MX2012014268A - Biomarcadores de cancer de pulmon y usos de los mismos. - Google Patents

Biomarcadores de cancer de pulmon y usos de los mismos.

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Sherini Wilcox
Deborah Ayers
Michael Riel-Mehan
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Abstract

La presente solicitud incluye biomarcadores, métodos, dispositivos, reactivos, sistemas y kits para la detección y diagnóstico de cáncer de pulmón. En un aspecto, la solicitud provee biomarcadores que pueden utilizarse solos o en varias combinaciones para diagnosticar cáncer de pulmón o permitir el diagnóstico diferencial de nódulos pulmonares como benignos o malignos. En otro aspecto, se proporcionan métodos para el diagnóstico de cáncer de pulmón en un individuo, en donde los métodos incluyen detectar, en una muestra biológica de un individuo, por lo menos un valor del biomarcador correspondiente a por lo menos un biomarcador seleccionado del grupo de biomarcadores provistos en Tabla 18, Tabla 20, o Tabla 21, caracterizado porque el individuo se clasifica como teniendo cáncer de pulmón, o se determina la probabilidad de que el individuo tenga cáncer de pulmón, con base en por lo menos un valor del biomarcador.

Description

BIOMARCADORES DE CANCER DE PULMON Y USOS DE LOS MISMOS Campo de la Invención La presente solicitud se refiere en general a la detección de biomarcadores y al diagnóstico de cáncer en un individuo y, más específicamente, a uno o más biomarcadores, métodos, dispositivos, reactivos, sistemas y kits para diagnosticar cáncer, más particularmente cáncer de pulmón en un individuo.
Antecedentes de la Invención La siguiente descripción proporciona un resumen de la información relevante a la presente solicitud y no una admisión de que cualquier información provista o publicación referenciada en la presente es la técnica anterior a la presente solicitud.
El cáncer de pulmón permanece como la causa más común de mortalidad relacionada con cáncer. Esto es verdadero tanto para hombres como mujeres. En 2005 en los Estados Unidos el cáncer de pulmón represente más muertes que el cáncer de pecho, cáncer próstata, y cáncer de colon combinados.' En ese año, 107,416 hombres y 89,271 mujeres fueron diagnosticados con cáncer de pulmón, y 90,139 hombres y 69,078 mujeres murieron de cáncer de pulmón. Entre los hombres en Estados Unidos, el cáncer de pulmón es el segundo cáncer más común entre hombres blancos, negros, de las Islas Ref. 237548 de Asia/Pacífico, Nativos Indios Americanos/Nativos de Alaska, y hombres hispánicos. Entre las mujeres en los Estados Unidos, el cáncer de pulmón es el segundo cáncer más común entre mujeres blancas, negras, Indias Americanas/Nativos de Alaska, y el tercer cáncer más común entre mujeres de las Islas de Asia/Pacífico e hispánicas. Para aquellos que no dejan de fumar, la probabilidad de morir de cáncer de pulmón es 15% y permanece por arriba del 5% aún para aquellos que dejaron dé fumar entre los 50-59 años. El costo del cuidado de la salud anual de cáncer de pulmón en los Estados Unidos solo es de $95 billones.
Noventa y uno porciento del cáncer de pulmón es causado por el fumar, es el cáncer de pulmón de célula no pequeña (NSCLC, por sus siglas en inglés) , que representa aproximadamente el 87% del todos los cánceres de pulmón. El 13% restante de todos los cánceres de pulmón son cánceres de pulmón de célula pequeña, aunque también existen los cánceres de pulmón de célula mixta. Debido a que el cáncer de pulmón de célula pequeña es raro y rápidamente fatal, la oportunidad de una detección temprana es poca.
Existen tres tipos principales de NSCLC: carcinoma de célula escamosa, carcinoma de célula grande y adenocarcinoma . El adenocarcinoma es forma más común de cáncer de pulmón (30%-40% y se reporta tan alto como 50%) , y es el cáncer de pulmón más frecuentemente encontrado entre fumadores y no fumadores. El carcinoma de célula escamosa representa el 25-30% de cánceres de pulmón y generalmente se encuentra en el bronquio próximo. El NSCLC en etapa temprana tiende a localizarse, y si se detecta temprano por lo general puede tratarse a través de cirugía como un resultado favorable y una supervivencia mejorada. Otras opciones de tratamiento incluyen el tratamiento por radiación, terapia con fármacos y una combinación de estos métodos.
NSCLC se organiza en etapas a través del tamaño del tumor y su presencia en otros tejidos incluyendo los nodos linfoides. En la etapa oculta, las células cancerígenas se encuentran en las muestras del esputo o en las muestras de lavado y el tumor no es detectable en los pulmones . En la etapa 0, solamente el revestimiento más íntimo de los pulmones exhibe células cancerígenas y el tumor no ha crecido a través del revestimiento. En la etapa IA, el cáncer se considera invasivo y ha crecido profundo dentro del tejido de los pulmones para tumores menores de 3 cm de un lado a otro. En esta etapa, el tumor no se encuentra en los bronquios o en los nodos linfoides. En la etapa IB, el tumor ya sea es mayor de 3 cm de un lado a otro o a crecido en los bronquios o la pleura, pero no ha crecido en los nodos linfoides. En la etapa IIA, el tumor es mayor de 3 cm de un lado a otro y ha crecido en los nodos linfoides. En la etapa IIB, el tumor ya sea se encuentra en los nodos linfoides y es mayor de 3 cm de un lado a otro o ha crecido en los bronquios de la pleura; o el cáncer no está en los nodos linfoides pero se encuentra en la pared del pecho, diafragma, pleura, bronquios o tejido que rodea el corazón. En la etapa IIIA, las células cancerígenas se encuentran en los nodos linfoides cerca del pulmón y los bronquios y en aquellos entre los pulmones pero no en el costado del pecho en el tumor se localiza. En la etapa Illb, las células cancerígenas se localizan en lado opuesto del pecho desde el tumor y en el cuello. Otros órganos cerca de los pulmones también pueden tener células cancerígenas y múltiples tumores pueden encontrarse en un lóbulo de los pulmones. En la etapa IV, los tumores se encuentran en más de un lóbulo del mismo pulmón o ambos pulmones y las células cancerígenas se encuentran en otras partes del cuerpo.
Los métodos actuales para diagnosticar el cáncer de pulmón incluyen ensayar el esputo de las células cancerígenas, rayos X del pecho, evaluación con fibra óptica de las vías aéreas, y tomografía computada espiral a baja dosis (CT, por sus siglas en inglés) . La citología del esputo tiene una muy baja sensibilidad. Los rayos X del pecho también son relativamente insensibles, requiriendo que las lesiones sean mayores de 1 cm en tamaño para ser visibles. La broncoscopía requiere que el tumor sea visible dentro de las vías aéreas accesible al broncoscopio . El método de diagnóstico más ampliamente reconocido es CT, pero en común con los rayos X, el uso de CT involucra radiación por ionización, que por sí misma puede causar cáncer. CT también tiene limitaciones significativas: las exploraciones requieren un alto nivel de experiencia técnica para interpretarlas y muchas de las anormalidades observadas de hecho no son cáncer de pulmón y se incurre en costos para el cuidado de la salud sustanciales en el seguimiento de los hallazgos CT. El hallazgo incidental más común es un nodulo de pulmón benigno.
Nodulos del pulmón son lesiones relativamente redondas, o áreas de tejido anormal, localizadas dentro del pulmón y pueden variar en tamaño. Los nodulos del pulmón pueden ser benignos o cancerígenos, pero la mayor parte son benignos. Si un nodulo está por debajo de 4 rara, la prevalencia es solamente de 1.5%. Si es. de 4-8 mm, la prevalencia es de aproximadamente 6%, y si está por arriba de 20 mm la incidencia es de aproximadamente 20%. Para nodulos de tamaño pequeño o medio, se aconseja al paciente experimentar una exploración repetida dentro de 2 meses a 1 año. Para muchos nodulos grandes, el paciente recibe una biopsia (que es invasiva y puede conducir a complicaciones) aún cuando la mayoría de estos son benignos.
Por consiguiente, los métodos de diagnóstico que pueden reemplazar o complementar CT son necesarios para reducir el número de procedimientos quirúrgicos conducidos y minimizar el riesgo de complicaciones quirúrgicas. Además, aún cuando están ausentes o son desconocidos los nodulos del pulmón, se necesitan métodos para detectar cáncer de pulmón en sus etapas tempranas para mejorar los resultados del paciente. Solamente 16% de casos de cáncer pulmón se diagnostican como localizados, cáncer en etapa temprana, en donde el grado de supervivencia de 5 años es de 46%, comparado con el 84% de los diagnosticados en una etapa tardía, en donde el grado de supervivencia de 5 años es de solamente 13%. Esto demuestra que basándose en los síntomas para el diagnóstico no es útil porque muchos de estos son comunes a otras enfermedades del pulmón. Estos síntomas incluyen una tos persistente, esputo sanguíneo, dolor de pecho, y bronquitis o neumonía recurrentes.
En donde existen métodos de diagnóstico de cáncer temprano, los beneficios son generalmente aceptados por la comunidad médica. Los cánceres que ampliamente han utilizado protocolos de clasificación tienen los grados de supervivencia de 5 años más altos, tales como cáncer de pecho (88%) y cáncer de colon (65%) , frente al 16% de cáncer de pulmón. Sin embargo, el 87% de los pacientes con cáncer de pulmón sobreviven 10 años o más si se diagnostica el cáncer en etapa 1 a través de la clasificación. Esto demuestra la clara necesidad de métodos de diagnóstico que puedan confiablemente detectar NSCLC en etapa temprana.
El avance del estado saludable a la enfermedad está acompañado por cambios en la expresión de la proteína en los tejidos afectados. La interrogación comparativa de la proteoma humana en te idos saludables y enfermos puede ofrecer perspectivas dentro de la biología de la enfermedad y conducir al descubrimiento de biomarcadores para diagnósticos, nuevos objetivos para intervención terapéutica, e identificación de pacientes que más probablemente se beneficiarán del tratamiento objetivo. La selección del biomarcador para un estado de enfermedad específico involucra primero la identificación de los marcadores que tienen una diferencia mensurable que estadísticamente es significativa en una población de enfermedad comparada con una población de control para una aplicación médica específica. Los biomarcadores pueden incluir moléculas secretadas esparcidas que colocan en paralelo al desarrollo o el avance de la enfermedad y fácilmente se difunden en la corriente sanguínea desde el tejido del pulmón o de los tejidos distales en respuesta a una lesión. El biomarcador o grupo de biomarcadores identificados están generalmente clínicamente validados o demuestran ser un indicador confiable para el uso previsto original para el cual se seleccionó. Los biomarcadores pueden incluir moléculas pequeñas, péptidos, proteínas y ácidos nucleicos. Algunos de los tejidos clave que afectan la identificación de los biomarcadores incluyen la sobre-adaptación de los datos disponibles y la alteración en los datos.
Se han utilizado una variedad de métodos en un intento de identificar biomarcadores y el diagnóstico de la enfermedad. Para marcadores con base en la proteína, estos incluyen los métodos de electroforesis bidimensional , espectrometría de masas e inmunoensayos . Para marcadores de ácido nucleico, estos incluyen perfiles de expresión de ARNm, perfiles de micro-ARN, FISH, análisis serial de la expresión génica (SAGE) , y arreglos de expresión génica a gran escala.
La utilidad de la electroforesis bidimensional está limitada por la baja sensibilidad de detección; los aspectos con la solubilidad de la proteína, la carga, y la hidrofobicidad; reproductibilidad del gel, y la posibilidad de un solo punto que representa múltiples proteínas. Para espectrometría de masas, dependiendo del formato utilizado, las limitaciones giran alrededor del procesamiento y la separación de la muestra, la sensibilidad para proteínas de baja abundancia, las consideraciones de señal a ruido, y la inhabilidad de inmediatamente identificar la proteína detectada. Las limitaciones en los métodos de inmunoensayo para el descubrimiento de los biomarcadores se centran en la inhabilidad de los ensayos múltiples a base de anticuerpos para medir un gran número de analitos. Se podría simplemente imprimir un arreglo de anticuerpos de alta calidad y, sin emparedados, medir los analitos unidos a esos anticuerpos. (Esto sería el equivalente formal de utilizar un genoma completo de secuencias de ácido nucleico para medir a través de hibridación todas las secuencias de ADN o ARN en un organismo o una célula. El experimento de hibridación trabaja porque la hibridación puede ser una prueba estricta para la identidad. Aún los muy buenos anticuerpos no son lo suficiente estrictos para seleccionar sus asociados de unión para trabajar en el contexto de extractos de sangre o aún de células debido a que el ensamble de la proteína en esas matrices tiene abundancia extremadamente diferente) . De esta forma, se debe utilizar un método diferente con métodos a base de inmunoensayos para el descubrimiento del biomarcador, se podría necesitar utilizar ensayos ELISA multiplexados (es decir, emparedados) para obtener la restricción suficiente para medir muchos analitos simultáneamente para decidir cuales analitos son ciertamente biomarcadores . Los inmunoensayos de emparedado no tienen un grado de alto contenido, y de esta forma el descubrimiento del biomarcador utilizando inmunoensayos de emparedado estrictos no es posible utilizando formatos de arreglo estándar. Finalmente, los reactivos del anticuerpo se someten sustancialmente a mucha variabilidad e inestabilidad del reactivo. La plataforma instantánea para el descubrimiento del biomarcador de la proteína supera este problema.
Muchos de estos métodos se basan en o requieren algún tipo de fraccionamiento de la muestra antes del análisis. De esta forma la preparación de la muestra requerida para correr un estudio lo suficientemente poderoso diseñado para identificar/descubrir biomarcadores estadísticamente relevantes en una serie de poblaciones de muestras bien definidas es extremadamente difícil, costoso, y consumidor de tiempo. Durante el fraccionamiento, un amplio intervalo de variabilidad puede introducirse en las varias muestras. Por ejemplo, un marcador potencial podría ser inestable para el proceso, la concentración del marcador podría cambiar, la inapropiada agregación o disgregación podría ocurrir, y una contaminación de la muestra inadvertida podría ocurrir y de esta forma oscurecer los cambios sutiles anticipados en la enfermedad temprana.
Es ampliamente aceptado que el descubrimiento del biomarcador y los métodos de detección utilizando estas tecnologías tienen serias limitaciones para la identificación los biomarcadores de diagnóstico. Estas limitaciones incluyen una inhabilidad para detectar biomarcadores de baja abundancia, una inhabilidad para consistentemente cubrir el intervalo completo de dinámicos de la proteoma, la irreproducibilidad en el procesamiento de la muestra y el fraccionamiento, y la irreproducibilidad general y la falta de robustez del método. Además, estos estudios han introducido alteraciones en los datos y no tratan adecuadamente la complejidad de las poblaciones de muestras, incluyendo controles apropiados, en términos de distribución y distribución aleatoria requerida para identificar y validar los biomarcadores dentro de una población de enfermedad ob etivo .
Aunque se han hecho esfuerzos por varias décadas dirigidos al descubrimiento de nuevos y efectivos biomarcadores, los esfuerzos han sido en su gran parte no exitosos. Los biomarcadores para varias enfermedades típicamente se han identificados en laboratorios académicos, usualmente a través de un descubrimiento accidental mientras se hace la investigación básica en algunos procesos de enfermedad. Con base en el descubrimiento y con pequeñas cantidades de datos clínicos, se publicaron papeles que sugieren la identificación de un nuevo biomarcador. La mayor parte de estos biomarcadores propuestos, sin embargo, no han sido confirmados como biomarcadores reales o útiles principalmente debido al pequeño número de muestras clínicas que proporcionaron solamente una prueba estadística débil de que un biomarcador efectivo de hecho se ha encontrado. Es decir, la identificación inicial no fue rigurosa con respecto a los elementos básicos de las estadísticas. En cada uno de los años 1994 a 2003, una búsqueda de la literatura científica demostró que se publicaron miles de referencias dirigidas a los biomarcadores. Durante el mismo marco del tiempo, sin embargo, la FDA aprobó para uso diagnóstico, cuando mucho, tres nuevos biomarcadores de proteína por año, y en varios años no se han aprobado ningún marcador de proteína nuevo.
Con base en el historial de los esfuerzos de descubrimiento de biomarcadores fallidos, las teorías matemáticas han propuesto que la promoción adicional del entendimiento general de los biomarcadores para las enfermedades son raras y difíciles de encontrar. La investigación de los biomarcadores con base en geles 2D o espectrometría de masa soporta estas nociones . Se han identificados muy pocos biomarcadores útiles a través de estos métodos. Sin embargo, usualmente se han pasado por alto que el gel 2D y la espectrometría de masas miden proteínas que están presentes en la sangre a aproximadamente concentraciones de 1 nM y mayores, y que este ensamble de proteínas puede ser menos probable que cambie con la enfermedad. Otra plataforma de descubrimiento del biomarcador instantánea diferente, la plataforma de descubrimiento del biomarcadores proteómicos que son capaces de precisamente medir los niveles de expresión de proteína a concentraciones muchos más bajas no existen.
Se conoce mucho acerca de las trayectorias bioquímicas para la biología humana de complejo. Muchas trayectorias bioquímicas culminan en, o parten de proteínas secretadas que trabajan localmente dentro de la patrología, por ejemplo factores de crecimiento que se secretan para estimular la replicacion de otras células en las patología, y otros factores se secretan para evitar el sistema inmunitario, etc. Aunque muchos de estas proteínas secretadas trabajan en una forma paracrina, algunas operan distalmente en el cuerpo. Un experto en la técnica con un entendimiento básico de trayectorias bioquímicas entendería que muchas proteínas específicas de la patología deben existir en la sangre a concentraciones por debajo de (aún más por debajo) los límites de detección de los geles 2D y la espectrometría de masa. Lo que debe preceder la identificación de estos números relativamente abundantes de biomarcadores de enfermedad es una plataforma proteómica que pueda analizar proteínas a concentraciones por debajo de las detectables por los geles 2D y espectrometría de masa.
Por consiguiente, existe la necesidad de biomarcadores, métodos, dispositivos, reactivos, sistemas y kits que permitan (a) la diferenciación de nodulos pulmonares benignos de nodulos pulmonares malignos; (b) la detección de biomarcadores de cáncer de pulmón; y (c) el diagnóstico de cáncer de pulmón.
Para cumplir con esta necesidad se necesita una nueva tecnología proteómica a base de aptámeros para el descubrimiento de biomarcadores , que sea capaz de simultáneamente medir miles de proteínas de volúmenes de plasma de muestra pequeños o suero que han sido desarrollados (ver, por ejemplo, Publicación de E. U. A. No. 2010/0070191; Publicación de E. U. A. No. 2010/0086948, Ostroff y otros Nature Precedings, http: //precedings. nature. com/documents/4537/version/l (2010) ; Gold y otros Nature Precedings, http://precedings.nature.eom/documents/4538/version/l 2010)) . Esta tecnología, referida como SOMAscan, está habilitada a través de una generación de aptámeros de baja disociación (SOMAmers) que contienen nucleótidos químicamente modificados, que en su mayor parte expanden la diversidad fisicoquímica de las grandes colecciones de ácidos nucleicos aleatorizadas de las cuales se seleccionan los aptámeros (ver Patente de E. ü. A. No. 7,947,447). Tales modificaciones, que son compatibles con SELEX, introducen grupos funcionales en aptámeros que por lo general se encuentran en la interacción de proteína-proteína, en las interacciones de anticuerpo-antígeno y las interacciones entre fármacos de molécula pequeña con sus objetivos proteicos. En general, el uso de estas modificaciones expande el intervalo de posibles objetivos de aptámeros, mejora sus propiedades de unión y facilita la selección de aptámeros con bajos grados de disociación.
Específicamente, las proteínas en matrices de complejo tales como plasma se miden con un proceso que transforma una identificación de las concentraciones de la proteína en una identificación correspondiente de concentraciones de aptámero de ADN, que después se cuantifican utilizando una plataforma de micro-arreglo de ADN (Gold y otros Nature Precedings, http://precedings.nature.eom/documents/4538/version/l 2010)) . El ensayo hace uso de la unión en equilibrio y el reto cinético. Ambos son llevados a cabo en solución, no en la superficie, para tomar la ventaja de cinéticos más favorables de unión y disociación. En esencia, el ensayo toma la ventaja de la naturaleza doble de los aptámeros como ambas entidades de unión plegadas con formas definidas y secuencias únicas reconocibles a través de sondas de hibridación específicas.
En ensayo es capaz de medir simultáneamente grandes números de proteínas en el intervalo de abundancia baja a alta en el suero. Por ejemplo, las muestras de 1,326 sujetos de cuatro estudios independientes de cáncer de pulmón de célula no pequeña (NSCLC) han sido analizadas en poblaciones expuestas al tabaco a largo plazo. Más de 800 proteínas en 15 µ? de suero se midieron y se desarrolló un panel de 12 proteínas que distingue NSCLC de los controles con 91% de sensibilidad y 84% de especificidad en el grupo de entrenamiento y 89% de sensibilidad y 83% de especificidad en el grupo de verificación independiente, ciega. De manera importante, el rendimiento fue similar para la etapa temprana y tardía de NSCLC (Ostroff y otros Nature Precedings, http : //precedings . nature . com/documents/4537/version/l (2010) ) .
A la fecha, se han conducido varios estudios dé biomarcadores clínicos de enfermedades humanas, incluyendo cáncer de pulmón (Publicación de E . U. A. No. 2010/0070191), cáncer ovárico (Publicación de E. U. A. No. 2010/0086948) , y cáncer de riñon crónico utilizando este método. Estos estudios han identificado nuevos biomarcadores de enfermedad potenciales para cada una de estas enfermedades así como para cáncer en general .
Breve Descripción de la Invención La presente solicitud demuestra la utilidad de la tecnología de plataforma de micro-arreglo recién descubierta para identificar biomarcadores relacionados con la enfermedad de tejido. La aplicación de la presente incluye biomarcadores, métodos, reactivos, dispositivos, sistemas y kits para la detección y el diagnóstico de cáncer y más particularmente, cáncer de pulmón de tejido. Los biomarcadores de la presente solicitud se identificaron utilizando un ensayo a base de aptámero multiplexado que se describe con detalle en el Ejemplo 6. Al utilizar el método de identificación del biomarcador a base de aptámero descrito en la presente, esa solicitud describe un sorprendentemente gran número de biomarcadores de cáncer de pulmón de tej ido que son útiles para la detección y el diagnóstico de cáncer de pulmón. En la identificación de estos biomarcadores sobre 800 proteínas de un número de muestras individuales que se midieron, algunas de las cuales estuvieron a concentraciones en el intervalo fentomolar bajo. Esto es de aproximadamente cuatro órdenes de magnitud inferiores que los experimentos de descubrimiento de biomarcadores hechos con geles 2D y/o espectrometría de masa.
Aunque ciertos de los biomarcadores de cáncer de pulmón descritos son útiles solos para detectar y diagnosticar cáncer de pulmón, se describen en la presente métodos para el agrupamiento de múltiples subgrupos de biomarcadores de cáncer de pulmón que son útiles como un panel de biomarcadores. Una vez que un biomarcador individual o subgrupo de biomarcadores ha sido identificado, la detección o el diagnóstico de cáncer de pulmón en un individuo puede lograrse utilizando cualquier plataforma o formato de ensayo que es capaz de medir las diferencias en los niveles del biomarcador o biomarcadores seleccionados en una muestra biológica.
Sin embargo, esto fue solamente a través del uso del método de identificación del biomarcador con base en aptámero descrito en la presente, en donde aproximadamente 800 valores de biomarcador potenciales separados se clasificaron individualmente de un gran número de individuos que habían sido previamente diagnosticados ya sea como teniendo o no teniendo cáncer de pulmón que fue posible identificar los biomarcadores de cáncer de pulmón descritos en la presente. Este método de descubrimiento está en un severo contraste con el descubrimiento de biomarcadores del medio condicionado o células lisadas ya que busca un sistema más relevante para el paciente que no requiera la traducción para la patología humana. De esta forma, en un aspecto de la presente solicitud, uno o más biomarcadores son provistos para utilizarse ya sea solos o en varias combinaciones para diagnosticar cáncer de pulmón, particularmente cáncer de pulmón de célula no pequeña (NSCLC) o permitir el diagnóstico diferencial de nodulos pulmonares como benignos o malignos. Las modalidades ilustrativas incluyen los biomarcadores provistos en la Tabla 18, que como se observa anteriormente, se identificaron utilizando un ensayo a base de aptámeros multiplexados , como se describe en general en el Ejemplo 1, y más específicamente en el Ejemplo 6. Los marcadores provistos en la Tabla 18 son útiles en la distinción de nodulos benignos de nodulos cancerígenos. Los marcadores provistos en la Tabla 18 también son útiles en la distinción de fumadores asintomáticos de fumadores que tienen cáncer de pulmón. En un aspecto, el biomarcador es MMP-7. En otro aspecto el biomarcador es MMP-12.
Aunque ciertos de los biomarcadores de cáncer de pulmón descritos son útiles solos para detectar y diagnosticar cáncer de pulmón, también se describen métodos en la presente para el agrupamiento de múltiples subgrupos de biomarcadores de cáncer de pulmón los cuales cada uno es útil como un panel de dos o más biomarcadores. De esta forma, varias modalidades de la presente invención proporcionan combinaciones que comprenden N biomarcadores, en donde N es al menos dos biomarcadores. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 2-36 biomarcadores En aún otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 2-7, 2-10, 2-15, 2-20, 2-25, 2-30, 2-36. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 3-7, 3-10, 3-15, 3-20, 3-25, 3-30, 3-36. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 4-7, 4-10, 4-15, 4-20, 4-25, 4-30, 4-36. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 5-7, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 5-36. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 6-10, 6-15, 6-20, 6-25, 6-30, 6-36. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 7-10, 7-15, 7-20, 7-25, 7-30, 7-36. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 8-10, 8-15, 8-20, 8-25, 8-30, 8-36. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 9-15, 9-20, 9-25, 9-30, 9-36. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 10-15, 10-20, 10-25, 10-30, 10-36. Se apreciará que N puede seleccionarse para abarcar intervalos similares, pero de mayor orden.
En otro aspecto, se proporciona un método para el diagnóstico de cáncer de pulmón en un individuo, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo, por lo menos un valor del biomarcador correspondiente a por lo menos un biomarcador seleccionado del grupo de biomarcadores provistos en Tabla 18, en donde el individuo se clasifica como teniendo cáncer de pulmón con base en por lo menos un valor del biomarcador.
En otro aspecto, se proporciona un método para el diagnóstico de cáncer de pulmón en un individuo, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo, los valores del biomarcador el cual cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores seleccionados del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 18, en donde la probabilidad de que el individuo tenga cáncer de pulmón se determina con base en los valores del biomarcador.
En otro aspecto, se proporciona un método para el diagnóstico de cáncer de pulmón en un individuo, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo, los valores del biomarcador el cual cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores seleccionados del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 18, en donde el individuo se clasifica como teniendo cáncer de pulmón con base en los valores del biomarcador, y en donde N = 2-10.
En otro aspecto, se proporciona un método para el diagnóstico de cáncer de pulmón en un individuo, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo, los valores del biomarcador el cual cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores seleccionados del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 18, en donde la probabilidad de que el individuo tenga cáncer de pulmón se determina con base en los valores del biomarcador, y en donde N = 2-10.
En otro aspecto, se proporciona un método para clasificar fumadores para cáncer de pulmón, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo que es un fumador, por lo menos un valor del biomarcador correspondiente a por lo menos un biomarcador seleccionado del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 18, en donde el individuo se clasifica como teniendo cáncer de pulmón, o la probabilidad de que el individuo tenga cáncer de pulmón se determina, con base en por lo menos un valor del biomarcador .
En otro aspecto, se proporciona un método para clasificar fumadores para cáncer de pulmón, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo que es un fumador, los valores del biomarcador el cual cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores seleccionados del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 18, en donde el individuo se clasifica como teniendo cáncer de pulmón, o la probabilidad de que el individuo tenga cáncer de pulmón se determina, con base en tales valores de los biomarcadores, en donde N = 2-10.
En otro aspecto, se proporciona un método para diagnosticar que un individuo no tiene cáncer de pulmón, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo, por lo menos un valor del biomarcador correspondiente a por lo menos un biomarcador seleccionado del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 18, en donde el individuo se clasifica como no teniendo cáncer de pulmón con base en por lo menos un valor del biomarcador.
En otro aspecto, se proporciona un método para diagnosticar que un individuo no tiene cáncer de pulmón, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo, los valores del biomarcador en donde cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores seleccionados del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 18, en donde el individuo se clasifica como no teniendo cáncer de pulmón con base en los valores del biomarcador, y en donde N = 2-10.
En otro aspecto, se proporciona un método para el diagnóstico de cáncer de pulmón, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo, los valores del biomarcador que cada uno corresponde a un biomarcador en un panel de N biomarcadores, en donde los biomarcadores se seleccionan del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 18, en donde una clasificación de los valores del biomarcador indica que el individuo tiene cáncer de pulmón, y en donde N = 3-10.
En otro aspecto, se proporciona un método para el diagnóstico de cáncer de pulmón, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo, los valores del biomarcador que cada uno corresponde a un biomarcador en un panel de N biomarcadores, en donde los biomarcadores se seleccionan del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 18, en donde una clasificación de los valores del biomarcador indica que el individuo tiene cáncer de pulmón, y en donde N = 3-15.
En otro aspecto, se proporciona un método para clasificar fumadores para cáncer de pulmón, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo que es un fumador, los valores del biomarcador que cada uno corresponde a un biomarcador en un panel de N biomarcadores, en donde los biomarcadores se seleccionan del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 18, en donde el individuo se clasifica como teniendo cáncer de pulmón, o la probabilidad de que el individuo tenga cáncer de pulmón se determina, con base en los valores del biomarcador, y en donde N = 3-10.
En otro aspecto, se proporciona un método para clasificar fumadores para cáncer de pulmón, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo que es un fumador, los valores del biomarcador que cada uno corresponde a un biomarcador en un panel de N biomarcadores, en donde los biomarcadores se seleccionan del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 18, en donde el individuo se clasifica como teniendo cáncer de pulmón, o la probabilidad de que el individuo tenga cáncer de pulmón se determina, con base en los valores del biomarcador, en donde N = 3-15.
En otro aspecto, se proporciona un método para diagnosticar la ausencia de cáncer de pulmón, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo, los valores del biomarcador que cada uno corresponde a un biomarcador en un panel de N biomarcadores , en donde los biomarcadores se seleccionan del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 18, en donde una clasificación de los valores del biomarcador indican la ausencia del cáncer de pulmón en el individuo, y en donde N = 3-10.
En otro aspecto, se proporciona un método para diagnosticar la ausencia de cáncer de pulmón, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo, los valores del biomarcador que cada uno corresponde a un biomarcador en un panel de N biomarcadores, en donde los biomarcadores se seleccionan del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 18, en donde una clasificación de los valores del biomarcador indican la ausencia del cáncer de pulmón en el individuo, y en donde N = 3-15.
En otro aspecto, se proporciona un método para el diagnóstico de cáncer de pulmón en un individuo, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo, los valores del biomarcador que corresponden a uno de por lo menos N biomarcadores seleccionados del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 18, en donde el individuo se clasifica como teniendo cáncer de pulmón con base en una puntuación de la clasificación que se desvía de un umbral predeterminado, y en donde N=2-10.
En otro aspecto, se proporciona un método para clasificar fumadores para cáncer de pulmón, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo que es un fumador, los valores del biomarcador que cada uno corresponde a un biomarcador en un panel de N biomarcadores, en donde los biomarcadores se seleccionan del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 18, en donde el individuo se clasifica como teniendo cáncer de pulmón, o la probabilidad de que el individuo tenga cáncer de pulmón se determina, con base en la puntuación de la clasificación que se desvía de un umbral predeterminado, en donde N = 3-10.
En otro aspecto, se proporciona un método para clasificar fumadores para cáncer de pulmón, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo que es un fumador, los valores del biomarcador que cada uno corresponde a un biomarcador en un panel de N biomarcadores , en donde los biomarcadores se seleccionan del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 18, en donde el individuo se clasifica como teniendo cáncer de pulmón, o la probabilidad de que el individuo tenga cáncer de pulmón se determina, con base en la puntuación de la clasificación que se desvía de un umbral predeterminado, en donde N = 3-15.
En otro aspecto, se proporciona un método para diagnosticar la ausencia de cáncer de pulmón en un individuo, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo, los valores del biomarcador que corresponden a uno de por lo menos N biomarcadores seleccionados del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 18, en donde el individuo se clasifica como no teniendo cáncer de pulmón con base en una puntuación de la clasificación que se desvía de un umbral predeterminado, y en donde N=2-10.
En otro aspecto, se proporciona un método implementado por computadora para indicar la probabilidad de cáncer de pulmón. El método comprende: obtener en una computadora la información del biomarcador para un individuo, en donde la información del biomarcador comprende valores de biomarcador que cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores , en donde N es como se definió anteriormente, seleccionada del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 18; llevar a cabo con la computadora una clasificación de cada uno de los valores del biomarcador; e indicar la probabilidad de que el individuo tenga cáncer de pulmón con base en la pluralidad de clasificaciones.
En otro aspecto, se proporciona un método implementado por computadora para clasificar a un individuo ya sea como teniendo o no teniendo cáncer de pulmón. El método comprende: obtener en una computadora la información del biomarcador para un individuo, en donde la información del biomarcador comprende valores de biomarcador que cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores seleccionados del grupo de biomarcadores provistos en Tabla 18; llevar a cabo con la computadora una clasificación de cada uno de los valores del biomarcador; e indicar si el individuo tiene cáncer de pulmón con base en la pluralidad de clasificaciones.
En otro aspecto, se proporciona un producto de programa de computadora para indicar la probabilidad de cáncer de pulmón. El producto de programa de computadora incluye un medio legible por computadora que modaliza el código del programa ejecutable por un procesador de un dispositivo o sistema de computación, el código del programa comprende: el código que obtiene los datos atribuidos a una muestra biológica de un individuo, 0 valores de biomarcador que cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores , en donde N es como se definió anteriormente, en la muestra biológica seleccionada del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 18; y un código que ejecuta un método de clasificación que incluye una probabilidad de que el individuo tiene cáncer de pulmón como una función de los valores del biomarcador.
En otro aspecto, se proporciona un producto de programa de computadora para indicar un estado de cáncer de pulmón en un individuo . El producto de programa de computadora incluye un medio legible por computadora que modaliza el código del programa ejecutable por un procesador de un dispositivo o sistema de computación, el código del programa comprende: el código que obtiene los datos atribuidos a una muestra biológica de un individuo, en donde los datos comprenden valores de biomarcador que cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores en la muestra biológica seleccionada del grupo de biomarcadores provistos en Tabla 18; y un código que ejecuta un método de clasificación que indica el estado del cáncer de pulmón del individuo como una función de los valores del biomarcador.
En otro aspecto, se proporciona un método implementado por computadora para indicar la probabilidad de cáncer de pulmón. El método comprende obtener en una computadora la información del biomarcador para un individuo, en donde la información del biomarcador comprende un valor del biomarcador correspondiente a un biomarcador seleccionado del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 18; llevar a cabo con la computadora una clasificación del valor del biomarcador; e indicar la probabilidad de que el individuo tenga cáncer de pulmón con base en la clasificación.
En otro aspecto, se proporciona un método implementado por computadora para clasificar a un individuo ya sea como teniendo o no teniendo cáncer de pulmón. El método comprende obtener de un biomarcador información para un individuo, en donde la información del biomarcador comprende un valor del biomarcador correspondiente a un biomarcador seleccionado del grupo de biomarcadores provistos en Tabla 18; llevar a cabo con la computadora una clasificación del valor del biomarcador; e indicar si el individuo tiene cáncer de pulmón con base en la clasificación.
En aún otro aspecto, se proporciona un producto de programa de computadora para indicar la probabilidad de cáncer de pulmón. El producto de programa de computadora incluye un medio legible por computadora que modaliza el código del programa ejecutable por un procesador de un dispositivo o sistema de computación, el código del programa comprende: el código que obtiene los datos atribuidos a una muestra biológica de un individuo, en donde los datos comprenden un valor del biomarcador correspondiente a un biomarcador en la muestra biológica seleccionada del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 18; y un código que ejecuta un método de clasificación que incluye una probabilidad de que el individuo tenga cáncer de pulmón como una función del valor del biomarcador.
En aún otro aspecto, se proporciona un producto de programa de computadora para indicar un estado de cáncer de pulmón en un individuo. El producto de programa de computadora incluye un medio legible por computadora que modaliza el código del programa ejecutable por un procesador de un dispositivo o sistema de computación, el código del programa comprende: el código que obtiene los datos atribuidos a una muestra biológica de un individuo, en donde los datos comprenden un valor del biomarcador correspondiente a un biomarcador en la muestra biológica seleccionada del grupo de biomarcadores provistos en Tabla 18; y un código que ejecuta un método de clasificación que indica el estado del cáncer de pulmón del individuo como una función del valor del biomarcador .
En otra modalidad de la presente solicitud, las modalidades ilustrativas incluyen los biomarcadores provistos en la Tabla 20, que como se observó anteriormente, se identificaron utilizando un ensayo a base de aptámeros multiplexados , como se describe en general en el Ejemplo 1 y más específicamente en el Ejemplo 6. Los marcadores provistos en la Tabla 20 con útiles en la distinción de nodulos benignos de nodulos cancerígenos. Los marcadores provistos en la Tabla 20 también son útiles en la distinción de fumadores asintomáticos de fumadores que tienen cáncer de pulmón. Con referencia a la Tabla 20, N se selecciona como siendo cualquier número de 2-25 biomarcadores. Los marcadores provistos en la Tabla 20 han sido determinados como siendo útiles tanto en muestras tisulares como séricas.
En aún otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 2-7, 2-10, 2-15, 2-20, 2-25. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 3-7, 3-10, 3-15, 3-20, 3-25. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 4-7, 4-10, 4-15, 4-20, 4-25. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 5-7, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 6-10, 6-15, 6-20, 6-25. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 7-10, 7-15, 7-20, 7-25. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 8-10, 8-15, 8-20, 8-25. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 9-15, 9-20, 9-25. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 10-15, 10-20, 10-25. Se apreciará que N puede seleccionarse para abarcar intervalos similares, pero de mayor orden.
En otro aspecto, se proporciona un método para el diagnóstico de cáncer de pulmón en un individuo, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo, por lo menos un valor del biomarcador correspondiente a por lo menos un biomarcador seleccionado del grupo de biomarcadores provistos en Tabla 20, en donde el individuo se clasifica como teniendo cáncer de pulmón con base en por lo menos un valor del biomarcador.
En otro aspecto, se proporciona un método para el diagnóstico de cáncer de pulmón en un individuo, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo, los valores del biomarcador el cual cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores seleccionados del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 20, en donde la probabilidad de que el individuo tenga cáncer de pulmón se determina con base en los valores del biomarcador.
En otro aspecto, se proporciona un método para el diagnóstico de cáncer de pulmón en un individuo, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo, los valores del biomarcador el cual cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores seleccionados del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 20, en donde el individuo se clasifica como teniendo cáncer de pulmón con base en los valores del biomarcador, y en donde N = 2-10.
En otro aspecto, se proporciona un método para el diagnóstico de cáncer de pulmón en un individuo, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo, los valores del biomarcador el cual cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores seleccionados del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 20, en donde la probabilidad de que el individuo tenga cáncer de pulmón se determina con base en los valores del biomarcador, y en donde N = 2-10.
En otro aspecto, se proporciona un método para clasificar fumadores para cáncer de pulmón, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo que es un fumador, por lo menos un valor del biomarcador correspondiente a por lo menos un biomarcador seleccionado del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 20, en donde el individuo se clasifica como teniendo cáncer de pulmón, o la probabilidad de que el individuo tenga cáncer de pulmón se determina, con base en por lo menos un valor del biomarcador.
En otro aspecto, se proporciona un método para clasificar fumadores para cáncer de pulmón, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo que es un fumador, los valores del biomarcador el cual cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores seleccionados del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 20, en donde el individuo se clasifica como teniendo cáncer de pulmón, o la probabilidad de que el individuo tenga cáncer de pulmón se determina, con base en tales valores de los biomarcadores, en donde N = 2-10.
En otro aspecto, se proporciona un método para diagnosticar que un individuo no tiene cáncer de pulmón, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo, por lo menos un valor del biomarcador correspondiente a por lo menos un biomarcador seleccionado del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 20, en donde el individuo se clasifica como no teniendo cáncer de pulmón con base en por lo menos un valor del biomarcador.
En otro aspecto, se proporciona un método para diagnosticar que un individuo no tiene cáncer de pulmón, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo, los valores del biomarcador en donde cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores seleccionados del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 20, en donde el individuo se clasifica como no teniendo cáncer de pulmón con base en los valores del biomarcador, y en donde N = 2-10.
En otro aspecto, se proporciona un método para el diagnóstico de cáncer de pulmón, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo, los valores del biomarcador que cada uno corresponde a un biomarcador en un panel de N biomarcadores, en donde los biomarcadores se seleccionan del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 20, en donde una clasificación de los valores del biomarcador indica que el individuo tenga cáncer de pulmón, y en donde N = 3-10.
En otro aspecto, se proporciona un método para el diagnóstico de cáncer de pulmón, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo, los valores del biomarcador que cada uno corresponde a un biomarcador en un panel de N biomarcadores, en donde los biomarcadores se seleccionan del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 20, en donde una clasificación de los valores del biomarcador indica que el individuo tenga cáncer de pulmón, y en donde N = 3-15.
En otro aspecto, se proporciona un método para clasificar fumadores para cáncer de pulmón, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo que es un fumador, los valores del biomarcador que cada uno corresponde a un biomarcador en un panel de N biomarcadores, en donde los biomarcadores se seleccionan del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 20, en donde el individuo se clasifica como teniendo cáncer de pulmón, o la probabilidad de que el individuo tenga cáncer de pulmón se determina, con base en los valores del biomarcador, y en donde N = 3-10.
En otro aspecto, se proporciona un método para clasificar fumadores para cáncer de pulmón, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo que es un fumador, los valores del biomarcador que cada uno corresponde a un biomarcador en un panel de N biomarcadores, en donde los biomarcadores se seleccionan del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 20, en donde el individuo se clasifica como teniendo cáncer de pulmón, o la probabilidad de que el individuo tenga cáncer de pulmón se determina, con base en los valores del biomarcador, en donde N = 3-15.
En otro aspecto, se proporciona un método para diagnosticar la ausencia de cáncer de pulmón, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo, los valores del biomarcador que cada uno corresponde a un biomarcador en un panel de N biomarcadores, en donde los biomarcadores se seleccionan del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 20, en donde una clasificación de los valores del biomarcador indican la ausencia del cáncer de pulmón en el individuo, y en donde N = 3-10.
En otro aspecto, se proporciona un método para diagnosticar la ausencia de cáncer de pulmón, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo, los valores del biomarcador que cada uno corresponde a un biomarcador en un panel de N biomarcadores , en donde los biomarcadores se seleccionan del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 20, en donde una clasificación de los valores del biomarcador indican la ausencia del cáncer de pulmón en el individuo, y en donde N = 3-15.
En otro aspecto, se proporciona un método para el diagnóstico de cáncer de pulmón en un individuo, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo, los valores del biomarcador que corresponden a uno de por lo menos N biomarcadores seleccionados del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 20, en donde el individuo se clasifica como teniendo cáncer de pulmón con base en una puntuación de la clasificación que se desvía de un umbral predeterminado, y en donde N=2-10.
En otro aspecto, se proporciona un método para clasificar fumadores para cáncer de pulmón, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo que es un fumador, los valores del biomarcador que cada uno corresponde a un biomarcador en un panel de N biomarcadores, en donde los biomarcadores se seleccionan del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 20, en donde el individuo se .clasifica como teniendo cáncer de pulmón, o la probabilidad de que el individuo tenga cáncer de pulmón se determina, con base en la puntuación de la clasificación que se desvía de un umbral predeterminado, en donde N = 3-10.
En otro aspecto, se proporciona un método para clasificar fumadores para cáncer de pulmón, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo que es un fumador, los valores del biomarcador que cada uno corresponde a un biomarcador en un panel de N biomarcadores, en donde los biomarcadores se seleccionan del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 20, en donde el individuo se clasifica como teniendo cáncer de pulmón, o la probabilidad de que el individuo tenga cáncer de pulmón se determina, con base en la puntuación de la clasificación que se desvía de un umbral predeterminado, en donde N = 3-15.
En otro aspecto, se proporciona un método para diagnosticar la ausencia de cáncer de pulmón en un individuo, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo, los valores del biomarcador que corresponden a uno de por lo menos N biomarcadores seleccionados del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 20, en donde el individuo se clasifica como no teniendo cáncer de pulmón con base en una puntuación de la clasificación que se desvía de un umbral predeterminado, y en donde N=2-10.
En otro aspecto, se proporciona un método implementado por computadora para indicar la probabilidad de cáncer de pulmón. El método comprende: obtener en una computadora la información del biomarcador para un individuo, en donde la información del biomarcador comprende valores de biomarcador que cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores, en donde N es como se definió anteriormente, seleccionada del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 20; llevar a cabo con la computadora una clasificación de cada uno de los valores del biomarcador; e indicar la probabilidad de que el individuo tenga cáncer de pulmón con base en la pluralidad de clasificaciones.
En otro aspecto, se proporciona un método implementado por computadora para clasificar a un individuo ya sea como teniendo o no teniendo cáncer de pulmón. El método comprende: obtener en una computadora la información del biomarcador para un individuo, en donde la información del biomarcador comprende valores de biomarcador que cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores seleccionados del grupo de biomarcadores provistos en Tabla 20; llevar a cabo con la computadora una clasificación de cada uno de los valores del biomarcador; e indicar si el individuo tiene cáncer de pulmón con base en la pluralidad de clasificaciones.
En otro aspecto, se proporciona un producto de programa de computadora para indicar la probabilidad de cáncer de pulmón. El producto de programa de computadora incluye un medio legible por computadora que modaliza el código del programa ejecutable por un procesador de un dispositivo o sistema de computación, el código del programa comprende: el código que obtiene los datos atribuidos a una muestra biológica de un individuo, en donde los datos comprenden valores de biomarcador que cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores , en donde N es como se definió anteriormente, en la muestra biológica seleccionada del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 20; y un código que ejecuta un método de clasificación que incluye una probabilidad de que el individuo tenga cáncer de pulmón como una función de los valores del biomarcador.
En otro aspecto, se proporciona un producto de programa de computadora para indicar un estado de cáncer de pulmón en un individuo. El producto de programa de computadora incluye un medio legible por computadora que modaliza el código del programa ejecutable por un procesador de un dispositivo o sistema de computación, el código del programa comprende: el código que obtiene los datos atribuidos a una muestra biológica de un individuo, en donde los datos comprenden valores de biomarcador que cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores en la muestra biológica seleccionada del grupo de biomarcadores provistos en Tabla 20; y un código que ejecuta un método de clasificación que indica el estado del cáncer de pulmón del individuo como una función de los valores del biomarcador.
En otro aspecto, se proporciona un método implementado por computadora para indicar la probabilidad de cáncer de pulmón. El método comprende obtener en una computadora la información del biomarcador para un individuo, en donde la información del biomarcador comprende un valor del biomarcador correspondiente a un biomarcador seleccionado del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 20; llevar a cabo con la computadora una clasificación del valor del biomarcador; e indicar la probabilidad de que el individuo tenga cáncer de pulmón con base en la clasificación.
En otro aspecto, se proporciona un método implementado por computadora para clasificar a un individuo ya sea como teniendo o no teniendo cáncer de pulmón. El método comprende obtener de un biomarcador información para un individuo, en donde la información del biomarcador comprende un valor del biomarcador correspondiente a un biomarcador seleccionado del grupo de biomarcadores provistos en Tabla 20; llevar a cabo con la computadora una clasificación del valor del biomarcador; e indicar si el individuo tiene cáncer de pulmón con base en la clasificación .
En aún otro aspecto, se proporciona un producto de programa de computadora para indicar la probabilidad de cáncer de pulmón. El producto de programa de computadora incluye un medio legible por computadora que modaliza el código del programa ejecutable por un procesador de un dispositivo o sistema de computación, el código del programa comprende: el código que obtiene los datos atribuidos a una muestra biológica de un individuo, en donde los datos comprenden un valor del biomarcador correspondiente a un biomarcador en la muestra biológica seleccionada del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 20; y un código que ejecuta un método de clasificación que incluye una probabilidad de que el individuo tenga cáncer de pulmón como una función del valor del biomarcador.
En aún otro aspecto, se proporciona un producto de programa de computadora para indicar un estado de cáncer de pulmón en un individuo. El producto de programa de computadora incluye un medio legible por computadora que modaliza el código del programa ejecutable por un procesador de un dispositivo o sistema de computación, el código del programa comprende: el código que obtiene los datos atribuidos a una muestra- biológica de un individuo, en donde los datos comprenden un valor del biomarcador correspondiente a un biomarcador en la muestra biológica seleccionada del grupo de biomarcadores provistos en Tabla 20; y un código que ejecuta un método de clasificación que indica el estado del cáncer de pulmón del individuo como una función del valor del biomarcador .
En otra modalidad de la presente solicitud, las modalidades ilustrativas incluyen los biomarcadores provistos en la Tabla 21, que se identificaron utilizando un ensayo a base de aptámeros multiplexados , como se describe en general en el Ejemplo 1 y más específicamente en el Ejemplos 2 y 6. Los marcadores provistos en la Tabla 21 con útiles en la distinción de nodulos benignos de nodulos cancerígenos . Los marcadores provistos en la Tabla 21 también son útiles en la distinción de fumadores asintomáticos de fumadores que tienen cáncer de pulmón. Con referencia a la Tabla 21, N se selecciona como siendo cualquier número de 2-86 biomarcadores . Todos los biomarcadores incluidos en la Tabla 21 son útiles en la provisión de información que se busca en ambas muestras, de tejido y suero En aún otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 2-7, 2-10, 2-15, 2-20, 2-25, 2-30, 2-35, 2-40, 2-45, 2-50, 2-55, 2-60, 2-65, 2-70, 2-75, 2-80, O 2-86. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 3-7, 3-10, 3-15, 3-20, 3-25, 3-30, 3-35, 3-40, 3-45, 3-50, 3-55, 3-60, 3-65, 3-70, 3-75, 3-80, O 3-86. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 4-7, 4-10, 4-15, 4-20, 4-25, 4-30, 4-35, 4-40, 4-45, 4-50, 4-55, 4-60, 4-65, 4-70, 4-75, 4-80, o 4-86. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 5-7, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 5-35, 5-40, 5-45, 5-50, 5-55, 5-60, 5-65, 5-70, 5-75, 5-80, O 5-86. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 6-10, 6-15, 6-20, 6-25, 6-30, 6-35, 6-40, 6-45, 6-50, 6-55, 6-60, 6-65, 6-70, 6-75, 6-80, o 6-86. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 7-10, 7-15, 7-20, 7-25, 7-30, 7-35, 7-40, 7-45, 7-50, 7-55, 7-60, 7-65, 7-70, 7-75, 7-80, o 7-86. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 8-10, 8-15, 8-20, 8-25, 8-30, 8-35, 8-40, 8-45, 8-50, 8-55, 8-60, 8-65, 8-70, 8-75, 8-80, o 8-86. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 9-15, 9-20, 9-25, 9-30, 9-35, 9- 40, 9-45, 9-50, 9-55, 9-60, 9-65, 9-70, 9-75, 9-80, o 9-86.
En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 10-15, 10-20, 10-25, 10-30, 10-35, 10-40, 10-45, 10- 50, 10-55, 10-60, 10-65, 10-70, 10-75, 10-80, o 10-86. Se apreciará que N puede seleccionarse para abarcar intervalos similares, pero de mayor orden.
En otro aspecto, se proporciona un método para el diagnóstico de cáncer de pulmón en un individuo, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo, por lo menos un valor del biomarcador correspondiente a por lo menos un biomarcador seleccionado del grupo de biomarcadores provistos en Tabla 21, en donde el individuo se clasifica como teniendo cáncer de pulmón con base en por lo menos un valor del biomarcador.
En otro aspecto, se proporciona un método para el diagnóstico de cáncer de pulmón en un individuo, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo, los valores del biomarcador el cual cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores seleccionados del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 21, en donde la probabilidad de que el individuo tenga cáncer de pulmón se determina con base en los valores del biomarcador.
En otro aspecto, se proporciona un método para el diagnóstico de cáncer de pulmón en un individuo, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo, los valores del biomarcador el cual cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores seleccionados del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 21, en donde el individuo se clasifica como teniendo cáncer de pulmón con base en los valores del biomarcador, y en donde N = 2-10.
En otro aspecto, se proporciona un método para el diagnóstico de cáncer de pulmón en un individuo, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo, los valores del biomarcador el cual cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores seleccionados del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 21, en donde la probabilidad de que el individuo tenga cáncer de pulmón se determina con base en los valores del biomarcador, y en donde N = 2-10.
En otro aspecto, se proporciona un método para clasificar fumadores para cáncer de pulmón, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo que es un fumador, por lo menos un valor del biomarcador correspondiente a por lo menos un biomarcador seleccionado del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 21, en donde el individuo se clasifica como teniendo cáncer de pulmón, o la probabilidad de que el individuo tenga cáncer de pulmón se determina, con base en por lo menos un valor del biomarcador .
En otro aspecto, se proporciona un método para clasificar fumadores para cáncer de pulmón, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo que es un fumador, los valores del biomarcador el cual cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores seleccionados del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 21, en donde el individuo se clasifica como teniendo cáncer de pulmón, o la probabilidad de que el individuo tenga cáncer de pulmón se determina, con base en tales valores de los biomarcadores, en donde N = 2-10.
En otro aspecto, se proporciona un método para diagnosticar que un individuo no tiene cáncer de pulmón, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo, por lo menos un valor del biomarcador correspondiente a por lo menos un biomarcador seleccionado del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 21, en donde el individuo se clasifica como no teniendo cáncer de pulmón con base en por lo menos un valor del biomarcador.
En otro aspecto, se proporciona un método para diagnosticar que un individuo no tiene cáncer de pulmón, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo, los valores del biomarcador en donde cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores seleccionados del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 21, en donde el individuo se clasifica como no teniendo cáncer de pulmón con base en los valores del biomarcador, y en donde N = 2-10.
En otro aspecto, se proporciona un método para el diagnóstico de cáncer de pulmón, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo, los valores del biomarcador que cada uno corresponde a un biomarcador en un panel de N biomarcadores, en donde los biomarcadores se seleccionan del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 21, en donde una clasificación de los valores del biomarcador indica que el individuo tenga cáncer de pulmón, y en donde N = 3-10.
En otro aspecto, se proporciona un método para el diagnóstico de cáncer de pulmón, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo, los valores del biomarcador que cada uno corresponde a un biomarcador en un panel de N biomarcadores, en donde los biomarcadores se seleccionan del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 21, en donde una clasificación de los valores del biomarcador indica que el individuo tenga cáncer de pulmón, y en donde N = 3-15.
En otro aspecto, se proporciona un método para clasificar fumadores para cáncer de pulmón, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo que es un fumador, los valores del biomarcador que cada uno corresponde a un biomarcador en un panel de N biomarcadores, en donde los biomarcadores se seleccionan del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 21, en donde el individuo se clasifica como teniendo cáncer de pulmón, o la probabilidad de que el individuo tenga cáncer de pulmón se determina, con base en los valores del biomarcador, y en donde N = 3-10.
En otro aspecto, se proporciona un método para clasificar fumadores para cáncer de pulmón, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo que es un fumador, los valores del biomarcador que cada uno corresponde a un biomarcador en un panel de N biomarcadores, en donde los biomarcadores se seleccionan del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 21, en donde el individuo se clasifica como teniendo cáncer de pulmón, o la probabilidad de que el individuo tenga cáncer de pulmón se determina, con base en los valores del biomarcador, en donde N = 3-15.
En otro aspecto, se proporciona un método para diagnosticar la ausencia de cáncer de pulmón, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo, los valores del biomarcador que cada uno corresponde a un biomarcador en un panel de N biomarcadores , en donde los biomarcadores se seleccionan del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 21, en donde una clasificación de los valores del biomarcador indican la ausencia del cáncer de pulmón en el individuo, y en donde N = 3-10.
En otro aspecto, se proporciona un método para diagnosticar la ausencia de cáncer de pulmón, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo, los valores del biomarcador que cada uno corresponde a un biomarcador en un panel de N biomarcadores, en donde los biomarcadores se seleccionan del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 21, en donde una clasificación de los valores del biomarcador indican la ausencia del cáncer de pulmón en el individuo, y en donde N = 3-15.
En otro aspecto, se proporciona un método para el diagnóstico de cáncer de pulmón en un individuo, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo, los valores del biomarcador que corresponden a uno de por lo menos N biomarcadores seleccionados del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 21, en donde el individuo se clasifica como teniendo cáncer de pulmón con base en una puntuación de la clasificación que se desvía de un umbral predeterminado, y en donde N=2-10.
En otro aspecto, se proporciona un método para clasificar fumadores para cáncer de pulmón, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo que es un fumador, los valores del biomarcador que cada uno corresponde a un biomarcador en un panel de N biomarcadores, en donde los biomarcadores se seleccionan del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 21, en donde el individuo se clasifica como teniendo cáncer de pulmón, o la probabilidad de que el individuo tenga cáncer de pulmón se determina, con base en la puntuación de la clasificación que se desvía de un umbral predeterminado, en donde N = 3-10.
En otro aspecto, se proporciona un método para clasificar fumadores para cáncer de pulmón, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo que es un fumador, los valores del biomarcador que cada uno corresponde a un biomarcador en un panel de N biomarcadores, en donde los biomarcadores se seleccionan del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 21, en donde el individuo se clasifica como teniendo cáncer de pulmón, o la probabilidad de que el individuo tenga cáncer de pulmón se determina, con base en la puntuación de la clasificación que se desvía de un umbral predeterminado, en donde N = 3-15.
En otro aspecto, se proporciona un método para diagnosticar la ausencia de cáncer de pulmón en un individuo, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo, los valores del biomarcador que corresponden a uno de por lo menos N biomarcadores seleccionados del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 21, en donde el individuo se clasifica como no teniendo cáncer de pulmón con base en una puntuación de la clasificación que se desvía de un umbral predeterminado, y en donde N=2-10.
En otro aspecto, se proporciona un método implementado por computadora para indicar la probabilidad de cáncer de pulmón. El método comprende: obtener en una computadora la información del biomarcador para un individuo, en donde la información del biomarcador comprende valores de biomarcador que cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores, en donde N es como se definió anteriormente, seleccionada del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 21; llevar a cabo con la computadora una clasificación de cada uno de los valores del biomarcador; e indicar la probabilidad de que el individuo tenga cáncer de pulmón con base en la pluralidad de clasificaciones.
En otro aspecto, se proporciona un método implementado por computadora para clasificar a un individuo ya sea como teniendo o no teniendo cáncer de pulmón. El método comprende: obtener en una computadora la información del biomarcador para un individuo, en donde la información del biomarcador comprende valores de biomarcador que cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores seleccionados del grupo de biomarcadores provistos en Tabla 21; llevar a cabo con la computadora una clasificación de cada uno de los valores del biomarcador; e indicar si el individuo tiene cáncer de pulmón con base en la pluralidad de clasificaciones .
En otro aspecto, se proporciona un producto de programa de computadora para indicar la probabilidad de cáncer de pulmón. El producto de programa de computadora incluye un medio legible por computadora que modaliza el código del programa ejecutable por un procesador de un dispositivo o sistema de computación, el código del programa comprende: el código que obtiene los datos atribuidos a una muestra biológica de un individuo, en donde los datos comprenden valores de biomarcador que cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores, en donde N es como se definió anteriormente, en la muestra biológica seleccionada del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 21; y un código que ejecuta un método de clasificación que incluye una probabilidad de que el individuo tenga cáncer de pulmón como una función de los valores del biomarcador.
En otro aspecto, se proporciona un producto de programa de computadora para indicar un estado de cáncer de pulmón en un individuo. El producto de programa de computadora incluye un medio legible por computadora que modaliza el código del programa ejecutable por un procesador de un dispositivo o sistema de computación, el código del programa comprende: el código que obtiene los datos atribuidos a una muestra biológica de un individuo, en donde los datos comprenden valores de biomárcador que cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores en la muestra biológica seleccionada del grupo de biomarcadores provistos en Tabla 21; y un código que ejecuta un método de clasificación que indica el estado del cáncer de pulmón del individuo como una función de los valores del biomárcador.
En otro aspecto, se proporciona un método implementado por computadora para indicar la probabilidad de cáncer de pulmón. El método comprende obtener en una computadora la información del biomárcador para un individuo, en donde la información del biomárcador comprende un valor del biomárcador correspondiente a un biomárcador seleccionado del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 21; llevar a cabo con la computadora una clasificación del valor del biomárcador; e indicar la probabilidad de que el individuo tenga cáncer de pulmón con base en la clasificación .
En otro aspecto, se proporciona un método implementado por computadora para clasificar a un individuo ya sea como teniendo o no teniendo cáncer de pulmón. El método comprende obtener de un biomárcador información para un individuo, en donde la información del biomarcador comprende un valor del biomarcador correspondiente a un biomarcador seleccionado del grupo de biomarcadores provistos en Tabla 21; llevar a cabo con la computadora una clasificación del valor del biomarcador; e indicar si el individuo tiene cáncer de pulmón con base en la clasificación.
En aún otro aspecto, se proporciona un producto de programa de computadora para indicar la probabilidad de cáncer de pulmón. El producto de programa de computadora incluye un medio legible por computadora que modaliza el código del programa ejecutable por un procesador de un dispositivo o sistema de computación, el código del programa comprende : el código que obtiene los datos atribuidos a una muestra biológica de un individuo, en donde los datos comprenden un valor del biomarcador correspondiente a un biomarcador en la muestra biológica seleccionada del grupo de los biomarcadores determinados en la Tabla 21; y un código que ejecuta un método de clasificación que incluye una probabilidad de que el individuo tenga cáncer de pulmón como una función del valor del biomarcador.
En aún otro aspecto, se proporciona un producto de programa de computadora para indicar un estado de cáncer de pulmón en un individuo. El producto de programa de computadora incluye un medio legible por computadora que modaliza el código del programa ejecutable por un procesador de un dispositivo o sistema de computación, el código del programa comprende: el código que obtiene los datos atribuidos a una muestra biológica de un individuo, en donde los datos comprenden un valor del biomarcador correspondiente a un biomarcador en la muestra biológica seleccionada del grupo de biomarcadores provistos en Tabla 21; y un código que ejecuta un método de clasificación que indica el estado del cáncer de pulmón del individuo como una función del valor del biomarcador.
En un aspecto de la solicitud al menos uno de los N biomarcadores seleccionado de la Tabla 21 en cada uno de los métodos anteriores es un biomarcador seleccionado de la Tabla 20. En aún otra modalidad tal biomarcador seleccionado de la Tabla 20 es MMP-12.
En otro aspecto, se proporciona un método para el diagnóstico de cáncer de pulmón, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo, los valores del biomarcador que cada uno corresponde a un biomarcador en un panel de biomarcadores seleccionados del grupo de paneles determinados en las Tablas 22-25 en donde una clasificación de los valores del biomarcador indica que el individuo tenga cáncer de pulmón.
En otro aspecto, se proporciona un método para diagnosticar la ausencia de cáncer de pulmón, el método incluye detectar, en una muestra biológica de un individuo, los valores del biomarcador que cada uno corresponde a un biomarcador en un panel de biomarcadores seleccionados del grupo de paneles proporcionados en las Tablas 22-25, en donde una clasificación de los valores del biomarcador indican la ausencia del cáncer de pulmón en el individuo.
Breve Descripción de las Figuras La Figura 1A es una gráfica de flujo para un método ilustrativo para detectar cáncer de pulmón en una muestra biológica.
La Figura IB es una gráfica de flujo para un método ilustrativo para detectar cáncer de pulmón en una muestra biológica utilizando el método de clasificación de Bayes sin experiencia .
La Figura 2 muestra una curva ROC para un solo biomarcador, SCFsR, utilizando el clasificador de Bayes sin experiencia para una prueba que detecta cáncer de pulmón en fumadores asintomáticos .
La Figura 3 muestra curvas ROC para paneles de biomarcadores de uno a diez biomarcadores utilizando los clasificadores Bayes sin experiencia para la prueba que detecta cáncer de pulmón en fumadores asintomáticos.
La Figura 4 ilustra el aumento en la puntuación de la clasificación (especificidad + sensibilidad) como el número de biomarcadores aumenta de uno a diez utilizando la clasificación de Bayes sin experiencia para un panel de cáncer de pulmón de nódulos benignos .
La Figura 5 muestra las distribuciones de biomarcadores medidos para SCFsR como una función de distribución acumulada (cdf) en RFU transformada con log para el grupo de control con nódulos benignos (línea sólida) y el grupo de enfermedad de cáncer de pulmón (línea punteada) a lo largo de su curva que se adapta a cdf normal (líneas discontinuas) utilizadas para entrenar a los clasificadores Bayes sin experiencia La Figura 6 ilustra un sistema de computadora ilustrativo para utilizarse con varios métodos implementados en computadora descritos en la presente.
La Figura 7 es una gráfica de flujo para un método para indicar la probabilidad de que un individuo tenga cáncer de pulmón de acuerdo con una modalidad.
La Figura 8 es una gráfica de flujo para un método para indicar la probabilidad de que un individuo tenga cáncer de pulmón de acuerdo con una modalidad.
La Figura 9 ilustra un ensayo de aptámero ilustrativo que puede utilizarse para detectar uno o más biomarcadores de cáncer de pulmón en una muestra biológica.
La Figura 10 muestra un histograma de frecuencias en los cuales se utilizaron biomarcadores en la construcción de los clasificadores para distinguir entre NSCLC y nódulos benignos de un grupo de agregados de biomarcadores potenciales.
La Figura 11 muestra un histograma de frecuencias en los cuales se utilizaron biomarcadores en la construcción de los clasificadores para distinguir entre NSCLC y fumadores asintomáticos de un grupo de agregados de biomarcadores potenciales .
La Figura 12 muestra un histograma de frecuencias en los cuales se utilizaron biomarcadores en la construcción de los clasificadores para distinguir entre NSCLC y nodulos benignos de un grupo de biomarcadores potenciales consistentes con el sitio.
La Figura 13 muestra un histograma de frecuencias en los cuales se utilizaron biomarcadores en la construcción de los clasificadores para distinguir entre NSCLC y fumadores asintomáticos de un grupo de biomarcadores potenciales consistentes con el sitio.
La Figura 14 muestra un histograma de frecuencias en los cuales se utilizaron biomarcadores en la construcción de los clasificadores para distinguir entre NSCLC y nodulos benignos de un grupo de biomarcadores potenciales que resultan de una combinación de marcadores agregados y consistentes con el sitio.
La Figura 15 muestra un histograma de frecuencias en los cuales se utilizaron biomarcadores en la construcción de los clasificadores para distinguir entre NSCLC y fumadores asintomáticos de un grupo de biomarcadores potenciales que resultan de una combinación de marcadores agregados y consistentes con el sitio.
La Figura 16 muestra imágenes de un gel que resultan de experimentos desplegables que ilustran la especificidad de los aptameros como reactivos de captura para las proteínas LBP, C9 e IgM. Para cada gel, el carril 1 es el eluato de las perlas de estreptavidina-agarosa, el carril 2 es el aluato final, y el carril es un carril del marcador M (bandas principales a 110, 50, 30, 15, y 3.5 kDa de la parte superior a la inferior) .
La Figura 17A muestra un par de histogramas que resumen todas las posibles puntuaciones de los clasificadores Bayes sin experiencia proteicos individuales (sensibilidad + especificidad) utilizando los biomarcadores determinados en i la Tabla 1, Columna 5 (sólido) y un grupo de marcadores aleatorios (punteado) .
La Figura 17B muestra un par de histogramas que resume todas las posibles puntuaciones del clasificador Bayes sin experiencia de dos proteínas (sensibilidad + especificidad) utilizando los biomarcadores determinados en la Tabla 1, Columna 5 (sólido) y un grupo de marcadores aleatorios (punteado) .
La Figura 17C muestra un par de histogramas que resume todas las posibles puntuaciones del clasificador Bayes sin experiencia de tres (sensibilidad + especificidad) utilizando los biomarcadores determinados en la Tabla 1, Columna 5 (sólido) y un grupo de marcadores aleatorios (punteado) .
La Figura 18A muestra un par de histogramas que resumen todas las posibles puntuaciones de los clasificadores Bayes sin experiencia proteicos individuales (sensibilidad + especificidad) utilizando los biomarcadores determinados en la Tabla 1, Columna 6 (sólido) y un grupo de marcadores aleatorios (punteado) .
La Figura 18B muestra un par de histogramas que resume todas las posibles puntuaciones del clasificador Bayes sin experiencia de dos proteínas (sensibilidad + especificidad) utilizando los biomarcadores determinados en la Tabla 1, Columna 6 (sólido) y un grupo de marcadores aleatorios (punteado) .
La Figura 18C muestra un par de histogramas que resume todas las posibles puntuaciones del clasificador Bayes sin experiencia de tres proteínas (sensibilidad + especificidad) utilizando los biomarcadores determinados en la Tabla 1, Columna 6 (sólido) y un grupo de marcadores aleatorios (punteado) .
La Figura 19A muestra la puntuación de sensibilidad + especificidad para clasificadores Bayes sin experiencia utilizando 2-10 marcadores adicionados del panel completo (?) y las puntuaciones obtenidas reduciendo los mejores marcadores 5 {¦) , 10 (A) y 15 (x) durante la generación del clasificador para el grupo de control con nódulos benignos.
Figura 19B muestra la puntuación de sensibilidad + especificidad para clasificadores Bayes sin experiencia utilizando de 2-10 marcadores seleccionados del panel completo (?) y las puntuaciones obtenidas reduciendo los mejores marcadores 5 (¦) , 10 (A) y 15 (x) durante la generación del clasificador para el grupo de control de fumadores .
La Figura 20A muestra un grupo de curvas ROC modeladas de los datos en las Tablas 38 y 39 para los paneles de uno a cinco marcadores.
La Figura 20B muestra un grupo de curvas ROC calculadas de los datos de entrenamiento para paneles de 1 a 5 marcadores como en la Figura 19A.
Las Figuras 21A-21C muestran los cambios relativos en la expresión de la proteína para 813 proteínas de ocho muestras de resección NSCLC entre el tejido adyacente y distante (Figura 21A) , el tejido de tumor y adyacente (Figura 21B) y el tejido de tumor y distante (Figura 21C) expresados como proporciones medias log2. La línea punteada representa un cambio doble (log2 = 1) .
La Figura 22 muestra un mapa de calor de los niveles de proteína en muestras tisulares de tumor. Las muestras se organizaron en columnas y se separaron en muestra distante, adyacente y de tumor. De entre cada tipo tisular, las muestras se separaron en adenocarcinoma (AC) y carcinoma de célula escamosa (SCC, por sus siglas en inglés) . Los números por arriba de cada columna corresponden a los códigos del paciente. Las proteínas se desplegaron en filas y se ordenaron utilizando el agrupamiento jerárquico.
Las Figura 23A-23T describen las proteínas con niveles en aumento en tejido tumoral comparado con tejido adyacente o distal.
Las Figuras 24A-24P describen las proteínas con niveles en disminución en tejido tumoral comparado con el tejido adyacente o distal de ocho muestras NSCLC utilizadas en este estudio.
Las Figuras 25A-25E muestran la histoquímica SOMAmer en secciones de tejido congeladas para biomarcadores seleccionados detectados en este estudio. (Figura 25A) La trombospondina-2 (roja) tiene la matriz fibrocolágena que rodea el nido del tumor. (Figura 25B) corresponde al espécimen de tumor normal que inhiben con trombospondina-2 SOMAmer (roja) . (Figura 25C) El SOMAmer del receptor de mañosa de macrófago (rojo) tiñe de manera diseminada los macrófagos en un adenocarcinoma de tumor. (Figura 25D) el SOMAmer del receptor de mañosa de macrófago (rojo) tiñe numerosos macrófagos alveolares ' en una sección de parénquima de tumor normal. (Figura 25E) la imagen multicolor resalta la distribución citomorfológica de la tinción de SOMAmer del receptor de mañosa de macrófago: Verde = Citoqueratina (anticuerpo AE1/AE3) , Rojo = CD31 (Anticuerpo EP3095) , y naranja = SOMAmer. Todos los núcleos en esta figura están contrateñidos con DAPI.
Las Figuras 26A-26F muestran los cambios en la expresión de la proteína en tejido NSCLC comparado con suero. Los dos paneles superiores (Fig. 26A y 26D) muestran la proporción log2 (LR) derivada de muestras séricas frente a proporciones log derivadas de tejido adyacente y tejido distante, respectivamente. Los cuatro paneles inferiores (Fig. 26A, 26D, 26C y 26F) caracterizan las porciones amplificadas de las gráficas anteriores, indicadas por el color de la gráfica (verde para expresión disminuida y rojo para expresión aumentada comparada con tejido no tumoral) . Los analitos mostrados en las Figuras 23 y 24 han sido marcados y los analitos mencionados en la publicación de las muestras séricas se muestran con símbolos rojos rellenos de rojo .
Las Figuras 27A-27H describen la identificación histoquímica de trombospondina-2 en las muestras tisulares. La trombospondina-2 se identifica en una sección congelada serial de un solo espécimen de carcinoma de pulmón a través de (Figura 27A) un anticuerpo policlonal de trombospondina-2 policlonal de conejo hecho en casa, (Figura 27B) el suero pre-inmunitario de conejos utilizados para hacer el anticuerpo policlonal hecho en casa. (Figura 27C) un anticuerpo de trombospondina-2 policlonal de conejo comercial (Novus) , (Figura 27D) la trombospondina-2 SOMAmer. La trombospondina-2 SOMAmer después se utilizó para teñir secciones congeladas de tejido de pulmón normal y maligno, con desarrollo de color de avidina-biotina-peroxidasa estándar para demostrar las diferentes distribuciones morfológicas: (Figura 27E) fuerte tinción del estroma fibrótico que rodea los nidos tumorales, con tinción citosólida mínima de células de carcinoma, (Figura 27F) fuerte tinción de la estroma fibrótica que rodea los nidos tumorales en un adenocarcinoma mucinoso, sin tinción significativa de las células de carcinoma, (Figura 27G) tejido de pulmón normal, mostrando una fuerte tinción citosólica del epitelio bronquial y macrófagos alveolares difusos, y (Figura 27H) fuete tinción citosólica de un adenocarcinoma, sin tinción significativa del estroma no fibrótico predominantemente inflamatorio.
Descripción Detallada de la Invención La práctica de la invención descrita en la presente utiliza, a menos que se indique lo contrario, métodos convencionales de química, microbiología, biología molecular, y técnicas de ADN recombinante dentro del nivel de la experiencia técnica. Tales técnicas se explican completamente en la literatura. Ver, por ejemplo, Sambrook, y otros Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Edición Actual) ; DNA Cloning: A Practical Approach, vol. I & II (D. Glover, ed.); Oligonucleotide Synthesis (N. Gait, ed., Edición Actual); Nucleic Acid Hybridization (B. Hames & S. Higgins, eds . , Edición Actual); Transcription and Translation (B. Hames & S. Higgins, eds., Edición Actual; Histology for Pathologists (S.E. Mills, Edición Actual). Todas las publicaciones, documentos de patente publicados, y solicitudes de patente citados en esta especificación indican el nivel de experiencia en la(s) técnica (s) a la cual pertenece la invención. Todas las publicaciones, documentos de patente publicados, y solicitudes de patente citados en la presente se incorporan por referencia al mismo grado como si cada publicación, documento de patente publicado o solicitud de patente individual indicada específica e individualmente como siendo incorporada por referencia.
Ahora se hará referencia en detalle a las modalidades representativas de la invención. Aunque la invención se describirá junto con las modalidades enumeradas, se entiende que la invención no pretende estar limitada a esas modalidades. Por el contrario, la invención pretende cubrir todas las alternativas, modificaciones y equivalentes que pueden incluirse dentro del alcance de la presente invención como se define por las reivindicaciones.
A menos que se defina lo contrario, los términos técnicos y científicos utilizados en la presente tienen el mismo significado comúnmente entendido por un experto en la técnica a la cual pertenece la invención. A pesar de que los métodos, dispositivos y materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente pueden utilizarse en la práctica o en la prueba de la invención, los métodos, métodos, dispositivos y materiales preferidos ahora se describen.
Como se utiliza en esta solicitud, incluyendo las reivindicaciones anexas, las formas singulares "un", "una", y "el, la" incluyen referencias plurales, a menos que el contenido claramente dicte lo contrario, y se utilizan de manera intercambiable con "por lo menos uno" y "uno o más" . De esta forma, la referencia a "un aptámero" incluye mezclas de aptámeros, la referencia a "una sonda" incluye mezclas de sondas, y similar.
Como se utiliza en la presente, el término "aproximadamente" representa una modificación o variación insignificante del valor numérico de tal forma que la función básica del aspecto al cual el valor numérico se requiere está sin cambiar.
Como se utiliza en la presente, los términos "comprende", "que comprende", "incluye", "que incluye", "contiene", "que contiene", y cualquiera de sus variaciones, pretenden cubrir una inclusión no exclusiva, tal como un proceso, método, producto-por-proceso, o composición de material que comprende, incluye o contiene un elemento o una lista de elementos que no incluyen solamente sus elementos sino pueden incluir otros elementos no expresablemente enumerados o inherentes a tal proceso, método, producto-por-proceso o composición de materia.
La presente solicitud incluye biomarcadores, métodos, dispositivos, reactivos, sistemas y kits para la detección y el diagnóstico de cáncer de pulmón.
En un aspecto, se proporciona uno o más biomarcadores para utilizarse ya sea solo o en varias combinaciones para diagnosticar cáncer de pulmón, permitir el diagnostico diferencial de nodulos pulmonares como benignos o malignos, monitorear la recurrencia del cáncer de pulmón, o tratar otras indicaciones clínicas. En otros aspectos tal biomarcador (s) puede utilizarse en la determinación de la información acerca del cáncer de pulmón en un individuo tal como, por ejemplo, pronóstico, clasificación del cáncer, predicción del riesgo de la enfermedad o selección del tratamiento. Como se describe con detalle a continuación, las modalidades ilustrativas incluyen los biomarcadores provistos en las Tablas 18, 20 y 21, que se identifican utilizando ensayo a base de aptámero multiplexado, que se describe en general al Ejemplo 1 y más específicamente en los Ejemplos 2 y 6. Cada uno de los biomarcadores es útil en el ensayo de cualquier tipo de muestra como se define a continuación.
La Tabla 1, Columna 2 determina los hallazgos obtenidos de los análisis de cientos de muestras sanguíneas individuales de casos con cáncer NSCLC, y cientos de muestras sanguíneas individuales equivalentes de fumadores y de individuos diagnosticados con nodulos de pulmón benignos. Los grupos de fumadores y de nodulos benignos se diseñaron para coincidir con las poblaciones con las cuales una prueba de diagnóstico de cáncer puede tener el mayor beneficio. (Estos casos y controles se obtuvieron de múltiples sitios clínicos para imitar el intervalo de afecciones mundiales reales bajo las cuales se puede aplicar la prueba) . Los biomarcadores potenciales se midieron en muestras individuales en lugar de abultamientos de enfermedad y sangre de control; esto permitió un mejor entendimiento de las variaciones individuales y de grupo de los fenotipos asociados con la presencia o ausencia de la enfermedad (en este caso cáncer de pulmón) . Ya que se hicieron aproximadamente 800 mediciones de proteínas en cada muestra, y varios cientos de muestras de cada una de las poblaciones con enfermedades de control se midieron individualmente, la Tabla 1, Columna 2 resultó de un análisis de un grupo de datos no comúnmente grandes. Las mediciones se analizaron utilizando los métodos descritos en la sección, "Clasificación de Biomarcadores y Cálculo de Puntuaciones de Enfermedad" en la presente.
La Tabla 1, Columna 2 enumera los biomarcadores encontrados como siendo útiles en la disfunción de muestras obtenidas de individuos con NSCLC de muestras "control" obtenidas de fumadores e individuos con nodulos de tumor benigno. Utilizando el ensayo de aptámero multiplexado como se describe en la presente, se descubrieron 38 biomarcadores que distinguen la muestras obtenidas de individuos que tuvieron cáncer de pulmón de las obtenidas de individuos en el grupo de control de fumadores (ver Tabla 1, Columna) . Similarmente, utilizando el ensayo de aptámeros multiplexados , se descubrieron 40 biomarcadores que distinguen las muestras obtenidas de individuos con NSCLC de muestras obtenidas de personas que tuvieron nodulos de pulmón benignos (ver Tabla 1, Columna 5) . Juntos, las dos listas de 38 y 40 biomarcadores están comprendidas de 61 biomarcadores únicos, debido a que existe un traslape considerable entre la lista de biomarcadores para distinguir NSCLC de nodulos benignos y la lista para distinguir NSCLC de fumadores que no tienen cáncer de pulmón.
La Tabla 18 determina los hallazgos obtenidos del análisis de ocho muestras tisulares individuales de fumadores diagnosticados con NSCLC como se describe en el Ejemplo 6. Todos los pacientes fueron fumadores en el intervalo de 47 a 75 años de edad y cubriendo las etapas 1A a 3B de NSCLC. Se obtuvieron tres muestras de cada individuo: tejido de tumor, tejido sano adyacente (dentro de 1 cm de tumor) y tejido de pulmón no involucrado distante. Las muestras se seleccionaron para coincidir con las poblaciones con las cuales la prueba de diagnóstico de cáncer de pulmón puede tener el mayor beneficio. Los biomarcadores potenciales se midieron en muestras individuales en lugar de agrupamiento del tejido enfermo y de control; esto permitió un mejor entendimiento de las variaciones individuales y de grupo en los fenotipos asociados con la presencia y la ausencia de la enfermedad (en este caso cáncer de pulmón) . Las mediciones se analizaron utilizando la prueba de Mann-Whitney.
La Tabla 18 enumera los biomarcadores encontrados como siendo útiles en la distinción de muestras obtenidas de individuos con NSCLC de muestras de "control" obtenidas del tejido de pulmón no involucrado adyacente y distal obtenido de los mismos individuos. Utilizando un ensayo de aptámero multiplexado como se describe en la presente, se descubrieron 36 biomarcadores que distinguen las muestras de tejido tumoral de las muestras obtenidas del tej ido de pulmón adyacente y distal en individuos que habían sido diagnosticados con NSCLC. Con referencia a la Tabla 2, columna 2, se puede ver que once de los biomarcadores se traslapan con los identificados en muestras séricas como se describe en el Ejemplo 2. Un marcador adicional que no se midió en el perfilamiento sérico original, MMP-12, que se ha encontrado que es un biomarcador útil tanto en suero como en tejido. La Tabla 21 proporciona una lista del número total de biomarcadores (86) identificados en ambas muestras tisulares de suero y tumor combinadas. La Tabla 20 proporciona una lista de los biomarcadores identificados que fueron únicos para las muestras tisulares de tumor (25) .
Aunque ciertos de los biomarcadores de cáncer de pulmón descritos son útiles solos para detectar y diagnosticar cáncer de pulmón, también se describen métodos en la presente para el agrupamiento de múltiples subgrupos de biomarcadores de cáncer de pulmón, en donde cada agrupamiento o selección de subgrupo es útil como un panel de tres o más biomarcadores, intercambiablemente referidos en la presente como un "panel de biomarcador" y un panel. De esta forma, varias modalidades de la presente invención proporcionan combinaciones que comprenden N biomarcadores, en donde N es por lo menos dos biomarcadores. En otras modalidades, N se selecciona de 2-86 biomarcadores (Tabla 21) ; 2-36 biomarcadores (Tabla 18) o 2-25 biomarcadores (Tabla 20) . En otras modalidades, N se selecciona de 2-86 (Tabla 21) y al menos uno de tales N biomarcadores es MMP-12. En otras modalidades, N se selecciona de 2-25 (Tabla 20) y al menos uno de tales N biomarcadores es MMP-12. Los paneles representativos de 2-5 biomarcadores que incluyen MMP-12 como uno de los marcadores se determinan en las Tablas 22-25.
En aún otras modalidades, los biomarcadores se seleccionan de aquellos enumerados en la Tabla 18 y N se selecciona como siendo cualquier número de 2-7, 2-10, 2-15, 2-20, 2-25, 2-30, 2-36. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 3-7, 3-10, 3-15, 3-20, 3-25, 3-30, 3-36. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 4-7, 4-10, 4-15, 4-20, 4-25, 4-30, 4-36. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 5-7, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 5-36. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 6-10, 6-15, 6-20, 6-25, 6-30, 6-36. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 7-10, 7-15, 7-20, 7-25, 7-30, 7-36. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 8-10, 8-15, 8-20, 8-25, 8-30, 8-36. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 9-15, 9-20, 9-25, 9-30, 9-36. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 10-15, 10-20, 10-25, 10-30, 10-36. Se apreciará que N puede seleccionarse para abarcar intervalos similares, pero de mayor orden .
En aún otras modalidades los biomarcadores se seleccionan de aquellos enumerados en la Tabla 20 y N se selecciona como siendo cualquier número de 2-7, 2-10, 2-15, 2-20, 2-25. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 3-7, 3-10, 3-15, 3-20, 3-25. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 4-7, 4-10, 4-15, 4-20, 4-25. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 5-7, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 6-10, 6-15, 6-20, 6-25. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 7-10, 7-15, 7-20, 7-25. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 8-10, 8-15, 8-20, 8-25. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 9-15, 9-20, 9-25. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 10-15, 10-20, 10-25. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 9-15, 9-20, 9-25. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 10-15, 10-20, 10-25. Se apreciará que N puede seleccionarse para abarcar intervalos similares, pero de mayor orden.
En aún otras modalidades los biomarcadores se seleccionan de aquellos enumerados en la Tabla 21 y N se selecciona como siendo cualquier número de 2-7, 2-10, 2-15, 2-20, 2-25, 2-30, 2-35, 2-40, 2-45, 2-50, 2-55, 2-60, 2-65, 2-70, 2-75, 2-80, o 2-86. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 3-7, 3-10, 3-15, 3-20, 3-25, 3-30, 3-35, 3-40, 3-45, 3-50, 3-55, 3-60, 3-65, 3-70, 3-75, 3-80, o 3-86. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 4-7, 4-10, 4-15, 4-20, 4-25, 4-30, 4-35, 4-40, 4-45, 4-50, 4-55, 4-60, 4-65, 4- 70, 4-75, 4-80, o 4-86. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 5-7, 5-10, 5-15, 5-20, 5-25, 5-30, 5-35, 5-40, 5-45, 5-50, 5-55, 5-60, 5-65, 5- 70, 5-75, 5-80, o 5-86. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 6-10, 6-15, 6-20, 6-25, 6-30, 6-35, 6-40, 6-45, 6-50, 6-55, 6-60, 6-65, 6-70, 6-75, 6-80, o 6-86. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 7-10, 7-15, 7-20, 7-25, 7-30, 7-35, 7-40, 7-45, 7-50, 7-55, 7-60, 7-65, 7-70, 7-75, 7-80, o 7-86. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 8-10, 8-15, 8-20, 8-25, 8-30, 8-35, 8-40, 8-45, 8-50, 8-55, 8-60, 8-65, 8-70, 8-75, 8-80, o 8-86. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 9-15, 9-20, 9-25, 9-30, 9-35, 9-40, 9-45, 9-50, 9-55, 9-60, 9-65, 9-70, 9-75, 9-80, o 9-86. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 10-15, 10-20, 10-25, 10-30, 10-35, 10-40, 10-45, 10-50, 10-55, 10-60, 10-65, 10-70, 10-75, 10-80, o 10-86. Se apreciará que N puede seleccionarse para abarcar intervalos similares, pero de mayor orden.
En una modalidad, el número de biomarcadores útiles para un subgrupo o panel de biomarcador se basa en el valor de sensibilidad y especificidad para la combinación particular de los valores del biomarcador. Los términos "sensibilidad" y "especificidad" se utilizan en la presente con respecto a la habilidad para correctamente clasificar a un individuo, con base en uno o más valores de biomarcador detectados en su muestra biológica, como teniendo cáncer de pulmón o no teniendo cáncer de pulmón. "Sensibilidad" indica el funcionamiento del (de los) biomarcador (s) con respecto a correctamente clasificar individuos que tienen cáncer de pulmón. "Especificidad" indica el funcionamiento de (de los) biomarcador (s) con respecto a correctamente clasificar individuos que no tienen cáncer de pulmón. Por ejemplo, 85% de especificidad y 90% de sensibilidad para un panel de marcadores utilizados para ensayar un grupo de muestras de control y muestras de cáncer de pulmón indica que el 85% de las muestras de control se clasificó correctamente como muestras de control a través del panel, y 90% de las muestras de cáncer de pulmón se clasificó correctamente como muestras con cáncer de pulmón por panel. El valor mínimo deseado o preferido puede determinarse como se describe en el Ejemplo 3.
En un aspecto, el cáncer de pulmón se detecta o se diagnostica en un individuo conduciendo a un ensayo de una muestra biológica del individuo y detectando los valores del biomarcador que cada uno corresponde a por lo menos uno de los biomarcadores MMP-7, MMP-12, o IGFBP-2 y por lo menos N biomarcadores adicionales seleccionados de la lista de los biomarcadores en la Tabla 21, en donde N es igual a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15. En un aspecto más, el cáncer de pulmón se detecta o se diagnostica en un individuo conduciendo un ensayo de una muestra biológica del individuo y detectando los valores de los biomarcadores que cada uno corresponde a los biomarcadores MMP-7, MMP-12, o IGFBP-2 y al menos N biomarcadores adicionales seleccionados de la lista de los biomarcadores en la Tabla 21, en donde N igual a l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ó 13. En un aspecto más, el cáncer de pulmón se detecta o se diagnostica en un individuo conduciendo un ensayo en una muestra biológica del individuo y detectando los valores del biomarcador que cada uno corresponde al biomarcador MMP-7 y uno de al menos N biomarcadores adicionales seleccionados de la lista de los biomarcadores en la Tabla 21, en donde N igual a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15. En un aspecto más, el cáncer de pulmón se detecta o se diagnostica en un individuo conduciendo un ensayo en una muestra biológica del individuo y detectando los valores del biomarcador que cada uno corresponde al biomarcador MMP-12 y uno de al menos N biomarcadores adicionales seleccionados de la lista de los biomarcadores en la Tabla 21, en donde N igual a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15. En un aspecto más, el cáncer de pulmón se detecta o se diagnostica en un individuo conduciendo un ensayo en una muestra biológica del individuo y detectando los valores del biomarcador que cada uno corresponde al biomarcador IGFBP-2 y uno de al menos N biomarcadores adicionales seleccionados de la lista de los biomarcadores en la Tabla 21, en donde N igual a 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15.
Los biomarcadores del cáncer de pulmón identificados en la presente representan un número relativamente grande de elecciones para subgrupos o paneles de biomarcadores que pueden utilizarse para efectivamente detectar o diagnosticar cáncer de pulmón. La selección del número deseado de tales biomarcadores de pende la combinación específica de los biomarcadores seleccionados . Es importante recordar que los paneles de biomarcadores para detectar o diagnosticar cáncer de pulmón también pueden incluir biomarcadores no encontrados en las tablas 18, 20 ó 21, y que la inclusión de los biomarcadores adicionales no encontrados en las Tablas 18, 20 ó 21 pueden reducir el número de biomarcadores en el subgrupo o panel particular que se selecciona de las Tablas 18, 20 ó 21. El número de biomarcadores de las Tablas 18, 20 ó 21 utilizado en un subgrupo o panel puede también reducirse si se utiliza información biomédica adicional junto con los valores del biomarcador para establecer los valores de sensibilidad y especificad aceptables para un ensayo dado.
Otro factor que puede afectar el número de biomarcadores a ser utilizados en un subgrupo o panel de biomarcadores son los procedimiento utilizados para obtener muestras biológicas de individuos que han sido diagnosticados con cáncer de pulmón. En un entorno de obtención de muestras cuidadosamente controlado, el número de biomarcadores necesarios para cumplir con los valores de sensibilidad y especificidad deseados será menor que una situación en donde puede haber más variación en la recolección, manejo y almacenamiento de mues ras. En el desarrollo de la lista de biomarcadores determinados en las Tablas 18, 20 ó 21, se utilizaron múltiples sitios de recolección de muestras para recolectar los datos para el entrenamiento del clarificador. Esto proporciona biomarcadores más robustos que son menos sensibles a las variaciones en la recolección, manejo y almacenamiento de muestras, pero también requiere que el número de biomarcadores en un subgrupo o panel se mayor si los datos de entrenamiento todos se obtuvieron bajo condiciones similares.
Un aspecto de la presente invención puede describirse en general con referencia a la Figuras 1A y IB. Una muestra biológica se obtiene de un individuo o individuos de interés. La muestra biológica después se ensaya para detectar la presencia de uno o más (N) biomarcadores de interés y para determinar un valor del biomarcador para cada uno de tales N biomarcadores (referido en la Figura IB como marcador RFU) . Una vez que se ha se detectado un biomarcador y se ha asignado un valor de biomarcador a cada marcador se filtra o clasifica como se describe con detalle en la presente. Las puntuaciones de los marcadores de estos se combinan para proporcionar una puntuación de diagnóstico total, que indica la probabilidad de que el individuo del cual se obtuvo la muestra tiene cáncer de pulmón.
Como se utiliza en la presente, "pulmón" puede referirse de manera intercambiable con "pulmonar" .
Como se utiliza en la presente, "fumador" se refiere a un individuo que tiene un historial de inhalación de humo de trabaj o .
"Muestra biológica" , "muestra" , y "muestra de prueba" se utilizan de manera intercambiable en la presente para referirse a cualquier material, fluido biológico, tejido o célula obtenida o por el contrario derivada de un individuo. Estos incluyen sangre (incluyendo sangre entera, leucocitos, células mononucleares de sangre periférica, células mononucleares de cultivo, plasma y suero) , esputo, lágrimas, moco, lavados nasales, aspirados nasales, aliento, orina, semen, saliva, fluido de las meninges, fluido amniótico, fluido glandular, fluido linfoide, aspirado de pezón, aspirado de bronquio, fluido sinovial, aspirado de floculaciones , células, un extracto celular y fluido cerebroespinal. Estos también incluyen fracciones experimentalmente separadas de todos los anteriores .
Por ejemplo, una muestra sanguínea puede fraccionarse en suero o en fracciones que contienen tipos particulares de células sanguíneas, tales como glóbulos rojos o glóbulos blancos (leucocitos) . Si se desea, una muestra puede ser una combinación de muestras de un individuo, tal como una combinación de una muestra tisular y de fluido. El término "muestra biológica" también incluye materiales que contienen material sólido homogeneizado , tal como de una muestra de heces, una muestra de tejido, o una biopsia tisular, por ejemplo. El término "muestra biológica" también incluye materiales derivados de un cultivo celular o de un cultivo celular o del cultivo de una célula. Cualquier método adecuado para obtener una muestra biológica puede utilizarse; los métodos ilustrativos incluyen, por ejemplo, flebotomía, hisopo (hisopo bucal) y un procedimiento de biopsia de aspirado con una aguja fina). Los tejidos ilustrativos susceptibles a la aspiración con aguja fina incluyen un nuevo linfoide, el pulmón, lavados pulmonares, BAL (lavado broncoalveolar) , tiroides, pecho, e hígado. Las muestras también pueden recolectarse, por ejemplo, a través de la micro-disección (por ejemplo, micro-disección de captura láser (LCM, por sus siglas en inglés) o micro-disección láser (LMD, por sus siglas en inglés)), lavado de la vejiga, frotis (por ejemplo, frotis PAP) , o lavado ductal . Una "muestra biológica" obtenida o derivada de un individuo incluye cualquier muestra que ha sido procesada en cualquier forma adecuada después de ser obtenida del individuo.
Una "muestra tisular" o "tejido" se refiere a un cierto subgrupo de muestras biológicas descritas anteriormente. De acuerdo con esta definición, los tejidos son reconexiones de macromoléculas en un entorno heterogéneo. Como se utiliza en la presente, tejido se refiere a un solo tipo de célula, una colección de tipos de células, un agregado de células, o un agregado de macromoléculas. Los tejidos son generalmente un arreglo físico de macromoléculas que pueden ya sea ser fluidas o rígidas, ambas en términos de estructura y composición. La matriz extracelular es un ejemplo de un tejido más rígido, tanto estructural como composicionalmente , aunque una bicapa de membrana es más fluida en estructura y composición. Tejido incluye, pero no se limita a, un agregado de células usualmente de una clase particular junto con su sustancia intercelular que forma uno de los materiales estructurales comúnmente utilizados para denotar la fábrica celular general de un órgano dado, por ejemplo, el tejido del riñon, el tejido del cerebro, el tejido del pulmón. Las cuatro clases generales de tejidos son tejido epitelial, tejido conectivo, tejido nervioso y tejido muscular. Los métodos para identificar los aptámeros de lenta disociación a objetivos tisulares se describen en la Publicación de la Solicitud Internacional No. O 2011/006075, publicada el 13 de enero del 2011, que se incorpora en la presente por referencia en su totalidad.
Los ejemplos de tejidos que caen dentro de esta definición incluyen, pero no se limitan a, agregados heterogéneos de macromoléculas tales como coágulos de fibrina que son acelulares ; agregados homogéneos o heterogéneos de células; estructuras de un orden más alto que contienen células que tienen una función específica, tales como órganos, tumor, nodos linfoides, arterias, etc.; y células individuales. Los tejidos de células pueden estar en su entorno natural, aislados o en cultivo tisular. El tejido puede estar intacto o modificado. La modificación puede incluir numerosos cambios tales como transformación, transíección, activación, y aislamiento de la subestructura, por ejemplo, membranas de célula, núcleo de la célula, organelos de célula, etc.
Las fuentes del tejido, célula o estructuras sub-celulares pueden obtenerse de procariotas o así como de eucariotas . Estos incluyen estructuras humanas, animales, de plantas bacterianas, fúngicas y virales.
Además, se debe entender que una muestra biológica puede derivarse tomando muestras biológicas de un número de individuos y agrupándolas o mezclándolas en una alícuota de cada muestra biológica del individuo. La muestra agrupada puede tratarse como una muestra de un solo individuo y si la presencia de cáncer se establece en la muestra agrupada, entonces cada muestra biológica individual puede re-ensayarse para determinar que el (los) individuo (s) tiene) (n) cáncer de pulmón .
Para propósitos de esta especificación, la frase "datos atribuidos a una muestra biológica de un individuo" pretende significar que los datos en alguna forma se derivan de, o se generaron utilizando, la muestra biológica del individuo. Los datos pueden reformatearse, revisarse, o alterarse matemáticamente en algún grado después de haber sido generados, tal como a través de conversión de unidades en un sistema de medición a unidades en otro sistema de medición; pero, los datos se entiende que han sido derivados de, o se generaron utilizando, la muestra biológica.
"Objetivo", "molécula objetivo", y "analito" se utilizan de manera intercambiable en la presente para referirse a cualquier molécula de interés que puede estar presente en una muestra biológica. Una "molécula de interés" incluye cualquier variación menor de una molécula particular, tal como, en el caso de una proteína, por ejemplo, variaciones menores en la secuencia de aminoácido, formación del enlace de disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, tal como la conjugación con el componente de marcación, que no altera sustancialmente la identidad de la molécula. Una "molécula objetivo", "objetivo" o "analito" en un grupo de copias de un tipo o especie de la molécula o de la estructura multi-molecular . "Moléculas objetivo", "objetivo" y "analito" se refieren a más de uno de tales grupos de moléculas. Las moléculas objetivo ilustrativas incluyen proteínas, polipéptidos , ácidos nucleicos, carbohidratos, lípidos, polisacáridos, glicoproteínas , hormonas, receptores, antígenos, anticuerpos, aficuerpos, mímicos de anticuerpo, virus, patógenos, sustancias tóxicas, sustratos, metabolitos, análogos de estado de transición, cofactores, inhibidores, fármacos, colorantes, nutrientes, factores de crecimiento, células, tejidos y cualquier fragmento o porción de cualquiera de los anteriores.
Como se utiliza en la presente, "polipéptido" , "péptido" y "proteína" se utilizan de manera intercambiable en la presente para referirse a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados, y puede estar interrumpido a través de no aminoácidos . Los términos también abarcan un polímero de aminoácido que ha sido modificado naturalmente o a través de la interrupción; por ejemplo, la formación de enlaces de disulfuro, glicosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o cualquier manipulación o modificación, tal como la conjugación con un componente de marcación. También se incluyen dentro la definición, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (incluyendo, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.) así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Los polipéptidos pueden ser cadenas individuales o cadenas asociadas. También se incluyen dentro de la definición las preproteínas y proteínas maduras intactas; péptidos o polipéptidos derivados de una proteína madura; fragmentos de una proteína; variantes de empalme; formas recombinantes de una proteína; variantes proteicas con modificaciones, eliminación o sustituciones de aminoácido; digestiones; y modificaciones post-traducción, tales como glicosilación, acetilación, fosforilación, y similares.
Como se utiliza en la presente, "marcador" y "biomarcador" se utilizan de manera intercambiable para referirse a una molécula objetivo que indica o es signo de un proceso normal o anormal en un individuo o de una enfermedad u otra afección en un individuo. Más específicamente, un "marcador" o "biomarcador" es un parámetro anatómico, fisiológico, bioquímico o molecular asociado con la presencia de un estado o proceso fisiológico específico ya sea normal o anormal, y, si es anormal, si es crónico o agudo. Los biomarcadores son detectables y mensurables a través de una variedad de métodos que incluyen ensayos de laboratorio y foto-recepción médicas. Cuando biomarcador es una proteína, también es posible utilizar la expresión del gen correspondiente como una medición de reemplazo de la cantidad o presencia o ausencia del biomarcador proteico correspondiente de una muestra biológica o estado de metilación del gen que codifica el biomarcador o proteínas que controlan la expresión del biomarcador.
Como se utiliza en la presente, "valor del biomarcador", "valor", "nivel del biomarcador" y "nivel" se utilizan de manera intercambiable para referirse a una medición que se hace utilizando cualquier método analítico para detectar el biomarcador en una muestra biológica y que indica la presencia, ausencia, cantidad absoluta o concentración, cantidad relativa o concentración, titulación, un nivel, un nivel de expresión, una proporción de los niveles medidos, o similares, de, para, o correspondiente al biomarcador en la muestra biológica. La naturaleza exacta del "valor" o "nivel" depende el diseño específico y los componentes del método analítico particular utilizado para detectar el biomarcador.
Cuando un biomarcador indica o es un signo de un proceso anormal o una enfermedad u otra afección en un individuo, el marcador generalmente se describe como siendo sobre-expresado, o sub-expresado cuando se compara con el nivel o valor de expresión del biomarcador que indica o en un signo de un proceso normal o la ausencia de una enfermedad u otra afección en un individuo.
"Regulación hacia arriba" , "regulador hacia arriba" "sobre-expresión", "sobre-expresado" y cualquiera de sus variaciones se utilizan de manera intercambiable para referirse a un valor o nivel de un biomarcador en una muestra biológica que es mayor que un valor o nivel (o intervalo de valores o niveles) del biomarcador que típicamente se detectan en muestras biológicas similares de individuos sanos o normales. Los términos también pueden referirse a un valor o nivel de un biomarcador en una muestra biológica que es mayor que un valor o nivel (o intervalo de valores o niveles) del biomarcador que puede detectarse en diferente etapa de la enfermedad particular.
"Regulación hacia abajo", "regulador hacia abajo" "sub-exprésion" , "sub-expresado" y cualquiera de sus variaciones se utilizan de manera intercambiable para referirse a un valor o nivel de un biomarcador en una muestra biológica que es menor que un valor o nivel (o intervalo de valores o niveles) del biomarcador que típicamente se detectan en muestras biológicas similares de individuos sanos o normales. Los términos también pueden referirse a un valor o nivel de un biomarcador en una muestra biológica que es menor que un valor o nivel (o intervalo de valores o niveles) del biqmarcador que puede detectarse en diferente etapa de la enfermedad particular.
Además, un biomarcador que está ya sea sobre-expresado o sub-expresado también puede referirse como siendo "diferencialmente expresado" o que tiene un "nivel diferencial" o "valor diferencial" cuando se compara con un nivel o valor de expresión "normal" del biomarcador que indica o es un signo de un proceso normal o una ausencia de una enfermedad u otra afección en un individuo. De esta forma, "expresión diferencial" de un biomarcador puede también ser referida como una variación de un nivel de expresión "normal" del biomarcador.
El término "expresión génica diferencial" y "expresión diferencial" se utilizan de manera intercambiable para referirse a un gen (o su producto de expresión proteico correspondiente) cuya expresión se activa a un nivel superior o inferior en un sujeto que sufre de una enfermedad específica, con relación a su expresión en un sujeto normal o de control. Los términos también incluyen genes (o los productos de expresión proteicos correspondientes) cuya expresión se activa a un nivel superior o inferior en diferentes etapas de la misma célula. También se entiende que un gen diferencialmente expresado puede ser ya sea activado o inhibido al nivel del ácido nucleico o al nivel de la proteína, o puede someterse a separación alternativa para dar como resultado un producto de polipéptido diferente. Tales diferencias pueden demostrarse a través de una variedad de cambios que incluyen los niveles ARNm, expresión de superficie, secreción u otro fraccionamiento de un polipéptido. La expresión génica diferencial puede incluir una comparación de expresión entre dos o más genes o sus productos génicos; o una comparación de proporciones de la expresión entre dos o más genes o sus productos génicos; o aún una comparación de dos productos diferencialmente procesados del mismo gen, que difieren entre sujetos normales y sujetos que sufren de una enfermedad; o entre varias etapas de la misma enfermedad. La expresión diferencial incluye tanto cuantitativa como cualitativa, diferencias en el patrón de expresión temporal o celular en un gen y sus productos de expresión entre éstos, por ejemplo, células normales y enfermas, o entre células que han experimentado diferentes eventos de enfermedad o etapas de enfermedad.
Como se utiliza en la presente, "individuo" se refiere a un sujeto o paciente de prueba. El individuo puede ser un mamífero o no mamífero. En varias modalidades, el individuo es un mamífero. Un individuo mamífero puede ser un humano o no humano. En varias modalidades, el individuo es un humano. Un individuo sano o normal es un individuo en el cual la enfermedad o afección de interés (incluyendo, por ejemplo, enfermedades del pulmón, enfermedades asociadas con el pulmón u otras afecciones del tumor) no es detectable a través de los métodos de diagnóstico convencionales .
"Diagnóstico", "diagnosticar", "diagnóstico", y sus variaciones se refieren a la detección, determinación o reconocimiento de un estado sano o afección de un individuo sobre las bases de uno o más signos, síntomas, datos u otra información que pertenece al individuo. El estado de salud de un individuo puede diagnosticarse como saludable/normal (es decir, un diagnóstico de la ausencia de una enfermedad o afección) o diagnosticado como enfermo/anormal (es decir, un diagnóstico de la presencia, o la evaluación de las características, de una enfermedad o afección) . Los términos "diagnóstico", "diagnosticar", "diagnóstico", etc., abarca, con respecto a una enfermedad o afección particular, la detección inicial de la enfermedad; la caracterización o clasificación de la enfermedad; la detección del avance, remisión o recurrencia de la enfermedad; y la detección de la respuesta a la enfermedad después de la administración de un tratamiento o terapia al individuo. El diagnóstico de cáncer de pulmón incluye distinguir individuos, incluyendo fumadores y no fumadores, que tienen cáncer de individuos que no lo tienen. Además incluye distinguir nodulos tumorales benignos de nodulos tumorales cancerígenos .
"Pronósticos", "pronosticar", "pronóstico", y sus variaciones se refieren al pronóstico de un curso futuro de una enfermedad o afección en un individuo que tiene la enfermedad o afección (por ejemplo, pronosticar la supervivencia del paciente) y tales términos abarcan la evaluación de la respuesta de la enfermedad después de la administración de un tratamiento o terapia al individuo.
"Evaluar" , "que evalúa" , "evaluación" , y sus variaciones abarcan ambos "diagnóstico" y "pronóstico" , y también abarca determinaciones o predicciones acerca del curso futuro de una enfermedad o afección en un individuo que no tiene la enfermedad así como determinaciones y predicción con respecto a la probabilidad de que una enfermedad o afección recurrirá en un individuo que aparentemente ha sido curado de la enfermedad. El término "evaluar" también abarca la evaluación de la respuesta de un individuo a la terapia, tal como, por ejemplo, pronosticar si un individuo probablemente responderá favorablemente al agente terapéutico o es muy probable que no responda al agente terapéutico (o experimentará defectos secundarios tóxicos o indeseables, por ejemplo) , seleccionar un agente terapéutico para administración a un individuo, o monitorear o determinar una respuesta del individuo a la terapia que ha sido administrada al individuo. De esta forma, "que evalúa" cáncer de pulmón puede incluir, por ejemplo, cualquiera de lo siguiente: el pronóstico del curso futuro del cáncer del pulmón en un individuo; pronosticar la recurrencia del cáncer del pulmón en un individuo que aparentemente ha sido curado de cáncer de pulmón; o determinar o pronosticar una respuesta del individuo al tratamiento de cáncer de pulmón o seleccionar un tratamiento de cáncer de pulmón para administrar al individuo con base en la determinación de los valores del biomarcador derivados de la muestra biológica del individuo.
Cualquiera de los siguientes ejemplos puede ser referido como ya sea "que diagnostica o "que evalúa" el cáncer de pulmón: inicialmente la detección de la presencia o ausencia del cáncer de pulmón; determinar una etapa, tipo o sub-tipo específico, u otra clasificación o característica del cáncer de pulmón; determinar si un nodulo pulmonar es una lesión benigna o un tumor de pulmón maligno; o detectar/monitorear el avance del cáncer de pulmón (por ejemplo, monitorear el crecimiento del tumor del pulmón o la diseminación metastática) , la remisión o recurrencia.
Como se utiliza en la presente, "información biomédica adicional" se refiere a una o más evaluaciones de un individuo, diferentes de las que se utilizan en cualquiera de los biomarcadores descritos en la presente, que está asociada con el riesgo de cáncer de pulmón. "Información biomédica adicional" incluye cualquiera de lo siguiente: descriptores físicos de un individuo, descriptores físicos de un nodulo pulmonar observado por un foto-recepción CT, la altura y/o el peso de un individuo, el género de un individuo, la etnicidad de un individuo, el historial de fumar, el historial ocupacional, la exposición a carcinógenos conocidos (por ejemplo, exposición a cualquiera de asbestos, gas radón, químicos, el humo de fuegos, y la contaminación del aire, que pueden incluir emisiones de fuentes estacionarios o móviles tales como emisiones industriales/de fábricas o de autos/marinos/aeronaves) , la exposición a humo de segunda mano, el historial familiar de cáncer de pulmón (otro cáncer) , la presencia de nodulos tumorales, el tamaño de los nodulos, la ubicación de los nodulos, la morfología de los nodulos (por ejemplo, como se observa a través de la foto-recepción CT, la opacidad de vidrio molino (GGO, por sus siglas en inglés) , sólido, no sólido) , características de borde del nodulo (por ejemplo, suave, lobulado, filoso y uniforme, con espículas, de infiltración), y similares. El historial de fumar usualmente se cuantifica en términos de "paquete-años", que se refiere al número de años que una persona ha fumado multiplicado por el número promedio de paquetes fumados por día. Por ejemplo, una persona que ha fumado, en promedio, un paquete de cigarrillos por día durante 35 años es referido como teniendo 35 paquetes-años de historial de fumar. La información biomédica adicional puede obtenerse de un individuo utilizando técnicas de rutina conocidas en la técnica, tales como de los individuos mismos a través del uso de un cuestionario de rutina al paciente o cuestionario del historial de salud, etc., o de un practicante médico, etc. Alternativamente, la información biomédica adicional puede obtenerse de técnicas de foto-recepción de rutinas, incluyendo foto-recepción CT (por ejemplo, foto-recepción CT de baja dosis), y rayos X. La prueba de los niveles de biomarcadores en combinación con una evaluación de cualquiera de la información biomédica adicional puede, por ejemplo, mejorar la sensibilidad, la especificidad y/o AUC para detectar cáncer de pulmón (u otros usos relacionados con el cáncer de pulmón) cuando se compara con la prueba del biomarcador solo o la evaluación de cualquier punto particular de información biomédica adicional sola (por ejemplo, foto-recepción CT sola) .
El término "área bajo la curva" o "AUC, por sus siglas en inglés" se refiere al área por debajo de la curva de una curva característica operativa del receptor (ROC, por sus siglas en inglés) , ambos de los cuales son bien conocidos en la técnica. Las mediciones de AUC son útiles para comparar la precisión de un clasificador a través del completo de datos. Los clasificadores con una AUC mayor tienen una capacidad mayor para clasificar desconocidos correctamente entre dos grupos de interés (por ejemplo, muestras de cáncer de pulmón y muestras normales o de control) . Las cuervas ROC son útiles para graficar el funcionamiento de una característica particular (por ejemplo, cualquiera de los biomarcadores descritos en la presente y/o cualquier aspecto de formación biomédica adicional) en la distinción entres dos poblaciones (por ejemplo, casos que tienen cáncer de pulmón y controles sin el cáncer de pulmón) . Típicamente, los datos de las características a través de la población completa (por ejemplo, los casos y controles) se clasifican en orden ascendente con base en valor de una sola característica. Después, se calculan para cada valor para esa característica, los valores de verdadero positivo y falso positivo para los datos. El valor de verdadero positivo se determina contando el número de casos por arriba del valor para esa característica y después dividiendo por el número total de casos. El valor de falso positivo se determina contando el número de controles por arriba del valor para esa característica y después dividiendo por el número total de controles. A pesar de que esta definición se refiere a escenarios en don de una característica se eleva en casos comparados con los controles, esta definición también se aplica a escenarios en donde una característica es menor en casos comparados con los controles (en tal escenario, las muestras por debajo del valor para esa característica se contarán) . Las curvas ROC pueden generarse para una sola característica así como para otros resultados individuales, por ejemplo, una combinación de dos o más características pueden matemáticamente combinarse (por ejemplo, agregarse, sustraerse, multiplicarse, etc.) para proveer un solo valor de suma, y este único valor de suma puede graficarse en una curva ROC. Adicionalmente cualquier combinación de múltiples características, en donde la combinación de deriva de un solo valor de resultad, puede graficarse en una curva ROC. Estas combinaciones de características pueden comprender una prueba. La curva ROC es la gráfica del grado verdadero positivo (sensibilidad) de una prueba contra el grado de falso positivo (1-especificidaad) de la prueba.
Como se utiliza en la presente, "detección" o "determinación" con respecto a un valor de un biomarcador incluye el uso de ambos el instrumento requerido para observar y registrar una señal correspondiente a un valor del biomarcador y el (los) material (s) requerido para generar esa señal. En varias modalidades, el valor del biomarcador se detecta utilizando cualquier método de acuerdo, incluyendo fluorescencia, quimioluminiscencia, resonancia de plasmón de superficie, ondas acústicas de superficie, espectrometría de masa, espectroscopia infrarroja, espectroscopia Raman, microscopía de fuerza atómica, microscopía de formación de túneles de exploración, métodos de detección electroquímicos, resonancia magnética nuclear, puntos cuánticos, y similar.
"Soporte sólido" se refiere en la presente a cualquier sustrato que tiene una superficie a la cual se pueden acoplar las moléculas, directa o indirectamente, a través de ya sea enlaces covalente o no covalente. Un "soporte sólido" puede tener una variedad de formatos físicos, que incluir, por ejemplo, una membrana; un chip (por ejemplo un chip de proteína) ; un portaobjetos (por ejemplo, un portaobjetos de vidrio o cubre-objetos) ; una columna, una partícula que contiene un hueco, sólido, semisólido, poro o cavidad, tal como, por ejemplo, una perla; un gel; una fibra, incluyendo un material de fibra óptica; una matriz; y un receptáculo de muestra. Los receptáculos de muestra ilustrativos incluyen paredes de muestra, tubos, capilares, recipientes y cualquier otro frasco, ranura o diente capaz de llevar una muestra. Un receptáculo de muestra puede estar contenido en una plataforma multi-muestras , tal como una placa de microtitulación, portaobjetos, dispositivos de microfluidos , y similares. Un soporte puede estar compuesto de un material natural o sintético, un material orgánico o inorgánico. La composición del soporte sólido en la cual los reactivos de captura se acoplan generalmente depende del método de acoplamiento (por ejemplo, acoplamiento covalente) . Otros receptáculos ilustrativos incluyen microgotículas y emulsiones oleosas/acuosas controladas o en volumen de microfluidos dentro de los cuales pueden ocurrir los ensayos y manipulaciones relacionadas . Los soportes sólidos adecuados incluyen, por ejemplo, plásticos, resinas, polisacáridos , sílice o materiales a base se sílice, vidrio funcionalizado, silicón modificado, carbón, metales, vidrios inorgánicos, membranas nylon, fibras naturales (tal como, por ejemplo, seda, lana y algodón), polímeros, y similares. El material que compone el soporte sólido puede incluir grupos reactivos tales como, por ejemplo, grupos carboxi, amino o hidroxilo, que se utilizan para el acoplamiento de reactivos de captura. Los soporte sólidos poliméricos pueden incluir, por ejemplo, poliestireno, tereftalato de polietilenglicol, acetato de polivinilo, cloruro de polivinilo, polivinilpirrolidona, poliacrilonitrilo, polimetil metacrilato, politetrafluoroetileno , caucho de butilo, caucho de estirenbutadieno, caucho natural, polietileno, polipropileno, (poli) tetrafluoroetileno, (poli) vinilidenfluoruro, policarbonato, y polimetilpenteno . Las partículas del soporte sólido adecuadas que pueden utilizarse incluyen, por ejemplo, partículas codificadas, tales como partículas codificadas de tipo Luminex*, partículas magnéticas y partículas de vidrio.
Usos Ilustrativos de los Biomarcadores En varias modalidades ilustrativas, se proporcionan métodos para diagnosticar cáncer de pulmón en un individuo a través de la detección de uno o más valores de biomarcador que corresponden a uno o más biomarcadores que están presentes en el tejido del pulmón de un individuo a través de cualquier número de métodos analíticos, incluyendo cualquiera de los métodos analíticos descritos en la presente. Estos biomarcadores son, por ejemplo, diferencialmente expresados en individuos con cáncer de pulmón según comparado con individuos sin cáncer de pulmón, particularmente NSCLC. La detección de la expresión diferencial de un biomarcador en un individuo puede utilizarse, por ejemplo, para permitir el diagnóstico temprano de cáncer de pulmón, para distinguir entre un nodulo pulmonar benigno y maligno (tal como por ejemplo, un nodulo observado en una exploración de tomografía computarizada (CT) ) , para monitorear la recurrencia del cáncer pulmón, o para otras indicaciones clínicas, incluyendo determinación del pronóstico y los métodos de tratamiento.
Cualquiera de los biomarcadores descritos en la presente pueden utilizarse en una variedad de indicaciones clínicas para cáncer de pulmón, incluyendo cualquiera de los siguientes: detección de cáncer de pulmón (tal como un individuo o población con un alto riesgo) ; caracterización del cáncer de pulmón (por ejemplo, determinación del tipo, sub-tipo o etapa del cáncer de pulmón) , tal como a través de la distinción entre cáncer de pulmón de célula no pequeña (NSCLC) y cáncer de pulmón de célula pequeña (SCLC) y/o entre adenocarcinoma y carcinoma de célula escamosa (o por el contrario facilitando la histopatología) ; determinación de sí un nodulo de pulmón es un nodulo benigno o un tumor de pulmón maligno; determinar el pronóstico del cáncer pulmón; monitorear el avance o la remisión del cáncer de pulmón; monitorear la recurrencia del cáncer de pulmón; monitorear la metástasis; selección del tratamiento; monitorear la respuesta a un agente terapéutico u otro tratamiento; estratificación de los individuos para clasificación de tomografía computarizada (CT) (por ejemplo, identificar aquellos individuos en mayor riesgo de cáncer de pulmón y por lo tanto que más probablemente se beneficien de la clasificación CT espiral, de esta forma aumentando el valor de pronóstico positivo de CT) ; combinar la prueba del biomarcador con una información biomédica adicional, tal como el historial del fumar, etc., o con el tamaño del nodulo, morfología, etc., (tal como proporcionar un ensayo con un funcionamiento diagnóstico aumentado comparado con la prueba CT o la prueba del biomarcador solo) ; facilitar el diagnóstico de un nodulo pulmonar como maligno o benigno ,-facilitar la decisión clínica hecha una vez que el nodulo pulmonar se observa en CT (por ejemplo, ordenar exploraciones CT repetidas si el nodulo se considera como siendo de bajo riesgo, tal como si una prueba a base de biomarcador es negativa, con o sin categorización del tamaño del nodulo, o considerar biopsia si el nodulo se considera de medio a alto riesgo, tal como si una prueba a base de biomarcador es positiva, con o sin categorización del tamaño del nodulo) ; y facilitar las decisiones con respecto al seguimiento clínico (por ejemplo, si implementar exploraciones CT repetidas, biopsia de agua fina, o toracotomía después de observar un nodulo no clasificado en CT) . La prueba del biomarcador puede mejorar el valor de pronóstico positivo (PPV) sobre clasificación CT sola. Además de sus utilidades junto con la clasificación CT, los biomarcadores descritos en la presente también pueden utilizarse junto con cualquier otra modalidad foto-receptora utilizada para cáncer de pulmón, tal como rayos X de pecho. Además, los biomarcadores descritos también pueden ser útiles en permitir ciertos de estos usos antes de que las indicaciones de cáncer de pulmón se detecten a través de modalidades foto-receptoras u otros correlaciones clínicos, o antes de que aparezcan los síntomas.
Como un ejemplo de la forma en la cual cualquiera de los marcadores descritos en la presente pueden utilizarse para diagnosticar cáncer de pulmón, la expresión diferencial de uno o más de los biomarcadores descritos en un individuo que se sabe que no tiene cáncer de pulmón puede indicar que el individuo tenga cáncer de pulmón, por lo tanto permitiendo la detección de cáncer de pulmón en una etapa temprana de la enfermedad cuando el tratamiento es más efectivo, quizás antes de detectar el cáncer de pulmón a través de otros medios o antes de que aparezcan los síntomas. La sobre-expresión de uno o más de los biomarcadores durante el curso de cáncer de pulmón puede ser indicativa del avance de cáncer de pulmón, por ejemplo, un tumor de pulmón que está creciendo y/o metastatizándose (y de esta forma indica un pobre pronóstico) , mientras una disminución en el grado en el cual uno o más de los biomarcadores se expresa diferencialmente (es decir, en pruebas de biomarcadores posteriores, el nivel de expresión en el individuo se mueve hacia o se acerca a un nivel de expresión "normal") puede ser indicativo de la remisión de cáncer de pulmón, por ejemplo, un tumor de pulmón se está encogiendo (de esta forma indica un buen o mejor pronóstico) . Similarmente, un aumento en el grado en el cual uno o más de los biomarcadores se expresa diferencialmente (es decir, entradas posteriores de biomarcadores, el nivel de expresión en el individuo se mueve más lejos de un nivel de expresión "normal") durante el curso del tratamiento de cáncer pulmón puede indicar que el cáncer de pulmón está avanzando y por consiguiente indica que el tratamiento inefectivo, mientras una disminución en la expresión diferencial de uno o más de los biomarcadores durante el curso del tratamiento de cáncer de pulmón puede ser indicativo de la remisión de cáncer de pulmón y por consiguiente indica que el tratamiento está trabajando exitosamente. Adicionalmente, un aumento o disminución en la expresión diferencial de uno o más de los biomarcadores después de que un individuo ha sido aparentemente curado de cáncer de pulmón puede ser indicativo de la recurrencia de cáncer de pulmón. En una situación como esta, por ejemplo, el individuo puede reiniciarse en terapia (o el régimen terapéutico modificado tal como un aumento en la cantidad de dosificación y/o frecuencia, si el individuo ha mantenido la terapia) en una etapa más temprana que si la recurrencia del cáncer de pulmón no se detecta posteriormente. Además, un nivel de expresión diferencial de uno o más de los biomarcadores en un individuo puede ser predictivo de la respuesta del individuo al agente terapéutico particular. En el monitoreo para la recurrencia o el avance de cáncer de pulmón, los cambios en los niveles de expresión del biomarcador pueden indicar la necesidad de repetir la foto-recepción (por ejemplo, repetir la exploración CT, tal como determinar la actividad de cáncer de pulmón para determinar la necesidad de cambios en el tratamiento.
La detección de cualquiera de los biomarcadores descritos en la presente puede particularmente ser útil después de, o junto con, el tratamiento de cáncer de pulmón, tal como para evaluar el éxito del tratamiento o para monitorear la remisión, recurrencia y/o avance del cáncer de pulmón (incluyendo metástasis) , después del tratamiento. El tratamiento de cáncer de pulmón puede incluir, por ejemplo, la administración de un agente terapéutico al individuo, el funcionamiento de la cirugía (por ejemplo, resección quirúrgica de por lo menos una porción del tumor del pulmón) , la administración de terapia por radiación o cualquier otro tipo de tratamiento para cáncer de pulmón utilizada en la técnica, y cualquier combinación de estos tratamientos. Por ejemplo, cualquiera de los biomarcadores puede detectarse al menos una vez después del tratamiento o puede detectarse múltiples veces después del tratamiento (tal como en intervalos periódicos) o puede detectarse ambos antes y después del tratamiento. Los niveles de expresión diferenciales de cualquiera de los biomarcadores en un individuo con el tiempo pueden ser indicativos del avance, remisión o recurrencia de cáncer de pulmón, los ejemplos de los cuales incluyen cualquiera de los siguientes: un aumento o disminución en el nivel de expresión de los biomarcadores después del tratamiento comparado con el nivel de expresión del biomarcador antes del tratamiento; un aumento o disminución del nivel de expresión del biomarcador en un punto en el tiempo posterior después del tratamiento comparado con el nivel de expresión del biomarcador en un punto en el tiempo más temprano después del tratamiento; y un nivel de expresión diferencial del biomarcador en un punto en el tiempo individual después del tratamiento comparado con niveles normales del biomarcador.
Como un ejemplo especifico, los niveles del biomarcador para cualquiera de los biomarcadores descritos en la presente puede determinarse en la pre-cirugía y la post-cirugía (por ejemplo, 2-4 semanas después de cirugía) en muestras séricas. Un aumento en el (los) nivel (s) de la expresión del biomarcador en la muestra post-cirugía comparada con la muestra pre-cirugía puede indicar avance de cáncer de pulmón (por ejemplo, cirugía no exitosa) , mientras una disminución en el (los) nivel (s) de expresión del biomarcador en la muestra post-cirugía comparado con la muestra pre-cirugía puede indicar la regresión del cáncer de pulmón (por ejemplo, la cirugía exitosamente removió el tumor del pulmón) . Se pueden llevar a cabo análisis similares de los niveles de biomarcadores antes y después de otras formas de tratamiento, tal como antes y después de terapia por radiación o administración de un agente terapéutico o una vacuna contra el cáncer.
Además de probar los niveles de los biomarcadores como una prueba de diagnóstico independiente, los niveles de los biomarcadores también pueden hacerse junto con la determinación del SNP u otras lesiones génicas o la variabilidad que son indicativas de un riesgo aumentado de susceptibilidad de la enfermedad (ver, por ejemplo, Amos y otros, Nature Genetics 40, 616-622 (2009)).
Además de la prueba de los niveles de los biomarcadores como una prueba de diagnóstico independiente, los niveles de los biomarcadores también pueden hacerse junto con exploración CT. Por ejemplo, los biomarcadores pueden facilitar la justificación médica y económica para implementar la exploración CT, tal como para explorar grandes poblaciones asintomáticas en riesgo de cáncer de pulmón (por ejemplo, fumadores) . Por ejemplo, una prueba "pre- CT" de los niveles del biomarcador podría utilizarse para estratificar individuos con alto riesgo para la exploración CT, tal como para identificar aquellos que están en un riesgo mayor de cáncer de pulmón con base en sus niveles de biomarcador y que deberán priorizarse para la exploración CT. Si se implementa una prueba CT, los niveles de biomarcador (por ejemplo, según determinado a través de un ensayo de aptámero de muestras de suero o plasma) de uno o más biomarcadores puede medirse y la puntuación del diagnóstico podría evaluarse junto con información biomédica adicional (por ejemplo, parámetros de tumor determinados por la prueba CT) para mejorar el valor predictivo positivo (PPV, por sus siglas en inglés) sobre CT o la prueba de biomarcador sola. Un panel de aptámero "post-CT" para determinar los niveles de biomarcador pueden utilizarse para determinar la probabilidad de que un nodulo pulmonar observado a través de CT (u otra modalidad foto-receptora) es maligno o benigno.
La detección de cualquiera de los biomarcadores descritos en la presente puede ser útil para la prueba post-CT. Por ejemplo, la prueba del biomarcador puede eliminar o reducir un número significativo de pruebas falsas positivas sobre CT solo. Además, la prueba del biomarcador puede facilitar el tratamiento de pacientes. A manera de ejemplo, si un nodulo de tumor es menor de 5 mm en tamaño, los resultados de la prueba del biomarcador pueden hacer avanzar los paciente de "observar y esperar" de la biopsia en un tiempo más temprano; si un nodulo de pulmón es de 5-9 mm, la prueba de biomarcador puede eliminar el uso de una biopsia o toracotomía en exploraciones falsas positivas; y si un nodulo del pulmón es mayor de 10 mm, la prueba de biomarcador puede eliminar la cirugía para una sub-población de estos pacientes con nodulos benignos. La eliminación de la necesidad de biopsia en algunos pacientes con base en la prueba del biomarcador sería benéfica debido a que existe una morbidez significativa asociada con la biopsia de nodulos y una dificultad en la obtención de tejido de nodulo dependiendo de la ubicación del nodulo. Similarmente , la eliminación de la necesidad de cirugía en algunos pacientes, tales como aquellos con nodulos actualmente benignos, evitaría riesgos innecesarios y costos asociados con la cirugía.
Además de probar los niveles del biomarcador junto con la exploración CT (por ejemplo, evaluación de los niveles de biomarcador junto con el tamaño u otras características del nodulo de pulmón observado en una exploración CT) , la información con respecto a los biomarcadores también evaluarse junto con otros tipos de datos, particularmente datos que indican un riesgo individual para cáncer de pulmón (por ejemplo historial clínico del paciente, síntomas, historial familiar de cáncer, factores de riesgo tales como sí o no el individuo es un fumador, y/o el estado de otros biomarcadores , etc.). Estos varios datos pueden evaluarse a través de métodos automatizados, tales como programas/software de computadora, que pueden modalizarse en una computadora u otro aparato/dispositivo.
Cualquiera de los biomarcadores descritos también puede utilizarse en pruebas foto-receptoras. Por ejemplo, un agente foto-receptor puede acoplarse a cualquiera de los biomarcadores descritos, que puede utilizarse para ayudar en el diagnóstico de cáncer de pulmón, para monitorear el avance/remisión o metástasis de la enfermedad, para monitorear la recurrencia de la enfermedad, o para monitorear la respuesta a terapia, entre otros usos.
Detección y Determinación de Biomarcadores y Valores del Biomarcador Un valor del biomarcador para los biomarcadores descritos en la presente puede detectarse utilizando cualquiera de una variedad de métodos analíticos conocidos. En una modalidad, un valor de biomarcador se detecta utilizando un reactivo de captura. Como se utiliza en la presente, un "agente de captura" o "reactivo de captura" se refiere a una molécula que es capaz de unirse específicamente a un biomarcador. En varias modalidades, el reactivo de captura puede exponerse al biomarcador en solución puede exponerse al biomarcador mientras el reactivo de captura se inmoviliza en un soporte sólido. En otras modalidades, el reactivo de captura contiene una característica que es reactiva con una característica secundaria en un soporte sólido. En estas modalidades, el reactivo de captura puede exponerse al biomarcador en solución, y después la característica en el reactivo de captura puede utilizarse junto con la característica secundaria del soporte sólido para inmovilizar el biomarcador en el soporte sólido. El reactivo de captura se selecciona con base en el tipo de análisis a ser conducido. Los reactivos de captura incluyen, pero no se limitan a, aptámeros, anticuerpos, adnectinas, anquirinas, otros miméticos de anticuerpo y otros andamios de proteína, auto-anticuerpos, quimeras, moléculas pequeñas, un fragmento F(ab')2, un fragmento de anticuerpo de cadena individual, un fragmento Fv, un fragmento Fv de cadena individual, un ácido nucleico, una lectina, un receptor de unión a ligando, anticuerpos, nanocuerpos, polímeros impresos, avímeros, peptidomiméticos , un receptor de hormona, un receptor de citocina, y receptores sintéticos, y modificaciones y fragmentos de estos.
En algunas modalidades, un valor del biomarcador se detecta utilizando un complejo de biomarcador/reactivo de captura.
En otras modalidades, el valor del biomarcador se deriva del complejo de biomarcador/reactivo de captura y se detecta indirectamente, tal como, por ejemplo, como un resultado de la reacción que es posterior a la interacción del biomarcador/reactivo de captura, pero depende de la formación del complejo del biomarcador/reactivo de captura.
En algunas modalidades el valor del biomarcador se detecta directamente del biomarcador en una muestra biológica .
En una modalidad, los biomarcadores se detectan utilizando un formato multiplexado que permite la detección simultánea de dos o más biomarcadores en una muestra biológica. En una modalidad el formato multiplexado, los reactivos de captura se inmovilizan, directa o indirectamente, covalente o no covalentemente, en ubicaciones discretas en un soporte sólido. En otra modalidad, un formato multiplexado utiliza soportes sólidos discretos en donde cada soporte sólido tiene un reactivo de captura único asociado con ese soporte sólido, tal como, por ejemplo, puntos cuánticos. En otra modalidad, un dispositivo individual se utiliza para la detección de cada uno de los múltiples biomarcadores ha ser detectados en una muestra biológica. Los dispositivos individuales pueden configurarse para permitir que cada biomarcador en la muestra biológica se procese simultáneamente. Por ejemplo, una placa de microtitulación puede utilizarse de tal forma que cada cavidad en la placa se utiliza para únicamente analizar uno de múltiples biomarcadores a ser detectados en una muestra biológica.
En una o más de las modalidades anteriores, se puede utilizar una etiqueta fluorescente para marcar un componente del complejo de biomarcador/captura para permitir la detección del valor del biomarcador. En varias modalidades, la etiqueta fluorescente puede conjugarse con un reactivo de captura especifico para cualquiera de los biomarcadores descritos en la presente utilizando técnicas conocidas, y la etiqueta fluorescente puede después utilizarse para detectar el valor biomarcador correspondientes. Las etiquetas fluorescentes adecuadas incluyen quelatos de tierra rara, fluoresceína y sus derivados, rodomina y sus derivados, dansilo, aloficocianina, PBXL-3, Qdot 605, Lisamina, ficoeritrina, Rojo Texas, y otros de tales componentes.
En una modalidad, la etiqueta fluorescente es una molécula de tinte fluorescente. En algunas modalidades, la molécula de tinte fluorescente incluye por lo menos un sistema anular de indolio sustituido en donde el sustituyente en el carbono 3 del anillo indolio contiene un grupo químicamente reactivo o una sustancia conjugada. En algunas modalidades, la molécula de tinte incluye una molécula de AlexFluor, tal como por ejemplo, AlexaFluor 488, AlexaFluor 532, AlexaFluor 647, AlexaFluor 680, o AlexaFluor 700. En otras modalidades, la molécula de tinte incluye un primer tipo y un segundo tipo de la molécula de tinte, tal como, por ejemplo, dos moléculas diferentes de AlexaFluor. En otras modalidades, la molécula del tinte incluye un primer tipo y un segundo tipo de molécula de tinte, y las dos moléculas de tinte tienen diferentes espectros de emisión.
La fluorescencia puede medirse con una variedad de instrumentación compatible con un amplio intervalo de formatos de ensayo. Por ejemplo, los espectrofluorímetros han sido diseñados para analizar placas de microtitulación, portaobjetos de microscopio, arreglos impresos, instrumentos de laboratorio, etc. Ver Principies of Fluorescence Spectroscopy, de J.R. Lakowicz, Springer Science + Business Media, Inc., 2004; Bioluminescence & Chemiluminescence : Progress & Current Applications; editores Philip E. Stanley y Larry J. Kricka, World Scientific Publishing Company, Enero del 2002.
En una o más de las modalidades anteriores, puede opcionalmente utilizarse una etiqueta quimioluminiscente para marcar un componente del complejo de biomarcador/captura para permitir la detección de un valor del biomarcador. Los materiales quimioluminiscentes adecuados incluyen cualquiera de cloruro de oxalilo, Rodamina 6G, Ru (bipi) 32+, TMAE (tetraquis (dimetilamino) etileno) , pirogalol (1,2,3-trihidroxibenceno) , Lucigenina, peroxioxalatos , oxalatos de arilo, ásteres de acridinio, dioxetanos, y otros, En aún otras modalidades, el método de detección incluye una combinación de enzima/sustrato que genera una señal detectable que corresponde al valor del biomarcador. En general, la enzima cataliza una alteración química del sustrato cromogénico que puede medirse utilizando varias técnicas, incluyendo espectrofotometría, fluorescencia y quimioluminiscencia . Las enzimas adecuadas incluyen, por ejemplo, luciferasas, luciferina, malato deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa de rábano picante (HRPO, por sus siglas en inglés) , fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa, y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, uricasa, xantina oxidasa, lactoperoxidasa, microperoxidasa, y similares.
En aún otras modalidades, el método de detección puede ser una combinación de fluorescencia, quimioluminiscencia, radionúclido o combinaciones de enzima/sustrato que generan una señal mensurable. La señalización multimodal tendría que tener características únicas y ventajosas en los formatos de ensayos de biomarcador .
Más específicamente, los valores del biomarcador para los biomarcadores descritos en la presente pueden detectarse utilizando métodos analíticos conocidos que incluyen, ensayos de aptámero uniplexados, ensayos de aptámero multiplexados, inmunoensayos uniplexados o multiplexados , perfilación de expresión de ARNm, perfilación de expresión de ARNmi, análisis espectrométricos de masas, método histológico/citológico, etc., como se detalla a continuación.
Determinación de los Valores de Biomarcadores Utilizando Ensayos a Base de Aptámeros Los ensayos dirigidos a la detección y cuantificación de moléculas fisiológicamente significativas en muestras biológicas y otras muestras son herramientas importantes en la investigación sintética y el campo del cuidado de la salud. Una clase de tales ensayos involucra el uso de un micro-arreglo que incluye uno o más aptámeros inmovilizados en un soporte sólido. Los aptámeros cada uno es capaz de unirse a una molécula objetivo en una forma altamente específica y con una muy alta afinidad. Ver, por ejemplo, Patente de E. U. A. No. 5,475,096 intitulada "Nucleic Acid Ligands", ver también, por ejemplo, Patente de E. U. A. No. 6,242,246, Patente de E. U. A. No. 6,458,543, y Patente de E. U. A. No. 6,503,715, cada una de las cuales se intitula "Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip" . Una vez que el micro-arreglo se pone en contacto con una muestra los aptámeros se unen a sus moléculas objetivo respectivas presentes en la muestra y por lo tanto permiten una determinación de un valor del biomarcador correspondiente a un biomarcador.
Como se utiliza en la presente, un "aptámero" se refiere un ácido nucleico que tiene una afinidad de unión específica para una molécula objetivo. Se reconoce que las interacciones de afinidad son una materia de grado sin embargo, en este contexto, la "afinidad de unión específica" de un aptámero para su objetivo significa que el aptámero se une a su objetivo generalmente con un grado mucho mayor de afinidad con el cual se une a otros componentes en la muestra de prueba. Un "aptámero" es un grupo de copias de un tipo o especies de moléculas de ácido nucleico que tienen una secuencia de nucleótido particular. Un aptámero puede incluir cualquier número adecuado de nucleótidos, incluyendo cualquier número de nucleótidos químicamente modificados. "Aptámeros" se refiere a más de uno de tales grupos de moléculas. Los diferentes aptámeros pueden tener ya sea los mimos o diferentes números de nucleótido. Los aptámeros pueden ser ADN o ARN o ácidos nucleicos químicamente modificados y pueden ser monocatenarios , bicatenarios , o contener regiones bicatenarias , y pueden incluir estructuras de un orden más alto. Un aptámero también puede ser un fotoaptámero, en donde el grupo funcional fotor-eactivo o químicamente reactivo se incluye en el aptámero para permitir que esté covalentemente enlazado a su objetivo correspondiente. Cualquiera de los métodos de aptámeros descritos en la presente puede incluir el uso de dos o más aptámeros que específicamente se unen a la misma molécula objetivo. Como además se describe a continuación, un aptámero puede incluir una etiqueta. Además, si diferentes aptámeros cada uno incluye una etiqueta, estos diferentes aptámeros pueden tener ya sea la misma etiqueta o una etiqueta diferente .
Un aptámero puede identificarse utilizando cualquier método conocido, incluyendo el proceso SELEX. Una vez identificado, un aptámero puede prepararse o sintetizarse de acuerdo con cualquier conocido, incluyendo métodos sintéticos químicos y métodos sintéticos enzimáticos.
Los términos "SELEX" y "proceso SELEX" se utilizan de manera intercambiable en la presente para referirse en general a una combinación de (1) la selección de aptámeros que interactúan con una molécula objetivo en una forma deseada, por ejemplo la unión con alta afinidad a una proteína, con (2) la amplificación de aquellos ácidos nucleicos seleccionados. El proceso SELEX puede utilizarse para identificar aptámeros con alta afinidad a un objetivo o biomarcador específico.
SELEX generalmente incluye la preparación de una mezcla candidato de ácidos nucleicos, la unión de la mezcla candidato a la molécula objetivo deseada para formar un complejo de afinidad, separar los complejos de afinidad de los ácidos nucleicos candidatos sin unir, separar y aislar el ácido nucleico del complejo de afinidad, purificar el ácido nucleico e identificar una secuencia de aptámero específica. El proceso puede incluir múltiples rondas para además refinar la afinidad del aptámero seleccionado. El proceso puede incluir pasos de amplificación en uno o más puntos en el proceso. Ver, por ejemplo, Patente de E. U. A. No. 5,475,096, titulada "Nucleic Acid Ligands" . El proceso SELEX puede utilizarse para generar un aptámero que covalentemente se une a su objetivo así como un aptámero que no se une covalentemente a su objetivo. Ver, por ejemplo, Patente de E. U. A. No. 5,705,337 titulada "Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment : Chemi-SELEX" .
El proceso SELEX puede utilizarse para identificar aptámeros de alta afinidad que contienen nucleótidos modificados que confieren características mejoradas en el aptámero, tal como, por ejemplo, una estabilidad mejorada ín vivo, o características de distribución mejoradas. Los ejemplos de tales modificaciones incluyen sustituciones químicas en la ribosa y/o fosfato y/o posiciones bases. Los aptámeros identificados con el proceso SELEX que contienen nucleótidos modificados se describe en Patente de E. U. A. No. 5,660,985, titulada "High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing Modified Nucleotides" , que describe derivados de nucleótido que contienen oligonucleótidos químicamente modificados en el extremo 5'- y 2'- en las posiciones de piridimidinas . Patente de E. U. A. No. 5,580,737, ver supra, que describe aptámeros altamente específicos que contienen uno o más nucleótidos modificados con 2'-amino (2'-NH2), 2'-fluoro (2'-F), y/o 21 -0-methyl (2'-OMe). Ver también, la Publicación de la Solicitud de Patente de E. U. A 20090098549, titulada "SELEX y PHOTOSELEX" , que describe colecciones de ácido nucleico que tienen propiedades físicas y químicas expandidas y su uso en SELEX y fotoSELEX.
SELEX también puede utilizarse para identificar aptámeros que tienen características de disociación deseables. Ver la Publicación de Patente de E. U. A. 20090004667, titulada "Method for Generating Aptamers with Improved Off-Rates", que describe métodos SELEX mejorados para generar aptámeros que pueden unirse a moléculas objetivo. Los métodos para producir aptámeros y foto-aptámeros que tienen lentos grados de disociación de sus moléculas objetivo respectivas se describen. Los métodos involucran poner en contacto una mezcla candidato con la molécula objetivo, permitiendo que ocurra la formación de los complejos de ácido nucleico-obj etivo, y llevar a cabo un proceso de enriquecimiento de lenta disociación en donde los complejos de ácido nucleico-objetivo con rápidos grados de disociación se disociarán y no se reformarán, aunque los complejos con lentos grados de disociación permanecerán intactos. Adicionalmente, los métodos incluyen el uso de nucleótidos modificados en la producción de mezclas de ácido nucleico candidatas para generar aptámeros con un rendimiento de disociación mejorado.
Una variación de este ensayo utiliza aptámeros que incluyen grupos funcionales foto-reactivos que permiten que los aptámeros se unan covalentemente o "se foto-entrelacen" a sus moléculas objetivo. Ver, por ejemplo, Patente de E. U. A. No. 6,544,776 titulada "Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip" . Estos aptámeros foto-reactivos también son referidos como foto-aptámeros . Ver, por ejemplo, Patente de E. U. A. No. 5,763,177, Patente de E. U. A. No. 6,001,577, y Patente de E. U. A. No. 6,291,184, cada una de las cuales titula "Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichmen : Photoselection of Nucleic Acid Ligands and Solution SELEX" , ver también por ejemplo, Patente de E. U. A. No. 6,458,539, titulada "Photoselection of Nucleic Acid Ligands" . Después de que el micro-arreglo se pone en contacto con la muestra y los foto-aptámeros han tenido la oportunidad de unirse a sus moléculas objetivo, los foto-aptámeros se foto-activan, y el soporte sólido se lava para eliminar cualquier molécula no específicamente unida. Se pueden utilizar condiciones de lavado rudas, ya que las moléculas objetivo que se unen a los foto-aptámeros generalmente no se eliminan, debido a los enlaces covalentes creados por el (los) grupo (s) funcional foto-activado en los foto-aptámeros . En esta forma, el ensayo permite la detección de un valor del biomarcador correspondiente a un biomarcador en la muestra de prueba.
En ambos de estos formatos de ensayo, los aptámeros se inmovilizan en el soporte sólido antes de ponerse en contacto con la muestra. Bajo ciertas circunstancias, sin embargo, la inmovilización de los aptámeros antes del contacto con la muestra puede no proporcionar un ensayo óptimo. Por ejemplo, la pre-inmovilización de los aptámeros puede dar como resultado una mezcla ineficiente de los aptámeros con las moléculas objetivo en la superficie del soporte sólido, quizás conduciendo a tiempos de reacción prolongados y, por consiguiente, periodos de incubación extendidos para permitir la eficiente unión de los aptámeros a sus moléculas objetivo. Además, cuando se utilizan foto-aptámeros en el ensayo y dependen del material utilizado como soporte sólido, el soporte sólido puede tender a diseminar o a absorber la luz utilizada para efectuar la formación de los enlaces covalentes entre los foto-aptámeros y sus moléculas objetivo. Además, dependiendo del método utilizado, la detección de las moléculas objetivo unidas a sus aptámeros puede someterse a imprecisión, desde la superficie de soporte sólido también puede exponerse a y estar afectada por cualquier agente de marcación que se utilice. Finalmente, la inmovilización de los aptámeros en el soporte sólido generalmente involucra un paso de preparación de aptámero (es decir, la inmovilización) antes de la exposición de los aptámeros a la muestra, y este paso de preparación puede afectar la actividad o funcionalidad de los aptámeros.
Los ensayos de aptámeros que permiten que un aptámero capture su objetivo en solución y después se utilicen los pasos de separación que están diseñados para eliminar los componentes específicos de la mezcla de aptámero-objetivo antes de la detección también han sido descritos (ver, por ejemplo, Solicitud de Publicación de Patente de E . U. A. 20090042206, titulada "Multiplexed Analyses of Test Samples") . Los métodos de ensayo de aptámeros descritos permiten la detección y cuantificación de un objetivo no de ácido nucleico (por ejemplo, un objetivo de proteína) en una muestra de prueba a través de la detección y cuantificación de un ácido nucleico (es decir, un aptámero) . Los métodos descritos crean un sustituto de ácido nucleico (es decir, el aptámero) para detectar y cuantificar un objetivo no de ácido nucleico, de esta forma permitiendo un amplia variedad de tecnologías de ácido nucleico, incluyendo amplificación, a ser aplicadas a un intervalo más amplio de objetivos deseados, incluyendo objetivos de proteina.
Los aptámeros pueden construirse para facilitar la separación de los componentes del ensayo de un complejo de biomarcador de aptámero (o complejo covalente de biomarcador de foto-aptámero) y permitir el aislamiento del aptámero para la detección y/o cuantificación . En una modalidad, estos constructos puede incluir un elemento divisible y liberable dentro de la secuencia del aptámero. En otras modalidades, la funcionalidad adicional puede introducirse en el aptámero, por ejemplo, un componente marcado o detectable, un componente separador, o una etiqueta de unión específica o elemento de inmovilización. Por ejemplo, el aptámero puede incluir una etiqueta conecta al aptámero a través de una fracción divisible, una etiqueta, un componente separador que separa a etiqueta, y la fracción divisible. En una modalidad, el elemento divisible es un enlazador foto-divisible. El enlazador foto-divisible puede acoplarse a una fracción de biotina y una sección de separador, puede incluir un grupo NHS para la derivatización de las aminas y puede utilizarse para introducir un grupo de biotina en un aptámero, por lo tanto permitiendo la liberación del aptámero posteriormente en un método de ensayo.
Los ensayos homogéneos, hechos con todos los componentes del ensayo en solución, no requieren la separación de la muestra en los reactivos antes de la detección de la señal . Estos métodos son rápidos y fáciles de utilizar. Estos métodos generan una señal con base en la captura molecular o el reactivo de unión que reaccionan con su objetivo específico. Para cáncer de pulmón, los reactivos de captura moleculares serían un aptámero o un anticuerpo o similar y el objetivo específico sería un biomarcador de cáncer de pulmón de la Tabla 20.
En una modalidad, un método para la generación de señal toma la ventaja del cambio de señal de anisotropía debido a la interacción de un reactivo de captura marcado con fluoróforo con su objetivo biomarcador específico. Cuando la captura marcada reacciona con su objetivo, el peso molecular aumentado causa el movimiento rotacional del fluoróforo acoplado al complejo para convertirse en un cambio mucho más lento en valor de anisotropía. Al monitorear el cambio de anisotropía, los eventos de unión pueden utilizarse para cuantitativamente medir los biomarcadores en soluciones . Otros métodos incluyen ensayos de polarización de fluorescencia, métodos de modelo molecular, extinción de fluorescencia resulta con el tiempo, quimioluminiscencia, transferencia de energía de resonancia de fluorescencia y similares.
Un ensayo de aptámeros a base de solución ilustrativo que puede utilizarse para detectar un valor de un biomarcador correspondiente al biomarcador en una muestra biológica incluye lo siguiente: (a) preparar una mezcla a través del contacto de la muestra biológica con un aptámero que incluye una primera etiqueta y tiene una afinidad específica para el biomarcador, en donde el complejo de afinidad del aptámero se forma cuando el biomarcador está presente en la muestra; (b) exponer la mezcla a un primer soporte sólido incluyendo un primer elemento de captura y permitiendo que la primera etiqueta se asociado con el primer elemento de captura; (c) remover cualquier componente de la mezcla no asociado con el primer soporte sólido; (d) acoplar una segunda etiqueta al componente del biomarcador del complejo de afinidad de aptámero; (e) liberar el complejo de afinidad de aptámero del primer soporte sólido; (f) exponer el complejo de afinidad de aptámero liberado a un segundo soporte sólido que incluye un segundo elemento de captura y permitir que la segunda etiqueta se asocie con el segundo elemento de captura; (g) remover cualquier aptámero no en complejo de la mezcla a través de la división del aptámero no en complejo del complejo de la afinidad del aptámero; (h) eluir el aptámero del soporte sólido; (i) detectar el biomarcador a través de la detección del componente del aptámero del complejo de afinidad de aptámero.
Determinación de los Valores del Biomarcador Utilizando Inmunoensayos Los métodos de inmunoensayo se basan en la reacción del anticuerpo con su objetivo o analito correspondiente y puede detectar el analito en una muestra dependiendo del formato de ensayo específico. Para mejorar la especificidad y la sensibilidad de un método de ensayo con base en la inmuno-reactividad, los anticuerpos monoclonales por lo general se utilizan debido a su reconocimiento de epítopo específico. Los anticuerpos policlonales también han sido exitosamente utilizados en varios inmunoensayos debido a su afinidad aumentada por el objetivo según comparado con anticuerpos monoclonales. Los inmunoensayos han sido diseñados para utilizarse con un amplio intervalo de matrices de muestra biológica. Los formatos de inmunoensayo han sido diseñados para proporcionar resultados cualitativos, semi-cuantitativos y cuantitativos.
Los resultados cuantitativos se generan a través del uso de la curva estándar creada con concentraciones conocidas del analito específico a ser detectado. La respuesta a la señal de una muestra desconocida se gráfica en una curva estándar, y una cantidad o valor correspondiente al objetivo en la muestra desconocida se establecen.
Se han diseñado numerosos formatos de inmunoensayos. ELISA o EIA pueden ser cuantitativos para la detección de un analito. Este método se basa en el acoplamiento de una etiqueta a ya sea el analito o el anticuerpo y el componente de etiqueta incluye, ya sea directa o indirectamente, una enzima. Las pruebas ELISA pueden formatearse para la detección directa, indirecta, competitiva o de emparedado del analito. Otros métodos se basan en etiquetas tales como, por ejemplo, radioisótopos (I125) o fluorescencia. Las técnicas adicionales incluyen, por ejemplo, aglutinación, nefelometría, turbidometría, Western blot, inmunoprecipitación, inmunocitoquímica, inmunohistoquímica, citometría de flujo, ensayo Luminex, y otros (ver ImmunoAssay: A Practical Guide, editado por Brian Law, publicada por Taylor & Francis, Ltd., 2005 edición) .
Los formatos de ensayo ilustrativos incluyen ensayos inmunoabsorbentes enlazados a enzima (ELISA, por sus siglas en inglés), radioinmunoensayos , transferencia de energía de resonancia fluorescente, quimioluminiscente y de fluorescencia (FRET, por sus siglas en inglés) , o inmunoensayos FRET (TR-FRET, por sus siglas en inglés) resueltos con el tiempo. Los ejemplos de procedimientos para detectar biomarcadores incluyen inmunoprecipitación del biomarcador seguido por métodos cuantitativos que permiten la discriminación del tamaño y el nivel del péptido, tal como electroforesis en gel, electroforesis capilar, electrocromatografía plana y similares.
Los métodos para detectar y/o cuantificar una etiqueta o señal detectable que generan un material dependen de la naturaleza de la etiqueta. Los productos de las reacciones catalizadas a través de las enzimas apropiadas (cuando la etiqueta detectable es una enzima; ver anteriormente) puede ser, sin limitación, fluorescente, luminiscente, o radioactiva o pueden absorber luz visible o ultravioleta. Los ejemplos de detectores adecuados para detectar tales etiquetas detectables incluyen, sin limitación, película de rayos X, contadores de radioactividad, contadores de cintilación, espectrofotómetros, colorímetros, fluorómetros, luminómetros , y densitométros .
Cualquiera de los métodos para la detección puede llevarse a cabo en cualquier formato que permita cualquier preparación, procesamiento y análisis adecuados de las reacciones. Estos pueden ser, por ejemplo, en placas de ensayo de multi-cavidad (por ejemplo, 96 cavidades o 384 cavidades) o utilizar cualquier arreglo o micro-arreglo adecuado. Las soluciones concentradas para varios agentes pueden hacerse manualmente o robóticamente , y todas las posteriores mediciones con pipeta, diluciones, mezclados, distribuciones, lavados, incubación, lectura de las muestras, recolección de datos y análisis pueden hacerse robóticamente utilizando un software de análisis comercialmente disponible, robóticos e instrumentación de detección capaz de detectar una etiqueta detectable.
Determinación de los Valores del Biomarcador Utilizando Perfilacion de Expresión Génica La medición de ARNm en una muestra biológica puede utilizarse como un sustituto para detección del nivel de la proteína correspondiente a la muestra biológica. De esta forma, cualquiera de los biomarcadores o paneles de biomarcadores descritos en la presente puede también detectarse a través de la detección del ARN apropiado.
Los niveles de expresión de ARNm se miden a través de reacción de cadena de polimerasa cuantitativa de transcripción inversa (RT-PCR seguido con qPCR) . RT-PCR se utilizan para crear ADNc de ARNm. El ADNc puede utilizarse en el ensayo qPCR para producir fluorescencia como avance el proceso de amplificación de AD . A través de la comparación con una curva estándar, qPCR puede producir una medición absoluta tal como el número de copias ARNm por célula. Northern blots, micro-arreglos, ensayos invasores, y RT-PCR combinados con electroforesis capilar todos han sido utilizados para medir los niveles de expresión de ARNm en una muestra (ver Gene Expression Profiling: Methods and Protocols, Richard A. Shimkets, editor, Humana Press, 2004) .
Las moléculas de ARNmi son ARNs pequeños que no de codificación pero pueden regular la expresión génica. Cualquiera de los métodos adecuados para la medición de los niveles de expresión de ARNm también puede utilizarse para el ARNmi correspondiente. Recientemente muchos laboratorios han investigado el uso de ARNmi como biomarcadores para enfermedad. Muchas enfermedades involucran una regulación transcripcional ampliamente diseminada, no es sorprendente que los ARNmi podrían encontrar un papel como biomarcadores . La conexión entre las concentraciones de ARNmi y la enfermedad por lo general es menos clara que las conexiones entre los niveles de proteína y la enfermedad, aún en valor de los biomarcadores de ARNmi podría ser sustancial. Por supuesto, como con cualquier ARN expresados diferencialmente durante la enfermedad, los problemas que orientan el desarrollo de un producto de diagnóstico in vitro incluirán el requerimiento de que los ARNmi sobrevivan en la célula enferma y se extraigan fácilmente para análisis, o que los ARNmi se liberen en la sangre u otras matrices en donde deben de revivir lo suficiente para ser medido. Los biomarcadores de proteína tienen requerimientos similares, aunque muchos biomarcadores de proteína potenciales se secretan intencionalmente en el sitio de la patología y la función, durante la enfermedad, en una forma paracrina. Muchos biomarcadores de proteína potenciales se diseñan para funcionar fuera de las células dentro de las cuales las proteínas se sintetizan.
Detección de Biomarcadores Utilizando Tecnología foto-receptora Molecular Cualquiera de los biomarcadores descritos (ver Tabla 20) también puede utilizarse en las pruebas foto-receptoras moleculares.
Por ejemplo, un foto-receptor puede acoplarse a cualquiera de los biomarcadores descritos, que puede utilizarse para ayudar en el diagnóstico del cáncer de pulmón, para monitorear el avance/progresión a metástasis de la enfermedad, para monitorear la recurrencia de la enfermedad, o para monitorear la respuesta a terapia, entre otros usos.
Las tecnologías foto-receptoras in vivo proporcionan métodos no invasivos para determinar el estado de enfermedad particular en el cuerpo de un individuo. Por ejemplo, las porciones completas del cuerpo o aun el cuerpo completo, pueden ser visualizados como una imagen tridimensional, por lo tanto proporcionando información valiosa concerniente a la morfología de las estructuras en el cuerpo. Tales tecnologías pueden combinarse con la detección de biomarcadores descritos en la presente para proporcionar información concerniente al estado del cáncer, en particular el estado del cáncer de pulmón, de un individuo.
El uso de tecnologías foto-receptoras moleculares in vivo se expande debido a los diversos avances en la tecnología. Esos avances incluyen el desarrollo de nuevos agentes o etiquetas de contraste, tales como radioetiquetas y/o etiquetas fluorescentes, que pueden proporcionar fuentes dentro del cuerpo,- y el desarrollo de la poderosa nueva tecnología foto-receptora, que puede detectar y analizar esas señales desde afuera del cuerpo, con suficiente sensibilidad y precisión para proporcionar información útil. El agente de contraste puede visualizarse en un sistema foto-receptor apropiado, por lo tanto proporcionando una imagen de la porción del cuerpo en donde se localiza el agente de contraste. El agente de contraste puede unirse a o estar asociado con un reactivo de captura, tal como un aptámeros o un anticuerpo, por ejemplo, y/o con un péptido o proteína, o un oligonucleótido (por ejemplo, para la detección de la expresión génica) o un complejo que contiene cualquiera de estos con una o más macromoléculas y/u otras formas en partículas.
El agente de contraste también puede presentar un átomo radioactivo que es útil en la foto-recepción. Los átomos radioactivos adecuados incluyen tacnetio-99, o yodo-123 para estudios cintigráficos . Otras fracciones fácilmente detectables incluyen, por ejemplo, etiquetas giratorias para foto-recepción de resonancia magnética (MRI, por sus siglas en inglés) tal como, por ejemplo, yodo- 123 de nuevo, yodo-131, indo-111, fluor-19, carbono-13, nitrógeno-15 , oxigeno-17, gadolinio, manganeso o hierro. Tales etiquetas son bien conocidas en la técnica y podrían fácilmente seleccionarse a través de un experto en la técnica.
Las técnicas foto-receptoras estándar incluyen pero no se limitan a la foto-recepción de resonancia magnética, exploración tomográfica computarizada, tomografía de emisión de positrón (PET, por sus siglas en inglés) , tomografía computarizada de emisión de fotón individual (SPECT, por sus siglas en inglés), y similares. Para foto-recepción in vivo de diagnóstico, el tipo de instrumento de detección disponible es un factor principal en la selección del agente de contraste dado, tal como un radionúclido dado y el biomarcador particular que se utiliza para el objetivo: (proteína, ARNm, y similares) . El radionúclido seleccionado típicamente tiene un tipo de descomposición que es detectable a través de un tipo dado de instrumento. También, cuando se selecciona un radionúclido para diagnóstico in vivo su vida media deberá ser lo suficientemente larga para permitir la detección en el tiempo de la absorción máxima a través del tejido objetivo pero lo suficientemente corta que la radiación perjudicial del hospedero se minimiza.
Las técnicas foto-receptoras ilustrativas incluyen pero no se limitan a PET y SPECT, que son técnicas foto-receptoras en donde un radionúclido se administra sintética o localmente a un individuo. La posterior absorción del radio rastreador se mide con el tiempo y se utiliza para obtener información acerca del tejido activado y el biomarcador. Debido a las emisiones de alta energía (rayos gamma) de los isótopos específicos utilizados y la sensibilidad y la sofisticación de los instrumentos utilizados para detectarlos, la distribución bidimensional de la radioactividad puede inferirse desde fuera del cuerpo.
Los núclidos emisores de positrón comúnmente y utilizados en PET incluyen, por ejemplo, carbono- 11, nitrógeno- 13 , oxígeno- 15, y flúor- 18. Los isótopos que se descomponen a través de la captura de electrón y las emisiones gamma se utilizan en SPECT e incluyen, por ejemplo, yodo- 123 y tectenio-99m. Un método ilustrativo para marcar aminoácidos con tectenio-99m es la reducción del ion de pertecnetato en la presencia del precursor de quelato para formar el complejo precursor de tectenio-99m lábil, el cual, a su vez reacciona con el grupo de unión metálico de un péptido quimiot ctico bifuncionalmente modificado para formar un conjugado de péptido de tectenio-99m-quimiotáctico .
Los anticuerpos se utilizan frecuentemente para tales métodos de diagnóstico foto-receptores in vivo. La preparación y uso de los anticuerpos para los diagnósticos in vivo son bien conocidos en la técnica. Los anticuerpos marcados que específicamente se unen a cualquiera de los biomarcadores en la Tabla 20 pueden inyectarse en un individuo que se sospecha que tiene un cierto tipo de cáncer (por ejemplo, cáncer de pulmón) , detectable de acuerdo con el biomarcador particular utilizado, con el propósito de diagnosticar o evaluar el estado de la enfermedad del individuo.
La etiqueta utilizada se seleccionará de acuerdo con la modalidad foto-receptora a ser utilizada, como se describe previamente. La localización de la etiqueta permite la determinación de la diseminación del cáncer. La cantidad de etiqueta dentro del tejido del órgano o tejido también permite la determinación de la presencia o ausencia del cáncer en este órgano o tej ido .
Similarmente, los aptámeros pueden utilizarse para tales métodos de diagnóstico foto-receptores in vivo. Por ejemplo, un aptámeros que se utilizó para identificar un biomarcador particular descrito en la Tabla 20 (y por lo tanto que se une especí icamente a ese biomarcador particular) puede apropiadamente marcarse o inyectarse en un individuo que se sospecha que tiene cáncer de pulmón, detectable de acuerdo con el biomarcador particular con el propósito de diagnosticar o evaluar el estado de cáncer de pulmón del individuo.
La etiqueta utilizada se seleccionará de acuerdo con la modalidad foto-receptora a ser utilizada, como se describe previamente.
La localización de la etiqueta permite la determinación de la diseminación del cáncer. La cantidad de la etiqueta dentro de un órgano o tejido también permite la determinación de la presencia o ausencia del cáncer en ese órgano o tejido. Los agentes foto-receptores dirigidos hacia el aptámeros podrían tener una característica única y ventajosa relacionada con la penetración del tejido, la distribución del tejido, los cinéticos, la eliminación, potencia y selectividad según comparado con otros agentes foto-receptores .
Tales técnicas también pueden opcionalmente llevarse a cabo con oligonucleótidos marcados, por ejemplo, para la detección de la expresión génica a través de la foto-recepción con oligonucleótidos anti sentido. Estos métodos se utilizan para la hibridación in situ, por ejemplo, con moléculas fluorescentes o radionúclidos como la etiqueta. Otros métodos para la detección de la expresión génica incluyen, por ejemplo, la detección de la actividad de un gen reportero .
Otro tipo general de tecnología foto-receptora es la foto-recepción óptica, en donde las señales fluorescentes dentro del sujeto se detectan a través de un dispositivo óptico que es externo al sujeto. Estas señales pueden ser debidas a la fluorescencia actual y/o a la bioluminiscencia . Las mejoras en la sensibilidad de los dispositivos de detección óptica han aumentado la utilidad de la foto-recepción ópticas para ensayos de diagnóstico in vivo.
El uso de la foto-recepción de biomarcadores moleculares in vivo está aumentando, incluyendo los ensayos clínicos, por ejemplo, para medir más rápidamente la eficacia clínica en los ensayos para nuevas terapias de cáncer y/o para evitar el tratamiento prolongado con un placebo para esas enfermedades, tales como esclerosis múltiple, en donde tal tratamiento prolongado puede considerarse como éticamente cuestionable.
Para una revisión de las otras técnicas, ver N, Blow, Nature Methods, 6, 465-469-2009.
Determinación de los valores del biomarcador utilizando métodos histológicos/citológicos Para la evaluación del cáncer de pulmón, puede utilizarse una variedad de muestras tisulares en métodos histológicos o^ citológicos. La selección de la muestra depende de la ubicación primaria del tumor y los sitios de la metástasis. Por ejemplo, las biopsias endo y trans-bronquiales, aspirados de aguja fina, agujas de corte, y las biopsias centrales pueden utilizarse para histología. El lavado y el cepillado bronquial, la aspiración pleural, y el esputo, pueden utilizarse para citologías. Aunque el análisis citológico aún se utiliza en el diagnóstico de cáncer de pulmón, se sabe que los métodos histológicos proveen una mejor sensibilidad para la detección del cáncer. Cualquiera de los biomarcadores identificados en la presente que se demuestra que se regulan de manera ascendente (ver Tabla 19) en los individuos con cáncer de pulmón puede utilizarse para teñir un espécimen histológico como una indicación de la enfermedad.
En una modalidad, uno o más reactivo (s) de captura específico al (a los) biomarcador (s) correspondiente se utiliza en una evaluación citológica de una muestra de célula de pulmón y puede incluir uno o más de los siguientes: recolección de una muestra celular, fijación de la muestra celular, deshidratación, aclaración, inmovilización de la muestra celular en un portaobjetos de microscopio, permeabilización de la muestra celular, tratamiento para la obtención del analito, tinción, destincion, lavado, bloqueo y reacción con uno o más reactivos de captura en una solución regulada en pH. En otra modalidad, la muestra celular se produce de un bloque de células .
En otra modalidad, uno o más reactivos de captura específicos para los biomarcadores correspondientes se utilizan en una evaluación histológica de una muestra tisular de pulmón y puede incluir uno o más de los siguientes : recolectar un espécimen tisular, fijar la muestra tisular, deshidratación, aclaración, inmovilización de la muestra tisular en un portaobjetos de microscopio, permeabilización de la muestra tisular, tratamiento para la obtención del analito, tinción, destincion, lavado, bloqueo, rehidratación y reacción con los reactivos de captura en una solución regulada en su pH. En otra modalidad la fijación y la deshidratación se remplazan con congelamiento.
En otra modalidad, el uno o más aptámeros específicos para los biomarcadores correspondientes se hacen reaccionar con la muestra histológica o citológica y pueden servir como el objetivo de ácido nucleico en un método de amplificación de ácido nucleico.
Los métodos de amplificación de ácido nucleico adecuados incluyen, por ejemplo, PCR, replicasa q-beta, amplificación de círculo enrollado, desplazamiento de estructura de cadena, amplificación de pendiente de helicasa, amplificación isotérmica mediada por bucle, reacción de cadena de ligasa y restricción y circularización dirigida en la amplificación de círculo enrollado.
En una modalidad, el uno o más reactivos de captura específicos a los biomarcadores correspondientes para utilizarse en la evaluación histológica o citológica se mezclan en una solución regulada en pH que puede incluir cualquiera de los siguientes: materiales de bloqueo, competidores, detergentes, estabilizantes, ácido nucleico portador, materiales polianiónicos , etc.
Un "protocolo de citología" generalmente incluye la recolección de la muestra, la fijación de la muestra, la inmovilización de la muestra, y la tinción. "Preparación celular" puede incluir varios pasos de procesamiento después de la recolección de la muestra, incluyendo el uso de uno o más aptámeros de lenta disociación para la tinción de las células preparadas.
La recolección de la muestra puede incluir la colocación completa de la muestra en un envase de transporte no tratado, colocar la muestra en un envase de transporte que contiene algún tipo de medio, o colocar la muestra directamente sobre un portaobjetos (inmovilización) sin ningún tratamiento o fijación.
La inmovilización de la muestra puede mejorarse a través de la aplicación de una porción del espécimen recolectado en un portaobjetos de vidrio que se trata con polilisina, gelatina o un silano.
Los portaobjetos pueden prepararse untando una delgada y uniforme capa de células a través del portaobjetos. Se tiene cuidado en general de minimizar la distorsión mecánica y los artefactos de secado. Los especímenes líquidos pueden procesarse en un método de bloque de células. 0, alternativamente, los especímenes líquidos pueden mezclarse 1:1 con la solución de fijación durante aproximadamente 10 minutos a temperatura ambiente .
Los bloques de células pueden prepararse de efusiones residuales, esputo, sedimentos de orina, fluidos gastrointestinales, raspado de células o aspirado de células finas. Las células se concentran o empacan a través de centrifugación o filtración por membrana. Un número de métodos para la preparación de bloques de células han sido desarrollados. Los procedimientos representativos incluyen el sedimento fijado, agar bacteriano o métodos de filtración de membrana. En el método de sedimento fijado, el sedimento de las células se mezcla con un fijativo de tipo Bouinis, ácido pícrico o formalina regular en pH y después la mezcla se centrifuga para granular las células fijadas. El sobrenadante se elimina, secando lo las pelotillas celulares tan completamente como sea posible. Los las pelotillas se recolectan y se envuelven en papel óptico y después se colocan en un cásete tisular. El cásete tisular se coloca en un tarro con un fijativo adicional y se procesa como una muestra tisular. El método de agar es muy similar pero los las pelotillas se eliminan y se secan en una toalla de papel y después se cortan a la mitad. El lado cortado se coloca en una gota de agar fundido en un portaobjetos y después el peletizado se cubre con agar asegurándose de que no se formen burbujas en el agar. El agar se deja endurecer y después cualquier exceso de agar se recorta. Esto se coloca en el cásete tisular y se completa el proceso del tejido. Alternativamente, los granos pueden directamente suspenderse en 2% de agar líquido a 65° centígrados y la muestra se centrifuga. El peletizado de las células de agar se deja solidificar durante una hora a 4o centígrados. El agar sólido puede eliminarse del tubo centrífugo y cortarse a la mitad. El agar se envuelve en papel filtro y después en cásete tisular. El procesamiento a partir de este punto hacia adelante es como se describe anteriormente. La centrifugación puede remplazarse en cualquiera de estos procedimientos con filtración en membrana. Cualquiera de estos procesos puede utilizarse para generar una "muestra de bloques de células" .
Los bloques de células pueden prepararse utilizando resina especializada incluyendo resinas Lowicryl, Blanco LR, Oro LR, Unicryl y Monostep. Estas resinas tienen baja viscosidad y pueden polimerizarse a bajas temperaturas y con luz Ultra violeta (UV) . El proceso de embebido se basa en enfriar progresivamente la muestra durante la deshidratación, transferir la muestra a la resina, y polimerizar un bloque a la baja temperatura final a una longitud de onda UV apropiada .
Las secciones de bloques de células pueden teñirse con hematoxicilina-eosina para la examinación citomorfológica mientras las secciones adicionales se utilizan para la examinación para marcadores específicos.
Si el proceso es citológico o histológico, la muestra puede fijarse antes del proceso adicional para evitar la degradación de la muestra. Este proceso se denomina "fijación" y describe un amplio intervalo de materiales y procedimientos que pueden usarse de manera intercambiable. El protocolo de fijación de la muestra y los reactivos se seleccionan de la mejor forma empíricamente con base en los objetivos a ser detectados y el tipo de celular/tej ido específico a ser analizado. La fijación de la muestra se basa en reactivos tales como el etanol, polietilenglicol , metanol, formalina, o isosopranol. Las muestras deben fijarse justo después de la recolección y la fijación al portaobjetos cuando sea posible. Sin embargo, el fijativo seleccionado puede introducir cambios estructurales en varios objetivos moleculares haciendo su posterior detección más difícil. Los procesos de fijación e inmovilización y su secuencia pueden modificar la apariencia de la célula y estos cambios pueden anticiparse y reconocerse a través del citotecnólogo , los fijativos pueden causar el encogimiento de ciertos tipos celulares y causar que el citoplasma aparezca granular o reticular. Muchos fijativos funcionan a través del entrelazamiento de componentes celulares . Esto puede dañar o modificar los epítopos específicos, generar nuevos epítopos, causar asociaciones moleculares, y reducir la permeabilidad de la membrana. La fijación con formalina es uno de los métodos citológicos/histológicos más comunes. La formalina forma puentes de metilo entre las proteínas contiguas o dentro de las proteínas . La precipitación o la coagulación también se utilizan para la fijación y el etanol frecuentemente se utiliza en este tipo de fijaciones. Una combinación de entrelazamiento y precipitación también puede utilizarse para la fijación. Un fuerte proceso de fijación es mejor en la conservación de la información morfológica aunque un proceso más débil es mejor para la conservación de los objetivos moleculares.
Un fijativo representativo es 50% de etanol absoluto, 2mM de polietilenglicol (PEG) , 1.85% de formaldehido. Las variaciones en esta formulación incluyen etanol (50% a 95%) , metanol (20%-50%) , y formalina (formaldehido) solamente. Otro fijativo común es 2% PEG 1500, 50% de etanol y 3% de metanol. Los portaobjetos se colocan en el fijativo durante aproximadamente 10 a 15 minutos a temperatura ambiente y después se remueven y se dejan secar. Una vez que los portaobjetos se fijan pueden enjuagarse con solución regulada en pH como PBS .
Un amplio intervalo de tintes pueden utilizarse para diferencialmente resaltar y contrastar o "teñir" características celulares, sub-celulares y tisulares o estructuras morfológicas. La Hematoxilina se utiliza para teñir el núcleo de un color azul o negro. El naranja G-6 y el Eosina Azure ambos tiñen el citoplasma de las células. El anaranjado G tiñe la queratina y el glicógeno que contiene células amarillas. La Eosina Y se utiliza para teñir el nucléolo, la cilia, los glóbulos rojos y las células escamosas epiteliales superficiales. Las tinciones de Romanowsky se utilizan para portaobjetos secados con aire y son útiles en el mejoramiento del pleomorfismo y la distinción extracelular del material intracitoplásmico.
El proceso de tinción puede incluir un tratamiento para aumentar la permeabilidad de las células a la tinción. El tratamiento de las células con un detergente puede usarse para aumentar la permeabilidad. Para aumentar la permeabilidad de las células y el tejido, las muestras fijas además pueden tratarse con solventes, saponinas o detergentes no iónicos. La digestión enzimática también puede mejorar la accesibilidad de objetivos específicos en una muestra tisular.
Después de la tinción, la muestra se deshidrata utilizando una sucesión de enjuagues con alcohol con concentración en aumento de alcohol. El lavado final se hace con xileno o un substituto de xileno, tal como terpeno cítrico, que tiene un índice de refracción cercano al del cubreobjetos a ser aplicado al portaobjetos. Este paso final es referido como aclaramiento . Una vez que la muestra se deshidrata y aclara, se aplica un medio de montaje. El medio de montaje se selecciona para tener un índice de refracción cercano al del vidrio y es capaz de unir el cubreobjetos al portaobjetos. También inhibirá el secado, encogimiento, o desvanecimiento adicional de la muestra celular.
Independientemente de las tinciones o procesamientos utilizados, la evaluación final del espécimen citológico del pulmón se hace a través de algún tipo de microscopio para permitir la inspección visual de la morfología y una determinación de la presencia o ausencia del marcador. Los métodos microscópicos ilustrativos incluyen campo brillante, contraste de fase, fluorescencia e interferencia diferencial.
Si se requieren pruebas secundarias en la muestra después de la examinación, el cubreobjetos puede removerse y el portaobjetos desteñirse. La destincion involucra utilizar sistemas solventes originales utilizados en la tinción del portaobjetos originalmente sin agregar el tinte y en un orden inverso al procedimiento de tinción original . La destincion también puede completarse empapando el portaobjetos en un alcohol ácido hasta que las células están sin color. Una vez que el portaobjetos esta sin color se enjuaga bien en un baño de agua y se aplica el segundo procedimiento de tinción.
Además como puede ser posible la diferenciación molecular específica junto con el análisis morfológico celular a través del uso de reactivos moleculares específicos tales como anticuerpos o sondas de ácido nucleico o aptámeros . Esto mejora la precisión de la citología diagnostica .
La micro-disección puede utilizarse para aislar un subgrupo de células para la evaluación adicional, en particular, para la evaluación genética de cromosomas anormales, expresión génica o mutación.
La preparación de una muestra de tejido para evaluación histológica involucra fijación, deshidratación, infiltración, inserción, y seccionamiento. Los reactivos de fijación utilizados en histología son muy similares o idénticos a los utilizados en citología y tienen los mismos aspectos de características morfológicas de conservación a expensas de las moleculares tales como proteínas individuales. Se puede ahorrar tiempo si la muestra tisular no se fija y se deshidrata sino más bien se congela y después se secciona mientras está congelada. Esto es un procedimiento de procesamiento más ligero y puede conservar más marcadores individuales. Sin embargo, el congelamiento no es aceptable para el almacenamiento a largo plazo de una muestra tisular como la información celular se pierde debido a la introducción de cristales de hielo. El hielo en la muestra de tejido congelada también evita que el proceso de seccionamiento produzca una sección muy delgada y de esta forma se pueden perder algo de resolución microscópica y foto-recepción de las estructuras sub-celulares . Además de la fijación con formolina, se utiliza tetraóxido de osmio para fijar y teñir los fosfolípidos (membranas) .
La deshidratación de los tej idos se logra con lavados sucesivos concentraciones en aumento de alcohol. La aclaración utiliza el material que es mensurable con alcohol y el material embebido e involucra un proceso por pasos a 50:50 de alcohol: reactivo de aclaramiento y después 100% del agente de aclaramiento (xileno o sustituto de xileno) . La infiltración involucra la incubación del tejido con una forma de líquido del agente de inserción (cera caliente, solución de nitrocelulosa) primera a 50:50 del agente de inserción: agente de aclaramiento y el 100% de agente de inserción. La inserción se completa colocando el tejido en un molde o cásete y llenando con el agente insertado fundido como cera, agar o gelatina. El agente de inserción se deja endurecer. La muestra de tejido endurecida después puede rebanarse en una sección delgada para la tinción y la posterior examinación.
Antes de la tinción, se elimina la cera de la sección de tejido y se rehidrata. El Xileno se utiliza para eliminar la cera de la sección, pueden utilizarse uno o más cambios de Xileno y el tejido se rehidrata a través del lavado sucesivos en alcohol en concentraciones en disminución.
Antes de eliminar la cera, la sección del tejido puede inmovilizarse con calor en un portaobjetos de vidrio a aproximadamente a 80°C durante aproximadamente 20 minutos.
La micro-disección de captura láser permite el aislamiento de un subgrupo de células para análisis adicionales de una sección tisular.
Como en la citología, para mejorar la visualización de las características microscópicas, la sección o porción tisular puede teñirse con una variedad de tinción. Un gran menú de tinciones disponibles puede utilizarse para mejorar e Identificar características específicas.
Para además fomentar la interacción de los reactivos moleculares con muestras citológicas/histológicas, tienen que desarrollarse un número de técnicas para "obtención del analito" la primera de tales técnicas utiliza calentamiento a alta temperatura de una muestra fijada. Este método también es referido como obtención de epítopo inducido por calor o HIER. Una variedad de técnicas de calentamiento han sido utilizadas, incluyendo calentamiento con vapor, ¦microondas, autoclave, baño de agua y presión de cocción o una combinación de estos métodos de calentamiento.
Las soluciones de obtención del analito incluyen, por ejemplo, agua, citrato, y reguladores de pH de salina normal. La clave para la obtención del analito es el tiempo a alta temperatura pero temperaturas inferiores durante tiempos más largos también se han utilizado exitosamente. Otra clave para la obtención del analito es el pH de la solución de calentamiento. Un bajo pH ha sido encontrado que proporciona la mejor inmunotensión pero también da origen a fondos que frecuentemente requieren el uso de una segunda sección de tejido como un control negativo. El beneficio más consistente (inmunotensión aumentada sin aumentar el fondo) generalmente se obtiene con una solución con un alto pH independientemente de la composición reguladora de pH. El proceso de obtención del analito para un objetivo específico se optimiza empíricamente para el objetivo utilizando calor, tiempo, pH, y composición reguladora de pH como variables para la optimización del proceso.
El uso del método de obtención de analito por microondas permite la tinción secuencial de diferentes objetivos con los reactivos de un anticuerpo. Pero el tiempo requerido para obtener complejos de anticuerpo y enzima entre los pasos de tinción también ha demostrado que degrada los analitos de membrana celular. Los métodos de calentamiento por microondas tienen métodos de hibridación in situ mejorados también.
Para iniciar el proceso de obtención del analito, se desparafina, rehidrata, el portaobjetos después se coloca en 10 mM del regulador de pH de citrato sódico pH 6.0 en un plato o tarro. Un procedimiento representativo utiliza 1100 de microondas y se calienta por microondas el portaobjetos al 100% de energía durante 2 minutos seguido por calentamiento con microondas de los portaobjetos utilizando el 20% de energía durante 18 minutos después de verificar para estar seguros que el portaobjetos permanece cubierto con el liquido. El portaobjetos después se deja enfriar en un envase sin tapa y después se enjuaga con agua destilada. HIER puede utilizarse en combinación con una digestión enzimática para mejorar la reactividad del objetivo para los reactivos inmunoquímicos .
Uno de tales protocolos de digestión enzimática nos indica proteinasa K. Una concentración de proteinasa K 20pg/ml es preparada en 50mM de Tris Base, lmM EDTA, 0.5% de Tritón X-100, regulador de H 8.0. El proceso primero involucra desparafinar secciones en dos cambios de xileno, de 5 minutos cada uno. Después la muestra se hidrata en dos cambios de 100% de etanol durante 3 minutos cada uno, 95% y 80% de etanol durante un minuto cada uno, y después se enjuaga en agua destilada. Las secciones se cubren con solución operativa de proteinasa K y se incuba 10-20 minutos a 37°C en una cámara humidificada (el tiempo de incubación óptimo puede variar de acuerdo al tipo de tejido y grado de fijación) . Las secciones se enfrían a temperatura ambiente durante 10 minutos y después se enjuagan en PBS Tween 20 durante 2x2 minutos . Si se desea las secciones pueden bloquearse para eliminar la interferencia" potencial de compuestos endógenos y enzimas. La sección después se incuba con anticuerpo primario a la dilución apropiada en regulador de pH de dilución y anticuerpo primario durante 1 hora a temperatura ambiente o durante la noche a 4°C. La sección después se enjuaga con PBS Tween 20 por 2x2 minutos. El bloqueo adicional puede llevarse a cabo, si se requiere para la aplicación específica, seguido por el enjuague adicional con PBS Tween 20 por 3x2 minutos y después finalmente se completa el protocolo de inmunotinción.
Un tratamiento simple con 1% de SDS a temperatura ambiente también ha demostrado que mejora la tinción inmunohistoquímica . Los métodos de obtención de analito han sido aplicados a secciones montadas en portaobjetos así como a secciones con libre flotación. Otra opción del tratamiento es colocar el portaobjetos en un tarro que contiene ácido cítrico y 0.1 de Nonident p40 a un pH de 6.0 y calentamiento a 95°C. El portaobjetos después se lava con una solución reguladora de pH como PBS .
Para la tinción inmunológica de los tejidos puede ser útil bloquear la asociación no específica del anticuerpo con proteínas tisulares empapando la sección en una solución de proteína como suero o leche seca desgrasada.
La reacción del desbloqueo puede incluir la necesidad de reducir el nivel de biotina endógena; eliminar los efectos de carga endógenos; inactivar las nucleasas endógenas; y/o inactivar las enzimas endógenas como peroxidasa y fosfatasa alcalina. Las nucleasas endógenas pueden inactivarse a través de la degradación con proteinasa K, a través de tratamiento con calor, en uso de un agente quelatador tal como EDTA o EGTA, la introducción de un ADN o ARN portador, el tratamiento con un caótropo tal como urea, tioúrea, clorhidrato de guanidina, tiocionato de guanidina, perclorato de litio, etc., o dietil pirocarbonato . La fosfatasa alcalina puede inactivarse mediante el tratamiento con 0.1N de HC1 durante 5· minutos a temperatura ambiente o un tratamiento con lmM de levamisol. La actividad de la peroxidasa puede eliminarse mediante el tratamiento con 0.03% de peróxido de hidrógeno. La biotina endógena puede bloquearse empapando el portaobjetos en una solución de avidina (estreptavidina, la neutravidina puede ser sustituida) durante al menos 15 minutos a temperatura ambiente. El portaobjetos o la sección después se lavan durante al menos 10 minutos en regulador de pH. Esto puede repetirse al menos tres veces. Después el portaobjetos o la sección se empapan en una solución de biotina por 10 minutos. Esto puede repetirse al menos tres veces con una solución de biotina fresca cada vez. El procedimiento de lavado regulador de pH se repite. Los protocolos de bloqueado deberán minimizarse para evitar el daño ya sea de la estructura de la célula o el tejido o el objetivo u objetivos de interés pero uno más de estos protocolos podría combinarse para "bloquear" el portaobjetos o sección antes de la reacción 'con uno o más aptámeros de lenta disociación, Ver Basic Medical Histology: the Biology of Cells, Tissues and Organs, authored by Richard G. Kessel, Oxford University Press, 1998.
Determinación de los valores del biomarcador utilizando métodos de espectrometría de masa.
Una variedad de configuraciones de espectrómetros de masa puede utilizarse para detectar valores de biomarcador. Están disponibles varios tipos de espectrómetros de masa o pueden producirse con varias configuraciones. En general, un espectrómetro de masa tiene los siguientes componentes: una entrada de muestra, una fuente de ion, un analizador de masa, un detector, un sistema de vacío y un sistema de control de instrumentos y un sistema de datos. La diferencia en la entrada de la muestra, la fuente de iones, y el analizador de masa generalmente define el tipo de instrumento y sus capacidades. Por ejemplo, una entrada puede ser una fuente cromatográfica liquida de columna capilar o puede ser una zonda o etapa directa tal cómo se utiliza en la desabsorción láser asistida por matriz. Las fuentes de ion comunes son, por ejemplo, electroaspersíón incluyendo nanoaspersion y microaspersión o desabsorción láser asistida por matriz. Los analizadores de masa comunes incluyen un filtro de masa cuadripolar, un analizador de masa de trampa de ion, y un analizador de masa de tiempo- ion-vuelo . Los métodos de espectrometría de masa adicionales son bien conocidos en la técnica (ver Burlingame y otros, Anal. Chem. 70:647 R-716R (1998); Kinter and Sherman . Protein sequencing and Identification using tándem mass spectrometry. New York: Wiley-Interscience (2000) .
Los biomarcadores de proteína y los valores del biomarcador pueden detectarse y medirse a través de cualquiera de los siguientes: espectrometría de masa de ionización de electroaspersión (ESI-MS) , ESI-MS/MS, ESI-MS/(MS)n, espectrometría de masa de tiempo- ion-vuelo de ionización por desabsorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF- S) , espectrometría de masa de tiempo- ion-vuelo de desabsorción/ionización láser mejorada en la superficie (SELDI-TOF-MS) , desabsorción/ionización en silicón (DIOS) , espectrometría de masas de ion secundario (SIMS) , tiempo-ion-vuelo cuadripolar (Q-TOF) , tecnología de tiempo- ion-vuelo al unísono (TOF/TOF) , tecnología denominada ultraflex III TOF/TOF, espectrometría de masa por ionización química de presión atmosférica (APCI-MS) , APCI-MS/ S, APCI-(MS)N, espectrometría de masa de fotoionización de presión atmosférica (APPI-MS) , APPI-MS/MS, y APPI-(MS)N, espectrometría de masa cuadripolar, espectrometría de masa de transformación Fourier (FTMS) , espectrometría de masa cuantitativa, y espectrometría de masa de trampa de ion.
Las estrategias para la preparación de muestras se utilizan para marcar y enriquecer las muestras antes de la caracterización espectroscópica de masa de biomarcadores de proteínas y la determinación de los valores del biomarcador.
Los métodos de marcación incluyen pero no se limitan a etiqueta isobárica para cuantificación relativa y absoluta (iTRAQ) y marcación de isótopo estable con aminoácidos en cultivo celular (SILAC) . Los reactivos de captura utilizados para selectivamente enriquecer muestras para proteínas biomarcadoras candidato antes del análisis espectroscópico incluyen pero no se limitan a aptámeros, anticuerpos, sendas de ácido nucleico, quimeras, moléculas pequeñas, un fragmento F(ab')2, un fragmento de anticuerpo de cadena individual, un fragmento Fv, un fragmento Fv de cadena individual, un ácido nucleico, una lectína, un receptor de unión a ligando, aficuerpos, nanocuerpos , anquirinas, anticuerpos de dominio, andamios de anticuerpo alternativo (por ejemplo, diacuerpos, etc .) olímeros impresos, avímeros, peptidomiméticos , peptoides, ácidos nucleicos de péptido, ácido nucleico de trehosa, un receptor de hormona, un receptor de citoquina, y receptores sintéticos y modificaciones y fragmentos de estos.
Los ensayos anteriores permiten la detección de valores de biomarcador que son útiles en los métodos para diagnosticar cáncer de pulmón, en donde los métodos comprenden detectar, en una muestra biológica de un individuo por lo menos los valores de N biomarcadores que cada uno corresponde a un biomarcador seleccionado del grupo que consiste de los biomarcadores provistos en las tablas 18, 20 ó 21, en donde la clasificación, como se describe con detalle a continuación, utilizando los valores del biomarcador indican si el individuo tiene cáncer de pulmón. Aunque ciertos de los biomarcadores de cáncer de pulmón descritos son útiles solos para detectar y diagnosticar cáncer de pulmón, también se describen métodos en la presente para el agrupamiento de múltiples subgrupos de biomarcadores de cáncer de pulmón que cada uno es útil como un panel de tres o más biomarcadores. De esta forma, varias modalidades de la presente invención proporcionan combinaciones que comprenden N biomarcadores en donde N mayúscula es al menos tres biomarcadores. En otras modalidades, N se selecciona como siendo cualquier número de 2-86 biomarcadores. Se apreciará que N puede seleccionarse como siendo cualquier número de cualquiera de los intervalos antes descritos, así como intervalos similares, pero de un orden superior. De acuerdo con cualquiera de los métodos descritos en la presenté, los valores del biomarcador pueden detectarse y clasificarse individualmente o pueden detectarse y clasificarse colectivamente, como por ejemplo en un formato de ensayo múltiple.
En otro aspecto, se proporcionan métodos para detectar una ausencia de cáncer de pulmón, los métodos comprenden detectar, en una muestra biológica de un individuo, al menos los valores de N biomarcadores que cada uno corresponde a un biomarcador seleccionado del grupo que consiste de los biomarcadores previstos en las Tablas 18, 20 ó 21, en donde una clasificación, como se describe con detalle a continuación, de los valores del biomarcador indican una ausencia de cáncer de pulmón en el individuo. Aunque ciertos de los biomarcadores de cáncer de pulmón son útiles solos para detectar y diagnosticar la ausencia de cáncer de pulmón, también se describen en la presente métodos para el agrupamiento de múltiples subgrupos de biomarcadores de cáncer de pulmón que cada uno es útil como un panel, de tres o más biomarcadores. De esta forma, varias modalidades de la presente solicitud proporcionan combinaciones que comprenden N biomarcadores en dónde N es al menos tres biomarcadores. En otras modalidades, N se selecciona conociendo cualquier número de 2-86 biomarcadores. Se apreciará que N puede seleccionarse conociendo cualquier número de cualquiera de los intervalos antes descritos, así como intervalos similares pero de orden superior. De acuerdo con cualquiera de los métodos descritos en la presente, los valores del biomarcador pueden detectarse y clasificarse individualmente o pueden detectarse y clasificarse colectivamente, como por ejemplo, en un formato de ensayo múltiple .
Clasificación de Biomarcadores y cálculo de puntuaciones de enfermedad.
Una "identificación" del biomarcador para una prueba de diagnostico dada contiene un grupo de marcadores, cada marcador teniendo diferentes niveles en las poblaciones de interés. Los diferentes modelos, en este contexto, pueden referirse a diferentes medios de los niveles del marcador para el individuo en dos o más grupos, o diferentes variaciones en dos o más grupos, o una combinación de ambos. Para la forma más simple de la prueba de diagnostico, estos marcadores pueden utilizarse para asignar una muestra desconocida de un individuo en uno de dos grupos, ya sea enfermo o no enfermo. La asignación de una muestra en uno de dos o más grupos se conoce como clasificación, y el procedimiento utilizado para lograr esta asignación se conoce como clasificador o un método de clasificación. Los métodos de clasificación también pueden ser referidos como métodos de puntuación. Existen muchos métodos de clasificación que pueden utilizarse para construir un clasificador de diagnostico de un grupo de valores del biomarcador. En general, los métodos de clasificación se llevan a cabo más fácilmente utilizando técnicas de aprendizaje supervisadas en donde el grupo de datos se recolecta utilizando muestras obtenidas de individuos dentro de dos (o más, para estados de clasificación múltiple) diferentes grupos que se desean distinguir. Dado que la clase (grupo o población) a la cual cada muestra pertenece es conocida por adelantado para cada muestra, el método de clasificación puede entrenarse para dar una respuesta de clasificación deseada. También es posible utilizar técnicas de aprendizaje sin supervisión para producir un clasificador de diagnostico.
Los métodos comunes para desarrollar incluyen arboles de decisión: captura+impulsión+bosques ; aprendizaje con base en la inferencia de la regla; ventanas parsen; modelos lineales; logística; métodos de red neural; agrupamientos sin supervisión; medios K; ascenso/descenso jerárquico; aprendizaje semi-supervisado; métodos prototipo; vecino mas cercano; estimación de densidad kernel; maquinas de vector de soporte; modelos Markov ocultos; aprendizaje Boltzmann; y clasificadores que pueden combinarse ya sea simplemente o en formas que minimizan las funciones objetivo particulares. Para una revisión, ver, por ejemplo, Pattern Classification, R.O. Duda, y otros, editores, John iley & Sons, Segunda edición, 2001; ver también, The Elements of Statistical Learning - Data Mining, Inference, y Prediction, T. Hastie, y otros, editores, Springer Science+Business Media, LLC, Segunda edición, 2009; cada una de las cuales se incorpora por referencia en su totalidad.
Para producir un clasificador utilizando técnicas de aprendizaje supervisadas, se obtiene un grupo de muestras denominadas datos de entrenamiento. En el contexto de las pruebas de diagnostico, los datos de entrenamiento incluyen muestras de diferentes grupos (clases) a las cuales se asignaran posteriormente muestras desconocidas. Por ejemplo, las muestras recolectadas de individuos en una población de control e individuos en una población con enfermedades particulares puede constituir los datos de entrenamiento para desarrollar un clasificador que pueda clasificar muestras desconocidas (o, mas particularmente, los individuos de los cuales se toman las muestras) ya sea teniendo la enfermedad o estando libres de la enfermedad. El desarrollo del clasificador de los datos de entrenamiento se conoce como entrenamiento del clasificador. Los detalles específicos sobre el entrenamiento del clasificador dependen de la naturaleza de la técnica de aprendizaje supervisada. Para propósitos de ilustración, se describirá a continuación un ejemplo de entrenamiento de un clasificador Bayesian sin experiencia (por ejemplo Pattern Classification, R.O. Duda, y otros, editors, John Wiley & Sons, Segunda edición, 2001; ver también, The Elements of Statistical Learning - Data Mining, Inference, y Prediction, T. Hastie, y otros, editors, Springer Science+Business Media, LLC, Segunda edición, 2009) .
Ya que típicamente existen muchos mas valores de biomarcador potenciales que muestras en un grupo de entrenamiento, se debe de tener cuidado de evitar la sobre-adaptación. La sobre-adaptación ocurre cuando un modelo estadístico describe un error aleatorio o ruido en lugar de la relación subyacente. La sobre-adaptación puede evitarse en una variedad de formas, incluyendo, como por ejemplo, limitando el número de marcadores utilizados en el desarrollo del clasificador, asumiendo que las respuestas del marcador son independientes entre si, limitándolo a complejidad del modelo estadístico subyacente utilizado, asegurando que el modelo estadístico subyacente se conforma con los datos.
Un ejemplo ilustrativo de el desarrollo de una prueba de diagnostico utilizando un grupo de biomarcadores incluye la aplicación de un clasificador Bayes sin experiencia, un clasificador probabilístico simple con base en el teorema de Bayes con un tratamiento independiente estricto de los biomarcadores. Cada biomarcador se describe a través de una función de densidad de probabilidad dependiente de la clase (pdf) para los valores RFU medidos o los valores RFU Log (unidades de fluorescencia relativa) en cada clase. Los pdfs unidos para el grupo de marcadores en una clase se asume que son el producto de pdfs dependientes de clases biomarcador. El entrenamiento de un clasificador Bayes sin experiencia en este contexto representa la asignación de los parámetros ( "parametrización" ) para caracterizar los pdfs dependiendo de la clase. Un modelo subyacente para los pdfs dependientes de la clase puede utilizarse, pero el modelo deberá generalmente conformarse con los datos observados en el grupo de entrenamiento.
Específicamente, la probabilidad dependiente de la clase de la medición de un valor x, para el biomarcador i en la clase de enfermedad se escribe como p(x¡ \ d) y ^a probabilidad Bayes sin experiencia general de los n marcadores en observación con valores x = (x\,X2,--.xn) escribe n como p(xId) = \p(xi Id) en donde el iS individual son los i=l niveles del biomarcador medidos en RFU o en RFU Log. La asignación de la clasificación para un desconocido se facilita a través del cálculo de la probabilidad de estar p(dIx) enfermo ~ teniendo x medido comparado con la p(cIx) probabilidad de estar sin enfermedad (control) ~ para los mismos valores medidos. La proporción de estas probabilidades se calcula a partir de los pdfs dependientes de la clase a través de la aplicación del teorema de Bayes, es p(c \ x) p(x \ c)(l - P(d)) decir' p{d \ x) p{x \ d)P{d) en donde p ( d) es la prevalencia de la enfermedad en la población apropiada a la prueba. Tomando el logaritmo en ambos lados de esta proporción y sustituyendo las probabilidades dependientes de la clase de Bayes sin experiencia de lo anterior da Esta forma se conoce como la proporción de la probabilidad log y simplemente manifiesta que la probabilidad log de estar libre de la enfermedad particular contra los que tienen la enfermedad y esta principalmente compuesta de la suma de proporciones de probabilidad log individuales de n biomarcadores individuales. En su forma mas simple, una muestra desconocida (o, mas particularmente, el individuo del cual se obtiene la muestra) se clasifica como estando libre de la enfermedad si la proporción anterior es mayor de 0 y tiene la enfermedad si la proporción es menor de 0.
En una modalidad ilustrativa, los pdfs de biomarcador dependientes de la clase p(x¡\c) y p(xj\d) se asume que son normales o son distribuciones normales log en los valores RFU medidos x¡ , es decir con una expresión similar para p(x¡ Id) con µ^ y .. La parametrización del modelo requiere la estimación de dos parámetros de cada pdf dependiente de la clase, una media µ y una variación s2 de los datos de entrenamiento. Esto puede lograrse en un número de formas, incluyendo por ejemplo, a través del estimado de probabilidad máxima, a través de cuadrados mínimos y a través de cualquier otro método conocido por un experto en la técnica. La sustitución de las distribuciones normales para p{x¡\c) y p(x¡ I d) en la proporción de la probabilidad log definida anteriormente da la siguiente expresión: vez que el grupo de y o2s han sido definidos para cada pdf en cada clase de los datos de entrenamiento y la prevalencia de la enfermedad en la población se especifica, el clasificador Bayes está completamente determinado y puede utilizarse para clasificas muestras desconocidas con valores X medidos ~ .
El funcionamiento del clasificador Bayes sin experiencia depende del número y calidad de biomarcadores utilizados para construir y entrenar el clasificador. Un biomarcador individual funcionará de acuerdo con su distancia KS (Kolmogorov-Smirnov) , como se define en el ejemplo 3, siguiente. Si el métrico del funcionamiento del clasificador se define como la suma de la sensibilidad (fracción de positivos verdaderos, frp ) Y Ia especificidad (1 menos la fracción de falsos positivos, l - fFP un clasificador perfecto tendrá una puntuación de dos y un clasificador aleatorio, intermedio tendrá una puntuación de uno.
Utilizando la definición de la distancia KS, el valor x que maximiza la diferencia en las funciones del cdf puede encontrarse resolviendo dKS = d(c c (x) - cdfd (x)) = Q dx dx para x que conduce a p{x* \ c) = ?(?' \ d) , es decir la distancia KS ocurre cuando los pdfs dependientes de la clase se cruzan. La sustitución de este valor de x* en la expresión para la distancia KS, produce la siguiente definición para cdfc (x ) - c \ d)dx 00 = 1 - jp(x I c)dx - l distancia KS es uno * x -°° menos la fracción total de los errores utilizando una prueba con un recorte en x esencialmente un clasificador Bayesiano de analito individual. Ya que se define una puntuación de sensibilidad + especificidad =2 fFP-fFNl > la combinación de la definición anterior de la distancia KS se ve la sensibilidad + especificidad= 1+ KS . Se seleccionaron biomarcadores con una estadística que es inherentemente adecuada para la construcción de los clasificadores Bayes sin experiencia.
La adición de los posteriores marcadores con buenas distancias KS (>0.3, por ejemplo), en general mejorará el funcionamiento de la clasificación si los posteriores marcadores adicionales son independientes del primer marcador. El uso de la sensibilidad más la especificidad como una puntuación del clasificador, es un modo directo de generar muchos clasificadores con una alta puntuación con una variación de un algoritmo ávido. (Un algoritmo ávido es cualquier algoritmo que sigue el problema de resolver la metaeurística de hacer la elección localmente óptima en cada etapa con la esperanza de hallar el óptimo global) .
El método del algoritmo utilizado en el presente se detalla en el Ejemplo 4. En resumen, todos los clasificadores de analito individuales se generan de una tabla de biomarcadores potenciales y se agregan a una lista. Después, todas las posibles adiciones de un segundo analito a cada uno de los clasificadores de analito individuales almacenados después se llevan a cabo guardando un número predeterminado de los mejores pares de puntuación, es decir, por ejemplo, mil, en una nueva lista. Todos los posibles clasificadores de tres marcadores se exploran utilizando esta nueva lista de los mejores clasificadores de dos marcadores, de nuevo guardando los mejores miles de estos. Este proceso continúa hasta que la puntuación ya sea se estanca o empieza a deteriorarse como los marcadores adicionales se agregan. Aquellos clasificadores con una alta puntuación que permanecen después de la convergencia pueden evaluarse para el funcionamiento deseado para un uso previsto. Por ejemplo, en una aplicación de diagnóstico, los clasificadores con una alta sensibilidad y una modesta especificidad pueden ser más deseables que con una modesta sensibilidad y alta especi icidad. En otras aplicaciones de diagnóstico, los clasificadores con una alta especificidad y una modesta sensibilidad pueden ser más deseables . El nivel de funcionamiento generalmente se selecciona con base en los cambios que deben hacerse entre el número de falsos positivos y falsos negativos que cada uno puede ser tolerado para la aplicación de diagnóstico particular. Tales cambios generalmente dependen de las consecuencias médicas de un error ya sea falso positivo o falso negativo.
Se conocen varias otras técnicas en la técnica y pueden utilizarse para generar muchos clasificadores potenciales de una lista de biomarcadores utilizando un clasificador Bayes sin experiencia. En una modalidad, lo que es referido como un algoritmo genético puede utilizarse para combinar diferentes marcadores utilizando la puntuación de adaptabilidad como se define anteriormente. Los algoritmos genéticos son particularmente bien adecuados para explorar una gran población diversa de clasificadores potenciales. En Otra modalidad, la denominada optimización de colonia de hormigas puede utilizarse para generar grupos de clasificadores. Otras estrategias que se conocen en la técnica también pueden utilizarse, incluyendo, por ejemplo, otras estrategias evolucionarías así como el templado simulado y otros métodos de búsqueda estocásticos . Los métodos metaeurísticos tales como, por ejemplo, la búsqueda de armonía también pueden utilizarse.
Las modalidades ilustrativas utilizan cualquier número de biomarcadores de cáncer de pulmón enumerados en las Tablas 18, 20 ó 21 en varias combinaciones para producir pruebas de diagnóstico para detectar cáncer de pulmón (ver Ejemplos 2 y 6 para una descripción detallada de como estos biomarcadores se identificaron) . En una modalidad, un método para diagnosticar cáncer de pulmón, utiliza el método de clasificación Bayes sin experiencia junto con cualquier número de biomarcadores de cáncer de pulmón enumerados en las Tablas 18, 20 ó 21. En un ejemplo ilustrativo (Ejemplo 3) la pruebas más simple para detectar cáncer de pulmón de una población de fumadores asintomáticos puede construirse utilizando un biomarcador individual, por ejemplo, SCFsR que se regula de manera descendente en cáncer de pulmón con la distancia KS de 0-37 ( 1 + ÁS = 1.37 ) .
Utilizando los parámetros y para SCFsR de la tabla 15 c,i > s?,?> d,i y adi^ la ecuación para la probabilidad descrita anteriormente, una prueba de diagnóstico con una sensibilidad de 63% y especificidad de 73% (sensibilidad + especificidad = 1.36) puede producirse, ver Tabla 14. La curva ROC para esta prueba se despliega en la Figura 2 y tiene una AUC de 0. 75.
Además del biomarcador HSP90a por ejemplo, con una distancia KS de 0.5, significativamente mejora el rendimiento del clasificador a una sensibilidad de 76% y especificidad del 0.75% (sensibilidad + especificidad = 1.51) y una AUC=0.84. Observar que la puntuación para un clasificador construido de dos bioraarcadores no es una simple suma de las distancias KS; las distancias KS no son aditivas cuando se combinan biomarcadores y toma mucho más marcadores débiles para obtener el mismo nivel de rendimiento como un marcador fuerte. La adición de un tercer biomarcador ERBB1, por ejemplo, refuerza el rendimiento del clasificador a 78% de sensibilidad y 83% especificidad y AUC=0.87. La adición de biomarcadores adicionales, tales como, por ejemplo, PTN, BTK, CD30, Calicreína 7, LRIG3 , LDH-H1 y PARC, produce una serie de pruebas de cáncer de pulmón resumidas en la Tabla 14 y desplegadas como series de curva RUC en la figura 3.
La puntuación de los clasificadores como una función del número de analitos utilizados en la construcción del clasificador se despliegan en la Figura 4. La sensibilidad y la especificidad de este clasificador de 10-marcadores ilustrativo >87% y la AUC es 0.91.
Los marcadores enumerados en las Tablas 18, 20 ó 21 pueden combinarse en muchas formas para producir clasificadores para diagnosticar cáncer de pulmón. En algunas modalidades, los paneles de biomarcadores están comprendidos de diferentes números de analitos dependiendo del criterio de rendimiento de diagnóstico específico que se selecciona. Por ejemplo, ciertas combinaciones de biomarcadores producirán pruebas que son más sencillas (o más específicas) que otras combinaciones.
Una vez que se define el panel para imprimir un grupo particular de biomarcadores de las Tablas 18, 20 ó 21 y un clasificador se construye de un grupo de datos de entrenamiento, la definición de la prueba de diagnóstico se completa. En una modalidad, el procedimiento utilizado para clasificar una muestra desconocida se perfila en la Figura IA. En otra modalidad el procedimiento utilizado para clasificar una muestra desconocida se perfila en la Figura IB. La muestra biológica se diluye apropiadamente y después se corre en uno o más ensayos para producir los niveles de biomarcador cuantitativos relevantes utilizados para la clasificación. Los niveles de biomarcador medidos se utilizan como una entrada para el método de clasificación que da salida a una clasificación y una puntuación óptima para la muestra que refleja la confianza de la asignación de la clase .
La Tabla 21 identifica 86 biomarcadores que son útiles para diagnosticar cáncer de pulmón en ambas muestras de tejido y sangre. La Tabla 20 identifica 25 biomarcadores que fueron identificados en muestras tisulares pero que son útiles en muestras de suero y plasma también. Esto es un sorprendentemente mayor número que el esperado cuando se compara lo que típicamente se encuentra durante los esfuerzos de descubrimiento del biomarcador y pueden ser atribuibles a la escala de estudio descrito que abarcó aproximadamente 800 proteínas medidas en cientos de muestras de individuos, en algunos casos a concentraciones en el intervalo femtomolar bajo. Presumiblemente, el gran número de biomarcadores descubiertos refleja las diversas trayectorias bioquímicas implicadas en ambas la biología del tumor y la respuesta del cuerpo a la presencia del tumor; cada trayectoria y proceso involucra muchas proteínas. Los resultados muestran que ninguna proteína individual de un pequeño grupo de proteínas es inequívocamente informativa acerca de tales procesos o completos; más bien, las proteínas múltiples están involucradas en procesos relevantes, tales como peptosis o reparación de la matriz extra celular, por ejemplo.
Dados los numerosos biomarcadores identificados durante el estudio descrito se esperaría que sean capaces de derivar grandes números de clasificadores de alto rendimiento que pueden utilizarse en varios métodos de diagnóstico. Para probar está moción, decenas de miles de clasificadores se evaluaron utilizando los biomarcadores en la Tabla 1. Como se describe en el Ejemplo 4 muchos subgrupos de biomarcadores presentados en la Tabla 1 puede combinarse para generar clasificadores útiles. A manera de ejemplo, las descripciones son provistas para clasificadores que contienen 1, 2, y 3 biomarcadores para cada uno de dos usos. Clasificación del cáncer de pulmón de fumadores con alto riesgo y el diagnóstico de individuos que tienen nodulos pulmonares que son detectables a través de CT. Como se describe en el ejemplo 4, todos los clasificadores que se construyeron utilizando los biomarcadores de la Tabla 1 funcionaron diferentemente mejor que los clasificadores que se construyeron utilizando "No-marcadores" .
El rendimiento de los clasificadores obtenidos a través de la exclusión aleatoria de algunos de los marcadores en la tabla 1, que dieron como resultado subgrupos menores de los cuales construyeron los clasificadores también se ensayaron. Como se describe en el ejemplo 4, parte 3, los clasificadores que se construyeron de subgrupos aleatorios de los marcadores en la tabla 1 funcionaron similarmente a los clasificadores óptimos que se construyeron utilizando la lista completa de los marcadores en la tabla 1.
El funcionamiento de los clasificadores de 10 marcadores obtenidos a través de la exclusión de los "mejores" marcadores individuales de la agregación de 10 marcadores también se ensayo. Como se describe en el ejemplo 4, parte 3, los clasificadores construidos sin los "mejores" marcadores en la tabla 1 también funcionaron bien. Muchos subgrupos de biomarcadores enumerados en la tabla l funcionaron casi óptimamente, aun después de remover los 15 principales marcadores enumerados en la tabla. Esto implica que las características de rendimiento de cualquier clasificador particular probablemente no se deben a algún grupo central pequeño de biomarcadores y que el proceso de la enfermedad probablemente impacta numerosas trayectorias bioquímicas, que alteran el nivel de expresión de muchas proteínas .
Los resultados el ejemplo 4 sugieren ciertas conclusiones posibles: En primer lugar, la identificación de un gran número de biomarcadores permite su agregación en un vasto número de clasificadores que ofrecen similarmente un alto rendimiento. En segundo lugar, los clasificadores pueden construirse de tal forma que los biomarcadores particulares pueden estar substituidos por otros biomarcadores en una forma que refleja las redundancias que indudablemente difunden las complejidades de los procesos de enfermedad contribuye a través de cualquier biomarcador individual identificado en la tabla 1 a traslaparse con la información contribuida través de otros biomarcadores, de tal forma que puede ser que ningún biomarcador particular o pequeño grupo de biomarcadores en la tabla 1 debe incluirse en ningún clasificador.
Las modalidades ilustrativas utilizan los clasificadores Bayes sin experiencia construidos de los datos en las tablas 38 y 39 para clasificar una muestra desconocida. El procedimiento se perfila en las figuras 1A y B. En una modalidad, la muestra biológica se diluye opcionalmente y se corre en un ensayo de aptámero multiplexado . Los datos del ensayo se normalizan y calibran como se describe en el ejemplo 3, y los niveles del biomarcador se utilizan como la entrada para el esquema de clasificación Bayes. La proporción de probabilidad log se calcula para cada biomarcador medido individualmente y después se suma para producir una puntuación de clasificación final, que también es referida como una puntuación de diagnostico. La asignación resultante también como la puntuación de clasificación global pueden reportarse. Opcionalmente, los factores de riesgo de probabilidad log individuales calculados para cada nivel de biomarcador pueden reportarse también. Los detalles del cálculo de la puntuación de la clasificación se presentan en el ejemplo 3.
Para demostrar la utilidad de la tecnología proteómica a base de aptámeros descrita en la presente para utilizarse en el descubrimiento de biomarcadores relacionados con la enfermedad de tejidos, las muestras tisulares homogeneizadas de resecciones quirúrgicas obtenidas de 8 pacientes con cáncer de pulmón de célula no pequeña (NSCLC) se analizaron, como se describe en el ejemplo 6. Todos los pacientes NSCLC eran fumadores, en el intervalo de edades de 45 a 75 años de edad y cubriendo las etapas 1A a 3B de NSCLC (tabla 17) . Se obtuvieron 3 muestras de cada resección: la muestra tisular de tumor, tejido no de tumor adyacente. La concentración proteica total se ajusto y normalizo en cada homogenato para el perfilamiento proteómico seguido por un análisis de la plataforma de micro arreglo de ADN para medir las concentraciones de aproximadamente 800 proteínas humanas (ver Gold y otros, Nature Precedings, http : //precedings . nature . com/documents/4538/version/l (2010) ) .
Las mediciones de la concentración de proteína, expresadas como unidades de fluorescencia relativas (RFU) , permiten comparaciones a gran escala de identificaciones de proteína entre las muestras (ver figuras 21A-21C) . Con referencia a las figuras 21A-21C, primero los niveles de expresión de proteína entre los tejidos adyacentes y distantes de control se compararon para cada muestra de paciente (figura 21A) . En esta comparación, solamente un analito (fibrinógeno) exhibió más de una diferencia de 2 veces entre las muestras. En general, las señales generadas por la mayor parte de los analitos son similares en tejido adyacente y distante.
En contraste, la comparación de los tejidos tumorales con tejidos no tumorales (adyacentes o distantes) identificaron 11 (1.3%) proteínas con mas de diferencias de 4 veces y 53 (6.5%) de proteínas con mas de diferencias de 2 veces (ver figuras 21B y 21C) . Las 767 (93.5%) proteínas restantes mostraron diferencias relativamente menores entre tejido con tumor y sin tumor. Algunas proteínas se suprimieron substancialmente mientras otras se elevaron en tej idos de tumor comparadas con tej idos adyacentes o distantes. La expresión diferencial de las proteínas entre el tejido adyacente y de tumor, o entre el tejido distal y de tumor, fueron similares en general. Los cambios en el tejido distal fueron generalmente mayores (figuras 21A-21C) , lo que demuestra que la mayor parte de los cambios de la proteína son específicos para el entorno del tumor local.
Para identificar biomarcadores de tejido NSCLC, los niveles de expresión de la proteína entre el tumor, las muestras de tejidos adyacentes y distantes, se compararon utilizando la prueba de Mann hitney descrita en Ostroff y otros Nature Precedings, htt : //precedings . nature . com/documents/4537/version/l (2010) ) . Treinta y seis proteinasas con cambios mayores y con diferencias estadísticamente significativas entre el tejido con tumor y sin tumor se identificaron con un recorte de grado de descubrimiento falso de q <0.05 para la significancia Figuras 23 y 24, y Tabla 18) . Veinte de estas proteínas se regularon de manera ascendente y diez y seis se regularon de manera descendente en el tej ido tumoral . Aunque el número de muestras utilizadas para este estudio fue relativamente pequeño, un diseño de estudio con base individual poderosa en donde cada muestra de tumor tuvo sus propios controles de tejido saludable se utilizaron. Hasta eliminar la variación de la población asociada con diseños de estudio a base de población. De las muestras de referencia apropiadamente seleccionadas se reconoce en aumento como un componente críticamente importante en la investigación del descubrimiento del biomarcador. (Bossuyt (2011) J. Am. Med. Assoc. 305:2229-30; Ioannidis and Panagiotou (2011) J. Am. Med. Assoc. 305:2200-10; Diamandis (2010) J. Nati. Cáncer Inst . 102 : 1462-7) .
Se cree que aproximadamente un tercio (13/36) de los biomarcadores de tejido NSCLC identificados en la presente son nuevos. Los dos tercios restantes (23/36) habían sido reportados previamente como proteínas diferencialmente expresadas o genes en tejidos de tumor NSCLC (Tabla 18) .
Los biomarcadores identificados de acuerdo con el método del ejemplo 6 pueden clasificarse ampliamente en cuatro procesos biológicos asociados con sellos importantes de biología de tumor (Hanahan & Weinberg (2011) Cell 144:646-74) en la tabla 19:1) angiogénesis, 2) crecimiento y metabolismo, 3inflamación y apoptosis y 4) invasión y metástasis. Sin duda alguna, estás son clasificaciones inexactas albeit convenientes que se aproximan a un sistema altamente complejo y dinámico en el cual estas moléculas por lo general juegan múltiples y variados papeles. Por consiguiente, el estado específico de un sistema dado finalmente afecta la expresión y la función de cualquier molécula particular. El entendimiento biológico está lejos de completarse en estos sistemas . Con la plataforma SOMAscan, la expresión cuantitativa de varios números de proteína en varios tejidos y procesos de enfermedad se hace posible. Estos datos proporcionan nuevas coordenadas para ayudar en el mapeo de los dinámicos de estos sistemas, que a su vez proporcionaran un entendimiento más completo de la biología de cáncer de pulmón así como otras enfermedades . Los resultados del estudio actual proporcionan una nueva perspectiva en la biología del tumor NSCLC, con ambos elementos familiar y nuevo.
Angiogénesis La angiogénesis conduce el crecimiento de nuevos vasos sanguíneo para soportar el crecimiento del tumor y el metabolismo. La regulación de la angiogénesis es un fenómeno biológico complejo controlado a través de ambas señales positivas y negativas (Hanahan & Weinberg, (2011) Cell 144:646-74). Entre los biomarcadores de tejido NSCLC identificados en este estudio estudiaron reguladores de angiogénesis positivos y negativos bien conocidos (Figuras 23A-23T y 24A-24P y Tabla 19) , . todos los cuales han sido observados previamente en tejido de tumor NSCLC (Fontanini y otros, (1999) British Journal of Cáncer 79 (2) :363-369; Imoto y otros (1998) J. Thorac . Carciovasc. Surg 115:1007-1011; Ohta y otros, (2006) Ann. Thorac. Surg. 82:1180-1184; Iizasa y otros, (2004) Clinical Cáncer Research 10:5361-5366). Estos incluyen el inductor de angiogénesis prototípico VEGF y los inhibidores de endostatina y trombospondina-1 (TSP-1) . VEFG es un factor de crecimiento poderosos que promueve el crecimiento de nuevos vasos sanguíneos y esta fuertemente regulado de manera ascendente en tejido de tumor NSCLC, consistente con previas observaciones (Imoto y otros, (1998) J. Thorac. Carciovasc. Surg 115:1007-1011), e incluyendo nuestro estudio de muestras médicas de pacientes NSCLC (Ostroff y otros, Nature Precedings, http : //precedings . nature . com/documents/4537/version/l (2010) ) . La endostatina es un fragmento proteolítico de colágeno XVIII y un fuerte inhibidor de la proliferación celular endotelial y la angiogénesis (Iizasa y otros (Ago . 2004) Clinical Cáncer Research 10:5361-5366) . TSP-1 y la trombospondina-2 (TSP-2) fueron sustancialmente reguladas de manera ascendente en tejido de tumor NSCLC. TSP-1 y TSP-2 son proteínas de matriz extracelular con efectos dependientes del contexto, complejos modulados a través de una variedad de interacciones con receptores de superficie celular, factores de crecimiento, citosinas, metaloproteinasas de matriz y otras moléculas. Arquetípicamente en sistemas de modelo, TSP-1 y TSP-2 inhiben la angiogénesis durante la inhibición de la proliferación de la célula endotelial a través del receptor CD47 e induciendo la apoptosis de la célula endotelial a través del receptor CD36. También existe evidencia de influencias proangiogénicas para TSP-1 y TSP-2 (Bornstein (2009) J. Cell Commun. Signal. 3 (3-4) : 189-200) . Finalmente, TSP-1 y TSP-2 relativos y los niveles de expresión absolutos en tejido NSCLC varían (Chijiwa y otros, (2009) Oncology Reports 22:279-283; Chen y otros, (2009) J Int Med Res 37:551-556; Oshika 1998, Fontanini y otros, (1999) British Journal of Cáncer 79 (2) : 363-369) , probablemente debido a sus funciones complejas. En este estudio se encontró que CD36 se regula de manera descenderte en tejido de tumor NSCLC, que podría indicar una adaptación de las células de tumor que reducen la sensibilidad a la apoptosis mediada por TSP-1 y TSP-2.
Crecimiento y Metabolismo Diez de los biomarcadores NSCLC identificados están asociados con las funciones de crecimiento y metabolismo. La mitad de estos biomarcadores está involucrada en la regulación hormonal compleja del crecimiento celular y el metabolismo de la energía. Tres proteínas de unión al factor de crecimiento del tipo insulina (IGFBP) , que moderan la actividad de los factores de crecimiento de tipo insulina (IGF) , se regularon de manera ascendente en tumores NSCLC (IGFBP-2, -5, y -7). Varios reportes han evaluado cualitativamente IGFBP-2, -5, y -7 en NSCLC (Tabla 18) y sugieren una expresión superior en tejido NSCLC que en tejido normal. La insulina IGF son hormonas que tienen una fuerte influencia en el crecimiento celular y el metabolismo, y las células cancerígenas por lo general dependen de estás moléculas para el crecimiento y proliferación (Robert y otros, (Aug. 1999) Clinical Cáncer Research 5:2094-2102; Liu y otros (Junio 2007) Lung Cáncer 56 (3 ): 307-317 ; Singhal y otros, (2008) Lung Cáncer 60:313-324) . Estas hormonas a su vez son degradadas por insulisina que se encontró que se regulan de manera ascendente en el tejido del tumor NSCLC. La adiponectina de la hormona controla el metabolismo de los lípidos y la sensibilidad de la insulina, y se encontró que la adiponectina se regula de manera descendente en tumores NSCLC. Los cinco biomarcadores restantes, Anhidrasa Carbónica III, NAGK, TrATPase, triptasa ß-2, y MAP 13 son enzimas con papeles en el metabolismo celular (Tabla 17) .
Inflamación y Apoptosis La inflamación y la apoptosis son señales de la biología cancerígena, y el número de biomarcadores potenciales asociados con estos procesos que han estado asociados previamente con NSCLC (Tabla 19). La Caspasa-3, que ha estado asociada con la metástasis (Chen y otros, (2010) Lung Cáncer (doi : 1016/j . lungcan.2010.10.015) , se encontró que se regula de manera ascendente en tejido de tumor NSCLC. Otro ejemplo notable es RAGE, que ha sido reportado como siendo dramáticamente regulado de forma descendente en tejido NSCLC. Este hallazgo es consistente con la medición descrita en la presente, en donde (Jing y otros (2010) Neoplasma. 57:55-61, Bartling y otros (2005) Carcinogénesis 26:293-301). Con la medición descrita en la presente, en donde sRAGE tiene el cambio observado más grande para proteínas que son inferiores en tumor que en tejido no maligno. Aunque no se limita por teoría, una hipótesis es que RAGE juega un papel en la organización epitelial, y niveles disminuidos de RAGE en tumores de pulmón pueden contribuir a la pérdida de la estructura tisular epitelial potencialmente conduciendo a la transformación maligna. (Bartling y otros (2005) Carcinogénesis 26 (2) : 293-301) . Varias quimiocinas, tales como BCA-1, CXCL16 , IL-8, y NAP-2, se alteran. (Tabla 18), consistente con la hipótesis de que la invasión de tumores con células de los brazos innatos y adaptativos del sistema inmunitario proporcionan moléculas bioactivas que afectan las señales proliferativa y angiogénica (Hanahan & Weinberg (2011) Cell 144:646-74) .
Invasión y Metástasis El grupo más grande de biomarcadores potenciales contiene proteínas que funcionan en interacciones de célula- célula y célula-matriz y están involucrados en la invasión y la metástasis. Muchos han sido previamente reportados como estando asociados con NSCLC. Lo más notable son dos de las metaloproteinasas de matriz MMP-7 y MMP-12, que contribuyen a la degradación proteolítica de los componentes de matriz extracelular y el procesamiento de sus tratos tales como factores de crecimiento (ver, por ejemplo, Su y otros, (2004) Chinese Journal of Clinical Oncology 1 (2 ) : 126 -130 ; Wegmann y otros, (1993) Eur . J. Cáncer 29A(11) : 1578-1584) . Se sabe que tales procesos juegan un papel en la creación de los microentornos del tumor. Se ha encontrado que ambos MMP-7 y MMP-12 se regularon de manera ascendente en tejido NSCLC (Tabla 18), que es consistente con estudio similar que utilizó mediciones a base de anticuerpos (Shah y otros (2010) The Journal of Thoracic y Cardiovascular Surgery 139(4) : 984-990) . La sobre-expresión de MMP-7 y MMP-12 ha estado asociada con un pobre pronóstico en NSCLC (Shah y otros, (2010) The Journal of Thoracic y Cardiovascular Surgery 139 (4) : 984-990) . Los niveles de MMP-12 han estado correlacionados con recurrencia local y enfermedad metastásica (Hofmann y otros (2005) Clin. Cáncer Res. 11:1086-92, Hoffman y otros, (2006) Oncol . Rep . 16:587-95) . Dos de ocho sujetos estudiados tuvieron niveles normales de MMP-12, mientras los otros seis tuvieron una elevación de 15-50x de MMP-12 en tejido de tumor comparado con tejido sin tumor.
Funcionamiento de los biomarcadores NSCLC como sondas histoquímicas Un entendimiento de la diferencia entre la expresión de la proteína entre tejidos de tumor y no de tumor puede utilizarse para identificar nuevas sondas histoquímicas. Tales sondas pueden permitir una caracterización molecular más precisa de tumores y sus efectos en el estroma circundante. Las Figuras 25A-25E muestra la habilidad de dos de los SOMAmeros identificados para teñir tejidos congelados frescos obtenidos de las mismas resecciones del tumor utilizadas para el descubrimiento de estos biomarcadores. Se encontró que la Trombospondina-2 (TSP2) se aumenta en homogenatos de tejido de tumor mientras el Receptor de Mañosa de Macrófago (MRC1, por sus siglas en inglés) disminuyó. La tinción del tejido con estos SOMAmeros fue consistente con los resultados de perfilación. Los ejemplos adicionales, así como la confirmación del anticuerpo de patrones de tinción se muestran en Las Figuras 27A.-27H.
Comparación de tejido NSCLC y biomarcadores esféricos La expresión diferencial de proteínas en suero de pacientes con NSCLC con relación a controles sin cáncer comparado con muestras de tejido NSCLC produce entendimientos útiles (Figuras 26A-26F) .
La observación más impresionante es que los cambios relativos en la expresión de la proteína son mayores en tejidos que en el suero. Este resultado podría esperarse ya que el tejido de tumor en la fuente de los cambios es la expresión de la proteína que después, aun cuando está completamente liberada en la circulación, se diluye varias veces en un volumen total de sangre. Esta tendencia es evidente en la distribución alargada de los puntos de datos a lo largo del eje x en la Figuras 26A-26F en donde los ejes se dibujan en la misma escala para ilustrar este punto. Doce de los analitos mostrados en las Figuras 23A-23T y 24A-24P como alterados en el tejido del tumor también se expresaron diferencialmente en suero de pacientes NSCLC contra los controles (círculos rellenos rojos en Figuras 26A-26F) . La mayor parte de los cambios direccionales son iguales entre el tejido y el suero, pero unos cuantos no. Las concentraciones locales de las proteínas en un homogenato tisular claramente no necesitan correlacionarse con los niveles en circulación de las proteínas y las correlaciones inversas pueden proporcionar indicaciones con respecto a la redistribución de ciertos biomarcadores en tejido enfermo frente al normal.
El descubrimiento de nuevos biomarcadores con utilidad del diagnóstico o clínica demostrable ha sido un reto considerable en los años recientes (Diamandis (2010) J. Nati. Cáncer Inst. 102 : 1462-7) . Las razones para esto incluyen la omnipresencia de artefactos pre-analíticos y analíticos, la no disponibilidad de controles en estado saludable adecuados y diseños de estudio no sofisticados, y la dificultad de detectar pequeños cambios en niveles de proteína a muy bajas concentraciones. Este reto es especialmente pronunciado con biomarcadores de cáncer en donde el objetivo por lo general es identificar una pequeña malignidad en un cuerpo humano relativamente grande en una etapa temprana. Con respecto al punto anterior, una forma de mejorar las oportunidades del recubrimiento de biomarcadores cancerígenos verdaderos es obtener datos de expresión de proteína de ambos, el origen de la enfermedad, tal como el tejido de tumor, así como de la circulación. Los resultados combinados pueden parcialmente corroborar la validez de los biomarcadores potenciales. La presente solicitud demuestra que esto es posible con el ensayo proteómico altamente multiplexado y sensible. Se ha demostrado que los tejidos, como plasma o suero, también son adaptables a SOMAscan, y el análisis comparativo resultante de la expresión de la proteína en tejidos de tumor NSCLC con tejidos de pulmón sanos circundantes ofrece un complemento al grupo de datos existente de biomarcadores NSCLC potencial identificado de muestras séricas (ver Publicación de E. U. A. No. 2010/0070191) . En el presente caso, un tercio, o doce de los treinta y seis biomarcadores de tejido reportados en la presente (BCA-1 (BCL) , cadherina-1 (cadherina-E) , catalasa, endostatina, IGFBP-2, MRC1 (receptor de mañosa de macrófago) , MAPK-13 (MK13), MMP-7, MMP-12, NAGK, VEGF y YES han sido previamente identificados en suero. Tomados juntos, estos datos contribuyen a un entendimiento adicional de l complejidad de los cambios que acompañan NSCLC y proporcionan biomarcadores potenciales adicionales para la detección temprana de esta enfermedad mortal.
Kits Cualquier combinación de los biomarcadores de la Tabla 20 (así como información biomédica adicional) puede detectarse utilizando un kit adecuado, tal como para utilizarse en la ejecución de los métodos descritos en la presente. Además, cualquier kit puede contener una o más etiquetas detectables como se describe en la presente, tales como una fracción fluorescente, etc.
En una modalidad, un kit incluye (a) uno o más reactivos de captura (tal como, por ejemplo, por lo menos un aptámero o anticuerpo) para detectar uno o más biomarcadores en una muestra biológica, en donde los biomarcadores incluyen cualquiera de los biomarcadores determinados en las Tablas 18, 20 ó 21 y opcionalmente (b) uno o más software o productos de programa de computadora para clasificar al individuo del cual se obtuvo la muestra biológica como ya sea teniendo o no teniendo cáncer de pulmón o para determinar la probabilidad de que el individuo tenga cáncer de pulmón, como se describe adicionalmente en la presente. Alternativamente, en lugar de uno o más productos de programa de computadora, una o más instrucciones para llevar a cabo manualmente los pasos anteriores a través de humano pueden ser provistos.
La combinación de un soporte sólido con un reactivo de captura correspondiente y un material generador de señal es referida en la presente como un "dispositivo de detección" o "kit" . El kit también puede incluir instrucciones para utilizar los dispositivos y reactivos, el manejo de la muestra y el análisis de los datos. Además el kit puede utilizarse con un sistema de computadora o software para analizar y reportar los resultados del análisis de la muestra biológica .
Los kits también contener uno o más reactivos (por ejemplo, reguladores de pH de solubilización, detergentes, lavados o reguladores de pH) , para procesar una muestra biológica. Cualquiera de los kits descritos en la presente también puede incluir, por ejemplo, reguladores de pH, agentes de bloqueo, materiales de matriz de espectrometría de masa, agentes de captura de anticuerpo, muestras de control positivo, muestras de control negativas, software e información tales como protocolos, instrucciones y datos de referencia .
En un aspecto, la invención proporciona kits para el análisis del estado del cáncer de pulmón. Los kits incluyen iniciadores PCR para uno o más biomarcadores seleccionados de las Tablas 18, 20 ó 21. El kit además puede incluir instrucciones para uso y la correlación de los biomarcadores con el cáncer de pulmón. El kit también puede incluir un arreglo de ADN que contiene el complemento de uno o más de los biomarcadores seleccionado de la Tabla 20, reactivos, y/o enzimas para amplificar o aislar el ADN de muestra. Los kits pueden incluir reactivos para PCR en tiempo real, por ejemplo, sondas TaqMan y/o iniciadores, y enzimas.
Por ejemplo, un kit puede comprender (a) reactivos que comprenden por lo menos un reactivo de captura para cuantificar uno o más biomarcadores en la muestra de prueba, en donde los biomarcadores comprenden los biomarcadores determinados en las Tablas 18, 20 ó 21, o cualquier otro biomarcador o panales de biomarcadores descritos en la presente, y opcionalmente (b) uno o más algoritmos o programas de computadora para llevar a cabo los pasos de comparación de la cantidad de cada biomarcador cuantificado en la muestra de prueba con uno o más de los recortes predeterminados y asignar una puntuación para cada biomarcador cuantificado con base en tal comparación, combinar las puntuaciones asignadas para biomarcador cuantificado para obtener una puntuación total, comparar la puntuación total con una puntuación predeterminada, y utilizar la comparación para determinar si un individuo tiene cáncer de pulmón. Alternativamente, en lugar de uno o más algoritmos o programas de computadora, una o más instrucciones para manualmente llevar a cabo los pasos anteriores a través de humano pueden ser provistos.
Métodos de Computadora y Software Una vez que el biomarcador o el panel de biomarcador se selecciona, un método para diagnosticar a un individuo puede comprender lo siguiente: 1) recolectar o por el contrario obtener una muestra biológica; 2) llevar a cabo un método analítico para detectar y medir el biomarcador o biomarcadores en el panel en la muestra biológica; 3) llevar a cabo cualquier normalización o estandarización de datos requerida para el método utilizado para recolectar los valores del biomarcador; 4) calcular la puntuación del marcador; 5) combinar las puntuaciones del marcador para obtener una puntuación de diagnóstico total; y 6) reportar la puntuación de diagnóstico del individuo. En este método, la puntuación del diagnóstico puede ser un número individual determinado de la suma de todos los cálculos del marcador que se compara con un valor de un umbral predefinido que es una indicación de la presencia o ausencia de la enfermedad. 0 en la puntuación del diagnóstico puede ser una serie de barra que cada una representa un valor del biomarcador y el patrón de las respuestas puede compararse con el patrón pre-definido para determinación de la presencia o ausencia de la enfermedad .
Al menos algunas modalidades de los métodos descritos en la presente pueden implementarse con el uso de una computadora. Un ejemplo de un sistema de computadora 100 se muestra en la Figura 6. Con referencia a la Figura 6, el sistema 100 se muestra comprendiendo elementos de hardware que se acoplan eléctricamente a través de un controlador 108, incluyendo un procesador 101, un dispositivo de entrada 102, un dispositivo de salida 103, un dispositivo almacenamiento 104, un lector de medios de almacenamiento legibles por computadora 105a, un sistema de comunicaciones 106 para procesar la aceleración (por ejemplo, DSP o procesadores de propósito especial) 107 y memoria 109. El lector del medio de almacenamiento legible por computadora 105a además se acopla al medio de almacenamiento legible por computadora 105b, la combinación comprensivamente representando dispositivos de almacenamiento remotos, locales, fijos y/o removibles más el medio de almacenamiento, memoria, etc., para temporalmente y/o más permanentemente contener la información legible por computadora, que puede incluir el dispositivo de almacenamiento 104, la memoria 109 y/o cualquier otro recurso de un sistema accesible 100. El sistema 100 también comprende elementos de software (mostrados como estando actualmente localizados dentro de la memoria operativa 191) incluyendo un sistema operativo 192 u otro código 193, tales como programas, datos y similares.
Con respecto a la Figura 6, el sistema 100 tiene una flexibilidad extensiva y capacidad de configuración. De esta forma, por ejemplo, una sola arquitectura podría utilizarse para implementar uno o más servidores que pueden además configurarse de acuerdo con los protocolos actualmente deseables, variaciones de protocolo, extensión, etc. Sin embargo, será evidente para el experto en la técnica que las modalidades pueden utilizarse bien de acuerdo con requerimientos de aplicación más específicos. Por ejemplo, uno o más elementos del sistema podrían implementarse como sub-elementos dentro de un componente del sistema 100 (por ejemplo, dentro del sistema de comunicaciones 106) . El hardware personalizado podría también utilizarse y/o los elementos particulares podrían implementarse en hardware, software o ambos. Además, a pesar que la conexión a otros dispositivos de computación tales como dispositivos de entrada/salida en red (no mostrado) pueden utilizarse, se entiende que también pueden utilizarse conexiones cableadas, inalámbricas, por modem y/u otras conexiones a otros dispositivos de computación.
En un aspecto, el sistema puede comprender una base de datos que contienen características de las características de los biomarcadores del cáncer de pulmón. Los datos del biomarcador (o información del biomarcador) pueden utilizarse como una captura a la computadora para utilizarse como parte de un método implementado por computadora. Los datos del biomarcador pueden incluir los datos como se describe en la presente .
En un aspecto, el sistema además comprende uno o más dispositivos para proporcionar datos de entrada al uno o más procesadores.
El sistema además comprende una memoria para almacenar un grupo de datos de elementos de datos clasificados .
En otro aspecto, el dispositivo para proporcionar los datos de entrada comprende un detector para detectar las características del elemento de los datos, por ejemplo, tales como un espectrómetro de masas o un lector de un chip génico.
El sistema adicionalmente puede comprender un sistema de administración de base de datos. Las solicitudes o consultas del usuario pueden formatearse en un lenguaje apropiado entendido por el sistema de administración de la base de datos que procesa la consulta para extraer la información relevante de la base de datos de los grupos de entrenamiento .
El sistema puede ser capaz de conectarse a una red a la cual un servidor de red y uno o más clientes están conectados. La red puede ser una red de área local (LAN) o una red de área amplia (WAN, por sus siglas en inglés) , como se conoce en la técnica. Preferiblemente, el servidor incluye el hardware necesario para correr los productos de programa de computadora (por ejemplo, software) para acceder la base de datos para procesar las solicitudes del usuario.
El sistema puede incluir un sistema operativo (por ejemplo, UNIX o Linux) para ejecutar instrucciones del sistema de administración de la base de datos. En un aspecto, el sistema operativo puede operar en una red de comunicaciones global, tal como el internet, y utilizar un servidor de red de comunicaciones global para conectarse con tal red.
El sistema puede incluir uno o más dispositivos que comprenden una interface de despliegue gráfica que comprende elementos de interface tales como botones, menús desplazables hacia abajo, barras desplazables, campos para capturar texto y similares como se encuentra rutinariamente en las interfaces de usuario gráficas conocidas en la técnica. Las solicitudes capturadas en una interface de usuario pueden transmitirse a un programa de aplicación en el sistema para formatear la búsqueda para la información relevante en una o más de las bases de datos del sistema. Las solicitudes o consultas capturas por un usuario pueden construirse en cualquier lenguaje de base de datos adecuada.
La interface de usuario gráfica puede generarse a través de un código de interface de usuario gráfica como parte del sistema operativo y puede utilizarse para capturar datos y/o para desplegar los datos capturados. El resultado de los datos procesados puede desplegarse en una interface, imprimirse en una impresora en comunicación con el sistema, guardarse en un dispositivo de memoria, y/o transmitirse a través de la red o puede ser provisto en la forma de un medio legible por computadora.
El sistema puede estar en comunicación con un dispositivo de entrada para proporcionar datos con respecto a los elementos de los datos al sistema (por ejemplo, valores de expresión) . En un aspecto, el dispositivo de entrada puede incluir un sistema de perfilación de expresión génica incluyendo, por ejemplo, un espectrómetro de masas, un chip génico o un lector de arreglo, y similares.
Los métodos y aparatos para analizar la información del biomarcador de cáncer de pulmón de acuerdo con las varias modalidades pueden implementarse en cualquier forma adecuada, por ejemplo, utilizando un programa de computadora que opera en un sistema de computadora. Un sistema de computadora convencional comprende un procesador y una memoria de acceso aleatorio, tal como un servidor de aplicación remotamente accesible, un servidor en red, una computadora personal, o una estación de trabajo pueden utilizarse. Los componentes del sistema de computadora adicionales pueden incluir dispositivos de memoria o sistemas de almacenamiento de información, tales como un sistema de almacenamiento en masa y una interface de usuario, por ejemplo, un monitor convencional, un teclado y un dispositivo de rastreo. El sistema de computadora puede ser un sistema independiente o parte de una red de computadoras incluyendo un servidor y una o más bases de datos .
El sistema de análisis del biomarcador de cáncer de pulmón proporciona funciones y operaciones para un análisis completo de los datos, tales como la obtención de los datos, el procesamiento, análisis, el reporte y/o diagnóstico. Por ejemplo, en una modalidad, el sistema de computadora puede ejecutar el programa de computadora que puede recibir, almacenar, buscar, analizar y reportar información relacionada con los biomarcadores de cáncer de pulmón. El programa de computadora puede comprender múltiples módulos que llevan a cabo varias funciones u operaciones, tales como el módulo de procesamiento para el procesamiento de datos en bruto y generar datos suplementarios y un módulo de análisis para analizar los datos en bruto y datos complementarios para generar un estado y/o diagnóstico del cáncer de pulmón. El diagnóstico del estado del cáncer de pulmón puede comprender generar o recolectar cualquier otra información, incluyendo información biomédica adicional, con respecto a la condición del individuo con relación a la enfermedad, identificar si pueden ser deseables pruebas adicionales, o por el contrario evaluar el estado de salud del individuo.
Con referencia a la Figura 7, se puede ver un ejemplo de un método para utilizar una computadora de acuerdo con los principios de la modalidad descrita. En la Figura 7, se muestra una gráfica de flujo 3000. En el bloque 3004, la información del biomarcador puede obtenerse para un individuo. La información del biomarcador puede obtenerse de una base de datos de computadora, por ejemplo, después de que la prueba de la muestra biológica del individuo se lleva a cabo. La información del biomarcador puede comprende valores de biomarcador que cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores seleccionados de un grupo que consiste de los biomarcadores provistos en la Tabla 18, en donde N=2-36, Tabla 20, en donde N=2-25 o Tabla 21, en donde N=2-86. En el bloque 3008, se puede utilizar una computadora para clasificar cada uno de los valores del biomarcador. Y, en el bloque 3012, se puede hacer una determinación como la probabilidad de que un individuo tenga cáncer de pulmón con base en una pluralidad de clasificaciones. La indicación puede enviarse a una pantalla u otro dispositivo de indicación que es visible a través de una persona. De esta forma, por ejemplo, puede desplegarse en una pantalla de despliegue de una computadora u otro dispositivo de salida.
Haciendo referencia a la Figura 8, un método alternativo para utilizar una computadora de acuerdo con otra modalidad puede ilustrarse a través de una gráfica de flujo 3200. En el bloque 3204, una computadora puede utilizarse para obtener la información del biomarcador para un individuo. La información del biomarcador comprende un valor de biomarcador correspondiente a un biomarcador seleccionado del grupo de biomarcadores provistos en las Tablas 18, 20 ó 21. En el bloque 3208, se puede llevar a cabo la clasificación del valor del biomarcador con la computadora. Y, en el bloque 3212, se puede hacer una indicación como la probabilidad de que el individuo tenga cáncer de pulmón con base en la clasificación. La indicación puede enviarse a una pantalla u otro dispositivo de indicación de tal forma que es visible para una persona. De esta forma, por ejemplo, puede desplegarse en una pantalla de despliegue de una computadora u otro dispositivo de salida.
Algunas modalidades descritas en la presente pueden implementarse para así incluir un producto de programa de computadora. Un producto de programa de computadora puede incluir un medio legible por computadora que tiene un código de programa legible por computadora que se modaliza en el medio para causar que un programa de aplicación se ejecute en una computadora con una base de datos .
Como se utiliza en la presente, un "producto de programa de computadora" se refiere a un grupo organizado de instrucciones en la forma de afirmaciones de lenguaje natural o de programación que están contenidas en un medio físico de cualquier naturaleza (por ejemplo, escrito, electrónico, magnético, óptico o de otra forma) y que puede utilizarse con una computadora u otro sistema de procesamiento de datos automatizados. Tales órdenes de lenguaje de programación, cuando se ejecutan a través de una computadora o un sistema de procesamiento de datos, causan que la computadora o el sistema de procesamiento de datos actúen de acuerdo con el contenido particular de las órdenes. Los productos de programa de computadora incluyen sin limitación: programas en el código de origen y de objeto y/o pruebas o colecciones de datos embebidas en un medio legible por computadora. Además, el producto de programa de computadora que permite que un sistema de computadora o un dispositivo de equipo de procesamiento de datos actúe en formas pre-seleccionadas puede ser provisto en un número de formas, incluyendo, pero no limitándose a, un código de origen original, un código de ensamble, un código de objeto, un lenguaje de máquina, versiones codificadas o comprimidas de lo anterior y cualquiera y todos los equivalentes .
En un aspecto, un producto de programa de computadora es provisto para indicar la probabilidad de cáncer de pulmón. El producto de programa de computadora incluye un medio legible por computadora que modaliza un código de programa ejecutable a través de un procesador de un dispositivo o sistema de computación, el código de programa comprende: el código que obtiene los datos atribuidos a la muestra biológica de un individuo, en donde los datos comprenden los valores de los biomarcadores que cada uno corresponde a uno al menos N biomarcadores en la muestra biológica seleccionada del grupo de biomarcadores provistos en Tabla 18, en donde N=2-36, Tabla 20, en donde N=2-25 o Tabla 21, en donde N=2-86; y el código que ejecuta un método de clasificación que indica un estado de la enfermedad del pulmón del individuo como una función de los valores del biomarcador .
En aún otro aspecto, un producto de programa de computadora es provisto para indicar la probabilidad de cáncer de pulmón. El producto de programa de computadora incluye un medio legible por computadora que modaliza un código de programa ejecutable a través de un procesador de un dispositivo o sistema de computación, el código de programa comprende: el código que obtiene los datos atribuidos a la muestra biológica de un individuo, en donde los datos comprenden un valor de biomarcador correspondiente a un biomarcador en la muestra biológica seleccionad del grupo de biomarcadores provistos en Tabla 18, en donde N=2-36, Tabla 20, en donde N=2-25 o Tabla 21, en donde N=2-86; y el código que ejecuta un método de clasificación que indica el estado de la enfermedad del pulmón del individuo como una función de los valores del biomarcador.
A pesar de que varias modalidades han sido descritas como métodos o aparatos, se debe entender que las modalidades pueden implementarse a través de un código acoplado con una computadora, por ejemplo, un código residente en una computadora o accesible a través de la computadora. Por ejemplo, el software y las bases de datos podrían utilizarse para implementar muchos de los métodos explicados anteriormente. De esta forma, además de las modalidades obtenidas a través de hardware, también se observa que estas modalidades pueden obtenerse a través del uso de un artículo de fabricación comprendido de un medio utilizable en computadora que tiene un código de programa legible por computadora modalizado en el mismo, que causa la habilitación de las funciones descritas en esta descripción. Por consiguiente, se desea que las modalidades también se consideren protegidas a través de esta patente en sus medios de código de programa también. Además, las modalidades pueden modalizarse como un código almacenado en una memoria legible por computadora virtualmente de cualquier clase incluyendo, sin limitación, RAM, ROM, medio magnético, medio óptico, o medio magneto-óptico. Aún más generalmente, las modalidades podrían implementarse en software, o hardware, o en cualquier combinación de estas incluyendo, pero no limitándose a, a software corriendo en un procesador de propósito general, micro-código, PLAs o ASlCs.
También se visualiza que las modalidades podrían lograrse como señales de computadora modalizadas en una onda portadora, así como señales (por ejemplo, eléctrica y óptica, propagada a través de un medio de transmisión. De esta forma, los varios tipos de información explicados anteriormente podrían formatearse en una estructura, tal como una estructura de datos, y transmitirse como una señal eléctrica a través de un medio de transmisión o almacenarse en un medio legible por computadora.
También se observa que muchas de las estructuras, materiales y acciones recitadas en la presente pueden recitarse como medios para llevar a cabo una función o paso para llevar a cabo una función, por consiguiente, se debe entender que tal lenguaje se intitula para cubrir todas tales estructuras, materiales o acciones descritas dentro de esta especificación y sus equivalente, incluyendo la materia incorporada por referencia.
EJEMPLOS Los siguientes ejemplos son provistos para propósitos ilustrativos solamente y no pretenden limitar el alcance de la solicitud como se define por las reivindicaciones anexas. Todos los ejemplos descritos en la presente se llevaron a cabo utilizando técnicas estándar, que son bien conocidas y rutinarias para el experto en la técnica. Las técnicas de biología molecular rutinarias descritas en la técnica en los siguientes ejemplos pueden llevarse a cabo como se describe en los manuales de laboratorio estándar, tales como Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3a. ed. , Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., (2001) .
Ejemplo 1. Análisis de Aptámero Multiplexado de Muestras para la Selección del Biomarcador de Cáncer de Pulmón Este ejemplo describe el ensayo de aptámero múltiple utilizado para analizar las muestras y controles para la identificación de los biomarcadores definidos en la Tabla 1, Col. 2 (ver Figura 9) . En este caso, el análisis multiplexado utilizó 820 aptámeros, cada uno para un objetivo específico .
En este método, las puntas de las pipetas se cambiaron para cada adición de solución.
También, a menos que se indique lo contrario, la mayor parte de las transferencias de solución y las adiciones de lavado utilizaron un cabeza de 96 cavidades de un Beckman Biomek FxP. Los pasos del método manualmente medidos con pipeta utilizaron un Pipetteman P200 de doce canales (Rainin Instruments, LLC, Oakland, CA) , a menos que se indique lo contrario . Se preparó un regulador de pH referido como internamente, que comprende 40 mM de HEPES, 100 mM de NaCl, 5 mM de KC1 , 5 mM de MgCl2 , 1 mM de EDTA a un pH 7.5. Todos los pasos se llevaron a cabo a temperatura ambiente a menos que se indique lo contrario. 1. Preparación de la Solución Concentrada de Aptamero Para aptámeros sin enlazador de biotina foto-divisibles, se prepararon soluciones de aptámero concentradas convencionales para 10%, 1% y 0.03% de suero a una concentración de 8x en lx de SB17, 0.05% de Tween-20 con iniciadores biotinilados foto-divisibles, en donde la concentración del iniciador resultante fue 3 veces la concentración el aptámero relevante. Los iniciadores hibridaron todo o parte del aptámero correspondiente.
Cada una de las 3 soluciones de aptámero de 8x se diluyó de forma separada 1:4 en 1 x SB17, 0.05% de Tween-20 (1500 8x concentrada . en 4500 pg de 1 x SB17, 0.05% de Tween-20) para obtener una concentración de 2x. Cada mezcla maestra de aptámero diluida después se dividió, 1500 g cada una, en 4 tubos con tapa roscada de 2 mi y se llevaron a 95°C por 5 minutos, seguido por incubación a 37 °C por 15 minutos. Después de la incubación, los 4 tubos de 2 mi correspondientes a una mezcla maestra de aptámero particular se combinaron en un recipiente de reacción, y 55 ig de una mezcla de 2x de aptámero (para las tres mezclas) se midieron con pipeta en una placa Hybaid de 96 cavidades y la placa de selló con aluminio. El resultado final fue 3 placas Hybaid selladas con aluminio de 96 cavidades. La concentración de aptámero individual estuvo en el intervalo de 0.5-4 nM como se indica en la Tabla 2. 2. Preparación de la Muestra de Ensayo Las alícuotas congeladas de 100% de suero, se almacenaron a -80°C, y colocaron en un baño de agua a 25°C por 10 minutos. Las muestras descongeladas se colocaron sobre hielo, se sometieron a un vórtice ligero (fijado en 4) por 8 segundos y después se volvieron a colocar en hielo.
Se preparó una solución de muestra de 20% transfiriendo 16 pg de la muestra utilizando una pipeta de 8. canales de extensión de 50 pg en las placas Hybaid de 96 cavidades, cada cavidad con un contenido de 64 g del diluyente de muestra apropiado a 4°C (0.8 x SB17, 0.05% de Tween-20, 2 µ? de bloque_2-Z, 0.6 mM de MgCl2 para suero). Esta placa se almacenó en hielo hasta iniciar los siguientes pasos de la dilución de la muestra.
Para iniciar el equilibrio de la muestra y el aptámero, la placa con 20% de la muestras se centrifugó brevemente y se colocó en el Beckman FX en donde se mezcló midiendo con pipeta verticalmente con la pipeta de 96 cavidades. Después de preparó una muestra de 2% mediante la dilución de 10 g de la muestra de 20% en 90 µg de 1 x SB17, 0.05% de Tween-20. Enseguida, la dilución de 6 µg de la muestra de 2% resultante en 94 g de 1 x SB17, 0.05% de Tween-20 formó una placa de muestra de 0.06%. Las diluciones se hicieron en el Beckman Biomek FxP . Después de cada transferencia, las soluciones se mezclaron midiendo con pipeta verticalmente. Las 3 placas de dilución de muestra después se transfirieron a sus soluciones de aptámero correspondientes mediante la adición de 55 pg de la muestra a 55 de la mezcla de 2x de aptámero apropiadas. Las soluciones de muestra y aptámero se mezclaron en un robot midiendo con pipeta verticalmente. 3. Unión de Equilibrio de la Muestra Las placas de muestra/aptámero se sellaron con aluminio y colocaron en una incubadora a 37 °C por 3.5 horas antes de proceder el paso de Captura 1. 4. Preparación de la placa de perlas de Captura 2 Se lavó una alícuota de 11 mi de perlas Estreptavidina Cl MyOne (Invitrogen Corp. , Carlsbad, CA) 2 veces con volúmenes iguales de 20 mM de NaOH (5 minutos de incubación para cada lavado) , 3 veces con volúmenes iguales de lx de SB17, 0.05% de Tween-20 y se volvió a suspender en 11 mi lx de SB17, 0.05% de Tween-20. Utilizando una pipeta multicanal de 12 canales de extensión, se midieron con pipeta manualmente 50 pg de esta solución en cada cavidad de una placa Hybaid de 96 cavidades. La placa después se cubrió con aluminio y se almacenó a 4°C para utilizarse en el ensayo. 5. Preparación de placas de perlas de Captura 1 Se equilibraron tres placas Millipore HV de 0.45 m (membrana Durapore, Cat# MAHVN4550) con 100 g de lx de SB17, 0.05% de Tween-20 durante al menos 10 minutos. El regulador de pH de equilibrio después se filtró a través de la placa y se agregaron 133.3 g de una lechada de perlas de 7.5% de Estreptavidina-agarosa (en lx de SB17, 0.05% de Tween-20) en cada cavidad. Para mantener las perlas de estreptavidina-agarosa suspendidas mientras se transferían a la placa de filtro, la solución de perlas se mezcló manualmente con una pipeta de 12 canales de 200 g 15 veces. Después de distribuir las perlas a través de las 3 placas de filtro, se aplicó vacío para remover el sobrenadante de las perlas. Finalmente, las perlas se lavaron en las placas de filtro con 200 µg de lx de SB17, 0.05% de Tween-20 y después se volvieron a suspender en 200 g lx de SB17, 0.05% de Tween-20. Los fondos de las placas de filtro se secaron y las placas se almacenaron para utilizarse en el ensayo. 6. Carga de Cytomat El cytomat se cargó con todas las puntas, placas, todos los reactivos en recipientes (excepto el reactivo NHS-biotina que se preparó fresco justo antes de la adición a las placas) , 3 placas de filtro de captura 1 y se preparó 1 placa MyOne . 7. Captura 1 Después de un tiempo de equilibrio de 3.5 horas, las placas de muestra/aptámero se removieron de la incubadora, se centrifugaron durante aproximadamente 1 minuto, se removió el aluminio, y se colocaron en la plataforma del Beckman Biomek FxP . El programa Beckman Biomek FxP se inició. Todos los pasos posteriores en la Captura 1 se realizaron mediante el robot Beckman Biomek FxP a menos que se indique lo contrario. Dentro del programa, se aplicó vacío a las placas de filtro de Captura 1 para remover el sobrenadante de las perlas. Se agregaron cien microlitros de cada una de las reacciones de equilibrio de 10%, 1% y 0.03% a sus placas de filtración de Captura 1 respectivas, y cada placa se mezcló utilizando un agitador orbital sobre la plataforma a 800 rpm por 10 minutos.
La solución no unida se removió mediante filtración al vacío. Las perlas de la captura 1 se lavaron con 190 \xg de 100 µ? de biotina en lx de SB17, 0.05% de Tween-20 seguido por 190 pg de lx de SB17, 0.05% de Tween-20 suministrando la solución e inmediatamente succionando el vacío para filtrar la solución a través de la placa.
Después, se agregaron 190 µg de lx de SB17, 0.05% de Tween-20 a las placas de Captura 1. Las placas se secaron para eliminar las gotículas utilizando una estación de secado sobre la plataforma y después incubando con agitadores orbitales a 800 rpm por 10 minutos a 25 °C.
El removió este lavado mediante filtración al vacío y secó el fondo de la placa de filtro para remover las gotículas utilizando una estación de secado sobre la plataforma . 8. Marcación Se descongeló una alícuota de NHS-PE04 -biotina a 37°C por 6 minutos y después se diluyó a 1:100 con regulador de pH de marcación (SB17 a pH=7.25 0.05% de Tween-20). El reactivo de NHS-PE04 -biotina se disolvió a una concentración de 100 mM en DMSO anhidro y se había mantenido almacenado congelado a -20 °C. Después de impulsar el robot, el reactivo de NHS-PE04 -biotina diluido se agregó manualmente al recipiente sobre la plataforma y el programa del robot se reinició manualmente para suministrar 100 g de NHS-PE04-biotina en cada cavidad de cada placa de filtro de Captura 1. Esta solución se dejó incubar con las perlas de Captura 1 agitando a 800 rpm por 5 minutos en los agitadores orbitales. 9. Reto Cinético y Foto-división La reacción de marcación se extinguió por la adición de 150 xg de 20 mM de glicina en lx de SB17, 0.05% de Tween-20 a las placas de la Captura 1 mientras aún contenían la etiqueta NHS . Las placas después se incubaron por 1 minuto en agitadores orbitales a 800 rpm. La solución de NHS-etiqueta/glicina se removió mediante filtración al vacío. Después se agregaron 190 pg de 20 mM de glicina (lx de SB17, 0.05% de Tween-20) a cada placa y se incubaron por 1 minuto en agitadores orbitales a 800 rpm antes de la remoción por filtración al vacío.
Se agregaron 190 g de lx de SB17, 0.05% de Tween-20 a cada palca y se removieron por filtración al vacío.
Las cavidades de las placas de Captura 1 posteriormente se lavaron tres veces mediante la adición de 190 g de lx de SB17, 0.05% de Tween-20, colocando las placas en agitadores orbitales por 1 minuto a 800 rpm seguido por filtración al vacío. Después del último lavado las placas se colocaron en la parte superior de una placa de cavidad profunda de 1 mi y se removieron de la plataforma. Las placas de la Captura 1 se centrifugaron a 1000 rpm por 1 minuto para remover tanto volumen extraño de las perlas de agarosa antes de la dilución como fue posible.
Las placas se colocaron de nuevo sobre el Beckman Biomek FxP y se agregaron 85 g de 10 mM de DxS04 en lx de SB17, 0.05% de Tween-20 a cada cavidad de las placas de filtro .
Las placas de filtro se removieron de la plataforma, se colocaron cobre el Termo-agitador Variomag (Thermo' Fisher Scientific, Inc., altham, MA) bajo fuentes de luz BlackRay (Ted Pella, Inc., Redding, CA) , y se irradiaron por 10 minutos con agitación a 800 rpm.
Las soluciones foto-divididas se eluyeron secuencialmente de cada placa de Captura 1 en una placa de cavidad profunda primero colocando la placa de filtro con 10% de Captura 1 en la parte superior de una placa de cavidad profunda de 1 mi y se centrifugando a 1000 rpm por 1 minuto. Las placas de captura 1 de 1% y 0.03% después se centrifugaron secuencialmente en la misma placa de cavidad profunda. 10. Captura de perlas de la Captura 2 El bloque de cavidades profundas de 1 mi conteniendo los eluatos combinados de la captura 1 se colocaron en una plataforma del Beckman Biomek FxP para la captura 2.
El robot transfirió todos los eluatos foto-divididos de la placa de cavidad profunda de 1 mi en la placa Hybaid conteniendo las perlas magnéticas MyOne de la Captura 2 previamente preparadas (después de la remoción del regulador de pH MyOne a través de separación magnética) .
Las soluciones se incubaron con agitación a 1350 rpm por 5 minutos a 25 °C en un Termo-agitador Variomag (Thermo Fisher Scientific, Inc., Waltham, A) .
El robot transfirió la placa a una estación de separación magnética en la plataforma. La placa se incubó en el imán por 90 segundos antes de la remoción y el descarte del sobrenadante . 11. Lavados con glicerol al 30%, 37 °C La placa de la captura 2 se movió a un agitador térmico sobre la plataforma y se transfirieron 75 g de lx de SB17, 0.05% de Tween-20 a cada cavidad. La placa se mezcló por 1 minuto a 1350 rpm y 37 °C para volver a suspender y calentar las perlas. Se transfirieron a cada cavidad de la placa de la captura 2, 75 g de 60% de. glicerol a 37 °C y la placa continuó mezclándose por otro minuto a 1350 rpm y 37°C. El robot transfirió la placa al separador magnético a 37°C en donde se incubó en el imán por 2 minutos y después el robot removió y descartó el sobrenadante. Estos lavados se repitieron dos veces más .
Después de la remoción del tercer lavado con 30% de glicerol de las perlas de la captura 2, se agregaron 150 g de lx de SB17, 0.05% de Tween-20 a cada cavidad y se incubaron a 37 °C, agitando a 1350 rpm por 1 minuto, antes de la remoción por separación magnética en el imán a 37 °C.
Las perlas de la captura 2 se lavaron una vez final utilizando 150 g de lx de SB19, 0.05% de Tween-20 con incubación por 1 minuto con agitación a 1350 rpm, antes de la separación magnética. 12. Elución y Neutralización de las Perlas de la Captura 2 Los aptámeros se eluyeron de las perlas de la captura 2 mediante la adición de 105 pg de 100 mM de CAPSO con 1 M de NaCl, 0.05% de Tween-20 a cada cavidad. Las perlas se incubaron con esta solución con agitación a 1300 rpm por 5 minutos.
La placa de la captura 2 después se colocó sobre el separador magnético por 90 segundos antes de la transferencia de 90 g del eluato a una nueva placa de 96 cavidades que contiene 10 g de 500 mM de HC1, 500 mM de HEPES, 0.05% de Tween-20 en cada cavidad. Después de la transferencia, la solución se mezcló robóticamente midiendo con pipeta 90 g verticalmente cinco veces. 13. Hibridación El Beckman Biomek FxP transfirió 20 g del eluato de captura 2 neutralizado a una placa Hybaid fresca, y se agregaron 5 g de lOx de Bloque Agilent, conteniendo un lOx de un pico de controles de hibridación a cada cavidad. Después, se midieron con pipeta manualmente 25 pg de 2x de regulador de pH de Hibridación Agilent para cada cavidad der la placa que contiene las muestras neutralizadas y regulador de pH de bloqueo y la solución se mezcló midiendo con pipeta manualmente 25 g verticalmente 15 veces lentamente para evitar la formación extensiva de burbujas. La placa se centrifugó a 1000 rpm por 1 minuto.
Se colocó un portaobjetos de empaque en una cámara de hibridación Agilent y se midieron con pipeta 40 pg de cada una de las muestras conteniendo la solución de hibridación y bloque en cada empaque. Se utilizó una pipeta de extensión variable de 8 canales en una forma prevista para minimizar la formación de burbujas. Los portaobjetos de micro-arreglo Agilent comunes (Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) , con su Número de Código de Barras orientado hacia arriba, después se hicieron descender lentamente sobre los portaobjetos de empaque (ver el manual de Agilent para una descripción detallada) .
La parte superior de las cámaras de hibridación se colocaron sobre el emparedado de portaobjetos/respaldo y se sujetaron con abrazaderas deslizadas sobre el ensamble completo. Estos ensambles se sujetaron fuertemente girando los tornillos firmemente.
, Cada emparedado de portaobjetos/portaobjeto de respaldo se inspeccionó visualmente para asegurar que las burbujas de la solución se movieran libremente dentro de la muestra. Si las burbujas no se mueven libremente, el ensamble de la cámara de hibridación se agitó lentamente para desacoplar las burbujas alojadas cerca del empaque.
Las cámaras de hibridación ensambladas se incubaron en un horno de hibridación Agilent por 19 horas a 60 °C girando a 20 rpm. 14. Lavado Post-hibridación Se colocaron aproximadamente 400 mi de Regulador de pH de Lavado Agilent 1 en cada uno de los dos platos de tinción de vidrio separados. Uno de los platos de tinción se colocó en una placa de agitación magnética y un soporte de portaobjetos y una barra de agitación se colocaron dentro del regulador de pH.
Se preparó un plato de tinción para el Lavado 2 Agilent colocando una barra de agitación dentro del plato de tinción de vidrio vacío.
Se colocó a un lado un cuarto plato de tinción de vidrio para el lavado con acetonitrilo final.
Cada una de las seis cámaras de hibridación se desensambló. Uno por uno, los emparedados de portaobjetos/respaldo se removieron de su cámara de hibridación y se sumergieron dentro del plato de tinción conteniendo el Lavado 1. El emparedado de portaobjetos/respaldo se abrió forzadamente con un par de pinzas, mientras aún estaba sumergido en el portaobjetos del micro-arreglo. El portaobjetos se transfirió rápidamente en el soporte del portaobjetos en el plato de tinción del Lavado 1 en la placa de agitación magnética.
El soporte del portaobjetos se enjuagó ligeramente y se redujo 5 veces. El agitador magnético se cambió a una configuración baja y los portaobjetos se incubaron 5 minutos.
Cuando restaba 1 minuto para el Lavado 1, se agregó el Regulador de pH 2 del Lavado precalentado a 37 °C en una incubadora al segundo plato de tinción preparado. El soporte del portaobjetos se transfirió rápidamente al Regulador de pH 2 de Lavado y cualquier exceso de regulador de pH en el fondo del soporte se removió raspándolo en la parte superior del plato de tinción. El soporte del portaobjetos se enjuagó ligeramente y se redujo 5 veces. El agitador magnético se enjuagó ligeramente y redujo 5 veces. El agitador magnético se cambió a una configuración baja y los portaobjetos se incubaron por 5 minutos.
El soporte del portaobjetos se extrajo lentamente del Lavado 2, tomando aproximadamente 15 segundos para remover los portaobjetos de la solución.
Con un minuto restante en el Lavado 2, se agregó acetonitrilo (ACN) al cuarto plato de tinción. El soporte del portaobjetos se transfirió al plato de tinción con acetonitrilo. El soporte del portaobjetos se enjuagó ligeramente y se redujo 5 veces. El agitador magnético se cambió a una configuración baja y los portaobjetos se incubaron por 5 minutos.
El soporte del portaobjetos se extrajo lentamente del plato de tinción ACN y se colocó en una toalla absorbente. Los bordes del fondo de los portaobjetos se secaron rápidamente y el portaobjetos se colocó en una caja de portaobjetos limpia. 15. Foto-recepción del Micro-arreglo Los portaobjetos del micro-arreglo se colocaron dentro de los soportes de portaobjetos del escáner Agilent y se cargaron en el escáner de Micro-arreglo Agilent de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Los portaobjetos procesaron gráficamente en el canal Cy3 a 5 µp\ de resolución en la configuración PMT al 100% y se habilitó la opción XRD a 0.05. Las imágenes tiff resultantes se procesaron utilizando el software de extracción de características Agilent, versión 10.5.
Ejemplo 2. Identificación del Biomarcador La identificación de los biomarcadores de cáncer de pulmón potenciales se llevó a cabo para tres diferentes aplicaciones de diagnóstico, el diagnóstico de nodulos sospechosos de la exploración CT, la clasificación de fumadores asintomáticos para cáncer de pulmón, y el diagnóstico de un individuo con cáncer de pulmón. Se recolectaron muestras de suero de cuatro diferentes sitios en soporte para estas tres aplicaciones, e incluyeron 48 casos NSCLC, 218 controles de alto riesgo compuestos de fuertes fumadores y pacientes con nodulos benignos. El ensayo de afinidad de aptámero multiplexado como se describe en el Ejemplo 1 se utilizó para medir y reportar el valor RFU para 820 analitos en cada una de estas 264 muestras. La prueba S después se aplicó a cada analito. La distancia KS (estadística Kolmogorov-Smirnov) entre los valores de dos grupos de muestras es una medición no paramétrica del grado al cual la distribución empíri.ca de los valores de un grupo (Grupo A) difiere de la distribución de valores del otro grupo (Grupo B) . Para cualquier valor de un umbral T alguna proporción de los valores del Grupo A será menor de T, y alguna proporción de los valores de Grupo B será menor que T. La distancia KS mide la diferencia máxima (sin asignar) entre la proporción de los valores de dos grupos de cualquier selección de T.
Los grupos de biomarcadores pueden utilizarse para construir clasificadores que asignan muestras a ya sea un grupo de control o enfermo. De hecho, muchos de tales clasificadores se produjeron de estos grupos de biomarcadores y se determinó la frecuencia con la cual cualquier biomarcador se utilizó en clasificadores con buena puntuación. Esos biomarcadores que aparecieron más frecuentemente entre los clasificadores de puntuación superior estuvieron los más útiles para crear una prueba de diagnóstico. En este ejemplo, los clasificadores Bayesianos se utilizaron para explorar el espacio de clasificación pero pueden utilizarse muchas otras técnicas de aprendizaje supervisado para este propósito. La adaptación de la puntuación de cualquier clasificador individual se calibró utilizando el área bajo la curva característica operativa del receptor (AUC of ROC) del clasificador en la superficie Bayesiana asumiendo una prevalencia de la enfermedad de 0.5. Esta métrica de puntuación varía de cero a uno, uno siendo un clasificador sin error. Los detalles de la construcción de un clasificador Bayesiano de las mediciones de la población de biomarcadores se describen en el Ejemplo 3.
Ejemplo 3. Clasificación Bayesiana Sin Experiencia de Cáncer de Pulmón De la lista de biomarcadores identificados como útiles para la discriminación entre el grupo con NSCLC y el de control de alto riesgo, se seleccionó un panel de cinco biomarcadores y se construyó un clasificador Bayes sin experiencia, ver Tabla 14. Las funciones de densidad de probabilidad dependientes de la clase (pdf) , p(x¡ \ c) y p(x¡ \ , en donde x¡ es el log para el valor RFU medido para el biomarcador i , y c y d se refieren a las poblaciones de control y de enfermedad, se modelaron como funciones de distribución normales caracterizadas por una media µ y una variación s2 . Los parámetros para los pdf de los cinco biomarcadores se enumeran en la Tabla 15 y un ejemplo de los datos en bruto junto con la adaptación del modelo a un pdf normal se despliegan en la Figura 5. La suposición subyacente parece que se adapta a los datos bastante bien como se demuestra en la Figura 5.
La clasificación Bayes sin experiencia de tal modelo se da por medio de la siguiente ecuación, en donde P(d) es la prevalencia de la enfermedad en la población apropiada para la prueba y n=5 aquí . Cada uno de los términos en la suma es una proporción de probabilidad log para un marcador individual y la proporción de probabilidad log total de una muestra estando libre de la enfermedad de interés (es decir, en este caso, NSCLC) frente a tener la enfermedad es simplemente la suma de esto términos individuales más un término que representa la prevalencia de la enfermedad. Para simplicidad, se asume que P(d) = 0.5 de tal forma que Dada una medición de muestra desconocida en log(RFU) para cada uno de los diez biomarcadores de x . Los componentes individuales que comprenden la probabilidad log para la clase de control frente a la enfermedad se tabularon y pueden calcularse de los parámetros de la Tabla 15 y los valores de x . La suma de las proporciones de probabilidad log individuales es 3.47, o una probabilidad de estar libre de la enfermedad frente a la enfermedad de 32:1, en donde la probabilidad = e3'47 = 32. Los cinco biomarcadores todos consistentemente se encontraron a favor del grupo de control. La multiplicación de las probabilidades juntas da los mismos resultados como los mostrados anteriormente; una probabilidad de 32:1 de que la muestra desconocida está libre de la enfermedad. De hecho esta muestra viene de la población de control en el grupo de entrenamiento. Aunque este ejemplo demuestra la clasificación de muestras séricas utilizando los biomarcadores en la Tabla 15, se puede utilizar el mismo método en cualquier tipo de tej ido con cualquier grupo de biomarcadores de la Tabla 21.
Ejemplo 4. Algoritmo Avido para la Selección de los Paneles del Biomarcador para Clasificadores Parte 1 Este ejemplo describe la selección de biomarcadores de la Tabla 21 para formar paneles que pueden utilizarse como clasificadores en cualquiera de los métodos descritos en la presente. Los paneles de biomarcadores que contienen MMP-12 y los Sub-grupos de los biomarcadores en la Tabla 21 se seleccionaron para construir clasificadores con buen funcionamiento. Este método también se utilizó para determinar que marcadores potenciales se incluyen como biomarcadores en el Ejemplo 2.
La medición del funcionamiento del clasificador utilizada en la presente es el área bajo la curva ROC (AUC) ; un funcionamiento de 0.5 es la expectativa de la línea base para un clasificador aleatorio (lanzamiento de moneda) , un clasificador peor que el aleatorio tendría una puntuación entre 0.0 y 0.5, un clasificador con mejor funcionamiento que el aleatorio tendría una puntuación de entre 0.5 y 1.0. Un clasificador perfecto sin errores tendría una sensibilidad de 1.0, una especificidad de 1.0 y una AUC de 1.0. Se pueden aplicar los métodos descritos en el Ejemplo 4 a otras mediciones comunes de funcionamiento tales como la medición F, la suma de la sensibilidad y especificidad, o el producto de la sensibilidad y especificidad. Específicamente se podrían desear tratar la especificidad y la especificidad con diferentes pesos, tal como para seleccionar aquellos clasificadores que funcionan con mayor especificidad a expensas de alguna sensibilidad, o para seleccionar aquellos clasificadores que funcionan con mayor sensibilidad a expensas de algo de especificidad. Ya que el método descrito en la presente solamente involucra una medición del "funcionamiento", cualquier esquema de ponderación que da como resultado una sola medición del funcionamiento puede utilizarse. Las diferentes aplicaciones tendrán diferentes beneficios para hallazgos verdaderos positivos y verdaderos negativos, y también diferentes costos asociados con hallazgos falsos positivos de hallazgos falsos negativos. Por ejemplo, la clasificación de fumadores asintomáticos y el diagnóstico diferencial de nódulos benignos encontrados en CT en general no tendrán el mismo intercambio óptimo entre la especificidad y sensibilidad. Las diferentes demandas de las dos pruebas en general requerirán configurar diferentes ponderaciones para clasificaciones erróneas positivas y negativas, reflejadas en la medición del funcionamiento. El cambio en la medición del funcionamiento en general cambiará el sub-grupo exacto de marcadores seleccionado de la Tabla 21 para un grupo de datos dado.
Para el método Bayesiano para la discriminación de muestras de cáncer de pulmón de muestras de control descritas en el Ejemplo 3, el clasificador de parametrizó completamente mediante las distribuciones de los biomarcadores en las muestras de entrenamiento con enfermedad y benignas, y la lista de biomarcadores se seleccionó de la Tabla 21; es decir, el sub-grupo de marcadores seleccionado para la inclusión determinó un clasificador en una forma de uno a uno dado un grupo de datos de entrenamiento .
El método ávido utilizado en la presente se utilizó para la búsqueda del sub-grupo óptimo de marcadores de la Tabla 21. Para pequeños números de marcadores o clasificadores con relativamente pocos marcadores, cada posible sub—grupo de marcadores se enumeró y evaluó en términos del funcionamiento del clasificador construido con ese grupo particular de marcadores (ver Ejemplo 4, Parte 2). (Este método es bien conocido en el campo de las estadísticas como "selección del mejor sub-grupo" ver, por ejemplo, The Elements of Statistical Learning - Data Mining, Inference, y Prediction, T. Hastie, y otros, editores, Springer Science+Business Media, LLC, 2a. edición, 2009). Sin embargo, para los clasificadores descritos en la presente, el número de combinaciones de múltiples marcadores puede ser muy grande, y no fue factible evaluar cada grupo de cinco marcadores posible, por ejemplo, de la lista de 86 marcadores (Tabla 21) (es decir, 34,826,302 combinaciones). Debido a que la falta de sentido práctico de la búsqueda a través de cada sub-grupo de marcadores, el sub-grupo óptimo individual puede no encontrarse; sin embargo, al utilizar este método, se encontraron muchos sub-grupos excelentes, y, en muchos casos, cualquiera de estos sub-grupos puede representar uno óptimo.
En lugar de evaluar cada posible grupo de marcadores, puede seguirse un método por pasos contiguos "ávido" (ver, por ejemplo, Dabney AR, Storey JD (2007) Optimality Driven Nearest Centroid Classification from Genomic Data. PLoS ONE 2(10): el002. doi : 10.1371/journal .pone .0001002) . Utilizando este método, se inicia un clasificador con el mejor marcador individual (con base en la distancia KS para los marcadores individuales) y se hace crecer en cada paso tratando, a su vez, cada miembro de una lista de marcadores que actualmente no es un miembro del grupo de marcadores en el clasificador. El marcador con la mejor puntuación en combinación con el clasificador existente se agrega al clasificador. Esto se repite hasta ya no se obtiene ninguna mejora en el funcionamiento. Desafortunadamente, este método puede pasar por alto combinaciones variables de marcadores para los cuales algunos de los marcadores individuales no se seleccionan para nada antes de detener el proceso.
El procedimiento ávido utilizado en la presente no fue una elaboración del método por pasos contiguo precedente, en que, para ampliar la búsqueda, en lugar de mantener solo un clasificador candidato individual (sub-grupo de marcadores) en cada paso, se mantuvo una lista de clasificadores candidato. La lista se pobló con cada sub-grupo de marcadores individuales (utilizando cada marcador en la tabla por sí mismo) . La lista se expandió en pasos derivando nuevos clasificadores (sub-grupos de marcadores) de los actualmente en la lista y agregándolos a la lista. Cada sub-grupo de marcadores actualmente en la lista se extendió por la adición de cualquier marcador de la Tabla 1 que no era ya parte de ese clasificador, y que, con esta adición, no se duplicaría con un sub-grupo existente (estos se denominan "marcadores permisibles"). Cada sub-grupo de marcadores existente se extendió a través de cada marcador permisible de la lista. Claramente, tal proceso eventualmente generaría cada posible sub-grupo, y a lista no tendría espacio. Por consiguiente, todos los clasificadores generados se mantuvieron solamente mientras la lista fue menor de algún tamaño predeterminado (por lo general lo suficiente para llevar los tres sub-grupos de marcadores) . Una vez que la lista llegó al límite tamaño predeterminado, se hizo elitista; es decir, solamente aquellos clasificadores que mostraron un cierto nivel de funcionamiento se mantuvieron en la lista, y los otros fueron mandados hasta el final de la lista y se perdieron. Esto se logró manteniendo la lista clasificada en el orden del funcionamiento del clasificador; los nuevos clasificadores que fueron al menos buenos como el peor de los clasificadores actualmente en la lista se insertaron, forzando la expulsión de los sub-archivados en el fondo actualmente. Un detalle de implementacion más es que la lista se reemplazó completamente en cada paso de generación; por consiguiente, cada clasificador en la lista tuvo el mismo número de marcadores, y en cada paso el número de marcadores por clasificador aumentó por uno.
Ya que este método produjo una lista de clasificadores candidato utilizando diferentes combinaciones de marcadores, se puede cuestionar si los clasificadores pueden combinarse en orden para evitar errores que podrían hacerse a través del mejor clasificador individual, o por grupos minoritarios de lo mejores clasificadores. Tales métodos de "ensamble" y "comité de expertos" son bien conocidos en los campos de las estadísticas y la máquina de aprendizaje e incluyen, por ejemplo, "promediar", "votar", "aplicar", "capturar" e "impulsar" (ver por ejemplo, The Elements of Statistical Learning - Data Mining, Inference, y Prediction, T. Hastie, y otros, editores, Springer Science+Business Media, LLC, 2a. edición, 2009). Estas combinaciones de clasificadores simples proporciona un método para reducir la variación en las clasificaciones debido al ruido en cualquier grupo de marcadores particular mediante la inclusión de varios diferentes clasificadores y por lo tanto información de un grupo mayor de los marcadores de la tabla de biomarcadores , efectivamente promediando entre los clasificadores. Un ejemplo de la utilidad de este método es que puede prevenir que los externos a un marcador individual afecten adversamente a clasificación de una muestra individual. El requerimiento para medir un mayor número de señales puede ser impráctico en ensayos de anticuerpo convencionales de "un marcador a la vez" pero no tiene un lado negativo para un ensayo de aptámero completamente multiplexado. Las técnicas como estas se benefician de una tabla más extensiva de biomarcadores y el uso de las múltiples fuentes de información concernientes a los procesos de la enfermedad para proporcionar una clasificación más robusta.
Parte 2 Los biomarcadores seleccionados en la Tabla 1 dan origen a clasificadores que funcionan mejor que los clasificadores construido con "no marcadores" (es decir, proteínas que tienen señales que no cumplen con el criterio para la inclusión en la Tabla 1 (como se describe en el Ejemplo 2) ) .
Para clasificadores que contienen solamente uno, dos, y tres marcadores, todos los posibles clasificadores obtenidos utilizando los biomarcadores en la Tabla 1 fueron enumerados y examinados para la distribución del funcionamiento comparados con los clasificadores construidos de una tabla similar de señales no de marcador aleatoriamente seleccionadas .
En las Figuras 17A-17C y las Figuras 18A-18C, la suma de la sensibilidad y la especificidad se utilizó como la medición del funcionamiento; un funcionamiento de 1.0 es la expectativa de la línea base para un clasificador aleatorio (lanzamiento de moneda) . El histograma del funcionamiento del clasificador se comparó con el histograma del funcionamiento de una enumeración exhaustiva similar de clasificadores construidos de una tabla de "no marcadores" de 40 señales no de marcador; las 40 señales se seleccionaron aleatoriamente de 400 aptámeros que no demostraron señalización diferencia entre las poblaciones de control y con enfermedad (distancia KS < 1.4) .
Las Figuras 17A-17B muestran histogramas del funcionamiento de todos los posibles clasificadores de uno, dos y tres marcadores construidos de los parámetros del biomarcador en la Tabla 13 para biomarcadores que pueden discriminar entre nodulos benignos y NSCLC y comprara estos clasificadores con todos los posibles clasificadores de uno, dos y tres marcadores construidos utilizando las 40 señales RFU de aptámero "no de marcador" . La Figura 17A muestra los histogramas del funcionamiento del marcador individual del clasificador, la Figura 17B muestra el histograma del funcionamiento de dos marcadores del clasificador, y la Figura 17C muestra el histograma del funcionamiento de tres marcadores del clasificador.
En las Figuras 17A-17B, las líneas sólidas representan los histogramas del funcionamiento del clasificador de todos, los posibles clasificadores de uno, dos y tres marcadores utilizando los datos del biomarcador data para nodulos benignos y NSCLC en la Tabla 13. Las líneas punteadas son los histogramas del funcionamiento del clasificador de todos los posibles clasificadores de uno, dos y tres marcadores utilizando los datos de nodulos benignos y NSCLC pero utilizando el grupo de señales no de marcador aleatorias .
Las Figuras 18A-18C muestran histogramas del funcionamiento de todos los posibles clasificadores de uno, dos y tres marcadores construidos de los parámetros del biomarcador en la Tabla 12 para biomarcadores que pueden discriminar entre fumadores asintomáticos y NSCLC y comprara estos con todos los posibles clasificadores de uno, dos y tres marcadores construidos utilizando el funcionamiento del clasificador de un solo marcador, la Figura 18B muestra el histograma del funcionamiento del clasificador de dos marcadores, y la Figura 18C muestra el histograma del funcionamiento del clasificador de tres marcadores.
En las Figuras 18A-18C, las líneas sólidas representan el histograma los histogramas del funcionamiento del clasificador de todos los clasificadores de uno, dos o tres marcadores utilizando los parámetros del biomarcador para fumadores asintomáticos y NSCLC en la Tabla 12. Las lineas punteadas son los histogramas del funcionamiento del clasificador de todos los clasificadores de uno, dos o tres marcadores utilizando los datos para fumadores asintomáticos y NSCLC pero utilizando el grupo de las señales no de marcador aleatorios .
Los clasificadores construidos de los marcadores enumerados en la Tabla 1 forman un histograma diferente, bien separado de los clasificadores construidos con señales de los "no-marcadores" para todas las comparaciones de un marcador, dos marcadores, y tres marcadores. El funcionamiento y puntuación AUC de los clasificadores construidos de los biomarcadores en la Tabla 1 también aumenta más rápido con el número de marcadores que lo que hacen los clasificadores construidos de no-marcadores, la separación aumenta entre los clasificadores de marcador y no marcador como el número de marcadores por clasificador aumenta. Todos los clasificadores construidos utilizando los biomarcadores enumerados en las Tablas 38 y 39 funcionan distintivamente mejor que los clasificadores construidos utilizando los "no-marcadores" .
Parte 3 Para ensayar si un sub-grupo de puntuaciones de lo marcadores representa un buen funcionamiento de los clasificadores, la mitad de los marcadores se hicieron descender de las listas de biomarcadores en las Tablas 38 y 39. El funcionamiento, según medido por la sensibilidad más la especificidad, de los clasificadores para distinguir nodulos benignos de nodulos malignos descendió ligeramente en 0.07 (de 1.74 a 1.67), y el funcionamiento de los clasif cadores para distinguir fumadores que tuvieron cáncer de los que no, también disminuyó ligeramente en 0.06 (de 1.76 a 1.70) . La implicación de las características del funcionamiento de los sub-grupos de la tabla del biomarcador es que múltiples sub-grupos de los biomarcadores enumerados son efectivos en la construcción de una prueba de diagnóstico, y ningún sub-grupo central particular de marcadores dicta el funcionamiento del clasificador.
En vista de estos resultados, los clasificadores que se excluyen de los mejores marcadores de las Tablas 12 y 13 se ensayaron. Las Figuras 19a-19B comparan el funcionamiento de los clasificadores construidos con la lista completa de biomarcadores en las Tablas 12 y 13 con el funcionamiento de los clasificadores construidos con un grupo de biomarcadores de las Tablas 38 y 39 los marcadores clasificados principales.
Las Figuras 19a- 19B demuestran que los clasificadores construidos sin los mejores marcadores, funcionan bien, implicando que el funcionamiento de los clasificadores no fue debido a algún pequeño grupo central de marcadores y que los cambios en los procesos subyacentes asociados con la enfermedad se reflejan en las actividades de muchas proteínas . Muchos sub-grupos de los biomarcadores en la Tabla 1 funcionan casi óptimamente, aún después de eliminar los 125 superiores de los 40 marcadores de la Tabla 1.
La Figura 19A muestra el efecto en los clasificadores para la discriminación de nodulos benignos de NSCLC construido con de 2 a 10 marcadores. Aún después de descender los 15 marcadores clasificados como superiores (clasificados por la distancia KS) de la Tabla 13, el funcionamiento del nodulo benigno frente al NSCLC aumentó con el número de marcadores seleccionados de la tabla para alcanzar sobre 1.65 (Sensibilidad + Especificidad).
La Figura 19B muestra el efecto sobre clasificadores para discriminar fumadores asintomáticos de NSCLC construido con de 2 a 10 marcadores. Aún después de descender el número de marcadores clasificados superiores (clasificados por la distancia KS) de la Tabla 12, el funcionamiento de fumadores asintomáticos frente NSCLC aumentó con el número de marcadores seleccionados de la tabla para llegar a sobre 1.7 (Sensibilidad + Especificidad), y llegó cercanamente al funcionamiento del mejor clasificador seleccionado de la lista completa de biomarcadores en la Tabla 12.
Finamente, las Figuras 20A-20B muestra el funcionamiento de ROC de clasificadores típicos construidos de la lista de parámetros en las Tablas 12 y 13 de acuerdo con el ejemplo 3. La Figura 20A muestra el funcionamiento del modelo de asumir la independencia de los marcadores como en el Ejemplo 3, y la Figura 20B muestra las curvas ROC actuales utilizando el grupo de datos del ensayo utilizados para generar los parámetros en las Tablas 12 y 13. Se puede ver que el funcionamiento para un número dado de marcadores seleccionados estuvo cualitativamente de acuerdo, y que el convenio cuantitativo se degradó como el número de marcadores aumenta. (Esto es consistente con la noción de que la información contribuida por cualquier biomarcador particular concerniente a los procesos de la enfermedad es redundante con la información contribuida por otros biomarcadores provistos n las Tablas 12 y 13) . La Figura 20 de esta forma demuestran que las Tablas 12 y 13 en combinación con los métodos descritos en el Ejemplo 3 permiten la construcción y evaluación de un muchos clasificadores útiles para la discriminación de NSCLC de nódulos benignos y la discriminación de fumadores asintomáticos que tienen NSCLC de los que no tienen NSCLC.
Ejemplo 5. Demostración de la Especificidad del Apt mero en un Ensayo de Impulsión Hacia Abajo La lectura final en el ensayo múltiple se basó en la cantidad de aptámero recuperado después de los pasos de captura sucesivos en el ensayo. El ensayo múltiple se basa en la premisa de que la cantidad de aptámero recuperado al final del ensayo es proporcional a la cantidad de proteína en la mezcla del complejo original (por ejemplo, plasma) . Con el fin de demostrar que esta señal ciertamente se deriva del analito previsto en lugar de proteínas específicamente unidas a gel en plasma, se desarrolló un ensayo de impulsión hacia abajo con base en gel. Este ensayo puede utilizarse para visualmente demostrar que un proteína deseada de hecho se impulsa fuera del plasma después del equilibrio con un aptámero así como demostrar que los aptámeros unidos a sus objetivos de proteína previstos pueden sobrevivir como un complejo a través de los pasos del reto cinético en el ensayo. En los experimentos descritos en este ejemplo, la recuperación de la proteína al final del ensayo de impulsión hacia abajo requiere que la proteína permanezca no covalentemente unida al aptámero por casi dos horas después del equilibrio. De manera importante, en este ejemplo también se proporciona evidencia de que las proteínas no covalente mente unidas de disocian durante estos pasos y no contribuyen significativamente con la señal final. Se debe observar que el procedimiento de impulsión hacia abajo descrito en este ejemplo incluye todos los pasos clave en el ensayo múltiple descrito anteriormente.
Ensayo de Impulsión Hacia Debajo de Plasma Las muestras de plasma se prepararon diluyendo 50 µ? de EDTA-plasma a 100 µ? en SB18 con 0.05% de Tween-20 (SB18T) y 2 µ? de Bloque-Z. La solución plasmática se equilibró con 10 pmoles de un aptámero PBDC en un volumen final de 150 µ? por 2 horas a 37 °C. Después del equilibrio, los complejos y el aptámero no unido se capturaron con 133 µ? de una lechada de 7.5% de Estreptavidina-agarosa a través de la incubación con agitación por 5 minutos a TR en una placa de filtro Durapore. Las muestras unidas a las perlas se lavaron con biotina y con regulador de pH al vacío como se describe en el Ejemplo 1. Después del lavado, las proteínas unidas se marcaron con 0.5 m de NHS-S-S-biotina, 0.25 mM de NHS-Alexa647 en el diluyente de biotina por 5 minutos con agitación a TR. Este paso de tinción permite la biotinilación para la captura de la proteína en perlas de estreptavidina así como una tinción altamente sensible para la detección en un gel. Las muestras se lavaron con glicina y con regulador de pH como se describe en el Ejemplo 1. Los aptámeros se liberaron de las perlas mediante foto-división utilizando una fuente de luz de Rayos Negros durante 10 minutos con agitación a TA. En este punto, las proteínas biotiniladas se capturaron en 0.5 mg de perlas de Estreptavidina MyOne por agitación por 5 minutos a TA. Este paso capturará proteínas unidas a aptámeros así como proteínas que pueden haberse disociado de aptámeros desde el equilibrio inicial. Las perlas se lavaron como se describe en el Ejemplo 1. Las proteínas se eluyeron de las perlas de Estreptavidina MyOne por incubación con 50 mM de DTT en SB17T por 25 minutos a 37°C con agitación. El eluato después se transfirió a perlas MyOne cubiertas con una secuencia complementaria a la región 3' fija del aptámero y se incubó por 25 minutos a 37 °C con agitación. Este paso captura todo el aptámero restante. Las perlas se lavaron 2x con 100 µ? de SB17T por 1 minuto y lx con 100 µ? de SB19T por 1 minuto. El aptámero se eluyó de estas perlas finales por incubación con 45 µ? 20 mM de NaOH por 2 minutos con agitación para alterar las estructuras de cadena hibridadas . Se neutralizaron 40 1 de este eluato con 10 µ? 80 mM de HCl conteniendo 0.05% de Tween-20. Las alícuotas representa el 5% del eluato del primer grupo de perlas (representan todas las proteínas plasmáticas unidas al aptámero) y 20% del eluato del grupo final de perlas (representan todas las proteínas plasmáticas unidas al final de nuestro ensayo clínico) se corrieron en un gel Bis-Tris 4-12% (Invitrogen) bajo condiciones de reducción y desnaturalización. Los geles se procesaron gráficamente en un escáner FluorChem Q de Alpha Innotech en el canal Cy5 para procesar la imagen de las proteínas.
Los geles de impulsión descendente para los aptámeros se seleccionaron contra LBP (-1x10-7 M en plasma, polipéptido PM -60 kDa) , C9 (-1x10-6 M en plasma, polipéptido PM -60 kDa) , e IgM (-9x10-6 M en plasma, PM -70 kDa y 23 kDa), respectivamente. (Ver Figura 16) .
Para cada gel, el carril 1 es el eluato de las perlas de Estreptavidina-agarosa, el carril 2 es el eluato final, y el carril 3 es un carril marcador de PM (las bandas principales son de 110, 50, 30, 15, y 3.5 kDa de la parte superior a la parte inferior) . Es evidente de estos geles que existe una pequeña cantidad de unión no específica de proteínas plasmáticas en el equilibrio inicial, pero so lamente el objetivo permanece después de llevar a cabo los pasos de captura del ensayo. Es claro que el reactivo de aptámero individual es suficiente para capturar su analito previsto sin depleción directa o fraccionamiento del plasma. La cantidad de aptámero restante después de estos pasos es después proporcional a la cantidad del analito en la muestra inicial.
Es claro que el reactivo de aptámero individual es suficiente para capturar su analito previsto sin depleción directa o fraccionamiento del plasma. La cantidad de aptámero restante después de estos pasos después es proporcionar a la cantidad de analito en a muestra inicial Ejemplo 6. Análisis de Resecciones Quirúrgicas NSCLC Para demostrar la utilidad de la tecnología con base en la plataforma descrita en la presente para identificar biomarcadores relacionados con la enfermedad de tejidos, se analizaron muestras tisulares homogenizadas de resecciones quirúrgicas obtenidas de ocho paciente con NSCLC. Todos los pacientes con NSCLC eran fumadores, en el intervalo de 47 a 75 años de edad y cubriendo las etapas de NSCLC 1A 3B (Tabla 17) . Todas las muestras de tejido se obtuvieron congelando el tejido dentro de los 5-10 minutos de la escisión durante la cirugía y después de colocar los tejidos en medio OCT (10.24% de alcohol polivinílico, 4.26% de polietilenglicol, y 85.5% de ingredientes no reactivos) . Se obtuvieron tres muestras de cada resección: muestra de tejido de tumor, tejido sano adyacente (dentro de 1 cm del tumor) y tejido de pulmón no involucrado distante. Mientras se mantuvieron las muestras constantemente congeladas, se cortaron cinco secciones gruesas de 10 um, se recortó el exceso de OCT de alrededor del tejido, y se colocaron en tubos de microfuga de 1.5. mi congelados. Después de la adición de 200 µ? de regulador de pH de homogenización (regulador de pH SB18 más coctel PI (coctel inhibidor de proteasa sin magnesio Pierce HALT) , las muestras se homogenizaron en los tubos de microfuga en hielo con mano de mortero giratorio por 30 segundos, hasta que no fueron visibles los fragmentos de tejido. Las muestras después se centrifugaron en una centrífuga a 21,000g por 10 minutos y se filtraron a través de un filtro de placa de multicavidades de 0.2 um en una placa multicavidad estéril. Se tomaron alícuotas de 5 µ? para el ensayo de proteina BCA y el resto de la muestra se almacenó congelado en placas de 96 cavidades a -70°C.
La proteína total de la muestra se ajustó a 16 pg/ml en regulador de pH SB17T (regulador de pH SB17 conteniendo 0.05% de tween 20) para la perfilación proteómica. Las muestras preparadas en esta forma se corrieron en el ensayo de aptámero multiplexado el cual, como se observa anteriormente, mide aproximadamente 800 proteínas como se describe previamente (Ostroff y otros, Nature Precedings , htt : //precedings . nature . com/documents/4537/version/l (2010)). Entre los analitos medidos, la mayor parte estuvo sin cambios entre tumor, tejido adyacente y tejido distal. Sin embargo, algunas proteínas se suprimieron claramente (Figuras 24A-24P) aunque otras se elevaron sustancialmente en tejidos de tumor (Figuras 23A-23T) comparadas con los tejidos adyacente y distal.
Las modalidades y ejemplos anteriores pretenden solamente ser ejemplos. Ninguna modalidad, ejemplo, o elemento particular de una modalidad o ejemplo particular se construirá como un elemento o característica crítica, requerida o esencial para cualquiera de las reivindicaciones. Además, ningún elemento descrito en la presente es requerido para la práctica de las reivindicaciones anexas a menos que expresamente se describa como "esencial" o "crítico" . Varias alteraciones, modificaciones, sustituciones, y otras variaciones pueden hacerse a las modalidades descritas sin apartarse del alcance de la presente solicitud, que se define por las reivindicaciones anexas. La especificación, incluyendo las figuras y los ejemplos, será referida en una forma ilustrativa, en lugar de una restrictiva, y todas las modificaciones y sustituciones pretenden incluirse dentro del alcance de la solicitud. Por consiguiente el alcance de la solicitud deberá determinarse por las reivindicaciones anexas y sus equivalentes legales, en lugar de a través de los ejemplos dados anteriormente. Por ejemplo, los pasos recitados en cualquiera de las reivindicaciones de método o proceso pueden ejecutare en cualquier forma factible y no están limitadas a un orden presentado en cualquiera de las modalidades, ejemplos o las reivindicaciones. Además, en cualquiera de los métodos antes mencionados, uno o más biomarcadores de la Tabla 18, Tabla 20, o Tabla 21 pueden excluirse específicamente ya sea como un biomarcador individual o como un biomarcador de cualquier panel.
Tabla 1. Biomarcadores de Cáncer de Pulmón Tabla 2. Concentraciones de Aptámero Tabla 3 Tabla 5. Biomarcadores Identificados en NSCLC fumadores en Datos Agregados Tabla 6. Biomarcadores Identificados en NSCLC Nodulo Benigno por Sitio Tabla 7. Biomarcadores Identificados en NSCLC de Fumadores por Sitio Tabla 8. Biomarcadores Identificados en NSCLC Nodulo Benigno en el Grupo de Datos Mezclados Tabla 9. Biomarcadores Identificados en NSCLC Fumadores en Grupo de Datos Mezclados Tabla 10 Tabla 11 Tabla 12. Parámetros para el Grupo de Control Fumadores Tabla 13. Parámetros para el Grupo Controlado Nodulos Benignos Tabla 14. Sensibilidad + Especificidad para Combinaciones Ilustrativas de Biornareadores Tabla 15. Parámetros Derivados del Grupo Entrenamiento para el Clasificador Bayes Sin Experiencia Tabla 16. Parámetros Bayes Sin Experiencia para los marcadores en la Tabla 21 para ambos tejido y suero Tabla 17. Demográficos del paciente, ubicación de la reacción y tipos de tumor para ocho muestras NSCLC Tabla 18. Biomarcadores Diferencialmente Expre Entre Tejido con Tumor y Normal * Traslape de Biomarcador Expresado en ambos Suero y Tejido de Tumor Tabla 19. Categorización de Biomarcadores de Tejido NSCLC en Procesos Biológicos * Nuevo Biomarcador NSCLC Tabla 20. Biomarcadores Identificados en Tejido NSCLC* * Esta lista excluye biomarcadores que se identificaron en ambas muestras de tejido y suero Tabla 21. Biomarcadores Identificados en Suero y Tejido Tabla 22. Paneles de Dos Biomarcadores incluyendo MMP-12 Tabla 23. 100 Paneles de Tres Biomarcadores Incluyendo MMP-12 Tabla 24. 100 Paneles de Cuatro Biomarcadores Incluyendo MMP-12 Tabla 25. 100 Paneles de Cinco Biomarcadores Incluyendo MMP-12 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (152)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones:
1. Un método para diagnosticar que un individuo tiene o no tiene cáncer de pulmón, caracterizado porque comprende : detectar, en una muestra biológica de un individuo, los valores del biomarcador el cual cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores seleccionado de la Tabla 21, en donde el individuo se clasifica como teniendo o no teniendo cáncer de pulmón con base en tales valores de los biomarcadores , y en donde N = 2 - 86.
2. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la detección en los valores del biomarcador comprende llevar a cabo un ensayo in vi tro.
3. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el ensayo in vitro comprende al menos un reactivo de captura correspondiente a cada uno de tales biomarcadores, y además comprende seleccionar al menos un reactivo de captura del grupo que consiste de aptámeros, anticuerpos, y una sonda de ácido nucleico.
4. El método de conformidad con la reivindicación 3, caracterizado porque al menos un reactivo de captura es un aptámero .
5. El método de conformidad con la reivindicación 2, caracterizado porque el ensayo in vitro se selecciona del grupo que consiste de un inmunoensayo, un ensayo con base en aptámero, un ensayo histológico o citológico, y un ensayo de nivel de expresión de ARNm.
6. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque cada valor del biomarcador se evalúa con base en un valor predeterminado o un intervalo predeterminado de valores.
7. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra biológica es tejido de pulmón y en donde los valores del biomarcador se derivan de un análisis histológico o citológico de tal tejido de pulmón.
8. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste de sangre entera, plasma y suero.
9. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque la muestra biológica es suero.
10. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el individuo es un humano.
11. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque N = 2 - 15.
12. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque N = 2 - 10.
13. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque N = 3 - 10.
14. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque N = 4 - 10.
15. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque N = 5 - 10.
16. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el individuo es un fumador.
17. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el individuo tiene un nodulo pulmona .
18. El método de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque el cáncer de pulmón es cáncer de pulmón de célula no pequeña.
19. Un método implementado por computadora para indicar una probabilidad de cáncer de pulmón, caracterizado porque comprende : obtener en una computadora la información del biomarcador para un individuo, en donde la información del biomarcador comprende valores de biomarcador que cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores seleccionado de la Tabla 21; llevar a cabo con la computadora una clasificación de cada uno de tales valores del biomarcador; e indicar la probabilidad de que tal individuo tenga cáncer de pulmón con base en la pluralidad de clasificaciones, y en donde N = 2 - 86.
20. El método de conformidad con la reivindicación 19, caracterizado porque la indicación de la probabilidad de que el individuo tenga cáncer de pulmón comprende desplegar la probabilidad en una pantalla de computadora.
21. Un producto de programa de computadora para indicar una probabilidad de cáncer de pulmón, caracterizado porque comprende : un medio legible por computadora que modaliza el código del programa ejecutable por un procesador de un dispositivo o sistema de computación, el código del programa comprende : el código que obtiene los datos atribuidos a una muestra biológica de un individuo, en donde los datos comprenden valores de biomarcador que cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores seleccionado de la Tabla 21, en donde los biomarcadores se detectan en la muestra biológica; y un código que ejecuta un método de clasificación que indica el estado de enfermedad de pulmón del individuo como una función de los valores del biomarcador; y en donde N = 2 - 86.
22. El producto de programa de computadora de conformidad con la reivindicación 21, caracterizado porque el método de clasificación utiliza como una función de densidad de probabilidad.
23. El producto de programa de computadora de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado porque el método de clasificación utiliza dos o más clases.
24. Un método para diagnosticar que un individuo tiene o no tiene cáncer de pulmón, caracterizado porque comprende : detectar, en una muestra biológica de un individuo, los valores del biomarcador el cual cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores seleccionado de la Tabla 20, en donde el individuo se clasifica como teniendo o no teniendo cáncer de pulmón con base en tales valores de los biomarcadores, y en donde N = 2 - 25.
25. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la detección en los valores del biomarcador comprende llevar a cabo un ensayo in vitro.
26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el ensayo in vitro comprende al menos un reactivo de captura correspondiente a cada uno de tales biomarcadores, y además comprende seleccionar al menos un reactivo de captura del grupo que consiste de aptámeros, anticuerpos, y una sonda de ácido nucleico.
27. El método de conformidad con la reivindicación 26, caracterizado porque al menos un reactivo de captura es un a tamero .
28. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado porque el ensayo in vitro se selecciona del grupo que consiste de un inmunoensayo, un ensayo con base en aptámero, un ensayo histológico o citológico, y un ensayo de nivel de expresión de ARNm.
29. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque cada valor del biomarcador se evalúa con base en un valor predeterminado o un intervalo predeterminado de valores.
30. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la muestra biológica es tejido de pulmón y en donde los valores del biomarcador se derivan de un análisis histológico o citológico de tal tejido de pulmón.
31. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste de sangre entera, plasma y suero.
32. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque la muestra biológica es suero.
33. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el individuo es un humano.
34. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque N = 2 - 15.
35. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque N = 2 - 10.
36. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque N = 3 - 10.
37. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque N = 4 - 10.
38. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque N = 5 - 10.
39. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el individuo es un fumador.
40. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el individuo tiene un nodulo pulmonar .
41. El método de conformidad con la reivindicación 24, caracterizado porque el cáncer de pulmón es cáncer de pulmón de célula no pequeña.
42. Un método implementado por computadora para indicar una probabilidad de cáncer de pulmón, caracterizado porque comprende : obtener en una computadora la información del biomarcador para un individuo, en donde la información del biomarcador comprende valores de biomarcador que cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores seleccionado de la Tabla 20; llevar a cabo con la computadora una clasificación de cada uno de tales valores del biomarcador; e indicar la probabilidad de que tal individuo tenga cáncer de pulmón con base en la pluralidad de clasificaciones, y en donde N = 2 - 25.
43. El método de conformidad con la reivindicación 42, caracterizado porque la indicación de la probabilidad de que el individuo tenga cáncer de pulmón comprende desplegar la probabilidad en una pantalla de computadora.
44. Un producto de programa de computadora para indicar una probabilidad de cáncer de pulmón, caracterizado porque comprende : un medio legible por computadora que modaliza el código del programa ejecutable por un procesador de un dispositivo o sistema de computación, el código del programa comprende : el código que obtiene los datos atribuidos a una muestra biológica de un individuo, caracterizado porque los datos comprenden valores de biomarcador que cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores seleccionado de la Tabla 20, caracterizado porque los biomarcadores se detectan en la muestra biológica; y un código que ejecuta un método de clasificación que indica el estado de enfermedad de pulmón del individuo como una función de los valores del biomarcador; y en donde N = 2 - 25.
45. El producto de programa de computadora de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el método de clasificación utiliza como una función de densidad de probabilidad.
46. El producto de programa de computadora de conformidad con la reivindicación 44, caracterizado porque el método de clasificación utiliza dos o más clases.
47. Un método para diagnosticar que un individuo tiene o no tiene cáncer de pulmón, caracterizado porque comprende : detectar, en una muestra biológica de un individuo, los valores del biomarcador el cual cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores seleccionado de la Tabla 18, en donde el individuo se clasifica como teniendo o no teniendo cáncer de pulmón con base en tales valores de los biomarcadores, y en donde N = 2 - 36.
48. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque la detección en los valores del biomarcador comprende llevar a cabo un ensayo in vitro.
49. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque el ensayo in vitro comprende al menos un reactivo de captura correspondiente a cada uno de tales biomarcadores, y además comprende seleccionar al menos un reactivo de captura del grupo que consiste de aptámeros, anticuerpos, y una sonda de ácido nucleico.
50. El método de conformidad con la reivindicación 49, caracterizado porque al menos un reactivo de captura es un aptámero.
51. El método de conformidad con la reivindicación 48, caracterizado porque el ensayo in vitro se selecciona del grupo que consiste de un inmunoensayo, un ensayo con base en aptámero, un ensayo histológico o citológico, y un ensayo de nivel de expresión de ARNm.
52. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque cada valor del biomarcador se evalúa con base en un valor predeterminado o un intervalo predeterminado de valores.
53. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque la muestra biológica es tejido de pulmón y en donde los valores del biomarcador se derivan de un análisis histológico o citológico de tal tejido de pulmón.
54. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste de sangre entera, plasma y suero.
55. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque la muestra biológica es suero.
56. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque el individuo es un humano.
57. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque N = 2 - 15.
58. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque N = 2 - 10.
59. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque N = 3 - 10.
60. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque N = 4 - 10.
61. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque N = 5 - 10.
62. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque el individuo es un fumador.
63. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque el individuo tiene un nodulo pulmonar .
64. El método de conformidad con la reivindicación 47, caracterizado porque el cáncer de pulmón es cáncer de pulmón de célula no pequeña.
65. Un método implementado por computadora para indicar una probabilidad de cáncer de pulmón, caracterizado porque comprende : obtener en una computadora la información del biomarcador para un individuo, en donde la información del biomarcador comprende valores de biomarcador que cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores seleccionado de la Tabla 18; llevar a cabo con la computadora una clasificación de cada uno de tales valores del biomarcador; e indicar la probabilidad de que tal individuo tenga cáncer de pulmón con base en la pluralidad de clasificaciones, y en donde N = 2 - 36.
66. El método de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado porque la indicación de la probabilidad de que el individuo tenga cáncer de pulmón comprende desplegar la probabilidad en una pantalla de computadora.
67. Un producto de programa de computadora para indicar una probabilidad de cáncer de pulmón, caracterizado porque comprende : un medio legible por computadora que modaliza el código del programa ejecutable por un procesador de un dispositivo o sistema de computación, el código del programa comprende : el código que obtiene los datos atribuidos a una muestra biológica de un individuo, en donde los datos comprenden valores de biomarcador que cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores seleccionado de la Tabla 18, caracterizado porque los biomarcadores se detectan en la muestra biológica; y un código que ejecuta un método de clasificación que indica el estado de enfermedad de pulmón del individuo como una función de los valores del biomarcador; y en donde N = 2 - 36.
68. El producto de programa de computadora de conformidad con la reivindicación 67, caracterizado porque el método de clasificación utiliza como una función de densidad de probabilidad.
69. El producto de programa de computadora de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado porque el método de clasificación utiliza dos o más clases.
70. Un método para determinar a información acerca del cáncer de pulmón en un individuo caracterizado porque comprende : detectar, en una muestra biológica de un individuo, los valores del biomarcador el cual cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores seleccionado de la Tabla 21, en donde N = 2-86; y en donde el valor del biomarcador provee información acerca del cáncer de pulmón en el individuo .
71. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque la detección en los valores del biomarcador comprende llevar a cabo un ensayo in vitro.
72. El método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque el ensayo in vitro comprende al menos un reactivo de captura correspondiente a cada uno de tales biomarcadores, y además comprende seleccionar al menos un reactivo de captura del grupo que consiste de aptámeros, anticuerpos, y una sonda de ácido nucleico.
73. El método de conformidad con la reivindicación 72, caracterizado porque al menos un reactivo de captura es un aptámero.
74. El método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque el ensayo in vitro se selecciona del grupo que consiste de un inmunoensayo, un ensayo con base en aptámero, un ensayo histológico o citológico, y un ensayo de nivel de expresión de ARNm.
75. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque cada valor del biomarcador se evalúa con base en un valor predeterminado o un intervalo predeterminado de valores.
76. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque la muestra biológica es tejido de pulmón y en donde los valores del biomarcador se derivan de un análisis histológico o citológico de tal tejido de pulmón.
77. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste de sangre entera, plasma y suero.
78. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque la muestra biológica es suero.
79. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque el individuo es un humano.
80. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque N = 2 - 15.
81. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque N = 2 - 10.
82. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque N = 3 - 10.
83. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque N = 4 - 10.
84. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque N = 5 - 10.
85. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque el individuo es un fumador.
86. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque el individuo tiene un nodulo pulmonar .
87. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque el cáncer de pulmón es cáncer de pulmón de célula no pequeña.
88. El método de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado porque la información comprende pronóstico, clasificación del cáncer, predicción del riesgo de la enfermedad, o la selección del tratamiento.
89. Un método para determinar la información acerca del cáncer de pulmón en un individuo caracterizado porque comprende : detectar, en una muestra biológica de un individuo, los valores del biomarcador el cual cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores seleccionado de la Tabla 18, en donde N = 2-36; y en donde el valor del biomarcador provee información acerca el cáncer de pulmón en el individuo .
90. El método de conformidad con la reivindicación 89, caracterizado porque la detección en los valores del biomarcador comprende llevar a cabo un ensayo in vitro.
91. El método de conformidad con la reivindicación 90, caracterizado porque el ensayo in vitro comprende al menos un reactivo de captura correspondiente a cada uno de tales biomarcadores , y además comprende seleccionar al menos un reactivo de captura del grupo que consiste de aptámeros, anticuerpos, y una sonda de ácido nucleico.
92. El método de conformidad con la reivindicación 91, caracterizado porque al menos un reactivo de captura es un aptámero .
93. El método de conformidad con la reivindicación 90, caracterizado porque el ensayo in vitro se selecciona del grupo que consiste de un inmunoensayo, un ensayo con base en aptámero, un ensayo histológico o citológico, y un ensayo de nivel de expresión de ARNm.
94. El método de conformidad con la reivindicación 89, caracterizado porque cada valor del biomarcador se evalúa con base en un valor predeterminado o un intervalo predeterminado de valores .
95. El método de conformidad con la reivindicación 89, caracterizado porque la muestra biológica es tejido de pulmón y en donde los valores del biomarcador se derivan de un análisis histológico o citológico de tal tejido de pulmón.
96. El método de conformidad con la reivindicación 89, caracterizado porque la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste de sangre entera, plasma y suero.
97. El método de conformidad con la reivindicación 89, caracterizado porque la muestra biológica es suero.
98. El método de conformidad con la reivindicación 89, caracterizado porque el individuo es un humano.
99. El método de conformidad con la reivindicación 89, caracterizado porque N = 2 - 15.
100. El método de conformidad con la reivindicación 89, caracterizado porque N = 2 - 10.
101. El método de conformidad con la reivindicación 89, caracterizado porque N = 3 - 10.
102. El método de conformidad con la reivindicación 89, caracterizado porque N = 4 - 10.
103. El método de conformidad con la reivindicación 89, caracterizado porque N = 5 - 10.
104. El método de conformidad con la reivindicación 89, caracterizado porque el individuo es un fumador.
105. El método de conformidad con la reivindicación 89, caracterizado porque el individuo tiene un nodulo pulmonar .
106. El método de conformidad con la reivindicación 89, caracterizado porque el cáncer de pulmón es cáncer de pulmón de célula no pequeña.
107. El método de conformidad con la reivindicación 89, caracterizado porque la información comprende el pronóstico, clasificación del cáncer, predicción del riesgo de la enfermedad, o la selección del tratamiento.
108. Un método para determinar- la información acerca del cáncer de pulmón en un individuo caracterizado porque comprende : detectar, en una muestra biológica de un individuo, los valores del biomarcador el cual cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores seleccionado de la Tabla 20, en donde N = 2-25; y en donde el valor del biomarcador provee información acerca el cáncer de pulmón en el individuo.
109. El método de conformidad con la reivindicación 108, caracterizado porque la detección en los valores del biomarcador comprende llevar a cabo un ensayo in vi tro.
110. El método de conformidad con la reivindicación 109, caracterizado porque el ensayo in vi tro comprende al menos un reactivo de captura correspondiente a cada uno de tales biomarcadores, y además comprende seleccionar al menos un reactivo de captura del grupo que consiste de aptámeros, anticuerpos, y una sonda de ácido nucleico.
111. El método de conformidad con la reivindicación 110, caracterizado porque al menos un reactivo de captura es un aptámero.
112. El método de conformidad con la reivindicación 109, caracterizado porque el ensayo in vitro se selecciona del grupo que consiste de un inmunoensayo, un ensayo con base en aptámero, un ensayo histológico o citológico, y un ensayo de nivel de expresión de ARNm.
113. El método de conformidad con la reivindicación 108, caracterizado porque cada valor del biomarcador se evalúa con base en un valor predeterminado o un intervalo predeterminado de valores .
11 . El método de conformidad con la reivindicación 108, caracterizado porque la muestra biológica es tejido de pulmón y en donde los valores del biomarcador se derivan de un análisis histológico o citológico de tal tejido de pulmón.
115. El método de conformidad con la reivindicación 108, caracterizado porque la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste de sangre entera, plasma y suero.
116. El método de conformidad con la reivindicación 108, caracterizado porque la muestra biológica es suero.
117. El método de conformidad con la reivindicación 108, caracterizado porque el individuo es un humano.
118. El método de conformidad con la reivindicación 108, caracterizado porque N = 2 - 15.
119. El método de conformidad con la reivindicación 108, caracterizado porque N = 2 - 10.
120. El método de conformidad con la reivindicación 108, caracterizado porque N = 3 - 10.
121. El método de conformidad con la reivindicación 108, caracterizado porque N = 4 - 10.
122. El método de conformidad con la reivindicación 108, caracterizado porque N = 5 - 10.
123. El método de conformidad con la reivindicación 108, caracterizado porque el individuo es un fumador.
124. El método de conformidad con la reivindicación 108, caracterizado porque el individuo tiene un nodulo pulmonar .
125. El método de conformidad con la reivindicación 108, caracterizado porque el cáncer de pulmón es cáncer de pulmón de célula no pequeña.
126. El método de conformidad con la reivindicación 108, caracterizado porque la información comprende el pronóstico, clasificación del cáncer, predicción del riesgo de la enfermedad, o la selección del tratamiento.
127. Un método para diagnosticar que un individuo tiene o no tiene cáncer de pulmón, caracterizado porque comprende : detectar, en una muestra biológica de un individuo, los valores del biomarcador el cual cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores seleccionado de la Tabla 21, en donde el individuo se clasifica como teniendo o no teniendo cáncer de pulmón con base en tales valores de los biomarcadores , caracterizado porque N = 2-86, y en donde al menos uno de tales biomarcadores se selecciona de la Tabla 20.
128. El método de conformidad con la reivindicación 127, caracterizado porque al menos uno de tales biomarcadores seleccionad de la Tabla 20 es MMP-12.
129. El método de conformidad con la reivindicación 127, caracterizado porque la detección en los valores del biomarcador comprende llevar a cabo un ensayo in vi tro.
130. El método de conformidad con la reivindicación 129, caracterizado porque el ensayo in vitro comprende al menos un reactivo de captura correspondiente a cada uno de tales biomarcadores, y además comprende seleccionar al menos un reactivo de captura del grupo que consiste de aptámeros, anticuerpos, y una sonda de ácido nucleico.
131. El método de conformidad con la reivindicación 130, caracterizado porque tal al menos un reactivo de captura es un aptámero.
132. El método de conformidad con la reivindicación 129, caracterizado porque el ensayo in vitro se selecciona del grupo que consiste de un inmunoensayo, un ensayo con base en aptámero, un ensayo histológico o citológico, y un ensayo de nivel de expresión de ARNm.
133. El método de conformidad con la reivindicación 127, caracterizado porque cada valor del biomarcador se evalúa con base en un valor predeterminado o un intervalo predeterminado de valores .
134. El método de conformidad con la reivindicación 127, caracterizado porque la muestra biológica es tejido de pulmón y en donde los valores del biomarcador se derivan de un análisis histológico o citológico de tal tejido de pulmón.
135. El método de conformidad con la reivindicación 127, caracterizado porque la muestra biológica se selecciona del grupo que consiste de sangre entera, plasma y suero.
136. El método de conformidad con la reivindicación 127, caracterizado porque la muestra biológica es suero.
137. El método de conformidad con la reivindicación 127, caracterizado porque el individuo es un humano.
138. El método de conformidad con la reivindicación 127, caracterizado porque N = 2 - 15.
139. El método de conformidad con la reivindicación 127, caracterizado porque N = 2 - 10.
140. El método de conformidad con la reivindicación 127, caracterizado porque N = 3 - 10.
141. El método de conformidad con la reivindicación 127, caracterizado porque N = 4 - 10.
142. El método de conformidad con la reivindicación 127, caracterizado porque N = 5 - 10.
143. El método de conformidad con la reivindicación 127, caracterizado porque el individuo es un fumador.
144. El método de conformidad con la reivindicación 127, caracterizado porque el individuo tiene un nodulo pulmonar .
145. El método de conformidad con la reivindicación 127, caracterizado porque el cáncer de pulmón es cáncer de pulmón de célula no pequeña.
146. Un método implementado por computadora para indicar una probabilidad de cáncer de pulmón, caracterizado porque comprende : obtener en una computadora la información del biomarcador para un individuo, en donde la información del biomarcador comprende valores de biomarcador que cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores seleccionado de la Tabla 21; en donde al menos de tales N biomarcadores se selecciona de la Tabla 20 llevar a cabo con la computadora una clasificación de cada uno de tales valores del biomarcador; e indicar la probabilidad de que tal individuo tenga cáncer de pulmón con base en la pluralidad de clasificaciones, y caracterizado porque N = 2 - 86.
147. El método de conformidad con la reivindicación 146, caracterizado porque al menos uno de tales biomarcadores seleccionado de la Tabla 20 es MMP-12.
148. El método de conformidad con la reivindicación 146, caracterizado porque la indicación de la probabilidad de que el individuo tenga cáncer de pulmón comprende desplegar la probabilidad en una pantalla de computadora.
149. Un producto de programa de computadora para indicar una probabilidad de cáncer de pulmón, caracterizado porque comprende : un medio legible por computadora que modaliza el código del programa ejecutable por un procesador de un dispositivo o sistema de computación, el código del programa comprende : el código que obtiene los datos atribuidos a una muestra biológica de un individuo, en donde los datos comprenden valores de biomarcador que cada uno corresponde a uno de por lo menos N biomarcadores seleccionado de la Tabla 21, en donde al menos uno de tales N biomarcadores se selecciona de la Tabla 10, y en donde los biomarcadores se detectan en la muestra biológica; y un código que ejecuta un método de clasificación que indica el estado de enfermedad de pulmón del individuo como una función de los valores del biomarcador; y en donde N = 2 - 86.
150. El producto de programa de computadora de conformidad con la reivindicación 149, caracterizado porque al menos uno de tales biomarcadores seleccionado de la Tabla 20 es MMP-12.
151. El producto de programa de computadora de conformidad con la reivindicación 149, caracterizado porque el método de clasificación utiliza como una función de densidad de probabilidad.
152. El producto de programa de computadora de conformidad con la reivindicación 149, caracterizado porque el método de clasificación utiliza dos o más clases.
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