades biodegradables . Los productos de degradación de los ácidos PLGA, láctico y glicólico, se pueden depurar rápidamente dentro del cuerpo humano. Además, la degradación de este polímero se puede ajusfar desde meses a años dependiendo de su peso molecular y composición. Las composiciones liposomales también se pueden usar para formular las proteínas o anticuerpos descritos en la presente. Dosificación La toxicidad y eficacia terapéutica de una formulación se puede determinar por procedimientos farmacéuticos conocidos en la técnica al usar, por ejemplo, cultivos celulares o animales experimentales, por ejemplo, para determinar el LD50 (la dosis letal para el 50% de la población) y el ED50 (la dosis terapéuticamente efectiva en el 50% de la población) . La relación de dosis entre efectos tóxicos y terapéuticos es el índice terapéutico, y se puede expresar como la relación LD5o/ED5o. Los datos obtenidos de los ensayos de cultivo celular y estudios en animales se pueden usar en la formulación de un intervalo de dosificación para uso en humanos. La dosificación de tales formulaciones se encuentra generalmente dentro de un intervalo de concentraciones en circulación que incluye el ED50 con poca o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de este intervalo dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. Para cualquier formulación usada en el método de la invención, se puede estimar la dosis terapéuticamente efectiva a partir de ensayos de cultivos celulares. Se puede formular una dosis en modelos animáis para alcanzar un intervalo de concentración de plasma en circulación que incluye el IC50 (es decir, la concentración del compuesto de prueba que alcanza una inhibición máxima media de síntomas) cuando se determina en el cultivo celular. Tal información se puede usar para determiner con mayor precisión las dosis útiles en humanos. Los niveles en plasma se pueden medir, por ejemplo, por cromatografía líquida de alta resolución. La dosificación apropiada de la proteína de la formulación dependerá del tipo de enfermedad a tratarse, la severidad y el curso de la enfermedad, ya sea que el agente se administra para propósitos terapéuticos o preventivos, terapia previa, la historia clínica del paciente y la respuesta al agente, y la discreción del médico que atiende. Una formulación se suministra generalmente tal que la dosificación esté entre alrededor de 0.1 mg proteína/kg de peso corporal hasta 100 mg proteína/kg de peso corporal. Con objeto de que las formulaciones se usen para la administración in vivo, deben estar estériles. La formulación puede hacerse estéril por filtración a través de membranas de filtración estériles, previo a, o después de, la formulación de un líquido o la liofilización y reconstitución. Las composiciones terapéuticas en la presente se colocan generalmente dentro de un recipiente que tiene un Puerto de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solució intravenosa, o un vial que tiene un tapón que se perfora por una aguja de inyección hipodérmica.

Artículos de Manufactura En otra modalidad, se proporciona un artículo de manufactura el cual contiene una formulación descrita en la presente y preferiblemente proporciona instrucciones para su uso. El articulo de manufactura comprende un recipiente adecuado para contener la formulación. Los recipientes adecuados incluyen, sin limitación, botellas, viales (por ejemplo, viales de cámara doble), jeringas (por ejemplo, jeringas de cámara sencilla o doble), tubos de ensayo, nebulizadores , inhaladores (por ejemplo, inhaladores de dosis medida o inhaladores de polvo seco), o depósitos. El recipiente se puede formar de una variedad de materiales, tal como vidrio, metal o plástico (por ejemplo, policarbonato, poliestireno, polipropileno) . El recipiente mantiene la formulación y la etiqueta sobre, o asociada con, el recipiente y puede indicar instrucciones para la reconstitución y/o uso. La etiqueta puede además indicar que la formulación es útil o pretendida para administración subcutánea. El recipiente que mantiene la formulación puede ser un vial multi-uso, el cual permite administraciones repetidas (por ejemplo, a partir de 2-6 administraciones) de la formulación. El articulo de manufactura puede comprender además un segundo recipiente que comprende un diluyente adecuado {por ejemplo, WFI, 0.9% NaCl, B FI, solución salina amortiguadora de fosfatos). Cuando el articulo de manufactura comprende una versión liofilizada de una formulación de proteínas, la mezcla de un diluyente con la formulación liofilizada proporcionará una concentración final de proteínas en la formulación reconstituida de generalmente al menos 20 mg/ml. El artículo de manufactura puede incluir además otros materiales deseables desde un punto de vista comercial y del usuario, incluyendo otras soluciones amortiguadoras, diluyentes, filtros, agujas, jeringas, e insertos de empaque con instrucciones para uso. Todos los artículos de revistas, patentes, solicitudes de patente y otras publicaciones referidas en esta solicitud se incorporan como referencia en su totalidad. Si existiera algún conflicto entre los contenidos de la solicitud actual y alguno del material incorporado como referencia, se entenderá que esta solicitud gobierna. La invención se entenderá más completamente por referencia a los siguientes ejemplos. No deben constituirse sin embargo, como limitantes del alcance de la invención.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Efecto de Metionina sobre la Agregación de proteínas en una Formulación de anticuerpos anti-B7.2 Sujeta a Almacenamiento a Temperatura elevada Este ejemplo ilustra la capacidad de la metionina para reducir la agregación de una proteína en una formulación de proteínas. Específicamente, los experimentos abajo descritos se dirigieron a probar los efectos de la metionina sobre la agregación de anticuerpos anti-B7.2 (IgG2, cadena ligera ?, ver, Fig. 9) en una formulación de un anticuerpo anti-B7.2 sometida a almacenamiento a 40°C. B7.2 es un ligando co-estimulador que se expresa en las células B, el cual puede interactuar con las moléculas de la superficie de las células T, CD28 y CTLA-4. El efecto de añadir la metionina sobre la agregación del anticuerpo anti-B7.2 formulado como un liquido a diversos niveles de pH se examinó durante un periodo de 12 semanas durante el cual se almacenó la formulación a 40°C. El anticuerpo anti-B7.2 se formuló a 1 mg/ml a diversos niveles de pH en la presencia y ausencia de 10 mM de metionina y 0.01% polisorbato 80. Los niveles de agregación se midieron inicialmente , en la semana 6, y en la semana 12, al medir el porcentaje de especies de alto peso molecular (% HMW) en las formulaciones en estos puntos de tiempo por SEC-HPLC. Un incremento en % HMW es indicative de la agregación. Los niveles iniciales del % de HMW de cada formulación fueron aproximadamente los mismos (-1-2% ver, Fig. la). Después de 6 y 12 semanas de almacenamiento a 40°C, sin embargo, el % de HMW se incrementó en las formulaciones que carecen de metionina, especialmente en las muestras que contienen polisorbato 80 y carecen de metionina y se formulan a niveles de pH en el intervalo desde 6.0 a 6.6 (ver, Figs.

Ib y le) . La presencia de metionina en la formulación mantuvo el % HMW cerca de los niveles iniciales en muestras sin polisorbato 80. Aunque hubiera un incremento en la agregación de proteínas en las muestras que contienen tanto polisorbato 80 y metionina comparado con muestras que contienen metionina pero carecen de polisorbato 80, los niveles de agregación de proteínas serían significativamente menores que en las muestras que contienen polisorbato 80 pero carecen de metionina (ver. Figs. Ib y le) . En resumen, estos experimentos muestran que la metionina redujo la agregación del anticuerpo anti-B7.2 en una formulación sometida a temperaturas elevadas tanto en la presencia y ausencia de polisorbato 80.

Ejemplo 2 Efecto de metionina sobre la Agregación de proteínas en una Formulación de anticuerpos anti-B7.1 Sometida a Temperatura elevada Este ejemplo ilustra además la capacidad de la metionina para reducir la agregación de una proteína en una formulación de proteínas. Los experimentos abajo descritos se dirigieron a probar los efectos de la metionina en la agregación de anticuerpos anti-B7.1 (IgG2, cadena ligera ?, ver, Fig. 8) en una formulación de anticuerpos anti-B7.1 sujeta a almacenamiento a 40°C. B7.1 es un ligando co-estimulador que se expresa en las células B, las cuales pueden interactuar con las moléculas de la superficie de células T, CD28 y CTLA-4. El efecto de añadir la metionina sobre la agregación del anticuerpo anti-B7.1 formulado como un liquido a diversos niveles de pH se examinó durante un periodo de 12 semanas durante el cual se almacenaron las muestras a 40°C. El anticuerpo anti-B7.1 se formuló a 1 mg/ml a diversos niveles de pH en la presencia y ausencia de 10 mM de metionina y 0.01% polisorbato 80. Se midieron inicialmente los niveles de agregación, y en la semana 12, al medir el porcentaje de especies de alto peso molecular (% HMW) en las formulaciones en esos puntos de tiempo por SEC-HPLC. Los niveles iniciales de % HMW de cada formulación fueron aproximadamente los mismos (~ 1%, ver, Fig. 2a) . El almacenamiento de la formulación de anticuerpos anti-B7.1 por 12 semanas a 40°C en la presencia de polisorbato 80 y carente de metionina resultó en un incremento menor en el % de HMW en el intervalo de pH de 4.7-6.3 en soluciones amortiguadoras de citrato y succinato (ver, Fig. 2b) . Un incremento más importante en el % HMW resultó en el intervalo de pH de 6-6.6 en solución amortiguadora de histidina (ver, Fig. 2b). La adición de metionina a las formulaciones de proteínas disminuyó los niveles del % de HMW. Esto se observó más claramente en el caso del anticuerpo anti-B7.1 formulado en solución amortiguadora de histidina y polisorbato 8 O : metionina mantuvo los niveles del % de HMW hasta un mínimo de 1.2% después de 12 semanas a 40°C. En resumen, estos experimentos muestran que la metionina redujo la agregación del anticuerpo anti-B7.1 en una formulación almacenada a 40°C/ tanto en la presencia y ausencia de polisorbato 80.

Ejemplo 3 Efecto De metionina en la Agregación de proteínas en una Formulación de Anticuerpos anti-CD22 Sujeto a Almacenamiento a Largo Plazo Este experimento se dirigió a probar el efecto de añadir la metionina sobre la agregación de proteínas en una formulación de anticuerpos anti-CD22 (ver, Fig. 10). CD22 es una sialoglicoproteína restringida de células B de 135 kD que se enlaza a oligosacáridos que contienen residuos de ácido siálico ligado en 2-6-, y se expresa sobre la superficie de células B durante las últimas etapas de la diferenciación. Parece jugar un papel en la activación de células B y actuar como una molécula de adhesión. CD22 y anti-CD22 se consideran útiles en el tratamiento de leucemia, linfoma, linfoma que no es Hodgkin, y determinadas condiciones autoinmunes. 25-26 mg/ml de anti-CD22 (IgG4, cadena ligera ?) se formularon como un líquido en solución amortiguadora 10 mM de succinato, pH 6. Estas formulaciones también contenían ya sea uno o ambos de 10 mM de metionina y 0.01% de polisorbato 80. Las formulaciones resultantes de anti-CD22 se almacenaron a 25°C o -80°C por entre 1 mes a 36 meses, y los niveles del % de HM en las formulaciones se evaluaron por SEC-HPLC. Los niveles del % de HMW de todas las formulaciones almacenadas a -80°C fueron aproximadamente los mismos (~0.5%) (ver, Fig. 3a) . En contraste, el almacenamiento con el tiempo a 25°C resultó en un incremento en los niveles del % HMW (ver, Fig. 3b) . Este incremento se disminuyó sustancialmente si la metionina estaba presente en la formulación. Es de señalar, que las formulaciones anti-CD22 formuladas con polisorbato 80 y de metionina generaron aproximadamente el mismo % de especies de HMW como las muestras formuladas con metionina pero carentes de polisorbato 80. Estos datos indican que la metionina disminuye la agregación de proteínas de una formulación de anticuerpos anti-CD22 en almacenamiento de larga duración, tanto en la presencia o ausencia de polisorbato 80.

Ejemplo 4 Efecto de metionina en la Agregación de proteínasen una formulación de PSGL-Ig Sometida a Almacenamiento a Altas Temperaturas Este ejemplo proporciona otra ilustración de la capacidad de la metionina para evitar la agregación en proteínas y, particularmente, en proteínas de fusión. Este experimento se dirigió a probar el efecto de añadir la metionina en la agregación de proteínas en una formulación de proteínas de fusión de inmunoglobulina de ligando-1 de glicoproteína de P-selectina (PSGL-Ig) . PSGL-1 es un homodímero de 240 kDa que consiste de dos cadenas de polipéptidos de 120kDa que se expresa constituidamente en todos los leucocitos. PSGL-1 se encuentra principalmente en las puntas de las microvellosidades . PSGL-1 se puede enlazar a la P-selectina sobre el endotelio cuando se cubre con los azúcares apropiados. Los efectos de la metionina en la agregación de la proteína de fusión glicoproteína de P-selectins ligando-Ig (PSGL-Ig) se examinaron a diversas temperaturas. PSGL-Ig se formuló como una formulación líquida en 10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.005% polisorbato 80, pH 7.5 en la presencia y ausencia de 10 mM de metionina. Las muestras se almacenaron a -80°C, 25°C, y 40°C y se evaluaron para el % de HM durante un periodo de 4 semanas por SEC-HPLC. Los niveles iniciales de % HMW en todas las muestras fueron similares y permanecieron sin cambios en las muestras almacenadas a -80°C independientemente de la presencia o ausencia de metionina (ver, Fig.4) . El almacenamiento a 25°C y 40°C resultó en una agregación aumentada con el tiempo; sin embargo, esa agregación se redujo en muestras formuladas con metionina .

Ejemplo 5 Efecto de metionina en la Agregación de proteínas en una Formulación de PSGL-Ig Sometida a Esfuerzo cortante Este ejemplo ilustra que la metionina reduce la agregación de proteínas sometida a esfuerzo cortante. La proteína de fusión PSGL-Ig se formuló como un líquido en 10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.005% polisorbato 80, pH 7.5 en la presencia y ausencia de 10 mM de metionina. Las formulaciones resultantes se dejaron ya sea sin agitar o sometidas a sacudida a 250 rpm por 96 horas. Las muestras sin agitar que contienen o carecen de metionina tuvieron niveles muy similares de % de HMW (0.6 y 0.7%) (ver, Fig. 5) . En contraste, las muestras agitadas que carecen de metionina contenían % elevado de HMW (4.2 % y 4.4%) . La adición de metionina a las formulaciones que se sometieron a sacudida resultaron en una disminución en los niveles del % de HMW hasta 1.0 y 2.2%. Estos datos muestran que la metionina reduce la agregación de proteínas sometidas a esfuerzo cortante.

E emplo 6 Efecto de metionina en la Agregación de proteínas de una Formulación de proteínas REFACTO® Almacenada en la Oscuridad Este experimento proporciona todavía otro ejemplo de la capacidad de la metionina para evitar la agregación en las proteínas y, particularmente, en proteínas recombinantes . Para ilustrar además, REFACTO® (ver, Figs. lla-llb) , una proteína recombinante del factor VIII que se usa para corregir las deficiencias del factor VIII, se usó en este experimento. Los efectos de la metionina en la estabilidad de REFACTO® se examinaron durante un estudio de estabilidad de 1 mes. REFACTO® se formuló como un líquido a alrededor de 250 IU/ml en solución amortiguadora de histidina 20 mM. Algunas de estas formulaciones también contenían 10 mM de metionina y 10 mM citrato. Todas las formulaciones contenían cloruro de calcio 4 mM y cloruro de sodio 310 mM, y 0.02% Tween-80. El pH de las formulaciones fue de 6.5. Las muestras se almacenarn en la oscuridad a temperatura ambiente por aproximadamente 1 mes. Las muestras de control se formularon como anteriormente y almacenaron a -80°C. Se evaluó la formación de agregados por SEC-HPLC. En las muestras de control, independientemente de la presencia de metionina y citrato, permanecieron iguales los niveles de % HMW (ver, Tabla 1) . En las formulaciones con solución amortiguadora de histidina sin metionina y citrato, el % de HMW fue 26-27% después de 1 mes de almacenamiento en la obscuridad, lo que indica un alto nivel de agregación. En las formulaciones de solución amortiguadora de histidina que contienen metionina y citrato, sin embargo, la agregación se redujo en el mismo periodo de tiempo, con un % HMW de solamente 7-8%.

Tabla 1 Ejemplo 7 Efecto de la metionina sobre la Agregación de proteínas de una Formulación de proteínas REFACTO® Almacenada bajo Luz fluorescente En este conjunto de experimentos, los efectos de metionina en la fragmentación de REFACTO® que se expuso a la luz fluorescente se examinaron durante un periodo de 1 mes. REFACTO® se formuló como un líquido a alrededor de 250 IU/ml en 20 mM histidina o solución amortiguadora de 20 mM succinato. Algunas de estas formulaciones también contenían 10 mM de metionina y 10 mM citrato. Todas las formulaciones contenían cloruro de calcio 4 mM y cloruro de sodio 310 mM, y 0.02% Tween-80. El pH de las formulaciones fue de 6.5. Las muestras se almacenaron a temperatura ambiente por aproximadamente 1 mes bajo luz fluorescente, y se evaluó la formación de agregados por SEC-HPLC. Las muestras de control se formularon como anteriormente y se almacenaron a -80°C. En las muestras de control, independientemente de la presencia de metionina y citrato, los niveles del % HM permanecieron sin cambios a un 0% HMW (ver, Tabla 2). En las formulaciones de solución amortiguadora de histidina grado USP sin metionina y citrato, el % de HMW fue 21% después de 1 mes de almacenamiento bajo luz fluorescente, lo que indica un alto nivel de agregación. En las formulaciones de solución amortiguadora de histidina grado USP que contienen metionina y citrato, sin embargo, la agregación se redujo durante el mismo periodo de tiempo, con un % de HMW de solamente alrededor de 2%. Similarmente, en las formulaciones de solución amortiguadora de succinato que carecen de metionina y citrato, el % de HMW fue 25%, mientras que las formulaciones de solución amortiguadora de succinato que contienen metionina y citrato tuvieron solamente 9% de HMW (ver, Tabla 3) . Asi, la metionina y citrato disminuyeron la agregación de REFACTO® formulado en soluciones amortiguadoras de histidina o succinato y almacenado bajo luz fluorescente, comparado con REFACTO® formulado sin metionina y citrato. Tabla 2 Tabla 3 Ejemplo 8 Efecto de la metionina en la Potencia de REFACTO' Los efectos de la metionina en la potencia de REFACTO que se mantuvo ya sea en la obscuridad o expuesto a luz fluorescente se examinaron durante un periodo de 1 mes.

REFACTO® se formuló como un liquido a alrededor de 250 IU/ml en 20 mM histidina o solución amortiguadora 20 mM de succinato. Algunas de estas formulaciones también contenían 10 mM de metionina y 10 mM citrato. Las muestras se expusieron a condiciones de luz fluorescente u oscuridad por 1 mes a temperatura ambiente. REFACTO® padeció una gran pérdida de potencia en las soluciones amortiguadoras formuladas sin metionina y citrato después de 1 mes de almacenamiento a temperatura ambiente en cualquiera de las muestras expuestas a la luz fluorescente (ver, Fig. 6). REFACTO® almacenado en la oscuridad en la presencia de metionina no padeció de efectos perjudiciales en la potencia, mientras que el REFACTO® almacenado bajo luz fluorescente en la presencia de metionina padeció alguna pérdida de potencia pero mantuvo todavía una potencia superior que las muestras almacenadas sin metionina, lo cual resultó en una pérdida de potencia.

Ejemplo 9 La Oxidación Disminuye la Multimerización de rhIL-11 Este experimento se dirigió a probar el efecto de la adición de metionina en la multimerización de IL-11. Cuatrocientos viales se llenaron a mano a 0.1 mg/ml con principio activo de IL-11 humana recombinante (rhIL-11) (relleno de 1.0 mi en un vial de tubería de 5 mi) y se liofilizó al usar el ciclo de liofilización estándar para rhIL-11. Doscientos viales que contenían rhIL-11 formulado con 10 mM NaP04, 300 mM de glicina, pH 7.0, y el resto se formularon con 10 mM NaP04, 300 mM glicina, 10 mM de metionina, pH 7.0. Cuatro diferentes tapones de 13 mm se usaron como cierres de recipientes. Cada tipo de tapón se usó sobre 100 viales. Los tapones se enjuagaron, pusieron a hervir y luego se trataron en autoclave. Luego se secaron la mitad de los tapones por 16 horas a 100°C. Se colocaron los viales en estabilidad acelerada de corto plazo a 4°C, 40°C, y 50°C por dos y cuatro semanas. Se ensayaron los viales a T=0 y a 2 y 4 semanas para la oxidación de Met58 y formación de multimeros. RP-HPLC (baja carga) se usó para determinar el grado de oxidación de Met58 en rhIL-11, mientras que SEC-HPLC se usó para monitorear la generación del multimero rhIL-11. Se construyó una gráfica inicial para probar cualquier correlación directa entre oxidación y multimeri zación (ver, Fig. 7) . Estos datos mostraron que cuando los niveles de oxidación son altos, los niveles de multimeros son bajos, y que cuando los niveles de oxidación son bajos, los niveles de multimeros son altos. Estos datos indican que la oxidación y multimerización de rhIL-11 parecen presentarse bajo circunstancias opuestas. Cuando los parámetros se optimizan para minimzar la oxidación de rhIL-11, se incrementa la multimerización. Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Un método para reducir la agregación de una proteina en una formulación de proteínas, que comprende la adición de metionina a la formulación hasta una concentración de alrededor de 0.5 mM hasta alrededor de 145 mM, caracterizado porque resulta en la agregación reducida de la proteína en la formulación comparado con la proteína en una formulación que carece de metionina.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la formulación de proteínas es una formulación líquida de un polvo secado por congelación.
3. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína está a una concentración de entre alrededor de 0.1 mg/ml y alrededor de 300 mg/ml.
4. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la formulación de proteínas comprende un tensoactivo.
5. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la formulación de proteínas comprende un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de arginina, lisina, ácido aspártico, glicina, y ácido glutámico.
6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la formulación de proteínas comprende un modificador de la tonicidad.
7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la formulación de proteínas comprende un azúcar.
8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la formulación de proteínas comprende además un agente que reduce la agregación de la proteína de la formulación.
9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la agregación de proteínas no es el resultado de la oxidación de metionina.
10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la agregación de la proteína de la formulación se evalúa antes y/o después de añadir la metionina a la formulación.
11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la agregación se evalúa por SEC-HPLC, AUC, dispersión de luz, y absorbancia UV.
12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la agregación se evalúa por % de especies de HM , y el % de especies de HMW se reduce por alrededor de 30% comparado con el % de especies de HMW en una formulación que carece de metionina.
13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la agregación de la proteina de la formulación se evalúa entre 1 semana y 12 semanas después de añadir la metionina a la formulación de proteínas o entre 1 mes y 36 meses después de la adición de metionina a la formulación de proteínas.
14. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la agregación de la proteína de la formulación se evalúa después de almacenamiento de la formulación de proteínas a un temperatura entre 4°C y 50°C por alrededor de 1 semana hasta alrededor de 12 semanas después de formular la formulación de proteínas con metionina.
15. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la agregación de la proteína de la formulación se evalúa después de almacenamiento de la formulación de proteínas a una temperatura entre 4°C y 30°C por alrededor de 1 mes hasta alrededor de 36 meses después de formular la formulación de proteínas con metionina.
16. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la agregación de la proteína de la formulación es un resultado del esfuerzo cortante, almacenamiento, almacenamiento a temperatura elevada, exposición a la luz, pH, presencia de tensoactivos, y combinaciones de los mismos.
17. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque se añade la metionina a la formulación hasta una concentración- final de entre alrededor de 1 mM y 25 mM .
18. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la formulación tiene un pH de entre alrededor de 5.0 y 7.0.
19. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la formulación de proteínas comprende una solución amortiguadora seleccionada del grupo que consiste de citrato, succinato, histidina, Tris, y combinaciones de los mismos.
20. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque incrementa el tiempo de conservación de la formulación, o mantiene la potencia de la formulación.
21. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la proteína carece de residuos de metionina o contiene menos de 5 residuos de metionina.
22. Un método para reducir la agregación de una proteína en una formulación de proteínas sometida a esfuerzo cortante, caracterizado porque comprende añadir la metionina a la formulación hasta una concentración de alrededor de 0.5 mM hasta alrededor de 145 mM, en donde el método resulta en la agregación reducida de la proteína en la formulación comparado con la proteína en una formulación que carece de metionina .
23. El método de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el esfuerzo cortante es el resultado de una sacudida, extracción en una jeringa y procedimientos de purificación, y combinaciones de los mismos.
24. Un método para reducir una pérdida en la potencia o actividad biológica de una proteina en una formulación de proteínas después de almacenamiento de la formulación a temperatura ambiente por más de un día, caracterizado porque comprende añadir la metionina a la formulación hasta una concentración de alrededor de 0.5 mM hasta alrededor de 145 mM, con lo cual se reduce la pérdida en la potencia o actividad biológica de la proteína en la formulación comparado con la proteína en una formulación que carece de metionina .
25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la formulación de proteínas es almacenada bajo luz fluorescente.
26. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la formulación de proteínas es almacenada en la oscuridad por alrededor de 1 mes.
27. Un método para reducir la agregación de una proteína en una formulación de proteínas, caracterizado porque comprende : (i) añadir la metionina a la formulación hasta una concentración de alrededor de 0.5 mM hasta alrededor de 145 mM; y (ii) determinar el % de niveles de HMW de la proteina de la formulación por SEC- HPLC; en donde el método resulta en la agregación reducida de la proteina en la formulación comparado con la proteina en una formulación que carece de metionina.
28. El método de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado porque resulta en una formulación de proteínas que tiene menos de alrededor de 5% de especies de HMW cuando se determina por SEC-HPLC.
29. Una formulación de proteínas, caracterizada porque comprende uno de un anticuerpo anti-B7.1, un anticuerpo anti-B7.2, un anticuerpo anti-CD22, PSGL-Ig y Factor VIII, o un fragmento biológicamente activo del mismo, y alrededor de 0.5 mM a 50 mM de metionina.
30. La formulación de conformidad con la reivindicación 29, caracterizada porque comprende además 1-150 mM de un aminoácido seleccionado del grupo que consiste de arginina, lisina, ácido aspártico, y ácido glutámico.