CN115023615A - 确定葡萄糖耐量减低的方法 - Google Patents
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Abstract
提供了用于确定受试者是否具有葡萄糖耐量减低且更具体地前驱糖尿病或糖尿病的方法、组合物和试剂盒。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求于2020年1月10日提交的美国临时申请第62/959,660号的优先权权益,其通过引用整体并入本文以用于任何目的。
技术领域
本申请整体涉及生物标志物的检测和葡萄糖耐量的表征,例如以鉴定具有或可能具有葡萄糖耐量减低的受试者,所述葡萄糖耐量减低是前驱糖尿病或糖尿病的指征。在各种实施方案中,本发明涉及用于表征可指示个体的前驱糖尿病和/或糖尿病的葡萄糖耐量减低的一种或多种生物标志物、方法、装置、试剂、系统和试剂盒。
背景技术
目前用于确定葡萄糖耐量的方法包括测量参与口服葡萄糖耐量测试(OGTT)的个体的2小时血浆葡萄糖水平。典型的OGTT由以下组成:在禁食过夜后摄入75克口服葡萄糖溶液,在基线(“空腹血浆葡萄糖”)和摄入后2小时(“2hr-OGTT葡萄糖值”)测量血浆葡萄糖。空腹血浆葡萄糖和2小时OGTT血浆葡萄糖以及HbA1c值目前都为美国糖尿病协会(AmericanDiabetes Association)所接受,以用于2型糖尿病的临床诊断。2型糖尿病的预防主要基于具有葡萄糖耐量减低的个体进行评估,所述葡萄糖耐量减低定义为2小时OGTT血浆葡萄糖水平≥7.8mmol/L。参见,例如,Knowler等人N.Engl.J.Med.2002;346:393-403和Tuomilehto等人N.Engl.J.Med.2001;344:1343-1350。开发用于葡萄糖耐量减低的代表OGTT血浆葡萄糖阈值的蛋白质组学模型,而无需禁食或葡萄糖施用,将是非常合乎需要的。
发明内容
在一些实施方案中,提供了确定受试者是否具有或是否可能具有葡萄糖耐量减低的方法。在一些实施方案中,提供了鉴定患有前驱糖尿病或可能发展为前驱糖尿病的受试者的方法。在一些实施方案中,提供了鉴定可能发展为糖尿病的受试者的方法。
在一些实施方案中,本文的方法用于确定受试者是否具有葡萄糖耐量减低或是否可能具有葡萄糖耐量减低,所述葡萄糖耐量减低是前驱糖尿病或糖尿病的指征,所述方法包括从受试者获得样品,形成具有N种生物标志物蛋白的生物标志物小组,以及检测来自受试者的样品中N种生物标志物蛋白中的每一种的水平,其中N为至少3,并且其中N种生物标志物蛋白中的至少一种选自ACY1、COL1A1、RTN4R、CRLF1:CLCF1复合物、CBX7、KIN、SERPINA11、PELI2、TFF3、FABP12、GAD1、SVEP1、SOCS7、F9、STC1、MYOC、WFDC11、CALB1、CCL16、SMCO2、CCL23、OSTM1、RNASE10、ITIH1、ZNF134、CFAP45和SFTPD。在一些实施方案中,N为3至41,N为4至41,N为5至41,或N为6至41,或N为7至41,或N为8至41,或N为9至41,或N为10至41,或N为11至41,或N为12至41,或N为13至41,或N为14至41,或N为15至41,或N为16至41,或N为至少4,或N为至少5,或N为至少6,或N为至少7,或N为至少8,或N为至少9,或N为至少10,或N为至少11,或N为至少12,或N为至少13,或N为至少14,或N为至少15,或N为至少16。在一些实施方案中,N为3,或N为4,或N为5,或N为6,或N为7,或N为8,或N为9,或N为10,或N为11,或N为12,或N为13,或N为14,或N为15,或N为16,或N为17,或N为18,或N为19,或N为20,或N为21,或N为22,或N为23,或N为24,或N为25,或N为26,或N为27,或N为28,或N为29,或N为30,或N为31,或N为32,或N为33,或N为34,或N为35,或N为36,或N为37,或N为38,或N为39,或N为40,或N为41。在一些这样的实施方案中,受试者具有葡萄糖耐量减低。在一些实施方案中,受试者可能具有葡萄糖耐量减低。在一些实施方案中,受试者可能发展为前驱糖尿病。在一些实施方案中,受试者患有前驱糖尿病。在一些实施方案中,受试者可能发展为糖尿病。在一些实施方案中,受试者具有葡萄糖耐量减低并患有糖尿病。在一些实施方案中,可能发展为糖尿病的受试者采取预防性措施或进行预防性治疗以降低发展为糖尿病的可能性。
在一些实施方案中,N种生物标志物中的每一种选自表1。在一些实施方案中,N种生物标志物蛋白中的至少一种选自ACY1、COL1A1、RTN4R、CRLF1:CLCF1复合物、CBX7和KIN。在一些实施方案中,N种生物标志物蛋白中的一种或两种是INHBC和/或SHBG。在一些实施方案中,N种蛋白生物标志物中的至少2种或至少3种选自ACY1、COL1A1、RTN4R、CRLF1:CLCF1复合物、CBX7、KIN、SERPINA11、PELI2、TFF3、FABP12、GAD1、SVEP1、SOCS7、F9、STC1、MYOC、WFDC11、CALB1、CCL16、SMCO2、CCL23、OSTM1、RNASE10、ITIH1、ZNF134、CFAP45和SFTPD。在一些实施方案中,N种生物标志物蛋白中的至少一种选自FAM20B、COL15A1、MARCKSL1、HTRA1、CHAD、CPM、DLK1、HERC1、IL20RB、MAP2K4、GPX2和FGFR4。在一些实施方案中,N种生物标志物蛋白中的两种是INHBC和ACY1,或N种生物标志物蛋白中的两种是SHBG和ACY1,或N种生物标志物蛋白中的三种是INHBC、SHBG和ACY1。在一些实施方案中,N种生物标志物蛋白中的两种是INHBC和COL1A1,或N种生物标志物蛋白中的两种是SHBG和COL1A1,或其中N种生物标志物蛋白中的三种是INHBC、SHBG和COL1A1。在一些实施方案中,N种生物标志物蛋白中的两种是INHBC和RTN4R,或N种生物标志物蛋白中的两种是SHBG和RTN4R,或其中N种生物标志物蛋白中的三种是INHBC、SHBG和RTN4R。在一些实施方案中,N种生物标志物蛋白中的两种是INHBC和CRLF1:CLCF1复合物,或N种生物标志物蛋白中的两种是SHBG和CRLF1:CLCF1复合物,或其中N种生物标志物蛋白中的三种是INHBC、SHBG和CRLF1:CLCF1复合物。在一些实施方案中,N种生物标志物蛋白中的两种是INHBC和CBX7,或N种生物标志物蛋白中的两种是SHBG和CBX7,或其中N种生物标志物蛋白中的三种是INHBC、SHBG和CBX7。在一些实施方案中,N种生物标志物蛋白中的两种是INHBC和KIN,或N种生物标志物蛋白中的两种是SHBG和KIN,或其中N种生物标志物蛋白中的三种是INHBC、SHBG和KIN。在一些实施方案中,N为至少五并且N种生物标志物蛋白中的五种是INHBC、SHBG、ACY1、COL1A1和RTN4R。在一些实施方案中,N为至少16,并且其中N种生物标志物蛋白中的16种是ACY1、COL1A1、RTN4R、CRLF1、CBX7、KIN、SERPINA11、PELI2、TFF3、FABP12、INHBC、SHBG、FAM20B、COL15A1、MARCKSL1和HTRA1。
在本文所述的任何实施方案中,受试者可有发展为葡萄糖耐量减低的风险。在本文所述的任何实施方案中,受试者可有发展为前驱糖尿病的风险。在本文所述的任何实施方案中,受试者可有发展为糖尿病的风险。在一些实施方案中,所述方法包括确定受试者是否具有或是否可能具有葡萄糖耐量减低,所述葡萄糖耐量减低是前驱糖尿病或糖尿病的指征。在一些实施方案中,所述方法包括确定受试者是否患有前驱糖尿病或是否可能发展为前驱糖尿病或糖尿病。在一些实施方案中,糖尿病是2型糖尿病。在一些实施方案中,所述方法包括向受试者施用治疗。在一些这样的实施方案中,治疗包括向受试者施用胰岛素和/或二甲双胍。在一些实施方案中,治疗包括为受试者实施减重计划、实施饮食限制、实施热量限制和/或实施锻炼计划。
在本文所述的任何实施方案中,N种生物标志物蛋白中的每一种彼此不同。在一些实施方案中,所述方法包括使来自受试者的样品的生物标志物与生物标志物捕获试剂集合接触,其中所述生物标志物捕获试剂集合中的各生物标志物捕获试剂特异性结合正在检测的不同生物标志物。在一些实施方案中,各生物标志物捕获试剂是抗体或适配体。在一些实施方案中,各生物标志物捕获试剂是适配体。在一些实施方案中,至少一种适配体是慢解离速率适配体。在一些实施方案中,至少一种慢解离速率适配体包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少10个具有修饰的核苷酸。在一些实施方案中,各慢解离速率适配体以≥30分钟、≥60分钟、≥90分钟、≥120分钟、≥150分钟、≥180分钟、≥210分钟或≥240分钟的解离速率(t1/2)结合生物标志物蛋白。
在本文所述的任何实施方案中,样品可以是血液样品。在本文所述的任何实施方案中,样品可选自血清样品或血浆样品。在本文所述的任何实施方案中,样品是血浆样品。在一些实施方案中,在获得样品之前,受试者食用典型饮食,其中典型饮食不包括比平时禁食更长时间。
在一些实施方案中,选自SHBG、COL1A1、CRLF1:CLCF1复合物、FAM20B、COL15A1、KIN、SERPINA11、PELI2、MARCKSL1、CHAD、IL20RB、MYOC、WFDC11、MAP2K4、CALB1、FGFR4、OSTM1、ITIH1、CFAP45和SFTPD的至少一种生物标志物的水平高于相应生物标志物的对照水平指示受试者具有或可能具有葡萄糖耐量减低、患有前驱糖尿病,和/或可能发展为前驱糖尿病或糖尿病。
在一些实施方案中,选自INHBC、ACY1、RTN4R、CBX7、TFF3、HTRA1、FABP12、GAD1、CPM、SVEP1、SOCS7、F9、DLK1、HERC1、STC1、CCL16、SMCO2、GPX2、CCL23、RNASE10和ZNF134的至少一种生物标志物的水平低于相应生物标志物的对照水平指示受试者具有或可能具有葡萄糖耐量减低、患有前驱糖尿病,和/或可能发展为前驱糖尿病或糖尿病。
在一些实施方案中,本文所述的方法用于确定医疗保险费或人寿保险费的目的。在一些实施方案中,一种方法还包括确定医疗保险费或人寿保险费。在一些实施方案中,本文所述的方法还包括使用由所述方法得到的信息预测和/或管理医疗资源的利用。
在一些实施方案中,提供了试剂盒。在一些实施方案中,试剂盒包含N种生物标志物蛋白捕获试剂,其中N为至少3,并且其中N种生物标志物蛋白捕获试剂中的至少一种特异性结合选自ACY1、COL1A1、RTN4R、CRLF1:CLCF1复合物、CBX7、KIN、SERPINA11、PELI2、TFF3、FABP12、GAD1、SVEP1、SOCS7、F9、STC1、MYOC、WFDC11、CALB1、CCL16、SMCO2、CCL23、OSTM1、RNASE10、ITIH1、ZNF134、CFAP45和SFTPD的生物标志物蛋白。在一些实施方案中,N为3至41,N为4至41,N为5至41,或N为6至41,或N为7至41,或N为8至41,或N为9至41,或N为10至41,或N为11至41,或N为12至41,或N为13至41,或N为14至41,或N为15至41,或N为16至41,或N为至少4,或N为至少5,或N为至少6,或N为至少7,或N为至少8,或N为至少9,或N为至少10,或N为至少11,或N为至少12,或N为至少13,或N为至少14,或N为至少15,或N为至少16。在一些实施方案中,N为3,或N为4,或N为5,或N为6,或N为7,或N为8,或N为9,或N为10,或N为11,或N为12,或N为13,或N为14,或N为15,或N为16,或N为17,或N为18,或N为19,或N为20,或N为21,或N为22,或N为23,或N为24,或N为25,或N为26,或N为27,或N为28,或N为29,或N为30,或N为31,或N为32,或N为33,或N为34,或N为35,或N为36,或N为37,或N为38,或N为39,或N为40,或N为41。在一些这样的实施方案中,所述试剂盒用于检测样品中N种生物标志物蛋白的水平,其中样品来自受试者。在一些实施方案中,所述试剂盒用于确定受试者是否具有或是否可能具有葡萄糖耐量减低、是否患有前驱糖尿病,和/或是否可能发展为前驱糖尿病或糖尿病。
在一些实施方案中,N种生物标志物中的每一种选自表1。在一些实施方案中,N种生物标志物蛋白中的至少一种选自ACY1、COL1A1、RTN4R、CRLF1:CLCF1复合物、CBX7和KIN。在一些实施方案中,N种生物标志物蛋白中的一种或两种是INHBC和/或SHBG。在一些实施方案中,N种蛋白生物标志物中的至少2种或至少3种选自ACY1、COL1A1、RTN4R、CRLF1:CLCF1复合物、CBX7、KIN、SERPINA11、PELI2、TFF3、FABP12、GAD1、SVEP1、SOCS7、F9、STC1、MYOC、WFDC11、CALB1、CCL16、SMCO2、CCL23、OSTM1、RNASE10、ITIH1、ZNF134、CFAP45和SFTPD。在一些实施方案中,N种生物标志物蛋白中的至少一种选自FAM20B、COL15A1、MARCKSL1、HTRA1、CHAD、CPM、DLK1、HERC1、IL20RB、MAP2K4、GPX2和FGFR4。在一些实施方案中,N种生物标志物蛋白中的两种是INHBC和ACY1,或N种生物标志物蛋白中的两种是SHBG和ACY1,或N种生物标志物蛋白中的三种是INHBC、SHBG和ACY1。在一些实施方案中,N种生物标志物蛋白中的两种是INHBC和COL1A1,或N种生物标志物蛋白中的两种是SHBG和COL1A1,或其中N种生物标志物蛋白中的三种是INHBC、SHBG和COL1A1。在一些实施方案中,N种生物标志物蛋白中的两种是INHBC和RTN4R,或N种生物标志物蛋白中的两种是SHBG和RTN4R,或其中N种生物标志物蛋白中的三种是INHBC、SHBG和RTN4R。在一些实施方案中,N种生物标志物蛋白中的两种是INHBC和CRLF1:CLCF1复合物,或N种生物标志物蛋白中的两种是SHBG和CRLF1:CLCF1复合物,或其中N种生物标志物蛋白中的三种是INHBC、SHBG和CRLF1:CLCF1复合物。在一些实施方案中,N种生物标志物蛋白中的两种是INHBC和CBX7,或N种生物标志物蛋白中的两种是SHBG和CBX7,或其中N种生物标志物蛋白中的三种是INHBC、SHBG和CBX7。在一些实施方案中,N种生物标志物蛋白中的两种是INHBC和KIN,或N种生物标志物蛋白中的两种是SHBG和KIN,或其中N种生物标志物蛋白中的三种是INHBC、SHBG和KIN。在一些实施方案中,N为至少五并且N种生物标志物蛋白中的五种是INHBC、SHBG、ACY1、COL1A1和RTN4R。在一些实施方案中,N为至少16,并且其中N种生物标志物蛋白中的16种是ACY1、COL1A1、RTN4R、CRLF1、CBX7、KIN、SERPINA11、PELI2、TFF3、FABP12、INHBC、SHBG、FAM20B、COL15A1、MARCKSL1和HTRA1。
在一些实施方案中,各生物标志物捕获试剂是抗体或适配体。在一些实施方案中,各生物标志物捕获试剂是适配体。在一些实施方案中,至少一种适配体是慢解离速率适配体。
在一些实施方案中,各慢解离速率适配体以≥30分钟、≥60分钟、≥90分钟、≥120分钟、≥150分钟、≥180分钟、≥210分钟或≥240分钟的解离速率(t1/2)结合生物标志物蛋白。
在本文所述的任何实施方案中,样品可以是血液样品。在本文所述的任何实施方案中,样品可选自血清样品和血浆样品。在一些实施方案中,样品是血浆样品。
在本文所述的任何实施方案中,N种生物标志物蛋白中的每一种不同于其他N种生物标志物蛋白。在本文所述的任何实施方案中,至少一种慢解离速率适配体可包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少10个具有修饰的核苷酸。在一些实施方案中,修饰是疏水修饰。在一些实施方案中,修饰是疏水碱基修饰。在一些实施方案中,一种或多种修饰可选自图2所示的修饰。
附图说明
图1A-C示出包含N种生物标志物蛋白的模型的AUC、敏感性和特异性,如实施例4中所述。图1A示出其中一次将一种生物标志物蛋白添加到模型中的模型的结果,如实施例4中所述。图1B示出其中一次从模型中去除一种生物标志物蛋白的模型的结果,如实施例4中所述。图1C示出包含来自表1的随机选择的N种生物标志物的模型的结果,如实施例4中所述。
图2示出可以用于适配体的某些核碱基修饰。
图3示出用于与本文所述的各种计算机实现的方法一起使用的非限制性示例性计算机系统。
图4示出相对于通过传统OGTT确定的分类(x轴)的通过实施例2中描述的方法确定的葡萄糖耐量状态(y轴)。
具体实施方式
虽然将结合某些代表性实施方案描述本发明,但是应理解,本发明由权利要求限定,并且不限于那些实施方案。
本领域技术人员将认识到,类似或等同于本文所述的那些方法和材料的许多方法和材料可用于本发明的实践。本发明绝不限于所描述的方法和材料。
除非另外定义,否则本文使用的技术术语和科学术语具有本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义。尽管与本文所述的那些相类似或等同的任何方法、装置和材料均可以用于本发明的实践,但是本文描述了某些方法、装置和材料。
本文所引用的所有出版物、公布的专利文献以及专利申请特此以引用的方式并入,其引用程度就如同具体地并且个别地指示每一单个出版物、公布的专利文献、或专利申请是以引用的方式并入。
如在包括随附权利要求书的本申请中所用,除非上下文另外明确规定,否则单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数形式,并且可与“至少一个/种”和“一个或多个/一种或多种”互换使用。因此,提及“适配体”包括适配体的混合物,提及“探针”包括探针的混合物,等等。
如本文所用,术语“包含(comprises、comprising)”、“包括(includes、including)”、“含有(contains、containing)”及其任何变型旨在涵盖非排他性的包括,使得包含、包括或含有一种要素或要素列表的过程、方法、方法限定产品(product-by-process)或物质组成(composition of matter)可包括其他未明确列出的要素。
本申请包括用于确定受试者是否具有或是否可能具有葡萄糖耐量减低,或者是否患有或是否可能发展为前驱糖尿病和/或糖尿病的生物标志物、方法、装置、试剂、系统和试剂盒。在一些实施方案中,提供了用于确定具有葡萄糖耐量减低的受试者是否患有或是否可能发展为前驱糖尿病或糖尿病的生物标志物、方法、装置、试剂、系统和试剂盒。
如本文所用,术语“CRLF1:CLCF1复合物”用于指CRLF1和/或CLCF1和/或CRLF1和CLCF1的复合物。因此,如果一种方法包括检测生物标志物“CRLF1:CLCF1复合物”,则所述方法可包括检测CRLF1、CLCF1、CRLF1和CLCF1两者,和/或CRLF1和CLCF1的复合物。特异性结合CRLF1:CLCF1复合物的生物标志物捕获试剂可结合CRLF1和/或CLCF1和/或CRLF1和CLCF1两者和/或CRLF1和CLCF1的复合物。
在一些实施方案中,提供了一种或多种生物标志物,其单独或以各种组合使用以确定受试者是否具有或是否可能具有葡萄糖耐量减低或者是否患有或是否可能发展为前驱糖尿病和/或糖尿病。如下文所详细描述的,示例性实施方案包括表1中提供的生物标志物。
使用基于多重适配体的测定来鉴定生物标志物。表1列出可用于将从葡萄糖耐受个体获得的样品与从具有葡萄糖耐量减低的个体获得的样品区分开来的生物标志物。
术语“敏感性”和“特异性”在本文关于基于在生物样品中检测到的一种或多种生物标志物水平将个体正确分类为患有疾病或未患有疾病的能力使用。在一些实施方案中,术语“敏感性”和“特异性”在本文可关于基于在生物样品中检测到的一种或多种生物标志物水平将个体正确分类为具有葡萄糖耐量减低或具有正常葡萄糖耐量的能力使用。在此类实施方案中,“敏感性”指示一种或多种生物标志物在正确分类具有葡萄糖耐量减低的个体方面的性能。“特异性”指示一种或多种生物标志物在正确分类不具有葡萄糖耐量减低的个体方面的性能。例如,用于测试对照样品(诸如来自已知不具有葡萄糖耐量减低的健康个体或受试者的样品)和测试样品(诸如来自具有葡萄糖耐量减低的个体的样品)集合的生物标志物小组的85%特异性和90%敏感性指示85%的对照样品通过该小组正确分类为对照样品,并且90%的测试样品通过该小组正确分类为测试样品。
在一些实施方案中,术语“敏感性”和“特异性”在本文可关于基于在生物样品中检测到的一种或多种生物标志物水平将个体正确分类为具有葡萄糖耐量减低的能力使用,所述葡萄糖耐量减低通常是前驱糖尿病的指征,并且在一些情况下可指示糖尿病。“敏感性”指示一种或多种生物标志物在正确分类具有葡萄糖耐量减低的个体方面的性能,所述葡萄糖耐量减低通常是前驱糖尿病的指征,并且在一些情况下可指示糖尿病。“特异性”指示一种或多种生物标志物在正确分类不具有葡萄糖耐量减低的个体方面的性能,所述葡萄糖耐量减低通常是前驱糖尿病的指征,并且在一些情况下可指示糖尿病。例如,用于测试来自具有正常葡萄糖耐量的个体的样品集合的生物标志物小组的85%特异性和90%敏感性将导致85%的个体被正确分类。同样,在来自具有葡萄糖耐量减低的个体的样品集合中,将正确分类90%的个体。
在一些实施方案中,一种或多种生物标志物的小组的整体性能通过曲线下面积(AUC)值表示。AUC值从接受者工作特征(receiver operating characteristic,ROC)曲线得出。ROC曲线是测试的真阳性率(敏感性)针对测试的假阳性率(1-特异性)的曲线图。术语“曲线下面积”或“AUC”是指接受者工作特征(ROC)曲线的曲线下面积,这两者都是本领域众所周知的。AUC度量对于比较分类器在整个数据范围内的准确性很有用。具有较大AUC的分类器在两个感兴趣的组(例如,正常个体和糖尿病个体,或具有葡萄糖耐量减低的个体和可能患有糖尿病的个体)之间正确分类未知项的能力更大。ROC曲线可用于绘制特定特征(例如,本文所述的任何生物标志物和/或另外的生物医学信息的任何项目)在区分两个群体方面的性能。通常,基于单一特征的值以递升顺序对整个群体内的特征数据排序。然后,对于所述特征的每个值,计算所述数据的真阳性率和假阳性率。真阳性率是通过对高于所述特征的值的病例数量进行计数,然后除以病例总数来确定的。假阳性率是通过对高于所述特征的值的对照的数量进行计数,然后除以对照的总数来确定的。虽然此定义是指与对照相比在病例中特征是升高的情况,但此定义还适用于与对照相比在病例中特征较低的情况(在这种情况下,将对低于所述特征的值的样品计数)。ROC曲线可以针对单一特征以及其他单一输出而生成,例如两个或更多个特征的组合可以用数学方式组合(例如,相加、相减、相乘,等等)以提供单一总和值,并且这个单一总和值可以绘制于ROC曲线中。此外,多个特征的任何组合(其中所述组合得到单一输出值)都可以绘制于ROC曲线中。
如本文所用,关于受试者的“肥胖”是指BMI为30或更大的受试者。
“生物样品”和“样品”在本文可互换使用,以指代从个体获得或以其他方式来源于所述个体的任何材料、生物流体、组织或细胞。这包括血液(包括全血、白细胞、外周血单核细胞、血沉棕黄层、血浆和血清)、痰液、泪液、粘液、鼻腔冲洗液、鼻腔抽吸物、尿液、唾液、腹腔冲洗液、腹水、囊液、腺液、淋巴液、支气管抽吸物、滑液、关节抽吸物、器官分泌物、细胞、细胞提取物以及脑脊液。这还包括所有前述的实验分离的级分。例如,可以将血液样品分级成血清、血浆或含有诸如红血细胞或白血细胞(白细胞)的特定类型的血细胞的级分。在一些实施方案中,样品可以是来自个体的样品的组合,诸如组织和流体样品的组合。术语“生物样品”还包括含有均质化固体材料的材料,例如像来自粪便样品、组织样品或组织活检的材料。术语“生物样品”还包括源自组织培养或细胞培养的材料。用于获得生物样品的任何合适的方法都可以采用;示例性方法包括例如静脉切开术、拭子(例如,口腔拭子)以及细针抽吸活检程序。易进行细针抽吸的示例性组织包括淋巴结、肺、甲状腺、乳房、胰腺和肝脏。还可以例如通过显微解剖(例如,激光捕获显微解剖(LCM)或激光显微解剖(LMD))、膀胱冲洗、涂片(例如,PAP涂片)或导管灌洗来收集样品。从个体获得或得到的“生物样品”包括在从个体获得之后已经以任何合适的方式进行处理的任何此类样品。
如本文所用,“典型饮食”是指个体的日常饮食习惯。个体的典型饮食可与任何其他个体的典型饮食相同、相似或不同。典型饮食不包括饮食改变,诸如比平时禁食时间长、吃得比平时多或少,或考虑到医学测试而做出的任何饮食改变。
此外,在一些实施方案中,可通过从多个个体获取生物样品并将它们汇集,或汇集每个个体的生物样品的等分试样来得到生物样品。对于来自单个个体的样品,可如本文所述对汇集的样品进行处理,并且例如,如果在汇集样品中确定不良预后,则可以重新测试每个单独的生物样品以确定哪些个体具有葡萄糖耐量减低和/或患有或可能发展为前驱糖尿病或糖尿病。
“靶标”、“靶分子”和“分析物”在本文中可互换使用,以指代可能存在于生物样品中的任何感兴趣的分子。“感兴趣的分子”包括特定分子的任何微小变化,诸如在蛋白的情况下,氨基酸序列的微小变化、二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或任何其他操纵或修饰,诸如与标记组分缀合,其不会实质上改变分子身份。“靶分子”、“靶标”或“分析物”是指一种类型或种类的分子或多分子结构的拷贝的集合。“靶分子”、“靶标”和“分析物”是指多于一种类型或种类的分子或多分子结构。示例性靶分子包括蛋白质、多肽、核酸、碳水化合物、脂质、多糖、糖蛋白、激素、受体、抗原、抗体、亲合体、抗体模拟物、病毒、病原体、毒性物质、底物、代谢物、过渡态类似物、辅因子、抑制剂、药物、染料、营养物、生长因子、细胞、组织以及前述物质中的任一种的任何片段或部分。在一些实施方案中,靶分子是蛋白质,在这种情况下,靶分子可称为“靶蛋白”。
如本文所用,“捕获剂”或“捕获试剂”是指能够与生物标志物蛋白特异性结合的分子。“生物标志物蛋白捕获试剂”是指能够与生物标志物蛋白特异性结合的分子。非限制性的示例性捕获试剂包括适配体、抗体、阿德奈汀(adnectin)、锚蛋白、其他抗体模拟物和其他蛋白支架、自身抗体、嵌合体、小分子、核酸、凝集素、配体结合受体、印迹聚合物、高亲合性多聚体(avimer)、拟肽、激素受体、细胞因子受体、合成受体,以及任何上述捕获试剂的修饰形式和片段。在一些实施方案中,捕获试剂选自适配体和抗体。
术语“抗体”是指任何种类的全长抗体以及此类抗体的片段和衍生物,包括Fab片段、F(ab')2片段、单链抗体、Fv片段以及单链Fv片段。术语“抗体”还指合成衍生的抗体,诸如噬菌体展示衍生的抗体和片段、亲合体、纳米抗体等。
如本文所用,“标志物”和“生物标志物”可互换使用,以指代靶分子,其指示个体中的正常或异常过程或个体中的疾病或其他状况或者是个体中的正常或异常过程或个体中的疾病或其他状况的标志。更具体地,“标志物”或“生物标志物”是与特定生理状态或过程的存在相关的解剖学、生理学、生物化学或分子参数,无论所述生理状态或过程是正常的还是异常的,并且如果是异常的,则无论是慢性的还是急性的。生物标志物可通过多种方法检测和测量,包括实验室测定和医学成像。在一些实施方案中,生物标志物是靶蛋白。
如本文所用,“生物标志物水平”和“水平”是指如下测量结果,其使用用于检测生物样品中的生物标志物的任何分析方法得到,并且指示生物样品中的生物标志物的、对于或对应于生物样品中的生物标志物的存在、不存在、绝对量或浓度、相对量或浓度、滴度、水平、表达水平、测量水平的比率等。“水平”的确切性质取决于用于检测生物标志物的特定分析方法的具体设计和组分。
靶分子的“对照水平”是指来自未患有疾病或病状的个体或来自不疑似患有疾病或病状的个体的相同样品类型中的靶分子的水平。靶分子的“对照水平”不需要在每次实践本发明的方法时都确定,并且可以是先前确定的水平,其用作参考或阈值来确定特定样品中的水平是高于还是低于正常水平。在一些实施方案中,本文所述方法中的对照水平是已在一个或多个具有正常葡萄糖耐量的受试者中观察到的水平。在一些实施方案中,本文所述方法中的对照水平是已在一个或多个具有葡萄糖耐量减低但不是糖尿病的受试者中观察到的水平。在一些实施方案中,本文所述方法中的对照水平是已在多个正常受试者或具有葡萄糖耐量减低但不是糖尿病的受试者中观察到的平均或均值水平,任选地加上或减去统计变异。
如本文所用,“个体”和“受试者”可互换使用以指代测试受试者或患者。个体可以是哺乳动物或非哺乳动物。在各种实施方案中,个体是哺乳动物。哺乳动物个体可以是人或非人。在各种实施方案中,个体是人。健康或正常个体是通过常规诊断方法无法检测到感兴趣的疾病或病状(诸如葡萄糖耐量减低)的个体。
“诊断(Diagnose、diagnosing、diagnosis)”及其变型是指基于一种或多种体征、症状、数据或与个体有关的其他信息检测、确定或识别所述个体的健康状态或状况。个体的健康状态可以被诊断为健康/正常(即,不存在疾病或病状的诊断)或诊断为有病/异常(即,存在疾病或病状的诊断或疾病或病状的特征的评估)。关于特定疾病或病状的术语“诊断(diagnose、diagnosing、diagnosis等)”包括疾病的初始检测;疾病的表征或分类;疾病的进展、缓解或复发的检测;以及在向个体施用治疗或疗法后疾病应答的检测。葡萄糖耐量减低的诊断包括将具有葡萄糖耐量减低的个体与具有正常葡萄糖耐量的个体区分开来。前驱糖尿病或糖尿病的诊断包括将患有糖尿病的个体与具有葡萄糖耐量减低但不是可能糖尿病的个体,以及与具有正常葡萄糖耐量的个体区分开来。
“预后(Prognose、prognosing、prognosis)”及其变型是指对患有疾病或病状的个体的疾病或病状的未来进程的预测(例如,预测患者存活率),并且此类术语涵盖在向个体施用治疗或疗法后评估疾病应答。
“评估(Evaluate、evaluating、evaluation)”及其变型既涵盖“诊断”和“预后”,还涵盖关于未患有疾病的个体的疾病或病状的未来进程的确定或预测以及关于疾病或病状将在表面已治愈所述疾病的个体中复发的可能性的确定或预测。术语“评估”还包括评估个体对疗法的应答,例如像预测个体是否可能对治疗剂产生有利应答或是否不太可能对治疗剂产生应答(或例如将经历毒性或其他不期望的副作用)、选择施用给个体的治疗剂,或监测或确定个体对已施用给所述个体的疗法的应答。因此,“评估”葡萄糖耐量可以包括,例如,以下中的任一个:预测个体的葡萄糖耐量的未来进程;预测葡萄糖耐量减低是否将进展为前驱糖尿病或糖尿病;预测前驱糖尿病或糖尿病的特定阶段是否将进展为前驱糖尿病或糖尿病的更高阶段;等等。
如本文所用,关于生物标志物水平的“检测”或“确定”包括用于观察和记录与生物标志物水平相对应的信号的仪器和生成所述信号所需要的一种或多种材料的使用。在各种实施方案中,使用任何合适的方法检测该水平,包括荧光、化学发光、表面等离子体共振、表面声波、质谱、红外光谱、拉曼光谱、原子力显微镜法、扫描隧道显微镜法、电化学检测方法、核磁共振、量子点等。
如本文所用,“具有葡萄糖耐量减低的受试者”是指已被诊断为具有葡萄糖耐量减低的受试者。在一些实施方案中,在例行体检、代谢综合征和肥胖的监测,或药物的可能副作用的监测期间怀疑葡萄糖耐量减低。
如本文所用,“患有前驱糖尿病的受试者”或“患有糖尿病的受试者”是指已被诊断为患有前驱糖尿病或糖尿病的受试者。在一些实施方案中,诊断前驱糖尿病或糖尿病包括上文针对葡萄糖耐量减低所述的方法。
如本文所用,“有发展病状风险的受试者”是指具有病状的一种或多种风险因素或合并症的受试者。在一些实施方案中,病状是糖尿病。与发展糖尿病相关的风险因素包括但不限于45岁或以上、男性、超重或BMI为约25kg/m2或更高、糖尿病家族史、体能活动少于每周3次、种族(例如,非裔美国人、西班牙裔/拉丁裔美国人、美洲印第安人或阿拉斯加原住民)、妊娠糖尿病史和/或多囊综合征史。
如本文所用,“可能”是指概率高于0.50。
“固体支持体”在本文是指具有分子可通过共价键或非共价键直接或间接附接的表面的任何基材。“固体支持体”可以具有多种物理形式,可以包括例如膜;芯片(例如,蛋白质芯片);载物片(例如,载玻片或盖玻片);柱;中空、实心、半实心、含有孔隙或腔体的颗粒,例如像珠粒;凝胶;纤维,包括光纤材料;基质;以及样品容器。示例性样品容器包括样品孔、管、毛细管、小瓶以及能够容纳样品的任何其他容器、凹槽或凹口。样品容器可以包含在多样品平台上,诸如微量滴定板、载物片、微流体装置等。支持体可以由天然或合成材料、有机或无机材料构成。捕获试剂附接在其上的固体支持体的组成通常取决于附接方法(例如,共价附接)。其他示例性容器包括微滴和微流体受控的或本体的(bulk)油/水乳液,可以在其中进行测定和相关操纵。合适的固体支持体包括,例如,塑料、树脂、多糖、二氧化硅或基于二氧化硅的材料、功能化玻璃、改性硅、碳、金属、无机玻璃、膜、尼龙、天然纤维(例如像,丝绸、羊毛和棉花)、聚合物等。构成固体支持体的材料可以包括反应性基团,例如像羧基、氨基或羟基,所述基团用于捕获试剂的附接。聚合物固体支持体可以包括,例如,聚苯乙烯、聚四苯二甲酸乙二醇酯、聚乙酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙烯腈、聚甲基丙烯酸甲酯、聚四氟乙烯、丁基橡胶、丁苯橡胶(styrenebutadiene rubber)、天然橡胶、聚乙烯、聚丙烯、(聚)四氟乙烯、(聚)偏二氟乙烯、聚碳酸酯以及聚甲基戊烯。可以使用的合适的固体支持体颗粒包括,例如,编码颗粒,诸如型编码颗粒、磁性颗粒和玻璃颗粒。
生物标志物的示例性使用
在各种示例性实施方案中,提供了用于确定受试者是否具有或是否可能具有葡萄糖耐量减低、是否患有前驱糖尿病和/或是否可能发展为前驱糖尿病或糖尿病的方法。在各种实施方案中,提供了一种用于确定受试者是否具有葡萄糖耐量减低和/或是否可能发展为前驱糖尿病或糖尿病的方法,包括从受试者获得样品,形成具有N种生物标志物蛋白的生物标志物小组,以及检测样品中N种生物标志物蛋白中的每一种的水平,其中N为至少3,并且其中N种生物标志物蛋白中的至少一种选自ACY1、COL1A1、RTN4R、CRLF1:CLCF1复合物、CBX7、KIN、SERPINA11、PELI2、TFF3、FABP12、GAD1、SVEP1、SOCS7、F9、STC1、MYOC、WFDC11、CALB1、CCL16、SMCO2、CCL23、OSTM1、RNASE10、ITIH1、ZNF134、CFAP45和SFTPD。
在各种实施方案中,N种生物标志物中的每一种选自表1。
表1:用于本文所述的实施方案的生物标志物
在一些实施方案中,与具有正常葡萄糖耐量的个体相比,生物标志物在具有葡萄糖耐量减低的个体中以不同的水平存在。
个体中生物标志物的差异水平的检测可以用于,例如,允许确定个体是否具有或是否可能具有葡萄糖耐量减低,或者具有葡萄糖耐量减低的个体是否患有前驱糖尿病或是否可能发展为前驱糖尿病。在一些实施方案中,本文所述的任何生物标志物可用于监测个体葡萄糖耐量减低的发展,或监测具有葡萄糖耐量减低的个体的前驱糖尿病或糖尿病的发展。
作为可以使用本文所述的任何生物标志物确定受试者是否具有或是否可能具有葡萄糖耐量减低的方式的一个实例,未被诊断为具有葡萄糖耐量减低但具有一种或多种葡萄糖耐量减低风险因素或合并症的个体中的一种或多种所述生物标志物的水平可在比将使用不同测试所确定的更早期指示所述个体已发展为葡萄糖耐量减低。通过在早期检测葡萄糖耐量减低,医疗干预可更有效。这种医疗干预可包括但不限于减重和血糖控制。在一些实施方案中,可使用治疗剂,诸如胰岛素或二甲双胍。
类似地,作为可以使用本文所述的生物标志物确定具有葡萄糖耐量减低的受试者是否正在发展为前驱糖尿病或糖尿病的方式的另一个实例,具有葡萄糖耐量减低的个体中的一种或多种所述生物标志物的水平可指示个体正在发展为前驱糖尿病或糖尿病。通过在早期检测前驱糖尿病或糖尿病,医疗干预可更有效。这种医疗干预可包括但不限于减重和血糖控制。在一些实施方案中,可使用治疗剂,诸如胰岛素或二甲双胍。
此外,在一些实施方案中,个体的一种或多种生物标志物随时间推移的差异表达水平可指示个体对特定治疗方案的应答。在一些实施方案中,在随访监测期间一种或多种生物标志物的表达变化可指示特定疗法是有效的,或者可表明应以某种方式改变治疗方案,诸如通过更积极地控制血糖、更积极地推进减重等。在一些实施方案中,个体的一种或多种生物标志物的表达水平随时间的推移保持不变可指示个体的葡萄糖耐量减低没有恶化,或者没有正在发展为前驱糖尿病或糖尿病。
除了将生物标志物水平作为独立的诊断测试进行测试之外,生物标志物水平还可以与单核苷酸多态性(SNP)或其他指示疾病易感性风险增加的遗传损伤或变异性的确定结合进行。
除了将生物标志物水平作为独立的诊断测试进行测试之外,生物标志物水平还可以与其他葡萄糖耐量减低筛查方法结合进行。在一些情况下,使用本文所述的生物标志物的方法可促进对葡萄糖耐量减低或前驱糖尿病或糖尿病实施更积极的治疗、更频繁的随访筛查等的医学和经济合理性。生物标志物也可用于开始在有发展为葡萄糖耐量减低风险但尚未被诊断为具有葡萄糖耐量减低的个体中进行治疗,如果诊断测试指示他们可能发展为所述疾病的话。
除了结合其他葡萄糖耐量减低诊断方法测试生物标志物水平之外,还可以结合其他类型的数据,尤其是指示个体葡萄糖耐量减低风险的数据来评估关于生物标志物的信息。各种这些数据可以通过自动化方法进行评估,诸如计算机程序/软件,其可以在计算机或其他设备/装置中实现。
生物标志物和生物标志物水平的检测和确定
可以使用多种已知分析方法中的任一种检测本文所述的生物标志物的生物标志物水平。在一个实施方案中,使用捕获试剂检测生物标志物水平。在各种实施方案中,捕获试剂可以暴露于溶液中的生物标志物或可以在捕获试剂固定在固体支持体上的同时暴露于生物标志物。在其他实施方案中,捕获试剂含有与固体支持体上的次要特征反应的特征。在这些实施方案中,捕获试剂可以暴露于溶液中的生物标志物,然后捕获试剂上的特征可以与固体支持体上的次要特征结合使用以将生物标志物固定在固体支持体上。基于待进行的分析的类型选择捕获试剂。捕获试剂包括但不限于适配体、抗体、阿德奈汀、锚蛋白、其他抗体模拟物和其他蛋白支架、自身抗体、嵌合体、小分子、F(ab')2片段、单链抗体片段、Fv片段、单链Fv片段、核酸、凝集素、配体结合受体、亲合体、纳米抗体、印迹聚合物、高亲合性多聚体、拟肽、激素受体、细胞因子受体和合成受体,以及这些的修饰形式和片段。
在一些实施方案中,使用生物标志物/捕获试剂复合物检测生物标志物水平。
在一些实施方案中,生物标志物水平从生物标志物/捕获试剂复合物得出并且间接检测,例如,作为生物标志物/捕获试剂相互作用之后的反应的结果,但取决于生物标志物/捕获试剂复合物的形成。
在一些实施方案中,直接从生物样品中的生物标志物检测生物标志物水平。
在一些实施方案中,使用允许同时检测生物样品中的两种或更多种生物标志物的多重模式(multiplexed format)来检测生物标志物。在多重模式的一些实施方案中,捕获试剂直接或间接、共价或非共价地固定在固体支持体上的离散位置。在一些实施方案中,多重模式使用离散的固体支持体,其中每个固体支持体具有与所述固体支持体相关的独特捕获试剂,例如像量子点。在一些实施方案中,使用单独装置检测要在生物样品中检测的多种生物标志物中的每一种。单独装置可以被配置成允许同时处理生物样品中的每种生物标志物。例如,可以使用微量滴定板,使得板中的每个孔用于分析生物样品中待检测的多种生物标志物中的一种或多种。
在一个或多个前述实施方案中,可以使用荧光标签来标记生物标志物/捕获试剂复合物的组分以实现生物标志物水平的检测。在各种实施方案中,可以使用已知技术将荧光标记与对本文所述的任何生物标志物具有特异性的捕获试剂缀合,然后可以使用荧光标记检测相应的生物标志物水平。合适的荧光标记包括稀土螯合物、荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰、别藻蓝蛋白、PBXL-3、Qdot 605、丽丝胺、藻红蛋白、德克萨斯红以及其他此类化合物。
在一些实施方案中,荧光标记是荧光染料分子。在一些实施方案中,荧光染料分子包括至少一个取代的吲哚鎓环系,其中吲哚鎓环的3-碳上的取代基含有化学反应性基团或共轭物质。在一些实施方案中,染料分子包括AlexFluor分子,例如像AlexaFluor 488、AlexaFluor 532、AlexaFluor 647、AlexaFluor 680或AlexaFluor 700。在一些实施方案中,染料分子包括第一类型和第二类型的染料分子,例如像两种不同的AlexaFluor分子。在一些实施方案中,染料分子包括第一类型和第二类型的染料分子,并且这两种染料分子具有不同的发射光谱。
荧光可以使用与广泛多种测定形式兼容的多种仪器来测量。例如,分光荧光计已被设计用于分析微量滴定板、显微镜载物片、印迹阵列、比色皿等。参见JR Lakowicz的Principles of Fluorescence Sp ectroscopy,Springer Science+Business Media,Inc.,2004。参见Bi oluminescence&Chemiluminescence:Progress&Current Applications;Philip E.Stanley和Larry J.Kricka编辑,World Scientific Publi shing Company,2002年1月。
在一个或多个实施方案中,化学发光标签可以任选地用于标记生物标志物/捕获复合物的组分以实现生物标志物水平的检测。合适的化学发光材料包括草酰氯、罗丹明6G、Ru(bipy)3 2+、TMAE(四(二甲基氨基)乙烯)、连苯三酚(1,2,3-三羟基苯)、光泽精(Lucigenin)、过氧化草酸酯、草酸芳基酯、吖啶酯、二氧杂环丁烷以及其他化学发光材料中的任一种。
在一些实施方案中,检测方法包括生成与生物标志物水平相对应的可检测信号的酶/底物组合。通常,酶催化显色底物的化学改变,可以使用各种技术测量,包括分光光度法、荧光和化学发光。合适的酶包括,例如,荧光素酶、萤光素、苹果酸脱氢酶、脲酶、辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、尿酸酶、黄嘌呤氧化酶、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。
在一些实施方案中,检测方法可以是荧光、化学发光、放射性核素或生成可测量信号的酶/底物组合的组合。在一些实施方案中,多模式信号传导在生物标志物测定形式中可以具有独特且有利的特征。
在一些实施方案中,可以使用任何分析方法检测本文所述的生物标志物的生物标志物水平,包括单重(singleplex)适配体测定、多重适配体测定、单重或多重免疫测定、mRNA表达谱、miRNA表达谱、质谱分析、组织学/细胞学方法等,如下文所论述。
使用基于适配体的测定来确定生物标志物水平
针对生物样品和其他样品中具有生理学意义的分子的检测和量化的测定是科学研究和医疗保健领域中的重要工具。一类这样的测定涉及使用包括一种或多种固定在固体支持体上的适配体的微阵列。所述适配体各自能够以高特异性方式且以非常高的亲和力与靶分子结合。参见,例如,标题为“Nucleic Acid Ligands”的美国专利第5,475,096号;另外参见,例如,美国专利第6,242,246号、美国专利第6,458,543号以及美国专利第6,503,715号,其中的每一个的标题均为“Nucleic Acid Ligand Diagnostic Biochip”。一旦微阵列与样品接触,适配体就与样品中存在的其各自的靶分子结合,从而能够确定与生物标志物相对应的生物标志物水平。
如本文所用,“适配体”是指对靶分子具有特异性结合亲和力的核酸。应认识到亲和力相互作用为程度问题;然而,在此背景下,适配体对其靶标的“特异性结合亲和力”意指所述适配体一般以比其结合测试样品中的其他组分高得多的亲和力程度结合其靶标。“适配体”为一种类型或种类的具有特定核苷酸序列的核酸分子的拷贝的集合。适配体可以包括任何合适数量的核苷酸,包括任何数量的经化学修饰的核苷酸。“适配体”是指分子的超过一种此类集合。不同的适配体可以具有相同或不同数量的核苷酸。适配体可以是DNA或RNA或经化学修饰的核酸,并且可以是单链、双链或含有双链区域,并且可以包括高阶结构。适配体还可以是光适配体,其中光反应性或化学反应性官能团包括在适配体中,以允许其共价连接至其相应靶标。本文公开的任何适配体方法可以包括使用特异性结合相同靶分子的两种或更多种适配体。如下文进一步描述的,适配体可包括标签。如果适配体包括标签,则适配体的所有拷贝不必须具有相同标签。此外,如果不同的适配体各自包括标签,那么这些不同的适配体可以具有相同的标签或不同的标签。
适配体可以使用任何已知的方法来鉴定,包括SELEX方法。一旦鉴定,适配体就可以根据任何已知方法制备或合成,包括化学合成方法和酶促合成方法。
术语“SELEX”和“SELEX方法”在本文中可互换使用以一般性地指代(1)以期望方式(例如以高亲和力结合蛋白)与靶标分子相互作用的适配体的选择,与(2)那些所选核酸的扩增的组合。所述SELEX方法可以用于鉴定对特定靶标或生物标志物具有高亲和力的适配体。
SELEX一般性地包括制备核酸的候选混合物、使候选混合物结合期望靶分子以形成亲和力复合物、分离亲和力复合物与未结合候选核酸、分离和离析核酸与亲和力复合物、纯化核酸,以及鉴定特定适配体序列。所述方法可包括多轮以进一步精化所选适配体的亲和力。所述方法可以在所述方法的一个或多个点处包括扩增步骤。参见例如标题为“Nucleic Acid Ligands”的美国专利第5,475,096号。所述SELEX方法可以用于生成共价结合其靶标的适配体以及非共价结合其靶标的适配体。参见例如标题为“SystematicEvolution of Nucleic Acid Ligands by Exponential Enrichment:Chemi-SELEX”的美国专利第5,705,337号。
SELEX方法可以用于鉴定含有修饰核苷酸的高亲和力适配体,所述核苷酸对适配体赋予改善特征,例如像改善的体内稳定性或改善的递送特征。此类修饰的实例包括在核糖和/或磷酸酯和/或碱基位置处的化学取代。SELEX方法鉴定的含有修饰核苷酸的适配体描述于标题为“High Affinity Nucleic Acid Ligands Containing ModifiedNucleotides”的美国专利第5,660,985号中,所述专利描述含有在嘧啶的5'和2'位置处以化学方式修饰的核苷酸衍生物的寡核苷酸。美国专利第5,580,737号(参见上文)描述含有用2'-氨基(2'-NH2)、2'-氟(2'-F)和/或2'-O-甲基(2'-OMe)修饰的一种或多种核苷酸的高度特异性适配体。另外参见标题为“SELEX and PHOTOSELEX”的美国专利申请公布第2009/0098549号,其描述具有扩展的物理和化学特性的核酸文库以及其在SELEX和光交联SELEX(photoSELEX)中的用途。
SELEX也可以用于鉴定具有期望解离速率特征的适配体。参见标题为“Method forGenerating Aptamers with Improved Off-Rates”的美国公布第2009/0004667号,其描述用于生成可以结合靶分子的适配体的改进的SELEX方法。描述了用于产生具有较慢的与其相应靶分子解离的速率的适配体和光适配体的方法。所述方法涉及使候选混合物与靶分子接触、允许发生核酸-靶标复合物的形成,以及执行慢解离速率富集方法,其中具有快解离速率的核酸-靶标复合物将解离且不再形成,而具有缓慢解离速率的复合物将保持完整。另外,所述方法包括在候选核酸混合物的产生中使用修饰核苷酸以生成具有改善的解离速率性能的适配体。非限制性的示例性修饰核苷酸包括,例如,图2所示的修饰嘧啶。在一些实施方案中,适配体包含至少一个具有修饰(诸如碱基修饰)的核苷酸。在一些实施方案中,适配体包含至少一个具有疏水修饰的核苷酸,诸如疏水碱基修饰,从而允许与靶蛋白的疏水接触。在一些实施方案中,此类疏水接触有助于适配体的更大亲和力和/或更慢解离速率结合。具有疏水修饰的非限制性的示例性核苷酸在图2中示出。在一些实施方案中,适配体包含至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少10个具有疏水修饰的核苷酸,其中每个疏水修饰可与其他修饰相同或不同。在一些实施方案中,适配体中的至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少10个疏水修饰可独立地选自图2所示的疏水修饰。
在一些实施方案中,慢解离速率适配体(包括包含至少一个具有疏水修饰的核苷酸的适配体)具有≥30分钟、≥60分钟、≥90分钟、≥120分钟、≥150分钟、≥180分钟、≥210分钟或≥240分钟的解离速率(t1/2)。
在一些实施方案中,测定采用包括光反应性官能团的适配体,所述官能团使得适配体能够共价结合或“光交联”其靶分子。参见例如标题为“Nucleic Acid LigandDiagnostic Biochip”的美国专利第6,544,776号。这些光反应性适配体也称为光适配体。参见,例如,美国专利第5,763,177号、美国专利第6,001,577号和美国专利第6,291,184号,其中的每一个的标题均为“Systematic Evolution of Nucleic Acid Ligands byExponential Enrichment:Photoselection of Nucleic Acid Ligands and SolutionSELEX”;另外参见,例如,标题为“Photoselection of Nucleic Acid Ligands”的美国专利第6,458,539号。在微阵列与样品接触并且光适配体有机会与其靶分子结合后,光适配体被光活化,并且洗涤固体支持体以去除任何非特异性结合的分子。可使用苛刻的洗涤条件,因为与光适配体结合的靶分子通常不被去除,这是由于光适配体上的一个或多个光活化的官能团产生的共价键。以此方式,该测定能够检测与测试样品中的生物标志物相对应的生物标志物水平。
在一些测定形式中,适配体在与样品接触之前固定在固体支持体上。然而,在某些情况下,在与样品接触之前固定适配体可能无法提供最佳测定。例如,适配体的预固定可能导致适配体与靶分子在固体支持体的表面上低效混合,这可能导致反应时间长,并且因此孵育时间段延长以允许适配体有效结合其靶分子。此外,当在测定中且取决于用作固体支持体的材料使用光适配体时,固体支持体可倾向于散射或吸收所使用的光以影响光适配体与其靶分子之间共价键的形成。此外,取决于所采用的方法,靶分子与其适配体的结合的检测可能不精确,因为固体支持体的表面也可能暴露于所使用的任何标记剂并受其影响。最后,将适配体固定在固体支持体上通常涉及在将适配体暴露于样品之前的适配体准备步骤(即,固定),并且该准备步骤可能影响适配体的活性或功能。
允许适配体在溶液中捕获其靶标并且接着采用旨在于检测之前去除适配体-靶标混合物的特定组分的分离步骤的适配体测定也已经有所描述(参见标题为“MultiplexedAnalyses of Test Samples”的美国公布第2009/0042206号)。所描述的适配体测定方法能够通过检测和量化核酸(即适配体)来检测和量化测试样品中的非核酸靶标(例如,蛋白质靶标)。所述方法产生用于检测和量化非核酸靶标的核酸替代物(即,适配体),从而允许将包括扩增在内的广泛多种核酸技术应用于更广泛的期望靶标,包括蛋白质靶标。
可以构建适配体以促进从适配体生物标志物复合物(或光适配体生物标志物共价复合物)中分离测定组分,并允许分离适配体以用于检测和/或量化。在一个实施方案中,这些构建体可以包括适配体序列内的可切割或可释放元件。在其他实施方案中,可以将另外的功能引入适配体中,例如,标记的或可检测的组分、间隔子组分,或特异性结合标签或固定元件。例如,适配体可以包括通过可切割部分与适配体连接的标签、标记、分隔标记的间隔子组分,以及可切割部分。在一个实施方案中,可切割元件是可光切割的接头。可光切割的接头可以附接于生物素部分和间隔子区段,可以包括用于胺衍生化的NHS基团,并且可以用于将生物素基团引入适配体,从而允许适配体稍后在测定方法中释放。
使用所有处于溶液中的测定组分进行的均相测定不需要在检测信号之前将样品和试剂分开。这些方法快速且易于使用。这些方法基于与其特定靶标反应的分子捕获或结合试剂生成信号。在本文所述方法的一些实施方案中,分子捕获试剂包括适配体或抗体等,并且特定靶标可以是表1所示的生物标志物。
在一些实施方案中,用于信号生成的方法利用由于荧光团标记的捕获试剂与其特异性生物标志物靶标的相互作用引起的各向异性信号变化。当标记的捕获物与其靶标发生反应时,增加的分子量导致附接于复合物的荧光团的旋转运动变得慢得多,从而改变各向异性值。通过监测各向异性变化,结合事件可用于定量地测量溶液中的生物标志物。其他方法包括荧光偏振测定、分子信标法、时间分辨荧光猝灭、化学发光、荧光共振能量转移等。
可以用于检测生物样品中的生物标志物水平的示例性的基于溶液的适配体测定包括以下:(a)通过使生物样品与包括第一标签并对生物标志物具有特异性亲和力的适配体接触来制备混合物,其中当样品中存在生物标志物时形成适配体亲和复合物;(b)将混合物暴露于包括第一捕获元件的第一固体支持体,并允许第一标签与第一捕获元件缔合;(c)去除混合物中未与第一固体支持体缔合的任何组分;(d)将第二标签附接于适配体亲和复合物的生物标志物组分;(e)使适配体亲和复合物从第一固体支持体上释放;(f)将释放的适配体亲和复合物暴露于包括第二捕获元件的第二固体支持体并允许第二标签与第二捕获元件缔合;(g)通过将非复合适配体与适配体亲和复合物分开,从混合物中去除任何非复合的适配体;(h)从固体支持体上洗脱适配体;以及(i)通过检测适配体亲和复合物的适配体组分来检测生物标志物。
在实施例3中描述了使用适配体检测生物样品中的生物标志物的非限制性的示例性方法。另外参见Kraemer等人,PLoS One 6(10):e26332。
使用免疫测定确定生物标志物水平
免疫测定方法是基于抗体与其对应靶或分析物(诸如生物标志物蛋白)的反应并且可以取决于具体的测定形式来检测样品中的分析物。为了改善基于免疫反应性的测定方法的特异性和敏感性,单克隆抗体及其片段由于其特异性表位识别而被经常使用。多克隆抗体也由于其对靶标的亲和力相比单克隆抗体有所增加而被成功地用于各种免疫测定中。已经设计出用于广泛范围的生物样品基质的免疫测定。已经设计出提供定性、半定量以及定量结果的免疫测定形式。
定量结果通过使用以已知浓度的待检测的特定分析物产生的标准曲线产生。将来自未知样品的应答或信号绘制到标准曲线上,并且确定与未知样品中的靶标相对应的量或水平。
已经设计出许多免疫测定形式。ELISA或EIA可以定量地检测分析物。这种方法依赖于标记与分析物或抗体的附接,并且标记组分直接地抑或间接地包括酶。ELISA试验的形式可以针对分析物的直接、间接、竞争性或夹心检测。其他方法依赖于标记,例如像放射性同位素(I125)或荧光。另外的技术包括例如凝集法、浊度测定法、比浊法、蛋白质免疫印迹、免疫沉淀法、免疫细胞化学、免疫组织化学、流式细胞术、Luminex测定以及其他(参见ImmunoAssay:A Practical Guide,由Brian Law编著,Taylor&Francis,Ltd.出版,2005版)。
示例性测定形式包括酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定、荧光、化学发光,以及荧光共振能量转移(FRET)或时间分辨FRET(TR-FRET)免疫测定。用于检测生物标志物的程序的实例包括生物标志物免疫沉淀,接着进行允许大小和肽水平判别的定量方法,诸如凝胶电泳、毛细管电泳、平面电色谱法等。
检测和/或用于量化可检测的标记或产生信号的材料的方法取决于标记的性质。由适当酶所催化的反应的产物(其中可检测的标记是酶;参见以上)可以是(但不限于)荧光的、发光的或放射性的,或它们可吸收可见光或紫外光。适合用于检测这类可检测标记的检测器的实例包括但不限于,x射线胶片、放射性计数器、闪烁计数器、分光光度计、色度计、荧光计、光度计以及光密度计。
用于检测的任何方法都可以按允许反应的任何合适的制备、处理以及分析的任何形式来进行。这可以是例如在多孔测定板(例如,96孔或386孔)中进行或者使用任何合适的阵列或微阵列进行。不同剂的储备溶液可以手动或自动制备,并且所有后续的移液、稀释、混合、分配、洗涤、孵育、样品读出、数据收集和分析都可以使用可商购获得的分析软件、机器人技术(robotics)以及能够检测可检测标记的检测仪器自动进行。
使用基因表达谱确定生物标志物水平
在一些实施方案中,测量生物样品中的mRNA可用作检测生物样品中对应蛋白质的水平的替代方案。因此,在一些实施方案中,本文所描述的生物标志物或生物标志物小组可以通过检测适当的RNA来检测。
在一些实施方案中,mRNA表达水平是通过反转录定量聚合酶链式反应(RT-PCR,接着用qPCR)来测量的。RT-PCR被用于由mRNA产生cDNA。cDNA可用于qPCR测定中以随着DNA扩增过程进展而产生荧光。通过与标准曲线相比较,qPCR可以产生绝对测量值,诸如每个细胞的mRNA拷贝数。RNA印迹、微阵列、侵入测定(Invader assay)以及RT-PCR结合毛细管电泳都已经被用于测量样品中mRNA的表达水平。参见Gene Expression Profiling:Methods andProtocols,Richard A.Shimkets编著,Humana Press,2004。
使用体内分子成像技术检测生物标志物
在一些实施方案中,本文所述的生物标志物可用于分子成像测试。例如,可以将成像剂与捕获试剂偶联,所述捕获试剂可以用于在体内检测生物标志物。
体内成像技术提供了用于确定个体身体中的特定疾病的状态的非侵入性方法。例如,身体的整个部分,或甚至整个身体,可作为三维图像查看,从而提供有关身体中的形态和结构的有价值的信息。此类技术可与本文所述的生物标志物的检测组合,以提供有关体内生物标志物的信息。
由于技术的各种进步,体内分子成像技术的使用正在扩大。这些进步包括开发新的造影剂或标记,诸如放射性标记和/或荧光标记,所述标记可以在体内提供强信号;以及开发强大的新成像技术,其可以检测和分析来自身体外部的这些信号,具有足够的敏感性和准确性,以提供有用的信息。造影剂可以在适当的成像系统中可视化,从而提供造影剂所定位的身体的一个或多个部分的图像。造影剂可结合或缔合捕获试剂,诸如适配体或抗体,和/或肽或蛋白质,或寡核苷酸(例如,用于基因表达的检测),或含有任何这些与一种或多种大分子和/或其他颗粒形式的复合物。
造影剂还可具有可用于成像的放射性原子。合适的放射性原子包括用于闪烁扫描研究的锝99m或碘123。其他易于检测的部分包括,例如,用于磁共振成像(MRI)的自旋标记,例如像碘123、碘131、铟111、氟19、碳13、氮15、氧17、钆、锰或铁。此类标记在本领域中是众所周知的并且可以由本领域普通技术人员容易地选择。
标准成像技术包括但不限于磁共振成像、计算机断层扫描、正电子发射断层摄影(PET)、单光子发射计算机断层摄影(SPECT)等。对于诊断性的体内成像,可用的检测仪器的类型是选择给定造影剂的主要因素,诸如给定的放射性核素和其用于靶向的特定生物标志物(蛋白质、mRNA等)。所选择的放射性核素通常具有给定类型的仪器可检测到的衰变类型。此外,在选择用于体内诊断的放射性核素时,其半衰期应足够长,以便在靶组织最大摄取时能够检测到,但又应足够短,以最大限度地减少对宿主的有害辐射。
示例性成像技术包括但不限于PET和SPECT,它们是其中放射性核素被合成或局部施用于个体的成像技术。随着时间的推移测量放射性示踪剂的后续摄取,并用于获取关于靶组织和生物标志物的信息。由于所使用的特定同位素的高能(γ射线)发射以及用于检测它们的仪器的敏感性和精密性,可从身体外部推断出放射性的二维分布。
PET中的常用正电子发射核素包括例如碳11、氮13、氧15和氟18。通过电子捕获和/或γ发射衰变的同位素用于SPECT并包括例如碘123和锝99m。用锝99m标记氨基酸的示例性方法是在螯合前体的存在下还原高锝酸根离子,以形成不稳定的锝99m前体络合物,所述络合物继而与双功能修饰的趋化肽的金属结合基团反应形成锝99m-趋化肽缀合物。
抗体经常用于这种体内成像诊断方法。用于体内诊断的抗体的制备和使用在本领域中是众所周知的。类似地,适配体可用于此类体内成像诊断方法。例如,用于鉴定本文所述的特定生物标志物的适配体可被适当地标记并注射到个体中以在体内检测生物标志物。如先前所述,将根据待使用的成像模式选择所使用的标记。与其他成像剂相比,适配体定向成像剂可以具有与组织穿透、组织分布、动力学、消除、效力和选择性相关的独特且有利的特征。
此类技术也可任选地用标记寡核苷酸进行,例如,用于通过使用反义寡核苷酸成像来检测基因表达。这些方法用于原位杂交,例如,与作为标记的荧光分子或放射性核素。用于检测基因表达的其他方法包括,例如,报告基因活性的检测。
另一种一般类型的成像技术是光学成像,其中通过受试者外部的光学装置检测受试者体内的荧光信号。这些信号可以是由实际荧光和/或生物发光造成的。光学检测装置敏感性的提高增加了光学成像在体内诊断测定中的有用性。
对于其他技术的综述,参见N.Blow,Nature Methods,6,465-469,2009。
使用组织学/细胞学方法确定生物标志物
在一些实施方案中,可使用组织学或细胞学方法在多种组织样品中检测本文所述的生物标志物。例如,对于组织学,可以使用支气管内和经支气管活检、细针抽吸物、切割针和核芯活检。对于细胞学,可以使用支气管冲洗液和刷检、胸膜穿刺抽液以及痰液。本文鉴定的任何生物标志物都可以用于对样本进行染色以作为疾病的指征。
在一些实施方案中,对一种或多种相应生物标志物具有特异性的一种或多种捕获试剂用于样品的细胞学评估中,并且可包括以下中的一个或多个:收集细胞样品、固定细胞样品、脱水、透明化、将细胞样品固定在显微镜载物片上、使细胞样品透化、用于分析物恢复(analyte retrieval)的处理、染色、脱色、洗涤、封闭,以及与缓冲溶液中的一种或多种捕获试剂反应。在另一个实施方案中,细胞样品由细胞块产生。
在一些实施方案中,对相应生物标志物具有特异性的一种或多种捕获试剂用于组织样品的组织学评估中,并且可包括以下中的一个或多个:收集组织样本、固定组织样品、脱水、透明化、将组织样品固定在显微镜载物片上、使组织样品透化、用于分析物恢复的处理、染色、脱色、洗涤、封闭、再水化,以及与缓冲溶液中的一种或多种捕获试剂反应。在另一个实施方案中,固定和脱水替换为冷冻。
在另一个实施方案中,对一种或多种相应生物标志物具有特异性的一种或多种适配体与组织学或细胞学样品反应并且可以在核酸扩增方法中用作核酸靶标。合适的核酸扩增方法包括例如PCR、q-β复制酶、滚环扩增、链置换、解旋酶依赖性扩增、环介导的等温扩增、连接酶链式反应,以及限制性和环化辅助的滚环扩增。
在一个实施方案中,将对用于组织学或细胞学评估的相应生物标志物具有特异性的一种或多种捕获试剂混合在缓冲溶液中,所述缓冲溶液可以包括以下中的任一种:封闭材料、竞争剂、去污剂、稳定剂、载体核酸、聚阴离子材料等。
“细胞学方案”通常包括样品收集、样品固定(sample fixation)、样品固定(sample immobilization)和染色。“细胞制备”可以包括样品收集后的几个处理步骤,包括使用一种或多种适配体对所制备的细胞进行染色。
使用质谱法确定生物标志物水平
可以使用多种质谱仪配置来检测生物标志物水平。几种类型的质谱仪是可供使用的或可以按不同配置来制造。一般来说,质谱仪具有以下主要部件:样品入口、离子源、质量分析器、检测器、真空系统、以及仪器控制系统和数据系统。样品入口、离子源以及质量分析器的差异通常限定了仪器的类型和其性能。例如,入口可以是毛细管柱液相色谱源或可以是直接探针或台,诸如基质辅助激光解吸中所使用的。常见的离子源是例如电喷雾(包括纳米喷雾和微米喷雾)或基质辅助激光解吸。常见的质量分析器包括四极滤质器、离子阱质量分析器以及飞行时间质量分析器。另外的质谱方法是本领域熟知的(参见Burlingame等人,Anal.Chem.70:647R-716R(1998);Kinter和Sherman,New York(2000))。
蛋白质生物标志物和生物标志物水平可以通过以下中的任一种来检测和测量:电喷雾电离质谱法(ESI-MS)、ESI-MS/MS、ESI-MS/(MS)n、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDI-TOF-MS)、表面增强的激光解吸/电离飞行时间质谱法(SELDI-TOF-MS)、硅解吸/电离(DIOS)、二次离子质谱法(SIMS)、四极飞行时间(Q-TOF)、串联飞行时间(TOF/TOF)技术(称为ultraflex III TOF/TOF)、大气压化学电离质谱法(APCI-MS)、APCI-MS/MS、APCI-(MS)N、大气压光电离质谱法(APPI-MS)、APPI-MS/MS以及APPI-(MS)N、四极质谱法、傅里叶变换质谱法(FTMS)、定量质谱法以及离子阱质谱法。
在质谱表征蛋白质生物标志物和确定生物标志物水平之前,使用样品制备策略来标记和富集样品。标记方法包括但不限于,用于相对定量和绝对定量的同量异位标签(iTRAQ)以及在细胞培养中的氨基酸稳定同位素标记(SILAC)。用于在质谱分析之前选择性地富集候选生物标志物蛋白质样品的捕获试剂包括但不限于,适配体、抗体、核酸探针、嵌合体、小分子、F(ab')2片段、单链抗体片段、Fv片段、单链Fv片段、核酸、凝集素、配体结合受体、亲合体、纳米抗体、锚蛋白、结构域抗体、替代性抗体支架(例如双特异抗体(diabody)等)印记的聚合物、高亲合性多聚体、拟肽、类胨、肽核酸、苏糖核酸、激素受体、细胞因子受体及合成受体,以及这些的修饰形式和片段。
前述测定能够检测可用于本文所述方法的生物标志物水平,其中所述方法包括在来自个体的生物样品中检测至少三种、至少四种、至少五种、至少六种、至少七种、至少八种或至少九种选自表1中的生物标志物的生物标志物。根据本文所述的任何方法,生物标志物水平可以单独检测和分类,或者可以共同检测和分类,如例如以多重测定形式。
生物标志物的分类和疾病评分的计算
在一些实施方案中,给定诊断测试的生物标志物“特征标签(signature)”含有生物标志物集合,每种生物标志物在感兴趣的群体中具有特征水平。在一些实施方案中,特征水平可指特定组中的个体的生物标志物水平的均值或平均值。在一些实施方案中,本文所述的诊断方法可以用于将来自个体的未知样品分配到具有葡萄糖耐量减低或正常葡萄糖耐量的两组中的一组中。在一些实施方案中,本文所述的诊断方法可以用于将来自个体的未知样品分配到正常葡萄糖耐量或葡萄糖耐量减低的两组中的一组中。在一些实施方案中,本文所述的诊断方法可以用于将来自个体的未知样品分配到以下三组中的一组中:正常葡萄糖耐量、没有前驱糖尿病或糖尿病的葡萄糖耐量减低,以及前驱糖尿病或糖尿病。
将样品分配到两个或更多个组中的一组中称为分类,并且用于完成这一分配的程序称为分类器或分类方法。分类方法也可称为评分方法。存在许多可以用于由生物标志物水平的集合构建诊断分类器的分类方法。在一些情况下,使用监督学习技术执行分类方法,其中使用从希望区分的两个(或更多个,对于多个分类状态)不同组内的个体获得的样品收集数据集。由于每个样品所属的类(组或群)对于每个样品都是提前知道的,因此可以训练分类方法以给出期望的分类响应。还可以使用无监督学习技术来产生诊断分类器。
用于开发诊断分类器的常用方法包括决策树;bagging+boosting+森林;基于规则推理的学习;帕尔森窗(Parzen Window);线性模型;逻辑(logistic);神经网络方法;无监督聚类;K-均值;分层升序/降序;半监督学习;原型方法;最邻近;核密度估计;支持向量机;隐马尔可夫模型(hidden Markov model);玻尔兹曼(Boltzmann)学习;并且分类器可以简单地或以最小化特定目标函数的方式组合。关于综述,参见例如Pattern Classification,R.O.Duda等人编辑,John Wiley&Sons,第2版,2001;另外参见,The Elements ofStatistical Learning-Data Mining,Inference,and Prediction,T.Hastie等人编辑,Springer Science+Business Media,LLC,第2版,2009。
为了使用监督学习技术产生分类器,获得被称为训练数据的样品集。在诊断测试的上下文中,训练数据包括来自不同组(类)的样品,未知样品稍后将被分配到所述组(类)中。例如,从对照群体中的个体和特定疾病群体中的个体收集的样品可以构成训练数据来开发分类器,所述分类器可以将未知样品(或更具体地,从中获得样品的个体)分类为具有疾病或没有疾病。由训练数据开发分类器称为训练分类器。分类器训练的具体细节取决于监督学习技术的性质。朴素贝叶斯分类器的训练是这种监督学习技术的一个实例(参见,例如,Pattern Classification,R.O.Duda等人编辑,John Wiley&Sons,第2版,2001;另外参见,The Elements of Statistical Learning-Data Mining,Inference,and Prediction,T.Hastie等人编辑,Springer Science+Business Media,LLC,第2版,2009)。例如,在美国公布第2012/0101002号和第2012/0077695号中描述了朴素贝叶斯分类器的训练。
由于通常在训练集中存在比样品多得多的潜在生物标志物水平,因此必须小心避免过度拟合。当统计模型描述随机误差或噪声而不是潜在关系时,就会发生过度拟合。可以通过多种方式避免过度拟合,包括,例如,通过限制用于开发分类器的生物标志物的数量、通过假设生物标志物应答彼此独立、通过限制所采用的基础统计模型的复杂性,以及通过确保基础统计模型符合所述数据。
使用生物标志物集合开发诊断测试的说明性实例包括应用朴素贝叶斯分类器,这是一种基于贝叶斯定理的简单的概率分类器,其中对生物标志物进行严格的独立处理。每种生物标志物通过每个类中测量得到的RFU值或log RFU(相对荧光单位)值的类依赖(class-dependent)概率密度函数(pdf)描述。一个类中的生物标志物集合的联合pdf被假定为每种生物标志的各个类依赖pdf的乘积。在这种情况下训练朴素贝叶斯分类器相当于分配参数(“参数化”)来表征类依赖pdf。可使用类依赖pdf的任何基础模型,但该模型通常应符合在训练集中观察到的数据。
朴素贝叶斯分类器的性能取决于用于构建和训练分类器的生物标志物的数量和质量。单个生物标志物将根据其KS距离(Kolmogorov-Smirnov)执行。如果后续添加的生物标志物独立于第一生物标志物,则具有良好KS距离(例如>0.3)的后续生物标志物的添加通常将改善分类性能。使用敏感性加特异性作为分类器评分,可以使用贪婪算法的变型生成许多高分分类器。(贪婪算法是任何遵循在每个阶段做出局部最优选择,希望找到全局最优的问题求解元启发式方法的算法。)
描绘分类器性能的另一种方式是通过接受者工作特征(ROC),或简称为ROC曲线或ROC曲线图。ROC是二元分类器系统的敏感性或真阳性率相对于假阳性率(1-特异性或1-真阴性率)的图形式曲线图,因为其鉴别力阈(discrimination threshold)是变化的。ROC也可以通过针对阳性中的真阳性比例(TPR=真阳性率)相对于阴性中的假阳性比例(FPR=假阳性率)作图来等效地表示。也称为相对工作特征曲线,因为它是当标准变化时两个工作特征(TPR和FPR)的比较。ROC曲线下面积(AUC)通常用作诊断准确性的概括性量度。其可以采用为0.0至1.0的值。AUC具有重要的统计特性:分类器的AUC等同于分类器将随机选择的正实例排在随机选择的负实例之前的概率(Fawcett T,2006.An introduction to ROCanalysis.Pattern Recognition Letters.27:861–874)。这等同于威尔科克森(Wilcoxon)秩检验(Hanley,J.A.,McNeil,B.J.,1982.The meaning and use of the area under areceiver operating characteristic(ROC)curve.Radiology 143,29–36)。
示例性实施方案以各种组合使用表1中列出的任何数量的生物标志物来产生诊断测试以鉴定具有葡萄糖耐量减低的个体。表1中列出的生物标志物可以以多种方式组合以产生分类器。在一些实施方案中,生物标志物的小组包括不同的生物标志物集合,这取决于所选择的特定诊断性能标准。例如,某些生物标志物组合可产生比其他组合更敏感(或更具特异性)的测试。
在一些实施方案中,一旦小组被定义为包括特定的生物标志物集合并且分类器是由训练数据集构建的,则诊断测试参数是完整的。在一些实施方案中,在一种或多种测定中运行生物样品以产生用于分类的相关定量生物标志物水平。测量得到的生物标志物水平用作分类方法的输入,所述分类方法输出样品的分类和反映类分配的置信度的任选评分。
在一些实施方案中,样品任选地被稀释并在多重适配体测定中运行,并且数据评估如下。首先,将来自测定的数据任选地归一化并校准,并且将所得的生物标志物水平用作贝叶斯分类方案的输入。其次,针对每个测量得到的生物标志物单独计算对数似然比,然后对其求和以产生最终分类评分,也称为诊断评分。可以报告所得的分配以及整体分类评分。在一些实施方案中,还可以报告针对每个生物标志物水平计算的各个对数似然风险因素。
试剂盒
可以使用合适的试剂盒检测本文所述的生物标志物的任何组合,诸如用于执行本文公开的方法。此外,任何试剂盒都可以含有一种或多种如本文所述的可检测标记,诸如荧光部分等。
在一些实施方案中,试剂盒包括(a)用于检测生物样品中的一种或多种生物标志物的一种或多种捕获试剂(例如像,至少一种适配体或抗体),以及任选地(b)用于预测从其获得生物样品的个体是否具有或是否可能具有葡萄糖耐量减低或者是否患有前驱糖尿病,或是否可能发展为前驱糖尿病或糖尿病的一种或多种软件或计算机程序产品。另选地,可以提供用于由人手动执行上述步骤的一个或多个指令,而不是一个或多个计算机程序产品。
在一些实施方案中,试剂盒包括固体支持体、捕获试剂和至少一种信号生成材料。试剂盒还可以包括使用装置和试剂、处理样品和分析数据的说明书。此外,试剂盒可与计算机系统或软件一起使用,以分析和报告生物样品的分析结果。
试剂盒还可以包含用于处理样品的一种或多种试剂(例如,增溶缓冲液、去污剂、洗涤液或缓冲液)。本文所述的任何试剂盒还可以包括例如缓冲液、封闭剂、质谱基质材料、抗体捕获剂、阳性对照样品、阴性对照样品、软件和信息,诸如方案、指导和参考数据。
在一些实施方案中,提供了用于分析葡萄糖耐量减低的试剂盒,其中试剂盒包括用于本文所述的一种或多种生物标志物的PCR引物。在一些实施方案中,试剂盒还可包括使用以及生物标志物与葡萄糖耐量减低和/或前驱糖尿病或糖尿病预后的相关性的说明书。在一些实施方案中,试剂盒可包括含有本文所述的一种或多种生物标志物的补体的DNA阵列、试剂和/或用于扩增或分离样品DNA的酶。试剂盒可包括用于实时PCR的试剂,例如,TaqMan探针和/或引物,以及酶。
例如,试剂盒可以包括(a)试剂,其包括用于确定样品中的一种或多种生物标志物的水平的至少一种捕获试剂,以及任选地(b)用于执行将在样品中量化的每种生物标志物的量与一个或多个预先确定的截断值相比较的步骤的一种或多种算法或计算机程序。在一些实施方案中,算法或计算机程序基于所述比较为量化的每种生物标志物分配评分,并且在一些实施方案中,将量化的每种生物标志物的分配评分合并以获得总评分。此外,在一些实施方案中,算法或计算机程序将总评分与预先确定的评分进行比较,并使用比较结果来确定个体是否具有葡萄糖耐量减低。另选地,可以提供用于由人手动执行上述步骤的一个或多个指令,而不是一个或多个算法或计算机程序。
计算机方法和软件
一旦选定了生物标志物或生物标志物小组,用于评估受试者是否具有或是否可能具有葡萄糖耐量减低,或者是否患有前驱糖尿病或是否可能发展为前驱糖尿病或糖尿病的方法可包括以下:1)从受试者收集或以其他方式获得生物样品;2)执行分析方法以检测和测量生物样品中的该小组中的生物标志物;以及3)报告生物标志物水平的结果。在一些实施方案中,生物标志物水平的结果被定性而不是定量地报告,例如像,建议诊断(“葡萄糖耐量减低”或“前驱糖尿病”,或简单的阳性/阴性结果,其中“阳性”和“阴性”已有定义。在一些实施方案中,用于评估个体的葡萄糖耐量减低的方法可包括以下:1)收集或以其他方式获得生物样品;2)执行分析方法以检测和测量生物样品中的该小组中的生物标志物;3)执行任何数据归一化或标准化;4)计算每种生物标志物水平;以及5)报告生物标志物水平的结果。在一些实施方案中,将生物标志物水平以某种方式合并,并且报告合并的生物标志物水平的单个值。在该方法中,在一些实施方案中,所报告的值可以是从所有生物标志物计算的总和确定的单个数字,将其与指示病状的存在或不存在的预设阈值进行比较。或者,诊断评分可以是各自代表生物标志物值的一系列条,并且可以将应答的模式与用于确定病状的存在或不存在的预设模式进行比较。
本文所述方法的至少一些实施方案可以使用计算机来实施。计算机系统100的实例在图3示出。参考图3,系统100被示出为包括通过总线108电耦合的硬件元件,包括处理器101、输入装置102、输出装置103、存储装置104、计算机可读存储介质读取器105a、通信系统106处理加速器(processing acceleration)(例如,DSP或专用处理器)107以及存储器109。计算机可读存储介质读取器105a进一步耦合到计算机可读存储介质105b,所述组合综合地代表用于临时和/或更永久地包含计算机可读信息的远程、本地、固定和/或可移动存储装置以及存储介质、存储器等,其可以包括存储装置104、存储器109和/或任何其他这种可访问的系统100资源。系统100还包括软件元件(示出为当前位于工作存储器191内),包括操作系统192和其他代码193,诸如程序、数据等。
关于图3,系统100具有广泛的灵活性和可配置性。因此,例如,可使用单个架构来实现一个或多个服务器,所述服务器可以根据当前期望的协议、协议变型、扩展等进一步配置。然而,对于本领域技术人员来说将显而易见的是,可根据更具体的应用需求很好地利用实施方案。例如,一个或多个系统元件可被实现为系统100部件内(例如,通信系统106内)的子元件。还可以利用定制的硬件和/或特定的元件可以实现为硬件、软件或两者。另外,尽管可以采用到诸如网络输入/输出装置(未示出)的其他计算装置的连接,但是应当理解,还可以利用到其他计算装置的有线、无线、调制解调器和/或一种或多种其他连接。
在一个方面,所述系统可以包括数据库,所述数据库含有葡萄糖耐量减低和/或前驱糖尿病的生物标志物特征的特征。生物标志物数据(或生物标志物信息)可以用作计算机的输入,以用作计算机实施的方法的一部分。生物标志物数据可以包括如本文所述的数据。
在一个方面,所述系统还包括用于向一种或多种处理器提供输入数据的一种或多种装置。
所述系统还包括用于存储排序的数据元素的数据集的存储器。
在另一方面,用于提供输入数据的装置包括用于检测数据元素的特征的检测器,诸如质谱仪或基因芯片阅读器。
所述系统可另外包括数据库管理系统。用户请求或查询可以用数据库管理系统理解的适当语言格式化,所述系统处理查询以从训练集数据库中提取相关信息。
所述系统可以连接到网络,所述网络与网络服务器和一个或多个客户端连接。如本领域已知的,网络可以是局域网(LAN)或广域网(WAN)。优选地,服务器包括运行计算机程序产品(例如,软件)以访问用于处理用户请求的数据库数据所必需的硬件。
所述系统可包括一个或多个装置,所述装置包括图形显示界面,所述图形显示界面包括诸如按钮、下拉菜单、滚动条、用于输入文本的输入栏等界面元素,如在本领域已知的图形用户界面中常规存在的。在用户界面上输入的请求可以传输到系统中的应用程序以进行格式化,以在一个或多个系统数据库中搜索相关信息。用户输入的请求或查询可以任何合适的数据库语言构建。
图形用户界面可由作为操作系统的一部分的图形用户界面代码生成并且可以用于输入数据和/或显示所输入的数据。所处理数据的结果可以显示在界面中,在与系统通信的打印机上打印,保存在存储器装置中,和/或通过网络传输,或者可以以计算机可读介质的形式提供。
所述系统可以与输入装置通信以向系统提供关于数据元素的数据(例如,表达值)。在一个方面,输入装置可以包括基因表达谱系统,其包括例如质谱仪、基因芯片或阵列阅读器等。
根据各种实施方案的用于分析生物标志物信息的方法和设备可以任何合适的方式实现,例如,使用在计算机系统上操作的计算机程序。可使用包括处理器和随机存取存储器的常规计算机系统,诸如可远程访问的应用服务器、网络服务器、个人计算机或工作站。另外的计算机系统部件可包括存储器装置或信息存储系统,诸如大容量存储系统和用户界面,例如常规监控器、键盘和跟踪装置。计算机系统可以是独立系统或包括服务器和一个或多个数据库的计算机网络的一部分。
生物标志物分析系统可以提供完成数据分析的功能和操作,诸如数据采集、处理、分析、报告和/或诊断。例如,在一个实施方案中,计算机系统可以执行可接收、存储、搜索、分析和报告与生物标志物有关的信息的计算机程序。计算机程序可包括执行各种功能或操作的多个模块,诸如用于处理原始数据和生成补充数据的处理模块以及用于分析原始数据和补充数据以生成疾病状态和/或诊断的分析模块。鉴定葡萄糖耐量减低、前驱糖尿病和/或可能糖尿病可包括生成或收集任何其他信息,包括相对于疾病而言关于个体状况的另外的生物医学信息,鉴定是否可能需要进一步测试,或以其他方式评估个体的健康状态。
可以实施本文描述的一些实施方案以包括计算机程序产品。计算机程序产品可以包括具有介质中体现的用于使应用程序在具有数据库的计算机上执行的计算机可读程序代码的计算机可读介质。
如本文所用,“计算机程序产品”是指以包含在任何性质(例如,书写、电子、磁性、光学或其他性质)的物理介质上且可以与计算机或其他自动数据处理系统一起使用的以自然或程序设计语言语句形式的有组织的指令集。这样的编程语言语句在由计算机或数据处理系统执行时,使得计算机或数据处理系统根据语句的特定内容而工作。计算机程序产品包括但不限于:源代码和目标代码中的程序和/或嵌入计算机可读介质中的测试或数据库。另外,使计算机系统或数据处理设备装置能够以预先选择的方式工作的计算机程序产品可以以多种形式提供,这些形式包括但不限于原始源代码、汇编代码、目标代码、机器语言、前述加密或压缩版本以及任何和所有的等同物。
在一个方面,提供了一种计算机程序产品,其用于指示个体是否具有葡萄糖耐量减低,和/或个体是否患有或是否可能发展为前驱糖尿病,和/或是否可能发展为糖尿病。计算机程序产品包括包含由计算装置或系统的处理器可执行的程序代码的计算机可读介质,所述程序代码包括:检索归因于来自个体的生物样品的数据的代码,其中数据包括与本文所述的生物标志物中的一种或多种相对应的生物标志物水平,以及执行分类方法的代码,所述分类方法指示作为生物标志物水平的函数的个体的葡萄糖耐量减低状态。
尽管已经作为方法或设备描述了各个实施方案,但应该理解的是,各实施方案可以通过例如驻留在计算机上或可由计算机访问的代码的与计算机耦合的代码来实施。例如,可以利用软件和数据库来实施上面讨论的许多方法。因此,除了通过硬件实现的实施方案之外,还应该注意的是,这些实施方案可以通过使用由具有体现在其中的计算机可读程序代码的计算机可用介质组成的制品来实现,这促使实现本说明书中公开的功能。因此,期望所述实施方案也被视为以其程序代码方式受到本专利的保护。另外,所述实施方案可体现为存储在包括而不限于RAM、ROM、磁介质、光学介质或磁光介质的实际上任何种类的计算机可读存储器中的代码。甚至更一般地讲,所述实施方案可以在软件中、或在硬件中,或在包括但不限于在通用处理器上运行的软件、微代码、可编程逻辑阵列(PLA)或专用集成电路(ASIC)的其任何组合中实施。
还可以设想,所述实施方案可以作为体现在载波中的计算机信号以及通过传输介质传播的信号(例如,电和光)来实现。因此,上面讨论的各种类型的信息可以在诸如数据结构的结构中格式化,并且通过传输介质作为电信号传输或存储在计算机可读介质上。
治疗方法
在一些实施方案中,在确定受试者具有或可能具有葡萄糖耐量减低,或患有前驱糖尿病,或可能发展为前驱糖尿病或糖尿病之后,受试者接受治疗方案以延迟或防止疾病恶化。用于葡萄糖耐量减低、前驱糖尿病和/或可能糖尿病的非限制性的示例性治疗方案包括减重和血糖控制。在一些实施方案中,向受试者给予治疗剂,诸如胰岛素或二甲双胍。
在一些实施方案中,提供了监测葡萄糖耐量减低的方法。在一些实施方案中,确定受试者是否具有葡萄糖耐量减低的本发明的方法在时间0进行。在一些实施方案中,所述方法在时间1,并且任选地,时间2,并且任选地,时间3等再次进行,以便监测受试者中葡萄糖耐量减低的进展。在一些实施方案中,取决于个体疾病的当前状态和/或取决于相信或预测疾病进展的速率,在不同时间点使用不同的生物标志物。
其他方法
在一些实施方案中,本文所述的生物标志物和方法用于确定医疗保险费和/或人寿保险费。在一些实施方案中,本文所述方法的结果用于确定医疗保险费和/或人寿保险费。在一些这样的情况下,提供医疗保险或人寿保险的组织请求或以其他方式获得有关受试者的葡萄糖耐量减低或前驱糖尿病或发展为前驱糖尿病或糖尿病状态的可能性的信息,并使用所述信息确定受试者的适当的医疗保险费或人寿保险费。在一些实施方案中,测试由提供医疗保险或人寿保险的组织请求并支付费用。
在一些实施方案中,本文所述的生物标志物和方法用于预测和/或管理医疗资源的利用。在一些这样的实施方案中,所述方法不是为了这样的预测目的而进行的,但是从该方法获得的信息用于这样的预测和/或医疗资源的利用的管理中。例如,测试设施或医院可将许多受试者的来自本发明的方法的信息整合起来,以便预测和/或管理特定设施或特定地理区域中的医疗资源的利用。
实施例
以下实施例仅出于说明性目的提供,并且不旨在限制由随附权利要求限定的本申请的范围。以下实施例中描述的常规分子生物学技术可以如标准实验室手册中描述的那样进行,诸如Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold SpringHarbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,(2001)。
实施例1.用于生物标志物鉴定的多重适配体测定和统计方法
使用多重适配体测定来分析测试样品和对照样品,以鉴定预测葡萄糖耐量减低的生物标志物。本实验中使用的多重分析包括从少量样品(~65μl血清或血浆)中检测血液中的大约5,000种蛋白质的适配体,其中检测极限低(1pM中值),动态范围为~7log,并且中值变异系数为~5%。多重适配体测定一般性地描述于例如Gold等人(2010)Apta mer-BasedMultiplexed Proteomic Technology for Biomarker Discov ery.PLoS ONE 5(12):e15004;以及美国公布号:2012/0101002和2012/0077695中。
葡萄糖耐量减低分类器
通过稳定性选择而选定的41种生物标志物的小组在表1中示出,并提供给随机森林算法以生成模型。本文应用于生物标志物的模型是分类模型,更具体地讲是弹性网逻辑回归模型。
每种生物标志物的β_hat值在下表2中示出。β_hat值示出测试样品中的生物标志物水平相对于对照样品的相对变化,表明测试样品是从具有葡萄糖耐量减低的受试者获得的。
表2:某些生物标志物的β_Hat值
开发队列和模型开发
开发队列来自英国的12,000多名男性和女性参与者(年龄29-64岁)中的基于群体的研究。该研究的目标是鉴定在一般群体中导致糖尿病、肥胖和相关健康状况的遗传和生活方式风险因素。临床诊断为糖尿病、临床诊断为精神病、绝症、怀孕或无法独立行走的参与者被排除在本研究之外。该队列包括来自参与者的样品测量结果,所述测量结果使用本文所述的多重测定从在四个研究登记地点采集的第1阶段(基线)和第2阶段(基线后随访~6年)样品得到。
样品处理方案在两次测量之间发生了变化。由于这一变化,从地点看,第1阶段的处理时间显示出比第2阶段更广泛的分布。在第1阶段(基线)访问期间,优先考虑以有效的方式进行研究参与者测试(OGTT、DEXA、跑步机等),从而导致血液样品处理的时间范围从样品收集后立刻到样品收集后几小时。对于第2阶段访问,提供了另外的工作人员,并且所有样品在收集时迅速处理。因此,与第一时间点(第1阶段)相比,第二时间点(第2阶段)在研究地点之间具有更一致的样品处理。考虑到方案的变化,并且为了提高模型在纵向数据中的稳健性,用于模型开发、验证和确认的数据集包括来自第1阶段和第2阶段的测量结果。这些数据包括7,116个第1阶段样本(来自仅参加第1阶段的参与者)和5,003个第2阶段样本(来自参加第1阶段和第2阶段的参与者)。使用利用有效2h-OGTT血浆葡萄糖测量得到的来自每个参与者的仅一个测量结果,以维持样本间独立性的假设。
在该数据集中,通过标准OGTT测量得到的具有葡萄糖耐量减低的个体的患病率为6.5%,如表3所示。在本研究的时间框架内,整个英国的葡萄糖耐量减低或前驱糖尿病的估计值为10.5%(参见https://www.diabetes.co.uk/pre-diabetes.html)。在美国,目前的估计值更高,其中18岁及以上成年人的预测患病率为33.9%(参见https://www.niddk.nih.gov/health-information/health-statistics/diabetes-statistics)。在诸如美国等较高患病率的群体中,与在低患病率群体中的测试性能相比,该测试结果的PPV(阳性预测值)可能提高,而NPV(阴性预测值)可能略有下降。美国群体患病率存在轻微的预测偏低风险,这在当前自费、特约医疗的目标市场中是可接受的。
队列数据集分别被拆分成70%/15%/15%的训练、验证和确认数据集。通过标准OGTT测量得到的训练和验证数据集人口统计资料列于表3中。
表3
在使用机器学习技术开发预测模型时,应使用多个数据集来鉴定具有最佳预测能力的模型。为此,使用以下拆分数据的策略。将数据拆分为三个集合:训练集(用于通过交叉确认鉴定顶层模型)、验证集(允许我们调整顶层模型参数的第二训练集)以及确认测试集(仅用于评估最终模型且不用于模型开发的保留集)。以这三种方式拆分数据是最理想的,并且需要大的样本量,因此不常用,也不被认为是模型开发所必需的。这种方法在进行特征选择和参数估计时减轻了过度拟合的问题。
该队列包括在两个时间点使用如本文所述的多重测定得到的样品测量结果,其中在两次测量之间样品处理方案发生了变化,因此,用于模型开发、验证和确认的数据集包括来自两个时间点的测量结果。被选择用于该分析的队列包括来自仅具有第1阶段的样品的个体的7,116个样本,加上来自在两个时间点都有数据的5,003个体的仅第2阶段数据。
为了确保数据的质量,在分析数据之前执行四个预处理步骤:
1.通过ANML进行归一化:通过最大似然法进行的自适应归一化(Adaptivenormalization by maximum likelihood,ANML)用于校正稀释特定样品(dilutionspecific sample)和测定偏差,包括移液误差、试剂浓度变化、测定定时以及系统变异性的其他来源。通过最大化样品的测量结果来自参考分布(对照样本集)的概率来计算比例因子)。将相对于参考分布Z评分超过|2|的分析物从这些计算中剔除,以减轻样品处理伪影或其他大的蛋白质组学变化的偏差。
2.数据质量控制(QC):此步骤核查样品处理和归一化问题。首先对样本数据进行归一化以去除运行中的杂交变异。随后对校准样品进行中值归一化,以去除运行中的其他测定偏差。然后在每个板的基础上进行整体缩放以去除运行之间的总体强度差异。然后进行校准以去除运行之间的测定差异。最后,针对参考对QC、缓冲液和各个样品进行中值归一化。
3.预分析:在这一步骤中,研究了临床变量与归一化比例因子之间的关系,以确保两者之间的相关性最小。
4.缺失数据:在模型开发之前没有需要去除受试者或样品的缺失数据点。模型被开发为二分模型:患者具有正常葡萄糖耐量(对应于OGTT葡萄糖测量结果<7.8mmol/L)或葡萄糖耐量减低(对应于OGTT葡萄糖测量结果≥7.8mmol/L)。应答变量在应用建模BI中计算。
在数据质量控制和预分析之后,分两步完成模型开发,列出如下:
1.概念证明(POC):单变量和机器学习分析,旨在了解是否存在感兴趣的端点的信号的任何证据。
2.精化:以建模者为导向(Modeler-directed)的分析,确认和扩展在POC中产生的模型;解决关于数据和模型的任何其他另外的问题。
在POC步骤中只使用了训练数据。使用t检验、KS检验、Mann-Whitney和Wald检验对逻辑回归系数进行单变量分析,以确定任何分析物与OGTT状态之间是否存在统计学上显著的关联。对于每个单变量检验,使用利用Benjamini-Hochberg程序(Hochberg等人)计算得到的错误发现率(FDR)和Bonferroni校正的p值对多重检验进行校正。还创建了初步弹性网逻辑回归模型以评估是否满足最低性能指标。所述模型是使用5次重复的10倍交叉确认开发的。由于类不平衡(只有6.5%的训练数据被标记为“葡萄糖减低”),采用交叉确认中的下采样。满足了初始模型性能标准,从而提供了充分的证据以将检验转移到模型精化中。
使用队列训练和验证数据集在精化时开发的模型。初始模型是在训练数据上使用5次重复的10倍交叉确认计算得到的,在交叉确认中使用下采样来适应端点中的类不平衡。使用模型的准确性选择顶层模型,其中准确性=(真阳性+真阴性)/n。使用该指标是因为它代表了敏感性与特异性之间的平衡(与AUC不同,即使对于具有低敏感性或低特异性的模型,它也可能非常高)。在精化过程中使用准确性作为分析工具,但模型的验收标准仍然是AUC、敏感性和特异性的组合。然后使用验证数据和各种模型强化工具(model hardeningtool)进一步精化这些顶层模型。
用于模型构建的主要方法包括重复轮次的弹性网惩罚模型,其中重复过滤特征直到模型性能没有提高。
重复弹性网特征减少建模的算法如下:
1.构建基于秩(rank)过滤特征的弹性网模型。
2.从步骤1中创建的顶层模型中,保留估计值不等于零的所有特征。
3.构建包括步骤2中保留的所有特征的新弹性模型。
4.重复步骤2和3至少十次,然后继续直到准确性不再增加。
此过程多次执行,以多种方式过滤特征,包括:按单变量秩(包括前100、200或500个特征);去除与禁食状态在统计学上显著相关(FDR<=0.01)的特征;去除与干扰测试失败相关的特征;以及去除基于用于建模强化的外部数据集的可变性的特征。
通过检查不同的合成数据集、核查插补对最小值和最大值的影响以及评估样品处理对模型预测的影响,还评估了这个最终模型的稳健性。
接着在第1阶段和第2阶段检查最佳模型的预测性能,以确保在两个时间点之间没有观察到显著差异。此外,还检查了模型的残差与年龄、性别或访问的相关性。
数据QC显示219个样本未通过行核查(row-check),这意味着杂交或三个中值比例因子中的至少一个超出0.4到2.5的范围,表明该特定样本存在将无法通过再次运行该样本解决的技术问题(例如,堵塞(clog))。此外,还有18个异常值样本,其中至少5%的测量结果超过了来自中值信号的6个MAD,还有两个样本具有大的归一化比例因子。从进一步分析中去除这239个样本(1.4%)。最后,仅使用通过靶标确认特异性测试的分析物进行分析。
PC1相对于PC2的PCA曲线图也示出两个主成分之间可能存在的非线性关系,但是,根据收集时间点(第1阶段相对于第2阶段),这些似乎没有显著差异,所以没有太大问题。两个时间点的比较很重要,因为样品收集方案在第1阶段与第2阶段之间发生了变化,因此确定方案变化不是测定信号变异的最大来源很重要。
在第一或第二时间点,预分析未显示出在任何端点与归一化比例因子之间存在密切关系的证据。
POC结果显示,许多分析物在不同FDR水平下是显著的。对于单变量t检验,那些数量和百分比在表4中示出。
表4
错误发现率(FDR) | 小于或等于FDR水平的分析物数量(%) |
0.10 | 1,895 |
0.05 | 1,548 |
0.01 | 1,122 |
表现最佳的模型是弹性网逻辑回归模型,其AUC为0.856并且敏感性/特异性为0.78/0.77,超过了≥0.70的AUC、敏感性和特异性的可行性标准。
弹性网逻辑回归模型被用于精化,因为这种类型的模型在POC阶段表现出最大的成功并且其减轻了模型转移过程对软件的负担。模型在训练和验证数据上的性能在表5中示出。95%的自举区间(bootstrapped interval)在表5中的括号中示出。
表5
插补对超出范围值的影响分两个阶段进行检查。
1.使用训练数据,每种分析物的最小和最大可接受RFU值计算如下:
a.使用训练数据,生成自举数据集(与训练数据的样本量相同)。
b.将数据拆分成k份,其中k=max{10,样本量/10}。
c.在每份中并且对于每种适配体,计算数据集中的最小值和最大值并存储。
d.重复步骤A-C 100次。
e.在k*100次重复中,对于每种适配体,计算标准偏差。
f.适配体特异性的最小/最大RFU值是最小/最大训练数据RFU值-/+2SD(其中SD来自步骤E)。
2.使用步骤1中计算得到的最小值和最大值以及验证数据执行以下步骤:
a.在验证数据集中的n*p个观察值中(其中n是验证数据的样本量并且p表示模型中适配体的数量),随机抽样1.5%的超出范围的RFU值。(1.5%是基于对先前测定性能和RFU测量结果的经验观察。)对这些行和列特定值进行标记。
b.将验证数据中的标记值替换为来自1(F)的最大值和最小值。使用该数据集计算最终模型的预测准确性(如章节5.4中的公式所示)。
c.将验证数据中的标记值替换为0(这类似于从模型中去除适配体)。使用该数据集计算最终模型的预测准确性(使用与步骤B相同的方法)。
d.重复步骤A-E 100次。汇总预测准确性指标。提供最高预测准确性指标的插补方法是推荐用于生产的插补方法。
超出范围的适配体应该被温索化(Winsorized),因为所得的预测指标是相同的(参见表6)并且这个过程是最常用的。
表6:超出范围的适配体的插补结果
插补法 | 准确性 |
初始验证数据 | 0.75 |
温索化验证数据 | 0.75 |
验证数据中的分析物去除 | 0.75 |
实施例2:模型确认
在15%保留确认(测试)集上评估最终模型。此数据存储在测试库中的单独文件夹中并且仅出于制作确认数据人口统计资料表的目的进行检查(参见表7)。
模型预测是表示个体具有葡萄糖耐量减低的概率的概率。截断阈值为0.5,概率高于截断值的个体被归类为“葡萄糖耐量减低”。更接近“1”的值表示葡萄糖耐量减低可能性最大的受试者。
在确认阶段,在确认数据上计算预测概率及其相关分类器。AUC、敏感性和特异性各自均应且实际上大于或等于0.70(参见表8)。
确认数据集由队列数据集的最后15%组成,共有1,761名患者。该数据集的人口统计资料(表7)在质量上与训练和验证集(表3)相同。
表7
AUC是通过使用最后41种生物标志物小组模型计算的,以对最后15%保留队列确认数据集进行分类。此数据未用于POC或精化。最终模型通过确认,AUC、敏感性和特异性大于0.70。确认数据集的预测指标结果在下表8中示出。95%自举区间在表8的括号中示出。
表8
图4示出通过41种生物标志物小组模型预测的葡萄糖耐量减低概率的箱线图,在确认数据集上通过基于标准口服葡萄糖耐量测试(正常、减低和可能糖尿病)的值的诊断进行分层。三组之间的分离相当强,表明模型稳健。
该模型满足AUC/敏感性/特异性≥0.7/0.7/0.7的确认标准(部分基于2小时OGTT血浆葡萄糖水平的10年糖尿病发病预测值)。最终模型的AUC为0.764,在保留确认集上的敏感性/特异性为0.794/0.734。该报告的结论是该测试已满足临床验收标准并且可以投入生产。
实施例3:使用适配体的示例性生物标志物检测
检测样品中的一种或多种生物标志物的示例性方法描述于例如Kraemer等人,PLoS One 6(10):e26332,并在下文描述。描述了三种不同的量化方法:基于微阵列的杂交、基于Luminex珠粒的方法和qPCR。
试剂
HEPES、NaCl、KCl、EDTA、EGTA、MgCl2和Tween-20可购自例如Fisher Biosciences。标称分子量为8000的葡聚糖硫酸钠盐(DxSO4)可购自例如AIC,并用去离子水透析至少20小时,更换一次。KOD EX DNA聚合酶可购自例如VWR。四甲基氯化铵和CAPSO可购自例如Sigma-Aldrich并且链霉亲和素-藻红蛋白(SAPE)可购自例如Moss Inc.。4-(2-氨基乙基)-苯磺酰氟盐酸盐(AEBSF)可购自例如Gold Biotechnology。链霉亲和素包被的96孔板可购自例如Thermo Scientific(Pierce Streptavidin Coated Plates HBC,透明,96孔,产品编号15500或15501)。NHS-PEO4-生物素可购自例如Thermo Scientific(EZ-Link NHS-PEO4-Biotin,产品编号21329),溶解在无水DMSO中,并且可以单次使用等分试样的形式冷冻储存。IL-8、MIP-4、脂质运载蛋白-2(Lipocalin-2)、RANTES、MMP-7和MMP-9可购自例如R&DSystems。抵抗素和MCP-1可购自例如PeproTech,并且tPA可购自例如VWR。
核酸
常规的(包括胺和生物素取代的)寡聚脱氧核苷酸可购自例如Inte grated DNATechnologies(IDT)。Z-嵌段是序列5′-(AC-BnBn)7-AC-3′的单链寡聚脱氧核苷酸,其中Bn表示苄基取代的脱氧尿苷残基。Z-嵌段可使用常规的亚磷酰胺化学合成。适配体捕获试剂也可通过常规的亚磷酰胺化学合成,并且可以例如在21.5×75mm PRP-3柱上纯化,在Waters Autopurification 2767系统(或Waters 600系列半自动系统)上在80℃下操作,例如,使用timberline TL-600或TL-150加热器和三乙基碳酸氢铵(TEAB)/ACN梯度以洗脱产物。在260nm处进行检测,并在汇集最佳级分之前跨主峰收集级分。
缓冲液
缓冲液SB18由40mM HEPES、101mM NaCl、5mM KCl、5mM MgCl2和0.05%(v/v)Tween20组成,用NaOH调节至pH 7.5。缓冲液SB17是补充了1mM EDTA三钠的SB18。缓冲液PB1由10mM HEPES、101mM NaCl、5mM KCl、5mM MgCl2、1mM EDTA三钠和0.05%(v/v)Tween-20组成,用NaOH调节至pH 7.5。CAPSO洗脱缓冲液由100mM CAPSO pH 10.0和1M NaCl组成。中和缓冲液含有500mM HEPES、500mM HCl和0.05%(v/v)Tween-20。Agilent杂交缓冲液(Agilent Hybridization Buffer)是作为试剂盒(芯片上Oligo aCGH/ChIP杂交试剂盒(Oligo aCGH/ChIP-on-chip Hybridization Kit))的一部分提供的专有制剂。Agilent洗涤缓冲液(Agilent Wash Buffer)1是专有制剂(芯片上Oligo aCGH/ChIP洗涤缓冲液1,Agilent)。Agilent洗涤缓冲液(Agilent Wash Buffer)2是专有制剂(芯片上Oligo aCGH/ChIP洗涤缓冲液2,Agilent)。TMAC杂交溶液由4.5M四甲基氯化铵、6mM EDTA三钠、75mMTris-HCl(pH 8.0)和0.15%(v/v)Sarkosyl组成。KOD缓冲液(10倍浓缩)由1200mM Tris-HCl、15mM MgSO4、100mM KCl、60mM(NH4)2SO4、1%v/v Triton-X 100和1mg/mL BSA组成。
样品制备
将血清(以100μL等分试样的形式储存在-80℃)在25℃水浴中解冻10分钟,然后在样品稀释前储存在冰上。通过轻轻涡旋将样品混合8秒。通过稀释到补充有0.6mM MgCl2、1mM EGTA三钠、0.8mM AEBSF和2μM Z-嵌段的0.94×SB17中制备6%血清样品溶液。将一部分6%血清储备溶液在SB17中稀释10倍,制成0.6%血清原液。在一些实施方案中,分别使用6%和0.6%的原液检测高丰度和低丰度分析物。
捕获试剂(适配体)和链霉亲和素板制备
根据其同源分析物(或生物标志物)的相对丰度,将适配体分组为2种混合物。每种适配体的原液浓度为4nM,并且每种适配体的最终浓度为0.5nM。在使用之前将适配体原液混合物在SB17缓冲液中稀释4倍,加热至95℃持续5min并经15分钟的时间段冷却至37℃。这种变性-复性循环旨在规范化(normalize)适配体构象异构体分布,从而确保可再现的适配体活性,尽管历史不同。链霉亲和素板在使用前用150μL缓冲液PB1洗涤两次。
孵化和板捕获
将热冷却的2×适配体混合物(55μL)与等体积的6%或0.6%血清稀释液合并,产生含有3%和0.3%血清的孵育混合物。将板用硅胶密封垫(Axymat硅胶密封垫,VWR)密封并在37℃下孵育1.5h。然后将孵育混合物转移到经过洗涤的96孔链霉亲和素板的孔中,并在设置为37℃的Eppendorf Thermomixer上进一步孵育,同时以800rpm振荡,持续两小时。
手动测定
除非另外指明,否则通过倾倒去除液体,然后轻拍两次到分层纸巾上。洗涤体积为150μL,所有振荡孵育均在设置为25℃、800rpm的Eppendorf Thermomixer上进行。通过移液去除孵育混合物,并且将板用补充有1mM硫酸葡聚糖和500μM生物素的缓冲液PB1洗涤两次,每次1分钟,然后用缓冲液PB1洗涤4次,每次15秒。添加新鲜制备的1mM NHS-PEO4-生物素在缓冲液PB1中的溶液(150μL/孔),并且将板在振荡下孵育5分钟。去除NHS-生物素溶液,并且将板用补充有20mM甘氨酸的缓冲液PB1洗涤3次,并用缓冲液PB1洗涤3次。然后将85μL补充有1mM DxSO4的缓冲液PB1添加到每个孔中,并且将板在振荡的同时在BlackRay紫外灯(标称波长365nm)下以5cm的距离照射20分钟。将样品转移到新鲜的、经过洗涤的链霉亲和素包被的板,或现有的经过洗涤的链霉亲和素板的未使用孔中,将高和低样品稀释度混合物合并到一个孔中。将样品在振荡下于室温孵育10分钟。去除未吸附的材料并且将板用补充有30%甘油的缓冲液PB1洗涤8次,每次15秒。然后将板用缓冲液PB1洗涤一次。适配体在室温下用100μL CAPSO洗脱缓冲液洗脱5分钟。将90μL洗脱液转移至96孔HybAid板中并添加10μL中和缓冲液。
半自动测定
将携带吸附的孵育混合物的链霉亲和素板放置在BioTek EL406洗板机的平台上,所述洗板机被编程为执行以下步骤:通过抽吸去除未吸附的材料,并且将孔用300μL补充有1mM硫酸葡聚糖和500μM生物素的缓冲液PB1洗涤4次。然后将孔用300μL缓冲液PB1洗涤3次。添加1mM NHS-PEO4-生物素在缓冲液PB1中的150μL新鲜制备的(来自100mM在DMSO中的原液)溶液。板在振荡下孵育5分钟。抽吸出液体,并用300μL补充有10mM甘氨酸的缓冲液PB1洗涤孔8次。添加100μL补充有1mM硫酸葡聚糖的缓冲液PB1。在这些自动化步骤之后,将板从洗板机中取出并放置在以5cm的距离安装在紫外光源(BlackRay,标称波长365nm)下的恒温振荡器上,持续20分钟。恒温振荡器设置为800rpm和25℃。照射20分钟后,将样品手动转移到新鲜的、经过洗涤的链霉亲和素板中(或现有的经过洗涤的板的未使用孔中)。此时将高丰度(3%血清+3%适配体混合物)和低丰度反应混合物(0.3%血清+0.3%适配体混合物)合并到一个孔中。将此“Catch-2”板放置在BioTek EL406洗板机的平台上,所述洗板机被编程为执行以下步骤:将板在振荡下孵育10分钟。抽吸出液体,并用300μL补充有30%甘油的缓冲液PB1洗涤孔21次。将孔用300μL缓冲液PB1洗涤5次,并且抽吸出最后的洗涤液。添加100μL CAPSO洗脱缓冲液,并在振荡下持续5分钟洗脱适配体。按照这些自动化步骤,接着将板从洗板机的平台上取下,并将样品的90μL等分试样手动转移到含有10μL中和缓冲液的HybAid96孔板的孔中。
与定制的Agilent 8×15k微阵列杂交
将24μL经过中和的洗脱液转移至新的96孔板并且向每个孔中添加6μL的含有由10种Cy3适配体组成的杂交对照集合的10×Agilent Block(芯片上Oligo aCGH/ChIP杂交试剂盒,Large Volume,Agilent 5188–5380)。将30μL 2×Agilent杂交缓冲液添加到每个样品中并混合。将40μL所得杂交溶液手动移液到杂交衬垫载物片(Hybridization GasketSlide,每个载物片格式8个微阵列,Agilent)的每个“孔”中。根据制造商的方案,将携带具有20x dT接头的与每种适配体的40个核苷酸随机区域互补的每个阵列10个探针的定制Agilent微阵列载物片置于衬垫载物片上。将组件(Hybridization Chamber Kit–SureHyb-enabled,Agilent)夹住并且在以20rpm旋转的同时在60℃下孵育19小时。
杂交后洗涤
将大约400mL Agilent洗涤缓冲液1放入两个单独的玻璃染色皿中的每一个中。将载物片(一次不超过两个)在浸没在洗涤缓冲液1中的同时拆散并分开,然后转移到同样含有洗涤缓冲液1的第二染色皿中的载物片架上。将载物片在搅拌的同时在洗涤缓冲液1中再孵育5分钟。将载物片转移到预先平衡至37℃的洗涤缓冲液2中,并在搅拌下孵育5分钟。将载物片转移到含有乙腈的第四染色皿中,并在搅拌下孵育5分钟。
微阵列成像
微阵列载物片用Agilent G2565CA微阵列扫描仪系统在Cy3通道中以5μm分辨率在100%PMT设置和在0.05下激活的XRD选项下成像。使用具有GE1_105_Dec08方案的Agilent特征提取软件版本10.5.1.1处理所得的TIFF图像。
Luminex探针设计
固定在珠粒上的探针具有40个脱氧核苷酸,其与靶标适配体的40个核苷酸随机区域的3'端互补。适配体互补区通过携带5'氨基末端的六甘醇(HEG)接头与Luminex微球偶联。生物素化的检测脱氧寡核苷酸包含与靶标适配体的5'引物区域互补的17-21个脱氧核苷酸。生物素部分附连于检测寡核苷酸的3'端。
探针与Luminex微球的偶联
基本上按照制造商的说明书将探针与Luminex Microplex微球偶联,但进行了以下修改:氨基末端寡核苷酸的量为每2.5×106个微球0.08nmol,并且第二次添加的EDC为5μL,10mg/mL。偶联反应在设置为25℃和600rpm的Eppendorf ThermoShaker中进行。
微球杂交
将微球储备溶液(约40000个微球/μL)在Health Sonics超声清洁器(型号:T1.9C)中涡旋并超声处理60秒以使微球悬浮。在1.5×TMAC杂交溶液中,每次反应将悬浮微球稀释至2000个微球,并通过涡旋和超声处理混合。每次反应将33μL的珠粒混合物转移到96孔HybAid板中。将7μL在1×TE缓冲液中的15nM生物素化检测寡核苷酸原液添加到每个反应中并混合。添加10μL中和的测定样品,并用硅帽垫密封件将板密封。在常规杂交烘箱中,首先将板在96℃下孵育5分钟,并且在50℃下无搅拌孵育过夜。将滤板(Dura孔隙,Millipore部件编号MSBVN1250,1.2μm孔隙尺寸)用75μL补充有0.5%(w/v)BSA的1×TMAC杂交溶液预润湿。将来自杂交反应的整个样品体积转移至滤板。用75μL含有0.5%BSA的1×TMAC杂交溶液冲洗杂交板,并将任何剩余材料转移至滤板。历经约8秒用抽真空的150μL缓冲液在慢真空下过滤样品。将滤板用75μL含0.5%BSA的1×TMAC杂交溶液洗涤一次,并且将滤板中的微球重悬于75μL含0.5%BSA的1×TMAC杂交溶液中。将滤板避光并在Eppendorf ThermalmixerR上以1000rpm孵育5分钟。然后将滤板用75μL含0.5%BSA的1×TMAC杂交溶液洗涤一次。将75μL在1×TMAC杂交溶液中的10μg/mL链霉亲和素藻红蛋白(SAPE-100,MOSS,Inc.)添加到每个反应中,并在Eppendorf Thermalmixer R上在25℃以1000rpm孵育60分钟。将滤板用75μL含0.5%BSA的1×TMAC杂交溶液洗涤两次,并且将滤板中的微球重悬于75μL含0.5%BSA的1×TMAC杂交溶液中。然后将滤板在Eppendorf Thermalmixer R上避光孵育5分钟,1000rpm。然后将滤板用75μL含有0.5%BSA的1×TMAC杂交溶液洗涤一次。将微球重悬于75μL补充有0.5%BSA的1×TMAC杂交溶液中,并在运行XPonent 3.0软件的Luminex 100仪器上进行分析。在高PMT校准和7500至18000的双联体鉴别器(doublet discriminator)环境下,每种珠粒类型数出至少100个微球。
QPCR读出
利用10倍稀释液和无模板对照在水中制备在108至102拷贝范围内的qPCR标准曲线。将中和的测定样品在diH2O中稀释40倍。将qPCR主混合物制备成2×最终浓度(2×KOD缓冲液,400μM dNTP混合物,400nM正向和反向引物混合物,2×SYBR Green I和0.5U KODEX)。将10μL 2×qPCR主混合物添加到10μL稀释的测定样品中。在BioRad MyIQ iCycler上运行qPCR,在96℃下2分钟,接着是40个96℃5秒和72℃30秒的循环。
实施例4.生物标志物小组模型的分析
对包含表1和2中列出的41种生物标志物的各种组合的模型进行分析,以确定包含各种生物标志物组合的小组的AUC、敏感性和特异性。以下表9示出当该小组的生物标志物蛋白按表9所示的顺序逐一添加或逐一去除时的模型结果。因此,表9的第一行示出当小组仅包括INHBC时的模型结果(用于“逐一添加”结果)或包括所列出的除INHBC之外的所有41种所列出的生物标志物时的模型结果(用于“逐一去除”结果)。表9中的结果显示,一旦该小组包括至少前五种生物标志物蛋白,具体地讲为INHBC、SHBG、ACY1、COL1A1和RTN4R,随着每种后续生物标志物蛋白的添加,AUC的提高不太显著。随着其余生物标志物蛋白的添加,敏感性和特异性值继续提高。表9中的结果还显示,缺失前10种生物标志物蛋白,具体地讲为INHBC、SHBG、ACY1、COL1A1、RTN4R、CRLF1、CBX7、FAM20B COL15A和KIN的模型小组的性能显著下降,如通过AUC、敏感性和特异性所测量的。表9中示出的结果也以图表形式在图1A和1B中示出。
表9:逐一添加和逐一去除模型结果
还对模型的AUC、敏感性和特异性进行了分析,其中该小组包括来自表1和2的N种生物标志物,其中生物标志物以随机顺序逐一添加。结果在图1C中示出。结果显示,无论添加了从表1和2中选择的哪些生物标志物,模型的性能都随着向小组中添加更多生物标志物而提高。此外,10种随机生物标志物蛋白通常将导致AUC为0.7。
前述实施方案和实施例仅旨在作为实例。特定实施方案、实施例或特定实施方案或实施例的要素不应被解释为任何权利要求的关键、必需或基本要素或特征。在不脱离由随附权利要求所限定的本申请的范围的情况下,可以对所公开的实施方案做出各种改变、修改、取代和其他变化。本说明书,包括附图和实施例,应当被认为是说明性的而不是限制性的,并且所有此类修改和取代都旨在包括在本申请的范围内。在任何方法或过程权利要求中列举的步骤可以任何可行的顺序执行并且不限于在任何实施方案、实施例或权利要求中呈现的顺序。此外,在任何上述方法中,一个或多个具体列出的生物标志物可以作为单独生物标志物或作为来自任何小组的生物标志物被明确排除在外。
Claims (68)
1.一种确定受试者是否具有葡萄糖耐量减低或受试者具有葡萄糖耐量减低的可能性的方法,包括形成具有N种生物标志物蛋白的生物标志物小组,以及检测来自所述受试者的样品中所述N种生物标志物蛋白中的每一种的水平,其中N为至少3,并且其中所述N种生物标志物蛋白中的至少一种选自ACY1、COL1A1、RTN4R、CRLF1:CLCF1复合物、CBX7、KIN、SERPINA11、PELI2、TFF3、FABP12、GAD1、SVEP1、SOCS7、F9、STC1、MYOC、WFDC11、CALB1、CCL16、SMCO2、CCL23、OSTM1、RNASE10、ITIH1、ZNF134、CFAP45和SFTPD。
2.一种确定受试者是否患有前驱糖尿病或是否可能发展为前驱糖尿病或糖尿病的方法,包括形成具有N种生物标志物蛋白的生物标志物小组,以及检测来自所述受试者的样品中所述N种生物标志物蛋白中的每一种的水平,其中N为至少3,并且其中所述N种生物标志物蛋白中的至少一种选自ACY1、COL1A1、RTN4R、CRLF1:CLCF1复合物、CBX7、KIN、SERPINA11、PELI2、TFF3、FABP12、GAD1、SVEP1、SOCS7、F9、STC1、MYOC、WFDC11、CALB1、CCL16、SMCO2、CCL23、OSTM1、RNASE10、ITIH1、ZNF134、CFAP45和SFTPD。
3.一种检测样品中的N种生物标志物蛋白的水平的方法,包括从受试者获得所述样品,形成具有N种生物标志物蛋白的生物标志物小组,以及检测来自所述受试者的所述样品中所述N种生物标志物蛋白中的每一种的水平,其中N为至少3,并且其中所述N种生物标志物蛋白中的至少一种选自ACY1、COL1A1、RTN4R、CRLF1:CLCF1复合物、CBX7、KIN、SERPINA11、PELI2、TFF3、FABP12、GAD1、SVEP1、SOCS7、F9、STC1、MYOC、WFDC11、CALB1、CCL16、SMCO2、CCL23、OSTM1、RNASE10、ITIH1、ZNF134、CFAP45和SFTPD。
4.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中N为3至41,或N为4至41,或N为5至41,或N为6至41,或N为7至41,或N为8至41,或N为9至41,或N为10至41,或N为11至41,或N为12至41,或N为13至41,或N为14至41,或N为15至41,或N为16至41。
5.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中N为3,或N为4,或N为5,或N为6,或N为7,或N为8,或N为9,或N为10,或N为11,或N为12,或N为13,或N为14,或N为15,或N为16,或N为17,或N为18,或N为19,或N为20,或N为21,或N为22,或N为23,或N为24,或N为25,或N为26,或N为27,或N为28,或N为29,或N为30,或N为31,或N为32,或N为33,或N为34,或N为35,或N为36,或N为37,或N为38,或N为39,或N为40,或N为41。
6.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述N种生物标志物蛋白中的每一种选自表1。
7.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述N种生物标志物蛋白中的至少一种选自ACY1、COL1A1、RTN4R、CRLF1:CLCF1复合物、CBX7和KIN。
8.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述N种生物标志物蛋白中的一种或两种是INHBC和/或SHBG。
9.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述N种蛋白生物标志物中的至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种或至少10种选自ACY1、COL1A1、RTN4R、CRLF1:CLCF1复合物、CBX7、KIN、SERPINA11、PELI2、TFF3、FABP12、GAD1、SVEP1、SOCS7、F9、STC1、MYOC、WFDC11、CALB1、CCL16、SMCO2、CCL23、OSTM1、RNASE10、ITIH1、ZNF134、CFAP45和SFTPD。
10.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述N种生物标志物蛋白中的至少1种、至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种或至少10种选自FAM20B、COL15A1、MARCKSL1、HTRA1、CHAD、CPM、DLK1、HERC1、IL20RB、MAP2K4、GPX2和FGFR4。
11.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述N种生物标志物蛋白中的两种是INHBC和ACY1,或所述N种生物标志物蛋白中的两种是SHBG和ACY1,或所述N种生物标志物蛋白中的三种是INHBC、SHBG和ACY1。
12.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述N种生物标志物蛋白中的两种是INHBC和COL1A1,或所述N种生物标志物蛋白中的两种是SHBG和COL1A1,或其中所述N种生物标志物蛋白中的三种是INHBC、SHBG和COL1A1。
13.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述N种生物标志物蛋白中的两种是INHBC和RTN4R,或所述N种生物标志物蛋白中的两种是SHBG和RTN4R,或其中所述N种生物标志物蛋白中的三种是INHBC、SHBG和RTN4R。
14.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述N种生物标志物蛋白中的两种是INHBC和CRLF1:CLCF1复合物,或所述N种生物标志物蛋白中的两种是SHBG和CRLF1:CLCF1复合物,或其中所述N种生物标志物蛋白中的三种是INHBC、SHBG和CRLF1:CLCF1复合物。
15.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述N种生物标志物蛋白中的两种是INHBC和CBX7,或所述N种生物标志物蛋白中的两种是SHBG和CBX7,或其中所述N种生物标志物蛋白中的三种是INHBC、SHBG和CBX7。
16.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述N种生物标志物蛋白中的两种是INHBC和KIN,或所述N种生物标志物蛋白中的两种是SHBG和KIN,或其中所述N种生物标志物蛋白中的三种是INHBC、SHBG和KIN。
17.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中N为至少五并且所述N种生物标志物蛋白中的五种是INHBC、SHBG、ACY1、COL1A1和RTN4R。
18.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中N为至少16,并且其中所述N种生物标志物蛋白中的16种是ACY1、COL1A1、RTN4R、CRLF1、CBX7、KIN、SERPINA11、PELI2、TFF3、FABP12、INHBC、SHBG、FAM20B、COL15A1、MARCKSL1和HTRA1。
19.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述样品是血液样品、血浆样品或血清样品。
20.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述受试者继续食用典型饮食并且在获得所述样品之前不向所述受试者施用葡萄糖溶液。
21.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中选自SHBG、COL1A1、CRLF1:CLCF1复合物、FAM20B、COL15A1、KIN、SERPINA11、PELI2、MARCKSL1、CHAD、IL20RB、MYOC、WFDC11、MAP2K4、CALB1、FGFR4、OSTM1、ITIH1、CFAP45和SFTPD的至少一种生物标志物的水平高于相应生物标志物的对照水平指示所述受试者具有或可能具有葡萄糖耐量减低、患有或可能发展为前驱糖尿病,和/或可能发展为糖尿病。
22.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中选自INHBC、ACY1、RTN4R、CBX7、TFF3、HTRA1、FABP12、GAD1、CPM、SVEP1、SOCS7、F9、DLK1、HERC1、STC1、CCL16、SMCO2、GPX2、CCL23、RNASE10和ZNF134的至少一种生物标志物的水平低于相应生物标志物的对照水平指示所述受试者具有或可能具有葡萄糖耐量减低、患有或可能发展为前驱糖尿病,和/或可能发展为糖尿病。
23.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述受试者有发展为糖尿病的风险。
24.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其包括确定所述受试者是否具有或是否可能具有葡萄糖耐量减低。
25.根据权利要求24所述的方法,其中所述受试者可能具有葡萄糖耐量减低。
26.根据权利要求24所述的方法,其中所述受试者具有葡萄糖耐量减低。
27.根据权利要求2至26中任一项所述的方法,其包括确定所述受试者是否可能发展为或是否患有前驱糖尿病。
28.根据权利要求27所述的方法,其中所述受试者可能发展为前驱糖尿病。
29.根据权利要求27所述的方法,其中所述受试者患有前驱糖尿病。
30.根据权利要求25、26、28和29中任一项所述的方法,其中所述受试者可能发展为糖尿病。
31.根据权利要求30所述的方法,其中所述糖尿病是2型糖尿病。
32.根据权利要求21-23、25、26和28-31中任一项所述的方法,其包括向所述受试者施用治疗。
33.根据权利要求32所述的方法,其中所述治疗包括胰岛素、二甲双胍、实施减重计划、实施饮食限制、实施热量限制和/或实施锻炼计划。
34.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述方法包括使所述一个或多个样品的生物标志物蛋白与生物标志物捕获试剂集合接触,其中所述生物标志物捕获试剂集合中的各生物标志物捕获试剂特异性结合正在检测的不同生物标志物蛋白。
35.根据权利要求34所述的方法,其中各生物标志物捕获试剂是抗体或适配体。
36.根据权利要求35所述的方法,其中各生物标志物捕获试剂是适配体。
37.根据权利要求36所述的方法,其中至少一种适配体是慢解离速率适配体。
38.根据权利要求37所述的方法,其中至少一种慢解离速率适配体包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少10个具有修饰的核苷酸。
39.根据权利要求37或权利要求38所述的方法,其中各慢解离速率适配体以≥30分钟、≥60分钟、≥90分钟、≥120分钟、≥150分钟、≥180分钟、≥210分钟或≥240分钟的解离速率(t1/2)结合其靶蛋白。
40.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中如果所述受试者具有或可能具有葡萄糖耐量减低、患有前驱糖尿病或可能发展为前驱糖尿病或糖尿病,则向所述受试者推荐包括减重、血糖控制和/或药物治疗的方案。
41.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述确定包括使用分类模型或弹性网逻辑回归模型分析所述N种生物标志物蛋白水平的水平。
42.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述方法包括确定受试者是否具有或是否可能具有葡萄糖耐量减低、是否患有前驱糖尿病或是否可能发展为前驱糖尿病或糖尿病,以用于确定医疗保险费或人寿保险费的目的。
43.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述方法还包括确定医疗保险费或人寿保险费。
44.根据前述权利要求中任一项所述的方法,其中所述方法还包括使用由所述方法得到的信息来预测和/或管理医疗资源的利用。
45.一种试剂盒,其包含N种生物标志物蛋白捕获试剂,其中N为至少3,并且其中所述N种生物标志物蛋白捕获试剂中的至少一种特异性结合选自ACY1、COL1A1、RTN4R、CRLF1:CLCF1复合物、CBX7、KIN、SERPINA11、PELI2、TFF3、FABP12、GAD1、SVEP1、SOCS7、F9、STC1、MYOC、WFDC11、CALB1、CCL16、SMCO2、CCL23、OSTM1、RNASE10、ITIH1、ZNF134、CFAP45和SFTPD的生物标志物蛋白。
46.根据权利要求45所述的试剂盒,其中N为3至41,或N为4至41,或N为5至41,或N为6至41,或N为7至41,或N为8至41,或N为9至41,或N为10至41,或N为11至41,或N为12至41,或N为13至41,或N为14至41,或N为15至41,或N为16至41。
47.根据权利要求45或46所述的试剂盒,其中N为3,或N为4,或N为5,或N为6,或N为7,或N为8,或N为9,或N为10,或N为11,或N为12,或N为13,或N为14,或N为15,或N为16,或N为17,或N为18,或N为19,或N为20,或N为21,或N为22,或N为23,或N为24,或N为25,或N为26,或N为27,或N为28,或N为29,或N为30,或N为31,或N为32,或N为33,或N为34,或N为35,或N为36,或N为37,或N为38,或N为39,或N为40,或N为41。
48.根据权利要求45至47中任一项所述的试剂盒,其中所述N种生物标志物蛋白捕获试剂中的每一种特异性结合不同的生物标志物蛋白。
49.根据权利要求45至48中任一项所述的试剂盒,其中所述N种生物标志物蛋白捕获试剂中的每一种特异性结合选自表1的生物标志物蛋白。
50.根据权利要求45至49中任一项所述的试剂盒,其中所述N种生物标志物蛋白捕获试剂中的至少一种特异性结合选自ACY1、COL1A1、RTN4R、CRLF1:CLCF1复合物、CBX7和KIN的生物标志物蛋白。
51.根据权利要求45至50中任一项所述的试剂盒,其中所述N种生物标志物蛋白捕获试剂中的一种或两种特异性结合INHBC和/或SHBG。
52.根据权利要求45至51中任一项所述的试剂盒,其中所述N种蛋白生物标志物捕获试剂中的至少2种或至少3种各自特异性结合选自ACY1、COL1A1、RTN4R、CRLF1:CLCF1复合物、CBX7、KIN、SERPINA11、PELI2、TFF3、FABP12、GAD1、SVEP1、SOCS7、F9、STC1、MYOC、WFDC11、CALB1、CCL16、SMCO2、CCL23、OSTM1、RNASE10、ITIH1、ZNF134、CFAP45和SFTPD的蛋白。
53.根据权利要求45至52中任一项所述的试剂盒,其中所述N种生物标志物蛋白捕获试剂中的至少一种特异性结合选自FAM20B、COL15A1、MARCKSL1、HTRA1、CHAD、CPM、DLK1、HERC1、IL20RB、MAP2K4、GPX2和FGFR4的蛋白。
54.根据权利要求45至53中任一项所述的试剂盒,其中所述N种生物标志物蛋白捕获试剂中的两种中的每一种特异性结合INHBC或ACY1,或所述N种生物标志物蛋白捕获试剂中的两种中的每一种特异性结合SHBG或ACY1,或所述N种生物标志物蛋白捕获试剂中的三种中的每一种特异性结合选自INHBC、SHBG和ACY1的生物标志物蛋白。
55.根据权利要求45至54中任一项所述的试剂盒,其中所述N种生物标志物蛋白捕获试剂中的两种中的每一种特异性结合INHBC或COL1A1,所述N种生物标志物蛋白捕获试剂中的两种中的每一种特异性结合SHBG或COL1A1,或所述N种生物标志物蛋白捕获试剂中的三种中的每一种特异性结合选自INHBC、SHBG和COL1A1的生物标志物蛋白。
56.根据权利要求45至55中任一项所述的试剂盒,其中所述N种生物标志物蛋白捕获试剂中的两种中的每一种特异性结合INHBC或RTN4R,所述N种生物标志物蛋白捕获试剂中的两种中的每一种特异性结合SHBG或RTN4R,或所述N种生物标志物蛋白捕获试剂中的三种中的每一种特异性结合选自INHBC、SHBG和RTN4R的生物标志物蛋白。
57.根据权利要求45至56中任一项所述的试剂盒,其中所述N种生物标志物蛋白捕获试剂中的两种中的每一种特异性结合INHBC或CRLF1:CLCF1复合物,所述N种生物标志物蛋白捕获试剂中的两种中的每一种特异性结合SHBG或CRLF1:CLCF1复合物,或所述N种生物标志物蛋白捕获试剂中的三种中的每一种特异性结合选自INHBC、SHBG和CRLF1:CLCF1复合物的生物标志物蛋白。
58.根据权利要求45至57中任一项所述的试剂盒,其中所述N种生物标志物蛋白捕获试剂中的两种中的每一种特异性结合INHBC或CBX7,所述N种生物标志物蛋白捕获试剂中的两种中的每一种特异性结合SHBG或CBX7,或所述N种生物标志物蛋白捕获试剂中的三种中的每一种特异性结合选自INHBC、SHBG和CBX7的生物标志物蛋白。
59.根据权利要求45至58中任一项所述的试剂盒,其中所述N种生物标志物蛋白捕获试剂中的两种中的每一种特异性结合INHBC或KIN,所述N种生物标志物蛋白捕获试剂中的两种中的每一种特异性结合SHBG或KIN,或所述N种生物标志物蛋白捕获试剂中的三种中的每一种特异性结合选自INHBC、SHBG和KIN的生物标志物蛋白。
60.根据权利要求45至59中任一项所述的试剂盒,其中N为至少5,并且所述N种生物标志物蛋白捕获试剂中的五种中的每一种特异性结合选自INHBC、SHBG、ACY1、COL1A1和RTN4R的生物标志物蛋白。
61.根据权利要求45至60中任一项所述的试剂盒,其中N为至少16,并且其中所述N种生物标志物蛋白捕获试剂中的16种中的每一种特异性结合选自ACY1、COL1A1、RTN4R、CRLF1、CBX7、KIN、SERPINA、PELI2、TFF3、FABP12、INHBC、SHBG、FAM20B、COL15A1、MARCKSL1和HTRA1的生物标志物蛋白。
62.根据权利要求45至61中任一项所述的试剂盒,其中所述N种生物标志物捕获试剂中的每一种是抗体或适配体。
63.根据权利要求62所述的试剂盒,其中各生物标志物捕获试剂是适配体。
64.根据权利要求63所述的试剂盒,其中至少一种适配体是慢解离速率适配体。
65.根据权利要求64所述的试剂盒,其中至少一种慢解离速率适配体包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个或至少10个具有修饰的核苷酸。
66.根据权利要求64或权利要求65所述的试剂盒,其中各慢解离速率适配体以≥30分钟、≥60分钟、≥90分钟、≥120分钟、≥150分钟、≥180分钟、≥210分钟或≥240分钟的解离速率(t1/2)结合其靶蛋白。
67.根据权利要求45至66中任一项所述的试剂盒,其用于在来自受试者的样品中检测所述N种生物标志物蛋白。
68.根据权利要求67所述的试剂盒,其用于确定所述受试者是否具有或是否可能具有葡萄糖耐量减低或是否患有前驱糖尿病,或是否可能发展为前驱糖尿病或糖尿病。
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