BR112012032537B1 - métodos para diagnosticar se um indivíduo tem ou não câncer de pulmão de não pequenas células, ou para fornecer informações sobre câncer de pulmão de não pequenas células em um indivíduo - Google Patents

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Abstract

MÉTODO IN VITRO PARA DIAGNÓSTICAR QUE UM INDIVÍDUO TEM OU NÃO TEM CÂNCER DE PULMÃO E PARA FORNECER INFORMAÇÃO SOBRE CÂNCER DE PULMÃO EM UM INDIVÍDUO. O presente pedido de patente inclui os marcadores biológicos, métodos, aparelhos, reagentes, sistemas e conjuntos para a detecção e diagnóstico de câncer de pulmão. Em um aspecto, o pedido proporciona marcadores biológicos que podem ser utilizados isoladamente ou em várias combinações para diagnosticar o câncer de pulmão ou permitir o diagnóstico diferencial de nódulos pulmonares como benigno ou maligno. Em outro aspecto, são proporcionados métodos para diagnosticar câncer de pulmão de um indivíduo, em que os métodos de detecção incluem, em uma amostra biológica de um indivíduo, pelo menos, um valor de marcador biológico correspondente a pelo menos um marcador biológico selecionado a partir do grupo de marcadores biológicos fornecidos na Tabela 18, Tabela 20, ou Tabela 21, em que o indivíduo é classificado como tendo câncer de pulmão, ou a probabilidade de o indivíduo ter câncer de pul mão é determinado, com base no valor de, pelo menos, um marcador biológico.

Description

Pedidos Relacionados
[001] Este pedido reivindica o benefício do Pedido Provisório dos EUA N°.de Série 61/363, 122, arquivado em 09 de Julho de 2010 e do Pedido Provisório dos EUA N°. de Série 61/444, 947, arquivado em 21 de Fevereiro de 2011, cada um dos quais é entitulado "Lung Cancer Biomarkers and Uses Thereon". Para todos os fins, cada um destes pedidos é aqui incorporado por referência na sua totalidade.
Campo da Invenção
[002] O presente pedido refere-se genericamente à detecção de marcadores biológicos e ao diagnóstico de câncer em um indivíduo e, mais especificamente, a um ou mais marcadores biológicos, métodos, dispositivos, reagentes, sistemas e conjuntos para diagnosticar câncer, mais particularmente câncer de pulmão, em um indivíduo.
Antecedentes
[003] A descrição a seguir apresenta um resumo das informações relevantes para o presente pedido e não é uma admissão de que qualquer informação fornecida ou publicações aqui referenciadas sejam da técnica anterior ao presente pedido. O câncer de pulmão continua a ser a causa mais comum de mortalidade relacionada ao câncer. Isto é verdade tanto para homens quanto para mulheres. Em 2005, nos Estados Unidos o câncer de pulmão respondeu por mais mortes do que o câncer de mama, câncer de próstata e câncer de cólon combinados. Naquele ano, 107.416 homens e 89.271 mulheres foram diagnosticados com câncer de pulmão, e 90.139 homens e 69.078 mulheres morreram de câncer de pulmão. Entre os homens nos Estados Unidos, o câncer de pulmão é o segundo câncer mais comum entre homens brancos, negros, Asiáticos/das Ilhas do Pacífico, Indios Americanos/do Alaska, e hispânicos. Entre as mulheres nos Estados Unidos, o câncer de pulmão é o segundo câncer mais comum entre mulheres brancas, negras e Índias americanas/americanas nativas do Alasca e, o terceiro câncer mais comum entre mulheres Asiáticas/das Ilhas do Pacífico e hispânicas. Para aqueles que não param de fumar, a probabilidade de morte por câncer de pulmão é de 15% e se mantém acima de 5%, mesmo para aqueles que deixaram de fumar na idade de 50 - 59. O custo anual de saúde do câncer de pulmão nos EUA é de US $ 95 bilhões. Noventa e um por cento de câncer de pulmão causado pelo fumo é câncer de pulmão de células não-pequenas (NSCLC), o que representa aproximadamente 87% de todos os cânceres de pulmão. Os restantes 13% de todos os cânceres de pulmão são cânceres de pulmão de pequenas células, embora ocorram câncer de pulmão de células mistas. Como o câncer de pulmão de pequenas células é raro e rapidamente fatal, a oportunidade para a detecção precoce é pequena. Há três tipos principais de NSCLC: carcinoma de célula escamosa, carcinoma de grandes células e adenocarcinoma. O adenocarcinoma é a forma mais comum de câncer de pulmão (30% - 40% e relatada ser tão alta quanto 50%) e é o câncer de pulmão mais freqüente em fumantes e não-fumantes. O carcinoma de células escamosas representa 25-30% de todos os cânceres de pulmão e é geralmente encontrado em um brônquio proximal. NSCLC em estágio inicial tende a ser localizado, e se for detectado cedo ele muitas vezes pode ser tratado por cirurgia com um resultado favorável e maior sobrevida. Outras opções de tratamento incluem o tratamento de radiação, terapia de droga, e uma combinação destes métodos. O estágio do NSCLC é determinado pelo tamanho do tumor e a sua presença em outros tecidos, incluindo os gânglios linfáticos. No estágio oculto, as células cancerosas são encontradas em amostras de expectoração ou amostras de lavagem e o tumor não é detectável nos pulmões. No estágio 0, apenas a camada mais interna dos pulmões apresenta células cancerosas e o tumor não cresceu através do revestimento. No estágio IA, o câncer é considerado invasivo e cresceu profundamente no tecido pulmonar, mas o tumor é menor do que 3 cm de diâmetro. Neste estágio, o tumor não é encontrado no brônquio ou gânglios linfáticos. No estágio IB, o tumor é maior do que 3 cm de diâmetro ou cresceu no brônquio ou pleura, mas não cresceu dentro dos gânglios linfáticos. No estágio II, o tumor é maior do que 3 cm de diâmetro e cresceu dentro dos gânglios linfáticos. No estágio IIB, o tumor, tanto terá sido encontrado nos gânglios linfáticos quanto é maior do que 3 cm de diâmetro ou cresceu no brônquio ou pleura, ou o câncer não está nos gânglios linfáticos, mas é encontrado na parede do tórax, diafragma, pleura, brônquio, ou tecido que envolve o coração. No estágio IIIA, as células cancerosas são encontradas nos gânglios linfáticos perto do pulmão e brônquios, e naqueles entre os pulmões, mas do lado do torax, onde o tumor está localizado. No estágio III-B, as células cancerosas estão localizadas no lado oposto do torax a partir do tumor e no pescoço. Outros órgãos próximos dos pulmões podem também ter as células cancerosas e tumores múltiplos podem ser encontrados em um lóbulo dos pulmões. No estágio IV, os tumores são encontrados em mais do que um lóbulo do mesmo pulmão ou em ambos os pulmões e células cancerosas são encontradas em outras partes do corpo. Os métodos atuais de diagnóstico de câncer de pulmão incluem o teste de escarro para células cancerosas, radiografia de tórax, avaliação de fibra ótica das vias aéreas, e baixa dose espiral de tomografia computadorizada (TC). A citologia do escarro tem uma sensibilidade muito baixa. A radiografia do tórax também é relativamente insensível, exigindo que as lesões sejam maiores do que 1 cm de tamanho para serem visíveis. A broncoscopia requer que o tumor seja visível no interior das vias aéreas acessíveis ao broncoscópio. O método mais amplamente reconhecido de diagnóstico é a CT, mas em comum com raios-X, o uso de CT envolve radiação ionizante, o que em si pode causar câncer. A CT também tem limitações significativas: os exames exigem um alto nível de habilidade técnica para interpretar e muitas das anomalias observadas não são de fato câncer de pulmão e custos de saúde substanciais são incorridos no acompanhamento de achados da TC. O achado mais comum incidental é um nódulo pulmonar benigno. Nódulos pulmonares são lesões relativamente redondas ou áreas de tecido anormal, localizadas no interior do pulmão e podem variar em tamanho. Nódulos pulmonares podem ser benignos ou cancerosos, mas a maioria é benigna. Se um nódulo é inferior a 4 mm, a prevalência é de apenas 1,5%, se 4-8 milímetros a prevalência é de cerca de 6%, e, se mais de 20 mm, a incidência é de aproximadamente 20%. Para nódulos pequenos e médios, o paciente é aconselhado a passar por uma verificação de repetição dentro de três meses a um ano. Para nódulos muitos grandes, o paciente recebe uma biópsia (que é invasiva e pode levar a complicações), embora a maioria destes sejam benignos. Assim, são necessários métodos de diagnóstico que podem substituir ou complementar a CT para reduzir o número de procedimentos cirúrgicos realizados e minimizar o risco de complicações cirúrgicas. Além disso, mesmo quando nódulos pulmonares estão ausentes ou desconhecidos, são necessários métodos para detectar câncer de pulmão em seus estágios iniciais para melhorar os resultados dos pacientes. Apenas 16% dos casos de câncer de pulmão são diagnosticados como câncer localizado de estágio inicial, onde a taxa de sobrevida em 5 anos é de 46%, em comparação com 84% daqueles diagnosticados em estágio tardia, onde a taxa de sobrevida em 5 anos é de apenas 13%. Isto demonstra que confiar nos sintomas para diagnóstico não é útil porque muitos deles são comuns a outras doenças pulmonares. Esses sintomas incluem tosse persistente, expectoração com sangue, dor no peito e bronquite recorrente ou pneumonia. Onde existem métodos de diagnóstico precoce de câncer, os benefícios são geralmente aceitos pela comunidade médica. Cânceres que têm sido amplamente utilizados protocolos de triagem têm as maiores taxas de sobrevida em 5 anos, como o câncer de mama (88%) e câncer do cólon (65%) contra 16% para câncer de pulmão. No entanto, 88% dos pacientes com câncer de pulmão sobrevivem dez anos ou mais se o câncer for diagnosticado no estágio 1 através de triagem. Isso demonstra a clara necessidade de métodos de diagnóstico que possam detectar confiavelmente NSCLC em estágio inicial. A progressão do estado de saúde para doença é acompanhada por alterações na expressão de proteínas em tecidos afetados. O interrogatório comparativo do proteoma humano em tecidos saudáveis e doentes pode oferecer compreensão sobre a biologia da doença e levar a descoberta de marcadores biológicos para diagnósticos, novas metas para a intervenção terapêutica, e identificação de pacientes com maior probabilidade de se beneficiar de tratamentos específicos. A seleção de marcador biológico para um estado de doença específico envolve primeiramente a identificação de marcadores que têm uma diferença estatisticamente significativa e mensurável em uma população doente em comparação com uma população de controle para uma aplicação específica. Marcadores biológicos podem incluir moléculas segregadas ou desprendidas com o desenvolvimento ou a progressão da doença em paralelo e prontamente difundem na corrente sanguínea do tecido do pulmão ou de tecidos distantes em resposta a uma lesão. O marcador biológico ou um conjunto de marcadores biológicos identificados são geralmente validados clinicamente ou demonstrados ser um indicador de confiança para a utilização original pretendida para a qual foi selecionado. Os marcadores biológicos podem incluir pequenas moléculas, péptidos, proteínas e ácidos nucleicos. Alguns dos problemas chave que afetam a identificação de marcadores biológicos incluem ajuste excessivo dos dados disponíveis e desvios nos dados. Uma variedade de métodos têm sido utilizada em uma tentativa de identificar marcadores biológicos e diagnosticar a doença. Para marcadores com base em proteína, estes incluem a eletroforese bidimensional, espectrometria de massa, e os métodos de ensaio imune. Para marcadores ácidos nucleicos, estes incluem perfis de expressão de mRNA, perfis de microRNA, FISH, análise serial de expressão gênica (SAGE), e matrizes de expressão gênica em grande escala. A utilidade da electroforese bidimensional é limitada pela baixa sensibilidade de detecção; problemas com a solubilidade, carga e hidrofobicidade da proteína; reprodutibilidade de gel, e a possibilidade de uma única marca representar múltiplas proteínas. Para a espectrometria de massa, dependendo do formato utilizado, as limitações giram em torno do processamento e a separação das amostras, a sensibilidade às proteínas de baixa abundância, considerações de sinal em relação a ruído, e a incapacidade de identificar imediatamente a proteína detectada. Limitações em abordagens de ensaio imune para a descoberta de marcadores biológicos são centradas na incapacidade de ensaios multiplexados baseados em anticorpos para medir um grande número de analitos. Pode-se simplesmente imprimir uma matriz de anticorpos de elevada qualidade e, sem sanduíches, medir os analitos ligados a esses anticorpos. (Isto seria o equivalente formal de utilizar um genoma completo de sequências de ácidos nucleicos por hibridação para medir todas as sequências de DNA ou RNA de um organismo ou de uma célula. A experiência de hibridação funciona porque a hibridação pode ser um teste rigoroso de identidade. Mesmo anticorpos muito bons não são suficientemente rigorosos na escolha dos seus parceiros de ligação para trabalhar no contexto do sangue ou de extratos de células, mesmo porque o conjunto de proteínas nessas matrizes têm abundância extremamente diferentes). Assim, deve-se utilizar uma abordagem diferente com abordagens baseadas em ensaio imune para descoberta de marcadores biológicos - seria preciso utilizar ensaios multiplexados ELISA (isto é, sanduíches) para obter rigor suficiente para medir muitos analitos simultaneamente para decidir qual analitos são realmente marcadores biológicos. Ensaios imunes de sanduíche não escalam para conteúdo alto e, assim, a descoberta de marcadores biológicos utilizando ensaios imunes de sanduíche rigorosos não é possível o uso de formatos de matriz padrão. Por último, os reagentes de anticorpo estão sujeitos a variabilidade e instabilidade muito substancial do reagente. A plataforma imediata para a descoberta de marcadores biológicos de proteína supera esse problema. Muitos destes métodos requerem ou baseiam-se em algum tipo de fracionamento da amostra antes da análise. Assim, a preparação da amostra necessária para executar um estudo suficientemente alimentado concebido para identificar/descobrir estatisticamente marcadores biológicos em uma série de populações bem definidas de amostra, é extremamente difícil, dispendioso e consome muito tempo. Durante o fracionamento, uma vasta faixa de variabilidade pode ser introduzida nas várias amostras. Por exemplo, um marcador potencial poderia ser instável para o processo, a concentração do marcador poderia ser alterada, poderia ocorrer a agregação ou desagregação inadequada, e a contaminação inadvertida da amostra poderia ocorrer e assim ocultar as alterações sutis antecipadas no início da doença. É amplamente aceito que os métodos de descoberta e detecção de marcadores biológicos que usam estas tecnologias têm sérias limitações para a identificação de marcadores biológicos de diagnóstico. Estas limitações incluem a incapacidade para detectar marcadores biológicos de baixa abundância, uma incapacidade para cobrir de forma consistente toda faixa dinâmica do proteoma, irreprodutibilidade no processamento e fracionamento das amostras, e irreprodutibilidade global e falta de robustez do método. Além disso, estes estudos introduziram desvios aos dados e não trataram de forma adequada a complexidade das populações de amostras, incluindo controles adequados, em termos de distribuição e randomização necessária para identificar e validar marcadores biológicos dentro de uma população de doença alvo. Embora tenham sido feitos por várias décadas esforços que visam a descoberta de novos e eficazes marcadores biológicos, os esforços têm sido em grande parte sem sucesso. Tipicamente, marcadores biológicos para várias doenças têm sido identificados em laboratórios acadêmicos, geralmente através de uma descoberta acidental ao fazer a pesquisa básica em algum processo de doença. Com base na descoberta e com pequenas quantidades de dados clínicos, artigos foram publicados que sugeriram a identificação de um novo marcador biológico. A maioria destes marcadores biológicos propostos, no entanto, não foram confirmados como marcadores biológicos reais ou úteis principalmente devido ao pequeno número de amostras clínicas testadas forneceram apenas prova estatística fraca que um marcador biológico eficaz de fato tenha sido encontrado. Isto é, a identificação inicial não foi rigorosa no que diz respeito aos elementos básicos de estatística. Em cada um dos anos de 1994 a 2003, uma pesquisa da literatura científica mostra que foram publicadas milhares de referências voltadas para marcadores biológicos. Durante esse mesmo intervalo de tempo, no entanto, a FDA aprovou para uso em diagnóstico, no máximo, três novos marcadores biológicos de proteína em um ano, e em vários anos nenhum marcador biológico de proteína foi aprovado. Com base no histórico de esforços falhos de descoberta de marcadores biológicos, foram propostas teorias matemáticas que promovem adicinalmente o entendimento geral de que os marcadores biológicos para doença são raros e difíceis de encontrar. A pesquisa com marcadores biológicos com base em géis de 2D ou espectrometria de massa suporta essas noções. Muito poucos marcadores biológicos úteis têm sido identificados através destas abordagens. No entanto, geralmente é ignorado que gel de 2D e espectrometria de massa de proteínas de medida que estão presentes no sangue em concentrações de cerca de 1 nM e mais elevadas, e que este conjunto de proteínas podem muito bem ser o menos provável de alterar com doença. Diferente da plataforma instantânea de descoberta de marcador biológico, não existem plataformas de descoberta de marcadores biológicos proteômicas que sejam capazes de medir com precisão os níveis de expressão de proteína em concentrações muito mais baixas. Muito se sabe sobre vias bioquímicas para a biologia humana complexa. Muitas vias bioquímicas culminam em proteínas segragadas que funcionam localmente dentro da patologia ou são iniciadas por elas, por exemplo, fatores de crescimento são segregados para estimular a replicação de outras células na patologia, e outros fatores são segregados para afastar o sistema imunológico, e assim por diante. Embora muitas destas proteínas segregadas trabalhem de um modo parácrino, algumas operam distantemente no corpo. Um perito na técnica com uma compreensão básica de vias bioquímicas entenderia que muitas proteínas de patologia específica devem existir no sangue em concentrações inferiores (até mesmo muito abaixo), dos limites de detecção dos géis de 2D e espectrometria de massa. O que deve preceder a identificação desse número relativamente abundante de marcadores biológicos da doença é uma plataforma proteômica que pode analisar proteínas em concentrações inferiores àquelas detetáveis por géis de 2D ou espectrometria de massa. Assim, existe uma necessidade de marcadores biológicos, métodos, dispositivos, reagentes, sistemas e conjuntos que permitem (a) a diferenciação de nódulos pulmonares benignos de nódulos pulmonares malignos, (b) a detecção de marcadores biológicos de câncer de pulmão, e (c) o diagnóstico de câncer de pulmão. Para satisfazer esta necessidade foi desenvolvida uma nova tecnologia proteômica baseada em aptâmero para a descoberta de marcadores biológicos, que é capaz de medir simultaneamente milhares de proteínas a partir de pequenos volumes de amostras de plasma ou soro (veja-se p. e, a Pub. dos EUA. N°. 2010/0070191 ; a Pub. dos EUA N°. 2010/0086948, Ostroff et al Nature Precedings, http://precedings.nature.com/documents/4537/version/1(2010); Gold et al. Nature Precedings,http://precedings.nature.com/documents/4538/version/1 (2010)). Esta tecnologia, denominada varreduraSOMA, é habilitada por uma nova geração de aptâmeros com baixas taxas de dissociação (SOMAmers) que contêm nucleótidos modificados quimicamente, os quais expandem grandemente a diversidade físico-química das grandes bibliotecas aleatórias de ácidos nucleicos a partir das quais os aptâmeros são selecionados (ver Patente dos EUA. N°. 7.947.447). Tais modificações, que são compatíveis com SELEX, introduzem grupos funcionais em aptâmeros que são freqüentemente encontrados em interação proteína-proteína, interações anticorpo-antígeno e interações entre pequenas moléculas de drogas com as suas metas de proteína. Em geral, a utilização de tais modificações expande a faixa de possíveis alvos de aptâmero, melhora as suas propriedades de ligação e facilita a seleção de aptâmeros com baixas taxas de dissociação.
[004] Especificamente, as proteínas em matrizes complexas, tais como o plasma são medidas com um processo que transforma uma assinatura de concentrações de proteína para uma assinatura correspondente da concentração de aptâmero DNA, que é, então, quantificada usando uma plataforma de micromatriz DNA (Gold et al. Precedings Nature, http://precedings.nature.com/documents/4538/version/1 (2010)). O ensaio alavanca ligação de equilíbrio e desafio cinético. Ambos são realizados na solução, não sobre uma superfície, para tirar vantagem da cinética mais favorável de ligação e dissociação. Em essência, o ensaio tira vantagem da natureza dual de aptâmeros como ambas as entidades de ligação dobradas com formas definidas e sequências únicas reconhecíveis por sondas de hibridação específicas.
[005] O ensaio é capaz de medir simultaneamente um grande número de proteínas variando de baixa a alta abundância no soro. Por exemplo, amostras de 1.326 indivíduos de quatro estudos independentes de cancer de pulmão de células não-pequenas (NSCLC) foram analisadas a longo prazo em populações expostas ao tabaco. Mais de 800 proteínas em 15 L μ de soro foram medidas e foi desenvolvido um painel de 12 proteínas que distingue NSCLC a partir de controles com sensibilidade de 91% e especificidade de 84% em um conjunto de treinamento e sensibilidade de 89% e um especificidade de 83% em conjunto de verificação independente ligado. É importante ressaltar que o desempenho foi semelhante para NSCLC de estágio inícial e final (Ostroff et al. Nature Precedings, http://precedings.nature.com/documents/4537/version/1 (2010)).
[006] Até o momento, vários estudos de marcadores biológicos clínicos de doenças humanas, incluindo câncer de pulmão (Pub. dos EUA. N°. 2010/0070191), o câncer de ovário (Pub. dos EUA. N°. 2010/0086948), e doença renal crônica foram realizados utilizando este método. Estes estudos identificaram novos marcadores biológicos potenciais para a doença de cada uma destas doenças, bem como para o câncer em geral. RESUMO
[007] O presente pedido demonstra a utilidade da recentemente descoberta tecnologia de plataforma de micromatriz para identificar marcadores biológicos relacionados com a doença a partir do tecido. O presente pedido de patente inclui marcadores biológicos, métodos, reagentes, dispositivos, sistemas e conjuntos para a detecção e diagnóstico de câncer e, mais particularmente, o câncer de pulmão a partir do tecido. Os marcadores biológicos do presente pedido de patente foram identificados utilizando um ensaio multiplexado baseado em aptâmero que é descrito em detalhe no Exemplo 6. Ao utilizar o método baseado em aptâmero de identificação de marcadores biológicos aqui descritos, o presente pedido descreve um número surpreendentemente grande de marcadores biológicos de câncer de pulmão a partir de tecido, que são úteis para a detecção e diagnóstico de câncer de pulmão. Na identificação destes marcadores biológicos, foram medidas mais de 800 proteínas a partir de um número de amostras individuais, algumas das quais foram, em concentrações na faixa de baixa fentomolar. Isso é cerca de quatro ordens de grandeza menor do que as experiências de descoberta de marcadores biológicos feitas com géis de 2D e/ou espectrometria de massa.
[008] Embora alguns dos marcadores biológicos de câncer de pulmão descritos são úteis por si só para a detecção e diagnóstico de câncer de pulmão, são aqui descritos métodos para o agrupamento dos vários subconjuntos dos marcadores biológicos de câncer de pulmão, que são úteis como um painel de marcadores biológicos. Uma vez que um marcador biológico individual ou um subconjunto de marcadores biológicos tenha sido identificado, a detecção ou diagnóstico de câncer de pulmão de um indivíduo pode ser realizada utilizando qualquer plataforma de ensaio ou formato que seja capaz de medir as diferenças nos níveis do marcador biológico ou marcadores biológicos selecionado(s) em uma amostra biológica. No entanto, foi apenas usando o método de identificação de marcadores biológicos baseado em aptâmero descrito aqui, em que mais de 800 diferentes valores potenciais de marcadores biológicos foram individualmente selecionados a partir de um grande número de indivíduos tendo anteriormente sido diagnosticado como tendo ou não tendo câncer de pulmão que foi possível identificar os marcadores biológicos de câncer de pulmão aqui divulgados. Esta abordagem descoberta está em contraste com a descoberta de marcadores biológicos de meio condicionado ou células lisadas já que ele consulta um sistema de paciente mais relevante que não requer tradução para a patologia humana.
[009] Assim, em um dos aspectos do presente pedido de patente, um ou mais marcadores biológicos são fornecidos para uso por si só ou em várias combinações para diagnosticar o câncer de pulmão, particularmente cancer de pulmão de células não-pequenas (NSCLC) ou permitir o diagnóstico diferencial de nódulos pulmonares como benigno ou maligno. Modalidades exemplificativas incluem os marcadores biológicos fornecidos na Tabela 18, que, tal como dito acima, foram identificados utilizando um ensaio multiplexado baseado em aptâmero, tal como descrito em geral no Exemplo 1, e mais especificamente no Exemplo 6. Os marcadores apresentados na Tabela 18 são úteis para distinguir os nódulos benignos de nódulos cancerosos. Os marcadores apresentados na Tabela 18 são também úteis para distinguir fumantes assintomáticos de fumantes com câncer de pulmão. Em um aspecto, o marcador biológico é MMP-7. Noutro aspecto, o marcador biológico é MMP-12.
[0010] Enquanto alguns dos marcadores biológicos de câncer de pulmão descritos são úteis por si só para a detecção e diagnóstico de câncer de pulmão, os métodos são também descritos aqui para o agrupamento dos vários subconjuntos dos marcadores biológicos de câncer de pulmão, que são úteis cada qual como um painel de dois ou mais marcadores. Assim, várias modalidades do presente pedido de patente proporcionam combinações que compreendem marcadores de N, em que N é de pelo menos dois marcadores biológicos. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 2-36 marcadores biológicos.
[0011] Ainda Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 2-7, 2-10, 2-15, 2-20, 2-25, 2-30, 2-36. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 3-7, 3-10, 3-15, 3-20, 3-25, 3-30, 3-36. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 4-7, 4-10, 4-15, 4-20, 4-25, 4-30, 4-36. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 5-7, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 5-36. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 6-10, 6-15, 6-20, 6-25, 6-30, 6-36. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 7-10, 7-15, 7-20, 7-25, 7-30, 7-36. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 8-10, 8-15, 8-20, 8-25, 8-30, 8-36. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 9-15, 9-20, 9-25, 9-30, 9-36. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 10-15, 10-20, 10-25, 10-30, 10-36. Será apreciado que N pode ser selecionado para abranger ordem, faixas semelhantes, mas mais elevadas.
[0012] Em outro aspecto, é fornecido um método para diagnosticar câncer de pulmão de um indivíduo, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, pelo menos, um valor de marcadores biológicos correspondente a pelo menos um marcador biológico selecionado a partir do grupo de marcadores biológicos fornecidos na Tabela 18, em que o indivíduo é classificado como tendo câncer de pulmão com base no valor de, pelo menos, um marcador biológico.
[0013] Em outro aspecto, é fornecido um método para diagnosticar câncer de pulmão de um indivíduo, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, os valores de marcadores biológicos, que correspondem a, pelo menos cada um dos N marcadores biológicos selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 18, em que a probabilidade de o indivíduo ter câncer de pulmão é determinado com base nos valores de marcadores biológicos. Em outro aspecto, é fornecido um método para diagnosticar câncer de pulmão de um indivíduo, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, os valores de marcadores biológicos, que correspondem a pelo menos um, de cada um dos N marcadores biológicos selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 18, em que o indivíduo é classificado como tendo câncer de pulmão com base nos valores de marcadores biológicos e, em que N = 2-10.
[0014] Em outro aspecto, é fornecido um método para diagnosticar câncer de pulmão de um indivíduo, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, os valores de marcadores biológicos, que correspondem a pelo menos um, de cada um dos N marcadores biológicos selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 18, em que a probabilidade de o indivíduo ter câncer de pulmão é determinado com base nos valores de marcadores biológicos e, em que N = 2-10.
[0015] Em outro aspecto, é fornecido um método para triagem de fumantes para o câncer de pulmão, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo que é um fumante, pelo menos, um valor de marcadores biológicos correspondente a pelo menos um marcador biológico selecionado entre o grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 18, em que o indivíduo é classificado como tendo câncer de pulmão, ou a probabilidade de o indivíduo ter câncer de pulmão é determinada com base no valor de, pelo menos, um marcador biológico.
[0016] Em outro aspecto, é fornecido um método para a triagem de fumantes para o câncer de pulmão, o método incluindo detectar em uma amostra biológica de um indivíduo que é um fumante, valores de marcador biológico cada um correspondendo a pelo menos um dos N marcadores biológicos selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 18, em que o indivíduo é classificado como tendo câncer de pulmão, ou a probabilidade de o indivíduo ter câncer de pulmão é determinada, com base nos ditos valores de marcadores biológicos, em que N = 2-10.
[0017] Em outro aspecto, é fornecido um método para diagnosticar um indivíduo que não possui o câncer de pulmão, o método incluindo detectar em uma amostra biológica de um indivíduo, pelo menos um valor de marcador biológico correspondendo a pelo menos um marcador biológico selecionado entre o grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 18, em que o indivíduo é classificado como não tendo o câncer de pulmão com base no valor de, pelo menos, um marcador biológico.
[0018] Em outro aspecto, é fornecido um método para diagnosticar um indivíduo que não possui o câncer de pulmão, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, os valores de marcadores biológicos, cada um dos quais corresponde a pelo menos um dos N marcadores biológicos selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 18, em que o indivíduo é classificado como não tendo o câncer de pulmão com base nos valores de marcadores biológicos, e em que N = 2-10.
[0019] Em outro aspecto, é fornecido um método para diagnosticar câncer de pulmão, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, valores de marcadores biológicos, cada um dos quais corresponde a um marcador biológico sobre um painel de N marcadores biológicos, em que os marcadores biológicos são selecionados a partir de o grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 18, em que a classificação dos valores de marcadores biológicos indica que o indivíduo tem câncer de pulmão, e em que N = 3-10.
[0020] Em outro aspecto, é fornecido um método para diagnosticar câncer de pulmão, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, os valores de marcadores biológicos, cada um dos quais corresponde a um marcador biológico sobre um painel de N marcadores biológicos, em que os marcadores biológicos são selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 18, em que a classificação dos valores de marcadores biológicos indica que o indivíduo tem câncer de pulmão, e em que N = 3-15.
[0021] Em outro aspecto, é fornecido um método para triagem de fumantes para câncer de pulmão, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo que é um fumante, os valores de marcadores biológicos, cada um dos quais correspondendo a um marcador biológico sobre um painel de N marcadores biológicos, em que os marcadores biológicos são selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 18, em que o indivíduo é classificado como tendo câncer de pulmão, ou a probabilidade de o indivíduo ter câncer de pulmão é determinada, com base nos valores de marcadores biológicos, e em que N = 3 - 10.
[0022] Em outro aspecto, é fornecido um método para triagem de fumantes para câncer de pulmão, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo que é um fumante, os valores de marcadores biológicos, cada um correspondendo a um marcador biológico sobre um painel de N marcadores biológicos, em que os marcadores biológicos são selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 18, em que o indivíduo é classificado como tendo câncer de pulmão, ou a probabilidade de o indivíduo ter câncer de pulmão é determinada, com base nos valores de marcadores biológicos, em que N = 3-15.
[0023] Em outro aspecto, é fornecido um método para diagnosticar a ausência de câncer de pulmão, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, os valores de marcadores biológicos, cada um correspondendo a um marcador biológico sobre um painel de N marcadores biológicos, em que os marcadores biológicos são selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 18, em que a classificação dos valores de marcadores biológicos indica a ausência de câncer de pulmão no indivíduo, e em que N = 3-10.
[0024] Em outro aspecto, é fornecido um método para diagnosticar a ausência de câncer de pulmão, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, os valores de marcadores biológicos, cada um correspondendo a um marcador biológico sobre um painel de N marcadores biológicos, em que os marcadores biológicos são selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 18, em que a classificação dos valores de marcadores biológicos indica a ausência de câncer de pulmão no indivíduo, e em que N = 3-15.
[0025] Em outro aspecto, é fornecido um método para diagnosticar câncer de pulmão de um indivíduo, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, os valores de marcadores biológicos, cada um dos quais corresponde a pelo menos um dos N marcadores biológicos selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos definidos na Tabela 18, em que o indivíduo é classificado como tendo câncer de pulmão baseado em uma pontuação de classificação que se desvia de um valor limiar predeterminado, e em que N = 2-10.
[0026] Em outro aspecto, é fornecido um método para triagem de fumantes para câncer de pulmão, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo que é um fumante, os valores de marcadores biológicos, cada um correspondendo a um marcador biológico sobre um painel de N marcadores biológicos, em que os marcadores biológicos são selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 18, em que o indivíduo é classificado como tendo câncer de pulmão, ou a probabilidade de o indivíduo ter câncer de pulmão é determinada, com base em uma pontuação de classificação que se desvia de um valor limiar predeterminado, em que N = 3-10.
[0027] Em outro aspecto, é fornecido um método para triagem de fumantes para câncer de pulmão, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo que é um fumante, os valores de marcadores biológicos, cada um correspondendo a um marcador biológico sobre um painel de N marcadores biológicos, em que os marcadores biológicos são selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 18, em que o indivíduo é classificado como tendo câncer de pulmão, ou a probabilidade de o indivíduo ter câncer de pulmão é determinada, com base em uma pontuação de classificação que se desvia de um valor limiar predeterminado, em que N = 3-15.
[0028] Em outro aspecto, é fornecido um método para diagnosticar a ausência de câncer de pulmão em um indivíduo, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, os valores de marcadores biológicos, cada um dos quais corresponde a pelo menos um dos N marcadores biológicos selecionados entre o grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 18, em que o dito indivíduo é classificado como não tendo câncer de pulmão com base na pontuação de classificação que se desvia de um valor limiar predeterminado, e em que N = 2-10.
[0029] Em outro aspecto, um método implementado por computador é fornecido para indicar uma probabilidade de câncer de pulmão. O método compreende: a recuperação de informações sobre um marcador biológico computador para um indivíduo, em que a informação marcador biológico compreende os valores de marcadores biológicos, que correspondem a cada um dos, pelo menos, N marcadores biológicos, em que n é tal como acima definido, selecionado a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 18; executar com o computador uma classificação de cada um dos valores de marcadores biológicos; e indicar uma probabilidade de que o indivíduo tem câncer de pulmão baseado em uma pluralidade de classificações.
[0030] Em outro aspecto, um método implementado por computador é fornecido para a classificação de um indivíduo tanto como tendo quanto não tendo câncer de pulmão. O método compreende: recuperar sobre um computador informação de marcador biológico para um indivíduo, em que a informação de marcador biológico compreende valores de marcadores biológicos cada um correspondendo a pelo menos um dos N marcadores biológicos selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos fornecidos na Tabela 18; executar com o computador uma classificação de cada um dos valores de marcadores biológicos; e indicar se o indivíduo tem câncer de pulmão baseada em uma pluralidade de classificações.
[0031] Em outro aspecto, é fornecido um produto de programa de computador para indicar uma probabilidade de câncer de pulmão. O produto de programa de computador inclui um meio legível por computador que contém o código de programa executável por um processador de um dispositivo ou sistema de computação, que compreende o código de programa: código que recupera dados atribuídos a uma amostra biológica de um indivíduo, em que os dados compreendem valores de marcadores biológicos cada um correspondendo a pelo menos um dos N marcadores biológicos, em que N é tal como acima definido, na amostra biológica selecionada a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 18; e o código que executa um método de classificação que indica uma probabilidade de que o indivíduo tem câncer de pulmão como um função dos valores de marcadores biológicos.
[0032] Em outro aspecto, é fornecido um produto de programa de computador para indicar um estado de câncer de pulmão de um indivíduo. O produto de programa de computador inclui um meio legível por computador que contém o código de programa executável por um processador de um dispositivo ou sistema de computação, que compreende o código de programa: código que recupera dados atribuídos a uma amostra biológica de um indivíduo, em que os dados compreendem valores de marcadores biológicos cada um correspondendo a pelo menos um dos N marcadores biológicos na amostra biológica selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos fornecidos na Tabela 18; e o código que executa um método de classificação que indica um estado de câncer de pulmão do indivíduo como uma função dos valores de marcadores biológicos.
[0033] Em outro aspecto, é fornecido um método implementado por computador para indicar uma probabilidade de câncer de pulmão. O método compreende recuperar em um computador informação de marcador biológico para um indivíduo, em que a informação de marcador biológico compreende um valor de marcador biológico correspondendo a um marcador biológico selecionado a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 18; executar com o computador uma classificação do valor do marcador biológico; e indicar uma probabilidade de que o indivíduo tem câncer de pulmão com base na classificação.
[0034] Em outro aspecto, é fornecido um método implementado por computador para a classificação de um indivíduo como tendo ou não tendo câncer de pulmão. O método compreende recuperar em um computador informação de marcador biológico para um indivíduo, em que a informação de marcador biológico compreende um valor de marcador biológico correspondendo a um marcador biológico selecionado a partir do grupo de marcadores biológicos fornecidos na Tabela 18; executar com o computador uma classificação do valor de marcador biológico; e indicar se o indivíduo tem câncer de pulmão com base na classificação.
[0035] Em ainda outro aspecto, é fornecido um produto de programa de computador para indicar uma probabilidade de câncer de pulmão. O produto de programa de computador inclui um meio legível por computador que contém o código de programa executável por um processador de um dispositivo ou sistema de computação, que compreende o código de programa: código que recupera dados atribuídos a uma amostra biológica de um indivíduo, em que os dados compreendem o valor de um marcador biológico correspondendo a um marcador biológico na amostra biológica selecionada a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 18; e código que executa um método de classificação que indica uma probabilidade de que o indivíduo tem câncer de pulmão como uma função do valor do marcador biológico.
[0036] Em ainda outro aspecto, é fornecido um produto de programa de computador para indicar um estado de câncer de pulmão de um indivíduo. O produto de programa de computador inclui um meio legível por computador que contém código de programa executável por um processador de um dispositivo ou sistema de computação, que compreende o código de programa: código que recupera dados atribuídos a uma amostra biológica de um indivíduo, em que os dados compreendem o valor de um marcador biológico correspondendo a um marcador biológico na amostra biológica selecionada a partir do grupo de marcadores biológicos fornecidos na Tabela 18; e código que executa um método de classificação que indica um estado de câncer de pulmão do indivíduo como uma função do valor do marcador biológico.
[0037] Em uma outra modalidade do presente pedido de patente, modalidades exemplificativas incluem os marcadores biológicos fornecidos na Tabela 20, os quais como notado acima, foram identificados utilizando um ensaio multiplexado baseado em aptâmero, tal como descrito genericamente no Exemplo 1, e mais especificamente no Exemplo 6. Os marcadores apresentados na Tabela 20 são úteis para distinguir os nódulos benignos de nódulos cancerosos. Os marcadores apresentados na Tabela 20 são também úteis para distinguir fumantes assintomáticos de fumantes com câncer de pulmão. Com referência à Tabela 20, N é selecionado para ser qualquer número de 2-25 marcadores biológicos. Os marcadores apresentados na Tabela 20 foram determinados para serem úteis tanto em amostras de tecidos quanto em amostras de soro.
[0038] Em ainda outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 2-7, 2-10, 2-15, 2-20, 2-25. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 3-7, 3-10, 3-15, 3-20, 3-25. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 4-7, 4-10, 4-15, 4-20, 4-25. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 5-7, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 6-10, 6-15, 6-20, 6-25. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 7-10, 7-15, 7-20, 7-25. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 810, 8-15, 8-20, 8-25. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 9-15, 9-20, 9-25. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 10-15, 10-20, 10-25. Será apreciado que N pode ser selecionado para abranger ordens, faixas semelhantes, mas mais elevadas.
[0039] Em outro aspecto, é fornecido um método para diagnosticar câncer de pulmão de um indivíduo, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, pelo menos, um valor de marcadores biológicos correspondente a pelo menos um marcador biológico selecionado a partir do grupo de marcadores biológicos fornecidos na Tabela 20, em que o indivíduo é classificado como tendo câncer de pulmão com base no valor de, pelo menos, um marcador biológico.
[0040] Em outro aspecto, é fornecido um método para diagnosticar câncer de pulmão de um indivíduo, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, os valores de marcadores biológicos, cada um dos quais correspondem a pelo menos um dos N marcadores biológicos selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 20, em que a probabilidade de o indivíduo ter câncer de pulmão é determinada com base nos valores de marcadores biológicos.
[0041] Em outro aspecto, é fornecido um método para diagnosticar câncer de pulmão de um indivíduo, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, os valores de marcadores biológicos, cada um dos quais correspondem a pelo menos um dos N marcadores biológicos selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 20, em que o indivíduo é classificado como tendo câncer de pulmão com base nos valores de marcadores biológicos e, em que N = 2-10.
[0042] Em outro aspecto, é fornecido um método para diagnosticar câncer de pulmão de um indivíduo, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, os valores de marcadores biológicos, cada um dos quais correspondem a pelo menos um dos N marcadores biológicos selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 20, em que a probabilidade de o indivíduo ter câncer de pulmão é determinada com base nos valores de marcadores biológicos e, em que N = 2-10.
[0043] Em outro aspecto, é fornecido um método para triagem de fumantes para câncer de pulmão, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo que é um fumante, pelo menos, um valor de marcador biológico correspondente a pelo menos um marcador biológico selecionado entre o grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 20, em que o indivíduo é classificado como tendo câncer de pulmão, ou a probabilidade de o indivíduo ter câncer de pulmão é determinada com base no valor de, pelo menos, um marcador biológico.
[0044] Em outro aspecto, é fornecido um método para triagem de fumantes para câncer de pulmão, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo que é um fumante, os valores de marcadores biológicos, cada um dos quais correspondem a pelo menos um dos N marcadores biológicos selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 20, em que o indivíduo é classificado como tendo câncer de pulmão, ou a probabilidade de o indivíduo ter câncer de pulmão é determinada, com base nos ditos valores de marcadores biológicos, em que N = 2-10.
[0045] Em outro aspecto, é fornecido um método para diagnosticar um indivíduo que não possui câncer de pulmão, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, pelo menos, um valor de marcadores biológicos correspondente a pelo menos um marcador biológico selecionado entre o grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 20, em que o indivíduo é classificado como não tendo câncer de pulmão com base no valor de, pelo menos, um marcador biológico.
[0046] Em outro aspecto, é fornecido um método para diagnosticar um indivíduo que não possui o câncer de pulmão, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, os valores de marcadores biológicos, cada um dos quais correspondem a pelo menos um dos N marcadores biológicos selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 20, em que o indivíduo é classificado como não tendo câncer de pulmão com base nos valores de marcadores biológicos, e em que N = 2-10.
[0047] Em outro aspecto, é fornecido um método para diagnosticar câncer de pulmão, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, os valores de marcadores biológicos, cada um correspondendo a um marcador biológico sobre um painel de N marcadores biológicos, em que os marcadores biológicos são selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 20, em que uma classificação dos valores de marcadores biológicos indica que o indivíduo tem câncer de pulmão, e em que N = 3-10.
[0048] Em outro aspecto, é fornecido um método para diagnosticar câncer de pulmão, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, os valores de marcadores biológicos, cada um correspondendo a um marcador biológico sobre um painel de N marcadores biológicos, em que os marcadores biológicos são selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 20, em que uma classificação dos valores de marcadores biológicos indica que o indivíduo tem câncer de pulmão, e em que N = 3-15.
[0049] Em outro aspecto, é fornecido um método para triagem de fumantes para câncer de pulmão, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo que é um fumante, os valores de marcadores biológicos, cada um correspondendo a um marcador biológico sobre um painel de N marcadores biológicos, em que os marcadores biológicos são selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 20, em que o indivíduo é classificado como tendo câncer de pulmão, ou a probabilidade de o indivíduo ter câncer de pulmão é determinada, com base nos valores de marcadores biológicos, e em que N = 3 - 10.
[0050] Em outro aspecto, é fornecido um método para triagem de fumantes para câncer de pulmão, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo que é um fumante, os valores de marcadores biológicos, cada um correspondendo a um marcador biológico sobre um painel de N marcadores biológicos, em que os marcadores biológicos são selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 20, em que o indivíduo é classificado como tendo câncer de pulmão, ou a probabilidade de o indivíduo ter câncer de pulmão é determinada, com base nos valores de marcadores biológicos, em que N = 3-15.
[0051] Em outro aspecto, é fornecido um método para diagnosticar a ausência de câncer de pulmão, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, os valores de marcadores biológicos, cada um correspondendo a um marcador biológico sobre um painel de N marcadores biológicos, em que os marcadores biológicos são selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 20, em que uma classificação dos valores de marcadores biológicos indica a ausência de câncer de pulmão no indivíduo, e em que N = 3-10.
[0052] Em outro aspecto, é fornecido um método para diagnosticar a ausência de câncer de pulmão, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, os valores de marcadores biológicos, cada um correspondendo a um marcador biológico sobre um painel de N marcadores biológicos, em que os marcadores biológicos são selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 20, em que uma classificação dos valores de marcadores biológicos indica a ausência de câncer de pulmão no indivíduo, e em que N = 3-15.
[0053] Em outro aspecto, é fornecido um método para diagnosticar câncer de pulmão de um indivíduo, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, os valores de marcadores biológicos, cada um dos quais corresponde a pelo menos um dos N marcadores biológicos selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos definidos na Tabela 20, em que o indivíduo é classificado como tendo câncer de pulmão baseado em uma pontuação de classificação que se desvia de um valor limiar predeterminado, e em que N = 2-10.
[0054] Em outro aspecto, é fornecido um método para triagem de fumantes para câncer de pulmão, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo que é um fumante, os valores de marcadores biológicos, cada um correspondendo a um marcador biológico sobre um painel de N marcadores biológicos, em que os marcadores biológicos são selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 20, em que o indivíduo é classificado como tendo câncer de pulmão, ou a probabilidade de o indivíduo ter câncer de pulmão é determinada, com base em uma pontuação de classificação que se desvia de um valor limiar predeterminado, em que N = 3-10.
[0055] Em outro aspecto, é fornecido um método para triagem de fumantes para câncer de pulmão, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo que é um fumante, os valores de marcadores biológicos, cada um correspondendo a um marcador biológico sobre um painel de N marcadores biológicos, em que os marcadores biológicos são selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 20, em que o indivíduo é classificado como tendo câncer de pulmão, ou a probabilidade de o indivíduo ter câncer de pulmão é determinada, com base em uma pontuação de classificação que se desvia de um valor limiar predeterminado, em que N = 3-15.
[0056] Em outro aspecto, é fornecido um método para diagnosticar a ausência de câncer de pulmão em um indivíduo, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, os valores de marcadores biológicos, cada um dos quais corresponde a pelo menos um dos N marcadores biológicos selecionados entre o grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 20, em que o dito indivíduo é classificado como não tendo câncer de pulmão com base na pontuação de classificação que se desvia de um valor limiar predeterminado, e em que N = 2-10.
[0057] Em outro aspecto, é fornecido um método implementado por computador para indicar uma probabilidade de câncer de pulmão. O método compreende: recuperar em um computador informação de marcador biológico para um indivíduo, em que a informação de marcador biológico compreende os valores de marcadores biológicos, cada um dos quais correspondem a pelo menos um dos N marcadores biológicos, em que N é, tal como acima definido, selecionado a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 20; executar com o computador uma classificação de cada um dos valores de marcadores biológicos; e indicar uma probabilidade de que o indivíduo tem câncer de pulmão baseado em uma pluralidade de classificações.
[0058] Em outro aspecto, é fornecido um método implementado por computador para a classificação de um indivíduo como tendo ou não tendo câncer de pulmão. O método compreende: recuperar em um computador, informação de marcador biológico para um indivíduo, em que a informação de marcador biológico compreende valores de marcadores biológicos, cada um correspondendo a pelo menos um dos N marcadores biológicos selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 20, executar com o computador uma classificação de cada um dos valores de marcadores biológicos; e indicar se o indivíduo tem câncer de pulmão baseado em uma pluralidade de classificações.
[0059] Em outro aspecto, é fornecido um produto de programa de computador para indicar uma probabilidade de câncer de pulmão. O produto de programa de computador inclui um meio legível por computador que contém o código de programa executável por um processador de um dispositivo ou sistema de computação, o código de programa compreendendo: código que recupera dados atribuídos a uma amostra biológica de um indivíduo, em que os dados compreendem valores de marcadores biológicos cada um correspondendo a pelo menos um dos N marcadores biológicos, em que N é, tal como acima definido, na amostra biológica selecionada a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 20, e código que executa um método de classificação que indica a probabilidade de que o indivíduo tem câncer de pulmão como uma função dos valores de marcadores biológicos.
[0060] Em outro aspecto, é fornecido um produto de programa de computador para indicar um estado de câncer de pulmão de um indivíduo. O produto de programa de computador inclui um meio legível por computador que contém o código de programa executável por um processador de um dispositivo ou sistema de computação, o código de programa compreendendo: código que recupera dados atribuídos a uma amostra biológica de um indivíduo, em que os dados compreendem valores de marcadores biológicos cada um correspondendo a pelo menos um dos N marcadores biológicos na amostra biológica selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos fornecidos na Tabela 20; e código que executa um método de classificação que indica um estado de câncer de pulmão do indivíduo como uma função dos valores de marcadores biológicos.
[0061] Em outro aspecto, é fornecido um método implementado por computador para indicar uma probabilidade de câncer de pulmão. O método compreende recuperar em um computador informação de marcador biológico para um indivíduo, em que a informação de marcador biológico compreende um valor de marcador biológico correspondente a um marcador biológico selecionado a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 20; executar com o computador uma classificação do valor de marcador biológico; e indicar uma probabilidade de que o indivíduo tem câncer de pulmão com base na classificação.
[0062] Em outro aspecto, é fornecido um método implementado por computador para classificar um indivíduo como tendo ou não tendo câncer de pulmão. O método compreende recuperar de um computador informação de marcador biológico para um indivíduo, em que a informação de marcador biológico compreende um valor de marcador biológico correspondente a um marcador biológico selecionado a partir do grupo de marcadores biológicos fornecidos na Tabela 20; executar com o computador uma classificação do valor de marcador biológico; e indicar se o indivíduo tem câncer de pulmão com base na classificação.
[0063] Em ainda outro aspecto, é fornecido um produto de programa de computador para indicar uma probabilidade de câncer de pulmão. O produto de programa de computador inclui um meio legível por computador que contém o código de programa executável por um processador de um dispositivo ou sistema de computação, o código de programa compreendendo: código que recupera dados atribuídos a uma amostra biológica de um indivíduo, em que o valor dos dados compreende um valor de marcador biológico correspondente a um marcador biológico na amostra biológica selecionada a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 20; e código que executa um método de classificação que indica uma probabilidade de que o indivíduo tem câncer de pulmão como uma função do valor do marcador biológico.
[0064] Em ainda outro aspecto, é fornecido um produto de programa de computador para indicar um estado de câncer de pulmão de um indivíduo. O produto de programa de computador inclui um meio legível por computador que contém o código de programa executável por um processador de um dispositivo ou sistema de computação, o código de programa compreendendo: código que recupera dados atribuídos a uma amostra biológica de um indivíduo, em que o valor dos dados compreende um valor de marcador biológico correspondente a um marcador biológico na amostra biológica selecionada a partir do grupo de marcadores biológicos fornecidos na Tabela 20; e código que executa um método de classificação que indica um estado de câncer de pulmão do indivíduo como uma função do valor do marcador biológico.
[0065] Em uma outra modalidade do presente pedido de patente, modalidades exemplificativas incluem os marcadores biológicos fornecidos na Tabela 21, que foram identificados utilizando um ensaio multiplexado com base em aptâmero, tal como descrito em geral no Exemplo 1 e, mais especificamente, nos Exemplos 2 e 6. Os marcadores apresentados na Tabela 21 são úteis para distinguir os nódulos benignos de nódulos cancerosos. Os marcadores apresentados na Tabela 21 são também úteis para distinguir fumantes assintomáticos de fumantes com câncer de pulmão. Com referência à Tabela 21, N é selecionado para ser qualquer número de 2-86 marcadores biológicos. Todos os marcadores biológicos da Tabela 21, são úteis para proporcionar a informação solicitada tanto em amostras de tecidos como em amostras de soro.
[0066] Ainda Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 2-7, 2-10, 2-15, 2-20, 2-25, 2-30, 2-35, 2-40, 2 - 45, 2-50, 2-55, 2-60, 2-65, 2-70, 2-75, 2-80, ou 2-86. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 3-7, 3-10, 3-15, 3-20, 3-25, 3-30, 3-35, 3-40, 3-45, 3 - 50, 3-55, 3-60, 3-65, 3-70, 3-75, 3-80, ou 3-86. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 4-7, 4-10, 4-15, 4-20, 4-25, 4-30, 4-35, 4-40, 4-45, 4 - 50, 4-55, 4-60, 4-65, 4-70, 4-75, 4-80, ou 4-86. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 5-7, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 5-35, 5-40, 5-45, 5 - 50, 5-55, 5-60, 5-65, 5-70, 5-75, 5-80, ou 5-86. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 6-10, 6-15, 6-20, 6-25, 6-30, 6-35, 6-40, 6-45, 650, 6 - 55, 6-60, 6-65, 6-70, 6-75, 6-80, ou 6-86. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 7-10, 715, 7-20, 7-25, 7-30, 7-35, 7-40, 7-45, 7-50, 7 - 55, 7-60, 7-65, 7-70, 775, 7-80, ou 7-86. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 8-10, 8-15, 8-20, 8-25, 8-30, 8-35, 8-40, 8-45, 850, 8 - 55, 8-60, 8-65, 8-70, 8-75, 8-80, ou 8-86. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 9-15, 9- 20, 9-25, 9-30, 9-35, 9-40, 9-45, 9-50, 9-55, 9 - 60, 9-65, 9-70, 9-75, 980, ou 9-86. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 10-15, 10-20, 10-25, 10-30, 10-35, 10-40, 10-45, 10-50, 10-55, 10 - 60, 10-65, 10-70, 10-75, 10-80, ou 10-86. Será apreciado que N pode ser selecionado para abranger ordem, faixas semelhantes, mas mais elevadas.
[0067] Em outro aspecto, é fornecido um método para diagnosticar câncer de pulmão de um indivíduo, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, pelo menos, um valor de marcadores biológicos correspondente a pelo menos um marcador biológico selecionado a partir do grupo de marcadores biológicos fornecidos na Tabela 21, em que o indivíduo é classificado como tendo câncer de pulmão com base no valor de, pelo menos, um marcador biológico.
[0068] Em outro aspecto, é fornecido um método para diagnosticar câncer de pulmão de um indivíduo, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, os valores de marcadores biológicos, cada um correspondendo a pelo menos um dos N marcadores biológicos selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 21, em que a probabilidade de o indivíduo ter câncer de pulmão é determinada com base nos valores de marcadores biológicos.
[0069] Em outro aspecto, é fornecido um método para diagnosticar câncer de pulmão de um indivíduo, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, os valores de marcadores biológicos, cada um dos quais correspondendo a pelo menos um dos N marcadores biológicos selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 21, em que o indivíduo é classificado como tendo câncer de pulmão com base nos valores de marcadores biológicos e, em que N = 2-10.
[0070] Em outro aspecto, é fornecido um método para diagnosticar câncer de pulmão de um indivíduo, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, os valores de marcadores biológicos, cada um dos quais correspondendo a pelo menos um dos N marcadores biológicos selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 21, em que a probabilidade de o indivíduo ter câncer de pulmão é determinada com base nos valores de marcadores biológicos e, em que N = 2-10.
[0071] Em outro aspecto, é fornecido um método para triagem de fumantes para câncer de pulmão, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo que é um fumante, pelo menos, um valor de marcador biológico correspondente a pelo menos um marcador biológico selecionado entre o grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 21, em que o indivíduo é classificado como tendo câncer de pulmão, ou a probabilidade de o indivíduo ter câncer de pulmão é determinada com base no valor de, pelo menos, um marcador biológico. Em outro aspecto, é fornecido um método para triagem de fumantes para câncer de pulmão, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo que é um fumante, os valores de marcadores biológicos, cada um dos quais corresponde a pelo menos um dos N marcadores biológicos selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 21, em que o indivíduo é classificado como tendo câncer de pulmão, ou a probabilidade de o indivíduo ter câncer de pulmão é determinada, com base nos ditos valores de marcadores biológicos, em que N = 2-10.
[0072] Em outro aspecto, é fornecido um método para diagnosticar que um indivíduo não possui o câncer de pulmão, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, pelo menos, um valor de marcadores biológicos correspondente a pelo menos um marcador biológico selecionado entre o grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 21, em que o indivíduo é classificado como não tendo câncer de pulmão com base no valor de, pelo menos, um marcador biológico.
[0073] Em outro aspecto, é fornecido um método para diagnosticar que um indivíduo não possui o câncer de pulmão, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, os valores de marcadores biológicos, cada um dos quais corresponde a pelo menos um dos N marcadores biológicos selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 21, em que o indivíduo é classificado como não tendo câncer de pulmão com base nos valores de marcadores biológicos, e em que N = 2-10.
[0074] Em outro aspecto, é fornecido um método para diagnosticar câncer de pulmão, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, os valores de marcadores biológicos, cada um correspondendo a um marcador biológico sobre um painel de N marcadores biológicos, em que os marcadores biológicos são selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 21, em que uma classificação dos valores de marcadores biológicos indica que o indivíduo tem câncer de pulmão, e em que N = 3-10.
[0075] Em outro aspecto, é fornecido um método para diagnosticar câncer de pulmão, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, os valores de marcadores biológicos, cada um correspondendo a um marcador biológico sobre um painel de N marcadores biológicos, em que os marcadores biológicos são selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 21, em que uma classificação dos valores de marcadores biológicos indica que o indivíduo tem câncer de pulmão, e em que N = 3-15.
[0076] Em outro aspecto, é fornecido um método para triagem de fumantes para câncer de pulmão, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo que é um fumante, os valores de marcadores biológicos, cada um correspondendo a um marcador biológico sobre um painel de N marcadores biológicos, em que os marcadores biológicos são selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 21, em que o indivíduo é classificado como tendo câncer de pulmão, ou a probabilidade de o indivíduo ter câncer de pulmão é determinada, com base nos valores de marcadores biológicos, e em que N = 3 - 10.
[0077] Em outro aspecto, é fornecido um método para triagem de fumantes para câncer de pulmão, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo que é um fumante, os valores de marcadores biológicos, cada um correspondendo a um marcador biológico sobre um painel de N marcadores biológicos, em que os marcadores biológicos são selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 21, em que o indivíduo é classificado como tendo câncer de pulmão, ou a probabilidade de o indivíduo ter câncer de pulmão é determinada, com base nos valores de marcadores biológicos, em que N = 3-15.
[0078] Em outro aspecto, é fornecido um método para diagnosticar a ausência de câncer de pulmão, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, os valores de marcadores biológicos, cada um correspondendo a um marcador biológico sobre um painel de N marcadores biológicos, em que os marcadores biológicos são selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 21, em que a classificação dos valores de marcadores biológicos indica a ausência de câncer de pulmão no indivíduo, e em que N = 3-10.
[0079] Em outro aspecto, é fornecido um método para diagnosticar a ausência de câncer de pulmão, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, os valores de marcadores biológicos, cada um correspondendo a um marcador biológico sobre um painel de N marcadores biológicos, em que os marcadores biológicos são selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 21, em que uma classificação dos valores de marcadores biológicos indica a ausência de câncer de pulmão no indivíduo, e em que N = 3-15.
[0080] Em outro aspecto, é fornecido um método para diagnosticar câncer de pulmão de um indivíduo, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, os valores de marcadores biológicos, cada um dos quais corresponde a pelo menos um dos N marcadores biológicos selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos definidos na Tabela 21, em que o indivíduo é classificado como tendo câncer de pulmão baseado em uma pontuação de classificação que se desvia de um valor limiar predeterminado, e em que N = 2-10.
[0081] Em outro aspecto, é fornecido um método para triagem de fumantes para câncer de pulmão, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo que é um fumante, os valores de marcadores biológicos, cada um correspondendo a um marcador biológico sobre um painel de N marcadores biológicos, em que os marcadores biológicos são selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 21, em que o indivíduo é classificado como tendo câncer de pulmão, ou a probabilidade de o indivíduo ter câncer de pulmão é determinada, com base em uma pontuação de classificação que se desvia de um valor limiar predeterminado, em que N = 3-10.
[0082] Em outro aspecto, é fornecido um método para triagem de fumantes para câncer de pulmão, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo que é um fumante, os valores de marcadores biológicos, cada um correspondendo a um marcador biológico sobre um painel de N marcadores biológicos, em que os marcadores biológicos são selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 21, em que o indivíduo é classificado como tendo câncer de pulmão, ou a probabilidade de o indivíduo ter câncer de pulmão é determinada, com base em uma pontuação de classificação que se desvia de um valor limiar predeterminado, em que N = 3-15.
[0083] Em outro aspecto, é fornecido um método para diagnosticar a ausência de câncer de pulmão em um indivíduo, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, os valores de marcadores biológicos, cada um dos quais corresponde a pelo menos um dos N marcadores biológicos selecionados entre o grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 21, em que o dito indivíduo é classificado como não tendo câncer de pulmão com base na pontuação de classificação que se desvia de um valor limiar predeterminado, e em que N = 2-10.
[0084] Em outro aspecto, é fornecido um método implementado por computador para indicar uma probabilidade de câncer de pulmão. O método compreende: recuperar em um computador informação de marcador biológico para um indivíduo, em que a informação de marcador biológico compreende os valores de marcadores biológicos, os quais correspondem a pelo menos um dos N marcadores biológicos, em que N é, tal como acima definido, selecionado a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 21; executar com o computador uma classificação de cada um dos valores de marcadores biológicos; e, indicar uma probabilidade de que o indivíduo tem câncer de pulmão baseada em uma pluralidade de classificações.
[0085] Em outro aspecto, é fornecido um método implementado por computador para classificar um indivíduo como tendo ou não tendo câncer de pulmão. O método compreende: recuperar em um computador informação de marcador biológico para um indivíduo, em que a informação de marcador biológico compreende valores de marcadores biológicos cada um dos quais correspondendo a pelo menos um dos N marcadores biológicos selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos fornecidos na Tabela 21; executar com o computador uma classificação de cada um dos valores de marcadores biológicos; e indicar se o indivíduo tem câncer de pulmão baseado em uma pluralidade de classificações.
[0086] Em outro aspecto, é fornecido um produto de programa de computador para indicar uma probabilidade de câncer de pulmão. O produto de programa de computador inclui um meio legível por computador que contém o código de programa executável por um processador de um dispositivo ou sistema de computação, o código de programa compreendendo: código que recupera dados atribuídos a uma amostra biológica de um indivíduo, em que os dados compreendem valores de marcadores biológicos cada um dos quais corresponde a pelo menos um dos N marcadores biológicos, em que N é, tal como acima definido, na amostra biológica selecionada a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 21; e código que executa um método de classificação que indica uma probabilidade de que o indivíduo tem câncer de pulmão como um função dos valores de marcadores biológicos.
[0087] Em outro aspecto, é fornecido um produto de programa de computador para indicar um estado de câncer de pulmão de um indivíduo. O produto de programa de computador inclui um meio legível por computador que contém o código de programa executável por um processador de um dispositivo ou sistema de computação, o código de programa compreendendo: código que recupera dados atribuídos a uma amostra biológica de um indivíduo, em que os dados compreendem valores de marcadores biológicos cada um dos quais corresponde a pelo menos um dos N marcadores biológicos na amostra biológica, selecionados a partir do grupo de marcadores biológicos fornecidos na Tabela 21; e código que executa um método de classificação que indica um estado de câncer de pulmão do indivíduo como uma função dos valores de marcadores biológicos.
[0088] Em outro aspecto, é fornecido um método implementado por computador para indicar uma probabilidade de câncer de pulmão. O método compreende recuperar em um computador informação de marcador biológico para um indivíduo, em que a informação de marcador biológico compreende um valor de marcador biológico correspondente a um marcador biológico selecionado a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 21; executar com o computador uma classificação do valor de marcador biológico; e indicar uma probabilidade de que o indivíduo tem câncer de pulmão com base na classificação.
[0089] Em outro aspecto, é fornecido um método implementado por computador para a classificação de um indivíduo como tendo ou não tendo câncer de pulmão. O método compreende recuperar de um computador informação de marcador para um indivíduo, em que a informação de marcador biológico compreende um valor de marcador biológico correspondente a um marcador biológico selecionado a partir do grupo de marcadores biológicos fornecidos na Tabela 21; executar com o computador uma classificação do valor do marcador biológico; e indicar se o indivíduo tem câncer de pulmão com base na classificação.
[0090] Em ainda outro aspecto, é fornecido um produto de programa de computador para indicar uma probabilidade de câncer de pulmão. O produto de programa de computador inclui um meio legível por computador que contém o código de programa executável por um processador de um dispositivo ou sistema de computação, o código de programa compreendendo: código que recupera dados atribuídos a uma amostra biológica de um indivíduo, em que o valor dos dados compreende um marcador biológico correspondente a um marcador biológico na amostra biológica selecionada a partir do grupo de marcadores biológicos apresentados na Tabela 21; e código que executa um método de classificação que indica a probabilidade de que o indivíduo tem câncer de pulmão como uma função do valor do marcador biológico.
[0091] Em ainda outro aspecto, é fornecido um produto de programa de computador para indicar um estado de câncer de pulmão de um indivíduo. O produto de programa de computador inclui um meio legível por computador que contém o código de programa executável por um processador de um dispositivo ou sistema de computação, o código de programa compreendendo: código que recupera dados atribuídos a uma amostra biológica de um indivíduo, em que o valor dos dados compreende um marcador biológico correspondente a um marcador biológico na amostra biológica selecionada a partir do grupo de marcadores biológicos fornecidos na Tabela 21; e o código executa um método de classificação que indica um estado de câncer de pulmão do indivíduo como uma função do valor do marcador biológico.
[0092] Em um aspecto do pedido, pelo menos, um dos ditos marcadores biológicos N selecionadas a partir da Tabela 21, em cada um dos métodos acima é um marcador selecionado a partir da Tabela 20. Em ainda outra modalidade o dito marcador biológico selecionado a partir da Tabela 20 é o MMP-12.
[0093] Em outro aspecto, é fornecido um método para diagnosticar câncer de pulmão, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, os valores de marcadores biológicos, os quais correspondem a cada um dos marcadores biológicos sobre um painel de marcadores biológicos selecionados a partir do grupo de painéis apresentados nas Tabelas 22-25 em que uma classificação dos valores de marcadores biológicos indica que o indivíduo tem câncer de pulmão.
[0094] Em outro aspecto, é fornecido um método para diagnosticar a ausência de câncer de pulmão, o método incluindo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, os valores de marcadores biológicos, cada um correspondendo a um marcador biológico sobre um painel de marcadores biológicos selecionados a partir do grupo de painéis fornecidos nas Tabelas 22-25, em que a classificação dos valores de marcadores biológicos indica a ausência de câncer de pulmão no indivíduo.
Breve Descrição dos Desenhos
[0095] A figura 1A é um fluxograma para um método exemplificativo de detecção de câncer de pulmão em uma amostra biológica.
[0096] A figura 1B é um fluxograma para um método exemplificativo de detecção de câncer de pulmão, em uma amostra biológica utilizando um método de classificação de Bayes simples.
[0097] A figura 2 mostra uma curva ROC para um marcador biológico único, SCFsR, utilizando um classificador de Bayes simples para um teste que deteta o câncer de pulmão em fumantes assintomáticos.
[0098] A figura 3 mostra as curvas ROC para os painéis de marcador biológico de 1-10 marcadores biológicos utilizando classificadores de Bayes simples para um teste que deteta o câncer de pulmão em fumantes assintomáticos.
[0099] A figura 4 ilustra o aumento da pontuação de classificação (especificidade + sensibilidade) enquanto o número de marcadores biológicos é aumentado de um para dez utilizando a classificação de Bayes simples para um painel de câncer benigno de nódulo de pulmão.
[00100] A figura 5 mostra distribuições de marcadores biológicos medidos para SCFsR como uma função de distribuição cumulativa (CDF) em RFU transformados por logaritmo para o grupo de controle de nódulo benigno (linha cheia) e o grupo de doença de câncer de pulmão (linha tracejada), juntamente com suas curvas de ajuste a uma cdf normal (linhas tracejadas) usadas para treinar classificadores de Bayes simples.
[00101] A figura 6 ilustra um sistema de computador exemplificativo para a utilização com os vários métodos implementados em computador aqui descritos.
[00102] A figura 7 é um fluxograma de um método de indicação da probabilidade de que um indivíduo tem câncer de pulmão de acordo com uma modalidade.
[00103] A figura 8 é um fluxograma de um método de indicação da probabilidade de que um indivíduo tem câncer de pulmão de acordo com uma modalidade.
[00104] A figura 9 ilustra um ensaio de aptâmero exemplificativo que pode ser usado para detectar um ou mais marcadores biológicos de câncer de pulmão, em uma amostra biológica.
[00105] A figura 10 mostra um histograma de frequências para o qual foram utilizados marcadores biológicos na construção de classificadores para distinguir entre NSCLC e nódulos benignos a partir de um conjunto agregado de marcadores biológicos potenciais.
[00106] A figura 11 mostra um histograma de frequências para o qual foram utilizados marcadores biológicos na construção de classificadores para distinguir entre NSCLC e fumantes assintomáticos a partir de um conjunto agregado de marcadores biológicos potenciais.
[00107] A figura 12 mostra um histograma de frequências para o qual foram utilizados marcadores biológicos na construção de classificadores para distinguir entre NSCLC e nódulos benignos de um conjunto de marcadores biológicos potenciais em locais consistentes.
[00108] A figura 13 mostra um histograma de frequências para o qual foram utilizadas em marcadores biológicos classificadores de construção para distinguir entre NSCLC e fumantes assintomáticos a partir de um conjunto de marcadores biológicos potenciais em locais consistentes.
[00109] A figura 14 mostra um histograma de frequências para o qual foram utilizados marcadores biológicos na construção de classificadores para distinguir entre NSCLC e nódulos benignos a partir de um conjunto de marcadores biológicos potenciais que resultam de uma combinação de marcadores agregados e em locais consistentes.
[00110] A figura 15 mostra um histograma de frequências para o qual foram utilizados marcadores biológicos na construção de classificadores para distinguir entre NSCLC e fumantes assintomáticos a partir de um conjunto de marcadores biológicos potenciais que resultam de uma combinação de marcadores agregados e em locais consistentes.
[00111] A figura 16 mostra imagens de gel resultantes de experiências para baixo que ilustram a especificidade dos aptâmeros como reagentes de captura para proteínas LBP, C9 e IgM. Para cada gel, a pista 1 é o eluato a partir dos glóbulos de Estreptavidina- agarose, a pista 2 é o eluato final, e pista é uma pista de marcador MW (faixas principais são a 110, 50, 30, 15, e 3,5 kDa a partir de cima para baixo, ).
[00112] A figura 17A mostra um par de histogramas resumindo todas as possíveis pontuações de classificador de Bayes simples de proteínas simples (sensibilidade + especificidade) utilizando os marcadores biológicos indicados na Tabela 1, Coluna 5 (sólido) e um conjunto de marcadores aleatórios (pontilhado).
[00113] A figura 17B mostra um par de histogramas resumindo todas as possíveis pontuações de classificador de Bayes simples de proteínas duplas (sensibilidade + especificidade) utilizando os marcadores biológicos indicados na Tabela 1, Coluna 5 (sólido) e um conjunto de marcadores aleatórios (pontilhado).
[00114] A figura 17C mostra um par de histogramas resumindo todas as possíveis pontuações de classificador de Bayes simples de proteínas triplas (sensibilidade + especificidade) utilizando os marcadores biológicos indicados na Tabela 1, Coluna 5 (sólido) e um conjunto de marcadores aleatórios (pontilhado).
[00115] A figura 18A mostra um par de histogramas resumindo todas as possíveis pontuações de classificador de Bayes simples de proteínas simples (sensibilidade + especificidade) utilizando os marcadores biológicos indicados na Tabela 1, Coluna 6 (sólido) e um conjunto de marcadores aleatórios (pontilhado).
[00116] A figura 18B mostra um par de histogramas resumindo todas as possíveis pontuações de classificador de Bayes simples de proteínas duplas (sensibilidade + especificidade) utilizando os marcadores biológicos indicados na Tabela 1, Coluna 6 (sólido) e um conjunto de marcadores aleatórios (pontilhado).
[00117] A figura 18C mostra um par de histogramas resumindo todas as possíveis pontuações de classificador de Bayes simples de proteínas triplas (sensibilidade + especificidade) utilizando os marcadores biológicos indicados na Tabela 1, Coluna 6 (sólido) e um conjunto de marcadores aleatórios (pontilhado).
[00118] Figura 19A mostra a pontuação de sensibilidade + especificidade para classificadores de Bayes simples usando 2-10 marcadores selecionados a partir do painel completo (♦) e as pontuações obtidas reduzindo aos melhores 5 (■), 10 (▲) e 15 (x) marcadores durante a geração de classificador para o grupo de controle de nódulo benigno.
[00119] Figura 19B mostra a pontuação de sensibilidade + especificidade para classificadores de Bayes simples usando 2-10 marcadores selecionados a partir do painel completo (♦) e as pontuações obtidas reduzindo aos melhores 5 (■), 10 (▲) e 15 (x) marcadores durante a geração de classificador para o grupo de controle de fumante.
[00120] A figura 20A mostra um conjunto de curvas ROC modeladas a partir dos dados das Tabelas 38 e 39 para painéis de 1-5 marcadores.
[00121] A figura 20B mostra um conjunto de curvas ROC calculado a partir dos dados de treinamento para painéis de 1-5 marcadores como na Figura 19A.
[00122] A figura 21 mostra as alterações relativas na expressão de proteína para 813 proteínas de oito amostras de resecção NSCLC entre tecido adjacente e distante (Figura 21A), tecido tumoral e tecido adjacente (Figura 21B) e tecido tumoral e tecido distante (Figura 21C), expressa como razões medianas de log2. A linha tracejada representa uma mudança de duas dobras (log2 = 1).
[00123] A figura 22 mostra um mapa de calor de níveis de proteína em amostras de tecidos tumorais. As amostras são organizadas em colunas e são separadas em amostras adjacentes, distantes, e de tumor. Dentro de cada tipo de tecido, as amostras são separadas em adenocarcinoma (AC) e carcinoma espinocelular (CEC). Os números acima de cada coluna correspondem a códigos de paciente. As proteínas são exibidas em linhas e foram ordenadas usando agrupamento hierárquico.
[00124] A figura 23 (A-T) descreve proteínas com níveis aumentados no tecido de tumor em comparação com o tecido adjacente ou distante.
[00125] A figura 24 (A-P) descreve proteínas com níveis reduzidos no tecido de tumor em comparação com o tecido adjacente ou distante das oito amostras NSCLC utilizadas neste estudo.
[00126] A Figura 25 mostra histoquímica SOMAmer em seções de tecidos congelados para marcadores biológicos selecionados detectados neste estudo. (A) Trombospondina-2 (vermelho) colorindo a matriz fibrocolagenosa em torno de um ninho de tumor. (B) Correspondendo a espécime de pulmão normal colorido com Trombospondina-2 SOMAmer (vermelho). (C) Receptor de Manose de Macrófago SOMAmer (vermelho) colorindo macrófagos dispersos em um adenocarcinoma de pulmão. (D) Receptor de Manose de Macrófagos SOMAmer (vermelho) colorindo numerosos macrófagos alveolares em uma seção de parênquima pulmonar normal. (E) Imagem Multicolorida destacando a distribuição citomorfológica de Receptor de Manose de Macrófagos SOMAmer colorindo: Verde = Citoqueratina (anticorpos AE1/AE3), Vermelho = CD31 (Anticorpo EP3095) e Laranja = SOMAmer. Todos os núcleos nesta figura são contrastados com DAPI.
[00127] A Figura 26 mostra as alterações na expressão de proteína em tecidos NSCLC em comparação com soro. Os dois painéis superiores mostram a relação log2 (LR) derivada a partir de amostras de soro contra relações de log derivadas de tecido adjacente e tecido distante, respectivamente. Os últimos quatro painéis apresentam partes de plotagens acima, indicadas pela cor da plotagem (verde para expressão diminuida e vermelho para expressão aumentada em comparação ao tecido não-tumoral). Analiticos mostrados nas Figuras 23 e 24, foram rotulados e os analiticos mencionados na publicação sobre as amostras de soro são mostrados em símbolos vermelhos cheios.
[00128] A figura 27 ilustra a identificação histoquímica de Trombospondina-2 em amostras de tecido. A Trombospondina-2 é identificada em uma seção congelada em série de um único espécime de carcinoma de pulmão por (A) um anticorpo policlonal de trombospondina-2 policlonal de coelho caseiro, (B) o soro pré-imune de coelhos utilizados para fazer o anticorpo caseiro policlonal, (C) um anticorpo comercial (Novus) de trombospondina-2 policlonal de coelho, e (D) a trombospondina-2 SOMAmer. A trombospondina-2 SOMAmer foi então usada para colorir seções congeladas de tecido pulmonar normal e maligno, com o desenvolvimento de cor padrão de Avidina- Biotina-Peroxidase, para demonstrar diferentes distribuições morfológicas: (E) Coloração forte do estroma fibrótico circundando ninhos tumorais, com mínima coloração citosólica de células de carcinoma, (F) Coloração forte do estroma fibrótico circundando ninhos tumorais em um adenocarcinoma mucinoso, sem coloração significativa das células de carcinoma, (G) tecido pulmonar normal, mostrando coloração citoplasmática forte do epitélio brônquico e dispersos macrófagos alveolares e (H) coloração citoplasmática forte de um adenocarcinoma, sem coloração significativa do estroma não fibrótico, predominantemente estroma inflamatório.
DESCRIÇÃO DETALHADA
[00129] A prática da invenção aqui revelada divulgada emprega, a menos que indicado em contrário, métodos convencionais de química, microbiologia, biologia molecular e técnicas de DNA recombinantes dentro do nível dos peritos na técnica. Tais técnicas estão totalmente explicadas na literatura. Ver, p.ex., Sambrook, et al. Molecular Cloning: A Laboratory Manual (edição atual); DNA cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., Edição Atual.); Nuclei Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds., Edição Atual.); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., Edição Atual; Histology for Pathologists (S.E. Mills, Edição Atual) Todas as publicações, documentos de patentes publicados, e pedidos de patente citadas nesta especificação são indicativos do nível dos peritos na(s) técnica(s ), às quais a invenção pertence. Todas as publicações, documentos de patentes publicados, e pedidos de patente aqui citados são aqui incorporados por referência na mesma extensão como se cada publicação individual, documento de patente publicado, ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente indicada como sendo incorporada por referência.
[00130] Referência será feita agora em detalhe às modalidades representativas da invenção. Embora a invenção seja descrita em conjunto com as modalidades enumeradas, faz-se observar que não se pretende que a invenção seja limitada a essas modalidades. Pelo contrário, a invenção destina-se a cobrir todas as alternativas, modificações e equivalentes que possam ser incluídas dentro do âmbito da presente invenção tal como definida pelas reivindicações.
[00131] A menos que definido de outro modo, os termos técnicos e científicos aqui utilizados têm o mesmo significado que normalmente entendido por alguem de cnhecimento comum na técnica à qual esta invenção pertence. Embora quaisquer métodos, dispositivos e materiais semelhantes ou equivalentes aos aqui descritos possam ser utilizados na prática ou testes da invenção, os métodos, aparelhos e materiais preferidos são agora descritos.
[00132] Conforme utilizado no presente pedido, incluindo as reivindicações anexas, as formas singulares "um", "uma", e "a" incluem referências no plural, a menos que o conteúdo dite claramente de outro modo, e são usados alternadamente com "pelo menos um" e "um ou mais". Assim, a referência a "um aptâmero" inclui as misturas de aptâmeros, a referência a "uma sonda" inclui misturas de sondas, e semelhantes.
[00133] Conforme aqui utilizado, o termo "cerca" representa uma modificação ou variação insignificante do valor numérico de tal modo que a função básica do ponto para o qual o valor numérico se refere é inalterada.
[00134] Conforme aqui utilizado, os termos "compreende", "compreendendo", "inclui", "incluindo", "contém", "contendo", e qualquer variação dos mesmos, destinam-se a cobrir uma inclusão não exclusiva, de tal forma que um processo, método, produto-por- processo, ou composição de matéria que compreende, inclui, ou contém um elemento ou uma lista de elementos não inclui apenas esses elementos mas pode incluir outros elementos que não estejam expressamente listados ou inerentes a tal processo, método, produto- por-processo, ou composição de matéria.
[00135] O presente pedido inclui marcadores biológicos, métodos, equipamentos, reagentes, sistemas e conjuntos para a detecção e diagnóstico de câncer de pulmão.
[00136] Em um aspecto, um ou mais marcadores biológicos são fornecidos para uso tanto por si só como em várias combinações para diagnosticar o câncer de pulmão, permitir o diagnóstico diferencial de nódulos pulmonares como benigno ou maligno, monitorar recorrência do câncer de pulmão, ou endereçar outras indicações clínicas. Em outros aspectos o(s) dito(s) marcador biológico (es) pode(m) ser usado(s) na determinação de informação sobre o câncer de pulmão de um indivíduo, tal como, o prognóstico, a classificação do câncer, a previsão de uma probabilidade de doença ou a seleção do tratamento. Como descrito em detalhe a seguir, modalidades exemplificativas incluem os marcadores biológicos fornecidos nas Tabelas 18, 20 e 21, que foram identificados utilizando um ensaio multiplexado baseado de aptâmero que é genericamente descrito no Exemplo 1 e, mais especificamente, nos Exemplos 2 e 6. Cada um dos marcadores biológicos é útil no ensaio de qualquer tipo de amostra, tal como definido abaixo.
[00137] A Tabela 1, Col. 2 apresenta os resultados obtidos a partir da análise de centenas de amostras de sangue individuais de casos de câncer NSCLC, e centenas de amostras de sangue equivalentes individuais de fumantes e de pessoas com diagnóstico de nódulos pulmonares benignos. Os grupos de fumantes e de nódulos benignos foram projetados para atender as populações com as quais um teste de diagnóstico de câncer de pulmão de pode ter o maior benefício. (Estes casos e controles foram obtidos a partir de vários locais clínicos para imitar a gama de condições reais mundiais em que tal teste pode ser aplicado). Os marcadores biológicos potenciais foram medidos em amostras individuais, em vez de reunir a doença e o sangue de controle, o que permitiu uma melhor compreensão das diferenças individuais e de grupo nos fenótipos associados com a presença ou ausência de doença (neste caso o câncer de pulmão). Uma vez que mais de 800 medidas de proteína foram feitas em cada amostra, e várias centenas de amostras de cada uma das doenças e das populações de controle foram medidas individualmente, a Tabela 1, coluna 2 resultou a partir de uma análise de um conjunto extraordinariamente grande de dados. As medidas foram analisadas usando os métodos aqui descritos na seção "Classificação de Marcadores biológicos e Cálculo de Pontuação de Doença".
[00138] A Tabela 1, coluna 2 lista os marcadores biológicos verificados serem úteis em amostras obtidas a partir de indivíduos particulares com NSCLC a partir de amostras de "controle" obtidas de fumantes e indivíduos com nódulos pulmonares benignos. Utilizando um ensaio multiplexado de aptâmero como aqui descrito, foram descobertos trinta e oito marcadores biológicos, os quais distinguiram as amostras obtidas a partir de indivíduos que tiveram câncer de pulmão das amostras obtidas a partir de indivíduos no grupo de controle fumante (ver Tabela 1, coluna 6). Da mesma forma, utilizando um ensaio multiplexado de aptâmero, foram descobertos quarenta marcadores biológicos os quais distinguiram amostras obtidas a partir de indivíduos com NSCLC de amostras obtidas a partir de pessoas que tinham nódulos pulmonares benignas (ver Quadro 1, coluna 5). Juntas, as duas listas de 38 e 40 marcadores biológicos são compostos de 61 marcadores biológicos singulares, porque existe uma considerável sobreposição entre a lista de marcadores biológicos para distinguir NSCLC de nódulos benignos e da lista para distinguir NSCLC de fumantes que não têm câncer de pulmão.
[00139] A Tabela 18 apresenta os resultados obtidos a partir da análise de oito amostras de tecido individuais dos fumantes com diagnóstico de NSCLC, tal como descrito no Exemplo 6. Todos os pacientes eram fumantes que variavam de 47 a 75 anos de idade e cobrindo os estágios 1A até 3B de NSCLC. Três amostras foram obtidas a partir de cada indivíduo: tecido de tumor, tecido saudável adjacente (a 1 cm do tumor) e tecido pulmonar distante não envolvido. As amostras foram escolhidas para coincidir com as populações com as quais um teste de diagnóstico de câncer de pulmão pode ter o maior benefício. Os marcadores biológicos potenciais foram medidos em amostras individuais, em vez de reunir a doença e tecido de controle, o que permitiu uma melhor compreensão das variações individuais e de grupo nos fenótipos associados com a presença ou ausência de doença (neste caso o câncer de pulmão). As medidas foram analisadas pelo teste de Mann-Whitney.
[00140] A Tabela 18 lista os marcadores biológicos verificados serem úteis em distinguir amostras obtidas a partir de indivíduos com NSCLC de amostras de "controle" obtidas a partir de tecido pulmonar adjacente e distante não envolvidos com câncer de pulmão obtidos dos mesmos indivíduos. Utilizando um ensaio multiplexado de aptâmero como aqui descrito, foram descobertos trinta e seis marcadores biológicos que distinguiram as amostras de tecido de tumor das amostras obtidas a partir de tecido pulmonar adjacente e distante em indivíduos que tinham sido diagnosticados com NSCLC. Com referência à Tabela 1, col. 2, pode-se ver que onze dos marcadores biológicos se sobrepõem àquelas identificadas em amostras de soro como descrito no Exemplo 2. Um marcador adicional o qual não foi medido no perfil inicial de soro, MMP-12, foi encontrado ser útil como marcador biológico tanto em soro quanto em tecido. A Tabela 21 fornece uma lista do número total de marcadores (oitenta e seis), identificados em ambas as amostras de soro e de tecido de tumor combinadas. A Tabela 20 apresenta uma lista dos marcadores biológicos identificados que foram únicos para as amostras de tecido de tumor (vinte e cinco).
[00141] Embora alguns dos marcadores biológicos de câncer de pulmão descritos são úteis por si só para a detectar e diagnosticar câncer de pulmão, são também descritos aqui métodos para o agrupamento dos vários subconjuntos dos marcadores biológicos de câncer de pulmão, em que cada grupo ou subgrupo de seleção é útil como um painel de três ou mais marcadores biológicos, intercambiavelmenete aqui referidos como um "painel de marcador biológico" e um painel. Assim, várias modalidades do presente pedido de patente proporcionam combinações que compreendem N marcadores, em que N é de pelo menos dois marcadores biológicos. Em outras modalidades, N é selecionado de 2-86 marcadores biológicos (Tabela 21); 2-36 marcadores biológicos (Tabela 18) ou 225 marcadores biológicos (Tabela 20). Em outras modalidades, N é selecionado de 2-86 (Tabela 21) e, pelo menos, um dos ditos N marcadores biológicos é MMP-12. Em outras modalidades, N é selecionado de 2-25 (Tabela 20) e, pelo menos, um dos ditos N marcadores biológicos é MMP-12. Os painéis representativos de 2-5 marcadores biológicos incluindo MMP-12, como um dos marcadores são apresentados nas Tabelas 22-25.
[00142] Em ainda outras modalidades, os marcadores biológicos são selecionados entre os listados na Tabela 18 e N é selecionado para ser qualquer número de 2-7, 2-10, 2-15, 2-20, 2-25, 2-30, 2-36. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 3-7, 3-10, 3-15, 3-20, 3-25, 3-30, 3-36. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 4-7, 4-10, 4-15, 4-20, 4-25, 4-30, 4-36. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 5-7, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 5-36. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 6-10, 615, 6-20, 6-25, 6-30, 6-36. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 7-10, 7-15, 7-20, 7-25, 7-30, 7-36. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 810, 8-15, 8-20, 8-25, 8-30, 8-36. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 9-15, 9-20, 9-25, 9-30, 9-36. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 10-15, 10-20, 10-25, 10-30, 10-36. Será apreciado que o N pode ser selecionado para abranger faixas semelhantes, mas de ordem mais elevada.
[00143] Em ainda outras modalidades os marcadores biológicos são selecionados entre os listados na Tabela 20 e N é selecionado para ser qualquer número de 2-7, 2-10, 2-15, 2-20, 2-25. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 3-7, 3-10, 3-15, 3-20, 3-25. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 4-7, 4-10, 4-15, 4-20, 4-25. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 5-7, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 6-10, 6-15, 6-20, 6-25. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 7-10, 7-15, 7-20, 7-25. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 810, 8-15, 8-20, 8-25. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 9-15, 9-20, 9-25. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 10-15, 10-20, 10-25. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 915, 9-20, 9-25. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 10-15, 10-20, 10-25. Será apreciado que o N pode ser selecionado para abranger faixas semelhantes, mas de ordem mais elevada.
[00144] Em ainda outras modalidades os marcadores biológicos são selecionados entre os listados na Tabela 21 e N é selecionado para ser qualquer número de 2-7, 2-10, 2-15, 2-20, 2-25, 2-30, 2-35, 240, 2-45, 2-50, 2-55, 2-60, 2-65, 2-70, 2-75, 2-80, ou 2-86. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 3-7, 3-10, 3-15, 3-20, 3-25, 3-30, 3-35, 3-40, 3-45, 3 - 50, 3-55, 3-60, 3-65, 3-70, 3-75, 3-80, ou 3-86. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 4-7, 4-10, 4-15, 4-20, 4-25, 4-30, 4-35, 4-40, 4-45, 4 - 50, 4-55, 4-60, 4-65, 4-70, 4-75, 4-80, ou 4-86. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 5-7, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 5-35, 5-40, 5-45, 5 - 50, 5-55, 5-60, 5-65, 5-70, 5-75, 5-80, ou 5-86. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 6-10, 6-15, 6-20, 6-25, 6-30, 6-35, 6-40, 6-45, 650, 6 - 55, 6-60, 6-65, 6-70, 6-75, 6-80, ou 6-86. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 7-10, 7- 15, 7-20, 7-25, 7-30, 7-35, 7-40, 7-45, 7-50, 7 - 55, 7-60, 7-65, 7-70, 775, 7-80, ou 7-86. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 8-10, 8-15, 8-20, 8-25, 8-30, 8-35, 8-40, 8-45, 850, 8 - 55, 8-60, 8-65, 8-70, 8-75, 8-80, ou 8-86. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 9-15, 920, 9-25, 9-30, 9-35, 9-40, 9-45, 9-50, 9-55, 9 - 60, 9-65, 9-70, 9-75, 980, ou 9-86. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 10-15, 10-20, 10-25, 10-30, 10-35, 10-40, 10-45, 10-50, 10-55, 10 - 60, 10-65, 10-70, 10-75, 10-80, ou 10-86. Será apreciado que o N pode ser selecionado para abranger faixas semelhantes, mas de ordem mais elevada.
[00145] Em uma modalidade, o número de marcadores biológicos úteis para um subconjunto de marcadores biológicos ou painel é baseado no valor de sensibilidade e especificidade para a combinação particular de valores de marcadores biológicos. O termo "sensibilidade" e "especificidade" são aqui utilizados no que diz respeito à capacidade de classificar corretamente um indivíduo, com base em um ou mais valores de marcadores biológicos detectados na amostra biológica, como tendo câncer de pulmão ou de não ter câncer de pulmão. "Sensibilidade" indica que o desempenho do(s) marcador biológico(es) em relação à classificar corretamente os indivíduos que têm câncer de pulmão. "Especificidade" indica que o desempenho do(s) marcador biológico(es) em relação à classificar corretamente os indivíduos que não têm o câncer de pulmão. Por exemplo, a especificidade de 85% e sensibilidade de 90% para um painel de marcadores utilizados para testar um conjunto de amostras de controle e amostras de câncer de pulmão indica que 85% das amostras de controle foram classificadas corretamente como amostras de controle pelo painel, e 90% das amostras de câncer de pulmão foram corretamente classificadas como amostras de câncer de pulmão pelo painel. O valor mínimo desejado ou preferido pode ser determinado como descrito no Exemplo 3.
[00146] Em um aspecto, o câncer de pulmão é detectado ou diagnosticado em um indivíduo através da realização de um ensaio de uma amostra biológica do indivíduo e detectando valores de marcadores biológicos, cada um dos quais correspondendo a pelo menos um dos marcadores biológicos MMP-7, MMP-12, ou IGFBP-2 e, pelo menos, N marcadores biológicos adicionais selecionados a partir da lista de marcadores biológicos na Tabela 21, em que N é igual a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15. Em um aspecto adicional, o câncer de pulmão é detectado ou diagnosticado em um indivíduo através da realização de um ensaio de uma amostra biológica do indivíduo e detectando valores de marcadores biológicos, que correspondem a cada um dos marcadores biológicos MMP-7, MMP-12, ou a IGFBP-2 e um de pelo menos, N marcadores biológicos adicionais selecionados a partir da lista de marcadores biológicos na Tabela 21, em que N é igual a 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13. Em um aspecto adicional, o câncer de pulmão é detectado ou diagnosticado em um indivíduo através da realização de um ensaio de uma amostra biológica do indivíduo e detectando valores de marcadores biológicos, cada um correspondendo ao marcador biológico MMP-7 e um de, pelo menos, N marcadores biológicos adicionais selecionados a partir da lista de marcadores biológicos na Tabela 21, em que N é igual a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15. Em um aspecto adicional, o câncer de pulmão é detectado ou diagnosticado em um indivíduo através da realização de um ensaio de uma amostra biológica do indivíduo e detectando valores de marcadores biológicos, cada um dos quais correspondem ao marcador biológico MMP-12 e um de, pelo menos, N marcadores biológicos adicionais selecionados a partir da lista de marcadores biológicos na Tabela 21, em que N é igual a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15. Em um aspecto adicional, o câncer de pulmão é detectado ou diagnosticado em um indivíduo através da realização de um ensaio de uma amostra biológica do indivíduo e detectando valores de marcadores biológicos, cada um correspondendo ao marcador biológico IGFBP-2 e um de, pelo menos, N marcadores biológicos adicionais selecionados a partir da lista de marcadores biológicos na Tabela 21, em que N é igual a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15.
[00147] Os marcadores biológicos de câncer de pulmão aqui identificados representam um número relativamente grande de escolhas para subconjuntos ou painéis de marcadores biológicos que podem ser utilizados para detectar ou diagnosticar eficazmente o câncer de pulmão. A seleção do número desejado de tais marcadores biológicos depende da combinação específica de marcadores biológicos selecionados. É importante lembrar que os painéis de marcadores biológicos para a detecção ou diagnóstico de câncer de pulmão podem também incluir marcadores biológicos que não são encontrados nas tabelas 18, 20 ou 21, e que a inclusão de marcadores biológicos adicionais não encontrados nas Tabelas 18, 20 ou 21, pode reduzir o número de marcadores biológicos em um determinado subconjunto ou o painel que é selecionado a partir das Tabelas 18, 20 ou 21. O número de marcadores biológicos a partir das Tabelas 18, 20 ou 21, usado em um subconjunto ou o painel também pode ser reduzido, se a informação biomédica adicional é usada em conjunto com os valores de marcadores biológicos para estabelecer a sensibilidade e especificidade aceitável para um dado ensaio.
[00148] Um outro fator que pode afetar o número de marcadores biológicos para ser usado em um subconjunto ou um painel de marcadores biológicos são os processos utilizados para a obtenção de amostras biológicas de indivíduos que estão sendo diagnosticados para câncer de pulmão. Em um ambiente de aquisição de amostra cuidadosamente controlado, o número de marcadores biológicos necessários para satisfazer os valores de sensibilidade e de especificidade desejados será menor do que em uma situação em que não pode haver mais variação na coleta manuseio e armazenagem de amostras. No desenvolvimento da lista de marcadores biológicos estabelecidos nas Tabelas 18, 20 ou 21, múltiplos locais de coleta de amostras foram utilizados para coletar dados de treinamento de classificador. Isto fornece marcadores biológicos mais robustos, que são menos sensíveis a variações na coleta manuseio e armazenagem de amostras, mas pode também requerer que o número de marcadores biológicos em um subconjunto ou o painel seja maior do que se os dados de treinamento fossem todos obtidos em condições semelhantes.
[00149] Um aspecto do presente pedido de patente pode ser descrito genericamente com referência às Figuras 1A e B. Uma amostra biológica é obtida de um indivíduo ou indivíduos de interesse. A amostra biológica é então testada para detectar a presença de um ou mais (N) marcadores biológicos de interesse e para determinar um valor de marcadores biológicos para cada um dos ditos N marcadores (referido na Figura 1B como marcador RFU). Uma vez que um marcador biológico foi detectado e atribuído um valor de marcador biológico, cada marcador é pontuado ou classificadas como aqui descrito em detalhe. As pontuações de marcadores são então combinadas para proporcionar uma pontuação total de diagnóstico, que indica a probabilidade de que o indivíduo de quem a amostra foi obtida tem câncer de pulmão.
[00150] Conforme aqui utilizado, "pulmão" pode ser indiferentemente referido como "pulmonar".
[00151] Conforme aqui utilizado, "fumante" refere-se a um indivíduo que tem uma história de inalação do fumo de tabaco.
[00152] "Amostra biológica", "amostra", e "amostra de teste" são aqui utilizados indiferentemente para se referir a qualquer material, fluido biológico, tecido ou célula obtida de outro modo derivada de um indivíduo. Isto inclui sangue (incluindo sangue total, leucócitos, células mononucleares do sangue periférico, revestimento da cor de couro, plasma, e soro), expectoração, lágrimas, muco, lavagens nasais, aspirado nasal, respiração, urina, sémen, saliva, fluidos das meninges, líquido amniótico, fluido glandular, fluido linfático, aspirado de mamilo, aspirado brônquico, fluido sinovial, aspirado de articulação, células, um extracto celular, e fluido cérebro-espinal. Isto também inclui as frações separadas experimentalmente de todos os precedentes. Por exemplo, uma amostra de sangue pode ser fraccionada em soro ou em frações contendo determinados tipos de células do sangue, tais como as células vermelhas do sangue ou células brancas do sangue (leucócitos). Se desejado, a amostra pode ser uma combinação de amostras de um indivíduo, tal como uma combinação de uma amostra de tecido e fluido. O termo "amostra biológica", também inclui materiais que contenham material sólido homogeneizado, tal como de uma amostra de fezes, uma amostra de tecido, ou de uma biópsia de tecido, por exemplo. O termo "amostra biológica", também inclui materiais derivados de uma cultura de tecido ou de uma cultura de células. Quaisquer métodos adequados para a obtenção de uma amostra biológica podem ser empregados; métodos exemplificativos incluem, por exemplo, flebotomia, cotonete (por exemplo, cotonete bucal), e um procedimento de biópsia de aspirado de agulha fina. Tecidos exemplificativos suscetíveis a aspiração com agulha fina incluem gânglios linfáticos, pulmão, lavagens de pulmão, BAL (lavagem broncoalveolar), tireóide, mama e fígado. As amostras também podem ser coletadas, por exemplo, por meio de micro dissecção (por exemplo, micro dissecção de captura a laser (LCM) ou micro dissecção a laser (LMD)), lavagem da bexiga, esfregaço (por exemplo, um teste de Papanicolaou), ou lavagem ductal. Uma "amostra biológica", obtida ou derivada de um indivíduo inclui qualquer uma de tais amostras que foi processada por qualquer forma adequada depois de ser obtida do indivíduo.
[00153] A "amostra de tecido" ou "tecido" refere-se a um determinado subconjunto das amostras biológicas descritas acima. De acordo com esta definição, os tecidos são conjuntos de macromoléculas em um ambiente heterogêneo. Tal como aqui utilizado, tecido refere-se a um único tipo de células, uma coleção de tipos de células, um agregado de células, ou um agregado de macromoléculas. Os tecidos são geralmente uma matriz física de macromoléculas que podem ser tanto fluida quanto rígida, tanto em termos de estrutura quanto de composição. A matriz extracelular é um exemplo de um tecido mais rígido, tanto estruturalmente quanto de composição, enquanto que uma camada dupla de membrana é mais fluida na sua estrutura e composição. Tecido inclui, mas não está limitado a, um agregado de células, normalmente de um tipo particular, juntamente com a sua substância intercelular, que forma um dos materiais estruturais mais usados para denotar o tecido celular geral de um determinado órgão, por exemplo, tecido de rim, tecido cerebral, tecido de pulmão. As quatro classes gerais de tecidos são o tecido epitelial, tecido conjuntivo, tecido nervoso, e tecido muscular. Métodos para identificar aptâmeros lentos fora de taxa para alvos de tecido são descritos na Publicação do Pedido Internacional N°. WO 2011/006075, publicado em 13 de Janeiro de 2011, que é aqui incorporado por referência na sua totalidade.
[00154] Exemplos de tecidos que se enquadram no âmbito desta definição incluem, mas não estão limitados a, agregados heterogêneos de macromoléculas, tais como a formação de coágulos de fibrina, que são acelulares; agregados homogêneos ou heterogêneos de células, maiores estruturas ordenadas contendo células que têm uma função específica, tais como órgãos, tumores, gânglios linfáticos, artérias, etc, e células individuais. Os tecidos ou células podem estar no seu ambiente natural, isolados, ou em cultura de tecidos. O tecido pode estar intacto ou modificado. A modificação pode incluir várias alterações, tais como transformação, transfecção, ativação e isolamento de subestrutura, por exemplo, membranas de células, núcleos das células, organelos celulares, etc.
[00155] Fontes de tecido, estruturas celulares ou subcelulares pode ser obtidas a partir de procariotos, bem como eucariotos. Isto inclui ser humano, animal, vegetal, estruturas bacterianas, fúngicas e virais.
[00156] Além disso, deve-se compreender que uma amostra biológica pode ser derivada tomando amostras biológicas de um grande número de indivíduos e agrupando-as ou agrupando uma alíquota de cada amostra biológica de cada indivíduo. A amostra combinada pode ser tratada como uma amostra de um único indivíduo, e se a presença de câncer é estabelecida na amostra combinada, em seguida, cada amostra biológica individual pode ser retestada para determinar qual(is) indivíduo(s) têm o câncer de pulmão.
[00157] Para os fins desta especificação, a expressão "dados atribuídos a uma amostra biológica de um indivíduo" pretende-se significar que os dados em uma forma derivada, ou foram gerados utilizando, a amostra biológica do indivíduo. Os dados podem ter sido reformatados, revistos, ou matematicamente alterados de alguma forma, depois de terem sido gerados, por exemplo, por conversão a partir de unidades de um sistema de medida para unidades de outro sistema de medida; mas, os dados são entendidos como tendo sido derivados a partir de, ou foram gerados utilizando, a amostra biológica.
[00158] "Alvo", "molécula alvo" e "analito" são aqui utilizados indiferentemente para se referir a qualquer molécula de interesse que pode estar presente em uma amostra biológica. A "molécula de interesse" inclui qualquer alteração menor de uma molécula específica, tal como, no caso de uma proteína, por exemplo, pequenas variações de sequência de aminoácidos, formação de ligação dissulfureto, glicosilação, lipidação,acetilação, fosforilação ou qualquer outra manipulação ou modificação, tal como conjugação com um componente de marcação, o que não altera substancialmente a identidade da molécula. A "molécula alvo", "alvo", ou "analito" é um conjunto de cópias de um tipo ou espécies de molécula ou estrutura multi-molecular. "Moléculas-alvo", "alvos" e "analitos" referem-se a mais de um conjunto de tais moléculas. Moléculas alvo exemplificativas incluem proteínas, polipéptidos, ácidos nucleicos, hidratos de carbono, lípidios, polissacáridios, glicoproteínas, hormonas, receptores, antígenos, anticorpos, corpos de afinidade, imitadores de anticorpos, vírus, agentes patogênicos, substâncias tóxicas, substratos, metabólitos, análogos de estado de transição, cofatores, inibidores, drogas, corantes, nutrientes, fatores de crescimento, células, tecidos e qualquer fragmento ou parte de qualquer um dos anteriores.
[00159] Conforme aqui utilizado, "polipeptídeo" péptido "," e "proteína" são aqui utilizados indiferentemente para se referir a polímeros de aminoácidos de qualquer comprimento. O polímero pode ser linear ou ramificado, o que pode compreender os aminoácidos modificados e pode ser interrompido por não-aminoácidos. Os termos também abrangem um polímero de aminoácidos que foi modificado naturalmente ou por intervenção, por exemplo, formação de ligações de dissulfureto, glicosilação, lipidação, acetilação, fosforilação ou qualquer outra modificação, tal como conjugação com um componente de marcação. Também estão incluídos dentro da definição, por exemplo, polipéptideos contendo um ou mais análogos de um aminoácido (incluindo, por exemplo, aminoácidos não naturais, etc), bem como outras modificações conhecidas na técnica. Polipeptídeos podem ser cadeias simples ou correntes associadas. Também estão incluídos dentro da definição as proteínas intactas e as pré-proteínas maduras; péptidos ou polipéptideos derivados de uma proteína madura, fragmentos de uma proteína, variantes de junção, formas recombinantes de uma proteína; variantes da proteína com modificações de aminoácidos, deleções ou substituições, digesto; e modificações pós-translacionais, tais como glicosilação, acetilação, fosforilação e semelhantes.
[00160] Conforme aqui utilizado, "marcador" e "marcador biológico" são utilizados indiferentemente para se referir a uma molécula alvo que indica ou é um sinal de um processo normal ou anormal de um indivíduo ou de uma doença ou outra condição de um indivíduo. Mais especificamente, um "marcador" ou "marcador biológico" é um parâmetro, anatômico, fisiológico, bioquímico ou molecular associado com a presença de um estado ou processo fisiológico específico, normal ou anormal, e, se for anormal, quer crônico ou agudo. Os marcadores biológicos são detectáveis e mensuráveis por uma variedade de métodos, incluindo ensaios de laboratório e formação de imagem médica. Quando um marcador biológico é uma proteína, é também possível utilizar a expressão do gene correspondente como uma medida substituta da quantidade ou da presença ou ausência da correspondente proteína de marcador biológico em uma amostra biológica, ou estado de metilação do gene que codifica o marcador biológico ou proteínas que controlam a expressão do marcador.
[00161] Conforme aqui utilizado, "valor de marcador biológico", "valor", "nível de marcador biológico", e "nível" são utilizados indiferentemente para se referir a uma medida que é feita através de qualquer método analítico para a detecção do marcador biológico em uma amostra biológica e que indica a presença, ausência, quantidade ou concentração absoluta, quantidade ou concentração relativa, título, um nível, um nível de expressão, uma relação de níveis medidos, ou semelhantes, de, para, ou correspondente ao marcador biológico na amostra biológica. A natureza exata do "valor" ou "nível" depende do projeto e componentes específicos do método analítico empregado para detectar o marcador biológico.
[00162] Quando um marcador biológico indica ou é um sinal de um processo anormal ou de uma doença ou outra condição de um indivíduo, aquele marcador biológico é genericamente descrito como sendo tanto sobre-expresso quanto sub-expresso, em comparação com um nível ou valor de expressão do marcador biológico que indica ou é um sinal de um processo normal ou uma ausência de uma doença ou outra condição de um indivíduo.
[00163] "regulação para cima", "regulado para cima", "sobre- expressão", "sobre-expresso", e quaisquer variações dos mesmos são usados como sinônimos para se referir a um valor ou nível de um marcador biológico em uma amostra biológica que é maior do que um valor ou nível (ou intervalo de valores ou níveis) de marcador biológico que é normalmente detectado em amostras biológicas semelhantes a partir de indivíduos saudáveis, ou normais. Os termos podem também referir-se a um valor ou nível de um marcador biológico em uma amostra biológica que é maior do que um valor ou nível (ou intervalo de valores ou níveis) de marcador biológico que possa ser detectado numo estágio diferente de uma doença particular.
[00164] "regulação para baixo", "regulado para baixo", "sob- expressão", "sub-expresso", e qualquer variação dos mesmos, são utilizados indiferentemente para se referir a um valor ou nível de um marcador biológico em uma amostra biológica que é inferior a um valor ou nível (ou intervalo de valores ou níveis) de marcador biológico que é normalmente detectado em amostras biológicas semelhantes a partir de indivíduos saudáveis, ou normais. Os termos podem também referir-se a um valor ou nível de um marcador biológico em uma amostra biológica que é inferior a um valor ou nível (ou intervalo de valores ou níveis) de marcador biológico que possa ser detectado numo estágio diferente de uma doença particular.
[00165] Além disso, um marcador biológico que, ou é sobre- expresso ou sub-expresso também pode ser dito como sendo "expresso diferencialmente" ou como tendo um "nível diferencial" ou "valor diferencial", em comparação com um nível de expressão "normal" ou o valor do marcador biológico que indica ou é um sinal de um processo normal ou uma ausência de uma doença ou outra condição de um indivíduo. Assim, "a expressão diferencial" de um marcador biológico pode também ser dita como uma variação a partir de um nível de expressão "normal" do marcador biológico.
[00166] O termo "expressão diferencial de gene" e "expressão diferencial" são utilizados indiferentemente para se referir a um gene (ou um seu produto de expressão da proteína correspondente), cuja expressão é ativada a um nível mais alto ou mais baixo em um indivíduo que sofre de uma doença específica, em relação à sua expressão em um indivíduo normal ou de controle. Os termos também incluem os genes (ou os correspondentes produtos de expressão de proteínas), cuja expressão é ativada a um nível mais alto ou mais baixo em estágios diferentes da mesma doença. Também é entendido que um gene expresso diferencialmente pode ser ou ativado ou inibido ao nível do ácido nucleico ou ao nível de proteína, ou pode ser sujeito a junção alternativa para resultar em um produto diferente do polipeptídeo. Tais diferenças podem ser comprovadas através de uma variedade de alterações incluindo os níveis mRNA, expressão de superfície, secreção ou outro particionamento de um polipeptídeo. A expressão do gene diferencial pode incluir uma comparação de expressão entre dois ou mais genes ou os seus produtos de genes, ou uma comparação dos índices de expressão entre dois ou mais genes ou os seus produtos de genes, ou mesmo uma comparação de dois produtos processados diferentemente do mesmo gene, que diferem entre indivíduos normais e indivíduos que sofrem de uma doença, ou entre diferentes estágios da mesma doença. Expressão diferencial inclui tanto diferenças quantitativas quanto qualitativas, no padrão de expressão temporal ou celular em um gene ou seus produtos de expressão, entre, por exemplo, células normais e doentes, ou entre as células que sofreram eventos de doença ou diferentes estágios da doença.
[00167] Conforme aqui utilizado, "indivíduo" refere-se a um sujeito de teste ou ao paciente. O indivíduo pode ser um mamífero ou um não mamífero. Em várias modalidades, o indivíduo é um mamífero. Um indivíduo pode ser um mamífero humano ou não-humano. Em várias modalidades, o indivíduo é um ser humano. Um indivíduo saudável ou normal é um indivíduo em que a doença ou condição de interesse (incluindo, por exemplo, doenças pulmonares, doenças pulmonares associadas, ou outras doenças pulmonares) não é detectável através de métodos de diagnóstico convencionais.
[00168] "Diagnose", "diagnóstico", "diagnósis" e suas variações referem-se à detecção, determinação, ou reconhecimento de um estado ou condição de saúde de um indivíduo, com base em um ou mais sinais, sintomas, dados ou outra informação pertencente a esse indivíduo. O estado de saúde de um indivíduo pode ser diagnosticado como saudável/normal (isto é, um diagnóstico de ausência de uma doença ou condição) ou diagnosticado como doente/anormal (i. é, um diagnóstico da presença ou uma avaliação das características, de uma doença ou condição). Os termos "diagnose", "diagnóstico", "diagnósis", etc, englobam, em relação a uma doença ou condição particular, a detecção inicial da doença, a caracterização ou classificação da doença, a detecção da progressão, remissão, ou recorrência da doença, e a detecção de resposta da doença após a administração de um tratamento ou terapia para o indivíduo. O diagnóstico de câncer de pulmão inclui distinguir indivíduos, incluindo fumantes e não fumantes, que têm câncer de indivíduos que não têm. Ele inclui ainda distinguir nódulos pulmonares benignos de nódulos pulmonares cancerosos.
[00169] "Prognose", "prognóstico", "prognósis", e as suas variações referem-se a previsão de um futuro curso de uma doença ou condição de um indivíduo que tem a doença ou condição (por exemplo, prevendo-se a sobrevivência do paciente), e tais termos abrangem a avaliação da resposta da doença após a administração de um tratamento ou terapia para o indivíduo.
[00170] "Avaliar", "avaliando", "avaliação", e a variação dos mesmos abrangem tanto o "diagnóstico" e "prognose" e também englobam determinações ou previsões sobre o futuro curso de uma doença ou condição em um indivíduo que não tem a doença, bem como determinações ou previsões sobre a probabilidade de que uma doença ou condição que se repetirá em um indivíduo que aparentemente foi curado da doença. O termo "avaliação" também inclui a avaliação da resposta de um indivíduo a um tratamento, tal como, por exemplo, prevendo-se se um indivíduo é susceptível de responder favoravelmente a um agente terapêutico, ou é pouco provável responder a um agente terapêutico (ou vai experimentar efeitos tóxicos ou outros efeitos secundários indesejáveis, por exemplo), a seleção de um agente terapêutico para administração a um indivíduo, ou a monitorização ou a determinação da resposta de um indivíduo a uma terapia que foi administrada ao indivíduo. Assim, "avaliar" o câncer de pulmão pode incluir, por exemplo, qualquer um dos seguintes: prognosticar o futuro curso do câncer de pulmão em um indivíduo; prever a recorrência de câncer de pulmão em um indivíduo que aparentemente tenha sido curado de câncer de pulmão, ou detrminar ou prever a resposta de um indivíduo a um tratamento de câncer de pulmão ou selecionar um tratamento de câncer de pulmão para administrar a um indivíduo com base em uma determinação dos valores de marcadores biológicos provenientes de amostras biológicas do indivíduo.
[00171] Qualquer um dos exemplos seguintes podem ser referidos tanto como "diagnosticar" quanto "avaliar" câncer de pulmão: inicialmente a detecção da presença ou ausência de câncer de pulmão, determinando umo estágio específica, tipo ou sub-tipo de classificação, ou outro, ou característica de câncer de pulmão; determinar se um nódulo pulmonar é uma lesão benigna ou um tumor pulmonar maligno; ou detectar/monitorar a progressão do câncer de pulmão (por exemplo, o acompanhamento do crescimento do tumor de pulmão ou metástase), remissão ou recorrência.
[00172] Conforme aqui utilizado, "informação biomédica adicional" refere-se a uma ou mais avaliações de um indivíduo, outras do que usar qualquer um dos marcadores biológicos aqui descritos, que estão associados com o risco de câncer de pulmão. "Informação biomédica adicional " inclui qualquer uma das seguintes: descritores físicos de um indivíduo, descritores físicos de um nódulo pulmonar observado por tomografia computadorizada, a altura e/ou peso de um indivíduo, o sexo de um indivíduo, a etnia de um indivíduo, tabagismo, história ocupacional, a exposição a agentes cancerígenos conhecidos (por exemplo, a exposição a qualquer um de amianto, gás radônio, produtos químicos, fumaça de incêndios e poluição do ar, que pode incluir as emissões de fontes móveis ou estacionárias, tais como industrial/fábrica ou emissões de auto/marinha/aeronave), a exposição à fumaça de segunda mão, história familiar de câncer de pulmão (ou outro tipo de câncer), a presença de nódulos pulmonares, tamanho dos nódulos, localização de nódulos, a morfologia de nódulos (por exemplo, como observado através de tomografia computadorizada, opacidade em vidro fosco (GGO), sólido, não-sólido), características de borda do nódulo (por exemplo, lisa, lobulada, afilada e lisa, espiculada, infiltrando), e semelhantes. O tabagismo é normalmente quantificado em termos de "pacote de anos", que se refere ao número de anos que a pessoa fumou multiplicado pelo número médio de maços fumados por dia. Por exemplo, uma pessoa que tenha fumado, em média, um maço de cigarros por dia durante 35 anos é dito como tendo um tabagismo de 35 pacote de anos. Informação biomédica adicional pode ser obtida a partir de um indivíduo utilizando técnicas de rotina conhecidas na especialidade, tais como a partir do próprio indivíduo através da utilização de um questionário de rotina de paciente ou questionário de história de saúde, etc, ou a partir de um profissional médico, etc. Alternativamente, informação biomédica adicional pode ser obtida a partir de técnicas de formação de imagem de rotina, incluindo a tomografia computadorizada (por exemplo, baixa dose de TC) e raios-X. Ensaios de níveis de marcadores biológicos em combinação com uma avaliação de qualquer informação biomédica adicional pode, por exemplo, melhorar a sensibilidade, a especificidade e/ou AUC para a detectar câncer de pulmão (ou outros usos relacionadas com o câncer de pulmão), em comparação com testes de marcador biológico isoladamente ou avaliando qualquer elemento de informação biomédica complementar por si só (por exemplo, a tomografia computadorizada sozinha).
[00173] O termo "área sob a curva" ou "AUC" significa a área sob a curva de uma curva característica de operação do receptor (ROC), ambos os quais são bem conhecidos na técnica. Medidas de AUC são úteis para comparar a exatidão de um classificador através de toda a faixa completa de dados. Classificadores com uma maior AUC têm uma maior capacidade de classificar corretamente incógnitas entre dois grupos de interesse (por exemplo, amostras de câncer de pulmão e amostras normais ou de controle). As curvas ROC são úteis para traçar o desempenho de um aspecto particular (por exemplo, qualquer um dos marcadores biológicos aqui descritos e/ou qualquer outro item de informação biomédica adicional) para distinguir entre duas populações (por exemplo, os casos tendo câncer de pulmão e controles sem câncer de pulmão). Tipicamente, os dados característico através de toda a população (por exemplo, os casos e controles) são classificados em ordem ascendente com base no valor de uma única característica. Então, para cada valor para essa característica, são calculadas as taxas de positivos verdadeiros e positivos falsos para os dados. A taxa de positivos verdadeiros é determinada pela pontuação do número de casos acima do valor para essa característica e, em seguida, dividindo-se pelo número total de casos. A taxa de positivos falsos é determinada pela pontuação do número de controles acima do valor para a característica e, em seguida, dividindo-se pelo número total de controles. Embora essa definição refere-se a situações em que uma característica é elevada em casos comparados aos controles, esta definição também se aplica a situações em que uma característica é menor em casos em comparação com os controles (em tal cenário, seriam contadas as amostras abaixo do valor dessa característica). As curvas ROC podem ser geradas por uma única característica, bem como para outras saídas únicas, por exemplo, uma combinação de duas ou mais características podem ser matematicamente combinadas (por exemplo, adicionadas, subtraídas, multiplicadas, etc.) para proporcionar um valor de soma simples, e este valor de soma simples pode ser plotado em uma curva ROC. Além disso, qualquer combinação de características múltiplas, em que a combinação obtém um único valor de saída, pode ser representada em uma curva ROC. Estas combinações de características podem incluir um teste. A curva ROC é a plotagem da taxa de verdadeiros positivos (sensibilidade) de um teste contra a taxa de falsos positivos (1-especificidade) do teste.
[00174] Conforme aqui utilizado, "detectar" ou "determinar" em relação a um valor de marcador biológico inclui o uso tanto do instrumento necessário para observar e registar um sinal correspondente a um valor de marcador biológico quanto do(s) material(is) necessário(s) para gerar o sinal. Em várias modalidades, o valor do marcador biológico é detetado através de qualquer método adequado, incluindo fluorescência, quimioluminiscência, ressonância de plasma de superfície, ondas acústicas de superfície, espectrometria de massa, espectroscopia de infravermelho, espectroscopia Raman, microscopia de força atômica, microscopia de varredura de tunelamento, métodos de detecção eletroquímica, ressonância magnética nuclear, pontos quânticos, e semelhantes.
[00175] "Suporte sólido" refere-se aqui a qualquer substrato que tem uma superfície à qual as moléculas podem ser fixadas, direta ou indiretamente, quer através de ligações covalentes ou não covalentes. Um "suporte sólido" pode ter uma variedade de formatos físicos, o que pode incluir, por exemplo, uma membrana, um chip (por exemplo, um chip de proteína), uma superfície lisa (por exemplo, uma lâmina de vidro ou lamela), uma coluna, um oco, sólido, semi-sólido, poros ou cavidade que contém partículas, tal como, por exemplo, um grânulo, um gel, uma fibra, que inclui um material de fibra ótica, uma matriz, e um recipiente de amostra. Recipientes de amostra exemplificativos incluem poços de amostra, tubos, frascos, vasos capilares, e qualquer outro recipiente de ranhura ou reentrância capaz de conter uma amostra. Um receptáculo de amostra pode estar contido em uma plataforma de multiplas amostras, tal como uma placa de microtitulação, lâmina, dispositivo de microfluidos, e semelhantes. Um suporte pode ser composto de um material natural ou sintético, um material orgânico ou inorgânico. A composição do suporte sólido sobre o qual os reagentes de captura são ligados geralmente depende do método de fixação (p. e. ligação covalente). Outros recipientes exemplificativos incluem emulsões a granel e microgotículas e microfluídicas controladas de óleo/aquosas dentro das quais os ensaios e manipulações relacionadas podem ocorrer. Os suportes sólidos adequados incluem, por exemplo, plásticos, resinas, polissacaridios, sílica, ou materiais à base de sílica, vidros funcionalizados, silício modificado, carbono, metais, vidros inorgânicos, membranas, nylon, fibras naturais (tais como, por exemplo, seda, lã, e algodão), polímeros, e outros semelhantes. O material que compõe o suporte sólido pode incluir grupos reativos tais como, por exemplo, carboxi, grupos amino ou hidroxila, que são utilizados para a fixação dos reagentes de captura. Suportes poliméricos sólidos podem incluir, por exemplo, poliestireno, polietileno glicol tetraftalato, acetato de polivinila, cloreto de polivinila, polivinil- pirrolidona, poliacrilonitrila, polimetacrilato de polimetila, politetrafluoroetileno, borracha de butila, borracha de estireno- butadieno, borracha natural, polietileno, polipropileno, (poli) tetrafluoroetileno, (poli) fluoreto de vinilideno, policarbonato, e polimetilpenteno. Partículas de suporte sólido adequadas, que podem ser utilizadas incluem, por exemplo, partículas codificadas, tais como partículas codificadas do tipo Luminex ®, partículas magnéticas, e partículas de vidro.
Usos Exemplificativos de Marcadores biológicos
[00176] Em várias modalidades exemplificativas, são proporcionados métodos para diagnosticar câncer de pulmão de um indivíduo através da detecção de um ou mais valores de marcadores biológicos que correspondem a um ou mais marcadores biológicos que estão presentes no tecido de pulmão de um indivíduo, por qualquer número de métodos analíticos, incluindo qualquer dos métodos analíticos descritos aqui. Esses marcadores biológicos são, por exemplo, expresso diferencialmente em indivíduos com câncer de pulmão, em comparação com indivíduos sem câncer de pulmão, particularmente NSCLC. A detecção da expressão diferencial de um marcador biológico de um indivíduo pode ser usada, por exemplo, para permitir o diagnóstico precoce do câncer de pulmão, para distinguir entre um nódulo pulmonar benigno e maligno (tais como, por exemplo, um nódulo observado na tomografia computadorizada (TC)), para monitorar a recorrência do câncer de pulmão, ou para outras indicações clínicas, incluindo a determinação do prognóstico e métodos de tratamento.
[00177] Qualquer um dos marcadores biológicos aqui descritos podem ser usados em uma variedade de indicações clínicas para o câncer de pulmão, incluindo qualquer uma das seguintes: detecção de câncer de pulmão (por exemplo, em um indivíduo ou população de alto risco), caracterizando câncer de pulmão (p. e., determinar tipo, sub- tipo, ou estágio de câncer de pulmão), tal como pela distinção entre câncer de pulmão de células não-pequenas (NSCLC) e câncer de pulmão de pequenas células (SCLC) e/ou entre o adenocarcinoma e o carcinoma de células escamosas (ou de outra forma facilitar a histopatologia ); determinar se um nódulo de pulmão é um nódulo benigno ou um tumor maligno de pulmão; determinar o prognóstico do câncer de pulmão, monitorar a progressão ou remissão do câncer de pulmão, monitorar a recorrência do câncer de pulmão; monitorar metástase, seleção do tratamento; monitorar resposta a um agente terapêutico ou outros tratamentos; estratificação de indivíduos para triagem de tomografia computadorizada (TC), (por exemplo, identificar aqueles indivíduos com maior risco de câncer de pulmão e, portanto, mais susceptíveis de se beneficiar da triagem espiral da CT, aumentando assim o valor preditivo positivo da CT), combinar testes de marcadores biológicos com informação biomédica adicional, tais como a história de tabagismo, etc, ou com o tamanho do nódulo, morfologia, etc. (tal como para proporcionar um ensaio de diagnóstico com desempenho aumentado em comparação com CT ou ensaio de marcador biológico sozinho); facilitar o diagnóstico de um nódulo pulmonar como maligno ou benigno; facilitar a decisão clínica tomada uma vez que o nódulo pulmonar é observado na CT (por exemplo, pedir repetição escaneamentos de CT se o nódulo é considerado ser de baixo risco, tal como se um teste baseado em marcador biológico é negativo, com ou sem categorização de tamanho do nódulo, ou considerando-se a biópsia se o nódulo é considerado de médio a alto risco, tal como se um teste baseado em marcador biológico é positivo, com ou sem a categorização do tamanho do nódulo), e facilitar decisões relativas a seguimento clínico (por exemplo, se implementar repetições de escaneamentos de CT, biópsia fina agulha, ou toracotomia depois de observar um nódulo não calcificado na CT). Teste de marcador biológico pode melhorar o valor preditivo positivo (VPP) sobre a triagem de CT sozinha. Em adição às suas utilidades em conjunto com a triagem de CT, os marcadores biológicos aqui descritos também podem ser usados em conjunto com quaisquer outras modalidades de imagem usadas para o câncer de pulmão, tais como radiografia toráxica. Além disso, os marcadores biológicos descritos podem também ser úteis em permitir que algumas destas utilizações antes que indicações de câncer de pulmão sejam detectadas por modalidades de imagem ou outras clínicas correlatas, ou antes do aparecimento dos sintomas.
[00178] A título de exemplo da maneira pela qual qualquer um dos marcadores biológicos aqui descritos podem ser utilizados para diagnosticar o câncer de pulmão, a expressão diferencial de um ou mais dos marcadores biológicos descritos em um indivíduo que não é conhecido ter câncer de pulmão pode indicar que o indivíduo tem câncer de pulmão, o que permite a detecção de câncer de pulmão no estágio inicial da doença, quando o tratamento é mais eficaz, talvez antes do câncer de pulmão ser detectado por outros meios, ou antes do aparecimento dos sintomas. A sobre-expressão de um ou mais dos marcadores biológicos durante o curso do câncer de pulmão pode ser um indicativo da progressão do câncer de pulmão, por exemplo, um tumor do pulmão está em crescimento e/ou está em metástase (e, assim, indicar um prognóstico pobre), aa etapa que uma diminuição no grau ppara o qual um ou mais dos marcadores biológicos é expresso diferencialmente (i. é, em testes de marcadores biológicos subsequentes, o nível de expressão no indivíduo está se movendo na direção ou se aproxima de um nível de expressão "normal") pode ser indicativo de remissão do câncer de pulmão, por exemplo, um tumor de pulmão está encolhendo (e, assim, indicar um bom ou melhor prognóstico). Do mesmo modo, um aumento do grau em que um ou mais dos marcadores biológicos é expresso diferencialmente (por exemplo, em testes de marcadores biológicos subsequentes, o nível de expressão em que o indivíduo está se movendo ainda mais longe de um nível de expressão "normal"), durante o curso do tratamento do câncer de pulmão pode indicar que o câncer de pulmão está progredindo e, portanto, indica que o tratamento é ineficaz, aa etapa que uma diminuição da expressão diferencial de um ou mais dos marcadores biológicos durante o curso do tratamento do câncer de pulmão pode ser indicativo da remissão do câncer de pulmão e, por conseguinte, indica que o tratamento está funcionando com sucesso. Além disso, um aumento ou diminuição da expressão diferencial de um ou mais dos marcadores biológicos depois que o indivíduo tenha sido aparentemente curado de câncer de pulmão pode ser indicativo da recorrência do câncer de pulmão. Em uma situação como esta, por exemplo, o indivíduo pode ser reiniciado na terapia (ou o regime terapêutico modificado de modo a aumentar a quantidade de dosagem e/ou frequência, se o indivíduo tem mantido terapia) em um estágio mais precoce do que se a recorrência de câncer de pulmão não foi detectada até mais tarde. Por outro lado, um nível de expressão diferencial de um ou mais dos marcadores biológicos em um indivíduo pode ser preditivo da resposta do indivíduo a um determinado agente terapêutico. No monitoramento para recorrência ou progressão do câncer de pulmão, as alterações nos níveis de expressão dos marcadores biológicos podem indicar a necessidade de repetição de imagem (por exemplo, repetir escaneamento de TC), tal como para determinar a atividade do câncer de pulmão ou para determinar a necessidade de alterações no tratamento.
[00179] A detecção de qualquer um dos marcadores aqui descritos pode ser particularmente útil após, ou em conjunto com, o tratamento do câncer de pulmão, tais como a avaliação do sucesso do tratamento, ou para monitorar a remissão do câncer de pulmão, a recorrência, e/ou progressão (incluindo metástases) após o tratamento. O tratamento do câncer de pulmão podem incluir, por exemplo, a administração de um agente terapêutico para o indivíduo, o desempenho da cirurgia (por exemplo, a resseção cirúrgica de pelo menos uma parte de um tumor do pulmão), administração de terapia de radiação, ou qualquer outro tipo de tratamento do câncer de pulmão utilizado na técnica, e qualquer combinação destes tratamentos. Por exemplo, qualquer um dos marcadores biológicos pode ser detetado pelo menos uma vez após o tratamento, ou pode ser detectado várias vezes depois do tratamento (por exemplo, em intervalos periódicos), ou pode ser detectado antes e depois do tratamento. Níveis de expressão diferencias de qualquer dos marcadores biológicos em um indivíduo ao longo do tempo podem ser um indicativo da progressão do câncer de pulmão, a remissão, ou a recidiva, exemplos dos quais incluem qualquer um dos seguintes: um aumento ou uma diminuição do nível de expressão dos marcadores biológicos após tratamento em comparação com o nível de expressão do marcador antes do tratamento, um aumento ou diminuição do nível de expressão do marcador em um ponto de tempo posterior após o tratamento comparado com o nível de expressão do marcador em um ponto de tempo mais cedo após o tratamento, e um nível de expressão diferencial do marcador biológico em um único momento, após o tratamento, em comparação com os níveis normais do marcador biológico.
[00180] Como um exemplo específico, os níveis de marcador biológico para qualquer um dos marcadores biológicos aqui descritos podem ser determinados na pré-cirurgia e pós-cirurgia (por exemplo, 2-4 semanas após a cirurgia) amostras de soro. Um aumento no nível de expressão de marcador biológico(es) na amostra de pós-cirurgia em comparação com a amostra de pré-cirurgia pode indicar a progressão do câncer de pulmão (por exemplo, cirurgia sem êxito), aa etapa que uma diminuição no nível de expressão de marcador biológico(es) na amostra de pós cirurgia comparada com a amostra de pré-cirurgia pode indicar a regressão do câncer de pulmão (por exemplo, a cirurgia removeu com sucesso o tumor do pulmão). Análises semelhantes sobre os níveis de marcadores biológicos podem ser efectuadas antes e depois de outras formas de tratamento, tais como antes e após a terapia por radiação ou à administração de um agente terapêutico ou de vacina contra o câncer.
[00181] Além de testar os níveis de marcadores biológicos como um teste de diagnóstico independente, os níveis de marcadores biológicos também podem ser feitos em conjunto com a determinação de SNPs ou outras lesões genéticas ou variabilidade que são indicativos de uma probabilidade aumentada de suscetibilidade da doença. (Ver, por exemplo, Amos et al., Nature Genetics 40, 616-622 (2009)).
[00182] Além de testar os níveis de marcadores biológicos como um teste independente de diagnóstico, os níveis de marcadores biológicos também podem ser feitos em conjunto com a triagem de CT. Por exemplo, os marcadores biológicos podem facilitar a justificação econômica e médica para a aplicação de triagem de CT, tal como para a triagem de grandes populações assintomáticas em risco para o câncer de pulmão (por exemplo, os fumantes). Por exemplo, um teste "pré-CT" de níveis de marcadores biológicos poderia ser usado para estratificar indivíduos de alto risco para triagem de CT, tal como para identificar as pessoas que estão em maior risco de câncer de pulmão com base em seus níveis de marcadores biológicos e quem deve ser priorizado para triagem de CT. Se um teste de CT é implementado, os níveis de marcadores biológicos (por exemplo, conforme determinado por um ensaio de aptâmero de amostras de soro ou plasma) de um ou mais marcadores biológicos podem ser medidos e a pontuação de diagnóstico poderia ser avaliada em conjunto com a informação biomédica adicional (por exemplo, os parâmetros do tumor determinado pelo teste de CT) para aumentar o valor preditivo positivo (VPP) sobre CT ou teste de marcador biológico sozinho. Um painel de aptâmero "pós-CT" para determinar os níveis dos marcadores biológicos pode ser usado para determinar a probabilidade de que um nódulo pulmonar observado por CT (ou outra modalidade de imagem) é maligno ou benigno.
[00183] A detecção de qualquer um dos marcadores biológicos aqui descritos pode ser útil para o pós-teste de CT. Por exemplo, o teste de marcador biológico pode eliminar ou reduzir um número significativo de falsos positivos sobre a CT sozinha. Além disso, o teste de marcador biológico pode facilitar o tratamento dos pacientes. A título de exemplo, se um nódulo de pulmão é inferior a 5 mm de tamanho, os resultados do teste de marcador biológico pode avançar pacientes de "observar e esperar" para biópsia em um tempo mais cedo; se um nódulo de pulmão é 5-9 mm, o teste de marcador biológico pode eliminar o uso de uma biópsia ou toracotomia em varreduras de falsos positivos, e se um nódulo pulmonar é maior do que 10 mm, o teste de marcador biológico pode eliminar a cirurgia para uma sub-população de pacientes com estes nódulos benignos. Eliminando a necessidade de biópsia, em alguns pacientes com base em testes de marcador biológico seria benéfico porque existe uma morbidade significativa associada à biópsia do nódulo e à dificuldade na obtenção de tecido de nódulo, dependendo da localização do nódulo. Do mesmo modo, eliminando a necessidade de cirurgia, em alguns doentes, tais como aqueles cujos nódulos são realmente benignos, o que evitaria riscos desnecessários e os custos associados com a cirurgia.
[00184] Além de testar os níveis de marcadores biológicos em conjunto com triagem de CT (por exemplo, avaliação de níveis de marcador biológico em conjunto com o tamanho ou outras características de um nódulo pulmonar observado em uma varredura de CT), a informação sobre os marcadores biológicos podem também ser avaliadas em conjunto com outros tipos de dados, especialmente de dados que indicam risco de um indivíduo para o câncer de pulmão (por exemplo, a história clínica do paciente, sintomas, história familiar de câncer, fatores de risco, tais como se o indivíduo é ou não é fumante, e/ou estado de outros marcadores biológicos, etc.). Estes vários dados podem ser avaliados por métodos automatizados, tais como um programa de computador/ software, que pode ser incorporado em um computador ou outro aparelho/dispositivo.
[00185] Qualquer um dos marcadores biológicos descritos pode também ser utilizado em exames de imagem. Por exemplo, um agente de formação de imagem pode ser acoplado a qualquer um dos marcadores biológicos descritos, o qual pode ser utilizado para auxiliar no diagnóstico de câncer de pulmão, para monitorar a progressão/remissão da doença ou metástase, para monitorar a recorrência da doença, ou para monitorar a resposta ao tratamento, entre outras utilizações. Detecção e Determinação de Marcadores biológicos e Valores de Marcador biológico
[00186] Um valor de marcador biológico para os marcadores biológicos aqui descritos pode ser detectado utilizando qualquer um de uma variedade de métodos analíticos conhecidos. Em uma modalidade, um valor de marcador biológico é detectado utilizando um reagente de captura. Como usado aqui, um "agente de captura" ou "reagente de captura" refere-se a uma molécula que é capaz de se ligar especificamente a um marcador biológico. Em várias modalidades, o reagente de captura pode ser exposto ao marcador biológico em solução ou pode ser exposto ao marcador biológico enquanto o reagente de captura é imobilizado sobre um suporte sólido. Em outras modalidades, o reagente de captura contém uma característica que é reativa com uma característica secundária sobre um suporte sólido. Nestas modalidades, o reagente de captura pode ser exposto ao marcador biológico em solução, e, em seguida, a característica do reagente de captura pode ser usada em conjunto com a característica secundária sobre o suporte sólido para imobilizar o marcador biológico no suporte sólido. O reagente de captura é selecionado com base no tipo de análise a efetuar. Reagentes de captura incluem, mas não estão limitados a, anticorpos, aptâmeros, adnectins, anquirinas, outros anticorpos miméticos e outras armações de proteínas, autoanticorpos, quimeras, moléculas pequenas, um fragmento F(ab')2, um fragmento de anticorpo de cadeia simples, um fragmento Fv, um fragmento Fv de cadeia simples, um ácido nucleico, uma lectina, um receptor de ligação-ligante, corpos de afinidade, nanocorpos, polímeros impressos, avimeros, peptidomiméticos, um receptor de hormona, um receptor de citocina, e receptores sintéticos, e modificações e fragmentos destes.
[00187] Em algumas modalidades, um valor de marcador biológico é detetado usando um complexo de reagente de marcador biológico/captura.
[00188] Em outras modalidades, o valor do marcador biológico é derivado do complexo de reagente de marcador biológico/captura e é detectado indiretamente, tal como, por exemplo, como um resultado de uma reação que é posterior à interação de reagente de marcador biológico/captura, mas é dependente da formação do complexo de reagente de marcador biológico/captura.
[00189] Em algumas modalidades, o valor do marcador biológico é detectado diretamente com o marcador biológico em uma amostra biológica.
[00190] Em uma modalidade, os marcadores biológicos são detectados utilizando um formato multiplexado que permite a detecção simultânea de dois ou mais marcadores biológicos em uma amostra biológica. Em uma modalidade do formato multiplexado, reagentes de captura são imobilizados, direta ou indiretamente, covalentemente ou não covalentemente, em localizações discretas sobre um suporte sólido. Em uma outra modalidade, um formato multiplexado utiliza suportes sólidos discretos, onde cada suporte sólido tem um único reagente de captura associado com o suporte sólido, tal como, por exemplo, pontos quânticos. Em uma outra modalidade, um dispositivo individual é utilizado para a detecção de cada um dos múltiplos marcadores biológicos a ser detectado em uma amostra biológica. Os dispositivos individuais podem ser configurados para permitir que cada marcador biológico na amostra biológica seja processado simultaneamente. Por exemplo, uma placa de microtitulação pode ser utilizada de tal forma que cada cavidade da placa seja utilizada exclusivamente para analisar um dos marcadores biológicos múltiplos a ser detectado em uma amostra biológica.
[00191] Em uma ou mais das modalidades anteriores, um marcador fluorescente pode ser utilizado para marcar um componente do complexo de marcador biológico/captura para permitir a detecção do valor do marcador biológico. Em várias modalidades, o marcador fluorescente pode ser conjugado com um reagente de captura específico para qualquer um dos marcadores aqui descritos, utilizando técnicas conhecidas, e o marcador fluorescente pode então ser utilizado para detectar o valor do marcador biológico correspondente. Marcadores fluorescentes adequados incluem quelatos de terras raras, fluoresceína e seus derivados, rodamina e seus derivados, dansilo, aloficocianina, PBXL-3, Qdot 605, Lissamina, ficoeritrina, Texas Red, e outros tais compostos.
[00192] Em uma modalidade, o marcador fluorescente é uma molécula de corante fluorescente. Em algumas modalidades, a molécula de corante fluorescente inclui pelo menos um sistema de anel substituído indolium no qual o substituinte no carbono 3 do anel de indolium contém um grupo quimicamente reativo ou uma substância conjugada. Em algumas modalidades, a molécula de corante inclui uma molécula de AlexFluor, tais como, por exemplo, AlexaFluor 488, AlexaFluor 532, AlexaFluor 647, AlexaFluor 680, ou AlexaFluor 700. Em outras modalidades, a molécula de corante compreende um primeiro tipo e um segundo tipo de molécula de corante, tal como, por exemplo, duas moléculas diferentes de AlexaFluor. Em outras modalidades, a molécula de corante compreende um primeiro tipo e um segundo tipo de molécula de corante, e as duas moléculas de corante têm diferentes espectros de emissão.
[00193] A fluorescência pode ser medida com uma grande variedade de instrumentação compatível com uma ampla variedade de formatos de ensaio. Por exemplo, foram projetados espectrofluorimetros para analisar placas de microtitulação, lâminas de microscópio, matrizes impressas, cadinhos, etc. Ver Principles of Fluorescence Spectroscopy, por J.R. Lakowicz, Springer Science + Business Media, Inc., 2004; Bioluminescence & Chemiluminescence: Progress & Current Aplications; Philip E. Stanley e Larry J. Kricka editores, World Scientific Publishing Company, janeiro de 2002.
[00194] Em uma ou mais das modalidades anteriores, um marcador quimioluminescente pode ser opcionalmente utilizado para marcar um componente do complexo de marcador biológico/captura para permitir a detecção de um valor de marcador biológico. Materiais quimioluminescentes adequados incluem quaisquer um de cloreto de oxalila, Rodamin 6G, Ru (bipy)32+, TMAE (etileno tetraquis (dimetilamino)), pirogalol (1,2,3 -trihidroxibenzeno), Lucigenina, peroxioxalatos, oxalatos de arila, ésteres de acridinio, dioxetanos, e outros.
[00195] Em ainda outras modalidades, o método de detecção inclui uma combinação de enzima/substrato, que gera um sinal detetável que corresponde ao valor de marcador biológico. Em geral, a enzima catalisa uma alteração química do substrato cromogênico que pode ser medida utilizando várias técnicas, incluindo a espectrofotometria, fluorescência e quimioluminescência. As enzimas adequadas incluem, por exemplo, luciferases, luciferina, malato desidrogenase, urease, peroxidase de rábano (HRPO), fosfatase alcalina, beta-galactosidase, glucoamilase, lisozima, glucose oxidase, galactose oxidase e glucose- 6-fosfato-dehidrogenase, uricase, xantina oxidase, lactoperoxidase, microperoxidase, e semelhantes.
[00196] Em ainda outras modalidades, o método de detecção pode ser uma combinação de fluorescência, quimioluminescência, combinações de radionuclídeos ou enzima/substrato, que geram um sinal mensurável. Sinalização multimodal poderia ter características vantajosas únicas em formatos de ensaio de marcador biológico.
[00197] Mais especificamente, os valores de marcador biológico para os marcadores biológicos aqui descritos podem ser detectados utilizando métodos analíticos conhecidos incluindo, ensaios simples de aptâmero, ensaios multiplexados de aptâmero, ensaios imunes simples ou multiplexados, perfis de expressão mRNA, perfis de expressão miRNA, análise espectrométrica de massa, métodos histológicos/citológicos, etc. como detalhado abaixo. Determinação dos Valores de Marcadores biológicos, utilizando Ensaios Baseados em Aptâmero
[00198] Ensaios voltados para a detecção e quantificação de moléculas fisiologicamente significativas em amostras biológicas e outras amostras são ferramentas importantes na pesquisa científica e na área de saúde. Uma classe de tais ensaios envolve o uso de uma micromatriz que inclui um ou mais aptâmeros imobilizada sobre um suporte sólido. Cada um dos aptâmeros é capaz de se ligar a uma molécula alvo de uma forma altamente específica e com afinidade muito elevada. Ver, p. e., a Patente dos EUA N°. 5,475,096, entitulada "Nucleic Acid Ligands," ver também, por exemplo, a Patente dos EUA N°. 6,242,246, Patente dos EUA N°. 6,458,543 e Patente dos EUA N°. 6,503,715, cada uma das quais é entitulada " Nucleic Acid Ligands Diagnostic Biochip". Uma vez que a micromatriz é contactada com uma amostra, os aptâmeros de se ligam às suas respectivas moléculas alvo presentes na amostra e, assim, permitem uma determinação de um valor de marcador biológico correspondente a um marcador biológico.
[00199] Conforme aqui utilizado, um "aptâmero" refere-se a um ácido nucleico que tem uma afinidade de ligação específica a uma molécula alvo. Reconhece-se que as interações de afinidade são uma questão de grau, no entanto, no presente contexto, a "afinidade de ligação especifica" de um aptâmero para o seu alvo significa que o aptâmero se liga ao seu alvo, geralmente com um grau muito mais elevado do que a afinidade com que se liga a outros componentes de uma amostra de teste. Um "aptâmero" é um conjunto de exemplares de um tipo ou espécie de molécula de ácido nucleico que tem uma sequência nucleotídica específica. Um aptâmero pode incluir qualquer número adequado de nucleótidos, incluindo qualquer número de nucleótidos modificados quimicamente. "Aptâmeros" refere-se a mais do que um tal conjunto de moléculas. Aptâmeros diferentes podem ter tanto o mesmo número de nucleótidos quanto diferentes. Aptâmeros podem ser DNA ou RNA ou ácidos nucleicos modificados quimicamente e podem ser de cadeia simples, cadeia dupla, ou conter regiões de cadeia dupla, e pode incluir estruturas de ordem mais elevadas. Um aptâmero também pode ser um fotoaptâmero, onde um grupo funcional fotorreativo ou reativo quimicamente é incluído no aptâmero para permitir que seja ligado covalentemente ao seu alvo correspondente. Qualquer um dos métodos de aptâmero aqui divulgados pode incluir a utilização de dois ou mais aptâmeros que se ligam especificamente à mesma molécula alvo. Tal como será descrito a seguir, um aptâmero pode incluir uma marca. Se um aptâmero inclui uma marca, todas as cópias do aptâmero necessitam não ter a mesma marca. Além disso, se cada um de aptâmeros diferentes, inclui uma marca, estes aptâmeros diferentes podem ter a mesma marca ou uma marca diferente.
[00200] Um aptâmero podem ser identificado usando qualquer método conhecido, incluindo o processo SELEX. Uma vez identificado, um aptâmero pode ser preparado ou sintetizado de acordo com qualquer método conhecido, incluindo os métodos de síntese química e métodos sintéticos enzimáticos.
[00201] Os termos "SELEX" e "processo SELEX" são aqui utilizados indiferentemente para referir geralmente a uma combinação de (1) a seleção de aptâmeros que interagem com uma molécula alvo de um modo desejável, por exemplo, com uma elevada afinidade de ligação para uma proteína, com (2) a amplificação dos ácidos nucleicos selecionados. O processo SELEX pode ser usado para identificar os aptâmeros com elevada afinidade a um alvo específico ou marcador biológico.
[00202] SELEX inclui geralmente preparar uma mistura candidata de ácidos nucleicos, ligar a mistura candidata à molécula alvo desejada, para formar um complexo de afinidade, separar os complexos de afinidade dos ácidos nucleicos candidatos não ligados, separar e isolar o ácido nucleico do complexo de afinidade, purificar o ácido nucleico, e a identificar uma sequência de aptâmero específico. O processo pode incluir múltiplas rodadas para refinar ainda mais a afinidade do aptâmero selecionado. O processo pode incluir etapas de amplificação em um ou mais pontos do processo. Ver, p. e., a Patente dos EUA N°. 5,475,096, entitulada "Nucleic Acid Ligands". O processo SELEX pode ser usado para gerar um aptâmero que se liga covalentemente ao seu alvo, assim como um aptâmero que de liga não covalentemente ao seu alvo. Ver, p. e., a Patente dos EUA N°. 5,705,337, entitulada "Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment: Chemi-SELEX"
[00203] O processo SELEX pode ser utilizado para identificar aptâmeros de alta afinidade contendo nucleótidos modificados que conferem características melhoradas sobre o aptâmero, tais como, por exemplo, uma melhoria da estabilidade ao vivo ou características de entrega melhoradas. Exemplos de tais modificações incluem substituições químicas na ribose e/ou fosfato e/ou posições de bases. Aptâmeros identificados pelo processo SELEX contendo nucleótidos modificados são descritos na Patente dos EUA N°. 5,660,985, entitulada "High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides", que descreve oligonucleotideos contendo derivados de nucleótidos modificados quimicamente nas posições de pirimidinas de 5'- e 2'-. A Patente dos EUA N°. 5,580,737, ver supra, descreve aptâmeros altamente específicos que contêm um ou mais nucleótidos modificados com 2'-amino (2 '-NH2), 2'-fluoro(2'-F), e/ou 2'-O-metil (2'- OMe). Ver também, a Publicação do Pedido de Patente dos EUA 20090098549, entitulada "SELEX e PHOTOSELEX", que descreve as bibliotecas de ácidos nucleicos tendo expandido propriedades físicas e químicas e a sua utilização em SELEX e PHOTOSELEX.
[00204] SELEX também pode ser usado para identificar aptâmeros que têm características desejáveis de taxas de dissociação. Ver Publicação de Pedido de Patente dos EUA 20090004667, entitulada "Method for Generating Aptâmeros with Improved Off-Rates", que descreve métodos melhorados de SELEX para gerar aptâmeros que podem se ligar a moléculas alvo. São descritos métodos para produzir aptâmeros e fotoaptâmeros com taxas mais lentas de dissociação das suas moléculas alvo. Os métodos envolvem o contacto da mistura candidata com a molécula alvo, permitindo a formação de complexos de ácido nucleico alvo a ocorrer, e realizando um processo de enriquecimento de taxa de dissoçiação lenta, em que o complexo de ácido nucleico alvo com taxas mais rápidas de dissociação irá dissociar e não reforma, enquanto complexos com baixas taxas de dissociação permanecerão intactos. Além disso, os métodos incluem o uso de nucleótidos modificados na produção de misturas de ácidos nucleicos candidatos para gerar aptâmeros com melhor desempenho de taxa de dissociação.
[00205] Uma variação deste ensaio utiliza aptâmeros fotorreativos que incluem os grupos funcionais que permitem aos aptâmeros se ligarem covalentemente ou com "fotoligar de forma cruzada" moléculas alvo. Ver, p. e., Patente dos EUA N°. 6,544,776, entitulada "Nucleic Acid Ligand Biochip Diagnostic." Estes aptâmeros fotorreativos são também ditos como fotoaptâmeros. Ver, p. e., Patente dos EUA N°. 5,763,177, Patente dos EUA N°. 6,001,577 e Patente dos EUA N°. 6,291,184, cada um dos quais é intitulado " Sistematic Evolution of Nucleic Acid Ligand by Exponential Enrichment: Photoselection of Nucleic Acid Ligand and Solution SELEX ", ver também, por exemplo, a Patente dos EUA N°. 6,458,539, entitulada "Photoselection of Nucleic Acid Ligand". Depois que a micromatriz contactou com a amostra e os fotoaptâmeros tiveram a oportunidade de se ligar a moléculas alvo, os fotoaptâmeros são fotoativados, e o suporte sólido é lavado para remover quaisquer moléculas não especificamente ligadas. Condições de lavagem duras podem ser utilizadas, uma vez que as moléculas alvo que estão ligadas aos fotoaptâmeros geralmente não são removidas, devido às ligações covalentes criadas pelo(s) grupo(s) funcional(is) fotoativado(s) sobre os fotoaptâmeros. Desta maneira, o ensaio permite a detecção de um valor correspondente a um valor de marcador biológico correspondente a um marcador biológico na amostra de teste.
[00206] Em ambos os formatos de ensaio, os aptâmeros são imobilizados sobre o suporte sólido antes de serem postos em contacto com a amostra. Em certas circunstâncias, no entanto, a imobilização dos aptâmeros antes do contacto com a amostra pode não proporcionar um ensaio ótimo. Por exemplo, a imobilização prévia das aptâmeros pode resultar em mistura ineficiente dos aptâmeros com as moléculas alvo na superfície do suporte sólido, talvez, levando a tempos de reação longos e, portanto, períodos de incubação prolongados para permitir a ligação eficiente dos aptâmeros a suas moléculas alvo. Além disso, quando fotoaptâmeros são empregados no ensaio e, dependendo do material utilizado como suporte sólido, o suporte sólido pode ter tendência a dispersar ou absorver a luz utilizada para efetuar a formação de ligações covalentes entre os fotoaptâmeros e suas moléculas alvo. Além disso, dependendo do método utilizado, a detecção de moléculas alvo ligadas aos seus aptâmeros pode estar sujeita a imprecisão, uma vez que a superfície do suporte sólido pode também ser exposta e influenciada por quaisquer agentes de rotulagem que sejam utilizados. Finalmente, a imobilização dos aptâmeros sobre o suporte sólido geralmente envolve uma etapa de preparação do aptâmero (isto é, a imobilização) antes da exposição dos aptâmeros à amostra, e esta etapa de preparação pode afetar a atividade ou a funcionalidade dos aptâmeros.
[00207] Também foram descritos ensaios de aptâmero que permitem a um aptâmero capturar o alvo em solução e, em seguida, utilizar etapas de separação que são concebidas para remover componentes específicos da mistura de aptâmero alvo antes da detecção (ver a Publicação do Pedido de Patente dos EUA 20090042206, entitulada "Multiplexed Analysis of Test Samples"). Os métodos de ensaio de aptâmero descritos permitem a detecção e quantificação de um não-alvo de ácido nucleico (por exemplo, uma proteína alvo) em uma amostra de ensaio através da detecção e quantificação de um ácido nucleico (isto é, um aptâmero). Os métodos descritos criam um substituto de ácido nucleico (i é, o aptâmero) para a detecção e quantificação de um não-alvo de ácido nucleico, permitindo assim uma grande variedade de tecnologias de ácidos nucleicos, incluindo a amplificação, a ser aplicada a uma ampla gama de alvos desejados, incluindo proteínas alvo.
[00208] Aptâmeros podem ser construídos de modo a facilitar a separação dos componentes de ensaio a partir de um complexo de marcador biológico de aptâmero (ou complexo de marcador biológico de fotoaptâmero covalente) e permitir o isolamento do aptâmero para a detecção e/ou quantificação. Em uma modalidade, essas construções podem incluir um elemento clivável ou libertável dentro da sequência de aptâmero. Em outras modalidades, pode ser introduzida funcionalidade adicional no aptâmero, por exemplo, um componente marcado ou detectável, um componente espaçador, ou um marcador específico de ligação ou elemento de imobilização. Por exemplo, o aptâmero pode incluir umo marcador conectada ao aptâmero por meio de uma porção clivável, umo marcador, um componente espaçador separando o marcador, e a porção clivável. Em uma modalidade, um elemento clivável é um ligante fotoclivável. O ligante fotoclivável pode ser ligado a uma porção de biotina e uma seção de separador, pode incluir um grupo NHS para derivatização de aminas, e pode ser utilizado para introduzir um grupo de biotina a um aptâmero, permitindo assim a libertação do aptâmero mais tarde em um método de ensaio.
[00209] Ensaios homogêneos, feitos com todos os componentes de ensaio na solução, não requerem a separação da amostra e dos reagentes antes da detecção do sinal. Estes métodos são rápidos e fácil de usar. Estes métodos geraram sinais baseado em uma captura molecular ou reagente ligante que reage com o seu alvo específico. Para câncer de pulmão, os reagentes de captura molecular seriam um aptâmero ou um anticorpo ou semelhante, e o alvo específico seria um marcador biológico de câncer de pulmão da Tabela 20.
[00210] Em uma modalidade, um método para a geração de sinal tira vantagem da mudança do sinal de anisotropia devido à interação de um reagente de captura marcado com fluoróforo com o seu alvo de marcador biológico específico. Quando a captura marcada reage com o seu alvo, o aumento do peso molecular faz com que o movimento rotacional do fluoróforo fixado ao complexo se tornar muito mais lenta a alteração do valor de anisotropia. Ao monitorar a alteração de anisotropia, eventos de ligação podem ser utilizados para medir quantitativamente os marcadores biológicos nas soluções. Outros métodos incluem ensaios de polarização de fluorescência, os métodos balizasmoleculares (molecular beacons) , têmpera resolvida em tempo de fluorescência, quimioluminescência, transferência de energia de ressonância de fluorescência, e semelhantes.
[00211] Um ensaio de aptâmero baseado em solução exemplificativo que pode ser usado para detectar um valor de marcador biológico correspondente a um marcador biológico em uma amostra biológica compreende o seguinte: (a) preparar uma mistura por contacto da amostra biológica com um aptâmero que inclui um primeiro marcador e tem uma afinidade específica para o marcador biológico, em que um complexo de afinidade de aptâmero é formado quando o marcador biológico está presente na amostra, (b) expor a mistura a um primeiro suporte sólido, incluindo um primeiro elemento de captura, e permitir à primeiro marcador a associar com o primeiro elemento de captura, (c) remover quaisquer componentes da mistura não associado com o primeiro suporte sólido, (d) fixar uma segundo marcador ao componente de marcador biológico do complexo de afinidade de aptâmero, (e) liberar o complexo de afinidade de aptâmero do primeiro suporte sólido, (f) expor o complexo de afinidade de aptâmero liberado a um segundo suporte sólido que inclui um segundo elemento de captura e permitindo à segundo marcador a se associar com o segundo elemento de captura, (g) remover qualquer aptâmero não complexado da mistura através do particionamento de aptâmero não complexado do complexo de afinidade de aptâmero, (h) eluir o aptâmero do suporte sólido, e (i) detectar o marcador biológico através da detecção do componente de aptâmero do complexo de afinidade de aptâmero. Determinação de Valores de Marcadores Biológicos utilizando Ensaios Imunes
[00212] Métodos de ensaio imune são baseados na reação de um anticorpo ao seu alvo correspondente ou analito e capaz de detectar o analito em uma amostra de acordo com o formato de ensaio específico. Para melhorar a especificidade e sensibilidade de um método de ensaio baseado na imuno-reatividade, frequentemente são utilizados anticorpos monoclonais por causa de seu reconhecimento de epítopo específico. Os anticorpos policlonais foram também utilizados com sucesso em vários ensaios, devido à sua maior afinidade ao alvo, em comparação com os anticorpos monoclonais. Os ensaios imunes foram concebidos para utilização com uma vasta gama de matrizes de amostras biológicas. Formatos de ensaio imune foram projetados para fornecer resultados qualitativos, semi- quantitativos e quantitativos.
[00213] Os resultados quantitativos são gerados através do uso de uma curva padrão criada com concentrações conhecidas de analito específico a ser detectado. A resposta ou sinal de uma amostra desconhecida é traçada para a curva padrão, e é estabelecida uma quantidade ou um valor correspondente ao alvo na amostra desconhecida.
[00214] Inúmeros formatos de ensaio imune foram concebidos. ELISA ou EIA podem ser quantitativos para a detecção de um analito. Este método baseia-se na colocação de umo marcador tanto no analito quanto no anticorpo e o componente de etiqueta inclui, quer direta quer indiretamente, uma enzima. Os testes de ELISA podem ser formatados para detecção direta, indireta, competitiva ou detecção de sanduíche do analito. Outros métodos dependem de etiquetas, tais como, por exemplo, radioisótopos (I125) ou de fluorescência. Outras técnicas incluem, por exemplo, aglutinação, nefelometria, turbidimetria, Western blot, imunoprecipitação, imunocitoquímica, imuno- histoquímica, citometria de fluxo, ensaio de Luminex, e outros (ver Immunoassay: A Practical Guide, editado por Brian Law, publicado por Taylor & Francis, Ltd., edição de 2005).
[00215] Formatos de ensaio exemplificativos incluem ensaio imunosorbente ligado a enzima (ELISA), ensaio radio imune, quimioluminescência, fluorescente, e ensaios imunes de transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) ou FRET resolvida no tempo (TR-FRET FRET). Exemplos de procedimentos para a detecção de marcadores biológicos incluem imunoprecipitação de marcador biológico seguido por métodos quantitativos que permitem a discriminação de tamanho e os níveis de peptídeo, tais como electroforese em gel, electroforese capilar, eletrocromatografia planar, e semelhantes.
[00216] Os métodos para detectar e/ou quantificar um marcador detetável ou material gerador de sinal dependem da natureza do marcador. Os produtos das reações catalisadas por enzimas apropriadas (em que o marcador detetável é uma enzima; ver acima) pode ser, sem limitação, fluorescente, luminescente ou radioativa ou podem absorver a luz visível ou ultravioleta. Exemplos de detetores apropriados para a detecção de tais marcadores detetáveis incluem, sem limitação, um filme de raios-X, os contadores de radioatividade, contadores de cintilação, espectrofotômetros, colorímetros, fluorímetros, luminômetros e densitômetros.
[00217] Qualquer um dos métodos de detecção pode ser realizado em qualquer formato que permite qualquer preparação, processamento e análise das reações adequada. Isto pode ser, por exemplo, em placas de ensaio de poços multiplos (por exemplo, 96 poços ou 384 poços) ou usando qualquer matriz ou micromatriz adequada. Soluções de reserva para os vários agentes podem ser feitas manualmente ou roboticamente, e toda a subsequente pipetagem, diluição, distribuição, mistura, lavagem, incubação, leitura de amostra, coleta de dados e análise pode ser feita roboticamente usando software de análise comercialmente disponível, robótica, e instrumentação de detecção capaz de detectar umo marcador detectável. Determinação dos Valores de Marcador Biológico usando Perfil de Expressão Gênica
[00218] A medição de mRNA em uma amostra biológica pode ser usada como um substituto para a detecção do nível de proteína correspondente na amostra biológica. Assim, qualquer um dos marcadores biológicos ou painéis de marcadores biológicos aqui descritos podem também ser detectados através da detecção de RNA apropriado.
[00219] Os níveis de expressão de mRNA são medidos por reação em cadeia por transcrição reversa quantitativa de polimerase (RT-PCR seguido com qPCR). RT-PCR é utilizada para criar um cDNA a partir da mRNA. O cDNA pode ser usado em um ensaio de qPCR para produzir fluorescência enquanto o processo de amplificação de DNA progride. Por comparação com uma curva padrão, o qPCR pode produzir uma medição absoluta tal como o número de cópias de mRNA por célula. Northern blots, micromatrizes, ensaios de invasor, e RT-PCR combinados com eletroforese capilar têm sido usados para medir os níveis de expressão de mRNA em uma amostra (ver, Gene Expression Profiling: Methods and Protocols, Richard A. Shimkets, editor, Humana Press, 2004).
[00220] Moléculas miRNA são pequenas RNAs que são não- codificantes, mas podem regular a expressão do gene. Qualquer um dos métodos adequados para a medição de níveis de expressão de mRNA também pode ser utilizados para a correspondente miRNA. Recentemente muitos laboratórios têm investigado o uso de miRNAs como marcadores biológicos para doença. Muitas doenças envolvem regulação da transcrição generalizada, e não é de surpreender que os miRNAs podem encontrar um papel como marcadores biológicos. A ligação entre a concentração de miRNA e doenças muitas vezes é ainda menos clara do que as conexões entre os níveis de proteína e doenças, mas o valor de marcadores biológicos miRNA pode ser substancial. É claro que, como com qualquer RNA expresso diferencialmente durante a doença, os problemas que se colocam ao desenvolvimento de um produto de diagnóstico in vitro incluem a exigência de que os miRNAs sobrevivam na célula doente e sejam facilmente extraídos para a análise, ou que os miRNAs sejam libertados no sangue ou outras matrizes onde devem sobreviver o tempo suficiente para serem medidos. Marcadores biológicos de proteína têm requisitos semelhantes, embora muitos marcadores biológicos de proteínas potenciais sejam segregados deliberadamente no local da patologia e função, durante a doença, de um modo parácrino. Muitos marcadores biológicos de proteínas potenciais são concebidos para funcionar fora das células, dentro das quais aquelas proteínas são sintetizadas. Detecção de Marcadores Biológicos Usando Tecnologias de Fomação de Imagem Molecular ao Vivo.
[00221] Qualquer um dos marcadores biológicos descritos (ver Tabela 20), podem também ser utilizados em testes de formação de imagens moleculares. Por exemplo, um agente de formação de imagem pode ser acoplado a qualquer um dos marcadores biológicos descritos, o qual pode ser utilizado para auxiliar no diagnóstico de câncer de pulmão, para monitorar a progressão/remissão ou metástase da doença, para monitorar a recorrência da doença, ou para monitorizar a resposta ao tratamento, entre outras utilizações.
[00222] Tecnologias de formação de imagem ao vivo fornecem métodos não invasivos para a determinação do estado de uma doença em particular no corpo de um indivíduo. Por exemplo, partes inteiras do corpo, ou mesmo todo o corpo, pode ser visto como uma imagem tridimensional, dando assim informação valiosa relativamente a morfologia e às estruturas do corpo. Tais tecnologias podem ser combinadas com a detecção dos marcadores descritos na presente invenção para fornecer informações sobre o estado do câncer, em particular o estado do câncer de pulmão, de um indivíduo.
[00223] O uso de tecnologias de formação de imagem molecular ao vivo está em expansão devido a vários avanços na tecnologia. Estes avanços incluem o desenvolvimento de novos agentes de contraste ou etiquetas, tais como radiomarcadores e/ou etiquetas fluorescentes, que podem fornecer sinais fortes dentro do corpo, e o desenvolvimento de tecnologia de formação de imagem nova e poderosa, que pode detectar e analisar os sinais a partir do exterior do corpo, com sensibilidade e precisão suficientes para fornecer informações úteis. O agente de contraste pode ser visualizado em um sistema de formação de imagem adequado, proporcionando assim uma imagem da parte ou partes do corpo em que o agente de contraste está localizado. O agente de contraste pode estar ligado ou associado com um reagente de captura, tal como um aptâmero ou um anticorpo, por exemplo, e/ou com um péptido ou proteína, ou um oligonucleótideo (por exemplo, para a detecção da expressão de gene), ou um complexo contendo qualquer um destes com um ou mais macromoléculas e/ou outras formas de partículas.
[00224] O agente de contraste pode também caracterizar um átomo radioativo que é útil na formação de imagem. Átomos radioativos adequados incluem tecnécio-99m ou iodo-123 para estudos de cintilografia. Outras porções prontamente detetáveis incluem, por exemplo, etiquetas de "spin" para formação de imagem de ressonância magnética (MRI), tais como, por exemplo, iodo-123 novamente, iodo- 131, índio-111, flúor-19, carbono-13, azoto-15, oxigênio -17, gadolínio, manganês ou ferro. Tais marcadores são bem conhecidos na técnica e podem ser facilmente selecionados por um perito comum na técnica.
[00225] Técnicas de formação de imagem padrão incluem, mas não estão limitadas a formação de imagem por ressonância magnética, tomografia computadorizada, tomografia por emissão de positrons (PET), tomografia computadorizada de emissão de foton único (SPECT), e semelhantes. Para diagnóstico por formação de imagem ao vivo, o tipo de instrumento de detecção disponível é um fator importante na seleção de um agente de contraste específico, tal como um dado radionuclídeo e o marcador biológico particular, que é utilizado para alvo (proteína, mRNA, e semelhantes). O radionuclídeo escolhido normalmente tem um tipo de decadência que é detetável por um determinado tipo de instrumento. Além disso, quando se seleciona um radionuclídeo para diagnóstico ao vivo, a sua meia-vida deve ser suficientemente longa para permitir a detecção, no momento de absorção máxima pelo tecido alvo, mas suficientemente curta para que a radiação deletéria do hospedeiro seja minimizada.
[00226] Técnicas de formação de imagem exemplificativas incluem, mas não estão limitados a PET e SPECT, as quais são técnicas de formação de imagem em que um radionuclídeo é sinteticamente ou localmente administrado a um indivíduo. A absorção subsequente do traçador é medida ao longo do tempo e usada para obter informação sobre o tecido alvo e o marcador biológico. Tendo em vista a alta energia (raios gama), as emissões dos isótopos específicos utilizados e da sensibilidade e da sofisticação dos instrumentos utilizados para detectá-los, a distribuição bidimensional de radioatividade pode ser inferida a partir do exterior do corpo.
[00227] Nuclídeos emissores de positron vulgarmente utilizados em PET incluem, por exemplo, carbono-11, azoto-13, oxigênio-15 e flúor- 18. Isótopos que decaem por captura de electrons e/ou emissão gama são utilizados em SPECT e incluem, por exemplo, iodo-123 e tecnétio- 99m. Um método exemplificativo para a marcação de aminoácidos com tecnécio-99m, é a redução do ion pertecnetato na presença de um precursor quelante, para formar o complexo precursor de tecnécio- 99m- lábil, o qual, por sua vez, reage com o metal do grupo de ligação de um péptido quimiotático bifuncionalmente modificado para formar um conjugado de péptido de tecnécio-99m-quimiotático.
[00228] Os anticorpos são freqüentemente usados para tais métodos ao vivo de diagnóstico por formação de imagem. A preparação e utilização de anticorpos para o diagnóstico ao vivo é bem conhecida na técnica. Anticorpos marcados que se ligam especificamente a qualquer um dos marcadores biológicos na Tabela 20 podem ser injetados em um indivíduo suspeito de ter um certo tipo de câncer (por exemplo, câncer de pulmão), detetável de acordo com o marcador biológico particular utilizado, com a finalidade de diagnosticar ou avaliar o estado da doença do indivíduo. O marcador utilizado será selecionado de acordo com a modalidade de formação de imagem a ser usada, como descrito anteriormente. A localização do marcador permite a determinação da propagação do câncer. A quantidade de marcador dentro de um órgão ou tecido, também permite a determinação da presença ou ausência de câncer naquele órgão ou tecido.
[00229] Do mesmo modo, aptâmeros podem ser utilizados para tais métodos de diagnóstico de formação de imagem ao vivo. Por exemplo, um aptâmero que foi utilizado para identificar um marcador biológico particular, descrito na Tabela 20 (e, portanto, se liga especificamente a esse marcador biológico particular) pode ser adequadamente marcado e injetado em um indivíduo suspeito de ter câncer de pulmão, detectável de acordo com o marcador biológico particular, para a finalidade de diagnosticar ou avaliar o estado do câncer de pulmão do indivíduo. O marcador utilizado será selecionado de acordo com a modalidade de formação de imagem a ser usada, como descrito anteriormente. A localização do marcador permite a determinação da propagação do câncer. A quantidade de marcador dentro de um órgão ou tecido, também permite a determinação da presença ou ausência de câncer naquele órgão ou tecido. Agentes de formação de imagem direcionados a aptâmero podem ter características únicas e vantajosas relacionadas com a penetração do tecido, a distribuição do tecido, a cinética, a eliminação, potência e seletividade em comparação com outros agentes de formação de imagem.
[00230] Tais técnicas também podem, opcionalmente, serem realizadas com oligonucleótidos marcados, por exemplo, para a detecção da expressão do gene através de formação de imagem com oligonucleótidos anti-sentido. Estes métodos são utilizados para hibridação no local, por exemplo, com moléculas fluorescentes ou radionuclideos como o marcador. Outros métodos para a detecção da expressão de genes incluem, por exemplo, a detecção da atividade de um gene relator.
[00231] Um outro tipo geral de tecnologia de formação de imagem é a formação de imagem ótica, em que os sinais fluorescentes no interior do sujeito são detetados por um dispositivo ótico que é externo ao sujeito. Estes sinais podem ser devidos a fluorescência real e/ou a luminescência biológica. As melhorias na sensibilidade dos dispositivos de detecção ótica têm aumentado a utilidade da formação de imagem ótica ao vivo em ensaios de diagnóstico.
[00232] O uso da formação de imagem de marcador biológico molecular ao vivo está aumentando, incluindo para ensaios clínicos, por exemplo, para mais rapidamente medir a eficácia clínica em ensaios para novas terapêuticas do câncer e/ou para evitar o tratamento prolongado com um placebo para aquelas doenças, tais como a esclerose múltipla, em que o tratamento prolongado pode ser considerado eticamente questionável.
[00233] Para uma revisão de outras técnicas, ver N. Blow, Nature Methods, 6, 465-469, 2009. Determinação dos Valores de marcador Biológico usando Métodos de Histologia/Citologia
[00234] Para a avaliação do câncer de pulmão, podem ser utilizadas uma variedade de amostras de tecidos em métodos histológicos ou citológicos. A seleção da amostra depende da localização do tumor primário e locais de metástases. Por exemplo, biópsias endo- e trans-brônquicas, aspirados de agulha fina, agulhas cortantes e biópsias do núcleo podem ser usada para histologia. Lavagem e escovagem brônquica, aspiração pleural, e expectoração, podem ser usadas para citologia. Embora a análise citológica seja ainda utilizada para diagnosticar câncer de pulmão, são conhecidos métodos histológicos para proporcionar uma melhor sensibilidade para a detecção de câncer. Qualquer um dos marcadores aqui identificados, que foram mostrados serem up-regulados (ver Tabela19) nos indivíduos com câncer de pulmão pode ser utilizado para colorir um espécime histológico como uma indicação de doença.
[00235] Em uma modalidade, um ou mais reagente(s) de captura específico para o(s) marcador(es) biológico(s) correspondente(s) são utilizados em uma avaliação citológica de uma amostra de células do pulmão e podem incluir um ou mais dos seguintes: coletar uma amostra de células, fixar a amostra de células, desidratar, limpar, imobilizar a amostra de célula em uma lâmina de microscópio, permeabilizar a amostra de célula, tratamento para a recuperação do analito, colorir, descolorir, lavar, bloquear, e reagir com um ou mais reagentes de captura em uma solução tamponada. Em uma outra modalidade, a amostra de células é produzida a partir de um bloco de células.
[00236] Em outra modalidade, um ou mais reagentes de captura específicos para os marcadores biológicos correspondentes são utilizados em uma avaliação histológica de uma amostra de tecido do pulmão e podem incluir um ou mais dos seguintes: coletar uma amostra de tecido, fixae a amostra de tecido, desidratar, limpar, imobilizar a amostra de tecido em uma lâmina de microscópio, permeabilizar a amostra de tecido, tratamento para a recuperação do analito, colorir, descolorir, lavar, bloquear, reidratar e reagir com o reagente de captura em uma solução tamponada. Noutra modalidade, a fixação e desidratação são substituídos por congelamento.
[00237] Em outra modalidade, o um ou mais aptâmero/s específicos para o marcador biológico correspondente são feitos reagir com a amostra histológica ou citológica e pode servir como o alvo de ácido nucleico em um método de amplificação do ácido nucleico. Métodos adequados de amplificação de ácidos nucleicos incluem, por exemplo, PCR, replicase q-beta, amplificação em círculo rolante, deslocamento de cadeia, amplificação dependente de helicase, laço de amplificação isotérmica mediada, reação em cadeia de ligase, e amplificação em círculo rolante auxiliada por circularização.
[00238] Em uma modalidade, o um ou mais reagente de captura específico para os marcadores biológicos correspondentes para utilização na avaliação histológica ou citológica são misturados em uma solução tamponada que pode incluir qualquer dos seguintes: materiais de bloqueio, concorrentes, detergentes, estabilizadores, portador de ácido nucleico, material polianiônicos, etc.
[00239] Um "protocolo de citologia" geralmente inclui coleta da amostra, fixação da amostra, imobilização da amostra, coloração. "Preparação de célula" pode incluir várias etapas de processamento após a coleta da amostra, incluindo a utilização de um ou mais aptâmeros de taxa de dissociação lenta para a coloração das células preparadas.
[00240] Coleta da amostra pode incluir colocar diretamente a amostra em um recipiente de transporte não tratado, colocar a amostra em um recipiente de transporte que contenha algum tipo de mídia, ou colocar a amostra diretamente na lâmina (imobilização), sem qualquer tratamento ou fixação.
[00241] Imobilização da amostra pode ser melhorada através da aplicação de uma parte da amostra recolhida a uma lâmina de vidro que é tratada com polilisina, gelatina, ou um silano. As lâminas podem ser preparadas por manchas de uma camada fina e uniforme de células através da lâmina. É geralmente tomado cuidado para minimizar a distorção mecânica e artefatos de secagem. As amostras líquidas podem ser processadas por um método de bloco de célula. Ou, alternativamente, amostras líquidas podem ser misturadas a 1:1 com a solução de fixação durante 10 minutos à temperatura ambiente.
[00242] Blocos de célula podem ser preparados a partir de derrame residual, escarro, sedimentos de urina, fluidos gastrintestinais, raspagem de células, ou aspirados por agulha fina. As células são concentradas ou embaladas por meio de centrifugação ou de filtração por membrana. Foram desenvolvidos um certo número de métodos para a preparação de blocos de células. Procedimentos representativos incluem o sedimento fixo, agar bacteriano, ou métodos de filtração por membrana. No método de sedimento fixo, o sedimento de células é misturado com um agente fixador como Bouins, ácido pícrico, ou formalina tamponada e, em seguida, a mistura é centrifugada para formar pelota das células fixadas. O sobrenadante é removido, secando a pelota de células, tão completamente quanto possível. A pelota é recolhida e embrulhada em papel de lente e, em seguida, colocada em um cassete de tecido. O cassete de tecido é colocado em um frasco com fixador adicional e processado como uma amostra de tecido. O método agar é muito semelhante, mas a pelota é removida e seca sobre toalha de papel e, em seguida, cortada ao meio. O lado de corte é colocado em uma gota de agar derretida em uma lâmina de vidro e, em seguida, a pelota é coberta com agar certificando-se que nenhuma bolha se forma no agar. O agar é permitido endurecer e, em seguida, qualquer excesso de agar é aparado fora. Este é colocado em um cassete de tecido e o processo de tecido completado. Alternativamente, a pelota pode ser diretamente suspensa em 2% de agar líquido a 65 °C e a amostra centrifugada. A pelota de células de agar é permitida solidificar durante uma hora a 4 °C. O agar sólido pode ser removido do tubo da centrífuga e cortado ao meio. O agar é embrulhado em papel de filtro e, em seguida, o cassete de tecido. O processamento a partir deste ponto para a frente é como descrito acima. A centrifugação pode ser substituída em qualquer destes processos com filtração de membrana. Qualquer desses processos pode ser usado para gerar uma " amostra de bloco de células".
[00243] Blocos de células podem ser preparados utilizando resina especializada, incluindo resinas Lowicryl, LR White, LR Gold, Unicryl e MonoStep. Estas resinas têm uma baixa viscosidade e podem ser polimerizadas a baixas temperaturas e com ultra-violetas (UV). O processo de incorporação depende em progressivamente arrefecer a amostra, durante a desidratação, transferindo a amostra para a resina, e polimerizando um bloco à temperatura final baixa em comprimento de onda UV apropriado.
[00244] Seções de bloco de células podem ser coloridos com hematoxilina-eosina para exame citomorfológico enquanto seções adicionais são usadas para exame para marcadores específicos.
[00245] Se o processo é citologico ou histológico, a amostra pode ser fixada antes de processamento adicional para evitar a degradação da amostra. Este processo é chamado de "fixação" e descreve uma grande variedade de materiais e procedimentos que podem ser utilizados de forma intercambiável. O protocolo de fixação de amostras e reagentes são melhor selecionados empiricamente com base nos alvos a serem detectados e o tipo de célula/tecido específico a ser analisado. A fixação da amostra baseia-se em reagentes tais como o etanol, o polietileno-glicol, metanol, formalina, ou isopropanol. As amostras devem ser fixados, logo após a sua coleta e fixação à lâmina quanto possível. No entanto, o fixador selecionado pode introduzir mudanças estruturais em vários alvos moleculares tornando sua subsequente detecção mais difícil. A fixação e os processos de imobilização e sua sequência podem modificar a aparência das células e estas alterações devem ser antecipadas e reconhecida pelo citotecnologista. Os fixadores podem causar encolhimento de certos tipos de células e fazer com que o citoplasma apareca granular ou reticular. Muitas fixadores funcionam por meio de componentes celulares de ligação cruzada. Isto pode danificar ou alterar epítopos específicos, gerar novos epítopos, causar associações moleculares, e reduzir a permeabilidade da membrana. A fixação de formol é uma das abordagens citológicas/histológicas mais comuns. A formalina forma pontes metílicas entre proteínas vizinhas ou dentro de proteínas. A precipitação ou coagulação é também usada para a fixação e o etanol é frequentemente utilizado neste tipo de fixação. Uma combinação de reticulação e precipitação também pode ser utilizada para a fixação. Um processo de fixação forte é melhor para a preservação de informações morfológicas enquanto um processo de fixação mais fraco é melhor para a preservação de alvos moleculares.
[00246] Um fixador representativo é de 50% de etanol absoluto, 2 mM de polietileno glicol (PEG), 1,85% de formaldeído. Variações sobre esta formulação incluem o etanol (50% a 95%), metanol (20% - 50%) e formalina (formaldeído) apenas. Outro fixador comum é de 2% de PEG 1500, 50% de etanol, e 3% de metanol. As lâminas são colocadas no fixador durante cerca de 10 a 15 minutos à temperatura ambiente e, em seguida, removidas e deixadas secar. Uma vez que as lâminas estão fixadas podem ser lavadas com uma solução tamponada como PBS.
[00247] Uma grande variedade de corantes podem ser usados para realçar diferencialmente e contrastar ou "colorir" características celulares, sub-celulares, e de tecidos ou estruturas morfológicas. Hematoilina é usada para colorir núcleos de uma cor azul ou preta. Orange G-6 e Eosina Azure, ambas, colorem citoplasma de célula. Orange G colre queratina e células que contêm glicogênio amarelo. Eosina Y é usada para colorir nucléolos, cílios, células vermelhas do sangue e células superficiais do epitélio escamoso. Corantes Romanowsky são utilizados para lâminas secas ao ar e são úteis em aumentar pleomorfismo e distinguir material extracelular de material intracitoplasmático.
[00248] O processo de coloração pode incluir um tratamento para aumentar a permeabilidade das células à coloração. O tratamento das células com um detergente pode ser usado para aumentar a permeabilidade. Para aumentar a permeabilidade celular e de tecido, amostras fixadas podem ainda ser tratadas com solventes, saponinas, ou detergentes não iônicos. A digestão enzimática pode também melhorar a acessibilidade dos alvos específicos em uma amostra de tecido.
[00249] Após a coloração, a amostra é desidratada com uma sucessão de lavagens com álcool de concentração crescente de álcool. A lavagem final é feita com xileno ou um substituto de xileno, tal como um terpeno cítrico, que tem um índice de refração próximo ao da lamela a ser aplicada à lâmina. Esta etapa final é dita como limpeza. Uma vez que a amostra é desidratada e limpa, é aplicado um meio de montagem. O meio de montagem é escolhido para ter um índice de refração próximo do vidro e é capaz de ligar a lamela à lâmina. Também irá inibir a secagem adicional, o encolhimento ou atenuação da amostra de células.
[00250] Independentemente da coloração ou de processamento utilizados, a avaliação final do espécime citológico de pulmão é feito por algum tipo de microscopia para permitir uma inspeção visual da morfologia e a determinação da presença ou ausência do marcador. Métodos de microscopia exemplificativos incluem microscopia de campo claro, contraste de fase, fluorescência e contraste de interferência diferencial.
[00251] Se são necessários testes secundários na amostra após o exame, a lamela pode ser removida e a lâmina descolorida. A descoloração envolve a utilização de sistemas de solventes originais utilizados na coloração da lâmina inicialmente sem o corante adicionado e em uma ordem inversa, ao procedimento de coloração original. A descoloração pode também ser completada por imersão da lâmina em um álcool de ácido até que as células sejam incolores. Uma vez incolor as lâminas são lavadas bem em um banho de água e o segundo processo de coloração aplicado.
[00252] Além disso, a diferenciação molecular específica pode ser possível, em conjunto com a análise morfológica celular através da utilização de reagentes moleculares específicos, tais como anticorpos ou sondas de ácidos nucleicos ou aptâmeros. Isso melhora a precisão do diagnóstico citológico. Micro-dissecção pode ser utilizada para isolar um subconjunto de células para avaliação adicional, em particular, para a avaliação genética dos cromossomas anormais, expressão de genes, ou mutações.
[00253] A preparação de uma amostra de tecido para exame histológico envolve fixação, desidratação, infiltração, incorporação e seccionamento. Os reagentes de fixação utilizados em histologia são muito semelhantes ou idênticos aos utilizados na citologia e tem os mesmos problemas de preservar as características morfológicas em detrimento das moleculares, tais como proteínas individuais. Tempo pode ser salvo se a amostra de tecido não está fixa e desidratada, mas em vez disso é congelada e seccionada enquanto congelada. Este é um procedimento de processamento mais suave e pode preservar mais marcadores individuais. No entanto, o congelamento, não é aceitável para o armazenamento a longo prazo de uma amostra de tecido já que a informação subcelular é perdida devido à introdução de cristais de gelo. O gelo na amostra de tecido congelado também evita que o processo de corte produza uma fatia muito fina e, consequentemente, alguma resolução de imagem microscópica e de estruturas subcelulares podem ser perdidas. Além da fixação em formalina, o tetróxido de ósmio é utilizado para fixar e colorir fosfolípidos (membranas).
[00254] A desidratação dos tecidos é realizada com lavagens sucessivas de álcool de concentração crescente. A limpeza utiliza um material que é miscível com o álcool e o material de embutir, e envolve um processo por etapas a partir de 50:50 de álcool e reagente de limpeza e, em seguida, agente de limpeza de 100% (xileno ou substituto de xileno). A infiltração envolve a incubação do tecido com uma forma líquida do agente de encastre (cera quente, a solução de nitrocelulose), primeiro a incorporação agente 50:50: agente de limpeza e o agente de incorporação de 100%. O embebimento é completado colocando o tecido em um molde ou cassete e enchendo com agente de embebimento derretido, tais como cera, agar ou gelatina. O agente de embebimento é deixado endurecer. A amostra de tecido endurecido pode, então, ser cortada em lâminas delgadas para a coloração e exame subsequente.
[00255] Antes da coloração, a seção de tecido é desencerado e reidratada. O xileno é usado para desencerar a seção, uma ou mais mudanças de xileno podem ser usadas, e o tecido é re-hidratado por lavagens sucessivas em álcool de concentração decrescente. Antes de desencera, a seção de tecido pode ser imobilizada por calor para uma lâmina de vidro a cerca de 80°C durante cerca de 20 minutos.
[00256] Micro-dissecção de captura a laser permite o isolamento de um sub-conjunto de células para análise posterior a partir de uma seção de tecido.
[00257] Como na citologia, para melhorar a visualização das características microscópicas, a seção de tecido ou lâmina pode ser marcada com uma variedade de colorações. Um grande menu de colorações comercialmente disponíveis podem ser usadas para melhorar ou identificar características específicas.
[00258] Para aumentar ainda mais a interação entre os reagentes moleculares com amostras citológicas /histológicas, foram desenvolvidas uma série de técnicas de "recuperação de analito". A primeira de tais técnicas, utiliza aquecimento a alta temperatura de uma amostra fixa. Este método é também conhecido como recuperação de epítopo induzida pelo calor ou HIER. Uma variedade de técnicas de aquecimento têm sido utilizadas, incluindo aquecimento a vapor, microondas, autoclavagem, banho de água, e cozimento a pressão ou de uma combinação destes métodos de aquecimento. Soluções de recuperação de analitos incluem, por exemplo, água, citrato, e tampões salinos normais. A chave para a recuperação do analito é o tempo a alta temperatura, mas as temperaturas mais baixas de tempos mais longos também têm sido utilizados com sucesso. Outra chave para a recuperação de analito é o pH da solução de aquecimento. pH baixo foi verificado proporcionar a melhor imunocoloração mas também dá origem a formações que frequentemente requerem a utilização de uma segunda seção de tecido, como um controle negativo. O benefício mais consistente (um aumento de imunocoloração sem aumento do fundo) é geralmente obtido com uma solução de pH elevado, independentemente da composição do tampão. O processo de recuperação do analito para um alvo específico é empiricamente otimizado para o alvo usando o calor, tempo, pH, e a composição do tampão como variáveis para a otimização do processo. Usando o método de recuperação de analito de microondas permite a coloração seqüencial de alvos diferentes, com reagentes de anticorpos. Mas o tempo necessário para atingir o anticorpo e os complexos de enzimas entre as etapas de coloração também foi mostrado degradar analitos de membrana celular. Bem como, métodos de aquecimento de micro-ondas têm melhorado métodos de hibridização no local.
[00259] Para iniciar o processo de recuperação de analito, a seção é primeiro desencerada e hidratada. A lâmina é então colocada em 10 mM de tampão de citrato de sódio de pH 6,0, em um prato ou frasco. Um procedimento representativo usa um microondas de 1100W e aplica microondas à lâmina em potência de 100% por 2 minutos, seguido de aplicação de microondas às lâminas usando a energia de 20% por 18 minutos após a verificação para ter certeza de que a lâmina permanece coberta no líquido. A lâmina é então deixada arrefecer no recipiente descoberto e, em seguida, lavada com água destilada. HIER pode ser utilizada em combinação com uma digestão enzimática para melhorar a reatividade do alvo a reagentes imunoquímicos.
[00260] Um tal protocolo de digestão enzimática, utiliza proteinase K. Uma concentração de 20 μg/ml de proteinase K é preparada em tampão de 50 mM Tris Base, 1 mM de EDTA, 0,5% de Triton X-100, pH 8,0. O primeiro processo envolve seções de desenceramento em duas mudanças de xileno, 5 minutos cada. Em seguida, a amostra é hidratada em duas mudanças de etanol a 100%, durante 3 minutos cada, a 95% e etanol a 80% durante 1 minuto cada uma, e, em seguida, lavada em água destilada. As seções são cobertas com a solução de trabalho de Proteinase K e incubadas 10-20 minutos a 37°C em câmara úmida (o tempo de incubação ideal pode variar dependendo do tipo de tecido e do grau de fixação). As seções são arrefecidas à temperatura ambiente durante 10 minutos e depois lavadas em PBS Tween 20 por 2x2 min. Se desejado, as seções podem ser bloqueadas para eliminar possíveis interferências de compostos endógenos e enzimas. A seção é depois incubada com anticorpo primário a uma diluição adequada em tampão de diluição de anticorpo primário durante 1 hora à temperatura ambiente ou durante a noite a 4°C. A seção é depois lavada com PBS Tween 20 por 2x2 min. Bloqueio adicional pode ser realizado, se necessário para a aplicação específica, seguido por lavagem adicional com PBS Tween 20 por 3x2 min e, em seguida, finalmente, o protocolo de imunocoloração está concluído.
[00261] Um tratamento simples com 1% de SDS à temperatura ambiente foi também demonstrado melhorar a coloração imuno- histoquímica. Métodos de recuperação de analitos foram aplicados seções montadas em lâmina, bem como em seções flutuantes livres. Outra opção de tratamento é o de colocar a lâmina em um frasco contendo ácido cítrico e 0,1 Nonident P40 a pH 6,0 e aquecimento a 95°C. A lâmina é então lavada com uma solução tampão como PBS.
[00262] Para a coloração imunológica de tecidos que pode ser útil para bloquear a não - associação específica do anticorpo com proteínas do tecido por imersão da seção em uma solução de proteína como soro ou de leite magro seco.
[00263] Reações de bloqueio podem incluir a necessidade de reduzir o nível de biotina endógena; eliminar os efeitos de carga endógenos; inativar nucleases endógenas, e/ou inativar as enzimas endógenas tais como peroxidase e fosfatase alcalina. Nucleases endógenas podem ser inativadas por degradação com proteinase K, por tratamento térmico, utilização de um agente quelante tal como EDTA ou EGTA, a introdução de portador DNA ou RNA, o tratamento com um agente caotrópico tal como a ureia, tio-ureia, hidrocloridrato de guanidina, tiocianato de guanidina, perclorato de lítio, etc, ou pirocarbonato de dietila. A fosfatase alcalina pode ser inativada por tratamento com 0,1 N HCl durante 5 minutos à temperatura ambiente, ou tratamento com 1 mM de levamisole. A atividade de peroxidase pode ser eliminada por tratamento com peróxido de hidrogênio a 0,03%. A biotina endógena pode ser bloqueada por imersão da lâmina ou seção em uma solução de avidina (estreptavidina, neutravidina pode ser substituída), por pelo menos 15 minutos à temperatura ambiente. A lâmina ou seção é então lavada durante pelo menos 10 minutos em tampão. Isto pode ser repetido pelo menos três vezes. Em seguida, a lâmina ou seção é embebida em uma solução de biotina durante 10 minutos. Isto pode ser repetido pelo menos três vezes com uma solução de biotina fresca de cada vez. O procedimento de lavagem de tampão é repetido. Protocolos de bloqueio devem ser minimizados para evitar a danificação das células ou do tecido ou da estrutura ou o alvo ou alvos de interesse, mas um ou mais destes protocolos podem ser combinadas para "bloquear" uma lâmina ou uma seção antes da reação com um ou mais aptâmeros de taxa de dissociação lenta. Ver Basic Medical Histology: the Biology of Cells, Tissues and Organs, de autoria de Richard G. Kessel, Oxford University Press, 1998. Determinação de Valores de Marcadores Biológicos utilizando Métodos de Espectrometria de Massa
[00264] Uma variedade de configurações de espectrômetros de massa pode ser utilizada para detectar os valores de marcadores biológicos. Vários tipos de espectrômetros de massa estão disponíveis ou podem ser produzidos com várias configurações. Em geral, um espectrômetro de massa tem os seguintes componentes principais: uma entrada de amostras, uma fonte de ions, um analisador de massa, um detetor, um sistema de vácuo, um instrumento de controle de sistema, e um sistema de dados. As diferença na entrada da amostra, fonte de íons, e analisador de massa geralmente definem o tipo de instrumento e suas capacidades. Por exemplo, uma entrada pode ser uma fonte de cromatografia líquida de coluna capilar ou pode ser uma sonda ou estágio direto tal como utilizado em. Fontes comuns de ions são, por exemplo, eletrosaspersão, incluindo nanoaspersão e microaspersão ou dessorção de matriz assistida por laser. Analisadores de massa comuns incluem um filtro de massa quadripolar, analisador de massa de armadilha de íon e analisador de massa tempo-de-vôo. Métodos de espectrometria de massa adicionais são bem conhecidos na técnica (ver Burlingame et al. Anal. Chem. 70:647 R-716R (1998); Kinter e Sherman Sequenciação e identificação de proteínas usando espectrometria de massa tandem New York: Wiley-Interscience ( 2000).
[00265] Marcadores biológicos de proteína e valores de marcadores biológicos podem ser detetados e medidos por qualquer um dos seguintes: espectrometria de massa com ionização por electroaspersão (ESI-MS), ESI-MS/MS, ESI-MS/(MS)n, espectrometria de massa de ionização de tempo-de-voo de dessorção dessorção de matriz assistida por laser (MALDI-TOF-MS), espectrometria de massa de ionização /dessorção de tempo de vôo de laser de superfície melhorada (SELDI-TOF-MS), dessorção/ionização em silício (DIOS) espectrometria de massa de ions secundários (SIMS), quadrupolo de tempo de voo (Q-TOF), tecnologia tandem por tempo de voo (TOF/TOF), chamada UltraFlex IIITOF/TOF, espectrometria de massa de ionização química à pressão atmosférica (APCI-MS), APCI- MS/MS, APCI-(MS)-N, espectrometria de massa de fotoionização a pressão atmosférica (APPI-MS), APPI-MS/MS e APPI (MS)N, espectrometria de massa quadrupolar, espectrometria de massa de transformada de Fourier (FTMS), espectrometria de massa quantitativa e espectrometria de massa de armadilha de íons.
[00266] Estratégias de preparação de amostra são utilizadas para marcar e enriquecer amostras antes da caracterização espectroscópica de massa de marcadores biológicos de proteína e determinação de valores de marcadores biológicos. Métodos de marcação incluem, mas não estão limitados a marcação isobárica para quantificação relativa e absoluta (iTRAQ) e marcação de isótopo estável com aminoácidos em cultura de células (SILAC). Reagentes de captura utilizados para enriquecer seletivamente as amostras para as proteínas de marcadores biológicos candidatos antes da análise espectroscópica de massa incluem, mas não estão limitados aaptâmeros, anticorpos, sondas de ácidos nucleicos, quimeras, moléculas pequenas, um fragmento F (ab')2, um fragmento de anticorpo de cadeia única, um fragmento Fv, um fragmento Fv de cadeia simples, um ácido nucleico, uma lectina, um receptor de ligação-ligante, corpos de afinidade, nanocorpos, anquirinas, anticorpos de domínio, estruturas e anticorpos alternativos (por exemplo, diacorpos etc) polímeros impressos, avimeros, peptidomiméticos, peptóides, peptídeos de ácidos nucleicos, ácidos nucleicos treose, um receptor de hormona, um receptor de citocina, e receptores sintéticos, e modificações e fragmentos destes.
[00267] Os ensaios anteriores permitem a detecção dos valores de marcadores biológicos, que são úteis em métodos para diagnosticar câncer de pulmão, onde os métodos compreendem, detectar uma amostra biológica de um indivíduo, pelo menos N valores de marcadores biológicos cada um correspondendo a um marcador biológico selecionado do grupo que consiste dos marcadores biológicos fornecidos nas Tabelas 18, 20 ou 21, em que uma classificação, tal como descrito em detalhe a seguir, utilizando os valores de marcadores biológicos indica se o indivíduo tem câncer de pulmão. Enquanto alguns dos marcadores biológicos de câncer de pulmão descritos são úteis por si só para a detecção e diagnóstico de câncer de pulmão, métodos são também descritos aqui para o agrupamento de vários subconjuntos dos marcadores biológicos de câncer de pulmão, cada um dos quais são úteis como um painel de três ou mais marcadores biológicos. Assim, várias modalidades do presente pedido de patente proporcionam combinações que compreendem N marcadores, em que N é de pelo menos três marcadores. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 2-86 marcadores biológicos. Será apreciado que N pode ser selecionado para ser qualquer número de qualquer uma das faixas acima descritas, bem como de faixas similares, mas de ordem superior. De acordo com qualquer dos métodos descritos neste documento, os valores de marcadores biológicos podem ser detectados e classificadas individualmente ou podem ser detectados e classificados em conjunto, como por exemplo, em um formato de ensaio multiplexado.
[00268] Em outro aspecto, são fornecido métodos para a detecção de uma ausência de câncer de pulmão, os métodos compreendendo detectar, em uma amostra biológica de um indivíduo, pelo menos N valores de marcadores biológicos, cada um correspondendo a um marcador biológico selecionado a partir do grupo consistindo dos marcadores biológicos fornecidos nas Tabelas 18, 20 ou 21, em que uma classificação, tal como descrito em detalhe a seguir, dos valores de marcadores biológicos indica a ausência de câncer de pulmão no indivíduo. Embora alguns dos marcadores biológicos de câncer de pulmão descritos são úteis por si só para detectar e diagnosticar a ausência de câncer de pulmão, os métodos são também descritos aqui para o agrupamento de vários subconjuntos dos marcadores biológicos de câncer de pulmão, cada um dos quais são úteis como um painel de três ou mais marcadores biológicos. Assim, várias modalidades do presente pedido de patente proporcionam combinações que compreendem N marcadores, em que N é de pelo menos três marcadores. Em outras modalidades, N é selecionado para ser qualquer número de 2-86 marcadores biológicos. Será apreciado que N pode ser selecionado para ser qualquer número de qualquer uma das gamas acima descritas, bem como de faixas similares, mas de ordem superior. Em conformidade com qualquer dos métodos descritos neste documento, os valores de marcadores biológicos podem ser detetadas e classificados individualmente ou podem ser detectados e classificados em conjunto, como por exemplo, em um formato de ensaio multiplexado. Classificação de Marcadores Biológicos e Cálculo de Pontuação de Doença
[00269] Uma "assinatura" de marcador biológico para um determinado teste de diagnóstico contém um conjunto de marcadores, cada marcador tendo níveis diferentes na população de interesse. Níveis diferentes, neste contexto, pode referir-se a diferentes meios dos níveis de marcadores para os indivíduos em dois ou mais grupos, ou variações diferentes nos dois ou mais grupos, ou uma combinação de ambos. Para a forma mais simples de um teste de diagnóstico, esses marcadores podem ser usados para atribuir uma amostra desconhecida de um indivíduo em um de dois grupos, ou doente ou não doente. A atribuição de uma amostra em um de dois ou mais grupos é conhecida como classificação, e o procedimento usado para realizar esta tarefa é conhecido como um classificador ou um método de classificação. Métodos de classificação podem também ser ditos como métodos de pontuação. Há muitos métodos de classificação que podem ser usados para construir um classificador de diagnóstico a partir de um conjunto de valores de marcadores biológicos. Em geral, os métodos de classificação são mais facilmente realizados utilizando técnicas de aprendizado supervisionado, onde um conjunto de dados são coletados através de amostras obtidas de indivíduos dentro de dois (ou mais, para os estados de classificação múltiplos) grupos distintos que se deseja distinguir. Uma vez que a classe (ou grupo de população), ao qual pertence cada amostra é conhecido antecipadamente, para cada amostra, o método de classificação pode ser treinado para dar resposta à classificação desejada. Também é possível a utilização de técnicas de aprendizagem não supervisionadas para produzir um classificador de diagnóstico.
[00270] Abordagens comuns para o desenvolvimento de classificadores de diagnóstico incluem árvores de decisão; ensacamento + impulsionamento + florestas; aprendizagem baseada em regra de inferência; Janelas Parzen; modelos lineares; logística, métodos de redes neurais; agrupamento não supervisionado; meios-K; hierárquica ascendente/descendente, aprendizagem semi- supervisionada, métodos de protótipo; vizinho mais próximo; estimativa da densidade kernel; máquinas de vetor de suporte; modelos ocultos de Markov; Aprendizagem Boltzmann e classificadores podem ser combinadas tanto simplesmente quanto de formas que minimizem funções objetivo particulares. Para uma revisão, ver, por exemplo, Pattern Classifications, R.O. Duda, et al., editores, John Wiley & Sons, 2a edição, 2001, ver também, The Elements of Statiscal Learning - Data Mining, Inference, and Prediction, T. Hastie, et al, editores, Springer Science + Business Media, LLC, 2a edição, 2009, cada um dos quais é incorporado por referência na sua totalidade.
[00271] Para produzir um classificador usando técnicas de aprendizagem supervisionada, são obtidos um conjunto de amostras chamados dados de treinamento. No contexto de testes de diagnóstico, dados de treinamento incluem amostras dos diferentes grupos (classes) aos quais amostras desconhecidas, mais tarde, serão atribuídas. Por exemplo, amostras coletadas de indivíduos de uma população de controle e indivíduos de uma população particular de doença podem constituir dados de treinamento para desenvolver um classificador que pode classificar as amostras desconhecidas (ou, mais particularmente, os indivíduos dos quais as amostras foram obtidas) ou como tendo a doença ou como estarem livres da doença. O desenvolvimento do classificador a partir dos dados de formação é conhecido como formação do classificador. Os detalhes específicos sobre a formação do classificador depende da natureza da técnica de aprendizagem supervisionada. Para fins de ilustração, um exemplo de formação de um classificador Bayesiano simples será descrito abaixo (ver por exemplo, Pattern Classifications, R.O. Duda, et al., editores, John Wiley & Sons, 2a edição, 2001; ver também, The Elements of Statiscal Learning - Data Mining, Inference, and Prediction, T. Hastie, et al, editores, Springer Science + Business Media, LLC, 2a edição, 2009).
[00272] Uma vez que normalmente há muito mais valores de marcadores biológicos potenciais do que amostras em um conjunto de treinamento, o cuidado deve ser usado para evitar o excesso de ajustagem. Excesso de ajustagem ocorre quando um modelo estatístico descreve erro aleatório ou ruído, em vez da relação subjacente. Excesso de ajustagem pode ser evitada de várias maneiras, incluindo, por exemplo, através da limitação do número de marcadores utilizados para o desenvolvimento do classificador, assumindo-se que as respostas de marcadores são independentes uma da outra, ao limitar a complexidade do modelo estatístico subjacente empregado, e assegurando que o modelo estatístico subjacente está de acordo com os dados.
[00273] Um exemplo ilustrativo do desenvolvimento de um teste de diagnóstico utilizando um conjunto de marcadores biológicos inclui a aplicação de um classificador de Bayes simples, um classificador probabilístico simples com base no teorema de Bayes com tratamento independente estrito dos marcadores biológicos. Cada marcador biológico é descrito por uma função de densidade de probabilidade dependente de classe (pdf) para os valores medidos RFU ou valores de log RFU (unidades relativas de fluorescência) em cada classe. As pdfs de junção para o conjunto de marcadores de uma classe é assumido como sendo o produto das pdfs dependentes de classe para cada marcador biológico. Treinar um classificador de Bayes simples neste contexto equivale a atribuir parâmetros ("parametrização") para caracterizar as pdfs dependentes de classe. Qualquer modelo subjacente para as pdfs dependentes de classe pode ser utilizado, mas em geral, o modelo deve estar em conformidade com os dados observados no conjunto de treinamento.
[00274] Especificamente, a probabilidade dependente de classe de medir um valor xi para o marcador biológico i na classe de doença é escrita como p(xi |d ) e a probabilidade global de Bayes simples de observar n marcadores com valores x = (x1, x2,...xn) é escrita como
[00275] P(x|d) = π p(xi |d ) para i variando de 1 a n, onde Xi s são os níveis de marcadores biológicos medidos em RFU ou log RFU. A atribuição de classificação para uma amostra desconhecida é facilitada pelo cálculo da probabilidade de estar livre de doença (controle) p(c|x) para os mesmos valores medidos. A razão destas probabilidades é calculada a partir dos pdfs dependentes de classe por aplicação do teorema de Bayes, ou seja,
[00276] p(c|x)/p(d|x) = p(x|c)(1-P(d))/p(x|d)P(d) onde P(d) é a prevalência da doença na população apropriada para o teste. Tomando o logaritmo de ambos os lados dessa relação e substituindo as probabilidades dependentes de classe de Bayes simples acima dá: In p(c|x)/p(d|x) = ∑ln {p(Xi|c)/p(Xi|d )} +ln{(1-P(d))/P(d)}
[00277] Esta forma é conhecida como a razão de log de probabilidade e simplesmente estabelece que o log de probabilidade de estar livre da doença em particular versus tendo a doença é essencialmente composta da soma das razões de log de probabilidade individual dos n marcadores biológicos individuais. Na sua forma mais simples, uma amostra desconhecida (ou, mais particularmente, o indivíduo de quem a amostra foi obtida) é classificada como sendo livres da doença, se a razão acima é maior do que zero e tendo a doença, se a relação for inferior a zero.
[00278] Em uma modalidade exemplificativa, os pdfs de marcadores biológicos dependentes de classe p(xi|c) e p(xi|d ) são assumidos ser distribuições normal ou log-normal nos valores xi de RFU medidos, ou
Figure img0001
[00279] com uma expressão similar para p(Xi|d) com μd,i e (αd,i)2. A parametrização do modelo requer a estimativa dos dois parâmetros para cada pdf dependente de classe, uma média μ e uma variância α2, a partir dos dados de treinamento. Isto pode ser conseguido de várias maneiras, incluindo, por eXemplo, por estimativas de probabilidade máXima, por mínimos quadrados, e por quaisquer outros métodos conhecidos de um perito na técnica. Substituindo as distribuições normais para p(Xi|c) e p(Xi|d ) dentro da razão de log de probabilidade definida acima dá a seguinte eXpressão:
Figure img0002
[00280] Uma vez que um conjunto de μs e α2s foram definidos para cada pdf em cada classe a partir dos dados de treinamento e a prevalência de doença na população é especificada, o classificador de Bayes, está completamente determinado e pode ser utilizado para classificar amostras desconhecidas com os valores de X medidos.
[00281] O desempenho do classificador de Bayes simples é dependente do número e da qualidade dos marcadores biológicos utilizados para construir e treinar o classificador. Um marcador biológico único que funcionará de acordo com a sua distância KS (Kolmogorov-Smirnov), tal como definido no Exemplo 3, abaixo. Se uma métrica de desempenho do classificador é definida como a soma da sensibilidade (fração de verdadeiros positivos,fTP) e especificidade (um menos a fracção de falsos positivos, 1- fFP), um classificador perfeito terá uma pontuação de dois e um classificador de forma aleatória, em média, terá uma pontuação de um. Utilizando a definição da distância KS, aquele valor x* que maximiza a diferença nas funções cdf pode ser encontrado resolvendo
Figure img0003
[00282] para x que leva a, p(x*|c) = p(x*|d )
[00283] isto é, a distância KS ocorre onde os pdfs dependentes de classe se cruzam. Substituindo este valor de x* dentro da expressão para a distância KS produz a seguinte definição para,
Figure img0004
[00284] a distância KS é um menos a fracção total de erros usando um teste com um ponto de corte em x*, essencialmente, um classificador Bayesiano de analito único. Desde que definimos uma pontuação de sensibilidade + especificidade = 2 - - fFP - fFN, combinando a definição acima da distância KS, vemos que sensibilidade + especificidade = 1 +KS. Nós selecionamos marcadores biológicos com uma estatística que é inerentemente adequada para a construção de classificadores de Bayes simples.
[00285] A adição de subsequentes marcadores com boas distâncias KS (> 0,3, por exemplo), em geral, melhora o desempenho da classificação, se os marcadores adicionados subsequentemente são independentes do primeiro marcador. Usando a sensibilidade mais especificidade como uma pontuação de classificação, é fácil gerar muitos classificadores de alta pontuação com uma variação de um algoritmo "greedy". (Um algoritmo "greedy" é qualquer algoritmo que segue a metaheurística de solução de problemas de fazer a escolha ótima localmente em cado estágio, com a esperança de encontrar o ótimo global.)
[00286] A abordagem de algoritmo aqui utilizada é descrita em detalhe no Exemplo 4. Resumidamente, todos os classificadores de analitos individuais são gerados a partir de uma tabela de marcadores biológicos potenciais e adicionados a uma lista. Em seguida, todas as adições possíveis de um segundo analito a cada um dos classificadores de analitos individuais armazenados é então realizada, salvando um número predeterminado de pares de melhor pontuação, digamos, por exemplo, um mil, em uma nova lista. Todos os possíveis classificadores de três marcadores são explorados usando essa nova lista dos melhores classificadores de dois marcadores, novamente salvando o melhor (mil) destes. Este processo continua até que a pontuação se torne um platô constante ou começa a se deteriorar enquanto marcadores adicionais são adicionados. Aqueles classificadores de pontuações elevadas que permanecem após a convergência podem ser avaliados para o desempenho desejado para uma utilização pretendida. Por exemplo, em uma aplicação de diagnóstico, classificadores com uma alta sensibilidade e especificidade modesta podem ser mais desejáveis do que a sensibilidade modesta e elevada especificidade. Em outra aplicação de diagnóstico, classificadores com uma elevada especificidade e uma sensibilidade modesta podem ser mais desejáveis. O nível desejado de desempenho é geralmente selecionado com base em um compromisso que deve ser feito entre o número de falsos positivos e falsos negativos, que podem cada um ser tolerados para a aplicação particular de diagnóstico. Tais compromissos geralmente dependem das conseqüências médicas de um erro, tanto falso negativo quanto falso positivo.
[00287] Várias outras técnicas são conhecidas na técnica e podem ser utilizadas para gerar muitos classificadores potenciais a partir de uma lista de marcadores biológicos utilizando um classificador de Bayes simples. Em uma modalidade, que é referida como um algoritmo genético pode ser usado para combinar diferentes marcadores utilizando a pontuação de aptidão, tal como definido acima. Os algoritmos genéticos são particularmente bem adaptados para explorar uma grande população diversa de classificadores potenciais. Noutra modalidade, a chamada otimização de colônia pode ser utilizada para gerar conjuntos de classificadores. Outras estratégias que são conhecidas na técnica podem também ser empregadas, incluindo, por exemplo, outras estratégias evolutivas bem como anelamento simulado ("Simulated Annealing") e outros métodos de pesquisa estocástica. Métodos de metaheurística, tais como, por exemplo, pesquisa de harmonia podem também ser empregados.
[00288] Modalidades exemplificativas usam qualquer número de marcadores biológicos de câncer de pulmão listados nas Tabelas 18, 20 ou 21, em várias combinações para a produção de testes de diagnóstico para a detecção de câncer de pulmão (ver Exemplos 2 e 6 para uma descrição detalhada de como estes marcadores foram identificados). Em uma modalidade, um método para diagnosticar câncer de pulmão usa um método de classificação de Bayes simples em conjunção com qualquer número de marcadores biológicos de câncer de pulmão que figuram nas tabelas 18, 20 ou 21. Em um exemplo ilustrativo (Exemplo 3), o teste mais simples para a detecção de câncer de pulmão a partir de uma população de fumantes assintomáticos pode ser construído utilizando um marcador biológico único, por exemplo, SCFsR que é regulada para baixo em câncer de pulmão com uma distância KS de 0,37 (1+KS= 1.37). Usando os parâmetros, μc,i, CTO.I, μd.i, e aa.i, para SCFsR a partir da Tabela 15 e a equação para o log de probabilidade descrito acima, um teste de diagnóstico com uma sensibilidade de 63% e especificidade de 73% (sensibilidade + especificidade = 1,36) pode ser produzido, ver Tabela 14. A curva ROC para este teste é apresentada na Figura 2 e tem uma AUC de 0,75.
[00289] A adição do marcador biológico HSP90a, por exemplo, com uma distância KS de 0,5, melhora significativamente o desempenho do classificador para uma sensibilidade de 76% e uma especificidade de 0,75% (sensibilidade + especificidade = 1,51) e uma AUC = 0,84. Note-se que a pontuação para um classificador constituído por dois marcadores biológicos não é uma simples soma das distâncias KS; as distâncias KS não são aditivas quando combinando marcadores biológicos e leva vários marcadores fracos para atingir o mesmo nível de desempenho como um marcador forte. Adicionando um terceiro marcador, ERBB1, por exemplo, aumenta o desempenho do classificador para sensibilidade de 78% e especificidade de 83% e AUC = 0,87. Adicionando marcadores biológicos adicionais, tais como, por exemplo, PTN, BTK, CD30, Calicreína 7, LRIG3, LDH-H1, e PARC, produz uma série de testes de câncer de pulmão resumidos na Tabela 14 e apresentados como uma série de curvas ROC na Figura 3. A pontuação dos classificadores como uma função do número de analitos usados na construção do classificador é apresentada na Figura 4. A sensibilidade e especificidade deste classificador exemplificativo de dez marcadores é > 87% e a AUC é de 0,91.
[00290] Os marcadores listados nas Tabelas 18, 20 ou 21 podem ser combinados de várias maneiras para produzir classificadores para diagnosticar câncer de pulmão. Em algumas modalidades, os painéis de marcadores biológicos são compostos por diferentes números de analitos, dependendo de um critério de desempenho específico de diagnóstico que é selecionado. Por exemplo, certas combinações de marcadores biológicos irá produzir testes que são mais sensíveis (ou mais específicos) do que outras combinações.
[00291] Uma vez que o painel é definido para incluir um conjunto particular de marcadores biológicos a partir das Tabelas 18, 20 ou 21 e um classificador é construído a partir de um conjunto de dados de treinamento, a definição do teste de diagnóstico está completa. Em uma modalidade, o procedimento utilizado para classificar uma amostra desconhecida é descrito na Figura 1A. Em uma outra modalidade, o processo utilizado para classificar uma amostra desconhecida é descrito na Figura 1B. A amostra biológica é apropriadamente diluída e, em seguida, executada em um ou mais ensaios relevantes para produzir os níveis de marcadores biológicos quantitativos utilizados para a classificação. Os níveis de marcadores biológicos medidos são utilizados como entrada para o método de classificação que gera uma classificação e uma pontuação opcional para a amostra que reflete a confiança da atribuição de classe.
[00292] A Tabela 21 identifica 86 marcadores biológicos que são úteis para diagnosticar câncer de pulmão ttanto em tecidos quanto em amostras de sangue. A Tabela 20 identifica 25 marcadores biológicos que foram identificados em amostras de tecido, mas que são úteis também em amostras de soro e plasma. Este é um número surpreendentemente maior do que o esperado, quando comparado com o que é normalmente encontrado durante os esforços de descoberta de marcadores biológicos e pode ser atribuído à escala do estudo descrito, o qual abrangeu cerca de 800 proteínas medidas em centenas de amostras individuais, em alguns casos, a concentrações na faixa femtomolar baixa. Presumivelmente, o grande número de marcadores biológicos descobertos reflete as diferentes vias bioquímicas implicadas tanto na biologia do tumor quanto na resposta do organismo à presença do tumor, cada caminho e processo envolve muitas proteínas. Os resultados mostram que nenhuma proteína única de um pequeno grupo de proteínas é exclusivamente informativo sobre tais processos complexos, em vez disso, que multiplas proteínas estão envolvidas em vários processos relevantes, tais como apoptose ou reparação de matriz extracelular, por exemplo.
[00293] Dados os numerosos marcadores biológicos identificados durante o estudo descrito, seria de esperar ser capaz de derivar um grande número classificadores de alto desempenho que podem ser usados em vários métodos de diagnóstico. Para testar esta noção, dezenas de milhares de classificadores foram avaliados usando os marcadores biológicos na Tabela 1. Tal como descrito no Exemplo 4, muitos subconjuntos dos marcadores biológicos apresentados na Tabela 1 podem ser combinados para gerar classificadores úteis. A título de exemplo, são fornecidos descrições para classificadores que contêm 1, 2, e 3 marcadores biológicos para cada uma das duas utilizações: triagem do câncer de pulmão de fumantes de alto risco e diagnóstico dos indivíduos que têm nódulos pulmonares que são detetáveis por CT. Tal como descrito no Exemplo 4, todos os classificadores que foram construídos utilizando os marcadores biológicos na Tabela 1 desempenham claramente melhor do que os classificadores que foram construídos utilizando "não-marcadores".
[00294] O desempenho dos classificadores obtidos aleatoriamente excluindo alguns dos marcadores na Tabela 1, o que resultou em subconjuntos mais pequenos do que para construir os classificadores, também foi testado. Tal como descrito no Exemplo 4, Parte 3, os classificadores que foram construídos a partir de subconjuntos de marcadores aleatórios da Tabela 1 desempenharam de forma semelhante aos classificadores ótimos, que foram construídos utilizando a lista completa dos marcadores na Tabela 1.
[00295] O desempenho de classificadores de dez marcadores obtido excluindo os "melhores" marcadores individuais da agregação de dez marcadores também foi testada. Tal como descrito no Exemplo 4, Parte 3, classificadores construídos sem os "melhores" marcadores na Tabela 1, também desempenharam bem. Muitos subconjuntos dos marcadores biológicos listados na Tabela 1 desempenharam próximo à forma ótima, mesmo após a remoção de 15 dos marcadores listados da parte superior da Tabela. Isto implica que as características de desempenho de qualquer classificador particular não são provavelmente devido a algum grupo de núcleo pequeno de marcadores biológicos e que o processo de doença provavelmente impacta numerosas vias bioquímicas, o que altera o nível de expressão de muitas proteínas.
[00296] Os resultados do Exemplo 4 sugerem certas conclusões possíveis: Em primeiro lugar, a identificação de um grande número de marcadores biológicos permite a sua agregação em um grande número de classificadores que oferecem um desempenho igualmente elevado. Em segundo lugar, os classificadores podem ser construídos de tal modo que os marcadores biológicos específicos podem ser substituídos por outros marcadores biológicos de uma forma que reflete as redundâncias que, sem dúvida, permeiam as complexidades dos processos de doença subjacentes. Isto é, a informação sobre a doença contribuída por qualquer marcador biológico indivídual identificado na Tabela 1 se sobrepõe com as informações provenientes de outros marcadores biológicos, de tal forma que é possível que nenhum marcador biológico particular ou pequeno grupo de marcadores biológicos na Tabela 1 devem ser incluídos em qualquer classificador.
[00297] Modalidades exemplificativas usam classificadores Bayes simples construídos a partir dos dados das Tabelas 38 e 39 para classificar uma amostra desconhecida. O procedimento é descrito nas Figuras 1A e B. Em uma modalidade, a amostra biológica é opcionalmente diluída e executada em um ensaio de aptâmero multiplexado. Os dados do ensaio são normalizados e calibrados tal como delineado no Exemplo 3, e os níveis de marcadores biológicos resultantes são usados como entrada para um esquema de classificação de Bayes. O log da razão de probabilidade é calculada para cada marcador biológico medido individualmente e depois somados para produzir uma pontuação de classificação final, o qual é também dito como um resultado de diagnóstico. A atribuição resultante, bem como a pontuação global de classificação pode ser relatada. Opcionalmente, os fatores de risco individuais de log de probabilidade calculados para cada nível de marcadores biológicos podem ser relatados. Os detalhes do cálculo da pontuação de classificação são apresentados no Exemplo 3.
[00298] Para demonstrar a utilidade da tecnologia proteomica baseada em aptâmero aqui descrita para utilização em detecção de doenças relacionadas com marcadores biológicos a partir de tecidos, amostras de tecidos homogeneizados de resseções cirúrgicas obtidos a partir de oito células não pequenas de câncer de pulmão (NSCLC), os pacientes foram analisados, como descrito no Exemplo 6. Todos os pacientes eram fumantes NSCLC, com idade variando de 47 a 75 anos de idade e cobrindo estágios 1A até 3B de NSCLC (Tabela 17). Foram obtidas três amostras a partir de cada resseção: amostra de tecido tumoral, tecido não tumoral adjacente. A concentração de proteína total foi ajustada e normalizada em cada homogenato para perfilamento proteomico seguido de análise da plataforma de micromatriz de DNA para medir as concentrações de cerca de 800 proteínas humanas (ver Gold et al., Nature Precedings, http://precedings.nature.eom/documents/4538/version/1 (2010)).
[00299] As medições da concentração de proteína, expressas como unidades relativas de fluorescência (RFU), permitem comparações em grande escala de assinaturas de proteínas entre as amostras (ver a Figura 21). Com referência à Figura 21, em primeiro lugar os níveis de expressão de proteína entre os tecidos de controle adjacentes e distantes foram comparados para cada amostra de doente (Figura 21A). Nesta comparação, apenas um analito (fibrinogênio) apresentou mais do que uma diferença de duas vezes entre as amostras. Em geral, os sinais gerados pela maior parte dos analitos foram semelhantes no tecido adjacente e distante.
[00300] Em contraste, a comparação dos tecidos tumorais com os tecidos não-tumorais (adjacentes ou distantes) identificou 11 (1,3%) proteínas com diferenças maiores do que quatro vezes e 53 (6,5%), proteínas com diferenças maiores do que duas vezes (ver as Figuras 21B e 21C). Nos restantes 767 (93,5%), as proteínas apresentaram diferenças relativamente pequenas entre o tecido tumoral e não tumoral. Algumas proteínas foram substancialmente suprimidas enquanto outras foram elevadas nos tecidos do tumor em comparação com os tecidos adjacentes ou distantes. A expressão diferencial das proteínas entre o tecido adjacente e do tumor, ou entre o tecido tumoral e distante, foi semelhante em geral. Alterações no tecido distante foram geralmente maiores (Figura 21), o que demonstra que a maioria das alterações de proteínas são específicas para o ambiente local do tumor.
[00301] Para identificar marcadores biológicos de tecido NSCLC, os níveis de expressão de proteínas entre amostras de tecidos tumorais, adjacente e distante foram comparados pelo teste de Mann-Whitney, como descrito em Ostroff et al. Nature Precedings, http://preeedings.nature.eom/doeuments/4537/version/1 (2010)). Trinta e seis proteínas com a maior mudança de dobra e com diferenças estatisticamente significativas entre o tecido tumoral e não tumoral foram identificadas com um corte taxa de descoberta de falso de q <0,05 para significância (Figuras 23 e 24, e Tabela 18). Vinte destas proteínas foram reguladas para cima e 16 foram reguladas para baixo no tecido tumoral. Embora o número de amostras utilizadas para este estudo foi relativamente pequeno, foi utilizado um projeto poderoso de estudo baseado no indivíduo, em que cada amostra de tumor teve os seus próprios controles de tecidos normais. Isso elimina a variação da população associada com projetos baseados na população de estudo. A disponibilidade de amostras de referência adequadamente escolhidas é cada vez mais reconhecido como um componente importante na pesquisa de descoberta de marcadores biológicos (Bossuyt (2011) J. Am Med Assoc 305:2229-30; Ioannidis e Panagiotou (2011) J. Am Med.. Assoc 305:2200-10; Diamandis (2010) J. Natl Cancer Inst. 102:1462-7).
[00302] Acredita-se que cerca de um terço (13/36) marcadores biológicos de tecido NSCLC aqui identificados são novos. Os restantes dois terços (23/36) foram relatados anteriormente na forma de proteínas ou genes expressas diferencialmente em tecido tumoral de NSCLC (Tabela 18).
[00303] Os marcadores biológicos identificados de acordo com o método do Exemplo 6, podem ser classificados em geral em quatro processos biológicos associados com características importantes da biologia tumoral (Hanahan & Weinberg (2011) Cell 144:646-74), como mostrado na Tabela 19: 1) angiogênese, 2) crescimento e metabolismo, 3) inflamação e apoptose, e 4) a invasão e metástase. Admitidamente, estas são classificações convenientes embora inexatas que aproximam um sistema altamente complexo e dinâmico em que essas moléculas, muitas vezes desempenham múltiplos papéis e nuances. Portanto, o estado específico de um dado sistema em última instância afeta a expressão e função de qualquer molécula particular. A compreensão biológica está longe de ser completa nestes sistemas. Com a plataforma escaneamentoSOMA, torna-se possível a expressão quantitativa de um grande número de proteínas em vários tecidos e os processos de doença. Estes dados fornecem novas coordenadas para ajudar a mapear a dinâmica destes sistemas, que por sua vez irá proporcionar uma compreensão mais completa da biologia do câncer de pulmão, bem como outras doenças. Os resultados do estudo fornecem uma nova perspectiva sobre a biologia do tumor NSCLC, com elementos tanto familiares quanto novos. Angiogênese
[00304] A angiogênese dirige o crescimento de novos vasos sanguíneos para apoiar o crescimento e metabolismo do tumor. A regulação da angiogênese é um fenómeno biológico complexo controlado tanto por sinais positivos quanto negativos (Hanahan & Weinberg, (2011) Cell 144:646-74). Entre os marcadores biológicos de tecido NSCLC identificados neste estudo foram bem conhecidos os reguladores positivos e negativos de angiogénese (Figuras 23 e 24 e Tabela 19), os quais foram observados anteriormente em tecido tumoral de NSCLC (Fontanini et al. (1999) British Journal of Cancer 79 (2) :363-369,Imoto et al (1998) J. Thorac. Carciovasc. Surg. 115:10071011, Ohta et al (2006) Ann. Thorac. Surg. 82:1180-1184; Iizasa et al. (2004) Clinical Cancer Research 10:5361-5366). Estes incluem o protótipo indutor de angiogênese VEGF e inibidores endostatina e trombospondina-1 (TSP-1). O VEGF é um fator de crescimento potente que promove o crescimento de novos vasos sanguíneos e foi fortemente regulado para cima em tecido de tumor de NSCLC, de acordo com observações anteriores (Imoto et al. (1998) J. Thorac. Carciovasc. Surg. 115:1007-1011), e incluindo o nosso estudo de amostras de soro de pacientes com NSCLC (Ostroff et al. Nature Precedings, http://precedings.nature.eom/documents/4537/version/1 (2010)). A endostatina é um fragmento proteolítico de colagênio XVIII e um forte inibidor de proliferação de células endoteliais e da angiogênese (Iizasa et al. (Ago. 2004) Clinical Cancer Research 10:5361-5366). TSP-1 e a relacionada trombospondina-2 (TSP-2) foram substancialmente regulada para cima em tecido tumoral de NSCLC. TSP-1 e TSP-2 são proteínas da matriz extracelular com efeitos complexos, dependentes do contexto modulados através de uma variedade de interações com receptores da superfície celular, fatores de crescimento, citocinas, metaloproteinases de matriz, e outras moléculas. Arquetipicamente em sistemas modelo, a TSP-1 e TSP-2 inibem a angiogênese por inibição da proliferação de células endoteliais através do receptor CD47 e induzndo a apoptose de células endoteliais através do receptor CD36. Existe também evidência de influências proangiogênicas de TSP-1 e TSP-2 (Bornstein (2009) J. Cell Commun. Signal. 3 (3-4) :189-200). Finalmente, TSP-1 e TSP-2 relataram variar os níveis de expressão relativa e absoluta em tecido NSCLC (Chijiwa et al (2009) Oncology Reports 22:279-283,.. Chen et al (2009) J Int Med Res 37:551 - 556; Oshika 1998, Fontanini et al (1999) British Journal of Cancer 79 (2) :363-369), provavelmente devido às suas funções complexas. Neste estudo, verificou-se que CD36 foi regulado para baixo em tecido do tumor NSCLC, o que pode indicar uma adaptação das células do tumor para reduzir a sensibilidade da TSP-1 e TSP-2 mediada por apoptose. Crescimento e Metabolismo
[00305] Dez dos marcadores biológicos de NSCLC identificados estão associados com as funções de crescimento e metabolismo. Metade destes marcadores biológicos estão envolvidos na regulação hormonal complexa do crescimento celular e metabolismo energético. Três proteínas de ligação do fator de crescimento semelhante a insulina (IGFBPs), as quais modulam a atividade de fatores de crescimento semelhantes à insulina (IGFs), foram reguladas para cima em tumores NSCLC (IGFBP-2, -5, e -7). Vários relatórios avaliaram qualitativamente IGFBP-2, -5, e -7 em NSCLC (Tabela 18) e sugerem uma maior expressão em tecido de NSCLC do que no tecido normal. A insulina e IGFs são hormônios que influenciam fortemente o crescimento celular e o metabolismo, e as células cancerosas são muitas vezes dependentes dessas moléculas para o crescimento e proliferação (Robert et al. (Agosto de 1999) Clinical Cancer Research 5:2094-2102;. Liu et al (Junho de 2007) Lung Cancer 56 (3) :307-317; Singhal et al (2008) Lung Cancer 60:313-324). Esses hormônios são, por sua vez degradados por insulisina, a qual encontramos regulada para cima em tecido tumoral de NSCLC. O hormônio adiponectina controla o metabolismo lipídico e sensibilidade à insulina, e encontramos adiponectina regulada para baixo em tumores de NSCLC. Os restantes cinco marcadores biológicos, anidrase carbônica III, NAGK, TrATPase, triptase β-2, e MAPK13, são enzimas com funções no metabolismo celular (Tabela 17). Inflamação e apoptose
[00306] A inflamação e apoptose são marcos da biologia do câncer, e um grande número de marcadores biológicos potenciais associados a estes processos, que foram associados anteriormente com NSCLC (Tabela 19). A caspase-3, a qual foi associada com metástase (Chen et al (2010) Lung Cancer (doi:. 1016/j.lungcan.2010.10.015), verificou- se ser regulada para cima no tecido tumoral de NSCLC. Outro exemplo notável é sRAGE, que tem sido relatado como sendo dramaticamente regulado para baixo no tecido de NSCLC (Jing et al. (2010) Neoplasma. 57:55-61, Bartling et al. (2005) Carcinogenesis 26:293-301). Este resultado é consistente com a medição aqui divulgada, na qual sRAGE teve a maior mudança observada para as proteínas que são mais baixos no tumor do que em tecido não maligno. Embora não limitados pela teoria, uma hipótese é que RAGE desempenha um papel na organização do epitélio, e a diminuição dos níveis de RAGE em tumores de pulmão pode contribuir para a perda da estrutura do tecido epitelial, podendo levar à transformação maligna (Bartling et al. (2005) Carcinogênese 26 (2) :293-301). Várias quimiocinas, tais como BCA-1, CXCL16, IL- 8, e NAP-2, são alteradas (Tabela 18), consistente com a hipótese de que a invasão de tumores com células dos braços inatos e adaptativos do sistema imunológico fornecem moléculas bioativas que afetam os sinais proliferativos e angiogênicos (Hanahan & Weinberg (2011) Cell 144:646-74). Invasão e Metástase
[00307] O maior grupo de marcadores biológicos potenciais contém proteínas que funcionam em célula-célula e célula-matriz e as interações envolvidas na invasão e metástase. Muitos foram previamente relatados serem associados com NSCLC. Mais notáveis são dois da matriz de metaloproteases, MMP-7 e MMP-12, que contribuem para a degradação proteolítica de componentes da matriz extracelular e de processamento de substratos, tais como fatores de crescimento (ver, por exemplo Su et al. (2004) Chinese Journal of Clinical Oncology 1 (2) :126-130, Wegmann et al. (1993) Eur. J. Câncer 29A (11) :1578-1584). Tais processos são bem conhecidos para desempenhar um papel na criação de microambientes tumorais. Verificou-se que tanto a MMP-7 quanto a MMP-12 foram reguladas para cima no tecido de NSCLC (Tabela 18), o que é consistente com estudo semelhante que utilizou medidas baseadas em anticorpos (Shah et al. (2010) The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery 139(4) :984-990). A sobre-expressão de MMP-7 e MMP-12 tem sido associada com mau prognóstico de NSCLC (Shah et al. (2010) The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery 139(4) :984-990). Os níveis do MMP-12 foram correlacionados com recorrência local e doença de metástase (Hofmann et al. (2005) Clin. Câncer. Res.11:1086-92, Hoffman et al. (2006) Oncol. Rep. 16:58795). ). Dois dos oito indivíduos estudados tinham níveis normais de MMP-12, enquanto que os outros seis tinham elevação de 15-50x da MMP-12 em tecidos de tumores em comparação com o tecido não tumoral. Desempenho de Marcadores Biológicos de NSCLC como Sondas Histoquímicas
[00308] A compreensão das diferenças na expressão da proteína entre tecidos tumorais e não tumorais pode ser utilizada para identificar novas sondas histoquímicas. Tais sondas podem permitir caracterização molecular mais precisa de tumores e dos seus efeitos no estroma circundante. A Figura 25 demonstra a capacidade de dois dos SOMAmeros identificados para colorir os tecidos congelados frescos obtidos a partir das mesmas resseções tumorais utilizadas para a descoberta destes marcadores biológicos. A trombospondina-2 (TSP2) foi encontrada ser aumentada em homogenatos de tecidos tumorais, enquanto o receptor de manose de macrófagos (MRC1) foi diminuído. A coloração de tecidos com estes SOMAmeros foi consistente com os resultados de perfil. Exemplos adicionais, bem como a confirmação de anticorpos de padrões de coloração, são mostrados na Figura 27. Comparação de Tecido de NSCLC e Marcadores Biológicos de Soro
[00309] A expressão diferencial de proteínas em soros de pacientes com NSCLC em relação aos controles livres de câncer comparada com aquelas amostras de tecidos com NSCLC dá informações úteis (Figura 26). A observação mais surpreendente é que a mudança relativa na expressão da proteína é maior nos tecidos do que no soro. Este resultado pode ser esperado uma vez que o tecido tumoral é a fonte das alterações na expressão de proteína que é, então, mesmo se totalmente libertada para a circulação, diluída muitas vezes em volume total de sangue. Esta tendência é evidente na distribuição alongada de pontos de dados ao longo do eixo x na figura 26 em que os eixos são desenhados na mesma escala para ilustrar este ponto. Doze dos analitos mostrados nas Figuras 23 e 24, como alterados no tecido do tumor também são expressos diferencialmente em soros de doentes com NSCLC versus controles (círculos vermelhos cheios na Figura 26). A maioria das mudanças direcionais são as mesmas entre o tecido e soro, mas algumas não são. As concentrações locais de proteínas em um homogenato de tecido claramente precisa não se correlacionar com os níveis circulantes de proteínas e correlações inversas podem proporcionar pistas sobre a redistribuição de certos marcadores biológicos em tecidos doentes versus normal.
[00310] A descoberta de novos marcadores biológicos com demonstrável diagnóstico ou utilidade clínica tem sido um desafio considerável nos últimos anos (Diamandis (2010) J. Natl. Cancer Inst. 102:1462-7). As razões para isso incluem a onipresença de artefatos pré-analíticos e analíticos, a indisponibilidade de controles de estado de saúde adequados e projetos de estudo não sofisticados, e a dificuldade de detectar pequenas mudanças nos níveis de proteína em concentrações muito baixas. Este desafio é especialmente pronunciado com marcadores biológicos de câncer, onde o objetivo é muitas vezes identificar um minúsculo tumor maligno em um corpo humano relativamente grande em um estágio inicial. No que se refere ao ultimo ponto, uma forma de melhorar as possibilidades de descoberta de marcadores biológicos de câncer verdadeiros é a obtenção de dados de expressão de proteínas a partir tanto da fonte da doença, tais como tecido tumoral, quanto a partir da circulação. Os resultados combinados podem corroborar parcialmente a validade de potenciais marcadores biológicos. O presente pedido de patente demonstra que tal é possível com o divulgado ensaio proteomico altamente multiplexado sensível. Foi monstrado que tecidos, como o plasma ou soro, são também passíveis de varredura SOMA e a análise comparativa resultante da expressão de proteínas em tecidos de tumores de NSCLC com tecidos de pulmão saudável circundante oferece um complemento para o conjunto de dados existentes de marcadores biológicos potenciais de NSCLC identificados a partir de amostras de soro (ver Pub. dos EUA. N°. 2010/0070191). No presente caso, um terço, ou 12 dos 36 marcadores de tecidos aqui relatados (BCA-1 (BCL), caderina-1 (caderina-E), catalase, endostatina, IGFBP- 2, MRC1 (receptor de manose de macrófagos), MAPK-13 (MK13), MMP-7, MMP-12, NAGK, VEGF e SIM foram previamente identificados no soro. Tomados em conjunto, estes dados contribuem para uma maior compreensão da complexidade das mudanças que acompanham o NSCLC e fornecem adicionais marcadores biológicos potenciais para a detecção precoce desta doença mortal. Conjuntos
[00311] Qualquer combinação dos marcadores biológicos da Tabela 20 (assim como a informação biomédica adicional) pode ser detectada usando um kit adequado, tal como para utilização na realização dos métodos aqui descritos. Além disso, o kit pode conter qualquer um ou mais marcadores detectáveis, tal como descrito aqui, tal como uma porção fluorescente, etc.
[00312] Em uma modalidade, um kit inclui (a) um ou mais reagentes de captura (tal como, por exemplo, pelo menos, um aptâmero ou anticorpo) para a detecção de um ou mais marcadores biológicos em uma amostra biológica, em que os marcadores biológicos incluem qualquer um dos marcadores biológicos apresentados nas Tabelas 18, 20 ou 21 e, opcionalmente, (b) um ou mais produtos de software ou programas de computador para classificar o indivíduo de quem a amostra biológica foi obtida como tendo ou não tendo o câncer de pulmão ou para determinar a probabilidade de que o indivíduo tem câncer de pulmão, como descrito no presente documento. Alternativamente, em vez de um ou mais produtos de programas de computador, pode ser fornecido uma ou mais instruções para manualmente efetuar as etapas acima por um ser humano.
[00313] A combinação de um suporte sólido com um reagente de captura correspondente e de um material gerador de sinal é aqui referido como um "dispositivo de detecção" ou "conjunto". O conjunto pode também incluir instruções para utilizar os dispositivos e reagentes, a manipulação da amostra e a análise de dados. Além disso, o conjunto pode ser utilizado com um sistema de computador ou de software para analisar e reportar o resultado da análise da amostra biológica.
[00314] Os conjuntos também podem conter um ou mais reagentes (por exemplo, tampões de solubilização, detergentes, lavagens, ou tampões) para o processamento de uma amostra biológica. Qualquer um dos conjuntos aqui descritos podem também incluir, por exemplo, tampões, agentes de bloqueio, materiais de matriz de espectrometria de massa, agentes de captura de anticorpos, amostras de controle positivas e amostras de controle negativo, software e informação, tais como protocolos, orientação, e dados de referência.
[00315] Em um aspecto, a presente invenção fornece conjuntos para a análise do estado de câncer de pulmão. Os conjuntos incluem iniciadores PCR para um ou mais marcadores biológicos selecionados a partir das Tabelas 18, 20, ou 21. O conjunto pode incluir ainda instruções de uso e correlação dos marcadores biológicos com câncer de pulmão. O conjunto também pode incluir uma matriz de DNA que contém o complemento de um ou mais dos marcadores biológicos selecionados a partir da Tabela 20, reagentes, e/ou enzimas para amplificar ou isolar amostra de DNA. Os conjuntos podem incluir reagentes para PCR em tempo real, por exemplo, sondas TaqMan e/ou iniciadores, e enzimas.
[00316] Por exemplo, um conjunto pode compreender: (a) reagentes compreendendo pelo menos reagente de captura para a quantificação de um ou mais marcadores biológicos em uma amostra de teste, em que os ditos marcadores biológicos incluem os marcadores biológicos apresentados nas Tabelas 18, 20, ou 21, ou qualquer outros marcadores biológicos ou painéis de marcadores biológicos aqui descritos, e, opcionalmente, (b) um ou mais algoritmos ou programas de computador para executar as etapas de comparar o valor de cada marcador biológico quantificado na amostra de teste a um ou mais pontos de corte predeterminados e atribuindo uma pontuação para cada marcador biológico baseado quantificados na dita comparação, combinando as pontuações atribuídas para cada marcador biológico quantificado para obter uma pontuação total, comparando-se a pontuação total com uma pontuação pré- determinada, e utilizando a dita comparação para determinar se um indivíduo tem câncer de pulmão. Alternativamente, em vez de um ou mais algoritmos ou programas de computador, pode ser fornecido uma ou mais instruções para manualmente efetuar as etapas acima por um ser humano. Métodos de Computador e Software
[00317] Uma vez que um marcador biológico ou painel de marcador biológico é selecionado, um método para diagnosticar um indivíduo pode incluir o seguinte: 1) coletar ou obter uma amostra biológica; 2) realizar um método analítico para detectar e medir o marcador biológico ou marcadores biológicos no painel na amostra biológica; 3) realizar qualquer normalização de dados ou padronização necessária para o método usado para coletar valores de marcadores biológicos, 4) calcular a pontuação do marcador; 5) combinar as pontuações de marcadores para obter uma pontuação total de diagnóstico e 6) relatar a pontuação de diagnóstico do indivíduo. Nesta abordagem, a pontuação de diagnóstico pode ser um único número determinado a partir da soma de todos os cálculos de marcador que é comparada com um valor limite préselecionado que é uma indicação da presença ou ausência de doença. Ou a pontuação de diagnóstico pode ser uma série de barras que representam um valor de cada marcador biológico e o padrão das respostas podem ser comparadas com um padrão préselecionado para a determinação da presença ou ausência de doença.
[00318] Pelo menos algumas modalidades dos métodos aqui descritos podem ser implementadas com a utilização de um computador. Um exemplo de um sistema de computador 100 é mostrado na Figura 6. Com referência à Figura 6, é mostrado o sistema 100 compreendido de elementos de hardware que estão eletricamente acoplados através do barramento 108, incluindo um processador 101, dispositivo de entrada 102, dispositivo de saída 103, dispositivo de armazenamento 104, leitor de meios de armazenamento legíveis por computador 105a, sistema de comunicação 106 aceleração de processamento (por exemplo, DSP ou processadores para fins especiais) 107 e memória 109. O leitor de meios de armazenamento legíveis por computador 105a está ainda acoplado ao meio de armazenamento legível por computador 105b, a combinação representando de forma abrangente, dispositivos de armazenamento remoto, locais fixos e/ou removíveis, mais mídia de armazenamento, memória, etc, para temporariamente e/ou de forma mais permanente conter informações legíveis por computador, o que pode incluir dispositivo de armazenamento 104, memória 109 e/ou qualquer outro recurso de tal sistema acessível 100. O sistema 100 também inclui elementos de software (mostrado como sendo atualmente localizado dentro da memória de trabalho 191), incluindo um sistema operativo 192 e outro código 193, tais como programas, dados e semelhantes.
[00319] Em relação à Figura 6, o sistema 100 tem uma grande flexibilidade e capacidade de configuração. Assim, por exemplo, pode ser utilizada uma arquitetura única para implementar um ou mais servidores que podem ser configurados de acordo com os protocolos atualmente desejáveis, variações de protocolo, extensões, etc. No entanto, será evidente para os peritos na técnica que modalidades pode muito bem ser utilizadas de acordo com mais requisitos de aplicação específicos. Por exemplo, um ou mais elementos do sistema podem ser implementados como sub-elementos no interior de um componente do sistema 100 (por exemplo, dentro do sistema de comunicações 106). Também pode ser utilizado hardware personalizado e/ou elementos particulares podem ser implementados em hardware, software ou ambos. Além disso, embora a conexão a outros dispositivos de computação, tais como rede de entrada/saída (não mostrada) pode ser empregados, é para ser entendido que a conexão de fios, modem sem fios, e/ou outras, ou conexões a outros dispositivos computacionais podem também ser utilizados.
[00320] Em um aspecto, o sistema pode compreender um banco de dados que contém as características de marcadores biológicos característicos de câncer de pulmão. Os dados de marcadores biológicos (ou informação de marcador biológico) podem ser utilizados como uma entrada para o computador para uso como parte de um método implementado em computador. Os dados dos marcadores biológicos podem incluir os dados tal como aqui descritos.
[00321] Em um aspecto, o sistema compreende ainda um ou mais dispositivos de fornecimento de dados de entrada para um ou mais processadores.
[00322] O sistema compreende ainda uma memória para armazenar um conjunto de dados de elementos de dados classificados.
[00323] Em outro aspecto, o dispositivo para o fornecimento de dados de entrada compreende um detetor para detectar a característica do elemento de dados, por exemplo, tal como um espectrômetro de massa ou um leitor de chip de gene.
[00324] O sistema pode compreender adicionalmente um sistema de gerenciamento de base de dados. Solicitações de usuários ou consultas podem ser formatadas em uma linguagem apropriada compreendida pelo sistema de gerenciamento de base de dados que processa a consulta para extrair as informações relevantes da base de dados de conjuntos de treinamento.
[00325] O sistema pode ser ligado a uma rede à qual um servidor de rede e um ou mais clientes estão conectados. A rede pode ser uma rede de área local (LAN) ou uma rede de área alargada (WAN), como é conhecida na técnica. De preferência, o servidor inclui o hardware necessário para a execução de produtos de programa de computador (por exemplo, software) para acessar os dados da base de dados para processar solicitações de usuários.
[00326] O sistema pode incluir um sistema operacional (por exemplo, UNIX ou Linux) para a execução de instruções de um sistema de gerenciamento de base de dados. Em um aspecto, o sistema operacional pode funcionar em uma rede de comunicações global, tal como a Internet, e utilizar um servidor de rede de comunicações globais para conectar a uma rede deste tipo.
[00327] O sistema pode incluir um ou mais dispositivos que compreendem uma interface gráfica de exibição compreendendo elementos de interface, como botões, menus, barras de rolagem, campos de inserção de texto, e outros como são rotineiramente encontrados em interfaces gráficas de usuário conhecidas na técnica. Pedidos inscritos em uma interface de usuário podem ser transmitidas para um programa de aplicação no sistema para formatar para pesquisar as informações relevantes em uma ou mais das bases de dados do sistema. Solicitações ou consultas introduzidos por um usuário podem ser construídas em qualquer linguagem de base de dados adequada.
[00328] A interface gráfica de usuário pode ser gerada por um código de interface gráfica de usuário, como parte do sistema operacional e pode ser usada para dados de entrada e/ou para exibir os dados introduzidos. O resultado dos dados processados pode ser exibido na interface, impresso em uma impressora em comunicação com o sistema, salvo em um dispositivo de memória, e/ou transmitido através da rede ou pode ser fornecido na forma de meio legível por computador.
[00329] O sistema pode estar em comunicação com um dispositivo de entrada para o fornecimento de dados relativos a elementos de dados para o sistema (por exemplo, valores de expressão). Em um aspecto, o dispositivo de entrada pode incluir um sistema de perfis de expressão de genes, incluindo, por exemplo, um espectrômetro de massa, chips de genes ou leitor de matriz, e outros semelhantes.
[00330] Os métodos e aparelhos para analisar informação de marcador biológico de câncer de pulmão de acordo com várias modalidades podem ser implementados de qualquer forma adequada, por exemplo, usando um programa de computador de operação de um sistema de computador. Pode ser usado um sistema de computador convencional que compreende um processador e uma memória de acesso aleatório, tal como um servidor de aplicação acessível remotamente, servidor de rede, computador pessoal ou de estação de trabalho. Componentes adicionais do sistema de computador pode incluir dispositivos de memória ou sistemas de armazenamento de informações, tais como um sistema de armazenamento em massa e uma interface de usuário, por exemplo, um monitor convencional, teclado e dispositivo de rastreio. O sistema de computador pode ser um sistema independente ou parte de uma rede de computadores incluindo um servidor e uma ou mais bases de dados.
[00331] O sistema de análise de marcador biológico de câncer de pulmão pode fornecer funções e operações para completar a análise de dados, tais como para coletar dados, processamento, análise, elaboração de relatórios e/ou diagnóstico. Por exemplo, em uma modalidade, o sistema de computador pode executar um programa de computador que pode receber, armazenar, pesquisar, analisar e relatar informação sobre os marcadores biológicos de câncer de pulmão. O programa de computador pode compreender vários módulos que executam várias funções ou operações, tais como um módulo de processamento para o processamento de dados em bruto e gerar dados suplementares e um módulo de análise para análise de dados em bruto e os dados suplementares para gerar um estado e/ou diagnóstico de câncer de pulmão. Diagnosticar o estado de câncer de pulmão pode compreender a gerar ou coletar qualquer outra informação, incluindo informação biomédica adicional, em relação à condição do indivíduo em relação à doença, identificar se testes adicionais podem ser desejáveis, ou de outro modo avaliar o estado de saúde do indivíduo.
[00332] Com referência à Figura 7, pode ser visto um exemplo de um método de utilizar um computador, de acordo com os princípios de uma modalidade divulgada. Na Figura 7, é mostrado um fluxograma 3000. No bloco 3004, informação de marcador biológico pode ser recuperada para um indivíduo. A informação de marcador biológico pode ser recuperada a partir de uma base de dados do computador, por exemplo, depois que o teste de amostras biológicas do indivíduo é executado. A informação de marcador biológico pode compreender valores de marcadores biológicos cada um correspondendo a pelo menos um dos N marcadores biológicos selecionados de um grupo consistindo dos marcadores biológicos fornecidos na Tabela 18, em que N = 2-36, Tabela 20, em que N = 2-25 ou na Tabela 21, em que N = 2-86. No bloco 3008, um computador pode ser utilizado para classificar cada um dos valores de marcadores biológicos. E, no bloco 3012, uma determinação pode ser feita quanto à probabilidade de que um indivíduo tem câncer de pulmão baseado em uma pluralidade de classificações. A indicação pode ser enviada a um visor ou outro dispositivo indicador, de modo que ele possa ser visto por uma pessoa. Assim, por exemplo, ela pode ser exibida em um tela de visualização de um computador ou outro dispositivo de saída.
[00333] Com referência à Figura 8, um método alternativo de se utilizar um computador, de acordo com outra modalidade pode ser ilustrado por meio do fluxograma 3200. No bloco 3204, um computador pode ser utilizado para recuperar a informação de marcadores biológicos para um indivíduo. A informação de marcador biológico compreende um valor de marcador biológico correspondente a um marcador biológico selecionado a partir do grupo de marcadores biológicos fornecidos nas Tabelas 18, 20 ou 21. No bloco 3208, a classificação do valor de marcadores biológicos pode ser realizada com o computador. E, no bloco 3212, uma indicação pode ser feita como a probabilidade de que o indivíduo tem câncer de pulmão com base na classificação. A indicação pode ser enviada para um visor ou outro dispositivo indicador, de modo que ele possa ser visto por uma pessoa. Assim, por exemplo, ela pode ser exibida em uma tela de visualização de um computador ou outro dispositivo de saída.
[00334] Algumas modalidades descritas aqui podem ser implementadas de forma a incluir um produto de programa de computador. Um produto de programa de computador pode incluir um meio legível por computador tendo o código de programa legível por computador incorporado ao meio para causar um programa de aplicação a executar em um computador com uma base de dados.
[00335] Conforme aqui utilizado, um "produto de programa de computador" refere-se a um conjunto organizado de instruções sob a forma de instruções de linguagem de programação ou naturais que são contidas em um suporte físico de qualquer natureza (por exemplo,escrita, electrônico, magnético, ótico ou de outro modo) e que pode ser utilizado com um computador ou outro sistema de processamento automatizado de dados. Tais instruçoes de linguagem de programação, quando executadas por um computador ou sistema de processamento de dados, fazem com que o computador ou sistema de processamento de dados aja de acordo com o conteúdo específico das instruções. Produtos de programa de computador incluem, sem limitação: os programas em código e fonte e objeto e/ou bibliotecas de teste ou de dados incorporadas em um meio legível por computador. Além disso, o produto de programa de computador que permite que um sistema de computador ou dispositivo de equipamento de processamento de dados atue em formas pré-selecionadas pode ser fornecido em diversas formas, incluindo, mas não limitado a, código fonte original, código assembly, código objeto, linguagem de máquina, versões criptografadas ou compactadas dos precedentes e qualquer e todos equivalentes.
[00336] Em um aspecto, um produto de programa de computador é fornecido para indicar uma probabilidade de câncer de pulmão. O produto de programa de computador inclui um meio legível por computador que contém o código de programa executável por um processador de um dispositivo ou sistema de computação, o código de programa compreendendo: código que recupera dados atribuídos a uma amostra biológica de um indivíduo, em que os dados compreendem valores de marcadores biológicos cada um correspondendo a pelo menos um dos N marcadores biológicos na amostra biológica selecionada a partir do grupo de marcadores biológicos fornecidos na Tabela 18, em que N = 2-36, Tabela 20, em que N = 2-25 ou na Tabela 21, em que N = 2-86; e código que executa um método de classificação que indica um estado de doença pulmonar do indivíduo como uma função dos valores de marcadores biológicos.
[00337] Em ainda outro aspecto, um produto de programa de computador é fornecido para indicar uma probabilidade de câncer de pulmão. O produto de programa de computador inclui um meio legível por computador que contém o código de programa executável por um processador de um dispositivo ou sistema de computação, o código de programa compreendendo: código que recupera dados atribuídos a uma amostra biológica de um indivíduo, em que os dados compreendem um valor de marcador biológico correspondendo a um marcador biológico na amostra biológica selecionada a partir do grupo de marcadores biológicos fornecidos na Tabela 18, em que N = 2-36, Tabela 20, em que N = 2-25 ou na Tabela 21, em que N-2-86; e o código que executa um método de classificação que indica um estado de doença pulmonar do indivíduo como uma função do valor do marcador biológico.
[00338] Embora tenham sido descritas várias modalidades como métodos ou aparelhos, deve ser entendido que modalidades podem ser implementadas por meio de código associado a um computador, por exemplo, o código residente no computador ou acessível pelo computador. Por exemplo, o software e bases de dados podem ser utilizados para implementar muitos dos métodos discutidos acima. Assim, em adição às modalidades realizadas por hardware, também é de se notar que estas modalidades podem ser conseguidas através da utilização de um artigo de fabricação compreendido de um meio utilizável de computador com um código de programa legível por computador nele incorporado, o qual causa a capacitação das funções divulgadas nesta descrição. Portanto, é desejado que modalidades também sejam consideradas protegidas por esta patente também nos seus meios de código de programa. Além disso, as modalidades podem ser incorporadas como códigos armazenados em uma memória de leitura por computador de virtualmente qualquer tipo, incluindo, sem limitação, meios de memória RAM, ROM, magnéticos, meios óticos, ou meios magneto-óticos. Mesmo mais genericamente, as modalidades podem ser implementadas em software, ou em hardware, ou qualquer combinação destes, incluindo, mas não limitado a, software executado em um processador de uso geral, de microcódigo, PLAs ou ASICs.
[00339] É também previsto que modalidades poderiam ser realizadas como sinais de computador incorporados em uma onda portadora, assim como sinais (por exemplo, elétricos e óticos) propagados através de um meio de transmissão. Assim, os vários tipos de informação discutidos acima podem ser formatados em uma estrutura, tal como uma estrutura de dados, e transmitidos como um sinal elétrico através de um meio de transmissão ou armazenados em um meio legível por computador.
[00340] É também notado que muitas das estruturas, materiais, e os atos recitados aqui podem ser recitados como um meio para realizar uma função ou uma etapa para a realização de uma função. Portanto, deve ser entendido que tal linguagem tem direito a cobrir todas essas estruturas, materiais ou atos divulgados na presente memória descritiva e os seus equivalentes, incluindo a matéria incorporada por referência.
EXEMPLOS
[00341] Os exemplos que se seguem são fornecidos apenas para fins ilustrativos e não se destinam a limitar o âmbito da aplicação, tal como definido pelas reivindicações em anexo. Todos os exemplos aqui descritos foram realizados usando técnicas convencionais, que são bem conhecidas e de rotina para os peritos na técnica. Técnicas de biologia molecular de rotina descritas nos exemplos a seguir podem ser realizadas como descrito em manuais de laboratório convencionais, tais como Sambrook et ai, Molecular Cloning:. A Laboratory Manual, 3rd. ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, (2001). Exemplo 1. Análise de Aptâmero Multiplexado de Amostras para Seleção de Marcador Biológico de Câncer de Pulmão
[00342] Este exemplo descreve o ensaio de aptâmero multiplexado usado para analisar as amostras e os controles para a identificação de marcadores biológicos apresentados na Tabela 1, coluna 2 (ver Figura 9). Neste caso, a análise multiplexa utilizou 820 aptâmeros, cada um único para um alvo específico.
[00343] Neste método, as pontas da pipeta foram mudadas para cada adição de solução.
[00344] Também, salvo indicação em contrário, a maioria das transferências de soluções e adições de lavagem usou as 96 cabeças de poços de um Beckman Biomek FxP. Etapas do método manualmente pipetado usaram um canal de doze P200 Pipetteman (Rainin Instruments, LLC, Oakland, CA), salvo indicação em contrário. Um tampão personalizado referido como SB17 foi preparado em casa, compreendendo 40 mM de HEPES, 100 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 5 mM de MgCl2, 1 mM de EDTA a pH 7,5. Todas as etapas foram realizadas à temperatura ambiente a não ser que seja indicado o contrário. 1. Preparação de Solução de Estoque de Aptâmero
[00345] Para aptâmeros sem um ligante de biotina foto clivável, soluções de aptâmero de estoque personalizadas para 10%, 1% e 0,03% de soro foram preparadas em concentração de 8x, em 1x SB17, 0,05% Tween-20 com "primers" biotinilados foto-cliváveis adequados, onde a concentração de "primer" resultante foi 3 vezes a concentração de aptâmero relevante. Os "primers" hibridados com a totalidade ou parte do aptâmero correspondente.
[00346] Cada uma das 3 soluções de aptâmero 8x foram separadamente em diluídas 1:4 em 1xSB17, 0,05% Tween-20 (1500 ul de 8x estoque em 4500 uL de 1xSB17, 0,05% de Tween-20) para obter uma concentração de 2x. Cada mistura mestre de aptâmero diluído foi, em seguida, dividido, 1500 uL cada uma, em 4, 2 mL de tubos com tampa de rôsca e levados a 95°C durante 5 minutos, seguido de uma incubação de 37°C durante 15 minutos. Após a incubação, os tubos de 4, 2 ml, correspondendo a uma mistura mestre particular de aptâmero foram combinados em um cadinho de reagente, e 55 ul de uma mistura de aptâmero 2x (para todas as três misturas) foi manualmente pipetada em uma placa Hybaid de 96 poços e a placa foi selada. O resultado final foi de 3 placas Hybaid de 96 poços fechadas com folha. A concentração de aptâmero indivídual variou na faixa 0,5-4 nM, como indicado na Tabela 2. 2. Preparação da Amostra de Ensaio
[00347] Aliquotas congeladas de 100% de soro, armazenadas a - 80°C, foram colocadas em banho de água a 25°C durante 10 minutos. Amostras descongeladas foram colocadas em gelo, cuidadosamente agitadas em vórtex (definido em 4), durante 8 segundos e em seguida substituídas no gelo.
[00348] Uma solução de amostra a 20% foi preparada transferindo 16 μL de amostra, utilizando um pipetador de 50 μL de 8 canais de extensão em 96 poços de placas Hybaid, cada cavidade contendo 64 μL de diluente de amostra adequado, a 4°C (0,8 x SB17, 0,05% de Tween-20, 2μM Z bloco_2, 0,6 mM de MgCl2 para soro). Esta placa foi armazenada em gelo até que as seguintes etapas de diluição de amostras foram iniciadas.
[00349] Para iniciar a equilibração de amostra e aptâmero, a placa de amostra a 20%, foi rapidamente centrifugada e colocada no Beckman FX onde foi misturada pipetando para cima e para baixo com o pipetador de 96 poços. Uma amostra de 2% foi então preparada pela diluição de 10μL da amostra de 20% em 90 μL de 1xSB17, 0.05% de Tween-20. A seguir a diluição de 6 μL da amostra resultante a 2% em 194 μL de 1xSB17, 0,05% de Tween-20 feita uma placa de amostra de 0,06%. As diluições foram feitas no Beckman Biomek FxP. Depois de cada transferência, as soluções foram misturadas pipetando para cima e para baixo. As três placas de diluição de amostra foram então transferidas para as suas respectivas soluções de aptâmero por adição de 55 μL da amostra e 55 μL da mistura apropriada de aptâmero 2x. As soluções de amostra e aptâmero foram misturadas no robô pipetando para cima e para baixo. 3. Ligação de Equilíbrio de Amostra
[00350] As placas de amostra/aptâmero foram vedadas com folha e colocadas em um incubador a 37°C durante 3,5 horas, antes de prosseguir para a etapa de Captura 1. 4. Preparação de placa de conta de Captura 2
[00351] Uma alíquota de 11 mL MyOne (Invitrogen Corp, Carlsbad, CA) contas de estreptavidina C1 foi lavada duas vezes com volumes iguais de 20 mM NaOH (5 minutos de incubação para cada lavagem), 3 vezes com volumes iguais de 1x SB17, 0,05% de Tween-20 e ressuspensas em 11 mL 1x SB17, 0,05% de Tween-20. Usando um pipetador multicanal span-12, 50 uL desta solução foi manualmente pipetado para cada poço de uma placa de 96 poços Hybaid. A placa foi então coberta com folha de alumínio e armazenadas a 4 ° C para utilização no ensaio. 5. Preparação de placas de contas de Captura 1
[00352] Três placas Millipore de 0,45 um (HV membrana Durapore Cat, # MAHVN4550) foram equilibradas com 100 ul de 1x SB17, 0,05% de Tween-20 durante pelo menos 10 minutos. O tampão de equilíbrio foi em seguida filtrada através de placa e 133,3 mL de um 7,5% de estreptavidina-agarose grânulo lama (em 1x SB17, 0,05% de Tween-20) foi adicionado a cada poço. Para manter as contas de estreptavidina-agarose suspenso enquanto transfere-os para a placa de filtro, a solução do grânulo foi manualmente misturada com um uL 200, pipetador de 12 canais, 15 vezes. Depois os grânulos foram distribuídos entre as 3 placas de filtro, a aplicou-se vácuo para remover o sobrenadante do grânulo. Finalmente, as contas foram lavadas em placas de filtro com 200 mL 1x SB17, 0,05% de Tween-20 e, em seguida, ressuspenderam-se em 200 uL 1x SB17, 0,05% de Tween-20. As partes inferiores das placas de filtro foram transferidas e as placas armazenadas para uso no ensaio. 6. Carregando o Cytomat
[00353] O "cytomat" foi carregado com todas as pontas, lâminas, todos os reagentes em calhas (exceto o reagente de biotina NHS o qual foi preparado fresco justamente depois da adição às placas), 3 placas de filtro de captura 1 e uma placa de MyOne preparadas. 7. Captura 1
[00354] Depois de um tempo de equilíbrio 3,5 horas, as placas de amostra/aptâmero foram removidas da incubadora, centrifugou-se durante cerca de 1 minuto, tiras removidas e colocadas no convés da Beckman Biomek FxP. O Beckman Biomek programa FxP foi iniciado. Todos as etapas subsequentes de uma captura foram realizados pela Beckman Biomek FxP robô, a menos que indicado em contrário. Dentro do programa, o vácuo foi aplicado para a captura uma placas de filtro para remover o sobrenadante do grânulo. Cem microlitros de cada um dos 10%, 1% e as reações de equilíbrio 0,03% de ligação foram adicionadas às respectivas placas de captura 1 de filtragem, e cada placa foi misturado usando uma plataforma on-agitador orbital a 800 rpm durante 10 minutos.
[00355] A solução não ligada foi removida por meio de filtração sob vácuo. As contas de captura 1 foram lavadas com 190 uL de 100 uM de biotina em 1x SB17, 0,05% de Tween-20, seguido por 190 mL de 1x SB17, 0,05% de Tween-20 por meio da supressão da solução e imediatamente extraíndo vácuo para filtrar a solução através da placa.
[00356] Em seguida, 190 ul 1x SB17, 0,05% de Tween-20 foi adicionado às placas de captura 1. As placas foram transferidas para remover gotículas através de uma bandeja de incubação de blot e, em seguida, incubaram-se com agitadores orbitais a 800 rpm durante 10 minutos a 25°C.
[00357] O robô removido esta lavagem por meio de filtração sob vazio e apagado na parte inferior da placa de filtro para remover gotículas usando a estação blot no convés. 8. Tagging
[00358] Uma alíquota de NHS-biotina-PEO4 foi descongelado a 37°C durante 6 minutos e, em seguida, diluído a 1:100 com tampão de marcação (SB17, pH = 7,25 a 0,05% de Tween-20). O reagente NHS- biotina-PEO4 foi dissolvido em 100 mM de concentração em DMSO anidro e foram armazenadas congeladas a -20°C. Mediante uma solicitação robot, os diluídas NHS-biotina-PEO4 reagente foi adicionado manualmente para uma calha no convés e do programa de robô foi re-iniciado manualmente para distribuir 100 L do NHS-biotina- PEO4 em cada poço de cada prendedor um filtro placa. Esta solução foi deixada a incubar com uma captura grânulos agitação a 800 rpm durante 5 minutos sobre os crivos obital. 9. Desafio cinética e foto-clivagem
[00359] A reação de marcação foi parada pela adição de 150 uL de 20 mM de glicina em 1x SB17, 0,05% de Tween-20 para a captura chapas 1 e ainda contendo o tag NHS. As placas foram então incubadas durante 1 minuto em crivos orbital a 800 rpm. A solução NHS-tag/glycine foi removido por filtração a vácuo. Em seguida, 190 ul de 20 mM de glicina (1x SB17, 0,05% de Tween-20) foi adicionado a cada placa e incubou-se durante 1 minuto em crivos orbital a 800 rpm antes da remoção, por filtração sob vácuo.
[00360] 190 ul de 1x SB17, 0,05% de Tween-20 foram adicionados a cada placa e removido por filtração a vácuo.
[00361] Os poços das placas de captura 1 foram subsequentemente lavadas três vezes por adição de 190 uL 1x SB17, 0,05% de Tween-20, colocando as placas sobre crivos orbital durante 1 minuto a 800 rpm seguida de filtração sob vácuo. Após a última lavagem, as placas foram colocadas no topo de uma placa de 1 mL de poços profundos e removida do baralho. As capturas 1 as placas foram centrifugadas a 1000 rpm durante 1 minuto para remover o máximo de volume estranhos a partir das contas de agarose antes de eluição possível.
[00362] As placas foram colocadas de volta na Beckman Biomek FxP e 85 uL de 10 mM DxSO4 em 1x SB17, 0,05% de Tween-20 foi adicionado a cada poço das placas de filtro.
[00363] As placas de filtro foram removidos a partir do convés, colocada sobre um Thermoshaker Variomag (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA) sob a BlackRay (Ted Pella, Inc., Redding, CA) fontes luminosas, e irradiada durante 10 minutos, enquanto agitando a 800 rpm.
[00364] As soluções photocleaved foram eluídos sequencialmente a partir de cada placa de captação 1 em uma placa de fundo comum bem colocando primeiro os 10% Trave uma placa de filtro no topo de uma placa de 1 mL de poços profundos e centrifugação a 1000 rpm durante 1 minuto. A 1% e 0,03% de apanhar uma placas foram então centrifugados sequencialmente na placa de fundo mesmo poço. 10. Catch 2 captura talão
[00365] A 1 mL poço profundo bloco contendo a totalidade dos eluatos de captura 1 foi colocada no convés do Biomek Beckman FxP para captura 2.
[00366] O robô transferido todo o eluato foto clivada a partir da placa 1 ml de poços profundos sobre a placa contendo as Hybaid preparados anteriormente captura 2 contas MyOne magnéticos (após a remoção do tampão MyOne através de separação magnética).
[00367] A solução foi incubada sob agitação a 1350 rpm durante 5 minutos a 25°C em uma Thermoshaker Variomag (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, MA).
[00368] O robô transferiu a placa para a plataforma na estação de separador magnético. A placa foi incubada no magneto durante 90 segundos antes da remoção e descarte do sobrenadante. 1. .37°C glicerol 30% lava
[00369] A captura 2 placa foi transferida para o agitador e 75 mL no convés térmica de 1x SB17, 0,05% de Tween-20 foi transferido para cada poço. A placa foi misturada durante 1 minuto a 1350 rpm e 37°C para voltar a suspender e aquecer as contas. A cada poço da placa de captação 2, 75 ul de glicerol a 60%, a 37°C e foi transferido a placa continuou a misturar durante mais um minuto a 1350 rpm e 37°C. O robô transferidos da placa para a 37°C separador magnético, onde foi incubada no magneto durante 2 minutos e, em seguida, o robot removido e rejeitado o sobrenadante. Estas lavagens foram repetidas mais duas vezes.
[00370] Após a remoção da lavagem glicerol terceira 30% da captura duas contas, 150 ul de 1x SB17, 0,05% de Tween-20 foi adicionado a cada poço e incubados a 37°C, com agitação a 1350 rpm durante 1 minuto, antes da remoção por separação magnética sobre o ímã a 37°C.
[00371] As capturas duas contas foram lavadas uma última vez com 150 mL 1x SB19, 0,05% de Tween-20 com incubação durante 1 minuto, agitando a 1350 rpm, antes da separação magnética. 12. Catch 2 eluição Bead e Neutralização
[00372] Os aptâmeros foram eluídos a partir de duas contas de captura, adicionando 105 ul de 100 mM CAPSO com 1 M de NaCl, 0,05% de Tween-20 a cada poço. As contas foram incubadas com esta solução, com agitação a 1300 rpm durante 5 minutos.
[00373] A captura 2 placa foi então colocada sobre o separador magnético durante 90 segundos, antes de transferir 90 mL de eluído de uma nova placa de 96 poços contendo 10 ul de 500 mM HCl, 500 mM de HEPES, 0,05% de Tween-20 em cada poço. Após a transferência, a solução foi misturada por pipetagem roboticamente 90 uL cima e para baixo cinco vezes. 13. Hibridização
[00374] A Beckman Biomek FxP transferidos 20 ul do eluato neutralizado captura 2 para uma placa fresca Hybaid, e 5 ul de Bloco Agilent 10x, 10x contendo um pico de controles de hibridação, foi adicionada a cada poço. Em seguida, 25 ul de tampão de hibridação 2x Agilent foi manualmente pipetados para cada poço da placa contendo as amostras neutralizadas e tampão de bloqueio e a solução foi misturada por pipetagem manual 25 uL cima e para baixo 15 vezes lentamente para evitar a formação de bolhas extensa. A placa foi centrifugada a 1000 rpm durante 1 minuto.
[00375] A junta deslizante foi colocado dentro de uma câmara de hibridação Agilent e 40 ul de cada um dos amostras que continham a hibridação e solução de bloqueio foi manualmente pipetados para cada junta. Um pipetador de 8 canais variável que mede foi utilizado de uma maneira destinada a minimizar a formação de espuma. Slides personalizados Agilent micromatriz (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA), com o seu código de barras Número voltado para cima, foram, então, baixou lentamente para os slides da junta (ver Agilent manual para descrição detalhada).
[00376] A parte superior das câmaras de hibridação foram colocados sobre a sanduíche slide/suporte e os suportes de fixação deslizar sobre todo o conjunto. Estes conjuntos foram apertados, girando os parafusos.
[00377] para garantir a bolha solução poderia mover-se livremente dentro da amostra. Se a bolha não se mover livremente a montagem câmara de hibridação foi gentilmente bateu para soltar bolhas apresentadas perto da junta.
[00378] As câmaras de hibridação montadas foram incubadas em um forno de hibridação Agilent durante 19 horas à 60°C a rodar a 20 rpm. 14. Publicar Hibridização lavar
[00379] Aproximadamente 400 mL Agilent Wash Buffer 1, foi colocado em cada uma de duas placas de vidro separadas de coloração. Um dos pratos de coloração foi colocada sobre uma placa de agitação magnética e um porta-lâminas e barra de agitação foram colocados na memória intermédia.
[00380] Um prato de coloração para Agilent Wash 2 foi preparado através da colocação de uma barra de agitação em um prato de coloração de vidro vazio.
[00381] Um quarto prato de coloração de vidro foi reservado para a lavagem final de acetonitrila.
[00382] Cada uma das seis câmaras de hibridização foi desmontada. Um-por-um, o sanduíche de lãmina/revestimento foi removido da sua câmara de hibridação e submerso no prato de coloração contendo Lavagem 1. O sanduíche de lâminas/revestimento foi separa a parte usando um par de pinças, enquanto ainda submergindo a lâmina de micromatriz. A lâmina foi rapidamente transferida para o porta-lâminas no prato de coloração de Lavagem 1 sobre a placa de agitação magnética.
[00383] O porta-lâminas foi gentilmente levantado e abaixado 5 vezes. O agitador magnético foi ligado a um nível baixo e as lâminas incubadas durante 5 minutos.
[00384] Quando restava um minuto para lavagem 1, o tampão de Lavagem 2 pré-aquecido a 37°C em um incubador foi adicionado ao segundo prato de coloração preparado. O porta-lâminas foi rapidamente transferido para o tampão de Lavagem 2 e qualquer tampão em excesso na parte inferior da prateleira foi removido por raspagem no topo do prato de coloração. O porta- lâminas foi gentilmente levantado e abaixado 5 vezes. O agitador magnético foi ligado a um nível baixo e as lâminas incubadas durante 5 minutos.
[00385] O porta-lâminas foi lentamente retirado da lavagem 2, tendo cerca de 15 segundos para remover as lâminas da solução.
[00386] Com um minuto restante na Lavagem 2, foi adicionada acetonitrila (ACN) ao disco de coloração IV. O porta-lâminas foi transferido para o prato de coloração de acetonitrila. O porta-lâminas foi gentilmente levantado e abaixado 5 vezes. O agitador magnético foi ligado a um nível baixo e as lâminas incubadas durante 5 minutos.
[00387] O porta-lâminas foi lentamente retirado do prato de coloração de ACN e colocado sobre uma toalha absorvente. As arestas inferiores das lâminas foram rapidamente secas e a lâmina foi colocada em uma caixa de lâmina limpa. 15. Formação de Imagem de Micromatriz
[00388] As lâminas de micromatriz foram colocadas em suportes de lâminas de escaner Agilent e carregado no scaner de Microensaio Agilent de acordo com as instruções do fabricante.
[00389] Foram formadas imagens das lâminas no canal Cy3 em resolução de 5 μM em configuração de 100% PMT e a opção XTD habilitada em 0,05. As imagens em formato.tiff resultantes foram processadas usando o recurso de software de extração Agilent, versão 10.5. Exemplo 2. Identificação de marcadores biológicos
[00390] A identificação de marcadores biológicos de câncer de pulmão em potencial foi realizada em três diferentes aplicações de diagnóstico, diagnóstico de nódulos suspeitos de uma tomografia computadorizada, a triagem de fumantes assintomáticos para câncer de pulmão, e diagnóstico de um indivíduo com câncer de pulmão. Amostras de soro foram coletadas de quatro locais diferentes em apoio a essas três aplicações e incluem 48 casos de NSCLC, 218 controles de alto risco composto de fumantes pesados e pacientes com nódulos benignos. O ensaio multiplexado de afinidade de aptâmero tal como descrito no Exemplo 1 foi usado para medir e relatar o valor de RFU para 820 analitos em cada uma destas 264 amostras. O teste KS foi então aplicado a cada analito. A distância KS (estatística de Kolmogorov-Smirnov) entre os valores de dois conjuntos de amostras é uma medida não paramétrica da extensão em que a distribuição empírica dos valores a partir de um conjunto (Conjunto A) difere da distribuição dos valores do outro conjunto (Conjunto B). Para qualquer valor de um limiar T alguma proporção dos valores do Conjunto A será menor do que T, e uma alguma proporção dos valores de Conjunto B será menor que T. A distância KS mede a máxima (não assinalada) diferença entre a proporção os valores dos dois conjuntos para qualquer escolha de T.
[00391] Conjuntos de marcadores biológicos podem ser usados para construir classificadores que atribuem amostras tanto para controle quanto para grupo de doença. De fato, muitos classificadores foram produzidos a partir desses conjuntos de marcadores biológicos e da frequência com a qual qualquer marcador biológico foi usado em classificadores de boa pontuação determinada. Esses marcadores biológicos que ocorreram com maior freqüência entre os classificadores de pontuação superiores foram os mais úteis para a criação de um teste de diagnóstico. Neste exemplo, classificadores Bayesianos foram usados para explorar o espaço de classificação, mas muitas outras técnicas de aprendizagem supervisionada podem ser empregadas para este propósito. A aptidão de pontuação de qualquer classificador individual foi avaliada utilizando a área sob a curva característica de operação do receptor (AUC ou ROC) do classificador na superfície Bayesiana assumindo uma prevalência da doença de 0,5. Esta métrica de pontuação varia de zero a um, com um sendo um classificador livre de erros. Os detalhes da construção de um classificador Bayesiano a partir de medições da população de marcadores biológicos são descritos no Exemplo 3. Exemplo 3. Classificação Bayesiana simples para Câncer de Pulmão
[00392] A partir da lista de marcadores biológicos identificados como úteis para discriminar entre NSCLC e o grupo de controle de alto risco, foi selecionado um painel de cinco marcadores biológicos e um classificador de Bayes simples foi construído, ver a Tabela 14. A classe de funções dependentes de densidade de probabilidade (pdfs), p(xi | c) e p(xi | d), onde xi é o log do valor medido de RFU para o marcador i, e c e d se referem ao controle e à população de doenças, foram modeladas como funções normais de distribuição caracterizadas por uma média μ e variância α2. Os parâmetros para pdfs dos cinco marcadores biológicos são listados na Tabela 15 e um exemplo dos dados brutos, juntamente com os quais o modelo ajusta a uma pdf normal é apresentado na Figura 5. O pressuposto subjacente aparece para ajustar os dados muito bem como evidenciado pela Figura 5.
[00393] A classificação de Bayes simples para um tal modelo é dada pela seguinte equação, onde P(d) é a prevalência da doença na população
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[00394] apropriada para o teste e n = 5 aqui. Cada um dos termos na soma é uma relação de probabilidade do log para um marcador individual e a relação de probabilidade log total de uma amostra isenta de doença de interesse (i. é, neste caso, NSCLC) versus tendo a doença é simplesmente a soma destes termos individuais mais um termo que representa a prevalência da doença. Para simplificar, assumimos P(d) = 0.5 de forma que, ln (1-P(d)/P(d) = 0
[00395] Dada uma medida da amostra desconhecida em log (RFU) para cada um dos 10 marcadores biológicos dos componentes individuais compreendendo o log da razão de probabilidade para controle versus classe de doença são tabulados e pode ser computado a partir dos parâmetros na Tabela 15 e os valores de x. A soma do log das razões de probabilidade individuais é 3,47, onde uma probabilidade de estar livre da doença versus ter a doença de 32:1, onde a probabilidade = e(3.47) =32. Todos os cinco marcadores biológicos são todos consistentemente encontrado favorecerem o grupo de controle. Multiplicando as probabilidades juntas dá os mesmos resultados como exposto acima, a probabilidade de 32:1 que a amostra desconhecida está livre da doença. Na verdade, esta amostra foi proveniente da população de controle no conjunto de treinamento. Embora este exemplo demonstre a classificação das amostras de soro utilizando os marcadores biológicos na Tabela 15, a mesma abordagem pode ser utilizada em qualquer tipo de tecido com qualquer conjunto de marcadores biológicos a partir da Tabela 21. Exemplo 4. Algoritmo (Greedy) para a Selecionar Painéis de Marcador Biológico para Classificadores Parte 1
[00396] Este exemplo descreve a seleção de marcadores biológicos a partir da Tabela 21, para formar painéis que podem ser usados como classificadores em qualquer um dos métodos aqui descritos. Painéis de marcadores biológicos contendo MMP-12 e Subconjuntos dos marcadores biológicos na Tabela 21 foram selecionados para a construção de classificadores com bom desempenho. Este método também foi utilizado para determinar quais os marcadores potenciais foram incluídos como marcadores biológicos no Exemplo 2.
[00397] A medida do desempenho do classificador usado aqui é a área sob a curva ROC (AUC), um desempenho de 0,5 é a expectativa de linha de base para um classificador (sorteio) aleatório, um classificador pior do que aleatório pontuaria entre 0,0 e 0,5, um classificador com melhor desempenho do que desempenho aleatório pontuaria entre 0,5 e 1,0. Um classificador perfeito sem erros teria uma sensibilidade de 1,0, uma especificidade de 1.0 e uma AUC de 1,0. Pode-se aplicar os métodos descritos no Exemplo 4 para outras medidas comuns de desempenho tais como a medida F, a soma de sensibilidade e especificidade, ou o produto de sensibilidade e especificidade. Especificamente pode-se desejar tratar sensibilidade e especificidade com peso diferente, de modo a selecionar os classificadores que realizem com maior especificidade, à custa de alguma sensibilidade, ou para selecionar os classificadores que realizem com maior sensibilidade à custa de alguma especificidade. Uma vez que o método aqui descrito, consiste apenas em uma medida de "desempenho", qualquer esquema de ponderação que resulta em uma única medida de desempenho pode ser usado. Diferentes aplicações terão diferentes benefícios para resultados de positivos verdadeiros e negativos verdadeiros, e também diferentes custos associados com resultados positivos falsos de resultados negativos falsos. Por exemplo, a triagem de fumantes assintomáticos e o diagnóstico diferencial de nódulos benignos encontrados na TC não terão, em geral, o mesmo compromisso ótimo entre sensibilidade e especificidade. As diferentes demandas dos dois testes, em geral irão requerer configuração diferente de ponderação para erros de classificação positivos e negativos, refletido na medida de desempenho. Alterando a medida do desempenho em geral irá alterar o subconjunto exato dos marcadores selecionados a partir da Tabela 21, para um dado conjunto de dados.
[00398] Para a abordagem Bayesiana para a discriminação de amostras de câncer de pulmão a partir de amostras de controle descritas no Exemplo 3, o classificador foi completamente parametrizado pelas distribuições de marcadores biológicos nas amostras de treinamento na doença e benignas, e a lista de marcadores biológicos foi escolhida a partir da Tabela 21, isto é, o subconjunto de marcadores escolhidos para inclusão determinou um classificador de uma forma um-para-um dado um conjunto de dados de treinamento.
[00399] O método "greedy" empregado aqui foi utilizado para pesquisar o subconjunto ótimo de marcadores da Tabela 21. Para um pequeno número de marcadores ou classificadores com relativamente poucos marcadores, cada possível subconjunto de marcadores foi enumerado e avaliado em termos de desempenho do classificador construído com esse conjunto particular de marcadores (ver o Exemplo 4, parte 2). (Essa abordagem é bem conhecida no domínio da estatística como "melhor seleção de subconjunto", ver, por exemplo, The Elements of Statistical Learning - Data Mining, Inference, and Prediction, T. Hastie, et al, editores, Springer Science + Business Media, LLC, 2a edição, 2009). No entanto, para os classificadores descritos no presente documento, o número de combinações de múltiplos marcadores pode ser muito grande, e não foi possível avaliar cada conjunto possível de cinco marcadores, por exemplo, a partir da lista de 86 marcadores (Tabela 21) (isto é, 34.826.302 combinações). Devido à impraticabilidade de busca através de cada subconjunto de marcadores, o subconjunto único ideal não pode ser encontrado, no entanto, ao utilizar esta abordagem, vários subconjuntos excelentes foram encontrados, e, em muitos casos, qualquer destes subconjuntos pode representar um resultado ótimo.
[00400] Em vez de avaliar cada conjunto possível de marcadores, pode ser seguida uma abordagem "greedy" um passo adiante (ver, por exemplo, Dabney AR, JD Storey (2007) Optimalility Driven Nearest Centroid Classification from Genomic Data. PLoS ONE 2 (10): e1002 doi: 10.1371/journal.pone.0001002). Usando este método, um classificador é iniciado com o melhor marcador único (com base na distância KS para os marcadores individuais), e é crescido em cada etapa através de tentativa, por sua vez, cada um dos membros de uma lista de marcador que não é atualmente um membro do conjunto de marcadores no classificador. O um marcador que pontua melhor, em combinação com o classificador existente é adicionado ao classificador. Este processo é repetido até que nenhuma melhoria adicional no desempenho é conseguida. Infelizmente, esta abordagem pode perder valiosas combinações de marcadores para as quais alguns dos marcadores individuais não são todos escolhidos antes que o processo pare.
[00401] O procedimento "greedy" utilizado aqui foi uma elaboração da abordagem anterior uma etapa adiante, em que, para ampliar a busca, em vez de manter apenas um único classificador candidato (subconjunto marcador) a cada etapa, foi mantida uma lista de classificadores candidatos. A lista foi semeada com cada subconjunto marcador único (usando cada marcador na tabela por si mesmo). A lista foi ampliada em etapas derivando novos classificadores (subconjuntos marcador) desde aqueles atualmente na lista e adicionando-os à lista. Cada subconjunto marcador atualmente na lista foi prolongado através da adição de qualquer marcador da Tabela 1 não já fazendo parte do classificador, e o qual não duplicaria um subconjunto existente, em sua adição ao subconjunto, (estes são designados "marcadores permissíveis"). Cada subconjunto de marcador existente foi extendido por cada marcador permitido a partir da lista. Claramente, um tal processo acabaria por gerar cada subconjunto possível, e a lista iria ficar sem espaço. Portanto, todos os classificadores gerados foram mantidos apenas enquanto a lista foi menor do que um tamanho predeterminado (geralmente o suficiente para manter todos os três subconjuntos de marcador). Uma vez que a lista atingiu o limite de tamanho predeterminado, ela se tornou elitista, isto é, apenas os classificadores que mostraram um determinado nível de desempenho foram mantidos na lista, e os outros cairam para o fim da lista e se perderam. Isto foi conseguido mantendo a lista classificada por ordem de desempenho do classificador; classificadores novos que eram pelo menos tão bons quanto o pior classificador atualmente na lista foram inseridos, forçando a expulsão do atual subempreendedor de fundo. Um detalhe adicional de implementação é que a lista foi completamente substituída em cada etapa de geração e, portanto, cada classificador na lista teve o mesmo número de marcadores, e, em cada etapa, o número de marcadores por classificador cresceu por um.
[00402] Uma vez que este método produziu uma lista de classificadores candidatos utilizando diferentes combinações de marcadores, pode-se pergunar se os classificadores podem ser combinados a fim de evitar os erros que possam ser feitos pelo melhor classificador único, ou por grupos minoritários dos melhores classificadores. Tais métodos "Ensemble" e "comissão de especialistas" são bem conhecidos nas áreas de estatística e de aprendizagem de máquina e incluem, por exemplo, "obter média", "voto", "empilhamento", "ensacamento" e "aumentar" (ver, por exemplo, The Elements of Statistical Learning- Data Mining, Interference, and Prediction, T. Hastie, et al., editores, Springer Science + Business Media, LLC, 2a edição, 2009). Estas combinações de classificadores simples fornecem um método para reduzir a variância nas classificações devido ao ruído em qualquer conjunto particular de marcadores incluindo vários classificadores diferentes e, portanto, informação a partir de um conjunto maior de marcadores a partir de uma tabela de marcador biológico, efetivamente fazendo a média entre os classificadores. Um exemplo da utilidade desta abordagem é que ela pode evitar valores extremos de um único marcador de afetar adversamente a classificação de uma única amostra. A exigência para medir um número maior de sinais pode ser impraticável em ensaios convencionais de anticorpos de "um marcador de cada vez", mas não tem nenhuma desvantagem para um ensaio aptâmero totalmente multiplexado. Técnicas tais como estas beneficiam-se de uma tabela mais extensa de marcadores biológicos e de utilizar múltiplas fontes de informação concernentes aos processos de doença para fornecer uma classificação mais robusta. Parte 2
[00403] Os marcadores biológicos selecionados na Tabela 1 deram origem a classificadores que têm melhor desempenho do que os classificadores construídos com "não-marcadores" (ou seja, proteínas que possuem sinais que não satisfazem os critérios de inclusão na Tabela 1 (como descrito no Exemplo 2)).
[00404] Para classificadores contendo apenas um, dois e três marcadores, todos os classificadores possíveis obtidos utilizando os marcadores biológicos da Tabela 1 foram enumerados e examinados para a distribuição de desempenho em comparação com os classificadores construídos a partir de uma tabela semelhante selecionada aleatoriamente de sinais de não marcadores.
[00405] Na Figura 17 e Figura 18, a soma da sensibilidade e especificidade foi utilizada como a medida do desempenho, um desempenho de 1,0 é a expectativa da linha de base para um classificador aleatório(sorteio). O histograma de desempenho do classificador foi comparado com o histograma de desempenho de uma enumeração exaustiva de classificadores semelhantes construídos a partir de uma tabela de sinais de 40 "não marcadores"; os 40 sinais foram escolhidos aleatoriamente a partir de 400 aptâmeros que não demonstraram diferença de sinalização entre controle e populações de doença (KS-distância <1,4).
[00406] A Figura 17 mostra os histogramas do desempenho de todos os possíveis classificadores de um, dois e três marcadores construídos a partir dos parâmetros de marcadores biológicos na Tabela 13 para marcadores biológicos que podem discriminar entre nódulos benignos e NSCLC e compara esses classificadores com todos os possíveis classificadores de um, dois e três marcadores, construídos com os 40 sinais de RFU de aptâmero "não marcador". A Figura 17A mostra os histogramas de desempenho de classificador de marcador único, a Figura 17B mostra o histograma de desempenho do classificador de dois marcadores, e a Figura 17C mostra o histograma de desempenho do classificador de três marcadores.
[00407] Na Figura 17, as linhas contínuas representam os histogramas de desempenho de classificador de todos os classificadores de um, dois e três marcadores utilizando os dados de marcadores biológicos para nódulos benignos e NSCLC na Tabela 13. As linhas tracejadas são os histogramas do desempenho de classificador de todos os classificadores de um, dois e três marcadores utilizando os dados para os nódulos benignos e NSCLC, mas utilizando o conjunto de sinais aleatórios de não marcadores.
[00408] A Figura 18 mostra os histogramas do desempenho de todos os possíveis classificadores de um, dois e três marcadores construídos a partir dos parâmetros de marcadores biológicos na Tabela 12 para marcadores biológicos que podem discriminar entre fumantes assintomáticos e NSCLC e compara este com todos os possível classificadores de um, dois, e três marcadores construído usando 40 sinais de RFU de aptâmero " não marcador". A Figura 18A mostra o histograma de desempenho do classificador de marcador único, a Figura 18B mostra o histograma de desempenho do classificador de dois marcadores, e a Figura 18C mostra o histograma de desempenho do classificador de três marcadores.
[00409] Na Figura 18, as linhas contínuas representam os histogramas de desempenho de classificador de todos os classificadores de um, dois e três marcadores utilizando os parâmetros para fumantes assintomáticos na Tabela 12. As linhas tracejadas são os histogramas do desempenho de classificador de todos os classificadores de um, dois e três marcadores utilizando os dados para fumantes assintomáticos e NSCLC, mas utilizando o conjunto de sinais aleatórios de não marcadores.
[00410] Os classificadores construídos a partir dos marcadores listados na Tabela 1 formam um histograma distinto, bem separado dos classificadores construídos com sinais de "não marcadores" para comparações de todos os marcadores de um-marcador de dois- marcadores de três-marcadores. O desempenho e pontuação AUC dos classificadores construídos a partir dos marcadores biológicos na Tabela 1 também aumenta mais rapidamente com o número de marcadores do que os classificadores construídos a partir dos não marcadores, a separação aumenta entre os classificadores de marcador e não marcador enquanto o número de marcadores por classificador aumenta. Todos os classificadores construídos com os marcadores biológicos listados nas Tabelas 38 e 39 desempenham melhor do que classificadores construídos usando os "não- marcadores". Parte 3
[00411] Para testar se um subconjunto do núcleo de marcadores considerados por bom desempenho dos classificadores, metade dos marcadores foram aleatoriamente retirados das listas de marcadores biológicos nas Tabelas 38 e 39. O desempenho, como medido pela sensibilidade mais especificidade, dos classificadores para distinguir nódulos benignos de nódulos malignos caiu ligeiramente por 0,07 (1,74-1,67), e o desempenho dos classificadores para distinguir fumantes que tiveram câncer daqueles que não tiveram câncer também caiu ligeiramente por 0,06 (1,76-1,70). A implicação das características de desempenho de subconjubtos da tabela de marcador biológico é que multiplos subconjuntos dos marcadores biológicos listados são eficazes na construção de um teste de diagnóstico, e nenhum subconjunto de núcleo particular de marcadores dita o desempenho de classificador.
[00412] Em face destes resultados, foram testados classificadores que excluíram os melhores marcadores das Tabelas 12 e 13. A Figura 19 compara o desempenho de classificadores construídos com a lista completa dos marcadores biológicos nas Tabelas 12 e 13, com o desempenho de classificadores construídos com um conjunto de marcadores biológicos a partir das Tabelas 38 e 39, excluindo os melhores marcadores classificados.
[00413] A figura 19 demonstra que os classificadores construídos sem os melhores marcadores desempenharam bem, o que implica que o desempenho dos classificadores não foi devido a algum pequeno grupo de núcleo de marcadores, e que as alterações nos processos subjacentes associados com a doença são refletidos nas atividades de muitas proteínas. Muitos subconjuntos dos marcadores biológicos na Tabela 1 desempenharam próximo à forma ótima, mesmo após a remoção de 15 da parte superior dos 40 marcadores da Tabela 1.
[00414] A figura 19A mostra o efeito sobre classificadores para discriminar nódulos benignos de NSCLC construídos com 2 a 10 marcadores. Mesmo depois da remoção dos 15 da parte superior de marcadores (classificados pela distância KS) da Tabela 13, o desempenho de nódulo benigno versus NSCLC aumentou com o número de marcadores selecionados da tabela para atingir a mais de 1,65 (Sensibilidade +Especificidade).
[00415] A figura 19B mostra o efeito sobre classificadores para discriminar fumantes assintomáticos de NSCLC construídos com 2 a 10 marcadores. Mesmo depois de remover os15 da parte superior do ranking de marcadores (classificados pela distância KS) da Tabela 12, o desempenho de fumantes assintomáticos versus NSCLC aumentou com o número de marcadores selecionados da tabela para chegar a mais de 1,7 (sensibilidade + especificidade), e se aproximou perto do desempenho do classificador melhor selecionado entre a lista completa de marcadores biológicos na Tabela 12.
[00416] Finalmente, a Figura 20 mostra como é o desempenho ROC de classificadores típicos construídos a partir de uma lista de parâmetros nas Tabelas 12 e 13, de acordo com o Exemplo 3. A Figura 20A mostra o desempenho do modelo de assumir a independência dos marcadores como no Exemplo 3, e a Figura 20B mostra as curvas ROC reais utilizando os dados do ensaio de conjunto utilizado para gerar os parâmetros das Tabelas 12 e 13. Pode ser visto que o desempenho de um determinado número de marcadores selecionados foi qualitativamente de acordo, e que o acordo quantitativa degradou enquanto aumenta o número de marcadores. (Isto é consistente com a noção de que as informações provenientes de qualquer marcador biológico particular no que respeita aos processos de doença é redundante com as informações provenientes de outros marcadores biológicos fornecidos nas Tabelas 12 e 13). A Figura 20 demonstra, portanto, que os quadros 12 e 13, em combinação com os métodos descritos no Exemplo 3 possibilitam a construção e avaliação de um grande número de classificadores úteis para a discriminação de NSCLC de nódulos benignos e a discriminação dos fumantes assintomáticos que têm NSCLC daqueles que não têm NSCLC. Exemplo 5. Demonstração de Especificidade de Aptâmero em um ensaio para baixo
[00417] A leitura final do ensaio multiplexado é baseada na quantidade de aptâmero recuperados após as etapas sucessivas de captura no ensaio. O ensaio multiplexado é baseado na premissa de que a quantidade de aptâmero recuperados no final do ensaio é proporcional à quantidade de proteína na mistura de complexo original (por exemplo, plasma). No sentido de demonstrar que este sinal é de fato derivado do analito pretendido ao invés de a partir de proteínas não especificamente ligadas no plasma, foi desenvolvido um ensaio à base de gel suspenso no plasma. Este ensaio pode ser utilizado para demonstrar visualmente que a proteína desejada é, de fato, puxado para fora a partir do plasma, após o equilíbrio com um aptâmero, bem como para demonstrar que aptâmeros ligados aos seus alvos pretendidos de proteína podem sobreviver como um complexo através de etapas de desafio cinéticos no ensaio. Nas experiências descritas no presente exemplo, a recuperação de proteína, no final deste ensaio para baixo requer que a proteína permaneça não ligada covalentemente ao aptâmero por cerca de duas horas após o equilibrio. É importante notar que, neste exemplo, nós também fornecemos evidência de que as proteínas não especificamente ligadas dissociam durante estas etapas e não contribuem significativamente para o sinal final. Deve notar-se que o procedimento para baixo descrito neste exemplo inclui todas as etapas chave no ensaio multiplexado descrito acima. Ensaio para baixo de Plasma
[00418] As amostras de plasma foram preparadas diluindo 50 μL de plasma -EDTA a 100 μL em SB18 com 0,05% de Tween-20 (SB18T) e 2 μM Z-Block. A solução de plasma foi equilibrada com 10 pmoles de um aptâmero PBDC em um volume final de 150 μL durante 2 horas a 37°C. Após o equilíbrio, complexos e aptâmero desacoplado foram capturados com 133 μL de uma 7,5% lama de conta de estreptavidina- agarose através da incubação com agitação durante 5 minutos à temperatura ambiente em uma placa de filtro de Durapore. As amostras ligadas a contas foram lavadas com biotina e com tampão sob vácuo, tal como descrito no Exemplo 1. Após lavagem, as proteínas ligadas foram marcadas com 0,5 mM de NHS-S-S-biotina, 0,25 mM NHS-Alexa647 no diluente de biotina durante 5 minutos com agitação à temperatura ambiente. Este etapa de coloração permite a biotinilação para captura de proteínas em contas de estreptavidina bem como como coloração altamente sensível para a detecção em um gel. As amostras foram lavadas com glicina tampão como descrito no Exemplo 1. Aptâmeros foram liberados a partir das contas por fotoclivagem usando uma fonte de Raio de Luz Negra durante 10 minutos com agitação à temperatura ambiente. Neste ponto, as proteínas biotiniladas foram capturadas em contas de 0,5 mg MyOne estreptavidina por agitação durante 5 minutos à temperatura ambiente. Este etapa irá capturar proteínas ligadas à aptâmeros, bem como proteínas que podem ter-se dissociado de aptâmeros desde o equilíbrio inicial. As contas foram lavadas como descrito no Exemplo 1. As proteínas foram eluídas a partir das contas de estreptavidina MyOne por incubação com 50 mM de DTT em SB17T durante 25 minutos a 37°C com agitação. O eluato foi, então, transferido para contas de MyOne revestidas com uma sequência complementar à região fixa a 3' do aptâmero e incubadas durante 25 minutos a 37°C com agitação. Esta etapa captura todo o aptâmero restante. As contas foram lavadas duas vezes com 100 μL SB17T durante 1 minuto e uma vez com 100 μL SB19T durante 1 minuto. O aptâmero foi eluído a partir destas contas finais por incubação com 45 μL 20 mM de NaOH, durante 2 minutos, com agitação para romper os cordões hibridizados. 40 μL deste eluato foi neutralizado com 10 μL HCl 80 mM contendo 0,05% de Tween-20. Alíquotas representando 5% do eluato a partir do primeiro conjunto de contas (representando todas as proteínas do plasma ligado ao aptâmero) e 20% do eluato a partir do último conjunto de contas (representando todas as proteínas do plasma restante ligado no fim do nosso ensaio clínico) foram executadas em uma NuPAGE 4-12% Bis-Tris gel (Invitrogen) sob condições redutoras e desnaturantes. Fora formadas imagens dos géis em um digitalizador Q Alpha Innotech FluorChem no canal Cy5 para formar imagens das proteínas.
[00419] Géis para baixo de aptâmeros foram selecionados contra LBP (~ 1x10-7 M em plasma, polipeptídeo MW ~ 60 kDa), C9 (~ 1x10-6 M em plasma, MW polipeptídeo ~ 60 kDa), e IgM (~ 9x10-6 M em plasma, MW ~ 70 kDa e 23 kDa), respectivamente. (Ver Figura 16).
[00420] Em cada gel, a pista 1 é o produto de eluição a partir das contas de estreptavidina-agarose, a pista 2 é o eluato final, e a pista 3 é um marcador de pista MW (bandas principais estão a 110, 50, 30, 15, e 3,5 kDa de cima para baixo). É evidente a partir destes géis que há uma pequena quantidade de ligação não específica de proteínas do plasma no equilíbrio inicial, mas apenas o alvo permanece depois de executar as etapas de captura de ensaio. É claro que o reagente de aptâmero único é suficiente para captar o seu analito pretendido sem depleção inicial ou fracionamento do plasma. A quantidade de aptâmero remanescente após estas etapas é então proporcional à quantidade de analito na amostra inicial. Exemplo 6. Análise de Resseções Cirúrgicas de NSCLC
[00421] Para demonstrar a utilidade da tecnologia baseada em plataforma aqui descrita para identificar doença relacionada com a marcadores biológicos a partir de tecidos, foram analisadas amostras de tecidos homogeneizados de resseções cirúrgicas obtidas a partir de oito pacientes com NSCLC, todos os pacientes eram fumantes NSCLC, com idades de 47-75 anos e cobrindo os estágios de NSCLC 1A até 3B (Tabela 17). Todas as amostras de tecido foram obtidas através do congelamento do tecido dentro de 5-10 minutos de excisão cirúrgica e depois colocando os tecidos em OCT médio (10,24% de álcool polivinílico, 4,26% de polietileno-glicol, e 85,5% de ingredientes não reactivos). Três amostras foram obtidas a partir de cada uma das resseções: amostra de tecido tumoral, o tecido saudável adjacente (a 1 cm do tumor) e tecido pulmonar distante não envolvido com câncer. Enquanto mantendo as amostras constantemente congeladas, cinco secções de 10 μm de espessura foram cortadas, aparadas do excesso de OCT em volta do tecido, e colocado em tubos de 1,5 ml congelados de microcentrífuga. Após a adição de 200 μL de tampão de homogeneização (SB18 tampão mais cocktail de PI (cocktail inibidor de protease Pierce HALT, sem magnésio), as amostras foram homogeneizadas em tubos de microcentrífuga com um pilão em gelo rotativo durante 30 segundos, até que não haja fragmentos de tecido visíveis. As amostras foram, então, centrifugadas em uma centrífuga a 21.000 g durante 10 minutos e filtrada através de um filtro de placa de múltiplos poços de 0,2 μm para uma placa com múltiplas cavidades estéreis. Cinco alíquotas μL foram tomadas para ensaio de proteína BCA e o resto da amostra foi armazenada congelada e vededa em 96 placas de poços a -70 °C.
[00422] A amostra de proteína total foi ajustada a 16 μg/mL em tampão SB17T (SB17 tampão contendo 0,05% de Tween 20) para criação de perfis proteômicos. As amostras preparadas desta maneira foram corridas no ensaio multiplexado de aptâmero que, como notado acima, mede mais de 800 proteínas, tal como descrito anteriormente (Ostroff et al., Nature Precedings, http://precedings.nature.com/documents/4537/version/ 1 (2010)). Entre os analitos medidos, a maioria estava inalterada entre o tecido tumoral e o tecido adjacente e distante. No entanto, algumas proteínas foram claramente suprimidas (Figura 24), enquanto outras foram substancialmente elevadas em tecidos de tumor (Figura 23) em comparação com os tecidos adjacentes e distantes.
[00423] As modalidades anteriores e os exemplos destinam-se apenas como exemplos. Nenhuma modalidade particular, exemplo, ou elemento de uma modalidade ou exemplo particular é para ser interpretado como um elemento crítico necessário ou essencial ou funcionalidade de qualquer uma das reivindicações. Além disso, nenhum elemento aqui descrito é necessário para a prática das reivindicações anexas, a menos que expressamente descrito como "essencial" ou "crítico". Várias alterações, modificações, substituições, e outras variações podem ser feitas às modalidades descritas sem se afastar do âmbito do presente pedido, o qual é definido pelas reivindicações em anexo. A especificação, incluindo as figuras e exemplos, deve ser considerada de uma maneira ilustrativa e não restritiva, e todas essas modificações e substituições se destinam a ser incluídas no âmbito do pedido. Por conseguinte, o âmbito do pedido o deve ser determinado pelas reivindicações anexas e seus equivalentes legais, em vez de pelos exemplos dados acima. Por exemplo, as etapas recitadas em qualquer um dos métodos ou processos das reivindicações podem ser executadas em qualquer ordem exequível e não estão limitadas a um pedido apresentado em qualquer uma das modalidades, oo exemplos, ou as reivindicações. Além disso, em qualquer um dos métodos acima mencionados, um ou mais marcadores biológicos da Tabela 18, Tabela 20, Tabela 21, podem ser especificamente excluídos quer como um marcador biológico particular ou como um marcador biológico de qualquer painel. Tabela 1. Biomarcadores de Câncer de Pulmão
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Table 2. Aptamer Concentrations
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Table 3
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Table 4. Biomarkers Identified in Benign Nodule-NSCLC in Aggregated Data
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Table 5. Bioniarkers Identified in Snioker-NSCLC in Aggregated Data
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Table 6. Biomarkers Identified in Benign Nodule-NSCLC by Site
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Table 7. Biomarkers Identified in Snioker-NSCLC by Site
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Table 8. Bioniarkers Identified in Benign Nodule-NSCLC in Blended Data Set
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Tabic 9. Biomarkers Identified in Smoker-NSCLC in Blended Data Set
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Table 10.
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Tabic 11
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Tabic 12. Parameters for Smoker Control Group
Figure img0033
Tabic 13. Parameters for benign nodules control group
Figure img0034
Tabic 14.
Figure img0035
Tabic 15.
Figure img0036
Table 16. Naive Bayes parameters for all markers in Table 21 for both tissue and serum
Figure img0037
Figure img0038
Figure img0039
Table 17. Patient demographics, resection location and tumor types for the eight NSCLC samples
Figure img0040
Table 18. Differentially Expressed Biomarkers Between Tumor and Normal Tissue
Figure img0041
Figure img0042
Figure img0043
Figure img0044
Table 19. Categorization of NSCLC tissue bioniarkers into biological processes
Figure img0045
Table 20. Biomarkers Identified in NSCLC Tissue*
Figure img0046
Table 21. Biomarkers Identified in Serum and Tissue
Figure img0047
Figure img0048
Table 22. XI Panels of two biomarkers including MMP-12
Figure img0049
Figure img0050
Table 23. KM) Panels of three biomarkers including MM P-12
Figure img0051
Figure img0052
Table 24. 100 Panels of four hiomarkers including MMP-12
Figure img0053
Figure img0054
Table 25. 100 Panels of five bioπiarkers including MMP-12
Figure img0055
Figure img0056

Claims (14)

1. Método in vitro para diagnosticar se um indivíduo tem ou não câncer de pulmão de não pequenas células, ou para fornecer informações sobre câncer de pulmão de não pequenas células em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende: detectar pelo menos um biomarcador selecionado dentre as proteínas MMP-12 e C9, MMP-7, ERBB1 e SCF sR em uma amostra de tecido de um indivíduo, e fornecer um valor de biomarcador correspondente a cada proteína biomarcadora, em que os referidos valores de biomarcador fornecem uma indicação quanto à probabilidade de o indivíduo ter ou não ter câncer de pulmão de não pequenas células ou fornecem informações sobre o câncer de pulmão de não pequenas células no referido indivíduo, em que as proteínas de biomarcadores são selecionadas por um algoritmo Greedy e em que a indicação quanto à probabilidade de que o indivíduo tem ou não câncer de pulmão de não pequenas células, ou informações sobre o câncer de pulmão de não pequenas células no referido indivíduo é determinada por um classificador Bayesiano Naive.
2. Método in vitro, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a detecção dos valores de biomarcadores compreende a realização de um ensaio in vitro.
3. Método in vitro, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o referido ensaio in vitro compreende pelo menos um reagente de captura correspondente a cada um dos referidos biomarcadores, e compreende ainda selecionar o referido pelo menos um reagente de captura dentre o grupo que consiste em aptâmeros, anticorpos e um sonda de ácido nucleico.
4. Método in vitro, de acordo com a reivindicação 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o ensaio in vitro é selecionado dentre o grupo que consiste em um imunoensaio, um ensaio baseado em aptâmero, um ensaio histológico ou citológico e um ensaio de nível de expressão de mRNA.
5. Método in vitro, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a amostra de tecido é tecido pulmonar, em que os valores dos biomarcadores são derivados de uma análise histológica ou citológica do tecido pulmonar.
6. Método in vitro, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é fumante.
7. Método in vitro, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem um nódulo pulmonar.
8. Método in vitro para diagnosticar se um indivíduo tem ou não câncer de pulmão de não pequenas células, ou para fornecer informações sobre câncer de pulmão de não pequenas células em um indivíduo, caracterizado pelo fato de que compreende: detectar, em uma amostra de tecido de um indivíduo, a proteína biomarcadora MMP-12 e pelo menos um biomarcador selecionado dentre C9, MMP-7, ERBB1 e SCF sR, fornecer valores de biomarcadores correspondentes à proteína biomarcadora, em que os referidos valores de biomarcadores, o indivíduo exibe a possibilidade de ter ou não câncer de pulmão de não pequenas células, em que as proteínas de biomarcadores são selecionadas por um algoritmo Greedy e em que a indicação quanto à probabilidade de que o indivíduo tem ou não câncer de pulmão de não pequenas células, ou informações sobre o câncer de pulmão de não pequenas células no referido indivíduo é determinada por um classificador Bayesiano Naive.
9. Método in vitro, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a detecção dos valores dos biomarcadores compreende a realização de um ensaio in vitro.
10. Método in vitro, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o referido ensaio in vitro compreende pelo menos um reagente de captura correspondente a cada um dos referidos biomarcadores, e compreende ainda selecionar o referido pelo menos um reagente de captura dentre o grupo que consiste em aptâmeros, anticorpos e um sonda de ácido nucleico.
11. Método in vitro, de acordo com a reivindicação 9 ou 10, caracterizado pelo fato de que o ensaio in vitro é selecionado dentre o grupo que consiste em um imunoensaio, um ensaio baseado em aptâmero, um ensaio histológico ou citológico e um ensaio de nível de expressão de mRNA.
12. Método in vitro, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a amostra de tecido é tecido pulmonar, em que o valor do biomarcador é derivado de uma análise histológica ou citológica do tecido pulmonar.
13. Método in vitro, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 12, caracterizado pelo fato de que o indivíduo é fumante.
14. Método in vitro, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 13, caracterizado pelo fato de que o indivíduo tem um nódulo pulmonar.
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