BR112014023196B1 - Vacinas contra o vírus sincicial respiratório (rsv), seu método de produção, e ácido nucleico recombinante isolado - Google Patents

Abstract

vacina contra o vírus sincicial respiratório (rsv), métodos para vacinar um sujeito contra o rsv, para redução da infeção e/ou replicação do rsv, de um sujeito e para produção de uma vacina contra o vírus sincicial respiratório (rsv), célula hospedeira isolada, e, ácido nucleico recombinante isolado. a invenção confere uma vacina contra o vírus sincicial respiratório (rsv), compreendendo um adenovírus humano recombinante de serotipo 26 que compreende ácido nucleico codificando uma proteína f do rsv ou parte imonologicamente ativa da mesma.

Description

[0001] A invenção se relaciona com a área da medicina. Mais em particular, a invenção se relaciona com a vacina contra o RSV.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

[0002] Depois da descoberta do vírus sincicial respiratório (RSV) na década de 1950, o vírus se tornou, de imediato, um patógeno reconhecido associado com infeções do trato respiratório inferior e superior em humanos. Se estima que, em todo o mundo, ocorram 64 milhões de infeções por RSV a cada ano, resultando em 160.000 mortes (OMS Atualização das Infeções Respiratórias Agudas, setembro de 2009). A doença mais grave ocorre particularmente em bebês prematuros, idosos e sujeitos com problemas imunitários. Em crianças com menos de 2 anos, o RSV é o patógeno do trato respiratório mais comum, sendo responsável por aproximadamente 50% das hospitalizações devidas a infeções respiratórias, e o pico das hospitalizações ocorre aos 2-4 meses de idade. Foi relatado que aos dois anos de idade a quase totalidade das crianças foram infetadas pelo RSV. A infeção repetida durante a vida é atribuída a uma ineficaz imunidade natural. O nível do peso da doença, mortalidade e morbidade por RSV em idosos estão em segundo lugar aos causados pelas infeções da gripe A não pandêmica.

[0003] O RSV é um paramixovírus, pertencente à subfamília pneumovirinae. O seu genoma codifica diversas proteínas, incluindo as proteínas de membrana conhecidas como glicoproteína (G) do RSV e proteína de fusão (F) do RSV que são os principais alvos antigênicos para anticorpos de neutralização. A clivagem proteolítica do precursor da proteína de fusão (F0) produz dois polipeptídeos F1 e F2 ligados através de pontes de dissulfeto. Os anticorpos contra a parte que medeia a fusão da proteína F1 podem prevenir a absorção do vírus na célula e, desse modo, têm um efeito de neutralização. Além de ser um alvo para os anticorpos de neutralização, F de RSV contém epitopos de célula T citotóxicas (Pemberton et al, 1987, J. Gen.Virol. 68: 21772182).

[0004] As opções de tratamento para a infeção por RSV incluemum anticorpo monoclonal contra a proteína F do RSV. Os elevados custos associados a esses anticorpos monoclonais e a exigência para administração em ambiente hospitalar, impedem a sua utilização em grande escala na profilaxia da população em situação de risco. Desse modo, existe uma necessidade para uma vacina do RSV, a qual, de preferência, pode ser utilizada na população pediátrica, bem como nos mais idosos.

[0005] Apesar dos 50 anos de pesquisa, ainda não existe uma vacina licenciada contra o RSV. Um grande obstáculo para o desenvolvimento da vacina é o legado do agravamento da doença com vacina em um ensaio clínico na década de 1960 com uma vacina do RSV inativada por formalina (FI). Crianças vacinadas com RSV - FI não estavam protegidas contra a infeção natural e as crianças infetadas sofreram de doença mais grave do que as crianças não vacinadas, incluindo duas mortes. Este fenômeno é conhecido como "doença agravada".

[0006] Desde o ensaio com a vacina FI do RSV, têm sido seguidas várias abordagens para gerar uma vacina do RSV. As tentativas incluem a clássica passagem a frio atenuada em vivo ou estirpes de RSV mutantes sensíveis à temperatura, as vacinas de subunidades de proteína (quimérica), vacinas de peptídeo e proteínas de RSV expressas a partir de vetores virais recombinantes. Embora algumas dessas vacinas tenham apresentado dados pré-clínicos promissores, não foi licenciada qualquer vacina para utilização humana devido às preocupações com a segurança ou falta de eficácia.

[0007] Os vetores de adenovírus são utilizados para a preparação de vacinas para uma variedade de doenças, incluindo a doença associada com as infeções por RSV. Os parágrafos seguintes conferem exemplos de vacinas candidatas do RSV à base de adenovírus que têm sido descritas.

[0008] Em uma abordagem, RSV.F tem sido inserido na região não essencial E3 de tipos de adenovírus de replicação competente 4, 5, e 7. A imunização de ratos do algodão, através da aplicação intranasal (i. n.) de 107 pfu, era moderadamente imunogênia e protetora do trato respiratório inferior contra a ameaça do RSV, mas não protetora contra a ameaça do trato respiratório superior contra o RSV (Connors et al, 1992, Vaccine 10: 475-484; Collins, P.L., Prince, G.A., Camargo, E., Purcell, R.H., Chanock, R.M. e Murphy, B.R. Avaliação do efeito protetor de vírus de vacina recombinantes e adenovírus que expressam glicoproteínas do vírus sincicial respiratório. Em: Vaccines 90: Modern Approaches to New Vaccines including prevention of AIDS (Eds. Brown, F., Chanock, R.M., Ginsberg, H. e Lerner, R.A.) Cold Spring Harbor Laboratory, Nova Iorque, 1990, pg 79-84). A subsequente imunização oral de um chimpanzé foi pouco imunogênica (Hsu et al, 1992, J Infect Dis. 66:769-775).

[0009] Em outros estudos (Shao et al, 2009, Vaccine 27: 5460 - 71; US2011/0014220), foram concebidos dois adenovírus de replicação incompetente recombinantes de 5 vetores que transportam o ácido nucleico codificando a transmembrana truncada (rAd-F0ΔTM) ou a versão de comprimento total (rAd-F0) da proteína F da estirpe RSV-B1 e foram administrados por via intranasal a camundongos BALB/c. Os animais foram inicialmente vacinados i. n. com 107 pfu e reforçados 28 dias depois com a mesma dose i. n. Embora os anticorpos anti-RSV-B1 tenham neutralizado e tenham reagido de modo cruzado com as estirpes RSV-Longa e RSV-A2, a imunização com esses vetores protegeu apenas parcialmente contra a replicação da ameaça do RSV B1. A proteção (parcial) com rAd-F0ΔTM foi ligeiramente superior do que com rAd-F0.

[00010] Noutro estudo, se observou que os camundongos BALB/c imunizados i. n. com 1011 partículas de vírus com a replicação de adenovírus FG-Ad deficiente (à base de AdS) que expressam o tipo selvagem da F do RSV (FG-Ad-F) reduziram os títulos virais pulmonares apenas em 1,5 log 10 em comparação com o grupo de controle (Fu et al, 2009, Biochem. Biophys. Res. Commun. 381: 528532.

[00011] Ainda noutros estudos, se observou que a aplicação intranasal do adenovetor deficiente de replicação à base de Ad5 recombinante que expressa o fragmento F1 solúvel de otimização de códon da proteína F do RSV A2 (amino ácido 155-524) (108 PFU) poderia reduzir a replicação da ameaça do RSV nos pulmões de camundongos BALB/c quando comparados com os camundongos de controle, mas camundongos imunizados por via intramuscular (i. m.) não apresentaram qualquer proteção contra a ameaça (Kim et al, 2010, Vaccine 28: 3801-3808).

[00012] Em outros estudos, foram utilizados os adenovetores à base de Ad5 portadores do códon otimizado de comprimento total F do RSV (AdV-F) ou da forma solúvel do gene de F do RSF (AdV-Fsol) de modo a imunizar os camundongos BALB/c duas vezes com uma dose de 1x1010 OPU (unidades de partículas ópticas: uma dose de 1x1010 OPU corresponde a 2x108 GTU (unidade de transdução do gene)). Esses vetores reduziram fortemente a carga viral nos pulmões depois da imunização i. n., mas apenas parcialmente após aplicação subcutânea (s. c.) ou i. m. (Kohlmann et al, 2009, J Virol 83: 1260112610; US 2010/0111989).

[00013] Ainda noutros estudos, se observou que a aplicação intramuscular do adenovetor deficiente de replicação à base de Ad5 recombinante que expressa a proteína F de cDNA sequenciada da estirpe RSV A2 (1010 unidades de partículas) poderia reduzir a replicação da ameaça do RSV apenas parcialmente nos pulmões dos camundongos BALB/c quando comparados com os camundongos de controle (Krause et al, 2011, Virology Journal 8:375-386)

[00014] Além de, em muitos casos, não serem totalmente eficazes, as vacinas do RSV sob avaliação clínica para uso pediátrico e a maioria das vacinas em avaliação pré-clínica, são vacinas intranasais. As vantagens mais importantes da estratégia intranasal são o reforço direto da imunidade do trato respiratório local e a ausência do agravamento da doença associada. De fato, em geral, a eficácia, por exemplo, das vacinas do RSV à base de adenovírus aparentam ser melhores para a administração intranasal, quando comparadas com a administração intramuscular. No entanto, a vacinação intranasal também gera preocupações de segurança em crianças menores do que 6 meses. A maioria das reações adversas comuns das vacinas intranasais são prurido do nariz ou congestão nasal em todas as idades. Os recém-nascidos são respiradores nasais obrigatórios e, por isso, devem respirar pelo nariz. Desse modo, a congestão nasal nos primeiros meses de vida de uma criança pode interferir com os tratamentos, e em casos raros, pode provocar graves problemas respiratórios.

[00015] Foram identificados mais do que 50 diferentes serotipos de adenovírus humanos. Destes, o serotipo 5 do adenovírus (Ad5), tem sido historicamente mais extensivamente estudado para utilização como portador do gene. No entanto, os vetores de adenovírus recombinantes de serotipos diferentes podem dar origem a resultados diferentes em razão à indução de respostas imunes e proteção. Por exemplo, o documento WO 2012/021730 descreve que o serotipo 7 vetor de adenovírus símio e o serotipo 5 vetor de adenovírus humano codificando a proteína F conferem uma melhor proteção contra o RSV do que um serotipo 28 vetor de adenovírus humano. Além disso, foi observada diferente imunogenicidade para os vetores com base em serotipos de adenovírus humanos ou não humanos (Abbink et al., 2007, J Virol 81: 4654-4663; Colloca et al., 2012, Sci Transl Med 4, 115ra2). Abbink et al. concluem que todos os vetores raros rAd de serotipos humanos estudados eram menos potentes do que os vetores rAd5, na ausência de imunidade anti -Ad5. Além disso, foi recentemente descrito que, embora o rAd5 com um transgene da glicoproteína (gp) do Ebolavírus (EBOV) proteja a 100% os primatas não humanos, o rAd35 e o rAd26 com transgene gp do EBOV conferia apenas uma proteção parcial e foi necessária uma estratégia de aumento de reforço heterólogo com esses vetores de forma a obter proteção total contra a ameaça com o vírus Ebola (Geisbert et al, 2011, J Virol 85: 4222-4233). Desse modo, não é, a priori, possível prever a eficácia de uma vacina de adenovírus recombinante, com base apenas em dados de um outro serotipo de adenovírus.

[00016] Além disso, para vacinas de RSV, são requeridas experiências em modelos de doenças adequados, tais como rato do algodão, de modo a determinar se um candidato a vacina é suficientemente eficaz para impedir a replicação de RSV no trato nasal e pulmonar, e ao mesmo tempo é seguro, isto é, não conduz a um agravamento da doença. Preferencialmente, essas vacinas candidatas devem ser altamente eficazes nesses modelos, mesmo depois da administração intramuscular.

[00017] Por esse motivo, permanece uma necessidade para vacinas eficientes e métodos de vacinação contra o RSV, que não conduzam a um agravamento da doença. A presente invenção tem como objetivo conferir essas vacinas e esses métodos de vacinação contra o RSV de um modo seguro e eficaz.

Sumário da invenção

[00018] Foi surpreendentemente descoberto pelos presentes inventores que os adenovírus recombinantes de serotipo 26 (Ad26) que compreendem uma sequência de nucleotídeos codificando a proteína F do RSV são vacinas muito eficazes contra o RSV em um modelo de rato do algodão bem estabelecido, e têm uma eficácia melhorada quando comparada com os dados descritos anteriormente para Ad5 codificando F de RSV. Foi demonstrado que mesmo uma única administração, mesmo por via intramuscular, de Ad26 codificando F de RSV é suficiente para conferir uma completa proteção contra a ameaça de replicação do RSV.

[00019] A invenção confere uma vacina contra o vírus sincicial respiratório (RSV), compreendendo um adenovírus humano recombinante de serotipo 26 que compreende ácido nucleico codificando uma proteína F do RSV ou fragmento da mesma.

[00020] Em certas modalidades, o adenovírus recombinante compreende ácido nucleico codificando a proteína F do RSV que compreende a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1.

[00021] Em certas modalidades, o ácido nucleico codificando a proteína F do RSV apresenta otimização de códon para a expressão em células humanas.

[00022] Em certas modalidades, o ácido nucleico codificando a proteína F do RSV compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2.

[00023] Em certas modalidades, o adenovírus humano recombinante tem uma deleção na região E1, uma deleção na região E3, ou uma deleção em ambas as regiões E1 e E3 do genoma do adenovírus.

[00024] Em certas modalidades, o adenovírus recombinante tem um genoma compreendendo nas suas extremidades terminais 5' a sequência CTATCTAT.

[00025] A invenção confere ainda um método para vacinar um sujeito contra RSV, em que o método compreende a administração ao sujeito de uma vacina de acordo com a invenção.

[00026] Em certas modalidades, a vacina é administrada por via intramuscular.

[00027] Em certas modalidades, uma vacina de acordo com a invenção é administrada ao sujeito mais do que uma vez.

[00028] Em certas modalidades, o método para vacinar um sujeito contra RSV também compreende a administração ao sujeito de uma vacina compreendendo um adenovírus humano recombinante de serotipo 35, que compreende o ácido nucleico codificando a proteína F do RSV ou um fragmento da mesma.

[00029] Em certas modalidades, o processo de vacinação de um sujeito contra o RSV compreende ainda a administração da proteína F do RSV (de preferência formulada como uma composição farmacêutica, assim, uma vacina de proteína) ao sujeito.

[00030] Em certas modalidades, o método para vacinação consiste em uma única administração da vacina ao sujeito.

[00031] A invenção também confere um método para redução da infeção e/ou replicação do RSV, por exemplo, no trato nasal e nos pulmões de um sujeito, compreendendo a administração ao sujeito, através de injeção intramuscular de uma composição compreendendo um adenovírus humano recombinante de serotipo 26, compreendendo ácido nucleico codificando uma proteína F do RSV ou um fragmento da mesma. Isso irá reduzir os efeitos adversos resultantes da infeção por RSV em um sujeito, e, desse modo, contribuir para a proteção do sujeito contra esses efeitos adversos depois da administração da vacina. Em certas modalidades, os efeitos adversos da infeção por RSV podem ser essencialmente prevenidos, ou seja, reduzidos a níveis tão baixos que não são clinicamente relevantes. O adenovírus recombinante pode estar sob a forma de uma vacina de acordo com a invenção, incluindo as modalidades acima descritas.

[00032] A invenção confere ainda uma célula hospedeira isolada, compreendendo um adenovírus humano recombinante de serotipo 26 compreendendo ácido nucleico codificando uma proteína F do RSV ou fragmento da mesma.

[00033] A invenção confere ainda um método para produção de uma vacina contra o vírus sincicial respiratório (RSV), compreendendo o fornecimento de um adenovírus humano recombinante de serotipo 26, que compreende ácido nucleico codificando uma proteína F do RSV ou um fragmento da mesma, a propagação do referido adenovírus recombinante em uma cultura de células hospedeiras, isolando e purificando o adenovírus recombinante, e formulando o adenovírus recombinante em uma composição farmaceuticamente aceitável. O adenovírus humano recombinante desse aspecto também pode ser qualquer dos adenovírus descritos nas modalidades anteriores.

[00034] A invenção confere ainda um ácido nucleico recombinante isolado que forma o genoma de um adenovírus humano recombinante de serotipo 26 que compreende ácido nucleico codificando uma proteína F do RSV ou fragmento da mesma. O adenovírus também pode ser qualquer dos adenovírus conforme descrito nas modalidades anteriores.

Breve descrição das Figuras

[00035] A FIG. 1 mostra a resposta imune celular contra peptídeos F sobrepondo o aa 1-252 de F e peptídeos F sobrepondo o aa 241- 574 de F de ratos após imunização com diferentes doses de rAd26 (A) e rAd35 (B) com base em vetores alojando o gene F do RSV, 2 e 8 semanas após a imunização.

[00036] A FIG. 2 mostra a resposta de anticorpos contra o RSV em camundongos após imunização com diferentes doses de rAd26 e rAd35 com base em vetores alojando o gene F do RSV, 2 e 8 semanas após a imunização.

[00037] A FIG. 3 mostra os resultados da razão da resposta de anticorpos IgG2a vs. IgG 1 contra o RSV em camundongos após imunização com 1010 vp de rAd26 e rAd35 com base em vetores alojando o gene F do RSV, 8 semanas após a imunização.

[00038] A FIG. 4 mostra a capacidade de neutralização do virus contra o RSV Longo em camundongos após imunização com doses de rAd26 (A) e rAd35 (B) com base em vetores alojando o gene F do RSV, 2 e 8 semanas após a imunização.

[00039] A FIG. 5 mostra a resposta imune celular contra (A) peptídeos F sobrepondo o aa 1-252 de F e (B) peptídeos F sobrepondo o aa 241-574 de F de camundongos após imunização por vacinação inicial - reforço de vetores com base em rAd26 e rAd35 alojando o gene F do RSV, 6 e 12 semanas após a imunização primária.

[00040] A FIG. 6 mostra a resposta de anticorpos contra o RSV em camundongos após imunização por vacinação inicial - reforço de vetores com base em rAd26 e rAd35 alojando o gene F do RSV, em diferentes momentos do tempo após a primeira imunização.

[00041] A FIG. 7 mostra a capacidade de neutralização contra o RSV Longo em soro de camundongos após imunização por vacinação inicial - reforço com diferentes doses de vetores com base em rAd26 e rAd35 alojando o gene F do RSV, em diferentes momentos do tempo após a primeira imunização.

[00042] A FIG. 8 mostra a capacidade de neutralização contra o RSV B1 em camundongos após imunização por vacinação inicial - reforço com diferentes doses de vetores com base em rAd26 e rAd35 alojando o gene F do RSV, em diferentes momentos do tempo após a primeira imunização.

[00043] A FIG. 9 mostra A) títulos de RSV pulmonares e B) títulos nasais de RSV em ratos do algodão depois da imunização por vacinação inicial - reforço com diferentes doses de vetores com base em rAd26 e rAd35 alojando o gene F de RSV, 5 dias depois da ameaça.

[00044] A FIG. 10 mostra a indução dos títulos de neutralização do vírus depois da imunização por vacinação inicial - reforço com diferentes doses de vetores com base em rAd26 e rAd35 alojando o gene F do RSV em A) 28 dias, e B) 49 dias após a imunização.

[00045] A FIG. 11 mostra o exame histopatológico dos pulmões de ratos do algodão no dia do sacrifício seguido pela imunização por vacinação inicial-reforço com diferentes doses de vetores com base em rAd26 e rAd35 alojando o gene F do RSV.

[00046] A FIG. 12 mostra A) os títulos de RSV pulmonares e B) os títulos de RSV nasais em ratos do algodão depois da imunização por dose única com diferentes doses de vetores com base em rAd26 e rAd35 alojando o gene F de RSV, 5 dias depois da ameaça, administrados através de diferentes vias.

[00047] A FIG. 13 mostra os títulos de neutralização do vírus induzidos depois da imunização por dose única com diferentes doses de vetores com base em rAd26 e rAd35 alojando o gene F do RSV em 28 e 49 dias, após a primeira imunização, administrados através de diferentes vias.

[00048] A FIG. 14 mostra o exame histopatológico dos pulmões de ratos do algodão no dia do sacrifício seguido pela imunização (i. m.) por dose única com diferentes doses de vetores com base em rAd26 e rAd35 alojando o gene F do RSV, no dia do sacrifício.

[00049] A FIG. 15 mostra mapas de plasmídeo compreendendo a extremidade esquerda do genoma de Ad35 e Ad26 com a sequência que codifica F do RSV:

[00050] A. pAdApt35BSU.RSV.F(A2)nat, e B. pAdApt26.RSV.F(A2- )nat

[00051] A FIG. 16 mostra A) os títulos de RSV pulmonares e B) os títulos de RSV nasais em ratos do algodão depois da imunização por dose única no dia 0 ou no dia 28 com doses diferentes de vetores com base em rAd26 alojando o gene F de RSV, 5 dias depois da ameaça. A ameaça ocorreu no dia 29.

[00052] A FIG. 17 mostra a indução dos títulos de neutralização do vírus depois da imunização por dose única com diferentes doses de rAd26 alojando o gene F do RSV, 49 dias após a imunização, conforme descrito para a FIG 16.

[00053] A FIG. 18 mostra a indução dos títulos de neutralização do vírus depois da imunização por dose única com diferentes doses de rAd26 alojando o gene F do RSV, durante o tempo após a imunização.

[00054] A FIG. 19 mostra os títulos VNA, 49 dias depois, contra RSV Longo e RSV B lavado com soro derivado a partir de ratos do algodão imunizados com 1010 de F de Ad-RSV ou nenhum transgene (Ad-e). PB: vacinação inicial-reforço.

[00055] A FIG. 20 mostra os títulos de RSV pulmonares em ratos do algodão depois da imunização por dose única no dia 0 com doses diferentes de vetores com base em rAd26 alojando o gene F de RSV, 5 dias depois da ameaça, com RSV A2 ou RSV B15/97.

[00056] A FIG. 21 mostra os títulos de RSV nasais em ratos do algodão depois da imunização por dose única no dia 0 com doses diferentes de vetores com base em rAd26 alojando o gene F de RSV, 5 dias depois da ameaça, com RSV A2 ou RSV B15/97.

[00057] A FIG. 22 mostra os títulos de VNA em soro de ratos do algodão depois da imunização por dose única no dia 0 com doses diferentes de vetores com base em rAd26 alojando o gene F de RSV, em diferentes momentos depois da vacinação inicial.

[00058] A FIG. 23 mostra os títulos de RSV pulmonares em ratos do algodão depois da imunização por dose única no dia 0 com doses diferentes de vetores com base em rAd26 alojando o gene F de RSV, 5 dias depois da ameaça, com uma dose padrão (105) ou uma dose elevada (5x105) de RSV A2.

[00059] A FIG. 24 mostra os títulos de RSV nasais em ratos do algodão depois da imunização por dose única no dia 0 com doses diferentes de vetores com base em rAd26 alojando o gene F de RSV, 5 dias depois da ameaça, com ameaça com uma dose padrão (105) ou uma dose elevada (5x105) de RSV A2.

[00060] A FIG. 25 mostra os títulos de RSV pulmonares em ratos do algodão depois da imunização no dia 0 e no dia 28 com doses diferentes de imunização única ou com vacinação inicial-reforço com vetores com base em rAd26 alojando o gene F de RSV, 5 dias depois da ameaça, com a ameaça efetuada 210 dias depois da imunização.

[00061] A FIG. 26 mostra os títulos VNA do soro de ratos do algodão depois da imunização por dose única e vacinação inicial- reforço, 140 dias após a imunização.

[00062] A FIG. 27 mostra o exame histopatológico dos pulmões de ratos do algodão no dia do sacrifício seguido pela imunização por dose única ou por vacinação inicial-reforço com diferentes doses de vetores com base em rAd26 alojando o gene F do RSV, 2 dias depois da ameaça. Os pontos representam a mediana e os filamentos os percentis 25 e 75.

[00063] A FIG. 28 mostra o exame histopatológico dos pulmões de ratos do algodão no dia do sacrifício seguido pela imunização por dose única ou por vacinação inicial-reforço com diferentes doses de vetores com base em rAd26 alojando o gene F do RSV, 6 dias depois da ameaça. Os pontos representam a mediana e os filamentos os percentis 25 e 75.

[00064] A FIG. 29 mostra a indução dos títulos de neutralização do vírus depois da imunização com rAd26 alojando o gene F de RSV (Ad26.RSV.F) seguida pelo reforço com Ad26.RSV.F ou com adjuvante da proteína F do RSV (após F).

[00065] A FIG. 30 mostra a indução de anticorpos de IgG2a e IgG1, e a razão indicada, após a imunização com Ad26.RSV.F seguida pelo reforço com Ad26.RSV.F ou pelo reforço com adjuvante da proteína F do RSV (após F).

[00066] A FIG. 31 mostra a produção de IFN-g pelos esplenócitos depois da imunização com Ad26.RSV.F seguida pelo reforço com Ad26.RSV.F ou com adjuvante da proteína F do RSV (após F).

Descrição detalhada da invenção

[00067] O termo "recombinante" para um adenovírus, conforme usado neste documento, implica que esse tenha sido modificado pela mão do homem, por exemplo, esse tenha extremidades terminais alteradas ativamente clonadas e/ou esse compreenda um gene heterólogo, ou seja, não é um tipo de adenovírus selvagem que ocorra naturalmente.

[00068] As sequências, neste documento, são fornecidas de 5 'para 3', como costume na técnica.

[00069] Uma "proteína da cápside do adenovírus" se refere a uma proteína na cápside de um adenovírus que está envolvido na determinação do serotipo e/ou tropismo de um adenovírus particular. As proteínas da cápside de adenovírus incluem, tipicamente, as proteínas de fibra, pentão e/ou hexão. Um adenovírus de (ou "com base em") um determinado serotipo de acordo com a invenção compreende, tipicamente, proteínas de fibra, pentão e/ou hexão desse determinado serotipo, e de preferência, compreende proteína de fibra, pentão e/ou hexão desse determinado serotipo. Essas proteínas são tipicamente codificadas pelo genoma do adenovírus recombinante. Um adenovírus recombinante de um determinado serotipo pode, opcionalmente, compreender e/ou codificar outras proteínas, a partir de outros serotipos de adenovírus. Desse modo, como exemplo não limitativo, um adenovírus recombinante que compreende hexão, pentão e fibra de Ad26 é considerado um adenovírus recombinante com base em Ad26.

[00070] Um adenovírus recombinante é "baseado em" um adenovírus, tal como utilizado neste documento, por derivação a partir do tipo selvagem, pelo menos, em sequência. Isso pode ser conseguido através da clonagem molecular, usando o genoma do tipo selvagem ou partes do mesmo, como material de partida. Também é possível utilizar a sequência do genoma conhecida de um adenovírus de tipo selvagem para gerar (partes de) o genoma de novo através da síntese do DNA, o que pode ser efetuado utilizando procedimentos de rotina através de empresas de serviços tendo atividade no campo da síntese de DNA e/ou de clonagem molecular (por exemplo, GeneArt, Invitrogen, GenScripts, Eurofins).

[00071] É entendido por um especialista na técnica que numerosos polinucleotídeos e ácidos nucleicos diferentes podem codificar o mesmo polipeptídeo, como um resultado da degenerescência do código genético. Também é entendido que os entendidos na técnica podem, usando técnicas de rotina, fazer substituições de nucleotídeos que não afetem a sequência do polipeptídeo codificado pelos polinucleotídeos descritos de modo a refletir a utilização de códons de qualquer organismo hospedeiro em particular naquele em que os os polipeptídeos devam ser expressos. Portanto, a menos que especificado de outra forma, uma "sequência de nucleotídeos codificando uma sequência de aminoácido" inclui todas as sequências de nucleotídeos que são versões degeneradas umas das outras e que codificam a mesma sequência de aminoácidos. As sequências de nucleotídeos que codificam proteínas e o RNA podem incluir íntrons.

[00072] Numa modalidade preferida, o ácido nucleico que codifica a proteína F do RSV ou um fragmento da mesma apresenta otimização de códons para a expressão em células de mamíferos, tais como células humanas. Os métodos de optimização dos códons são conhecidos e foram descritos anteriormente (por exemplo, WO 96/09378). Um exemplo de uma sequência com códons optimizados específica da proteína F do RSV é descrito na SEQ ID NO: 2 do documento EP 2102345 B1.

[00073] Numa modalidade, a proteína F do RSV é a partir de uma estirpe de RSV A2, e tem a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Numa modalidade particularmente preferida, o ácido nucleico que codifica a proteína F do RSV compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2. Foi descoberto pelos inventores que esta modalidade resulta em expressão estável e que uma vacina de acordo com esta modalidade confere uma proteção para a replicação do RSV no trato nasal e pulmonar, mesmo depois de uma dose única, que foi administrada por via intramuscular.

[00074] O termo "fragmento" conforme utilizado neste documento se refere a um peptídeo que tem uma deleção amino-terminal e/ou carboxi-terminal e/ou interna, mas em que a restante sequência de aminoácidos é idêntica às correspondentes posições na sequência de uma proteína F do RSV, por exemplo, a sequência de comprimento total de uma proteína F do RSV. Será apreciado que, para indução de uma resposta imune e, em geral, para fins de vacinação, uma proteína não precisa de ter comprimento total ou ter todas as suas funções de tipo selvagem, e que os fragmentos da proteína são igualmente úteis. De fato, os fragmentos da proteína F do RSV como F1 ou F solúvel mostraram ser eficazes na indução de respostas imunes, tal como o comprimento total F (Shao et al, 2009, Vaccine 27: 5460-71, Kohlmann et al, 2009, J Virol 83: 12601-12610). A incorporação de fragmentos de proteínas F correspondentes aos aminoácidos 255-278 ou 412-524 na imunização ativa induziu anticorpos de neutralização e alguma proteção contra a ameaça RSV (Sing et al, 2007, Immunol. 20, 261-275; Sing et al, 2007, Vaccine 25, 6211-6223).

[00075] Um fragmento de acordo com a invenção é um fragmento imunologicamente ativo, e tipicamente compreende, pelo menos 15 aminoácidos, ou pelo menos 30 aminoácidos da proteína F do RSV. Em certas modalidades, essa compreende pelo menos 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, ou 550 aminoácidos da proteína F do RSV.

[00076] O entendido na técnica também apreciará que podem ser feitas alterações a uma proteína, por exemplo, através das substituições, deleções, adições de aminoácidos, etc., por exemplo, utilizando procedimentos de rotina de biologia molecular. Geralmente, as substituições de aminoácidos conservativos podem ser aplicadas, sem perda de função ou imunogenicidade de um polipeptídeo. Isso pode ser facilmente verificado de acordo com os procedimentos de rotina bem conhecidos pelo entendido na técnica.

[00077] O termo "vacina" se refere a um agente ou composição contendo um componente ativo eficaz na indução de um grau terapêutico de imunidade num sujeito contra um determinado agente patogênico ou doença. Na presente invenção, a vacina compreende uma quantidade eficaz de um adenovírus recombinante que codifica uma proteína F do RSV, ou um fragmento antigênico da mesma, o que resulta em uma resposta imune contra a proteína F do RSV. Isto confere um método para prevenção de doenças graves do trato respiratório inferior levando à hospitalização e à diminuição da frequência de complicações, tais como pneumonia e bronquiolites devido à infeção pelo RSV e replicação em um sujeito. Desse modo, a invenção também confere um método para prevenção ou redução de doenças graves do trato respiratório inferior, prevenção ou redução (por exemplo encurtamento) da hospitalização, e/ou redução da frequência e/ou da gravidade da pneumonia ou bronquiolite provocada pelo RSV num sujeito, compreendendo a administração ao sujeito, por injeção intramuscular de uma composição compreendendo um adenovírus humano recombinante de serotipo 26 compreendendo ácido nucleico codificando uma proteína F do RSV ou um fragmento da mesma. O termo "vacina" de acordo com a invenção implica que é uma composição farmacêutica e, desse modo, inclui, tipicamente, um diluente, transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. Essa pode, ou não, compreender mais ingredientes ativos. Em certas modalidades essa pode ser uma vacina de combinação que compreende ainda outros componentes que induzem uma resposta imune contra, por exemplo, outras proteínas do RSV e/ou contra outros agentes infecciosos.

[00078] Os vetores da presente invenção são adenovírus recombinantes, também referidos como vetores de adenovírus recombinantes. A preparação dos vetores de adenovírus recombinantes é bem conhecida na técnica.

[00079] Em certas modalidades, um vetor de adenovírus de acordo com a invenção é deficiente em, pelo menos, uma função do gene essencial da Região E1, por exemplo, a região E1a e/ou a região E1b, do genoma do adenovírus que é necessário para a replicação viral. Em certas modalidades, um vetor de adenovírus de acordo com a invenção é deficiente em, pelo menos, parte da região E3 não essencial. Em certas modalidades, o vetor é deficiente em, pelo menos, uma função do gene essencial da região E1 e, pelo menos, parte da região E3 não essencial. O vetor de adenovírus pode ser "deficiente multiplicador", o que significa que o vetor de adenovírus é deficiente em uma ou mais funções do gene essencial em cada uma das duas ou mais regiões do genoma do adenovírus. Por exemplo, os acima mencionados vetores de adenovírus deficientes em E1 ou deficientes em E1, E3 também podem ser deficientes em pelo menos um gene essencial da região E4 e/ou pelo menos um gene essencial da região E2 (por exemplo, a região E2A e/ou a região E2B).

[00080] Os vetores de adenovírus, os métodos para a realização dos mesmos e os métodos para a propagação dos mesmos, são bem conhecidos na técnica e são descritos, por exemplo, nas Patentes dos E.U.A. N°s 5,559,099, 5,837,511, 5,846,782, 5,851,806, 5,994,106, 5,994,128, 5,965,541, 5,981,225, 6,040,174, 6,020,191, e 6,113,913, e em Thomas Shenk, "Adenoviridae and their Replication", M. S. Horwitz, "Adenovíruses", Capítulos 67 e 68, respectivamente, em Virology, B. N. Fields et al., eds., 3a ed., Raven Press, Ltd., Nova Iorque (1996), e outras referências mencionadas neste documento. Tipicamente, a construção de vetores de adenovírus envolve a utilização de técnicas padrão de biologia molecular, tais como as descritas em, por exemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, a Laboratory Manual, 2a ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. I. (1989), Watson et al., Recombinant DNA, 2a ed., Scientific American Books (1992), e Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers, NI (1995) e outras referências mencionadas neste documento.

[00081] De acordo com a invenção, um adenovírus é um adenovírus humano do serotipo 26. As vacinas de acordo com a invenção com base nesse serotipo, bem como aquelas com base no Ad35 surpreendentemente parecem mais potentes do que aquelas descritas na técnica anterior que tinham base em Ad5, uma vez que essas falharam ao conferir proteção completa contra a replicação da ameaça do RSV após uma única administração intramuscular (Kim et al, 2010, Vaccine 28: 3801-3808; Kohlmann et al, 2009, J Virol 83: 12601-12610; Krause et al, 2011, Virology Journal 8:375). O serotipo da presente invenção geralmente também tem uma baixa prevalência do soro e/ou baixos títulos de anticorpos de neutralização pré- existentes na população humana. Os vetores de adenovírus recombinantes desse serotipo e de Ad35 com diferentes genes são avaliados em ensaios clínicos, e, até agora, mostraram ter um excelente perfil de segurança. A preparação de vetores rAd26 é descrita, por exemplo, no documento WO 2007/104792 e em Abbink et al., (2007) Virol 81(9): 4654-63. Sequências genômicas exemplares de Ad26 se encontram no GenBank Accession EF 153474 e na SEQ ID NO:1 do documento WO 2007/104792. A preparação de vetores rAd35 é descrita, por exemplo, na Patente dos E.U..A 7,270,811, no documento WO 00/70071, e em Vogels et al., (2003) J Virol 77(15): 8263-71. Sequências genômicas exemplares de Ad35 se encontram no GenBank Accession AC_000019 e na Fig. 6 do documento WO 00/70071.

[00082] Um adenovírus recombinante de acordo com a invenção pode ser de replicação deficiente ou de replicação competente.

[00083] Em certas modalidades, o adenovírus é de replicação deficiente, por exemplo, porque contém uma deleção na região E1 do genoma. Conforme é do conhecimento do entendido na técnica, em caso de deleções de regiões essenciais do genoma do adenovírus, as funções codificadas por essas regiões têm de ser conferidas em trans, de preferência, pela célula produtora, isto é, quando as partes ou a totalidade das regiões E1, E2 e/ou E4 são deletadas do adenovírus, esses têm de estar presentes na célula produtora, por exemplo integrados no genoma da mesma, ou sob a forma dos chamados adenovírus auxiliares ou plasmídeos auxiliares. O adenovírus também pode ter uma deleção na região E3, que é dispensável para replicação, e, desse modo essa deleção não tem de ser complementada.

[00084] A célula produtora (por vezes também referida na técnica e neste documento como "célula empacotadora" ou "célula complementar" ou "célula hospedeira"), que pode ser utilizada pode ser qualquer célula produtora, em que pode ser propagado um adenovírus desejado. Por exemplo, a propagação de vetores de adenovírus recombinantes é efetuada em células produtoras que complementam deficiências no adenovírus. Tais células produtoras têm, de preferência, no seu genoma, pelo menos, uma sequência de adenovírus E1, e, desse modo, são capazes de complementar os adenovírus recombinantes com uma deleção na região E1. Pode ser utilizada qualquer célula produtora E1 complementar, tal como células da retina humana imortalizada por E1, por exemplo, células 911 ou PER.C6 (ver a Patente dos E.U.A. 5,994,128), amniócitos E1 transformados (ver a Patente EP 1230354), células A549 E1 transformadas (ver por exemplo, o documento WO 98/39411, patente dos E.U.A. 5,891,690), GH329:HeLa (Gao et aI, 2000, Human Gene Therapy 11: 213-219), 293, e semelhantes. Em certas modalidades, as células produtoras são por exemplo células HEK293, ou células PER.C6 ou células 911, ou células IT293SF, e semelhantes.

[00085] Para os adenovírus deficientes em E1 subgrupo não C, tais como Ad35 (subgrupo B) ou Ad26 (subgrupo D), é preferível trocar a sequência de codificação E4-orf6 desse adenovírus de subgrupo não C com E4-orf6 de um adenovírus de subgrupo C tal como Ad5. Isto permite a propagação desses adenovírus em linhagens celulares bem conhecidas complementares que expressam os genes E1 de Ad5, tais como, por exemplo, células 293 ou células PER.C6 (ver, por exemplo, Havenga et al, 2006, J. Gen. Virol. 87: 2135-2143; WO 03/104467, incorporado na sua totalidade neste documento por referência). Em certas modalidades, um adenovírus que pode ser utilizado é um adenovírus humano de serotipo 35, com uma deleção na região E1 na qual o ácido nucleico que codifica o antigênio da proteína F do RSV foi clonado, e com uma região E4 orf6 do Ad5. Em certas modalidades, o adenovírus da composição da vacina da invenção é um adenovírus humano de serotipo 26, com uma deleção na região E1 na qual o ácido nucleico que codifica o antigênio da proteína F do RSV foi clonado, e com uma região E4 orf6 do Ad5.

[00086] Em modalidades alternativas, não há necessidade de colocar uma região heteróloga E4orf6 (por exemplo de Ad5) no vetor de adenovírus, mas em vez disso é propagado o vetor deficiente E1 subgrupo não C numa linhagem celular que expressa tanto E1 como E4orf6 compatível, por exemplo, a linhagem celular 293-0RF6 que expressa tanto E1 como E40rf6 a partir de Ad5 (ver, por exemplo, Brough et al, 1996, J Virol 70: 6497-501 que descreve a geração de células 293-ORF6; Abrahamsen et al, 1997, J Virol 71: 8946-51 e Nan et al, 2003, Gene Therapy 10: 326-36 cada geração descrevendo os vetores de adenovírus de E1 deletado de subgrupo não C utilizando essa linhagem celular).

[00087] Alternativamente, pode ser utilizada uma célula complementar que expressa E1 a partir do serotipo que deve para ser propagado (ver, por exemplo o documento WO 00/70071, WO 02/40665).

[00088] Para os adenovírus de subgrupo B, tais como Ad35, contendo uma deleção na região E1, é preferível reter a extremidade 3' do quadro de leitura aberta E1B 55K no adenovírus, por exemplo, a 166 bp diretamente a montante do quadro de leitura aberta pIX ou um fragmento compreendendo este tal como um fragmento 243 bp, diretamente a montante do códon de iniciação pIX (marcado na extremidade 5' por um local de restrição Bsu36I no genoma Ad35), uma vez que isso aumenta a estabilidade do adenovírus, uma vez que o promotor do gene pIX está parcialmente residente nessa área (ver, por exemplo, Havenga et al, 2006, J. Gen. Virol. 87: 2135-2143; WO 2004/001032, incorporado neste documento por referência).

[00089] "Ácido nucleico heterólogo" (também referido neste documento como "transgene") em adenovírus da invenção é o ácido nucleico que não está naturalmente presente no adenovírus. Esse é introduzido no adenovírus, por exemplo, através de técnicas padrão de biologia molecular. Na presente invenção, o ácido nucleico heterólogo codifica a proteína F do RSV ou um fragmento da mesma. Esse pode, por exemplo, ser clonado numa região deletada E1 ou E3 de um vetor de adenovírus. Um transgene está, geralmente, operacionalmente ligado a sequências de controle de expressão. Isso pode, por exemplo, ser feito através da colocação do ácido nucleico que codifica o(s) transgene(s) sob o controle de um promotor. Podem ser adicionadas sequências regulatórias adicionais. Muitos promotores podem ser usados para a expressão de um transgene(s), e são conhecidos pelos entendidos na técnica. Um exemplo não limitativo de um promotor adequado para a obtenção de expressão em células eucarióticas é um promotor de CMV (US 5,385,839), por exemplo, o promotor precoce imediato de CMV, por exemplo, compreendendo nt. -735 a +95 do promotor/potenciador precoce imediato de CMV. Um sinal de poliadenilação, por exemplo, o sinal poliA da hormona de crescimento dos bovino (US 5,122,458), pode estar presente por trás do(s) transgene(s).

[00090] Em certas modalidades, os vetores recombinantes Ad26 da invenção compreendem como nucleotídeos terminais 5' a sequência de nucleotídeo: CTATCTAT. Estas modalidades são vantajosas uma vez que esses vetores exibem uma replicação melhorada nos processos de produção, resultando em lotes de adenovírus com homogeneidade melhorada, quando comparadas com os vetores tendo as sequências terminais 5' (geralmente CATCATCA) (ver também os Pedidos de Patente N°s PCT/EP2013/054846 e US 13/794,318, entitulados ‘Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends’ submetidos a 12 de março de 2012 no nome de Crucell Holland B.V.), incorporados na sua totalidade para referência. Desse modo, a invenção também confere lotes de adenovírus recombinante que codificam a proteína F do RSV ou uma parte da mesma, em que o adenovírus é um adenovírus humano de serotipo 26, e em que, essencialmente a totalidade (por exemplo, pelo menos 90%) do adenovírus no lote compreende um genoma com sequência de nucleotídeos terminal CTATCTAT.

[00091] De acordo com a invenção, a proteína F do RSV pode ser derivada a partir de qualquer estirpe de RSV de ocorrência natural ou recombinante, de preferência a partir de estirpes de RSV humanas, tal como estirpes A2, Longo, ou B. Em outras modalidades, a sequência pode ser uma sequência de consenso baseada em uma pluralidade de sequências de aminoácidos da proteína F do RSV. Num exemplo da invenção, a estirpe do RSV é a estirpe A2 do RSV.

[00092] De acordo com a invenção, a proteína F do RSV pode ser a proteína de comprimento total F do RSV ou um fragmento da mesma. Em uma modalidade da invenção, a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína F do RSV codifica a totalidade do comprimento da proteína F do RSV (F0), tal como o aminoácido de SEQ ID NO: 1. Em um exemplo da invenção, a sequência de nucleotídeos que codifica a proteína F do RSV possui a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2. Alternativamente, a sequência que codifica a proteína F do RSV pode ser qualquer sequência que seja pelo menos cerca de 80%, de preferência mais do que cerca de 90%, mais preferivelmente pelo menos cerca 95%, idêntica à sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 2. Noutras modalidades, podem ser utilizadas as sequências com códons optimizados, tais como, por exemplo, as conferidas nas SEQ ID NO: 2, 4, 5 ou 6 do documento WO 2012/021730.

[00093] Noutra modalidade da invenção, a sequência de nucleotídeos pode, alternativamente, codificar um fragmento da proteína F do RSV. O fragmento pode resultar de uma ou de ambas as deleções amino-terminal e carboxi-terminal. A extensão da deleção pode ser determinada por um entendido na técnica de modo a, por exemplo, conseguir um melhor rendimento do adenovírus recombinante. O fragmento irá ser escolhido de modo a incluir um fragmento imunologicamente ativo da proteína F, ou seja, uma parte que irá dar origem a uma resposta imune em um sujeito. Isto pode ser facilmente determinado utilizando métodos in sílico, in vitro e/ou in vivo, todos rotina para o entendido na técnica. Em uma modalidade da presente invenção, o fragmento é uma proteína transmembranar que codifica a região truncada da proteína F do RSV (F0ΔTM, ver por exemplo, o documento US 20110014220). Os fragmentos da proteína F também podem ser domínio F1 ou domínio F2 da proteína F. Os fragmentos de F também podem ser fragmentos contendo epitopos de neutralização e epitopos de células T (Sing et al, 2007, Virol. Immunol. 20, 261-275; Sing et al, 2007, Vaccine 25, 6211-6223).

[00094] O termo "cerca de" em valores numéricos conforme utilizado na presente divulgação significa o valor de ± 10%.

[00095] Em certas modalidades, a invenção confere métodos para produção de uma vacina contra o vírus sincicial respiratório (RSV), compreendendo o fornecimento de um adenovírus humano recombinante de serotipo 26, que compreende ácido nucleico codificando uma proteína F do RSV ou um fragmento da mesma, a propagação do referido adenovírus recombinante em uma cultura de células hospedeiras, isolando e purificando o adenovírus recombinante, e trazendo o adenovírus recombinante em uma composição farmaceuticamente aceitável.

[00096] O adenovírus recombinante pode ser propagado e preparado em células hospedeiras, de acordo com métodos bem conhecidos, que envolvem a cultura celular das células hospedeiras que são infetadas com o adenovírus. A cultura celular pode ser qualquer tipo de cultura celular, incluindo a cultura de células aderentes, por exemplo, células ligadas à superfície de um recipiente de cultura ou a microtransportadores, bem como cultura de suspensão.

[00097] A maioria das culturas de suspensão de grande escala é efetuada como processos descontínuos ou descontínuos alimentados, uma vez que esses são os mais simples de efetuar e ampliar. Hoje em dia, os processos contínuos com base em princípios de perfusão estão-se tornando cada vez mais comuns e são também adequados (ver por exemplo os documentos WO 2010/060719, e WO 2011/098592, ambos incorporados neste documento por referência, que descrevem métodos adequados para obtenção e purificação de grandes quantidades de adenovírus recombinantes).

[00098] Células produtoras são cultivadas de forma a aumentar o número de células e de vírus e/ou títulos do vírus. A cultura de uma célula é feita de forma a permitir que essa metabolize, e/ou cresça e/ou se divida e/ou produza vírus de interesse de acordo com a invenção. Isso pode ser efetuado por métodos como os bem conhecidos pelos entendidos na técnica, e inclui, mas não está limitado ao fornecimento de nutrientes às células, por exemplo, no meio de cultura apropriado. Meios de cultura adequados são bem conhecidos do entendido na técnica e podem ser geralmente obtidos a partir de fontes comerciais, em grandes quantidades, ou feitos de modo customizado de acordo com os protocolos padrão. A cultura pode ser feita, por exemplo, em placas, frascos rotativos ou em biorreatores, usando sistemas contínuos, descontínuos, descontínuos alimentados e semelhantes. São conhecidas as condições apropriadas para a cultura de células (ver, por exemplo, Tissue Culture, Academic Press, Kruse e Paterson, editores (1973), e R.I. Freshney, Culture of animal cells: A manual of basic technique, quarta edição (Wiley-Liss Inc., 2000, ISBN 0-471-34889-9).

[00099] Tipicamente, o adenovírus será exposto à célula produtora adequada em uma cultura, o que permite a captação do vírus. Habitualmente, a agitação ótima ocorre entre cerca de 50 e 300 rpm, tipicamente cerca de 100-200, por exemplo, cerca de 150, DO típica é de 20-60%, por exemplo, 40%, o pH ótimo é entre 6,7 e 7,7, a temperatura ótima entre 30 e 39 °C, por exemplo 34-37 °C, e a MOI ótima entre 5 e 1000, por exemplo, cerca de 50-300. Tipicamente, o adenovírus infeta as células produtoras espontaneamente, e colocando as células produtoras de partículas em contato com o rAd é suficiente para a infeção das células. Geralmente, é adicionado um estoque de sementes do adenovírus à cultura de forma a iniciar a infeção e, subsequentemente, o adenovírus se propaga nas células produtoras. Tudo isso é rotina para o entendido na técnica.

[000100] Após a infeção de um adenovírus, o vírus se replica dentro da célula e é, desse modo, amplificado, um processo referido neste documento como propagação de adenovírus. A infeção do adenovírus resulta, finalmente, na lise das células a serem infetadas. As características líticas do adenovírus permitem, por esse motivo, dois modos diferentes de produção de vírus. O primeiro modo é a colheita do vírus antes da lise celular, empregando fatores externos para a lise das células. O segundo modo é a colheita do vírus sobrenadante após a (quase) completa lise das células pelo vírus produzido (ver por exemplo, a patente dos E.U.A. 6,485,958, que descreve a colheita de adenovírus sem lise das células hospedeiras por um fator externo). É preferível utilizar fatores externos para lisar ativamente as células para a colheita do adenovírus.

[000101] Os métodos que podem ser utilizados para a lise ativa das células são conhecidos do entendido na técnica, e têm, por exemplo, sido discutidos no documento WO 98/22588, pg. 28-35. Os métodos úteis a este respeito são, por exemplo, congelamento- descongelamento, cisalhamento sólido, lise hipertônica e/ou hipotônica, cisalhamento líquido, sonicação, extrusão a alta pressão, lise com detergente, combinações dos anteriores, e semelhantes. Em uma modalidade da invenção as células são lisadas usando, pelo menos, um detergente. A utilização de um detergente para a lise tem a vantagem de ser um método fácil, e de ser facilmente escalável.

[000102] Os detergentes que podem ser utilizados, e a forma como esses são utilizados, são geralmente conhecidos pelo entendido na técnica. Vários exemplos são, por exemplo, discutidos no documento WO 98/22588, pg. 29-33. Os detergentes podem incluir detergentes aniônicos, catiônicos, zwitteriônicos, e não iônicos. A concentração do detergente pode ser variada, por exemplo, dentro de uma escala de cerca de 0,1% -5% (p/p). Em uma modalidade, o detergente utilizado é Triton X-I00.

[000103] A nuclease pode ser utilizada para remover contaminantes, ou seja, principalmente a partir da célula produtora, ácidos nucleicos. Exemplos de nucleases adequadas para utilização na presente invenção incluem Benzonase®, Pulmozyme®, ou qualquer outra DNase e/ou RNase vulgarmente utilizadas na técnica. Em modalidades preferidas, a nuclease é Benzonase®, que hidrolisa rapidamente os ácidos nucleicos através da hidrólise internas das ligações fosfodiéster entre nucleotídeos específicos, reduzindo, desse modo, a viscosidade do lisado celular. A Benzonase® pode ser comercialmente obtida a partir da Merck KGaA (código W214950). A concentração em que a nuclease é utilizada está, de preferência, dentro da escala de 1 a 100 unidades/ml. Alternativamente, ou em adição ao tratamento com nuclease, também é possível, precipitar seletivamente o DNA da célula hospedeira para fora das preparações de adenovírus, durante a purificação de adenovírus, usando agentes de precipitação seletivos tais como o brometo de domifeno (ver por exemplo, o documento US 7,326,555; Goerke et al., 2005, Biotechnology and bioengineering, Vol. 91: 12-21; WO 2011/045378; WO 2011/045381).

[000104] Os métodos para a colheita a partir de culturas de adenovírus de células produtoras foram extensivamente descritos no documento WO 2005/080556.

[000105] Em certas modalidades, o adenovírus recolhido sofre purificação adicional. A purificação do adenovírus pode ser efetuada em vários passos, compreendendo a clarificação, ultrafiltração, diafiltração ou separação com cromatografia, conforme descrito, por exemplo, no documento WO 05/080556, incorporado, neste documento, para referência. A clarificação pode ser efetuada através de um passo de filtração, removendo os detritos celulares e outras impurezas do lisado celular. A ultrafiltração é utilizada para concentrar a solução do vírus. A diafiltração, ou a mudança de tampão, utilizando ultrafiltros é uma forma para remover e trocar sais, açúcares e semelhantes. O entendido na técnica sabe como encontrar as condições ótimas para cada etapa de purificação. O documento WO 98122588, incorporado neste documento na sua totalidade para referência, também descreve métodos para a produção e purificação de vetores de adenovírus. Os métodos compreendem o crescimento de células hospedeiras, infetar as células hospedeiras com adenovírus, recolher e lisar as células hospedeiras, concentrar o lisado em bruto, trocar o tampão do lisado em bruto, tratar o lisado com nuclease, e também purificar o vírus, utilizando cromatografia.

[000106] De preferência, a purificação utiliza pelo menos uma etapa de cromatografia, como, por exemplo, discutido no documento WO 98/22588, pg. 61-70. Têm sido descritos muitos processos para a purificação adicional de adenovírus, em que as etapas de cromatografia são incluídas no processo. O entendido na técnica estará ciente desses processos, e pode variar a forma exata de utilização das etapas cromatográficas de modo a otimizar o processo. É possível, por exemplo, purificar os adenovírus através de etapas de cromatografia de troca aniônica, ver por exemplo o documento WO 2005/080556 e Konz et al, 2005, Hum Gene Ther 16: 1346-1353. Já foram descritos muitos outros métodos de purificação de adenovírus e estão dentro do alcance do entendido na técnica. Outros métodos para a produção e purificação de adenovírus são divulgados, por exemplo, em (WO 00/32754; WO 04/020971; US 5,837,520; US 6,261,823; WO 2006/108707; Konz et al, 2008, Methods Mol Biol 434: 13-23; Altaras et al, 2005, Adv Biochem Eng Biotechnol 99: 193-260), todosincorporados neste documento por referência.

[000107] Para a administração a seres humanos, a invenção pode utilizar composições farmacêuticas compreendendo rAd e um transportador ou excipiente farmaceuticamente aceitável. No presente contexto, a expressão "Farmaceuticamente aceitável" significa que o transportador ou excipiente, nas dosagens e concentrações utilizadas, não irá provocar quaisquer efeitos indesejados ou nocivos nos sujeitos nos quais são administrados. Tais transportadores e excipientes farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na técnica (ver Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edição, A. R. Gennaro, Ed., Mack Publishing Company [1990]; Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins, S. Frokjaer e L. Hovgaard, Eds., Taylor & Francis [2000]; e Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a adição, A. Kibbe, Ed., Pharmaceutical Press [2000]). O rAd purificado é, de preferência, formulado e administrado como uma solução estéril, embora também seja possível utilizar preparações liofilizadas. Soluções estéreis são preparadas por filtração estéril ou por outros métodos conhecidos per se na técnica. As soluções são, de seguida, liofilizadas ou colocadas em recipientes de dosagem farmacêutica. O pH da solução, geralmente, está na escala de pH de 3,0 a 9,5, por exemplo, pH 5,0 a 7,5. O rAd está, tipicamente, em uma solução possuindo um tampão farmaceuticamente aceitável adequado, e a solução de rAd também pode conter um sal. Opcionalmente pode estar presente um agente de estabilização, tal como a albumina. Em certas modalidades, é adicionado detergente. Em certas modalidades, rAd pode ser formulado em uma preparação injetável. Estas formulações contêm quantidades eficazes de rAd, ou são soluções estéreis líquidas, suspensões líquidas ou versões liofilizadas e, opcionalmente, contêm estabilizadores ou excipientes. Uma vacina de adenovírus também pode ser transformada em aerossol para administração intranasal (ver por exemplo o documento WO 2009/117134).

[000108] Por exemplo, o adenovírus pode ser armazenado no tampão, que também é utilizado para o Adenovirus World Standard (Hoganson et al, Development of a stable adenoviral vetor formulation, Bioprocessing março 2002, pg. 43-48): 20 mM de Tris pH 8, 25 mM de NaCl, glicerol a 2.5%. Outra formulação tampão útil adequada para administração a seres humanos é 20 mM de Tris, 2 mM de MgCl2, 25 mM de NaCl, sacarose a 10% p/v, polisorbato-80 a 0,02% p/v. Obviamente, podem ser usados muitos outros tampões, e vários exemplos de formulações adequadas para o armazenamento e para a administração farmacêutica de preparações purificadas de (adeno)vírus, por exemplo, podem ser encontrados, por exemplo, na patente europeia n°. 0853660, na patente dos E.U.A. 6,225,289 e nos pedidos de patentes internacionais WO 99/41416, WO 99/12568, WO 00/29024, WO 01/66137, WO 03/049763, WO 03/078592, WO 03/061708.

[000109] Em certas modalidades uma composição compreendendo os adenovírus também compreende um ou mais adjuvantes. Os adjuvantes são conhecidos na técnica, por aumentarem ainda mais a resposta imunitária a um determinante antigênico aplicado, e composições farmacêuticas compreendendo adenovírus e adjuvantes adequados são divulgadas, por exemplo, no documento WO 2007/110409, incorporado neste documento por referência. Os termos "adjuvante" e "estimulante imune" são utilizados, neste documento, indiscriminadamente, e são definidos como uma ou mais substâncias que provocam estimulação do sistema imune. Neste contexto, é utilizado um adjuvante para melhorar uma resposta imune para os vetores de adenovírus da invenção. Exemplos de adjuvantes adequados incluem sais de alumínio, tais como o hidróxido de alumínio e/ou o fosfato de alumínio; composições em emulsão em óleo (ou composições de óleo-em-água), incluindo emulsões de esqualeno em água, tal como MF59 (ver, por exemplo, o documento WO 90/14837); formulações de saponina, tais como, por exemplo, QS21 e Complexos Imunoestimulantes (ISCOMS) (ver, por exemplo os documentos US 5,057,540; WO 90/03184, WO 96/11711, WO 2004/004762, WO 2005/002620); derivados bacterianos ou microbianos, exemplos dos quais são monofosforil-lípido A (MPL), 3- O-desacilado MPL (3dMPL), oligonucleotídeos contendo motivo CpG, as toxinas bacterianas de ribosilação ADP ou mutantes das mesmas, tais como a enterotoxina LTda E. coli instável ao calor, a toxina da cólera CT, e semelhantes. Também é possível utilizar adjuvantes codificados do vetor, por exemplo, através da utilização do ácido nucleico heterólogo que codifica uma fusão do domínio de oligomerização da proteína de ligação C4 (C4bp) com o antigênio de interesse (por exemplo, Solabomi et al, 2008, Infect Immun 76: 381723). Em certas modalidades as composições da invenção compreendem alumínio como um adjuvante, por exemplo, na forma de hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, fosfato de alumínio e potássio, ou combinações dos mesmos, em concentrações de 0,05 -5 mg, por exemplo, 0,075-1,0 mg, de conteúdo de alumínio por dose.

[000110] Em outras modalidades, as composições não incluem adjuvantes.

[000111] Também é possível, de acordo com a invenção, administrar outros componentes ativos, em combinação com as vacinas de acordo com a invenção. Esses componentes ativos adicionais podem compreender, por exemplo, outros antigênios do RSV ou vetores compreendendo ácido nucleico que codifica esses. Tais vetores podem ser não adenovirais ou adenovirais, dos quais o último pode ser de qualquer serotipo. Um exemplo de outros antigênios do RSV inclui a proteína G do RSV ou partes imunologicamente ativas da mesma. Por exemplo, o adenovetor rAd/3xG à base de Ad5 deficiente Ad5 de replicação recombinante aplicado por via intranasal, que expressa o domínio de núcleo solúvel da glicoproteína G (aminoácidos 130 a 230) foi protetor em um modelo de murino (Yu et al, 2008, J Virol 82: 2350-2357), e embora não fosse protetor quando aplicado por via intramuscular, é claro a partir desses dados que a G do RSV é um antígeno apropriado para induzir respostas protetoras. Outros componentes ativos podem também compreender antigênios não- RSV, por exemplo, a partir de outros agentes patogênicos, tais como vírus, bactérias, parasitas, e semelhantes. A administração de componentes ativos adicionais pode, por exemplo, ser feita através da administração em separado ou através da administração de produtos de combinação de vacinas da invenção e dos componentes ativos adicionais. Em certas modalidades, podem ser codificados antigênios não adenovirais adicionais (além de RSV.F), nos vetores da invenção. Em certas modalidades, pode ser assim desejável expressar mais do que uma proteína a partir de um único adenovírus, e nesses casos mais sequências de codificação, por exemplo, podem ser ligadas de modo a formar um único transcrito a partir de um único cassete de expressão, ou podem estar presentes em dois cassetes de expressão separados clonados em diferentes partes do genoma do adenovírus.

[000112] As composições de adenovírus podem ser administradas a um sujeito, por exemplo, um ser humano. A dose total do adenovírus conferida a um sujeito durante uma administração pode ser variada conforme é conhecido do entendido na técnica, e está geralmente entre 1x107 partículas virais (vp) e 1x1012 vp, preferencialmente entre 1x108 vp e 1x1011 vp, por exemplo entre 3x108 e 5x1010 vp, por exemplo, entre 109 e 3x1010 vp.

[000113] A administração de composições de adenovírus pode ser efetuada utilizando vias de administração padrão. As modalidades não limitativas incluem a administração parentérica, tais como por exemplo por injeção intradérmica, intramuscular etc., ou por administração subcutânea, transcutânea, ou na mucosa, por exemplo, intranasal, oral e semelhantes. A administração intranasal tem sido geralmente considerada como uma via preferida para as vacinas contra o RSV. A vantagem mais importante da estratégia in vivo é a estimulação direta da imunidade do trato respiratório local e a ausência de agravamento da doença associada. As únicas vacinas em avaliação clínica para utilização pediátrica no presente momento são vacinas intranasais in vivo (Collins e Murphy. Vaccines against human respiratory syncytial virus). Em: Perspectives in Medical Virology 14: Respiratory Syncytial Virus (Ed. Cane, P.), Elsevier, Amsterdão, Holanda, pg. 233-277). A administração intranasal representa uma via preferida adequada de acordo com a presente invenção. Contudo, é particularmente preferida de acordo com a presente invenção administrar a vacina intramuscularmente, uma vez que foi surpreendentemente verificado que a administração intramuscular da vacina de acordo com a invenção resultou na proteção contra a replicação do RSV no nariz e nos pulmões de ratos do algodão, ao contrário das vacinas do RSV intramusculares anteriormente relatadas com base em outros serotipos de adenovírus. A vantagem da administração intramuscular é que essa é simples e está bem estabelecida, e não implica preocupações de segurança para aplicação nasal nas crianças menores do que 6 meses. Em uma modalidade é administrada uma composição através de injeção intramuscular,, por exemplo, no músculo deltoide do braço, ou no músculo vasto lateral da coxa. O entendido conhece as várias possibilidades para administrar uma composição, por exemplo, uma vacina de forma a induzir uma resposta imunitária ao(s) antigênio(s) na vacina.

[000114] Um sujeito, conforme utilizado neste documento é de preferência um mamífero, por exemplo, um roedor por exemplo, um camundongo, um rato do algodão, ou um primata não humano, ou um ser humano. Preferencialmente, o sujeito é um ser humano. O sujeito pode ser de qualquer idade, por exemplo, de cerca de 1 mês a 100 anos de idade, por exemplo, de cerca de 2 meses a cerca de 80 anos de idade, por exemplo, de cerca de 1 mês a cerca de 3 anos de idade, de cerca de 3 anos a cerca de 50 anos de idade, de cerca de 50 anos a cerca de 75 anos de idade, etc.

[000115] Também é possível conferir uma ou mais administrações de reforço de uma ou mais vacinas de adenovírus da invenção. Se for efetuado um reforço da vacinação, tipicamente, esse reforço de vacinação irá ser administrado ao mesmo sujeito num momento entre uma semana e um ano, de preferência entre duas semanas e quatro meses, depois da administração da composição ao sujeito pela primeira vez (que é, nesses casos referida como "vacinação inicial"). Em regimes de reforço alternativos, também é possível administrar diferentes vetores, por exemplo, um ou mais adenovírus de serotipo diferente, ou outros vetores, tais como MVA ou DNA, ou proteína, ao sujeito depois da vacinação inicial. É por exemplo possível administrar ao sujeito um vetor de adenovírus recombinante de acordo com a invenção como vacinação inicial, e reforçar com uma composição compreendendo a proteína F do RSV.

[000116] Em certas modalidades, a administração compreende uma administração inicial e, no mínimo, uma administração de reforço. Em certas modalidades da mesma, a administração inicial é com rAd35 compreendendo o ácido nucleico que codifica a proteína F do RSV ou um fragmento da mesma (‘rAd35-RSV.F’) e a administração de reforço é com rAd26 compreendendo o ácido nucleico que codifica a proteína F do RSV de acordo com a a invenção (‘rAd26-RSV.F’). Em outras modalidades da mesma, a administração inicial é com rAd26-RSV.F e a administração de reforço é com rAd35-RSV.F. Em outras modalidades, tanto a administração inicial como a de reforço são com rAd26.RSV.F. Em certas modalidades, a administração inicial é com rAd26-RSV.F e a administração de reforço é com a proteína F do RSV. Em todas estas modalidades, é possível conferir outras administrações de reforço com os mesmos ou outros vetores ou proteína. As modalidades em que o reforço com a proteína F do RSV pode ser particularmente benéfico incluem, por exemplo, sujeitos idosos em grupos de risco (por exemplo, tendo asma ou DPOC) de 50 anos ou mais, ou por exemplo, em sujeitos saudáveis de 60 anos ou mais ou 65 anos ou mais.

[000117] Em certas modalidades, a administração compreende uma única administração de um adenovírus recombinante de acordo com a invenção, sem administrações adicionais (reforço). Tais modalidades são vantajosas tendo em conta a complexidade e os custos de um único regime de administração única, em comparação com um regime de vacinação inicial-reforço. A proteção completa já é observada depois de uma única administração dos vetores de adenovírus recombinantes da invenção sem administrações de reforço no modelo do rato do algodão nos exemplos deste documento.

[000118] A invenção é adicionalmente explicada nos exemplos seguintes. Os exemplos não limitam a invenção de qualquer forma. Esses servem meramente para clarificar a invenção.

EXEMPLOS Exemplo 1. Preparação de vetores de adenovirus Clonagem do gene F do RSV na região E1 de Ad35 e Ad26:

[000119] O gene RSV.F(A2)nat, que codifica a proteína (F) de fusão do RSV nativa da estirpe A2 (Genbank ACO83301.1), foi otimizado para a expressão do gene humano e sintetizado, pela Geneart. Uma sequência de Kozak (5’ GCCACC 3’) foi incluída em frente do códon de início ATG, e dois códons de terminação (5’ TGA TAA 3’) foram adicionados na extremidade da sequência de codificação de RSV.F(A2)nat. O gene RSV.F(A2)nat foi inserido no plasmídeo pAdApt35BSU e no plasmídeo pAdApt26 através de locais HindIII e XbaI. Os plasmídeos resultantes, pAdApt35BSU.RSV.F(A2)nat e pAdApt26.RSV.F(A2)nat estão representados na Fig. 15. A sequência de aminoácidos da proteína F, e a sequência otimizada do códon que codifica essa sequência de aminoácido, são fornecidas na Tabela 1 como SEQ. ID. NOs: 1 e 2, respectivamente. Cultura celular:

[000120] Células PER.C6 (Fallaux et al., 1998, Hum Gene Ther 9: 1909-1917) foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com 10% de soro de feto de bovino (FBS), suplementado com 10 mM de MgCl2. Geração de adenovírus, infeções e passagem:

[000121] Todos os adenovírus foram gerados em células PER.C6 através da recombinação homóloga simples e produzidos conforme anteriormente descrito (para rAd35: Havenga et al., 2006, J. Gen. Virol. 87: 2135-2143; para rAd26: Abbink et al., 2007, J. Virol. 81: 4654-4663). Resumidamente, as células PER.C6 foram transfetadas com plasmídeos de vetor Ad, utilizando Lipofectamina de acordo com as instruções fornecidas pelo fabricante (Life Technologies). Para resgate dos vetores de Ad35 que transportamo cassete de expressão do transgene RSV.F(A2)nat, foram utilizados o plasmídeo pAdApt35BSU.RSV.F(A2)nat e o cosmídeo pWE/Ad35.pIX- rITR.dE3.5orf6, enquanto que para os vetores de Ad26 que transportavam o cassete de expressão do transgene RSV.F(A2)nat, foram utilizados o plasmídeo pAdApt26.RSV.F(A2)nat e o cosmídeo pWE.Ad26.dE3.5orf6. As células foram colhidas um dia após a CPE completa, congeladas-descongeladas, centrifugadas durante 5 min a 3.000 rpm, e armazenadas a 20 °C. De seguida, os vírus foram purificados em placas e amplificados em células PER.C6 cultivadas em um único poço de uma placa de cultura de tecido de 24 multipoços. Foi efetuada amplificação adicional em células PER.C6 cultivadas utilizando um frasco de cultura de tecido T25 e um balão de cultura de tecido T175. Do lisado em bruto T175, foram utilizados 3 a 5 ml para inocular 20*T175 frascos de cultura de tecidos de tripla camada contendo 70% de camadas confluentes de células de PER.C6. O vírus foi purificado utilizando um método de purificação CsCl de duas etapas. Finalmente, o vírus foi armazenado em alíquotas a 85 °C.

Exemplo 2. Indução de imunidade contra F do RSV utilizando serotipos 26 e 35 de adenovírus recombinantes in vivo.

[000122] Essa é uma experiência para investigar a capacidade de o serotipo de adenovírus recombinante (Ad26) e de o serotipo de adenovírus recombinante 35 (Ad35) induzirem imunidade contra o antigênio da glicoproteína F do RSV em camundongos BALB/c.

[000123] Nesse estudo os animais foram distribuídos em grupos experimentais de 5 camundongos. Os animais foram imunizados com uma única dose de Ad26 ou de Ad35 transportando o gene F do RSV de comprimento total (Ad26-RSV.F ou Ad35- RSV.F) ou sem qualquer transgene (Ad26e ou Ad35e). Três diluições em série de 10 vezes de rAd variando de 1010 a 108 partículas virais (vp), foram administradas por via intramuscular.Como controles, um grupo de 3 animais recebeu o vetor Ad26 vazio e um grupo recebeu o vetor Ad35e vazio.

[000124] O ensaio ELISPOT é usado para determinar o número relativo de células T secretando IFNy específico para a proteína F no baço, e é essencialmente efetuado conforme descrito por Radosevic et al. (Clin Vaccine Immunol. 2010;17(11):1687-94.). Para a estimulação de esplenócitos no ensaio ELISPOT, foram utilizados dois conjuntos de peptídeos constituídos por 11 aminoácidos sobrepondo peptídeos 15-mer abrangendo a totalidade da sequência da proteína F do RSV (A2). Foi calculado o número de unidades formadoras de mancha (SFU) por 106 células.

[000125] Para a determinação dos títulos de anticorpos foi utilizado um ensaio de ELISA. Para isso, as placas de ELISA (Thermo Scientific) foram revestidas com 25 μg/ml do antigênio RSV Longo totalmente inativado (Virion Serion, cat# BA113VS). Amostras de soro diluídas foram adicionadas às placas, e os anticorpos IgG contra o RSV foram determinados utilizando biotina marcada anti-camundongo IgG (DAKO, cat# E0413), utilizando a deteção por peroxidase de raiz forte, (PO) conjugada a estreptavidina (SA). Os títulos foram calculados por interpolação linear, utilizando-se 1,5 x sinais OD a partir de soro ingênuo diluído 50 x como corte. Os títulos de anticorpos IgG1 e IgG2a específicos do RSV no soro do camundongo foram determinados utilizando IgG1 anti-camundongo marcado com PO e o IgG2a anti-camundongo marcado com PO (Southern Biotechnology Associates, cat#s 1070-05 e 1080-05) foi usado para quantificar as subclasses.

[000126] A atividade de neutralização do vírus (VNA) dos anticorpos foi determinada através de ensaio por microneutralização, efetuado essencialmente conforme descrito por Johnson et al. (J Infect Dis. 1999 jul;180(1):35-40.). Células VERO suscetíveis a RSV foram semeadas em placas de cultura de células de 96 poços, um dia antes da infeção. No dia da infeção, os soros diluídos em série e os controles foram misturados com 1.200 pfu do RSV (Longo ou B1) e incubados 1 h a 37 °C. Subsequentemente, as misturas de vírus/anticorpo foram transferidas para placas de 96 poços contendo monocamadas de células VERO. Três dias mais tarde, as monocamadas foram fixadas com acetona a frio a 80% e o antigênio do RSV foi determinado com um anticorpo monoclonal anti-F. O título de neutralização é expresso como a diluição do soro (log2), que provoca uma redução de 50% na OD450 dos poços de controle apenas com vírus (IC50).

[000127] Na semana 2 e na semana 8 após a dose inicial os animais foram sacrificados e as respostas celulares e humorais foram monitorizadas conforme descrito acima.

[000128] A Fig. 1 mostra que todas as doses de Ad26-RSV.F (Fig. 1A) e Ad35-RSV.F (Fig. 1B) foram eficazes na indução de uma boa resposta celular imunológica e que as respostas eram estáveis ao longo do tempo. Não foram observadas diferenças significativas da dose de vetor na resposta das células T tanto com Ad26-RSV.F ou Ad35-RSV.F.

[000129] A Fig. 2 mostra os títulos de anticorpos na mesma experiência, conforme descrito acima. Ambos os vetores induziram aumento de tempo muito claro e dependente da dose nos títulos de ELISA (Fig. 2.). Títulos anti-F aumentaram claramente de 2 para 8 semanas, o que foi significativo para a dose 1010. Às 8 semanas, não houve diferença nos títulos entre o vetor Ad26-RSV.F e Ad35-RSV.F.

[000130] A distribuição de subclasse (IgG1 vs IgG2a) de IgG específico para F foi determinada de forma a avaliar o balanço da resposta de Th1 vs Th2. Uma resposta enviesada Th2/Th1 predispõe os animais a desenvolverem a doença RSV agravada pela vacina, conforme visto com RSV inativado com formalina. Conforme mostrado na Fig. 3, a razão de IgG2a/IgG1 para ambos Ad26-RSV.F e Ad35- RSV.F é maior do que 1. Isto indica fortemente que os adenovetores Ad26-RSV.F e Ad35-RSV.F exibem um tipo de resposta Th1 em vez de um tipo Th2.

[000131] A Fig. 4 mostra os títulos de neutralização de vírus (VNA) dos mesmos soros utilizados para os títulos de anticorpos. A imunização com Ad26-RSV.F e rAd35-RSV.F levou à indução de títulos de anticorpos de neutralização. Os títulos VNA aumentaram fortemente entre duas e oito semanas depois do reforço nos camundongos que receberam 1010 vp. Às oito semanas, não houve diferença nos títulos entre os vetores Ad26-RSV.F e Ad35-RSV.F nos camundongos que receberam 1010 vp.

[000132] A partir destas experiências de imunização é evidente que os vetores Ad35 e Ad26 que alojam o transgene RSV.F induzem fortes respostas celulares e humorais contra RSV.F.

Exemplo 3. Imunidade contra RSV.F depois de vacinação inicial- reforço heteróloga utilizando vetores de adenovírus recombinantes codificando RSV.F.

[000133] Este estudo foi projetado para investigar a capacidade dos regimes de vacinação inicial-reforço com base em vetores de adenovírus derivados a partir de dois serotipos diferentes induzirem imunidade contra RSV.F.

[000134] Este estudo envolveu camundongos BALB/c distribuídos em grupos experimentais de 8 camundongos. Os animais foram imunizados por injeção intramuscular com 1010 vp transportando a sequência de tipo selvagem do gene RSV.F baseado em/ derivado a partir de RSV A2 (Ad-RSV.F ou Ad35-RSV.F) ou sem transgene (Ad26e ou Ad35e). Um grupo de animais foi inicialmente vacinado na semana com Ad26-RSV.F e reforçado na semana 4 com Ad35-RSV.F ou Ad35e. Outro grupo de animais foi inicialmente vacinado com Ad35- RSV.F e reforçado na semana 4 com Ad26-RSV.F ou Ad26e. Um grupo de controle de camundongos foi inicialmente vacinado com Ad35e e reforçado na semana 4 com Ad26e. Na semana 6 e na semana 12 depois da vacinação inicial, 8 animais foram sacrificados em cada momento de tempo e as respostas celulares e humorais foram monitorizadas com ensaios imunológicos bem conhecidos pelos entendidos na técnica e conforme descrito acima.

[000135] A Fig. 5 mostra a resposta celular às 6 e 12 semanas depois da primeira imunização. Às 6 semanas depois da vacinação inicial (e 2 semanas depois do reforço), foi medido um efeito significativo de reforço tanto por Ad26-RSV.F como por Ad35-RSV.F nas respostas das células T, e a magnitude da resposta das células T foi independente da ordem de imunização com Ad26-RSV.F ou Ad35- RSV.F na vacinação inicial-reforço. Às 12 semanas depois da vacinação inicial (e 8 semanas depois do reforço), os camundongos imunizados com Ad26-RSV.F mantiveram níveis mais elevados de células T especificas para F tanto em animais apenas com vacinação inicial como com vacinação inicial-reforço, comparados com animais apenas com vacinação inicial com rAd35-RSV.F. Globalmente, os números de linfócitos específicos para F (SFU) foram elevados e estáveis durante pelo menos 12 semanas em todos os animais imunizados tanto com rAd26-RSV.F ou rAd35-RSV.F (vacinação inicial /ou vacinação inicial-reforço).

[000136] A Fig. 6 mostra a resposta humoral em diferentes momentos de tempo após a vacinação inicial-reforço com os vetores de adenovírus. Ad35.RSV.F e Ad26.RSV.F conferiram imunização igualmente boa, e foi mostrado um efeito de reforço significativo induzido tanto por Ad26.RSV.F ou rAd35.RSV.F nas respostas das células B. Além disso, a magnitude da resposta das células B em vacinação inicial-reforço heteróloga foi independente da ordem de imunização com Ad35.RSV.F e Ad26.RSV.F, e depois do reforço os títulos ELISA mantiveram-se estáveis durante 12 semanas.

[000137] A Fig. 7 mostra o título de anticorpos de neutralização do vírus, em diferentes momentos do tempo após a imunização por vacinação inicial-reforço. Ambos os vetores Ad35.RSV.F e Ad26.RSV.F conferiram imunização igualmente boa de modo a obter títulos de VNA claros, conforme foi observado nos títulos de ELISA. Além disso, o aumento nos títulos de VNA depois da vacinação inicial- reforço heteróloga era independente da ordem de imunização com Ad35.RSV.F e Ad26.RSV.F. O efeito do reforço tanto por Ad26.RSV.F ou Ad35.RSV.F em títulos VNA foi significativo em ambos os momentos do tempo e já era máximo às 6 semanas. Os grupos que só foram inicialmente vacinados com Ad.RSV.F aumentaram os títulos de VNA às 12 semanas comparados com as 6 semanas. A sequência F do RSV nos construtos de vetores de adenovírus é derivada a partir do RSV A2 isolado. O ensaio de neutralização descrito neste pedido se baseia na estirpe de RSV Longo, pertencente ao subgrupo A do RSV, o que demonstra que os anticorpos induzidos por F (A2) são capazes de neutralizar por cruzamento um subtipo diferente de estirpe A.

[000138] Uma vez que a proteína F do RSV é bem conservada entre os RSV isolados, se testou se os soros dos animais imunizados com vetores Ad-RSV.F eram capazes de neutralizar por cruzamento uma estirpe isolada de RSV B, RSV B1. Conforme mostrado na Fig. 8, os soros de camundongos imunizados também eram capazes de neutralizar por cruzamento a estirpe B1. A capacidade para neutralizar por cruzamento o RSV B 1 não era dependente do vetor que foi utilizado nos grupos apenas com vacinação inicial ou da ordem da imunização por vacinação inicial-reforço com os vetores Ad26.RSV.F e Ad35.RSV.F.

[000139] Em conjunto, estes dados mostram que, em um regime de vacinação inicial-reforço, as imunizações consecutivas com Ad26.RSV.F e Ad35.RSV.F induziram fortes respostas humorais e celulares, que a resposta imune humoral inclui a capacidade de neutralizar tanto os subtipos A e B isolados do RSV.

Exemplo 4. Indução de proteção contra a infeção por RSV utilizando vetores de adenovírus recombinantes in vivo num modelo de rato do algodão.

[000140] Esta experiência foi efetuada para investigar a capacidade dos regimes de vacinação inicial-reforço com base em vetores de adenovírus derivados a partir de dois serotipos diferentes para induzir proteção contra a replicação da ameaça por RSV no rato do algodão. Os ratos do algodão (Sigmodon hispidus) são suscetíveis tanto à infeção do trato respiratório superior e inferior com RSV, e foi verificado serem, no mínimo, 50 vezes mais permissivos do que as linhagens de camundongos (Niewiesk et al, 2002, Lab. Anim. 36(4):357-72). Além disso, o rato do algodão tem sido o modelo principal para determinar a eficácia e a segurança das candidatas a vacinas, antivirais e anticorpos, do RSV. Dados pré-clínicos gerados no modelo do rato do algodão avançaram o desenvolvimento de formulações de dois anticorpos (RespiGam® e Synagis®) para ensaios clínicos, sem a necessidade de estudos intermédios em primatas não humanos.

[000141] O estudo registrou ratos do algodão em grupos experimentais de 8 ratos do algodão cada. Os animais foram imunizados com injeções intramusculares de 109 partículas virais (vp) ou 1010 vp vetores de adenovírus transportando a totalidade do comprimento do gene RSV F (A2) (Ad26.RSV.F ou Ad35.RSV.F) ou sem transgene (Ad26e ou Ad35e). Os animais foram reforçados 28 dias depois com a mesma dose vp, tanto com o mesmo vetor (vacinação inicial-reforço homóloga) ou com outro serotipo de adenovírus (vacinação inicial-reforço heteróloga); os grupos de controle foram imunizados de acordo com os vetores Ad-e, exceto que apenas foi aplicada 1 dose (1010). Os grupos de controle consistiram em 6 animais. Os animais infetados por via intranasal com RSV A2 (104 unidades formadoras de placas (pfu)) foram utilizados como controle positivo para a proteção contra a replicação da ameaça, uma vez que é sabido que a principal infeção com o vírus RSV protege contra a replicação da ameaça secundária (Prince. Lab Invest 1999, 79:1385-1392). Além disso, o RSV inativado por formalina (FI-RSV) serviu como controle para a doença RSV histopatológica agravada pela vacina. Três semanas após a segunda imunização (reforço), os ratos do algodão foram expostos à ameaça por via intranasal com 1x105 pfu de RSV A2 de placa purificada. Como controles, um grupo de ratos do algodão não foi imunizado mas recebeu o vírus da ameaça, e outro grupo de controle não foi imunizado e não recebeu a ameaça. OS ratos do algodão foram sacrificados 5 dias depois da infeção, um momento no tempo no qual o vírus da ameaça RSV atinge títulos máximos (Prince. Lab Invest 1999, 79:1385-1392), e os títulos RSV do pulmão e nariz foram determinados por titulação da placa do vírus (Prince et al. 1978, Am J Pathology 93,711-791).

[000142] A Fig. 9 mostra que foram observados elevados títulos de vírus RSV nos pulmões e no nariz nos controles não imunizados, bem como nos animais que receberam os vetores de adenovírus sem transgene, respectivamente 5,3 +/- 0.13 log10 pfu/gram e 5,4 +/- 0.35 log10 pfu. Por outro lado, não podia ser detectado qualquer vírus de ameaça em tecido do pulmão e do nariz de animais que receberam a imunização por vacinação inicial-reforço com vetores Ad26.RSV.F e/ou Ad35.RSV.F, independentes da dose ou regime.

[000143] Estes dados mostram claramente que ambos os vetores à base de Ad35 e à base de Ad26 conferem uma proteção completa contra a replicação da ameaça do RSV no modelo do rato do algodão. Isto foi surpreendente, uma vez que os vetores de adenovírus à base de Ad5 codificando F do RSV eram conhecidos por não serem capaz de induzir uma proteção completa em modelos animais depois da administração intramuscular.

[000144] No decurso da experiência, as amostras de sangue foram recolhidas antes da imunização (dia 0), antes do reforço de imunização (dia 28), no dia de ameaça (dia 49) e no dia do sacrifício (dia 54). Os soros foram testados num ensaio de neutralização de vírus (VNA) baseado no ensaio de placa para a indução de anticorpos de neutralização específicos do RSV sistêmicos conforme descrito por Prince (Prince et al. 1978, Am J Pathology 93,711-791). O título de neutralização é expresso como a diluição do soro (log2), que provoca uma redução nas placas de 50% comparada com os poços de controle apenas com vírus (IC50).

[000145] A Fig. 10 mostra que os animais de controle não têm anticorpos de neutralização de vírus no dia 28 e no dia 49, enquanto títulos VNA elevados são induzidos depois dos animais terem sido inicialmente vacinados com vetores Ad26.RSV.F ou Ad35.RSV.F. É observado um aumento moderado de título VNA depois das imunizações de reforço. A infeção inicial pelo vírus RSV A2 resultou em títulos VNA bastante moderados que aumentaram gradualmente com o tempo.

[000146] De forma a avaliar se a vacina Ad26.RSV.F ou Ad35.RSV.F pode exacerbar a doença após uma ameaça com RSV A2, foram efetuadas análises histopatológicas dos pulmões 5 dias depois da infeção. Os pulmões foram removidos, perfundidos com formalina, secionados e corados com hematoxilina e eosina para exame histológico. A pontuação do exame histopatológico foi efetuada num ensaio cego, de acordo com critérios publicados por Prince (Prince et al. Lab Invest 1999, 79:1385-1392), e pontuados para os seguintes parâmetros: peribronquiolite, perivasculite, pneumonite intersticial e alveolite. A Fig. 11 mostra a pontuação da patologia pulmonar dessa experiência. Após a ameaça com RSV, os animais imunizados com FI- RSV apresentaram elevada histopatologia em todos os parâmetros histopatológicos analisados, em comparação com os animais ameaçados com imunização vazia, o que era esperado com base em estudos anteriormente publicados (Prince et al. Lab Invest 1999, 79:1385-1392). As pontuações histopatológicas em imunizados com Ad26.RSV.F e Ad35.RSV.F em comparação com animais imunizados com rAd-e ou de imunização vazia, foram semelhantes, embora a perivasculite nos animais imunizados com rAd-RSV.F pareça ser um pouco menor. Desse modo, as vacinas Ad26.RSV.F e Ad35.RSV.F não resultaram em doença agravada, ao contrário das vacinas FI-RSV.

[000147] Todas as estratégias de vacinação resultaram na proteção completa contra a replicação da ameaça do RSV, induziram fortes anticorpos de neutralização de vírus, e não foi observada patologia agravada.

Exemplo 5. Eficácia protetora dos vetores rAd utilizando diferentes vias de administração, após uma única imunização

[000148] Este estudo serve para investigar a influência das vias de administração sobre a eficácia protetora induzida por vetores Ad26 ou Ad35 que codificam RSV.F. A vacina foi administrada tanto por via intramuscular como por via intranasal.

[000149] Os ratos do algodão receberam uma única imunização com 1x109 ou 1x1010 partículas virais (vp) de Ad26 ou Ad35 transportando tanto o RSV F como transgene (Ad26.RSV.F ou Ad35.RSV.F) ou sem transgene (Ad26-e ou Ad35-e) no dia 0, foram ameaçados no dia 49 com 105 RSV pfu e sacrificados no dia 54.

[000150] A Fig. 12 mostra os resultados das experiências em que foram determinados os vírus de ameaça do pulmão e do nariz. Os elevados títulos de vírus RSV foram detectados nos pulmões e nariz dos ratos que não foram imunizados ou foram imunizados com vetores de adenovírus sem um transgene, respectivamente 4,9 +/- 0,22 log10 pfu/gram e 5,4 +/- 0,16 log10 pfu. Em contraste, os pulmões e narizes de animais que receberam tanto Ad35-RSV.F como Ad26-RSV.F estavam desprovidos de replicação do vírus da ameaça, independentemente da via de administração e da dose.

[000151] Estes dados demonstraram, surpreendentemente, que cada um dos vetores à base de Ad26 e à base de Ad35 que codificam a proteína F do RSV confere proteção completa em experiências de ameaça de rato do algodão, independentemente da via de administração dos vetores. Isso foi inesperado, uma vez que nenhuma das vacinas publicadas de RSV à base de adenovírus, que foi baseada em outros serotipos, demonstrou proteção completa após a vacinação intramuscular.

[000152] Durante a experiência, as amostras de sangue foram recolhidas antes da imunização (dia 0), 4 semanas após a imunização (dia 28), e no dia de ameaça (dia 49). Os soros foram testados num teste de neutralização para a indução de anticorpos específicos para o RSV (Fig 13). Antes da imunização não foram detectados anticorpos de neutralização do vírus em nenhum rato do algodão. Todas as estratégias de imunização do vetor de adenovírus, independente da via de administração, induziram claramente elevados títulos de VNA, que se mantiveram estáveis ao longo do tempo. Estes dados demonstraram, surpreendentemente, que cada um dos vetores à base de Ad26 e à base de Ad35 que codificam a proteína F do RSV conferem elevados títulos de anticorpos de neutralização do vírus em experiências de imunização de rato do algodão, independentemente da via de administração dos vetores.

[000153] De forma a avaliar se uma única imunização com a vacina Ad26.RSV.F ou Ad35.RSV.F pode provocar uma doença agravada pela vacina após uma ameaça com RSV A2, foram efetuadas análises histopatológicas dos pulmões 5 dias depois da infeção (Fig. 14). A imunização única com rAd26.RSV.F ou rAd35.RSV.F resultou em pontuações imunopatologicas semelhantes em animais imunizados com rAd26.RSV.F ou rAd35.RSV.F em comparação com rAd-e ou com animais com imunização vazia, conforme observado nas experiências de vacinação inicial-reforço acima descritas. Claramente, a doença exacerbada não foi observada, em contraste com os animais que foram imunizados com FI-RSV. As pontuações histopatológicas de animais imunizados com vetores rAd foram comparáveis com os animais infetados com "vazio".

[000154] Em conclusão, todas as estratégias de vacinação de dose única resultaram na proteção completa contra a replicação da ameaça do RSV, induziram fortes anticorpos de neutralização de vírus, e não apresentaram patologia melhorada.

Exemplo 6. Vetores com variantes, tais como fragmentos da F do RSV ou com promotores alternativos mostram semelhante imunogenicidade

[000155] Os exemplos anteriores foram efetuados com vetores que expressam o tipo selvagem de F do RSV. Outras, formas truncadas ou modificadas de F foram realizadas em rAd35, conferindo modalidades de fragmentos de F do RSV em vetores de adenovírus. Essas formas truncadas ou modificadas de F incluem uma forma truncada de RSV-F, em que o domínio citoplasmático e a região transmembranar estavam em falta (ou seja, apenas permaneceu o fragmento de ectodomínio), e uma forma de fragmento do RSV-F com truncagem do domínio citoplásmico e a região transmembranar e uma deleção interna adicional no ectodomínio e adição de um domínio de trimerização. Esses vetores não melhoraram as respostas sobre rAd35.RSV.F com proteína F de comprimento total.

[000156] Em adição, foram construídos outros vetores rAd35 com diferentes promotores alternativos conduzindo a expressão de tipo selvagem de F do RSV.

[000157] A imunogenicidade das formas modificadas de RSV. F e as variantes do promotor foram comparadas no modelo do rato e comparadas com Ad35.RSV.F que expressa o tipo selvagem F. Todos os vetores Ad35 que alojam esses variantes F ou variantes do promotor mostraram respostas na mesma ordem de magnitude que Ad35.RSV. F.

Exemplo 7. Proteção de curto prazo contra a infeção por RSV depois de imunização por vetores de adenovírus recombinantes in vivo num modelo de rato do algodão.

[000158] Esta experiência determina o potencial do rápido início de proteção por vetores de adenovírus que expressam a proteína F do RSV, no modelo de rato do algodão. Para este objectivo, os ratos do algodão foram imunizados com uma única injeção i.m. de 107, 108 ou 109 partículas virais (vp) vetores de adenovírus transportando a totalidade do comprimento do gene RSV F (A2) (Ad26.RSV.F) ou sem transgene (Ad26e) no dia 0 ou no dia 21. Os animais infetados por via intranasal com RSV A2 (104 unidades formadoras de placas (pfu)) foram utilizados como controle positivo para a proteção contra a replicação da ameaça, uma vez que é sabido que a principal infeção com o vírus RSV protege contra a replicação da ameaça secundária (Prince. Lab Invest 1999, 79:1385-1392). No dia 49, sete ou quatro semanas após a imunização, os ratos do algodão foram expostos à ameaça por via intranasal com 1x105 pfu de RSV A2 de placa purificada. Os ratos do algodão foram sacrificados 5 dias depois da infeção, um momento no tempo no qual o vírus da ameaça RSV atinge títulos máximos (Prince. Lab Invest 1999, 79:1385-1392), e os títulos RSV do pulmão e nariz foram determinados por titulação da placa do vírus (Prince et al. 1978, Am J Pathology 93,711-791). A Fig. 16A e a Fig. 16B mostram que foram observados elevados títulos de vírus RSV nos pulmões e no nariz nos animais que receberam os vetores de adenovírus sem transgene, respetivamente 4,8 +/- 0.11 log10 pfu/gram e 5,1 +/- 0.32 log10 pfu. Por outro lado, não podia ser detectado qualquer vírus de ameaça em tecido do pulmão e do nariz de animais que receberam a imunização com vetores Ad26.RSV.F independentes do tempo entre a imunização e a ameaça. Essa experiência indica claramente o rápido início de proteção contra a replicação da ameaça do vírus através de Ad26 expressando RSV-F. Foram retiradas amostras de sangue de ratos do algodão imunizados no dia 0, no dia 28 e no dia da ameaça (dia 49). Os soros foram testados num teste de neutralização para a indução de anticorpos específicos para o RSV (Fig 17). A imunização com vetores de adenovírus de dose induziu títulos VNA dependentes. A Fig. 18 mostra que os animais de controle não têm anticorpos de neutralização de vírus no dia 28 e no dia 49, enquanto títulos VNA elevados são induzidos 28 ou 49 dias depois das imunização com 107 a 109 Ad26.RSV.F vp. A infeção inicial pelo vírus RSV A2 resultou em títulos VNA bastante moderados que aumentaram gradualmente com o tempo. Essa experiência indica claramente o rápido início da proteção contra a replicação da ameaça do vírus pela Ad26 expressando RSV-F.

Exemplo 8. Proteção contra infeção do subgrupo A e subgrupo B do RSV depois de imunização por vetores de adenovírus recombinantes in vivo num modelo de rato do algodão.

[000159] As estirpes do RSV podem ser divididas em dois subgrupos, os subgrupos A e B. Essa divisão em subgrupos é baseada em diferenças na antigenicidade da glicoproteína G altamente variável. A sequência da proteína F é altamente conservada, mas também pode ser classificada nos mesmos subgrupos A e B. O Exemplo 3 descreveu que os soros dos camundongos imunizados com vetores Ad-RSV.F também eram capazes de neutralizar por cruzamento a estirpe B1 in vitro. A Fig. 19 mostra claramente que o soro do rato do algodão derivado a partir de ratos do algodão imunizados com Ad26.RSV-FA2 mostra elevados títulos VNA no dia 49 depois da imunização contra RSV-A Longo (subgrupo A) e lavagem de B (subgrupo B, ATCC #1540). De seguida, foi determinada a proteção in vivo contra ambas as ameaças dos subgrupos A ou B no rato do algodão utilizando baixas doses de vetores de adenovírus em uma escala de 106 a 108 vp. Para este objetivo os ratos do algodão foram divididos em grupos experimentais de 8 ratos do algodão cada. Os animais foram imunizados no dia 0 através de injeções intramusculares de 106, 107 ou 108 partículas virais (vp) vetores de adenovírus transportando a totalidade do comprimento do gene RSV F (A2) (Ad26.RSV.F) ou sem transgene ( Ad26e) no dia 0. No dia 49 os animais foram ameaçados i. n. com tanto com 10A5 pfu RSV-A2 (estirpe RSV-A) ou RSV-B 15/97 (estirpe RSV-B). A Fig. 20 mostra que foram observados elevados títulos de vírus RSV nos pulmões e no nariz em animais que receberam vetores de adenovírus sem transgene. Em contraste, não foi detetado ou foi detetado limitada ameaça de vírus no tecido dos pulmões e nariz de animais que receberam imunização com Ad26.RSV.F. Apenas foram observadas pequenas diferenças na proteção quando ameaçados quer com RSV- A2 ou com RSV -B 15/97. Ad26.RSV.FA2 mostrou uma proteção completa contra a replicação da ameaça do pulmão quando utilizando doses de 108 e 107vp, e avanço excepcionalmente limitado a 106 vp Ad26.RSV.FA2. Uma tendência semelhante foi observada para proteção contra a replicação do vírus de ameaça no nariz, embora tenha sido observado avanço parcial para todos os animais a 106 e 107 vp Ad26.RSV.FA2, apesar de menor do que nos grupos de controle (Fig. 21). Durante a experiência, as amostras de sangue foram recolhidas no dia da ameaça (dia 49). Os soros foram testados num teste de neutralização para a indução de anticorpos específicos para o RSV (Fig. 22). Este exemplo demonstra que os vetores de adenovírus nas doses baixas de 106 a 108 vp Ad26.RSV mostraram uma resposta à dose dos títulos VNA contra RSV A2. Antes da imunização não foram detectados anticorpos de neutralização do vírus em nenhum rato do algodão.

[000160] O Ad26.RSV.F provou ser de alguma forma melhor do que Ad35.RSV.F, uma vez que o último apresentou algum avanço nas experiências de ameaça nasal com uma dose de 108 vp.

Exemplo 9. Proteção contra uma elevada dose de ameaça de RSV-A2 depois de imunização por vetores de adenovírus recombinantes in vivo num modelo de rato do algodão.

[000161] Este exemplo determina a proteção contra uma elevada dose de ameaça de 5 x105 pfu em comparação com a dose padrão de 1 x105 pfu de RSV-A2. O estudo registrou ratos do algodão em grupos experimentais de 8 ratos do algodão cada. Os animais foram imunizados através de injeções intramusculares únicas de 107, ou 108 partículas virais (vp) vetores de adenovírus transportando a totalidade do comprimento do gene RSV F (A2) (Ad26.RSV.F) ou sem transgene ( Ad26e) no dia 0. Os animais infetados por via intranasal com RSV A2 (104 unidades formadoras de placas (pfu) foram utilizados como controle positivo para proteção contra a replicação da ameaça. Os ratos do algodão foram sacrificados 5 dias após a infeção, e foram determinados os títulos RSV do pulmão e do nariz através de titulação da placa do vírus. A Fig. 23 mostra que uma dose de ameaça mais elevada induz maior carga viral pulmonar em animais que receberam os vetores de adenovírus sem transgene do que com a dose de ameaça padrão. Os animais que receberam a imunização com 107 ou 108 vp vetores Ad26.RSV.F foram completamente protegidos contra os títulos elevados e padrão de ameaça por RSV nos pulmões. A Fig. 24 mostra que os animais que receberam a imunização com 108 vp vetores Ad26.RSV.F estavam completamente protegidos contra títulos elevados e padrão de ameaça por RSV no nariz, enquanto os animais que receberam a imunização com 107 vp vetores Ad26.RSV.F estavam parcialmente protegidos contra os títulos de ameaça RSV padrão.

Exemplo 10. Proteção de longo prazo contra RSV-A2 e RSV-B15/97 depois de imunização por vetores de adenovírus recombinantes in vivo num modelo de rato do algodão.

[000162] Este exemplo determina a durabilidade da proteção contra RSV-A2 e RSV-B15/97 depois de imunização por vetores de adenovírus recombinantes in vivo num modelo de rato do algodão. O estudo registrou ratos do algodão em grupos experimentais de 6 ratos do algodão cada. Os animais foram imunizados com injeções intramusculares de 108 partículas virais (vp) ou 1010 vp vetores de adenovírus transportando a totalidade do comprimento do gene RSV F (A2) (Ad26.RSV.F) ou sem transgene (Ad26e ou Ad35e). Os animais foram reforçados 28 dias depois com a mesma dose vp, tanto com o mesmo vetor (Ad26.RSV.F) (vacinação inicial-reforço homóloga) ou com adenovírus Ad35.RSV.F (vacinação inicial-reforço heteróloga); os grupos de controle foram imunizados de acordo com os vetores Ad-e, exceto que foi aplicada apenas 1 dose (1010). Alguns grupos não receberam uma imunização de reforço. Os grupos de controle consistiram em 6 animais. Os animais infetados por via intranasal com RSV A2 e B15/97 (104 unidades formadoras de placas (pfu) foram utilizados como controle positivo para proteção contra a replicação da ameaça. A ameaça foi aos 210 dias depois da primeira imunização.

[000163] A Fig. 25 mostra que foram observados elevados títulos de vírus RSV nos pulmões e no nariz em animais que receberam vetores de adenovírus sem transgene. Em contraste, não foi detetada ameaça de vírus no tecido dos pulmões de animais que receberam imunização com Ad26.RSV.F e/ou Ad35.RSV.F. Não foi detetada ameaça de vírus RSV-A2 no tecido do nariz de animais que receberam imunização com Ad26.RSV.F e/ou Ad35.RSV.F. A ameaça com RSV-B15/97 induziu replicação viral limitada nos tecidos nasais dos animais que receberam imunização com Ad26.RSV.F e/ou Ad35.RSV.F, exceto nos animais que receberam uma vacinação inicial com Ad26.RSV.F seguido por um reforço de Ad35.RSV.F com 1010 vp. A Fig. 26 mostra o título de anticorpos de neutralização do vírus, 140 dias depois da imunização. Apenas a vacinação inicial de vetor adenovírus ou imunização por vacinação inicial e reforço com doses de 108 e 1010 vp apresentaram uma resposta à dose dos títulos de VNA durável durante pelo menos 4,5 meses após a imunização. Além disso, os títulos observados foram superiores aos títulos de neutralização gerados pela imunização i. n. inicial. Foi observado um claro efeito de reforço tanto por Ad26.RSV.F como por Ad35.RSV.F nos títulos VNA.

[000164] Em conclusão, estes exemplos mostram títulos VNA duradouros após a imunização com doses individuais ou duplas de Ad26.RSV.F ou Ad35.RSV.F, e proteção integral de longo prazo no pulmão e nariz contra a ameaça com vírus homólogo combinada com proteção total a longo prazo no pulmão e proteção parcial no nariz contra a ameaça com vírus heterólogo.

Exemplo 11. Ausência de imunopatologia agravada pela vacina após imunização por vetores de adenovírus recombinantes in vivo num modelo de rato do algodão.

[000165] De forma a avaliar se a vacina Ad26.RSV.F pode exacerbar a doença após uma ameaça com RSV A2, foram efetuadas análises histopatológicas dos pulmões 2 e 6 dias depois da infeção. Dois dias depois da ameaça, a resposta imediata (incluindo a infiltração neurofílica pulmonar) tem um máximo, enquanto as alterações subagudas, tais como a infiltração de linfócitos atingem um máximo no dia 6 após a infeção (Prince et al., J Virol, 1986, 57:721-728). O estudo registrou ratos do algodão em grupos experimentais de 12 ratos do algodão cada. Os animais foram imunizados com injeções intramusculares de 108 partículas virais (vp) ou 1010 vp vetores de adenovírus transportando a totalidade do comprimento do gene RSV F (A2) (Ad26.RSV.F) ou sem transgene (Ad26e). Alguns grupos foram reforçados 28 dias depois com a mesma dose vp, com o mesmo vetor (Ad26.RSV.F) (vacinação inicial-reforço homóloga); os grupos de controle foram imunizados de acordo com os vetores Ad-e, exceto que foi apenas aplicada 1 dose (1010). Os grupos de controle consistiram em 12 animais. Os animais infetados por via intranasal com RSV A2 (104 unidades formadoras de placas (pfu)) foram utilizados como controle positivo para proteção contra a replicação da ameaça. Os animais imunizados com FI-RSV foram utilizados como controles para a doença agravada. Os pulmões foram removidos, perfundidos com formalina, secionados e corados com hematoxilina e eosina para exame histológico. A pontuação do exame histopatológico foi efetuada num ensaio cego, de acordo com critérios publicados por Prince (Prince et al. Lab Invest 1999, 79:1385-1392), e pontuados para os seguintes parâmetros: peribronquiolite, perivasculite, pneumonite intersticial e alveolite. A pontuação da patologia do pulmão dessa experiência está representada na Fig. 27 para o dia 2 e na Fig. 28 para o dia 6. Após a ameaça com RSV, os animais imunizados com FI-RSV apresentaram no dia 2 e no dia 6 elevada histopatologia em todos os parâmetros histopatológicos analisados em comparação com os animais ameaçados e com imunização vazia, o que era esperado com base em estudos anteriormente publicados. As pontuações histopatológicas em todos os grupos imunizados com vetores Ad26.RSV.F foram comparáveis com os animais com imunização vazia no dia 2 e no dia 6 após a ameaça tiveram sempre pontuações inferiores aos ameaçados com imunização vazia (Ad26.e). Desse modo, as vacinas Ad26.RSV.F não resultaram em doença agravada, ao contrário das vacinas FI-RSV.

Exemplo 12. Vacinação inicial com Ad26.RSVF reforçada com proteína F recombinante resulta em uma resposta enviesada Th1 num modelo de camundongo.

[000166] Neste exemplo, foi investigado se a resposta imunitária da vacinação inicial Ad26.RSV.F pode ser melhorada, através do reforço com proteína F do RSV recombinante com adjuvante. Para este objetivo os camundongos foram divididos em grupos experimentais de 7 camundongos cada. Os animais foram imunizados no dia 0 através de injeções intramusculares de 1010, partículas virais (vp) vetores de adenovírus transportando a totalidade do comprimento do gene RSV F (A2) (Ad26.RSV.F) ou PBS. No dia 28 os animais foram reforçados i. m. quer com o mesmo vetor, na mesma dose, ou com proteína F do RSV com adjuvante (comprimento total; conformação pós fusão: pós- F) (em 2 doses: 5 μg e 0.5 μg). A Fig 29 mostra claramente que o soro derivado de camundongos imunizados com Ad26.RSV-FA2 e reforçado com F do RSV com adjuvante apresenta elevados títulos VNA, 12 semanas após a imunização contra o VRS-A Longo (subgrupo A). A Fig. 30 mostra a razão IgG2a/IgG1 nos soros de camundongos imunizados com Ad26.RSV-FA2 e reforçados com e proteína F do RSV com adjuvante. Uma razão elevada é indicativa de uma resposta Th1 equilibrada, enquanto uma baixa razão indica uma resposta Th2 enviesada. Claramente, os animais imunizados com Ad26.RSV.F, ou reforçados com Ad26.RSV.F ou proteína F do RSV resultam numa elevada razão IgG2a/IgG1, enquanto que os camundongos de controle imunizados com FI-RSV ou a proteína F do RSV (sem o contexto dos vetores de adenovírus) induzem uma baixa razão. Uma vez uma resposta Th1 enviesada é fortemente desejada em uma vacina contra o RSV para evitar a doença agravada sob ameaça e para induzir forte memória das células T, a resposta Th2 enviesada de uma imunização de proteína pode ser direcionada no sentido de uma resposta Th1 quando é aplicada uma vacinação inicial com Ad26.RSV.F. A Fig. 31 mostra a resposta celular em baços retirados de camundongos imunizados com Ad26.RSV-FA2 e reforçados com proteína F do RSV com adjuvante. Isso pode ser claramente observado que o reforço com a proteína F do RSV, com adjuvante, também irá aumentar fortemente a resposta celular.Tabela 1. Sequências

[000167] SEQ ID NO: 1: sequência de aminoácidos da proteína de fusão do RSV (Genbank ACO83301.1):

[000168] MELLILKANAITTILTAVTFCFASGQNITEEFYQSTCSAVSKGY LSALRTGWYTSVITIELSNIKKNKCNGTDAKIKLIKQELDKYKNAVTELQLL MQSTPATNNRARRELPRFMNYTLNNAKKTNVTLSKKRKRRFLGFLLGV GSAIASGVAVSKVLHLEGEVNKIKSALLSTNKAVVSLSNGVSVLTSKVLD LKNYIDKQLLPIVNKQSCSISNIETVIEFQQKNNRLLEITREFSVNAGVTTP VSTYMLTNSELLSLINDMPITNDQKKLMSNNVQIVRQQSYSIMSIIKEEVL AYVVQLPLYGVIDTPCWKLHTSPLCTTNTKEGSNICLTRTDRGWYCDNA GSVSFFPQAETCKVQSNRVFCDTMNSLTLPSEVNLCNVDIFNPKYDCKI MTSKTDVSSSVITSLGAIVSCYGKTKCTASNKNRGIIKTFSNGCDYVSNK GVDTVSVGNTLYYVNKQEGKSLYVKGEPIINFYDPLVFPSDEFDASISQV NEKINQSLAFIRKSDELLHNVNAVKSTTNIMITTIIIVIIVILLSLIAVGLLLYCK ARSTPVTLSKDQLSGINNIAFSN

[000169] SEQ ID NO: 2: otimização de códons do gene RSV.F (A2) nat que codifica para a proteína de fusão RSV

[000170] ATGGAACTGCTGATCCTGAAGGCCAACGCCATCACCAC CATCCTGACCGCCGTGACCTTCTGCTTCGCCAGCGGCCAGAACAT CACCGAGGAATTCTACCAGAGCACCTGTAGCGCCGTGTCCAAGG GCTACCTGAGCGCCCTGCGGACCGGCTGGTACACCAGCGTGATC ACCATCGAGCTGAGCAACATCAAAAAGAACAAGTGCAACGGCACC GACGCCAAAATCAAGCTGATCAAGCAGGAACTGGACAAGTACAAG AACGCCGTGACCGAGCTGCAGCTGCTGATGCAGAGCACCCCCGC CACCAACAACCGGGCCAGACGGGAGCTGCCCCGGTTCATGAACT ACACCCTGAACAACGCCAAAAAGACCAACGTGACCCTGAGCAAGA AGCGGAAGCGGCGGTTCCTGGGCTTCCTGCTGGGCGTGGGCAG CGCCATTGCTAGCGGAGTGGCTGTGTCTAAGGTGCTGCACCTGG AAGGCGAAGTGAACAAGATCAAGTCCGCCCTGCTGAGCACCAAC AAGGCCGTGGTGTCCCTGAGCAACGGCGTGTCCGTGCTGACCAG CAAGGTGCTGGATCTGAAGAACTACATCGACAAGCAGCTGCTGCC CATCGTGAACAAGCAGAGCTGCAGCATCAGCAACATCGAGACAGT GATCGAGTTCCAGCAGAAGAACAACCGGCTGCTGGAAATCACCC GCGAGTTCAGCGTGAACGCCGGCGTGACCACCCCCGTGTCCACC TACATGCTGACCAACAGCGAGCTGCTGAGCCTGATCAACGACATG CCCATCACCAACGACCAGAAAAAGCTGATGAGCAACAACGTGCAG ATCGTGCGGCAGCAGAGCTACTCCATCATGTCCATCATCAAAGAA GAGGTGCTGGCCTACGTGGTGCAGCTGCCCCTGTACGGCGTGAT CGACACCCCCTGCTGGAAGCTGCACACCAGCCCCCTGTGCACCA CCAACACCAAAGAGGGCAGCAACATCTGCCTGACCCGGACCGAC CGGGGCTGGTACTGCGATAATGCCGGCAGCGTGTCATTCTTTCCA CAAGCCGAGACATGCAAGGTGCAGAGCAACCGGGTGTTCTGCGA CACCATGAACAGCCTGACCCTGCCCAGCGAGGTGAACCTGTGCA ACGTGGACATCTTCAACCCTAAGTACGACTGCAAGATCATGACCT CCAAGACCGACGTGTCCAGCTCCGTGATCACCTCCCTGGGCGCC ATCGTGTCCTGCTACGGCAAGACCAAGTGCACCGCCAGCAACAA GAACCGGGGCATCATCAAGACCTTCAGCAACGGCTGCGACTACG TGTCCAACAAGGGCGTGGACACCGTGTCCGTGGGCAACACCCTG TACTACGTGAACAAACAGGAAGGCAAGAGCCTGTACGTGAAGGG CGAGCCCATCATCAACTTCTACGACCCCCTGGTGTTCCCCAGCGA CGAGTTCGACGCCAGCATCAGCCAGGTCAACGAGAAGATCAACC AGAGCCTGGCCTTCATCAGAAAGAGCGACGAGCTGCTGCACAAT GTGAATGCCGTGAAGTCCACCACCAATATCATGATCACCACAATC ATCATCGTGATCATCGTCATCCTGCTGTCCCTGATCGCCGTGGGC CTGCTGCTGTACTGCAAGGCCCGGTCCACCCCTGTGACCCTGTC CAAGGACCAGCTGAGCGGCATCAACAATATCGCCTTCTCCAAC

Claims (14)

1. Vacina contra o vírus sincicial respiratório (RSV), caracterizada pelo fato de que compreende um adenovírus humano recombinante de sorotipo 26 que compreende ácido nucleico codificando uma proteína F do RSV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

2. Vacina de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico que codifica a proteína F do RSV é códon otimizado para a expressão em células humanas.

3. Vacina de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o ácido nucleico que codifica a proteína F do RSV compreende a sequência de ácido nucleico de SEQ ID NO: 2.

4. Vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o adenovírus humano recombinante tem uma deleção na região E1, uma deleção na região E3, ou uma deleção em ambas as regiões E1 e E3 do genoma do adenovírus.

5. Vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizada pelo fato de que o adenovírus recombinante contém um genoma compreendendo nas suas extremidades terminais 5' a sequência CTATCTAT.

6. Vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que ser para uso na vacinação de um sujeito contra o RSV.

7. Vacina de acordo com a reivindicação 6, caracterizada pelo fato de que a vacina é administrada intramuscularmente.

8. Vacina de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizada pelo fato de que a vacina é administrada ao sujeito mais do que uma vez.

9. Vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizada pelo fato de que também compreende a administração ao sujeito de uma vacina compreendendo um adenovírus humano recombinante de sorotipo 35, que compreende o ácido nucleico codificando a proteína F do RSV.

10. Vacina de acordo com a reivindicação 6 ou 7, caracterizada pelo fato de que consiste em uma administração única da vacina ao sujeito.

11. Vacina de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 10, caracterizada pelo fato de que compreende ainda a administração da proteína F do RSV ao sujeito.

12. Vacina, caracterizada pelo fato de que é para uso na redução da infeção e/ou replicação do RSV em um sujeito, através da administração ao sujeito através de injeção intramuscular de uma composição compreendendo um adenovírus humano recombinante de sorotipo 26, compreendendo ácido nucleico codificando uma proteína F do RSV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

13. Método para produção de uma vacina contra o vírus sincicial respiratório (RSV), caracterizado pelo fato de que compreende o fornecimento de um adenovírus humano recombinante de serotipo 26, que compreende ácido nucleico codificando uma proteína F do RSV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, a propagação do referido adenovírus recombinante em uma cultura de células hospedeiras, isolando e purificando o adenovírus recombinante, e formulando o adenovírus recombinante em uma composição farmaceuticamente aceitável.

14. Ácido nucleico recombinante isolado, caracterizado pelo fato de que forma o genoma de um adenovírus humano recombinante de sorotipo 26 que compreende ácido nucleico codificando uma proteína F do RSV que compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

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