TW201343669A - 抗ｒｓｖ疫苗 - Google Patents

抗ｒｓｖ疫苗 Download PDF

Info

Publication number
TW201343669A
TW201343669A TW102110400A TW102110400A TW201343669A TW 201343669 A TW201343669 A TW 201343669A TW 102110400 A TW102110400 A TW 102110400A TW 102110400 A TW102110400 A TW 102110400A TW 201343669 A TW201343669 A TW 201343669A
Authority
TW
Taiwan
Prior art keywords
rsv
protein
adenovirus
vaccine
recombinant
Prior art date
Application number
TW102110400A
Other languages
English (en)
Other versions
TWI640534B (zh
Inventor
Katarina Radosevic
Jerome H H V Custers
Jort Vellinga
Myra N Widjojoatmodjo
Original Assignee
Crucell Holland Bv
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Crucell Holland Bv filed Critical Crucell Holland Bv
Publication of TW201343669A publication Critical patent/TW201343669A/zh
Application granted granted Critical
Publication of TWI640534B publication Critical patent/TWI640534B/zh

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A61K39/155—Paramyxoviridae, e.g. parainfluenza virus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/04—Immunostimulants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/525—Virus
    • A61K2039/5256—Virus expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/54—Medicinal preparations containing antigens or antibodies characterised by the route of administration
    • A61K2039/541—Mucosal route
    • A61K2039/543—Mucosal route intranasal
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10311—Mastadenovirus, e.g. human or simian adenoviruses
    • C12N2710/10341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/18011—Paramyxoviridae
    • C12N2760/18511—Pneumovirus, e.g. human respiratory syncytial virus
    • C12N2760/18534—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本發明提供一種抗呼吸道融合性病毒(RSV)疫苗，該疫苗包含血清型26重組人類腺病毒，該重組人類腺病毒包含編碼RSV F蛋白質或其免疫活性部分之核酸。

Description

抗RSV疫苗
本發明係關於醫藥領域。更特定言之，本發明係關於抗RSV疫苗。
在1950年代發現呼吸道融合性病毒(RSV)之後，該病毒很快即成為公認的與人類下呼吸道感染及上呼吸道感染相關之病原體。據估計，全世界每年出現64,000,000例RSV感染，導致160,000例死亡(WHO急性呼吸道感染，2009年9月更新)。最嚴重之疾病尤其在早產兒、老年人及免疫功能降低之個體中出現。在2歲以下兒童中，RSV為最常見之呼吸道病原體，佔因呼吸道感染而住院治療之約50%，且住院治療之峰值出現在2-4月齡。據報道，幾乎所有兒童至兩歲為止均受到RSV感染。終生反覆感染歸結於無效的自然免疫。老年人中RSV疾病負擔、死亡率及發病率之水準僅次於非泛流行性A型流感感染所引起者。
RSV為副黏液病毒，屬於肺病毒亞科。RSV之基因組編碼多種蛋白質，包括稱為RSV醣蛋白(G)及RSV融合(F)蛋白質之膜蛋白，該等膜蛋白為中和抗體之主要抗原標靶。融合蛋白質前驅體(F0)之蛋白質裂解產生經由二硫橋鍵連接之兩個多肽F1及F2。抗F1蛋白質之融合介導部分之抗體可阻止細胞中之病毒吸收且因此具有中和作用。除作為中和抗體之標靶外，RSV F含有細胞毒性T細胞抗原決定基(Pemberton等人，1987,J.Gen.Virol.68：2177-2182)。
RSV感染之治療選項包括抗RSV之F蛋白質之單株抗體。與該等單株抗體相關之高成本及醫院配置中對投藥之要求排除了其大規模用於危險群體預防之用途。因此，需要一種RSV疫苗，其較佳可用於小兒群體以及老年人。
儘管歷經50年研究，但仍無獲准之抗RSV疫苗。疫苗開發之一個主要障礙為在1960年代使用福馬林不活化(formalin-inactivated，FI)RSV疫苗之臨床試驗中遺留的疫苗增強疾病。FI-RSV接種疫苗之兒童未受到保護以免於自然感染，且受感染兒童遭受比未接種疫苗之兒童更嚴重的疾病，包括兩例死亡。此現象稱為『增強疾病』。
自使用FI-RSV疫苗之試驗以來，已實行多種方法來產生RSV疫苗。嘗試包括RSV之傳統活減毒冷繼代病毒株或溫度敏感性突變病毒株、(嵌合)蛋白質次單位疫苗、肽疫苗及由重組病毒載體表現之RSV蛋白質。雖然此等疫苗中之一些疫苗展示具前途之臨床前資料，但因安全性問題或缺乏功效而尚無疫苗獲准供人類使用。
腺病毒載體用於製備多種疾病之疫苗，包括與RSV感染相關之疾病。以下段落提供已描述之基於腺病毒之RSV候選疫苗的實例。
在一種方法中，已將RSV.F插入4型、5型及7型複製勝任型腺病毒之非必需E3區中。棉鼠鼻內(i.n.)施用107 pfu之免疫接種具有適度免疫原性，且保護下呼吸道免受RSV攻擊，但不保護上呼吸道免受RSV攻擊(Connors等人，1992,Vaccine 10：475-484；Collins,P.L.,Prince,G.A.,Camargo,E.,Purcell,R.H.,Chanock,R.M.及Murphy,B.R.Evaluation of the protective efficacy of recombinant vaccinia viruses and adenoviruses that express respiratory syncytial virus glycoproteins.Vaccines 90：Modern Approaches to New Vaccines including prevention of AIDS(Brown,F.,Chanock,R.M.,Ginsberg,H.及Lerner,R.A.編)Cold Spring Harbor Laboratory,New York,1990，第79-84頁)。黑猩猩 之後續經口免疫接種具有不良免疫原性(Hsu等人，1992,J Infect Dis.66：769-775)。
在其他研究，中(Shao等人，2009,Vaccine 27：5460-71；US2011/0014220)，帶有編碼RSV-B1病毒株之F蛋白質之跨膜截短(rAd-F0△TM)或全長(rAd-F0)型式之核酸的兩種重組複製勝任不能型腺病毒5載體經工程改造且經由鼻內途徑給與BALB/c小鼠。動物經鼻內初打107 pfu且在28天後鼻內加打相同劑量。雖然抗RSV-B1抗體中和RSV-Long及RSV-A2病毒株且與其交叉反應，但使用此等載體之免疫接種僅部分防止RSV B1攻擊複製。使用rAd-F0△TM之(部分)保護略高於使用rAd-F0。
在另一研究中，觀測到使用表現野生型RSV F(FG-Ad-F)之複製缺陷型(基於Ad5)FG-Ad腺病毒之1011個病毒粒子對BALB/c小鼠進行鼻內免疫接種與對照組相比肺病毒效價僅減小1.5 log 10(Fu等人，2009,Biochem.Biophys.Res.Commun.381：528-532)。
在其他研究中，觀測到鼻內施用之表現RSV A2之F蛋白質之密碼子最佳化可溶性F1片段(胺基酸155-524)的基於Ad5之複製缺陷型腺病毒載體(108 PFU)與對照小鼠相比可減少BALB/c小鼠肺中之RSV攻擊複製，但由肌肉內(i.m.)途徑免疫接種之小鼠未展現出抗攻擊之任何保護(Kim等人，2010,Vaccine 28：3801-3808)。
在其他研究中，使用基於Ad5且帶有密碼子最佳化全長RSV F(AdV-F)或可溶性形式之RSF F基因(AdV-Fsol)之腺病毒載體以1×1010 OPU(光學粒子單位：1×1010 OPU之劑量相當於2×108 GTU(基因轉導單位))之劑量對BALB/c小鼠免疫接種兩次。在鼻內免疫接種之後，此等載體大大減少肺內病毒負荷，但在皮下(s.c.)或肌肉內施用後僅部分減少肺內病毒負荷(Kohlmann等人，2009,J Virol 83：12601-12610；US 2010/0111989)。
在其他研究中，觀測到肌肉內施用之表現RSV A2病毒株之定序F蛋白質cDNA的基於Ad5之複製缺陷型重組腺病毒載體(1010個粒子單位)與對照小鼠相比可僅部分減少BALB/c小鼠肺中之RSV攻擊複製(Krause等人，2011,Virology Journal 8：375-386)。
除了在許多情況下並不完全有效以外，在臨床評估下供小兒使用之RSV疫苗及在臨床前評估下之大多數疫苗為鼻內疫苗。鼻內策略之最重要優勢在於直接刺激局部呼吸道免疫性且不存在相關之疾病增強。實際上，一般用於鼻內投藥之例如基於腺病毒之RSV候選疫苗的功效與肌肉內投藥相比似乎較佳。然而，鼻內接種疫苗亦在不到6個月大的嬰兒中引起安全性問題。在所有年齡層中，鼻內疫苗最常見之不良反應為流鼻涕或鼻充血。新生兒為強制型鼻腔呼吸者且因此必須經鼻呼吸。因此，頭幾個月大之嬰兒鼻充血可干擾哺乳，且在極少情況下可導致嚴重呼吸問題。
已鑑別超過50種不同人類腺病毒血清型。其中，過去已研究最廣泛地用作基因載運體之血清型5腺病毒(Ad5)。然而，不同血清型之重組腺病毒載體可產生關於誘導免疫反應及保護之不同結果。舉例而言，WO 2012/021730描述編碼F蛋白質之血清型7猴腺病毒載體及血清型5人類腺病毒載體與血清型28人類腺病毒載體相比提供較佳抗RSV保護。此外，觀測到基於人類或非人類腺病毒血清型之載體的差異免疫原性(Abbink等人，2007,J Virol 81：4654-4663；Colloca等人，2012,Sci Transl Med 4,115ra2)。Abbink等人得出結論：在不存在抗Ad5免疫性之情況下，所研究之所有稀少血清型人類rAd載體不如rAd5載體有效。另外，近來已描述，雖然具有埃博拉病毒(Ebolavirus，EBOV)醣蛋白(gp)轉殖基因之rAd5保護100%非人類靈長類動物，但具有EBOV gp轉殖基因之rAd35及rAd26僅提供部分保護，且此等載體需要異源初打-加打策略來獲得抗埃博拉病毒攻擊之完全 保護(Geisbert等人，2011,J Virol 85：4222-4233)。因此，事前不可能僅基於另一腺病毒血清型之資料預測重組腺病毒疫苗之功效。
此外，對於RSV疫苗，需要在適當疾病模型(諸如棉鼠)中進行實驗以判定疫苗候選物是否足以有效防止RSV在鼻道及肺中複製且同時為安全的，亦即不導致增強疾病。該等候選疫苗較佳應在該等模型中極其有效，甚至在肌肉內投藥時仍如此。
因此，仍需要不導致增強疾病之有效疫苗及接種抗RSV疫苗之方法。本發明旨在提供該等疫苗及以安全且有效之方式接種抗RSV疫苗之方法。
本發明之發明人驚訝地發現包含編碼RSV F蛋白質之核苷酸序列之血清型26重組腺病毒(Ad26)為明確建立之棉鼠模型中極有效的抗RSV疫苗，且與先前關於編碼RSV F之Ad5所述之資料相比具有改良之功效。據證實，即使單次投與、甚至肌肉內投與編碼RSV F之Ad26仍足以提供抗攻擊性RSV複製之完全保護。
本發明提供一種抗呼吸道融合性病毒(RSV)疫苗，該疫苗包含血清型26重組人類腺病毒，該重組人類腺病毒包含編碼RSV F蛋白質或其片段之核酸。
在某些實施例中，重組腺病毒包含編碼RSV F蛋白質之核酸，該RSV F蛋白質包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列。
在某些實施例中，編碼RSV F蛋白質之核酸係針對在人類細胞中之表現進行密碼子最佳化。
在某些實施例中，編碼RSV F蛋白質之核酸包含SEQ ID NO：2之核酸序列。
在某些實施例中，重組人類腺病毒之腺病毒基因組的E1區中具有缺失、E3區中具有缺失或E1區與E3區中均具有缺失。
在某些實施例中，重組腺病毒具有在5'末端包含序列CTATCTAT之基因組。
本發明另外提供一種對個體接種抗RSV疫苗之方法，該方法包含向該個體投與本發明之疫苗。
在某些實施例中，疫苗經肌肉內投與。
在某些實施例中，將本發明之疫苗投與個體一次以上。
在某些實施例中，對個體接種抗RSV疫苗之方法另外包含向該個體投與包含血清型35重組人類腺病毒之疫苗，該重組人類腺病毒包含編碼RSV F蛋白質或其片段之核酸。
在某些實施例中，對個體接種抗RSV疫苗之方法另外包含向該個體投與RSV F蛋白質(較佳調配成醫藥組合物，因此為蛋白質疫苗)。
在某些實施例中，接種疫苗之方法由向個體單次投與疫苗組成。
本發明亦提供一種減少例如個體鼻道及肺中RSV感染及/或複製之方法，其包含藉由肌肉內注射向該個體投與包含血清型26重組人類腺病毒之組合物，該重組人類腺病毒包含編碼RSV F蛋白質或其片段之核酸。在投與疫苗時，此方法將減少由個體中之RSV感染引起的不良影響，且因此有助於保護個體免受該等不良影響。在某些實施例中，可基本上預防RSV感染之不良影響，亦即降至使其臨床上不相關之低水準。重組腺病毒可呈本發明之疫苗形式，包括上文所述之實施例。
本發明亦提供一種包含血清型26重組人類腺病毒之經分離之宿主細胞，該重組人類腺病毒包含編碼RSV F蛋白質或其片段之核酸。
本發明另外提供一種製造抗呼吸道融合性病毒(RSV)疫苗之方法，其包含提供包含編碼RSV F蛋白質或其片段之核酸的血清型26重組人類腺病毒，使該重組腺病毒在宿主細胞培養物中增殖，分離並純 化該重組腺病毒，及將該重組腺病毒調配於醫藥學上可接受之組合物中。此態樣之重組人類腺病毒亦可為上述實施例中所述之任何腺病毒。
本發明亦提供一種形成血清型26重組人類腺病毒之基因組的經分離之重組核酸，該重組人類腺病毒包含編碼RSV F蛋白質或其片段之核酸。腺病毒亦可為如上述實施例中所述之任何腺病毒。
圖1展示在使用不同劑量的具有RSV F基因之基於rAd26(A)及rAd35(B)之載體免疫接種時，在免疫接種後2週及8週，小鼠之抗重疊F之胺基酸1-252之F肽及抗重疊F之胺基酸241-574之F肽的細胞免疫反應。
圖2展示在使用不同劑量的具有RSV F基因之基於rAd26及rAd35之載體免疫接種時，在免疫接種後2週及8週，小鼠之抗RSV抗體反應。
圖3展示在使用1010vp的具有RSV F基因之基於rAd26及rAd35之載體免疫接種時，在免疫接種後8週，小鼠之抗RSV IgG2a抗體反應與抗RSV IgG1抗體反應之比率的結果。
圖4展示在使用不同劑量的具有RSV F基因之基於rAd46(A)及rAd35(B)之載體免疫接種時，在免疫接種後2週及8週，小鼠之抗RSV Long之病毒中和能力。
圖5展示在使用具有RSV F基因之基於rAd26及rAd35之載體進行初打-加打免疫接種時，在初次免疫接種後6週及12週，小鼠之抗(A)重疊F之胺基酸1-252之F肽及抗(B)重疊F之胺基酸241-574之F肽的細胞免疫反應。
圖6展示在使用具有RSV F基因之基於rAd26及rAd35之載體進行初打-加打免疫接種時，在第一次免疫接種後之不同時間點，小鼠之 抗RSV抗體反應。
圖7展示在使用不同劑量的具有RSV F基因之基於rAd26及rAd35之載體進行初打-加打免疫接種時，在第一次免疫接種後之不同時間點，小鼠血清中抗RSV Long之病毒中和能力。
圖8展示在使用不同劑量的具有RSV F基因之基於rAd26及rAd35之載體進行初打-加打免疫接種時，在第一次免疫接種後之不同時間點，小鼠之抗RSV B1之病毒中和能力。
圖9展示在使用不同劑量的具有RSV F基因之基於rAd26及rAd35之載體進行初打-加打免疫接種後，在攻擊後5天，棉鼠之A)RSV肺效價及B)RSV鼻效價。
圖10展示在使用不同劑量的具有RSV F基因之基於rAd26及rAd35之載體進行初打-加打免疫接種後，在第一次免疫接種後A)28天及B)49天誘導之病毒中和效價。
圖11展示在使用不同劑量的具有RSV F基因之基於rAd26及rAd35之載體進行初打-加打免疫接種後，在處死當天棉鼠肺部之組織病理學檢查。
圖12展示在經由不同途徑投與不同劑量的具有RSV F基因之基於rAd26及rAd35之載體進行單次劑量免疫接種後，在攻擊後5天，棉鼠之A)RSV肺效價及B)RSV鼻效價。
圖13展示在經由不同途徑投與不同劑量的具有RSV F基因之基於rAd26及rAd35之載體進行單次劑量免疫接種後，在第一次免疫接種後28天及49天誘導之病毒中和效價。
圖14展示在處死當天使用不同劑量的具有RSV F基因之基於rAd26及rAd35之載體進行單次劑量免疫接種(i.m.)後，在處死當天棉鼠肺部之組織病理學檢查。
圖15展示包含具有編碼RSV F之序列的Ad35及Ad26基因組左端 之質體圖譜：A.pAdApt35BSU.RSV.F(A2)nat，及B.pAdApt26.RSV.F(A2)nat。
圖16展示在第0天或第28天使用不同劑量的具有RSV F基因之基於rAd26之載體進行單次劑量免疫接種後，在攻擊後5天，棉鼠之A)RSV肺效價及B)RSV鼻效價。第49天進行攻擊。
圖17展示在使用不同劑量的具有RSV F基因之rAd26進行單次劑量免疫接種後，在如圖16所述之免疫接種後49天誘導之病毒中和效價。
圖18展示在使用不同劑量的具有RSV F基因之rAd26進行單次劑量免疫接種後，在免疫接種後之時間內誘導之病毒中和效價。
圖19展示在使用源於經1010 Ad-RSV F或無轉殖基因(Ad-e)免疫接種之棉鼠的血清對抗RSV Long及RSV Bwash之後49天之VNA效價。PB：初打-加打。
圖20展示在第0天使用不同劑量的具有RSV F基因之基於rAd26之載體進行單次劑量免疫接種後，在使用RSV A2或RSV B15/97攻擊後5天，棉鼠之RSV肺效價。
圖21展示在第0天使用不同劑量的具有RSV F基因之基於rAd26之載體進行單次劑量免疫接種後，在使用RSV A2或RSV B15/97攻擊後5天，棉鼠之RSV鼻效價。
圖22展示在第0天使用不同劑量的具有RSV F基因之基於rAd26之載體進行單次劑量免疫接種後，在初打後之不同時間點，棉鼠血清中之VNA效價。
圖23展示在第0天使用不同劑量的具有RSV F基因之基於rAd26之載體進行單次劑量免疫接種後，在使用標準劑量(105)或高劑量(5×105)RSV A2攻擊後5天，棉鼠之RSV肺效價。
圖24展示在第0天使用不同劑量的具有RSV F基因之基於rAd26之 載體進行單次劑量免疫接種後，在使用標準劑量(105)或高劑量(5×105)RSV A2攻擊後5天，棉鼠之RSV鼻效價。
圖25展示在第0天及第28天使用不同劑量的具有RSV F基因之基於rAd26之載體之單次免疫接種或初打-加打免疫接種進行免疫接種後，在攻擊後5天，棉鼠之RSV肺效價，其中在免疫接種後210天進行攻擊。
圖26展示在單次劑量免疫接種及初打-加打免疫接種後，在免疫接種後140天，棉鼠之VNA效價。
圖27展示在使用不同劑量的具有RSV F基因之基於rAd26之載體進行單次免疫接種或初打-加打免疫接種後，在攻擊後2天，處死之棉鼠肺部之組織病理學檢查。點表示中位數及第25百分位數與第75百分位數之鬚(whisker)。
圖28展示在使用不同劑量的具有RSV F基因之基於rAd26之載體進行單次免疫接種或初打-加打免疫接種後，在攻擊後6天，處死之棉鼠肺部之組織病理學檢查。點表示中位數及第25百分位數與第75百分位數之鬚。
圖29展示在使用具有RSV F基因之rAd26(Ad26.RSV.F)免疫接種，繼而使用Ad26.RSV.F或使用輔助型RSV F蛋白質(post-F)加打後誘導之病毒中和效價。
圖30展示在使用Ad26.RSV.F免疫接種，繼而使用Ad26.RSV.F加打或使用輔助型RSV F蛋白質(post-F)加打後，IgG2a及IgG1抗體之誘導及其比率。
圖31展示在使用Ad26.RSV.F免疫接種，繼而使用Ad26.RSV.F或使用輔助型RSV F蛋白質(post-F)加打後，脾細胞產生IFN-g之情況。
如本文中所用，關於腺病毒之術語『重組』暗指其已經人工修 飾，例如其已改變其中主動選殖之末端及/或其包含異源基因，亦即其並非天然存在之野生型腺病毒。
如此項技術中所慣用，本文中之序列自5'至3'方向提供。
「腺病毒衣殼蛋白」係指在測定特定腺病毒之血清型及/或向性時所涉及之腺病毒衣殼上之蛋白質。腺病毒衣殼蛋白通常包括纖維蛋白、五鄰體蛋白及/或六鄰體蛋白。本發明之具有(或『基於』)特定血清型之腺病毒通常包含彼特定血清型之纖維蛋白、五鄰體蛋白及/或六鄰體蛋白，且較佳包含彼特定血清型之纖維蛋白、五鄰體蛋白及六鄰體蛋白。此等蛋白質通常由重組腺病毒之基因組編碼。具有特定血清型之重組腺病毒可視情況包含及/或編碼來自其他腺病毒血清型之其他蛋白質。因此，作為非限制性實例，包含Ad26之六鄰體、五鄰體及纖維之重組腺病毒視為基於Ad26之重組腺病毒。
重組腺病毒係『基於』如本文中所用之腺病毒，至少在序列上源於野生型。此可藉由使用野生型基因組或其部分作為起始物質進行分子選殖來實現。亦可使用野生型腺病毒基因組之已知序列以藉由DNA合成重新產生基因組(之部分)，DNA合成可由DNA合成及/或分子選殖領域中之商業性服務公司(例如GeneArt、Invitrogen、GenScripts、Eurofins)使用常規程序來進行。
熟習此項技術者應瞭解，許多不同聚核苷酸及核酸可由於遺傳密碼之簡併性而編碼相同多肽。亦應瞭解，熟習此項技術者可使用常規技術進行不會影響由此處所述之聚核苷酸編碼之多肽序列的核苷酸取代，從而反映欲表現多肽之任何具體宿主生物體之密碼子使用。因此，除非另有規定，否則「編碼胺基酸序列之核苷酸序列」包括彼此呈簡併型式且編碼相同胺基酸序列之所有核苷酸序列。編碼蛋白質及RNA之核苷酸序列可包括內含子。
在一個較佳實施例中，編碼RSV F蛋白質或其片段之核酸係針對 在哺乳動物細胞(諸如人類細胞)中之表現進行密碼子最佳化。密碼子最佳化方法為已知的且先前已有描述(例如WO 96/09378)。RSV F蛋白質之特定密碼子最佳化序列之一個實例描述於EP 2102345 B1之SEQ ID NO：2中。
在一個實施例中，RSV F蛋白質來自RSV A2病毒株且具有SEQ ID NO：1之胺基酸序列。在一個尤其較佳實施例中，編碼RSV F蛋白質之核酸包含SEQ ID NO：2之核酸序列。發明人已發現，此實施例產生穩定表現且此實施例之疫苗甚至在肌肉內投與單次劑量之後仍在鼻道及肺中提供抗RSV複製之保護。
如本文中所用之術語「片段」係指具有胺基端及/或羧基端及/或內部缺失，但剩餘胺基酸序列與RSV F蛋白質序列(例如RSV F蛋白質之全長序列)中之相應位置相同的肽。應瞭解，出於誘導免疫反應及一般出於接種疫苗之目的，蛋白質無須為全長的，亦無須具有所有其野生型功能，且該蛋白質之片段同等適用。實際上，如可溶性F1或F之RSV F蛋白質片段已顯示如同全長F一般可有效誘導免疫反應(Shao等人，2009,Vaccine 27：5460-71；Kohlmann等人，2009,J Virol 83：12601-12610)。將對應於胺基酸255-278或412-524之F蛋白質片段併入主動免疫接種中會誘導中和抗體及抗RSV攻擊之某種保護(Sing等人，2007,Virol.Immunol.20,261-275；Sing等人，2007,Vaccine 25,6211-6223)。
本發明之片段為免疫活性片段，且通常包含RSV F蛋白質之至少15個胺基酸或至少30個胺基酸。在某些實施例中，其包含RSV F蛋白質之至少50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500或550個胺基酸。
熟習此項技術者亦應瞭解，可例如使用常規分子生物學程序，例如藉由胺基酸取代、缺失、添加等對蛋白質作出改變。一般而言， 可在不損失多肽之功能或免疫原性之情況下應用保守胺基酸取代。此可根據熟習此項技術者熟知之常規程序而容易地檢查。
術語「疫苗」係指含有有效誘導個體之抗特定病原體或疾病之治療程度之免疫性之活性組分的作用物或組合物。在本發明中，疫苗包含有效量之編碼RSV F蛋白質之重組腺病毒或其抗原片段，其引起抗RSV F蛋白質之免疫反應。此提供一種為個體預防因RSV感染及複製而導致住院治療之嚴重下呼吸道疾病且減少因RSV感染及複製而引起之併發症(諸如肺炎及細支氣管炎)之頻率的方法。因此，本發明亦提供一種為個體預防或減少由RSV引起之嚴重下呼吸道疾病、預防或減少(例如縮短)由RSV引起之住院治療、及/或降低由RSV引起之肺炎或細支氣管炎之頻率及/或嚴重程度的方法，其包含藉由肌肉內注射向該個體投與包含血清型26重組人類腺病毒之組合物，該重組人類腺病毒包含編碼RSV F蛋白質或其片段之核酸。本發明之術語「疫苗」意指其為醫藥組合物，且因此通常包括醫藥學上可接受之稀釋劑、載劑或賦形劑。其可能包含或可能不包含其他活性成分。在某些實施例中，其可為另外包含誘導免疫反應(例如抗RSV之其他蛋白質及/或抗其他感染物)之其他組分的組合疫苗。
本發明之載體為重組腺病毒，亦稱為重組腺病毒載體。重組腺病毒載體之製備在此項技術中為熟知的。
在某些實施例中，本發明之腺病毒載體缺乏病毒複製所需之腺病毒基因組E1區(例如E1a區及/或E1b區)之至少一個必需基因功能。在某些實施例中，本發明之腺病毒載體缺乏非必需E3區之至少一部分。在某些實施例中，載體缺乏E1區之至少一個必需基因功能及非必需E3區之至少一部分。腺病毒載體可為「多重缺乏」的，意謂腺病毒載體之腺病毒基因組之兩個或兩個以上區中各自缺乏一或多個必需基因功能。舉例而言，前述E1缺乏或E1、E3缺乏腺病毒載體可另外缺 乏E4區之至少一個必需基因及/或E2區(例如E2A區及/或E2B區)之至少一個必需基因。
腺病毒載體、其構築方法及其增殖方法在此項技術中為熟知的且描述於以下文獻中：例如美國專利第5,559,099號、第5,837,511號、第5,846,782號、第5,851,806號、第5,994,106號、第5,994,128號、第5,965,541號、第5,981,225號、第6,040,174號、第6,020,191號及第6,113,913號，及Thomas Shenk,「Adenoviridae and their Replication」,M.S.Horwitz,「Adenoviruses」，分別在第67章及第68章，Virology,B.N.Fields等人編，第3版，Raven Press,Ltd.,New York(1996)，及本文中所提及之其他參考文獻。腺病毒載體之構築通常涉及使用標準分子生物學技術，諸如以下文獻中所述之技術：例如Sambrook等人，Molecular Cloning,a Laboratory Manual，第2版，Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)，Watson等人，Recombinant DNA，第2版，Scientific American Books(1992)，及Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology,Wiley Interscience Publishers,NY(1995)，及本文中所提及之其他參考文獻。
根據本發明，腺病毒為血清型26人類腺病毒。本發明之基於此血清型之疫苗以及基於Ad35之疫苗令人驚訝地似乎比先前技術中所述之基於Ad5之疫苗更有效，此係因為先前技術中所述之彼等疫苗在單次肌肉內投與後無法提供抗RSV攻擊複製之完全保護(Kim等人，2010,Vaccine 28：3801-3808；Kohlmann等人，2009,J Virol 83：12601-12610；Krause等人，2011,Virology Journal 8：375)。本發明之血清型另外一般在人類群體中具有低血清流行率及/或低原有中和抗體效價。在臨床試驗中評估具有不同轉殖基因之此血清型之重組腺病毒載體及Ad35重組腺病毒載體，且迄今顯示具有極佳安全型態。rAd26載 體之製備描述於例如WO 2007/104792及Abbink等人，(2007)Virol 81(9)：4654-63中。Ad26之例示性基因組序列見於GenBank寄存編號EF 153474及WO 2007/104792之SEQ ID NO：1中。rAd35載體之製備描述於例如美國專利第7,270,811號、WO 00/70071及Vogels等人，(2003)J Virol 77(15)：8263-71中。Ad35之例示性基因組序列見於GenBank寄存編號AC_000019及WO 00/70071之圖6中。
本發明之重組腺病毒可為複製勝任型或複製缺陷型。
在某些實施例中，腺病毒例如由於其在基因組之E1區中含有缺失而為複製缺陷型。如熟習此項技術者所知，在腺病毒基因組缺失必需區之情況下，由此等區編碼之功能必須反式(in trans)提供，較佳由生產細胞提供，亦即當腺病毒缺失部分或整個E1、E2及/或E4區時，此等區必須存在於生產細胞中，例如整合於其基因組中或呈所謂的輔助腺病毒或輔助質體形式。腺病毒亦可在並非複製所必需之E3區中具有缺失，且因此無須補充此種缺失。
可使用之生產細胞(有時在此項技術中及本文中亦稱為『包裝細胞』或『補充細胞』或『宿主細胞』)可為可使所需腺病毒增殖之任何生產細胞。舉例而言，重組腺病毒載體之增殖係在補充腺病毒中之缺陷的生產細胞中進行。該等生產細胞較佳在其基因組中具有至少腺病毒E1序列，且藉此能夠補充E1區缺失之重組腺病毒。可使用任何補充E1之生產細胞，諸如由E1永生化之人類視網膜細胞，例如911或PER.C6細胞(參見美國專利5,994,128)，E1轉形羊水細胞(參見EP專利1230354)、E1轉形A549細胞(參見例如WO 98/39411、美國專利5,891,690)、GH329：HeLa(Gao等人，2000,Human Gene Therapy 11：213-219)、293及其類似細胞。在某些實施例中，生產細胞為例如HEK293細胞、或PER.C6細胞、或911細胞、或IT293SF細胞及其類似細胞。
對於非亞群C E1缺乏型腺病毒，諸如Ad35(亞群B)或Ad26(亞群D)，較佳將此等非亞群C腺病毒之E4-orf6編碼序列與亞群C腺病毒(諸如Ad5)之E4-orf6交換。此使得該等腺病毒可在表現Ad5之E1基因之熟知補充細胞株(諸如293細胞或PER.C6細胞)中增殖(參見例如Havenga等人，2006,J.Gen.Virol.87：2135-2143；WO 03/104467，以全文引用的方式併入本文中)。在某些實施例中，可使用之腺病毒為血清型35人類腺病毒，其在已選殖編碼RSV F蛋白質抗原之核酸的E1區中具有缺失，且具有Ad5之E4 orf6區。在某些實施例中，本發明之疫苗組合物中之腺病毒為血清型26人類腺病毒，其在已選殖編碼RSV F蛋白質抗原之核酸的E1區中具有缺失，且具有Ad5之E4 orf6區。
在替代性實施例中，無須將(例如Ad5之)異源E4orf6區置於腺病毒載體中，取而代之的是在表現E1與相容E4orf6之細胞株，例如表現Ad5之E1與E4orf6之293-ORF6細胞株中使E1缺乏型非亞群C載體增殖(參見例如Brough等人，1996,J Virol 70：6497-501，其描述293-ORF6細胞之產生；Abrahamsen等人，1997,J Virol 71：8946-51及Nan等人，2003,Gene Therapy 10：326-36，各自描述使用此種細胞株產生缺失E1之非亞群C腺病毒載體)。
或者，可使用表現來自欲增殖之血清型之E1的補充細胞(參見例如WO 00/70071、WO 02/40665)。
對於在E1區中具有缺失之亞群B腺病毒(諸如Ad35)，較佳保留腺病毒中E1B 55K開放閱讀框架之3'末端，例如在pIX開放閱讀框架上游緊鄰之166bp或包含其之片段，諸如在pIX起始密碼子上游緊鄰之243bp片段(在Ad35基因組中在5'末端由Bsu36I限制性位點標記)，此係因為此片段由於pIX基因之啟動子部分地存在於此區域中而增加腺病毒之穩定性(參見例如Havenga等人，2006,J.Gen.Virol.87：2135-2143；WO 2004/001032，以引入的方式併入本文中)。
本發明之腺病毒中之「異源核酸」(在本文中亦稱為『轉殖基因』)為非天然存在於腺病毒中之核酸。其係例如藉由標準分子生物學技術引入腺病毒中。在本發明中，異源核酸編碼RSV F蛋白質或其片段。可將其例如選殖於腺病毒載體缺失之E1或E3區中。轉殖基因一般可操作地連接於表現控制序列。此可例如藉由將編碼轉殖基因之核酸置於啟動子之控制下來完成。可添加其他調控序列。許多啟動子可用於轉殖基因之表現且為熟習此項技術者所知。適用於在真核細胞中獲得表現之啟動子的非限制性實例為CMV啟動子(US 5,385,839)，例如CMV即刻早期啟動子，例如包含來自CMV即刻早期基因強化子/啟動子之核苷酸-735至+95。聚腺苷酸化信號，例如牛生長激素聚A信號(US 5,122,458)，可存在於轉殖基因之後。
在某些實施例中，本發明之重組Ad26載體包含以下核苷酸序列作為5'端核苷酸：CTATCTAT。此等實施例為有利的，因為該等載體與具有原始5'端序列(一般為CATCATCA)之載體相比在產生過程中顯示改良之複製，從而產生具有改良之均質性的腺病毒批次(亦參見專利申請案第PCT/EP2013/054846號及US 13/794,318，題為『Batches of recombinant adenovirus with altered terminal ends』，以Crucell Holland B.V.之名義於2012年3月12日申請)，其以全文引用的方式併入本文中。因此，本發明亦提供編碼RSV F蛋白質或其一部分之重組腺病毒批次，其中該腺病毒為血清型26人類腺病毒，且其中該批次中基本上所有(例如至少90%)腺病毒包含具有末端核苷酸序列CTATCTAT之基因組。
根據本發明，RSV之F蛋白質可源於天然存在之RSV或重組RSV之任何病毒株，較佳源於人類RSV病毒株，諸如A2、Long或B病毒株。在其他實施例中，序列可為基於複數個RSV F蛋白質胺基酸序列之共同序列。在本發明之一個實例中，RSV病毒株為RSV-A2病毒 株。
根據本發明，RSV之F蛋白質可為RSV之全長F蛋白質或其片段。在本發明之一個實施例中，編碼RSV之F蛋白質之核苷酸序列編碼RSV之全長F蛋白質(F0)，諸如SEQ ID NO：1之胺基酸。在本發明之一個實例中，編碼RSV之F蛋白質之核苷酸序列具有SEQ ID NO：2之核苷酸序列。或者，編碼RSV之F蛋白質之序列可為與SEQ ID NO：2之核苷酸序列至少約80%、較佳超過約90%、更佳至少約95%一致的任何序列。在其他實施例中，可使用諸如WO 2012/021730之SEQ ID NO：2、4、5或6中所提供之密碼子最佳化序列。
在本發明之另一實施例中，核苷酸序列或者可編碼RSV之F蛋白質之片段。片段可由胺基端及羧基端中之一或兩者缺失而產生。缺失程度可由熟習此項技術者確定以例如獲得重組腺病毒之較佳產率。所選擇之片段將包含F蛋白質之免疫活性片段，亦即將引起個體之免疫反應之部分。此可易於使用電腦模擬(in silico)、活體外及/或活體內方法來確定，所有方法均為熟習此項技術者所常用。在本發明之一個實施例中，片段為RSV之跨膜編碼區截短之F蛋白質(F0△TM，參見例如US 20110014220)。F蛋白質之片段亦可為F蛋白質之F1域或F2域。F之片段亦可為含有中和抗原決定基及T細胞抗原決定基之片段(Sing等人，2007,Virol.Immunol.20,261-275；Sing等人，2007,Vaccine 25,6211-6223)。
如本發明中所用，關於數值之術語『約』意謂值±10%。
在某些實施例中，本發明提供製造抗呼吸道融合性病毒(RSV)疫苗之方法，其包含提供包含編碼RSV F蛋白質或其片段之核酸的血清型26重組人類腺病毒，使該重組腺病毒在宿主細胞培養物中增殖，分離並純化該重組腺病毒，及將該重組腺病毒引入醫藥學上可接受之組合物中。
可根據熟知方法製備重組腺病毒且在宿主細胞中增殖，該等方法需要經腺病毒感染之宿主細胞的細胞培養。細胞培養可為任何類型之細胞培養，包括黏附細胞培養，例如細胞附著於培養容器或微載體表面；以及懸浮培養。
大多數大規模懸浮培養以分批製程或補料分批製程操作，因為該等製程最易於操作及擴大規模。如今，基於灌注原理之連續製程變得更常見且亦適合(參見例如WO 2010/060719及WO 2011/098592，兩者以引入的方式併入本文中，其描述適用於獲得並純化大量重組腺病毒之方法)。
培養生產細胞以增加細胞及病毒數目及/或病毒效價。完成細胞培養以使其能夠代謝及/或生長及/或分裂及/或產生本發明之相關病毒。此可藉由如熟習此項技術者所熟知之方法來實現，且包括(但不限於)例如在適當培養基中為細胞提供營養物。適合培養基為熟習此項技術者所熟知，且一般可自商業來源大量獲得或根據標準方案定製。可使用分批系統、補料分批系統、連續系統及其類似系統在培養皿、滾瓶或生物反應器中進行培養。適用於培養細胞之條件為已知的(參見例如Tissue Culture,Academic Press,Kruse及Paterson編(1973)，及R.I.Freshney,Culture of animal cells：A manual of basic technique,第四版(Wiley-Liss Inc.,2000,ISBN 0-471-34889-9))。
腺病毒通常應暴露於培養物中允許吸收病毒之適當生產細胞。通常，最佳攪拌介於約50rpm與300rpm之間，通常為約100-200rpm，例如約150rpm；典型DO為20-60%，例如40%；最佳pH值介於6.7與7.7之間；最佳溫度介於30℃與39℃之間，例如34-37℃；且最佳MOI介於5與1000之間，例如約50-300。腺病毒通常自發感染生產細胞，且生產細胞與rAd粒子之接觸足以感染該等細胞。一般而言，將腺病毒種子儲備物(seed stock)添加至培養物中以起始感染，隨後腺病 毒在生產細胞中增殖。此均為熟習此項技術者所常用。
在感染腺病毒後，病毒在細胞內部複製且由此擴增，該過程在本文中稱為腺病毒增殖。腺病毒感染最終導致經感染之細胞溶解。腺病毒之溶胞特徵因此可允許兩種不同模式之病毒產生。第一模式為在細胞溶解之前收集病毒，採用外部因子溶解細胞。第二模式為在所產生之病毒(幾乎)完全溶解細胞之後收集病毒上清液(參見例如美國專利6,485,958，其描述在未由外部因子溶解宿主細胞之情況下收集腺病毒)。較佳採用外部因子主動溶解細胞以便收集腺病毒。
可用於主動溶解細胞之方法為熟習此項技術者所知，且已例如在WO 98/22588第28-35頁中論述。就此而言適用之方法為例如冷凍-解凍、固體剪切、高滲及/或低滲溶解、液體剪切、音波處理、高壓擠壓、清潔劑溶解、上述方法之組合及其類似方法。在本發明之一個實施例中，使用至少一種清潔劑溶解細胞。使用清潔劑溶解之優勢在於其為一種簡易方法且容易調整規模。
可使用之清潔劑及其使用方式一般為熟習此項技術者所知。若干實例例如在WO 98/22588第29-33頁中論述。清潔劑可包括陰離子型清潔劑、陽離子型清潔劑、兩性離子型清潔劑及非離子型清潔劑。清潔劑之濃度可例如在約0.1%至5%(w/w)範圍內變化。在一個實施例中，所用清潔劑為Triton X-100。
可採用核酸酶移除污染性(亦即主要來自生產細胞)核酸。適用於本發明之例示性核酸酶包括Benzonase®、Pulmozyme®或此項技術中常用之任何其他DNase及/或RNase。在較佳實施例中，核酸酶為Benzonase®，其藉由水解特定核苷酸之間的內部磷酸二酯鍵而迅速水解核酸，從而降低細胞溶解產物之黏度。Benzonase®可在商業上獲自Merck KGaA(代碼W214950)。所採用核酸酶之濃度較佳在1至100個單位/毫升之範圍內。或者，或除核酸酶處理之外，亦可在腺病毒純 化期間使用選擇性沈澱劑(諸如溴化度米芬(domiphen bromide))選擇性地沈澱宿主細胞DNA而與腺病毒製劑分離(參見例如US 7,326,555；Goerke等人，2005,Biotechnology and bioengineering，第91卷：12-21；WO 2011/045378；WO 2011/045381)。
自生產細胞培養物收集腺病毒之方法已詳盡地描述於WO 2005/080556中。
在某些實施例中，進一步純化所收集之腺病毒。可分若干步驟進行腺病毒純化，包含淨化、超濾、透濾或層析分離，如在例如以引入的方式併入本文中之WO 05/080556中所述。可藉由過濾步驟進行淨化，自細胞溶解產物移除細胞碎片及其他雜質。使用超濾來濃縮病毒溶液。使用超濾器進行透濾或緩衝液交換為移除及交換鹽、糖及其類似物之方式。熟習此項技術者已知如何發現各純化步驟之最佳條件。以全文引用的方式併入本文中之WO 98/22588亦描述產生及純化腺病毒載體之方法。該等方法包含使宿主細胞生長，用腺病毒感染該等宿主細胞，收集並溶解該等宿主細胞，濃縮粗溶解產物，交換該粗溶解產物之緩衝液，用核酸酶處理該溶解產物，及使用層析進一步純化病毒。
純化較佳採用至少一個層析步驟，如在例如WO 98/22588第61-70頁中所論述。已描述用於進一步純化腺病毒之許多製程，其中層析步驟包括於製程中。熟習此項技術者應瞭解此等製程，且可改變採用層析步驟之確切方式以使製程最佳化。舉例而言，可由陰離子交換層析步驟純化腺病毒，參見例如WO 2005/080556及Konz等人，2005,Hum Gene Ther 16：1346-1353。已描述許多其他腺病毒純化方法且在熟習此項技術者之可達範圍內。產生及純化腺病毒之其他方法揭示於例如(WO 00/32754；WO 04/020971；US 5,837,520；US 6,261,823；WO 2006/108707；Konz等人，2008,Methods Mol Biol 434：13-23； Altaras等人，2005,Adv Biochem Eng Biotechnol 99：193-260)中，所有文獻均以引入的方式併入本文中。
為投與人類，本發明可採用包含rAd及醫藥學上可接受之載劑或賦形劑的醫藥組合物。在本發明情形中，術語「醫藥學上可接受」意謂載劑或賦形劑在所用劑量及濃度下不會對所投與之個體產生任何不當或有害影響。該等醫藥學上可接受之載劑及賦形劑在此項技術中為熟知的(參見Remington's Pharmaceutical Sciences，第18版，A.R.Gennaro編，Mack Publishing Company[1990]；Pharmaceutical Formulation Development of Peptides and Proteins,S.Frokjaer及L.Hovgaard編，Taylor & Francis[2000]；及Handbook of Pharmaceutical Excipients，第3版，A.Kibbe編，Pharmaceutical Press[2000])。經純化之rAd較佳以無菌溶液形式調配及投藥，但亦可利用凍乾製劑。無菌溶液係藉由無菌過濾或藉由此項技術中本身已知之其他方法來製備。接著，將溶液凍乾或填充於藥物劑量容器中。溶液之pH值一般在pH 3.0至9.5之範圍內，例如pH 5.0至7.5。rAd通常呈具有適合醫藥學上可接受之緩衝液的溶液形式，且rAd之溶液亦可含有鹽。視情況可存在穩定劑，諸如白蛋白。在某些實施例中，添加清潔劑。在某些實施例中，可將rAd調配成可注射製劑。此等調配物含有有效量之rAd，呈無菌液體溶液、液體懸浮液或凍乾型式，且視情況含有穩定劑或賦形劑。亦可霧化腺病毒疫苗以供鼻內投藥(參見例如WO 2009/117134)。
舉例而言，腺病毒可儲存於亦用於腺病毒世界標準(Adenovirus World Standard；Hoganson等人，Development of a stable adenoviral vector formulation,Bioprocessing 2002年3月，第43-48頁)之緩衝液中：20mM Tris pH 8、25mM NaCl、2.5%甘油。另一適合投與人類之適用調配緩衝液為20mM Tris、2mM MgCl2、25mM NaCl、10% w/v蔗糖、0.02% w/v聚山梨醇酯-80。顯然，可使用許多其他緩衝 液，且適用於經純化之(腺)病毒製劑之儲存及醫藥投與之調配物的若干實例可例如見於歐洲專利第0853660號、美國專利6,225,289及國際專利申請案WO 99/41416、WO 99/12568、WO 00/29024、WO 01/66137、WO 03/049763、WO 03/078592、WO 03/061708中。
在某些實施例中，包含腺病毒之組合物另外包含一或多種佐劑。此項技術中已知之佐劑進一步增強對所施用之抗原決定子之免疫反應，且包含腺病毒及適合佐劑之醫藥組合物在例如以引入的方式併入本文中之WO 2007/110409中揭示。術語「佐劑」及「免疫刺激劑」在本文中可互換使用，且定義為刺激免疫系統之一或多種物質。在此情形中，佐劑用於增強對本發明之腺病毒載體的免疫反應。適合佐劑之實例包括鋁鹽，諸如氫氧化鋁及/或磷酸鋁；油-乳液組合物(或水包油組合物)，包括角鯊烯-水乳液，諸如MF59(參見例如WO 90/14837)；皂素調配物，諸如QS21及免疫刺激複合物(ISCOMS)(參見例如US 5,057,540；WO 90/03184、WO 96/11711、WO 2004/004762、WO 2005/002620)；細菌或微生物衍生物，其實例為單磷醯脂A(MPL)、3-O-去醯化MPL(3dMPL)、含CpG基元之寡核苷酸、ADP核糖基化細菌毒素或其突變體，諸如大腸桿菌熱不穩定腸毒素LT、霍亂毒素CT及其類似物。亦可使用載體編碼之佐劑，例如藉由使用編碼C4結合蛋白(C4bp)之寡聚域與相關抗原之融合體的異源核酸(例如Solabomi等人，2008,Infect Immun 76：3817-23)。在某些實施例中，本發明之組合物包含鋁作為佐劑，例如呈氫氧化鋁、磷酸鋁、磷酸鋁鉀或其組合之形式，濃度為每一劑量0.05-5mg(例如0.075-1.0mg)之鋁含量。
在其他實施例中，組合物不包含佐劑。
根據本發明，亦可與本發明之疫苗組合投與其他活性組分。該等其他活性組分可包含例如其他RSV抗原或包含編碼此等抗原之核酸 的載體。該等載體可為非腺病毒載體或腺病毒載體，其中腺病毒載體可為任何血清型。其他RSV抗原之一個實例包括RSV G蛋白質或其免疫活性部分。舉例而言，鼻內施用之表現G醣蛋白可溶性核心域(胺基酸130至230)之基於Ad5之重組複製缺陷型腺病毒載體rAd/3xG在鼠類模型中具有保護性(Yu等人，2008,J Virol 82：2350-2357)，但當肌肉內施用時其不具保護性，由此等資料顯而易見，RSV G為用於誘導保護性反應之適合抗原。其他活性組分亦可包含非RSV抗原，例如來自其他病原體，諸如病毒、細菌、寄生蟲及其類似物。其他活性組分之投與可例如藉由獨立投與或藉由投與本發明之疫苗與其他活性組分之組合產品來進行。在某些實施例中，其他非腺病毒抗原(除RSV.F之外)可在本發明之載體中編碼。在某些實施例中，因此可能需要表現來自單一腺病毒之一種以上蛋白質，且在該等情況下，更多編碼序列例如可連接形成來自單一表現卡匣之單一轉錄物或可存在於在腺病毒基因組之不同部分選殖之兩個獨立表現卡匣中。
腺病毒組合物可投與個體，例如人類個體。在一次投與期間向個體提供之腺病毒的總劑量可如熟練此項技術者所知而變化，且一般介於1×107個病毒粒子(vp)與1×1012vp之間，較佳介於1×108 vp與1×1011vp之間，例如介於3×108vp與5×1010vp之間，例如介於109vp與3×1010vp之間。
可使用標準投藥途徑投與腺病毒組合物。非限制性實施例包括非經腸投藥，諸如藉由例如皮內、肌肉內等注射，或皮下、經皮或經黏膜投藥，例如鼻內、經口及其類似途徑。鼻內投藥一般已視為抗RSV疫苗之較佳途徑。活的鼻內策略之最重要優勢在於直接刺激局部呼吸道免疫性且不存在相關疾病增強。目前在臨床評估下供小兒使用之唯一疫苗為活鼻內疫苗(Collins及Murphy.Vaccines against human respiratory syncytial virus,Perspectives in Medical Virology 14： Respiratory Syncytial Virus(Cane,P.編)，Elsevier,Amsterdam,the Netherlands，第233-277頁)。鼻內投藥亦為本發明之適合較佳途徑。然而，根據本發明尤其較佳的是肌肉內投與疫苗，因為令人驚訝地發現肌肉內投與本發明之疫苗在棉鼠鼻及肺中產生抗RSV複製之保護，與先前報導的基於其他腺病毒血清型之肌肉內RSV疫苗不同。肌肉內投藥之優勢在於其簡單且完善，且不具有6個月以下之嬰兒鼻內施用之安全性問題。在一個實施例中，藉由肌肉內注射將組合物投與例如手臂三角肌或大腿股外側肌中。熟習此項技術者已知投與組合物(例如疫苗)以誘導對疫苗中之抗原之免疫反應的多種可能性。
如本文中所用之個體較佳為哺乳動物，例如齧齒動物，例如小鼠、棉鼠，或非人類靈長類動物，或人類。個體較佳為人類個體。個體可為任何年齡，例如約1個月大至100歲，例如約2個月大至約80歲，例如約1個月大至約3歲、約3歲至約50歲、約50歲至約75歲等。
亦可提供本發明之一或多種腺病毒疫苗之一或多次加打投藥。若進行加打接種疫苗，則此種加打接種疫苗通常將在組合物第一次投與個體(在該等情況下稱為『初打接種疫苗』)之後，在一週與一年之間、較佳兩週與四個月之間的時刻投與同一個體。在替代性加打方案中，亦可在初打接種疫苗之後向個體投與不同載體，例如不同血清型之一或多種腺病毒，或其他載體，諸如MVA或DNA或蛋白質。舉例而言，可向個體投與本發明之重組腺病毒載體作為初打，且加打包含RSV F蛋白質之組合物。
在某些實施例中，投藥包含初打及至少一次加打投藥。在其某些實施例中，初打投藥使用包含編碼RSV F蛋白質或其片段之核酸的rAd35(『rAd35-RSV.F』)，且加打投藥使用本發明之包含編碼RSV F蛋白質之核酸的rAd26(『rAd26-RSV.F』)。在其其他實施例中，初打投藥使用rAd26-RSV.F且加打投藥使用rAd35-RSV.F。在其他實施例 中，初打與加打投藥均使用rAd26.RSV.F。在某些實施例中，初打投藥使用rAd26-RSV.F且加打投藥使用RSV F蛋白質。在所有此等實施例中，可提供使用相同或其他載體或蛋白質之其他加打投藥。加打RSV F蛋白質可尤其有利之實施例包括例如50歲或50歲以上之危險群體(例如患有COPD或哮喘)之年長個體，或例如60歲或60歲以上或65歲或65歲以上之健康個體。
在某些實施例中，投藥包含單次投與本發明之重組腺病毒，而無其他(加打)投藥。該等實施例鑒於單次投藥方案與初打-加打方案相比複雜性及成本降低而為有利的。在本文之實例中，在單次投與本發明之重組腺病毒載體而無加打投藥後，在棉鼠模型中已觀測到完全保護。
在以下實例中進一步說明本發明。該等實例不以任何方式限制本發明。其僅用以闡明本發明。
實例 實例1. 製備腺病毒載體 將RSV F基因選殖於Ad35及Ad26之E1區中：
藉由Geneart使編碼A2病毒株之原生RSV融合(F)蛋白質之RSV.F(A2)nat基因(Genbank ACO83301.1)針對人類表現進行基因最佳化且加以合成。緊鄰ATG起始密碼子之前包括Kozak序列(5' GCCACC 3')，且在RSV.F(A2)nat編碼序列末端添加兩個終止密碼子(5' TGATAA 3')。將RSV.F(A2)nat基因經由HindIII及XbaI位點插入pAdApt35BSU質體及pAdApt26質體中。所得質體pAdApt35BSU.RSV.F(A2)nat及pAdApt26.RSV.F(A2)nat描繪於圖15中。F蛋白質之胺基酸序列及編碼彼胺基酸序列之密碼子最佳化序列分別作為SEQ.ID.NO：1及2提供於表1中。
細胞培養：
將PER.C6細胞(Fallaux等人，1998,Hum Gene Ther 9：1909-1917)維持於含10%胎牛血清(FBS)且補充有10mM MgCl2之達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco's modified Eagle's medium，DMEM)中。
腺病毒產生、感染及繼代：
在PER.C6細胞中藉由單一同源重組產生所有腺病毒，且如先前所述而產生(關於rAd35：Havenga等人，2006,J.Gen.Virol.87：2135-2143；關於rAd26：Abbink等人，2007,J.Virol.81：4654-4663)。簡言之，根據製造商(Life Technologies)所提供之用法說明，使用脂染胺(Lipofectamine)，以Ad載體質體轉染PER.C6細胞。為補救帶有RSV.F(A2)nat轉殖基因表現卡匣之Ad35載體，使用pAdApt35BSU.RSV.F(A2)nat質體及pWE/Ad35.pIX-rITR.dE3.5orf6黏質體，而對於帶有RSV.F(A2)nat轉殖基因表現卡匣之Ad26載體，使用pAdApt26.RSV.F(A2)nat質體及pWE.Ad26.dE3.5orf6黏質體。在完整CPE後一天收集細胞，冷凍-解凍，以3,000rpm離心5分鐘且在-20℃下儲存。接著，對病毒進行空斑純化且在多孔24組織培養板之單孔上培養之PER.C6中擴增。在使用T25組織培養瓶及T175組織培養瓶培養之PER.C6中進行進一步擴增。使用T175粗溶解產物中之3至5ml接種含有PER.C6細胞之70%匯合層之20×T175三層組織培養瓶。使用兩步CsCl純化方法純化病毒。最後，將病毒以等分試樣儲存於-85℃下。
實例2. 使用血清型26及35重組腺病毒活體內誘導抗RSV F免疫性
此為查明血清型重組腺病毒(Ad26)及血清型35重組腺病毒(Ad35)誘導BALB/c小鼠之抗RSV之醣蛋白F抗原之免疫性的實驗。
在此研究中，將動物分配於具有5隻小鼠之實驗組中。用單次劑量之帶有全長RSV F基因之Ad26或Ad35(Ad26-RSV.F或Ad35-RSV.F)或無轉殖基因之Ad26或Ad35(Ad26e或Ad35e)對動物免疫接種。肌肉內給與在1010至108個病毒粒子(vp)範圍內之rAd的三個10倍連續稀釋 液。作為對照，一組3隻動物接受空載體Ad26e且一組接受空載體Ad35e。
ELISPOT分析用於測定脾臟中F蛋白質特異性IFNγ分泌T細胞之相對數目，且基本上如Radoevi等人(Clin Vaccine Immunol.2010；17(11)：1687-94)所述來進行。為在ELISPOT分析中刺激脾細胞，使用由跨越RSV F(A2)蛋白質整個序列之11胺基酸重疊15聚體肽組成之兩個肽庫。計算每106個細胞之斑點形成單位(SFU)的數目。
為測定抗體效價，使用ELISA分析。為此，用25μg/ml RSV Long完整不活化抗原(Virion Serion，目錄號BA113VS)塗佈ELISA板(Thermo Scientific)。將稀釋之血清樣品添加至板中，且使用經生物素標記之抗小鼠IgG(DAKO，目錄號E0413)，由辣根過氧化酶(PO)結合之抗生蛋白鏈菌素(SA)偵測來測定抗RSV之IgG抗體。使用來自50倍稀釋之未處理血清之1.5×OD信號作為截止，藉由線性內插法計算效價。使用用於定量子類之經PO標記之抗小鼠IgG1及經PO標記之抗小鼠IgG2a(Southern Biotechnology Associates，目錄號1070-05及1080-05)測定小鼠血清中RSV特異性IgG1及IgG2a抗體之效價。
藉由微量中和分析來測定抗體之病毒中和活性(VNA)，基本上如Johnson等人(J Infect Dis.1999年7月；180(1)：35-40)所述來進行。在感染前一天，將RSV易感VERO細胞接種於96孔細胞培養板中。在感染當天，使連續稀釋之血清及對照與1200 pfu之RSV(Long或B1)混合且在37℃下培育1小時。隨後，將病毒/抗體混合物轉移至含有VERO細胞單層之96孔板中。三天後，用80%冰冷丙酮固定單層且使用抗F單株抗體測定RSV抗原。中和效價表示為使得僅病毒對照孔之OD450減少50%(IC50)之血清稀釋度(log2)。
在初打後第2週及第8週，處死動物且如上所述監測細胞反應及體液反應。
圖1展示所有劑量之Ad26-RSV.F(圖1A)及Ad35-RSV.F(圖1B)均有效誘導良好細胞免疫反應且反應隨著時間推移而穩定。使用Ad26-RSV.F或Ad35-RSV.F未觀測到載體劑量對於T細胞反應之顯著差異。
圖2展示如上所述之相同實驗中之抗體效價。兩種載體均誘導ELISA效價之極其明顯之時間依賴性及劑量依賴性增加(圖2)。抗F效價自第2週至第8週明顯增加，對於1010劑量為顯著的。第8週，Ad26-RSV.F或Ad35-RSV.F載體之間不存在效價差異。
測定F特異性IgG之子類分佈(IgG1相對IgG2a)以評估Th1相對Th2反應之平衡。如使用福馬林不活化RSV所見，偏斜之Th2/Th1反應使動物易顯現疫苗增強之RSV疾病。如圖3所示，Ad26-RSV.F與Ad35-RSV.F之IgG2a/IgG1比率均高於1。此強烈指示腺病毒載體Ad26-RSV.F及Ad35-RSV.F展現Th1類型反應而非Th2類型反應。
圖4展示用於抗體效價之相同血清之病毒中和效價(VNA)。使用Ad26-RSV.F及rAd35-RSV.F免疫接種會誘導中和抗體效價。給與1010vp之小鼠在初打後兩週與八週之間VNA效價大大增加。第八週，給與1010vp之小鼠的Ad26-RSV.F載體與Ad35-RSV.F載體之間的效價不存在差異。
由此等免疫接種實驗顯而易見，具有RSV.F轉殖基因之Ad35載體及Ad26載體誘導強烈的抗RSV.F細胞反應及體液反應。
實例3. 使用編碼RSV.F之重組腺病毒載體，在異源初打-加打後抗RSV.F之免疫性
設計此研究以查明基於源於兩種不同血清型之腺病毒載體之初打-加打方案誘導抗RSV.F免疫性的能力。
此研究涉及將BALB/c小鼠分配於具有8隻小鼠之實驗組中。藉由肌肉內注射1010個帶有基於/源於RSV A2之RSV.F基因之野生型序列的病毒粒子(Ad-RSV.F或Ad35-RSV.F)或無轉殖基因之病毒粒子(Ad26e或 Ad35e)對動物免疫接種。一組動物首週使用Ad26-RSV.F初打且在第4週使用Ad35-RSV.F或Ad35e加打。另一組動物使用Ad35-RSV.F初打且在第4週使用Ad26-RSV.F或Ad26e加打。小鼠對照組使用Ad35e初打且在第4週使用Ad26e加打。在初打後第6週及第12週，在各時間點處死8隻動物且使用熟習此項技術者熟知且如上所述之免疫分析來監測細胞反應及體液反應。
圖5展示在第一次免疫接種後6週及12週之細胞反應。在初打後6週(及加打後2週)，量測Ad26-RSV.F與Ad35-RSV.F對於T細胞反應之顯著加強作用，且T細胞反應之量值與初打-加打中使用Ad26-RSV.F或Ad35-RSV.F免疫接種之順序無關。在初打後12週(加打後8週)，在僅接受初打之動物及接受初打-加打之動物中，與rAd35-RSV.F初打之動物相比，使用Ad26-RSV.F初打之小鼠已維持較高水準之F特異性T細胞。總之，在使用rAd26-RSV.F或rAd35-RSV.F(初打或初打-加打)免疫接種之所有動物中，F特異性淋巴細胞(SFU)之數目較高且穩定至少12週。
圖6展示在使用腺病毒載體初打-加打接種疫苗後之不同時間點的體液反應。完全同等地初打Ad35.RSV.F及Ad26.RSV.F，且展示由Ad26.RSV.F或rAd35.RSV.F誘導的對於B細胞反應之顯著加強作用。此外，異源初打-加打中B細胞反應之量值與Ad35.RSV.F及Ad26.RSV.F免疫接種之順序無關，且加打後ELISA效價保持穩定12週。
圖7展示在初打-加打免疫接種後之不同時間點的病毒中和抗體效價。完全同等地初打Ad35.RSV.F載體與Ad26.RSV.F載體以獲得明顯VNA效價，如對於ELISA效價所觀測之情況。此外，異源初打-加打後VNA效價之增加與Ad35.RSV.F及Ad26.RSV.F免疫接種之順序無關。Ad26.RSV.F或Ad35.RSV.F對於VNA效價之加強作用在兩個時間 點均顯著且在第6週已達到最大。僅使用Ad.RSV.F初打之組在第12週之VNA效價與第6週相比增加。腺病毒載體構築體中之RSV F序列源於RSV A2分離株。本申請案中所述之中和分析係基於屬於RSV亞群A之RSV Long病毒株，證實由F(A2)誘導之抗體能夠交叉中和不同RSV A病毒株亞型。
由於RSV F蛋白質在RSV分離株中完全保守，故測試經Ad-RSV.F載體免疫接種之動物的血清是否能夠交叉中和原型RSV B病毒株分離株RSV B1。如圖8所示，經免疫接種之小鼠之血清亦能夠交叉中和B1病毒株。交叉中和RSV B1之能力並不依賴於僅初打組中所用之載體或使用Ad26.RSV.F載體及Ad35.RSV.F載體進行初打-加打免疫接種之順序。
總之，此等資料顯示在初打-加打方案中，使用Ad26.RSV.F及Ad35.RSV.F連續免疫接種誘導強體液反應及細胞反應，且體液免疫反應包括中和RSV A亞型與RSV B亞型之分離株的能力。
實例4. 在棉鼠模型中使用重組腺病毒載體活體內誘導抗RSV感染之保護
進行此實驗以查明基於源於兩種不同血清型之腺病毒載體的初打-加打方案誘導棉鼠之抗RSV攻擊複製之保護的能力。棉鼠(剛毛棉花鼠，Sigmodon hispidus)易受RSV引起之上呼吸道及下呼吸道感染且發現感染容許度為小鼠品系之至少50倍(Niewiesk等人，2002,Lab.Anim.36(4)：357-72)。此外，棉鼠已成為評估RSV候選疫苗、抗病毒劑及抗體之功效及安全性的初級模型。在棉鼠模型中得到之臨床前資料促進開發兩種抗體調配物(RespiGam®及Synagis®)用於臨床試驗，而無需非人類靈長類動物中之中間研究。
該研究將棉鼠錄入實驗組中，每組8隻棉鼠。藉由肌肉內注射109個病毒粒子(vp)或1010vp之帶有全長RSV F(A2)基因之腺病毒載體 (Ad26.RSV.F或Ad35.RSV.F)或無轉殖基因之腺病毒載體(Ad26e或Ad35e)對動物免疫接種。動物在28天後加打相同vp劑量之相同載體(同源初打-加打)或其他腺病毒血清型(異源初打-加打)；除僅施用1次劑量(1010)之外，據此使用Ad-e載體對對照組免疫接種。對照組由6隻動物組成。經RSV A2(104個空斑形成單位(pfu))鼻內感染之動物用作抗攻擊複製之保護的陽性對照，眾所周知的是，經RSV病毒初次感染會防止二次攻擊複製(Prince.Lab Invest 1999,79：1385-1392)。此外，福馬林不活化RSV(FI-RSV)充當疫苗增強組織病理學疾病之對照。在第二次(加打)免疫接種後三週，經鼻內使用1×105 pfu之空斑純化RSV A2攻擊棉鼠。作為對照，一組棉鼠未經免疫接種但接受攻擊病毒，且另一對照組未經免疫接種且不受攻擊。在感染後5天(RSV攻擊病毒達成峰值效價之時間點)處死棉鼠(Prince.Lab Invest 1999,79：1385-1392)，且藉由病毒空斑滴定來測定肺RSV效價及鼻RSV效價(Prince等人1978,Am J Pathology 93,711-791)。
圖9展示在未經免疫接種之對照以及接受無轉殖基因之腺病毒載體之動物中觀測到肺中及鼻中之高RSV病毒效價，分別為5.3 +/- 0.13 log10 pfu/g及5.4 +/- 0.35 log10 pfu。相比之下，在接受使用Ad26.RSV.F及/或Ad35.RSV.F載體之初打-加打免疫接種之動物的肺及鼻組織中不可偵測到攻擊病毒，與劑量或方案無關。
此等資料清楚地證實基於Ad35之載體與基於Ad26之載體在棉鼠模型中均產生抗RSV攻擊複製之完全保護。此種情況令人驚訝，因為已知編碼RSV F之基於Ad5之腺病毒載體在肌肉內投與後在動物模型中不能誘導完全保護。
在實驗過程中，在免疫接種之前(第0天)、在加打免疫接種之前(第28天)、在攻擊當天(第49天)及在處死當天(第54天)獲取血液樣品。如Prince(Prince等人1978,Am J Pathology 93,711-791)所述，在 基於空斑分析之病毒中和分析(VNA)中針對全身性RSV特異性中和抗體之誘導來測試血清。中和效價表示為與僅病毒對照孔相比使得空斑減少50%(IC50)之血清稀釋度(log2)。
圖10展示對照動物在第28天及第49天不具有病毒中和抗體，而在動物使用Ad26.RSV.F或Ad35.RSV.F載體初打後誘導高VNA效價。在加打免疫接種後觀測到VNA效價適度增加。初次感染RSV A2病毒產生相當適度的VNA效價，其隨著時間推移而逐漸增加。
為評估在使用RSV A2攻擊後Ad26.RSV.F或Ad35.RSV.F疫苗是否可能使疾病惡化，在感染後5天進行肺之組織病理學分析。收集肺，用福馬林灌注，切片且用蘇木精(hematoxylin)及伊紅(eosin)染色以供組織學檢查。根據Prince(Prince等人Lab Invest 1999,79：1385-1392)所公佈之準則，以盲法進行組織病理學評分，且對以下參數進行評分：細支氣管周炎、血管周炎、間質性肺炎及肺泡炎。圖11展示此實驗之肺病理學評分。在RSV攻擊後，經FI-RSV免疫接種之動物與基於先前公開之研究所預期之虛擬免疫接種之受攻擊動物相比顯示關於所檢查之所有組織病理學參數的組織病理學評分提高(Prince等人Lab Invest 1999,79：1385-1392)。經Ad26.RSV.F及Ad35.RSV.F免疫接種之動物與經rAd-e免疫或虛擬免疫接種之動物相比組織病理學得分類似，但經rAd-RSV.F免疫接種之動物的血管周炎似乎略輕。因此，與FI-RSV疫苗不同，Ad26.RSV.F及Ad35.RSV.F疫苗不會導致增強疾病。
所有接種疫苗策略產生抗RSV攻擊複製之完全保護，誘導強病毒中和抗體，且未觀測到增強病變。
實例5. 使用不同投藥途徑在單次免疫接種後rAd載體之保護功效
此研究用以查明投藥途徑對於由編碼RSV.F之Ad26或Ad35載體誘導之保護功效的影響。疫苗經肌肉內或經鼻內投與。
在第0天已接受1×109或1×1010個病毒粒子(vp)之帶有轉殖基因RSV F之Ad26或Ad35(Ad26.RSV.F或Ad35.RSV.F)或無轉殖基因之Ad26或Ad35(Ad26-e或Ad35-e)的棉鼠在第49天經105 RSV pfu攻擊且在第54天處死。
圖12展示測定肺攻擊病毒及鼻攻擊病毒之實驗結果。在未經免疫接種或經無轉殖基因之腺病毒載體免疫接種之大鼠的肺及鼻中偵測到高RSV病毒效價，分別為4.9 +/- 0.22 log10 pfu/g及5.4 +/- 0.16 log10 pfu。相比之下，接受Ad35-RSV.F或Ad26-RSV.F之動物的肺及鼻中不存在攻擊病毒的複製，與投藥途徑及劑量無關。
此等資料令人驚訝地證實編碼RSV F蛋白質之基於Ad26及基於Ad35之載體各自在棉鼠攻擊實驗中提供完全保護，與載體之投藥途徑無關。此種情況出乎意料，因為所公開之基於腺病毒之RSV疫苗(其基於其他血清型)中無一者已證實在肌肉內接種疫苗後具有完全保護。
在實驗期間，在免疫接種之前(第0天)、免疫接種後4週(第28天)及攻擊當天(第49天)獲取血液樣品。在中和測試中針對RSV特異性抗體之誘導來測試血清(圖13)。在免疫接種之前，在任何棉鼠中均未偵測到病毒中和抗體。所有腺病毒載體免疫接種策略與投藥途徑無關，明顯誘導高VNA效價，其隨著時間推移而保持穩定。此等資料令人驚訝地證實編碼RSV F蛋白質之基於Ad26及基於Ad35之載體各自在棉鼠免疫接種實驗中提供病毒中和抗體之高效價，與載體之投藥途徑無關。
為評估在經RSV A2攻擊後Ad26.RSV.F或Ad35.RSV.F疫苗之單次免疫接種是否可能導致疫苗增強疾病，在感染後5天進行肺之組織病理學分析(圖14)。與經rAd-e免疫接種或虛擬免疫接種之動物相比，使用rAd26.RSV.F或rAd35.RSV.F之單次免疫接種在經rAd26.RSV.F或 rAd35.RSV.F免疫接種之動物中產生類似的免疫病理學評分，如上述初打-加打免疫接種實驗中所觀測。顯然，未觀測到疾病惡化，與使用FI-RSV初打之動物形成對比。經rAd載體免疫接種之動物的組織病理學評分與虛擬感染之動物相當。
總之，所有單次劑量接種疫苗策略均產生抗RSV攻擊複製之完全保護，誘導強病毒中和抗體，且不展示增強病變。
實例6. 具有變體(諸如RSV F之片段)或具有替代性啟動子之載體顯示類似免疫原性
已使用表現野生型RSV F之載體進行上述實例。已在rAd35中構築F之其他截短或修飾形式，從而提供腺病毒載體中RSV F片段之實施例。F之此等截短或修飾形式包括缺少細胞質域及跨膜區(亦即僅保留胞外域片段)之RSV-F截短形式，及細胞質域及跨膜區截短且胞外域中具有另一內部缺失且添加三聚化域之RSV-F片段形式。此等載體與具有全長F蛋白質之rAd35.RSV.F相比未改良反應。
另外，已構築具有驅使野生型RSV F表現之不同替代性啟動子的其他rAd35載體。
已在小鼠模型中比較RSV.F之修飾形式及啟動子變體之免疫原性且與表現野生型F之Ad35.RSV.F相比。具有此等F變體或啟動子變體之所有Ad35載體均顯示與Ad35.RSV.F相同數量級之反應。
實例7. 在棉鼠模型中在重組腺病毒載體活體內免疫接種後抗RSV感染之短期保護
此實驗確定在棉鼠模型中由表現RSV-F蛋白質之腺病毒載體迅速發起保護之潛力。為此目的，在第0天或第21天，藉由單次肌肉內注射107、108或109個病毒粒子(vp)之帶有全長RSV F(A2)基因之腺病毒載體(Ad26.RSV.F)或無轉殖基因之腺病毒載體(Ad26e)對棉鼠免疫接種。經RSV A2(104個空斑形成單位(pfu))鼻內感染之動物用作抗攻擊 複製之保護的陽性對照，眾所周知的是，經RSV病毒初次感染防止二次攻擊複製(Prince.Lab Invest 1999,79：1385-1392)。在免疫接種後七週(第49天)或四週，使用1×105 pfu之空斑純化RSV A2經鼻內攻擊棉鼠。在感染後5天(RSV攻擊病毒達成峰值效價之時間點)處死棉鼠(Prince.Lab Invest 1999,79：1385-1392)，且藉由病毒空斑滴定來測定肺RSV效價及鼻RSV效價(Prince等人1978,Am J Pathology 93,711-791)。圖16A及圖16B展示在接受無轉殖基因之腺病毒載體之動物中觀測到肺中及鼻中之高RSV病毒效價，分別為4.8 +/- 0.11 log10 pfu/g及5.1 +/- 0.32 log10 pfu/g。相比之下，接受Ad26.RSV.F載體免疫接種之動物的肺及鼻組織中不可偵測到攻擊病毒，與免疫接種與攻擊之間的時間無關。此實驗清楚指示表現RSV-F之Ad26迅速發起抗攻擊病毒複製之保護。第0天、第28天及攻擊當天(第49天)，自經免疫接種之棉鼠獲取血液樣品。在中和測試中針對RSV特異性抗體之誘導來測試血清(圖17)。使用腺病毒載體免疫接種誘導劑量依賴性VNA效價。圖18展示對照動物在第28天及第49天不具有病毒中和抗體，但在使用107至109vp Ad26.RSV.F免疫接種後28天或49天在動物中誘導高VNA效價。初次感染RSV A2病毒產生相當適度的VNA效價，其隨著時間推移而逐漸增加。此實驗清楚指示表現RSV-F之Ad26迅速發起抗攻擊病毒複製之保護。
實例8. 在棉鼠模型中在重組腺病毒載體活體內免疫接種後抗RSV亞群A及亞群B感染之保護
RSV病毒株可分成兩個亞群：亞群A及亞群B。此亞型分類係基於高變G醣蛋白抗原性之差異。F蛋白質之序列高度保守，但亦可歸入上述亞群A及亞群B中。實例3描述經Ad-RSV.F載體免疫接種之小鼠的血清亦能夠活體外交叉中和B1病毒株。圖19清楚展示源於經Ad26.RSV-FA2免疫接種之棉鼠的棉鼠血清在免疫接種後第49天展示抗 RSV-A Long(亞群A)及Bwash(亞群B，ATCC編號1540)之高VNA效價。接著，使用在106至108vp範圍內之低腺病毒載體劑量在棉鼠中測定抗亞群A或B攻擊之活體內保護。為此目的，將棉鼠分配於實驗組中，每組8隻棉鼠。第0天，藉由肌肉內注射106、107或108個病毒粒子(vp)之帶有全長RSV F(A2)基因之腺病毒載體(Ad26.RSV.F)或無轉殖基因之腺病毒載體(Ad26e)對動物免疫接種。第49天，使用105 pfu RSV-A2(RSV-A病毒株)或RSV-B 15/97(RSV-B病毒株)鼻內攻擊動物。圖20展示在接受無轉殖基因之腺病毒載體之動物中觀測到肺中及鼻中之高RSV病毒效價。相比之下，在接受Ad26.RSV.F免疫接種之動物的肺及鼻組織中不可偵測到攻擊病毒或偵測到有限攻擊病毒。當使用RSV-A2或RSV-B 15/97攻擊時，對於保護僅觀測到較小差異。Ad26.RSV.FA2當使用108及107vp劑量時展示抗肺攻擊複製之完全保護，且在106vp Ad26.RSV.FA2時展示格外有限的失效(breakthrough)。關於抗鼻攻擊病毒複製之保護可見類似趨勢，不過所有動物在106及107vp Ad26.RSV.FA2時觀測到部分失效，但低於對照組(圖21)。在實驗期間，在攻擊當天(第49天)獲取血液樣品。在中和測試中針對RSV特異性抗體之誘導來測試血清(圖22)。此實例證實106至108vp Ad26.RSV之低劑量腺病毒載體顯示抗RSV A2之VNA效價的劑量反應。在免疫接種之前，在任何棉鼠中均未偵測到病毒中和抗體。
Ad26.RSV.F被證實比Ad35.RSV.F略佳，因為後者在108vp劑量下在鼻攻擊實驗中顯示一些失效。
實例9. 在棉鼠模型中在重組腺病毒載體活體內免疫接種後抗高攻擊劑量之RSV-A2之保護
此實例確定與1×105 pfu RSV-A2之標準劑量相比，抗5×105 pfu之高攻擊劑量之保護。該研究將棉鼠錄入實驗組中，每組8隻棉鼠。第0天，藉由單次肌肉內注射107或108個病毒粒子(vp)之帶有全長RSV F (A2)基因之腺病毒載體(Ad26.RSV.F)或無轉殖基因之腺病毒載體(Ad26e)對動物免疫接種。經RSV A2(104個空斑形成單位(pfu))鼻內感染之動物用作抗攻擊複製之保護的陽性對照。在感染後5天處死棉鼠，且藉由病毒空斑滴定來測定肺RSV效價及鼻RSV效價。圖23展示在接受無轉殖基因之腺病毒載體之動物中，較高攻擊劑量比標準攻擊劑量誘導較高肺病毒負荷。接受107或108vp Ad26.RSV.F載體免疫接種之動物在肺中受到抗較高及標準RSV攻擊效價之完全保護。圖24展示接受108vp Ad26.RSV.F載體免疫接種之動物在鼻中受到抗較高及標準RSV攻擊效價之完全保護，而接受107vp Ad26.RSV.F載體免疫接種之動物受到抗較高及標準RSV攻擊效價之部分保護。
實例10. 在棉鼠模型中在重組腺病毒載體活體內免疫接種後抗RSV-A2及RSV-B15/97之長期保護
此實例確定在棉鼠模型中在重組腺病毒載體活體內免疫接種後抗RSV-A2及RSV-B15/97之保護的持久性。該研究將棉鼠錄入實驗組中，每組6隻棉鼠。藉由肌肉內注射108個病毒粒子(vp)或1010vp之帶有全長RSV F(A2)基因之腺病毒載體(Ad26.RSV.F)或無轉殖基因之腺病毒載體(Ad26e或Ad35e)對動物免疫接種。動物在28天後加打相同vp劑量之相同載體(Ad26.RSV.F)(同源初打-加打)或Ad35.RSV.F腺病毒(異源初打-加打)；除僅施用1次劑量(1010)之外，據此使用Ad-e載體對對照組免疫接種。一些組未接受加打免疫接種。對照組由6隻動物組成。經RSV A2及B15/97(104個空斑形成單位(pfu))鼻內感染之動物用作抗攻擊複製之保護的陽性對照。在第一次免疫接種後210天進行攻擊。
圖25展示在接受無轉殖基因之腺病毒載體之動物中觀測到肺中及鼻中之高RSV病毒效價。相比之下，在接受Ad26.RSV.F及/或Ad35.RSV.F免疫接種之動物的肺組織中不可偵測到攻擊病毒。在接受 Ad26.RSV.F及/或Ad35.RSV.F免疫接種之動物的鼻組織中不可偵測到RSV-A2攻擊病毒。使用RSV-B15/97攻擊在接受Ad26.RSV.F及/或Ad35.RSV.F免疫接種之動物(接受Ad26.RSV.F初打，繼而加打1010vp Ad35.RSV.F之動物除外)的鼻組織中誘導有限病毒複製。圖26展示在免疫接種後140天之病毒中和抗體效價。僅初打108及1010vp劑量之腺病毒載體或使用108及1010vp劑量進行初打-加打免疫接種顯示在免疫接種後VNA效價之劑量反應可持續至少4.5個月。此外，所觀測之效價高於藉由初次鼻內免疫接種產生之中和效價。觀測到Ad26.RSV.F或Ad35.RSV.F對於VNA效價之明顯加強作用。
總之，此實例在使用單次劑量或兩次劑量之Ad26.RSV.F或Ad35.RSV.F免疫接種後展示持久VNA效價，且肺及鼻中抗同源病毒攻擊之長期完全保護與肺中抗異源病毒攻擊之長期完全保護及鼻中抗異源病毒攻擊之部分保護組合。
實例11. 在棉鼠模型中在重組腺病毒載體活體內免疫接種後不序在疫苗增強免疫病變
為評估在使用RSV A2攻擊後Ad26.RSV.F疫苗是否可能使疾病惡化，在感染後2天及6天進行肺之組織病理學分析。在攻擊後兩天，即刻反應(包括肺部嗜中性白血球浸潤)達到峰值，而諸如淋巴細胞浸潤之亞急性變化在感染後第6天達到峰值(Prince等人，J Virol,1986,57：721-728)。該研究將棉鼠錄入實驗組中，每組12隻棉鼠。藉由肌肉內注射108個病毒粒子(vp)或1010vp之帶有全長RSV F(A2)基因之腺病毒載體(Ad26.RSV.F)或無轉殖基因之腺病毒載體(Ad26e)對動物免疫接種。動物在28天後加打相同vp劑量之相同載體(Ad26.RSV.F)(同源初打-加打)；除僅施用1次劑量(1010)之外，據此使用Ad-e載體對對照組免疫接種。對照組由12隻動物組成。經RSV A2(104個空斑形成單位(pfu))鼻內感染之動物用作抗攻擊複製之保護的陽性對照。經FI- RSV免疫接種之動物用作增強疾病之對照。收集肺，用福馬林灌注，切片且用蘇木精及伊紅染色以供組織學檢查。根據Prince(Prince等人Lab Invest 1999,79：1385-1392)所公佈之準則，以盲法進行組織病理學評分，且對以下參數進行評分：細支氣管周炎、血管周炎、間質性肺炎及肺泡炎。此實驗第2天之肺病理學評分描繪於圖27中且第6天之肺病理學評分描繪於圖28中。在RSV攻擊後，經FI-RSV免疫接種之動物與基於先前公開之研究所預期之虛擬免疫接種及攻擊之動物相比顯示在第2天及第6天所檢查之所有組織病理學參數的組織病理學評分提高。第2天經Ad26.RSV.F載體免疫接種之所有組中之組織病理學得分與虛擬免疫接種之動物相當，且在攻擊後第6天得分始終低於虛擬免疫接種及攻擊(Ad26.e)之動物。因此，與FI-RSV疫苗不同，Ad26.RSV.F疫苗不會導致增強疾病。
實例12. 初打Ad26.RSV.F且加打重組F蛋白質在小鼠模型中產生向Th1偏斜之反應
在此實例中，查明在初打Ad26.RSV.F後之免疫反應是否可藉由加打輔助型重組RSV F蛋白質來增強。為此目的，將小鼠分配於實驗組中，每組7隻小鼠。第0天，藉由肌肉內注射1010個病毒粒子(vp)之帶有全長RSV F(A2)基因之腺病毒載體(Ad26.RSV.F)或PBS對動物免疫接種。第28天，動物肌肉內加打相同劑量之相同載體或輔助型RSV F蛋白質(全長；融合後構形：post-F)(以2種劑量：5μg及0.5μg)。圖29清楚展示源於經Ad26.RSV-FA2免疫接種且加打輔助型RSV F之小鼠的血清在免疫接種後12週展示抗RSV-A Long(亞群A)之高VNA效價。圖30展示經Ad26.RSV-FA2免疫接種且加打輔助型RSV F蛋白質之小鼠的血清中之IgG2a/IgG1比率。高比率指示Th1平衡之反應，而低比率指示向Th2偏斜之反應。顯然，經Ad26.RSV.F免疫接種且加打Ad26.RSV.F或RSV F蛋白質之動物產生高IgG2a/IgG1比率，而經FI- RSV或RSV F蛋白質免疫接種之對照小鼠(無腺病毒載體之情形)誘導低比率。由於RSV疫苗強烈需要向Th1偏斜之反應以避免在攻擊後增強疾病及誘導強T細胞記憶，故當施用Ad26.RSV.F初打時，可將蛋白質免疫接種之Th2偏斜反應向Th1反應引導。圖31展示源於經Ad26.RSV-FA2免疫接種且加打輔助型RSV F蛋白質之小鼠的脾臟中之細胞反應。可清楚觀測到加打輔助型RSV F蛋白質亦將大大增強細胞反應。
<110> 荷蘭商庫賽爾荷蘭公司 卡塔利納 勒多賽維 彌拉 維喬爵摩喬 傑洛 庫斯特 約特 費林嘉
<120> 抗RSV疫苗
<130> 0200 EP P00 PRI
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 574
<212> PRT
<213> 呼吸道融合性病毒
<220>
<221> RSV F protein(A2 strain)
<222> (1)..(574)
<400> 1
<210> 2
<211> 1722
<212> DNA
<213> 呼吸道融合性病毒
<220>
<221> codon optimized sequence encoding RSV F protein(A2 strain)
<222> (1)..(1722)
<400> 2

Claims (16)

  1. 一種抗呼吸道融合性病毒(RSV)疫苗，其包含血清型26重組人類腺病毒，該重組人類腺病毒包含編碼RSV F蛋白質或其片段之核酸。
  2. 如請求項1之疫苗，其中該重組腺病毒包含編碼RSV F蛋白質之核酸，該RSV F蛋白質包含SEQ ID NO：1之胺基酸序列。
  3. 如前述請求項中任一項之疫苗，其中該編碼RSV F蛋白質之核酸係針對在人類細胞中之表現進行密碼子最佳化。
  4. 如前述請求項中任一項之疫苗，其中該編碼RSV F蛋白質之核酸包含SEQ ID NO：2之核酸序列。
  5. 如前述請求項中任一項之疫苗，其中該重組人類腺病毒之腺病毒基因組的E1區中具有缺失、E3區中具有缺失或E1區與E3區中均具有缺失。
  6. 如前述請求項中任一項之疫苗，其中該重組腺病毒之基因組在5'末端包含序列CTATCTAT。
  7. 一種對個體接種抗RSV疫苗之方法，該方法包含向該個體投與如前述請求項中任一項之疫苗。
  8. 如請求項7之方法，其中該疫苗係經肌肉內投與。
  9. 如請求項7或8之方法，其中如請求項1至6中任一項之疫苗係投與該個體一次以上。
  10. 如請求項7至9中任一項之方法，其另外包含向該個體投與包含血清型35重組人類腺病毒之疫苗，該重組人類腺病毒包含編碼RSV F蛋白質或其片段之核酸。
  11. 如請求項7或8之方法，其係由向該個體單次投與該疫苗組成。
  12. 如請求項7至11中任一項之方法，其另外包含向該個體投與RSV F蛋白質。
  13. 一種減少個體之RSV感染及/或複製之方法，其包含藉由肌肉內注射向該個體投與包含血清型26重組人類腺病毒之組合物，該重組人類腺病毒包含編碼RSV F蛋白質或其片段之核酸。
  14. 一種經分離之宿主細胞，其包含血清型26重組人類腺病毒，該重組人類腺病毒包含編碼RSV F蛋白質或其片段之核酸。
  15. 一種製造抗呼吸道融合性病毒(RSV)疫苗之方法，其包含提供包含編碼RSV F蛋白質或其片段之核酸的血清型26重組人類腺病毒，使該重組腺病毒在宿主細胞培養物中增殖，分離並純化該重組腺病毒，及將該重組腺病毒調配於醫藥學上可接受之組合物中。
  16. 一種經分離之重組核酸，其形成血清型26重組人類腺病毒之基因組，該重組人類腺病毒包含編碼RSV F蛋白質或其片段之核酸。
TW102110400A 2012-03-22 2013-03-22 抗ｒｓｖ疫苗 TWI640534B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
??12160682.6 2012-03-22
EP12160682 2012-03-22

Publications (2)

Publication Number Publication Date
TW201343669A true TW201343669A (zh) 2013-11-01
TWI640534B TWI640534B (zh) 2018-11-11

Family

ID=49221877

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW102110399A TWI624545B (zh) 2012-03-22 2013-03-22 抗ｒｓｖ疫苗
TW102110400A TWI640534B (zh) 2012-03-22 2013-03-22 抗ｒｓｖ疫苗

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
TW102110399A TWI624545B (zh) 2012-03-22 2013-03-22 抗ｒｓｖ疫苗

Country Status (15)

Country Link
EP (2) EP2827894B1 (zh)
JP (2) JP5805908B2 (zh)
KR (2) KR102023791B1 (zh)
CN (2) CN104334188B (zh)
AP (2) AP2014007994A0 (zh)
AR (2) AR090469A1 (zh)
AU (2) AU2013237429B2 (zh)
BR (1) BR112014023196B1 (zh)
CA (2) CA2867955C (zh)
EA (2) EA026620B1 (zh)
MY (2) MY169331A (zh)
NZ (2) NZ630753A (zh)
SG (2) SG11201405804YA (zh)
TW (2) TWI624545B (zh)
WO (2) WO2013139911A1 (zh)

Families Citing this family (34)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
HRP20211756T1 (hr) 2012-07-05 2022-02-18 Glaxosmithkline Biologicals Sa Novi senzibilizacijsko-pojačivački režimi koji uključuju imunogene polipeptide koje kodiraju polinukleotidi
EP2983708A4 (en) * 2013-04-08 2016-10-05 Medimmune Llc VACCINE COMPOSITION AND METHOD OF USE
AU2014259474B2 (en) 2013-04-25 2018-09-13 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized soluble prefusion RSV F polypeptides
MY171210A (en) 2013-06-17 2019-10-02 Janssen Vaccines & Prevention Bv Stabilized soluble pre-fusion rsv f polypeptides
US11571472B2 (en) 2014-06-13 2023-02-07 Glaxosmithkline Biologicals Sa Immunogenic combinations
US10100372B2 (en) 2014-06-18 2018-10-16 Georgia State University Research Foundation, Inc. Recombinant RSV reporter virus
WO2016144675A1 (en) * 2015-03-06 2016-09-15 Medimmune, Llc Vaccine dose and use thereof
EP3283634B1 (en) 2015-04-14 2019-05-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Recombinant adenovirus expressing two transgenes with a bidirectional promoter
CN108025058B (zh) 2015-06-12 2022-12-16 葛兰素史密丝克莱恩生物有限公司 腺病毒多核苷酸和多肽
CN107847581B (zh) 2015-07-07 2022-03-22 扬森疫苗与预防公司 稳定化的可溶性融合前rsv f多肽
WO2017005844A1 (en) 2015-07-07 2017-01-12 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Vaccine against rsv
KR102136678B1 (ko) 2015-12-23 2020-07-22 화이자 인코포레이티드 Rsv f 단백질 돌연변이체
IL262108B2 (en) 2016-04-05 2023-04-01 Janssen Vaccines Prevention B V Soluble pre-fusion rsv f proteins are stabilized
WO2017174564A1 (en) * 2016-04-05 2017-10-12 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Vaccine against rsv
KR102573534B1 (ko) 2016-05-12 2023-08-31 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. 강력하고 균형 잡힌 양방향성 프로모터
WO2017207480A1 (en) 2016-05-30 2017-12-07 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Stabilized pre-fusion rsv f proteins
US11001858B2 (en) 2016-06-20 2021-05-11 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Potent and balanced bidirectional promoter
WO2018146205A1 (en) 2017-02-09 2018-08-16 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Potent and short promoter for expression of heterologous genes
JP2020519663A (ja) * 2017-05-17 2020-07-02 ヤンセン ファッシンズ アンド プリベンション ベーフェーＪａｎｓｓｅｎ Ｖａｃｃｉｎｅｓ ＆ Ｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎ Ｂ．Ｖ． Ｒｓｖ感染に対する防御免疫を誘導するための方法及び組成物
WO2018210871A1 (en) * 2017-05-17 2018-11-22 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Methods and compositions for inducing protective immunity against rsv infection
MX2020002876A (es) * 2017-09-15 2020-07-22 Janssen Vaccines & Prevention Bv Metodo para la induccion segura de inmunidad contra el vsr.
KR20220008875A (ko) * 2019-05-15 2022-01-21 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. 계절성 인플루엔자 백신과 아데노바이러스 기반 호흡기 세포융합 바이러스 백신의 공동투여
EA202193119A1 (ru) * 2019-05-15 2022-02-18 Янссен Вэксинс Энд Превеншн Б.В. Профилактическое лечение инфекции, вызванной респираторно-синцитиальным вирусом, вакциной на основе аденовируса
US20210353744A1 (en) 2020-05-12 2021-11-18 Janssen Vaccines Prevention B.V. Administration of homologous adenoviral vectors
JP7360544B2 (ja) * 2020-08-22 2023-10-12 フェデラル ステート バジェタリー インスティテューション“ナショナル リサーチ センター フォー エピデミオロジー アンド マイクロバイオロジー ネームド アフター ザ オナラリー アカデミシャン エヌ．エフ．ガマレヤ”オブ ザ ミニストリー オブ ヘルス オブ ザ ロシアン フェデレーション Ｓａｒｓ－ｃｏｖ－２に対する特異的免疫を誘導するための医薬品
MX2022002609A (es) * 2020-08-22 2022-06-08 Federal State Budgetary Institution National Res Centre For Epidemiology And Microbiology Named Afte Vector de expresion para el desarrollo de un agente inmunobiologico para inducir inmunidad especifica contra el virus de sindrome respiratorio agudo grave sars-cov-2 (variantes).
RU2731342C9 (ru) * 2020-08-22 2021-10-05 федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации Фармацевтическое средство и способ его использования для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 (варианты)
RU2731356C9 (ru) * 2020-08-22 2021-10-05 федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации Экспрессионный вектор для создания иммунобиологического средства для индукции специфического иммунитета против вируса тяжелого острого респираторного синдрома SARS-CoV-2 (варианты)
CN112220921B (zh) * 2020-08-25 2022-08-16 北京交通大学 一种针对呼吸道合胞病毒感染的组合疫苗
CN112226444B (zh) * 2020-08-25 2022-11-04 北京交通大学 呼吸道合胞病毒全长融合前融合糖蛋白核苷酸序列、重组腺病毒载体及其应用产品
WO2022215436A1 (ja) * 2021-04-05 2022-10-13 株式会社クボタ 管理機制御システム
WO2023217189A2 (zh) * 2022-05-10 2023-11-16 康希诺生物股份公司 一种呼吸道合胞病毒腺病毒载体疫苗及其制备方法和应用
CN116003536A (zh) * 2022-09-23 2023-04-25 暨南大学 呼吸道合胞病毒融合前f蛋白突变体及其应用
CN117986382A (zh) * 2022-11-04 2024-05-07 北京康乐卫士生物技术股份有限公司 针对rsv的重组亚单位疫苗及其应用

Family Cites Families (62)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3584341D1 (de) 1984-08-24 1991-11-14 Upjohn Co Rekombinante dna-verbindungen und expression von polypeptiden wie tpa.
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
US5057540A (en) 1987-05-29 1991-10-15 Cambridge Biotech Corporation Saponin adjuvant
NZ230747A (en) 1988-09-30 1992-05-26 Bror Morein Immunomodulating matrix comprising a complex of at least one lipid and at least one saponin; certain glycosylated triterpenoid saponins derived from quillaja saponaria molina
JPH0832638B2 (ja) 1989-05-25 1996-03-29 カイロン コーポレイション サブミクロン油滴乳剤を含んで成るアジュバント製剤
FR2705686B1 (fr) 1993-05-28 1995-08-18 Transgene Sa Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes.
EP0784690B1 (en) 1994-06-10 2006-08-16 Genvec, Inc. Complementary adenoviral vector systems and cell lines
US5851806A (en) 1994-06-10 1998-12-22 Genvec, Inc. Complementary adenoviral systems and cell lines
US5559099A (en) 1994-09-08 1996-09-24 Genvec, Inc. Penton base protein and methods of using same
US5965541A (en) 1995-11-28 1999-10-12 Genvec, Inc. Vectors and methods for gene transfer to cells
US5846782A (en) 1995-11-28 1998-12-08 Genvec, Inc. Targeting adenovirus with use of constrained peptide motifs
US5786464C1 (en) 1994-09-19 2012-04-24 Gen Hospital Corp Overexpression of mammalian and viral proteins
AUPM873294A0 (en) 1994-10-12 1994-11-03 Csl Limited Saponin preparations and use thereof in iscoms
US5837520A (en) 1995-03-07 1998-11-17 Canji, Inc. Method of purification of viral vectors
DE69633565T3 (de) 1995-06-15 2013-01-17 Crucell Holland B.V. Verpackungssysteme für humane, menschliche adenoviren, zur verwendung in die gentherapie
US5837511A (en) 1995-10-02 1998-11-17 Cornell Research Foundation, Inc. Non-group C adenoviral vectors
CA2177085C (en) 1996-04-26 2007-08-14 National Research Council Of Canada Adenovirus e1-complementing cell lines
US6485958B2 (en) 1996-07-01 2002-11-26 Gencell Sa Method for producing recombinant adenovirus
FR2751343B1 (fr) 1996-07-16 1998-12-18 Transgene Sa Procede de conservation de virus recombinants infectieux, suspension aqueuse virale et utilisation comme medicament
ATE348155T1 (de) 1996-11-20 2007-01-15 Introgen Therapeutics Inc Ein verbessertes verfahren zur produktion und reinigung von adenoviralen vektoren
US7732129B1 (en) 1998-12-01 2010-06-08 Crucell Holland B.V. Method for the production and purification of adenoviral vectors
US6261823B1 (en) 1996-12-13 2001-07-17 Schering Corporation Methods for purifying viruses
WO1998039411A1 (en) 1997-03-04 1998-09-11 Baxter International Inc. Adenovirus e1-complementing cell lines
US6020191A (en) 1997-04-14 2000-02-01 Genzyme Corporation Adenoviral vectors capable of facilitating increased persistence of transgene expression
US6210683B1 (en) 1997-09-05 2001-04-03 Merck & Co., Inc. Stabilizers containing recombinant human serum albumin for live virus vaccines
ID28298A (id) 1998-02-17 2001-05-10 Schering Corp Komposisi yang mengandung virus dan metode untuk memekatkan preparat-preparat virus
US5981225A (en) 1998-04-16 1999-11-09 Baylor College Of Medicine Gene transfer vector, recombinant adenovirus particles containing the same, method for producing the same and method of use of the same
US6113913A (en) 1998-06-26 2000-09-05 Genvec, Inc. Recombinant adenovirus
ATE421337T1 (de) 1998-11-16 2009-02-15 Introgen Therapeutics Inc Adenovirus-formulierungen zur gentherapie
US6225289B1 (en) 1998-12-10 2001-05-01 Genvec, Inc. Methods and compositions for preserving adenoviral vectors
KR100741247B1 (ko) 1999-05-17 2007-07-19 크루셀 홀란드 비.브이. 아데노바이러스 타입 35의 적어도 하나의 구성성분을포함하는 아데노바이러스 유래 유전자 전달체
US6492169B1 (en) 1999-05-18 2002-12-10 Crucell Holland, B.V. Complementing cell lines
US6913922B1 (en) 1999-05-18 2005-07-05 Crucell Holland B.V. Serotype of adenovirus and uses thereof
DE19955558C2 (de) 1999-11-18 2003-03-20 Stefan Kochanek Permanente Amniozyten-Zelllinie, ihre Herstellung und Verwendung zur Herstellung von Gentransfervektoren
CA2399321C (en) 2000-03-07 2013-04-30 Robert K. Evans Adenovirus formulations
CA2469491A1 (en) 2001-12-12 2003-06-19 Kerrie Setiawan Composition for viral preservation
CN1617745A (zh) 2002-01-18 2005-05-18 舍林股份公司 稳定的腺病毒配方
US20030180936A1 (en) 2002-03-15 2003-09-25 Memarzadeh Bahram Eric Method for the purification, production and formulation of oncolytic adenoviruses
JP4495588B2 (ja) 2002-04-25 2010-07-07 クルセル ホランド ベー ヴェー 安定なアデノウイルスベクターおよびその増殖方法
SI1497438T1 (sl) 2002-04-25 2010-03-31 Crucell Holland Bv Sredstva in postopki za pripravo adenovirusnih vektorjev
DE60313451T2 (de) 2002-05-14 2008-01-03 Merck & Co., Inc. Verfahren zur reinigung von adenovirus
SE0202110D0 (sv) 2002-07-05 2002-07-05 Isconova Ab Iscom preparation and use thereof
WO2004020971A2 (en) 2002-08-28 2004-03-11 Introgen Therapeutics Inc. Chromatographic methods for adenovirus purification
SE0301998D0 (sv) 2003-07-07 2003-07-07 Isconova Ab Quil A fraction with low toxicity and use thereof
WO2005033320A1 (en) * 2003-10-02 2005-04-14 Crucell Holland B.V. Packaging cells for recombinant adenovirus
JP2007522814A (ja) 2004-02-23 2007-08-16 クルセル ホランド ベー ヴェー ウイルスの精製方法
JP4787936B2 (ja) * 2004-05-26 2011-10-05 サイオクサス セラピューティクス リミティド 癌処理への使用のためのキメラアデノウィルス
JP4843613B2 (ja) * 2004-10-13 2011-12-21 クルセル ホランド ベー ヴェー 改良されたアデノウイルスベクターおよびその使用方法
EP1851343A2 (en) * 2005-02-11 2007-11-07 Merck and Co., Inc. Adenovirus serotype 26 vectors, nucleic acid and viruses produced thereby
AU2006233800B2 (en) 2005-04-11 2011-07-07 Crucell Holland B.V. Virus purification using ultrafiltration
WO2007104792A2 (en) * 2006-03-16 2007-09-20 Crucell Holland B.V. Recombinant adenoviruses based on serotype 26 and 48, and use thereof
WO2007110409A1 (en) 2006-03-27 2007-10-04 Crucell Holland B.V. Compositions comprising a recombinant adenovirus and an adjuvant
DE102006060799A1 (de) 2006-12-21 2008-06-26 RUHR-UNIVERSITäT BOCHUM RSV F-Protein und seine Verwendung
CN101012463A (zh) * 2007-01-19 2007-08-08 安徽医科大学 HDAd/F载体及制备方法和用途
WO2009117134A2 (en) 2008-03-21 2009-09-24 National Institutes Of Health Aerosolized genetic vaccines and methods of use
US10041049B2 (en) 2008-11-03 2018-08-07 Janssen Vaccines & Prevention B.V. Method for the production of adenoviral vectors
US9095546B2 (en) 2009-07-20 2015-08-04 National Health Research Institutes Human respiratory syncytial virus (RSV) vaccine
AU2010305765B2 (en) 2009-10-15 2015-07-02 Crucell Holland B.V. Method for the purification of adenovirus particles
KR101805938B1 (ko) 2009-10-15 2018-01-10 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. 고밀도 세포 배양액에서 아데노바이러스의 정제 방법
US8920812B2 (en) * 2009-11-03 2014-12-30 Takeda Vaccines, Inc. Chimeric RSV-F polypeptide and lentivirus or alpha-retrovirus Gag-based VLPS
KR101820980B1 (ko) 2010-02-15 2018-01-22 얀센 백신스 앤드 프리벤션 비.브이. Ａｄ 26 아데노바이러스 벡터를 제조하는 방법
WO2012021730A2 (en) 2010-08-11 2012-02-16 Genvec, Inc. Respiratory syncytial virus (rsv) vaccine

Also Published As

Publication number Publication date
AU2013237424B2 (en) 2017-07-06
WO2013139916A1 (en) 2013-09-26
CN104334188B (zh) 2016-08-24
AR090469A1 (es) 2014-11-12
JP2015519295A (ja) 2015-07-09
BR112014023196B1 (pt) 2021-09-08
TW201341531A (zh) 2013-10-16
NZ630649A (en) 2016-12-23
KR102023791B1 (ko) 2019-09-23
CA2867950A1 (en) 2013-09-26
KR20140138765A (ko) 2014-12-04
EA026504B1 (ru) 2017-04-28
EP2827894B1 (en) 2017-05-17
SG11201405804YA (en) 2014-10-30
EP2827894A1 (en) 2015-01-28
CN104334188A (zh) 2015-02-04
MY169352A (en) 2019-03-25
WO2013139911A1 (en) 2013-09-26
AU2013237429A1 (en) 2014-10-09
AR090470A1 (es) 2014-11-12
AP2014007994A0 (en) 2014-10-31
JP2015512380A (ja) 2015-04-27
NZ630753A (en) 2016-12-23
EA026620B1 (ru) 2017-04-28
SG11201405803PA (en) 2014-11-27
AP2014007993A0 (en) 2014-10-31
EP2827895A1 (en) 2015-01-28
AU2013237429B2 (en) 2015-07-23
AU2013237424A1 (en) 2014-10-16
KR102050616B1 (ko) 2019-12-03
CA2867950C (en) 2023-02-21
EA201491754A1 (ru) 2014-12-30
TWI624545B (zh) 2018-05-21
JP5845376B2 (ja) 2016-01-20
EP2827895B1 (en) 2017-08-09
KR20140138769A (ko) 2014-12-04
CN105431169A (zh) 2016-03-23
CA2867955A1 (en) 2013-09-26
CA2867955C (en) 2023-02-07
MY169331A (en) 2019-03-21
TWI640534B (zh) 2018-11-11
JP5805908B2 (ja) 2015-11-10
CN105431169B (zh) 2019-04-02
EA201491752A1 (ru) 2015-02-27
BR112014023196A2 (zh) 2017-06-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
TWI640534B (zh) 抗ｒｓｖ疫苗
US11801297B2 (en) Vaccine against RSV
US9125870B2 (en) Vaccine against RSV
PH12014502013B1 (en) Vaccine against rsv
OA17889A (en) Vaccine against RSV.
OA17940A (en) Vaccine against RSV
NZ785676A (en) Vaccine against rsv

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Annulment or lapse of patent due to non-payment of fees