BR112012004157B1

BR112012004157B1 - biomateriais, processo de misturar acp com hbc e uso dos mesmos

Info

Publication number: BR112012004157B1
Application number: BR112012004157-6A
Authority: BR
Inventors: Matteo D'este; Davide Renier
Original assignee: Fidia Farmaceutici S.P.A.
Priority date: 2009-08-27
Filing date: 2010-08-25
Publication date: 2021-03-09
Also published as: US20120190644A1; EP2772273B9; AU2010288937B2; KR20120107455A; RU2692800C2; ITPD20090246A1; CA2995957C; WO2011023355A2; CN102548590B; SI2470230T1; SI2470230T2; PL2470230T5; EP2470230B1; AU2010288937A1; PT2470230E; RU2014149799A3; EP2772273A2; SMT201600062B; US8846640B2; RU2543329C2

Abstract

GELES VISCOELÁSTICOS COMO CARGAS INOVADORAS. A presente invenção refere-se a biomateriais obteníveis por mistura: - do derivado autorreticulado de acihi (ACP) com - o derivado (HBC) de ácido hialurônico reticulado com - éter diglicidílico de 1,4-butanodiol (BDDE) na relação em peso entre 10:90 e 90:10, como novos enchimentos.

Description

CAMPO DA INVENÇÃO

[001] O ácido hialurônico (HA) é um hetero-polissacarídeo consistindo em resíduos alternados de ácido D-glucurônico e N-acetil- d-glicosamina.

[002] O HA é um polímero de cadeia reta com um peso molecular variando entre 50.000 e 13 x 106 Da, dependendo da fonte da qual ele é oriundo e dos métodos de preparação empregados.

[003] HA está presente na natureza em geles pericelulares, na substância fundamental do tecido conjuntivo dos vertebrados (dos quais ele é um dos principais componentes), no humor vítreo e no cordão umbilical.

[004] HA desempenha um importante papel no organismo biológico como um suporte estrutural e mecânico para os tecidos, e como um componente ativo na fisiologia celular de tecidos como pele, tendões, músculos e cartilagem, tratando-se de uma das moléculas principais na matriz cartilaginosa, representando também o constituinte principal não proteico do fluido sinovial. Como se trata de uma molécula viscoelástica fortemente hidrofílica, confere propriedades lubrificantes ao fluido sinovial. HA tem sido empregado, portanto, na osteoartrite por cerca de 30 anos, principalmente para tratar a dor associada.

[005] O ácido hialurônico (HA) ainda desempenha um papel crucial no processo de reparação de tecidos do ponto de vista estrutural (na organização da matriz extracelular e regulação de sua hidratação), e ainda como uma substância reguladora/estimulante de uma faixa ampla de processos fisiológicos em que o referido polissacarídeo atua direta e/ou indiretamente (formação de coágulo, atividade fagocitária, proliferação de fibroblastos, neovascularização, re-epitelialização, etc.) (Weigel P. et al., J Theoretical Biol, 1986:219-234; Abatangelo G. et al., J Surg Res, 1983, 35:410-416; Goa K. et al., Drugs, 1994, 47:536-566). Como essas propriedades foram reconhecidas há tempos, o HA é também empregado para preparação de ataduras no cuidado de ferimentos, úlceras e lesões de pele de várias origens.

[006] O ácido hialurônico também é usado como um enchimento de rugas, vincos e pequenas depressões da face, e ainda para aumento do volume dos lábios e face, devido a ser imunologicamente inerte, não tóxico, biodegradável e biorreabsorvível.

[007] O tratamento à base de ácido hialurônico está indicado para correção de: volume e contorno dos lábios; vincos (por exemplo dobras nasolabiais; remodelação dos contornos faciais (por exemplo, face e queixo); rugas (por exemplo, linhas glabelares e comissuras orais); rugas periorbitais; cicatrizes fibrosas pós-acne; cicatrizes fibrosas pós-trauma; defeitos de tecido mole; cicatrizes de rinoplastia.

[008] O ácido hialurônico não é um enchimento permanente, significando que uma vez injetado, o produto é metabolizado gradualmente e reabsorvido pelo corpo, com o tempo, variando de acordo com a área tratada e o tipo de preparação usado. O efeito de enchimento e aumento de volume (ou atenuação de rugas) é imediato, durando apenas umas poucas semanas. Os principais produtos presentes no mercado podem ser classificados sob as seguintes categorias, com base em seus diferentes tempos de reabsorção: enchimentos de reabsorção rápida (2 a 3 meses), enchimentos de reabsorção de médio prazo (5 a 6 meses), enchimentos de reabsorção lenta (1 ano) como Restylane Sub Q (QMed, EP0839159).

[009] Na derme, o HA realiza funções hidratantes devido a sua grande capacidade em ligar-se à água e funções estruturais como "andaime", pois, pela ligação com outras substâncias, ele forma complexos macromoleculares que tornam a pela compacta.

[010] O mecanismo de ação, portanto, consiste em enchimento volumétrico imediato, devido às propriedades viscoelásticas do produto e nova síntese de colágeno, devido ao estímulo dos fibroblastos cutâneos.

[011] Entretanto, HA é um polissacarídeo natural que é rapidamente quebrado pelas enzimas hialuronidase presentes no tecido conjuntivo; de modo a obter enchimentos cujo efeito perdura por vários meses, O HA é, portanto, submetido a processos de reticulação que melhorar suas propriedades viscoelásticas e aumenta seu tempo de residência. Os enchimentos assim formados são reticulados, por exemplo, por meio de BDDE (éter diglicidílico de 1,4-butanodiol, Restylane®, BELOTERO® e Regenyal Idea) ou DVS (divinil sulfona, Hylaform®), o qual cria pontes entre as moléculas de polímero. Entretanto, com o aumento do grau de reticulação, há a desnaturação progressiva de HA até o ponto de modificar profundamente suas propriedades físicas, químicas e biológicas. Matrizes de HA excessivamente reticuladas presentes como particulados sólidos que não são mais reconhecidos pelas células (e especialmente pelo sistema imunológico) como HA; o polissacarídeo é, portanto, percebido como um corpo estranho, que aciona reações inflamatórias com formação de cápsulas fibrosas em torno dele. Além do mais, HA excessivamente reticulado é incapaz de estimular a regeneração do tecido dérmico/cutâneo, induzido como se sabe de resultados científicos bem instituídos pelos fragmentos de HA (especialmente aqueles com um baixo peso molecular) que têm o efeito de estimular a síntese de colágeno pelos fibroblastos cutâneos.

[012] Os enchimentos são ainda classificados como reabsorvíveis ou permanentes. Os enchimentos reabsorvíveis são os mais biocompatíveis; eles consistem em ácido hialurônico ou colágeno, seja modificado ou presente na forma nativa, sendo consequentemente reabsorvidos dentro de um ano, no máximo. O tipo permanente consiste em polímeros sintéticos como poliacrilamidas, moléculas reticuladas particulares, que formam um gel estável quando combinado com água. O tipo permanente permanece sempre in situ sendo bastante útil para enchimento dos lábios, porém seu uso não é recomendado, porque a ocorrência de inflamações agudas cada vez mais frequentes, devido à sua inserção cutânea, leva à formação de cápsulas fibrósicas em torno do enchimento, o que se percebe como um corpo estranho, sendo por isso, considerado tóxico.

[013] O depositante aperfeiçoou um novo tipo de biomaterial como enchimento inovador, e/ou como novo produto para conformação corporal, formado por mistura de dois derivados de HA reticulados de modos diferentes, porém complementares, para obter-se um substituto de pele/tecido que permite a hidratação imediata (e consequentemente, um enchimento imediato) do tecido/pele tratado(a), enquanto ao mesmo tempo mantém tempos de quebra in vivo bastante longos a fim de eliminar a necessidade de injeções repetidas, reduzindo assim, os efeitos colaterais.

[014] Os novos biomateriais aos quais a presente invenção se refere, apresentam características particulares inovadoras de biocompatibilidade idênticas aos do ácido hialurônico como tal, porém sua biodegradabilidade é diferente; quando implantado in vivo, seu tempo de residência é muito maior do que o do HA não modificado, permitindo assim, uma regeneração/reconstrução imediata do tecido dérmico/cutâneo que perdeu sua densidade original.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[015] O depositante aperfeiçoou um novo tipo de biomaterial como um novo enchimento e/ou como um novo produto para moldagem corpórea, com base na mistura de derivados de HA com diferentes características, porém complementares, na obtenção de um novo produto para injeção, no tratamento de imperfeições da pele, na dermatologia, na dermocosmetologia e/ou em cirurgia estética, produzindo: imediata hidratação dermocutânea; Imediato enchimento do tecido tratado; tempos de quebra muito longos in vivo; reduzidos efeitos colaterais.

[016] Os novos biomateriais consistem em:

[017] Ácido hialurônico autorreticulado (ACP) ou hexadecilamina de HA (HYADD) misturado com ácido hialurônico reticulado com BDDE (HBC).

[018] O ACP usado na presente invenção preparado como descrito na EP 0341745, é dotado de um grau médio de reticulação entre 4 e 5% sendo preferivelmente preparado usando-se HA com um peso molecular médio (MW) de 200 KDa. Quando hidratado ele se apresenta como um gel autorreticulado sem moléculas estranhas ao polissacarídeo nativo, porque ele surge da ligação éster entre os grupos carboxila e hidroxila da mesma cadeia polissacarídea e/ou cadeias adjacentes. Ele é, portanto, destituído de imunotoxicidade, como biocompatível com HA nativo, altamente umectante, e facilmente degradável pelas hialuronidases, liberando moléculas com um baixo peso molecular, capazes de estimular a síntese de colágeno para melhora do tônus e elasticidade do tecido cutâneo.

[019] Hexadecilaminda de HA (HYADD) é preparado conforme descrito em EP 1095064 e EP1853279, de preferência, usando HA com um peso molecular médio (MW) de 500-730 KDa. com um grau médio de amidação/substituição final entre 1 e 3% em mol.

[020] ACP e HYADD são os derivados do HA responsáveis pela hidratação imediata (levando ao enchimento dérmico instantâneo) proposto pela injeção intradérmica do enchimento ao qual se refere a presente invenção.

[021] HA reticulado com BDDE (uma molécula contendo grupos epóxi para formação de éteres nas hidroxilas primárias de HA) contém a molécula de reticulação, sendo portanto, mais resistente à degradação enzimática, porque ela possui pontes éter que estabilizam o polissacarídeo conferindo ao produto obtido um longo tempo de residência.

[022] Misturando-se as duas espécies de HA reticulado tem-se formação de um novo biomaterial que possui características de biocompatibilidade idênticas àquelas do ácido hialurônico nativo, porém com uma diferente biodegradabilidade, de modo que, quando implantado in vivo, seu tempo de residência é muito maior do que o do HA não modificado, permitindo assim, a regeneração/reconstrução do tecido dérmico que perdeu sua densidade original. O Depositante demonstrou ainda que, sua associação bastante inesperada leva a um tempo de quebra in vivo muito maior do que o dos enchimentos comerciais de referencia formados pelo mesmo tipo de HA reticulado com BDDE, com um consequente aumento no tempo de residência. Finalmente o Depositante reivindica o uso de novos biomateriais como enchimentos e/ou como novos produtos para moldagem de corpo no tratamento de imperfeições de pele, na dermatologia, na dermocosmetologia e/ou em cirurgia estética.

[023] A natureza quimicamente heterogênea dos novos biomateriais permite que as propriedades do produto acabado sejam moduladas por variação adequada da relação ponderal entre os constituintes. Os dois HA podem ser misturados em ACP (ou relação HYADD):HBC de 10:90 a 90:10: A relação em peso será selecionada na base da desejada viscosidade final, dependendo do local tratado. Caso algumas áreas de implantação que precisem de grandes quantidades de biomaterial vão ser tratadas, como em casos de enchimento de seios, nádegas, face ou queixo, ou rugas de expressão profundas o biomaterial usado irá consistir, preferivelmente de boa densidade, e portanto uma viscosidade adequada na obtenção de um gel com excelente consistência e baixa velocidade de biodegradabilidade; neste caso o ACP (mistura HYADD:HBC ficará entre 10:90 e 50:50, e preferivelmente, 25:75, porque o produto obtido por aumento da fração de peso de HBC é mais adequado para realizar um efeito intensificador de volume de longa duração.

[024] Contudo, caso o tratamento seja para vincos labiais ou rugas finas da fronte, a relação de ACP (ou HYADD):HBC ficara, preferentemente, entre 90:10 e 50:50, pois uma maior fração de ACP no enchimento produz um material mais adequado para a biorrevitalização da pele e correção de linhas finas, rugas de expressão secundárias e outros. Além disso, a agulha deverá ter um grande calibre, o gel deve, portanto, ser facilmente extrusável e menos viscoso do que o descrito acima. As propriedades reológicas do produto são por isso, ajustáveis com base na relação de ACP:HBC selecionada.

[025] ACP (ou composição HYADD)/HBC sendo igual, as propriedades do biomaterial também podem ser adequadamente moduladas por meio de uma seleção-alvo do veículo, em que ele é preparado:por exemplo, uma mistura em peso de ACP:HBC 50:50 dispersa na solução salina (0.9% NaCl) será mais viscosa do que se for dispersa em tampão de fosfato a pH=6.95; e portanto, para esta mistura específica, a solução salina é um meio mais adequado para formulação dos produtos com uma velocidade limitada de dispersão in situ.

[026] Materiais consistindo principalmente em HBC apresentarão o perfil oposto. As propriedades viscoelásticas do material, afetam, consequentemente o desempenho do produto.

[027] A presente invenção refere-se ainda a processos de preparação dos dois biomateriais descritos supra: processo A e processo B.

[028] Os processos inovadores A e B são divididos em duas etapas: 1. processo para produção do derivado de HBC, e 2. processo para misturá-lo com o derivado ACP ou HYADD.

[029] As duas etapas levam à produção dos produtos com um elevado grau de pureza; Com os métodos normalmente empregado na produção de HA reticulado com BDDE, os processos de purificação são realizados por lavagem da massa de gel obtida, ou por diálise. Em ambos os casos, a eficiência de purificação ótima não pode ser conseguida, devido à natureza da matriz de gel, que, em virtude de sua tendência a inchar, incorpora grandes quantidades de solvente. Esses geles possuem baixa capacidade de mobilidade e de transporte, tendendo a precipitar-se como gomas gelatinosas. O precipitado assim obtido, isolado como um solido possui diferentes propriedades de solubilidade e reologia, quando reidratado, especialmente a capacidade de inchar, elasticidade e homogeneidade (características essências para um enchimento) do gel antes da purificação.

[030] Contudo, o método a seguir descrito pelo Depositante como processo A precipita o produto na forma de um pó finamente dividido, que é a seguir facilmente lavável. Além disso, a escolha cuidadosa das condições de reação produz, após isolamento por precipitação e lavagem um produto com capacidade de reconstrução do gel, por meio de re- hidratação e esterilização, originando um biomaterial com características reprodutíveis, bem padronizado de elasticidade e homogeneidade.

[031] O processo B não inclui a etapa de precipitação do produto HBC como um pó; a purificação e homogeneização do gel (obtido após mistura com HBC com ACP ou HYADD) é realizada na etapa de trituração envolvendo a passagem dele através de um filtro com um coeficiente de retenção de matéria particulada entre 25 e 150 μm. Esta etapa purifica o gel final tornando-o perfeitamente homogêneo.

[032] O HA usado na presente invenção para preparação dos derivados descritos supra (HBC, ACP e HYADD) pode ser derivado de qualquer fonte, como extração de crista-de-galo (botânica) ou fermentação tendo um peso molecular médio entre 400 e 3x 106 Da, preferivelmente entre 1x 105 Da e 1x 106 Da, e ainda mais preferivelmente entre 200,000 e 1x 106 Da.

[033] Um novo processo de fabricação A compreende as seguintes etapas: Síntese de HBC reticulado 1. Dissolução em solução alcalina (preferivelmente 0,15M - 0,35M NaOH) de diepóxido de BDDE em uma relação estequiométrica entre 2,5 e 25% molar, preferivelmente entre 5 e 15% molar (dependendo do uso pretendido do produto; quanto maior for a percentagem de BDDE, maior o tempo de residência) das unidades repetitivas de ácido hialurônico, seguido por: 2. dispersão do HA na solução referida no parágrafo precedente à temperatura ambiente. A concentração de HA deve ficar entre 80 e 300 mg/ml e o tempo de homogeneização entre 30 e 300 minutos. 3. Realização da reação por ativação térmica, a solução é aquecida a uma temperatura entre 35 e 55°C entre 2 e 36 horas. 4. Extrusão da massa obtida por meio de uma peneira de metal, a fim de reduzi-la a partículas com um tamanho de aproximadamente 600 μm. 5. Hidratação do gel diluindo-o com água em um fator de 3 a 25, por um tempo entre 4 e 48 horas a uma temperatura de 4 a 24°C. 6. Correção do pH para neutro, com uma solução aquosa de HCl tendo uma concentração de 0,5 a 5 moles/L, preferivelmente 1 a 2 moles/L. 7. Adição de 2,5 volumes de solvente orgânico hidrossolúvel como etanol, metanol, isopropanol, n-propanol, dioxano, acetonitrila, acetona e/ou misturas destes (preferivelmente etanol e acetona), até ser obtido o produto na forma de um pó precipitado. 8. Lavagem com solventes orgânicos como etanol, metanol, isopropanol, n-propanol, dioxano, acetonitrila, acetona e/ou misturas destes (preferivelmente etanol e acetona) contendo uma fração aquosa abaixo de 35%. 9. Secagem sob vácuo a uma temperatura entre 30 e 45°C por 2 e 7 dias, e em qualquer caso, até eliminação dos solventes residuais sob 400 ppm obtendo-se um pó de HBC branco. Mistura de ACP (ou HYADD) com HBC 10. Mistura do pó de HBC com pó de ACP (ou HYADD) em uma relação de ACP:HBC entre 10:90 e 90:10 (dependendo do uso escolhido, como previamente descrito). 11. Hidratação com solução salina ou tampão de fosfato, preferivelmente solução salina (que pode conter mais excipientes como lidocaína), levando a uma concentração total de HA entre 12 e 27 mg/ml, preferivelmente entre 20 e 25 mg/ml, a uma temperatura entre 0 e 26°C. 12. Extrusão por meio de peneira com uma malha entre 50 e 500 μm, preferivelmente, entre 100 e 250 μm. A filtração é realizada a temperatura ambiente, ou a uma temperatura entre 25 e 65°C, preferivelmente, entre 40 e 60°C. 13. Enchimento das seringas, preferivelmente feitas de vidro ou material polimérico, com o produto obtido. 14. Esterilização térmica com vapor saturado a uma temperatura dentre 120 e 124°C (preferivelmente 121,5 ±1°C) por pelo menos 10 minutos.

[034] Novo Processo de fabricação B compreende as seguintes etapas: Síntese de HBC reticulado 1. Dissolução em solução alcalina (preferivelmente 0.15M - 0,35M NaOH) de diepóxido BDDE em uma relação estequiométrica de 2,5 para 25% molar, preferivelmente entre 5 e 15% em mol dependendo do uso pretendido do produto) das unidades repetitivas de ácido hialurônico seguido por: 2. Dispersão do HA na solução referida no parágrafo precedente à temperatura ambiente. A concentração de HA deve ficar entre 80 e 300 mg/ml e o tempo de homogeneização entre 30 e 300 minutos. 3. Realização da reação por ativação térmica, a solução é aquecida a uma temperatura entre 35 e 55°C entre 2 e 36 horas. 4. Correção do PH para neutro com uma solução aquosa de HCl tendo uma concentração de 0,05 a 1 mol/l, preferivelmente 0,1 mol/l. 5. Hidratação do gel diluindo-o com água em um fator de 3 a 20 por um tempo entre 4 e 48 horas a uma temperatura de 4 a 24°C. Esta solução pode conter outros excipientes tais como as NaCl, sais de sódio ou potássio do ácido fosfórico e lidocaína, preferivelmente na forma de sal de cloridrato. Os sais de sódio (cloro ou fosfato) tem a função de manter a adequada osmolaridade do produto, mantendo o pH a um valor compatível com os tecidos. Em uma modalidade preferida, da invenção o NaCl é adicionado em uma proporção tal que a solução final contém uma concentração entre 0,8 e 1,0% do mesmo, preferivelmente, 0,9%; o cloridrato de lidocaína, caso presente, é adicionado em uma proporção tal que a formulação final contém uma proporção entre 2,2 e 3,2 mg/ml do mesmo, preferivelmente 2,7 mg/ml. Mistura de ACP (ou HYADD) com HBC 6. Mistura de gel HBC com pó ACP (ou HYADD) em uma relação de ACP (ou HYADD):HBC entre 10:90 e 90:10 (em peso do ingrediente ativo) dependendo do uso pretendido para o novo enchimento, como descrito anteriormente. Alternativamente, o ACP ou HYADD podem ser misturados com HBC começando com ambos os cotes na forma de gel, usando-se um sistema padrão de agitação (preferivelmente com uma lamina orbital) por um tempo entre 30 minutos e 24 horas a uma temperatura entre 0 e 26°C. 7. Trituração e homogeneização passando através de um filtro com um coeficiente de retenção de material particulada entre 25 e 150 μm, preferivelmente, entre 40 e 110 μm. Caso a viscosidade seja excessiva, a operação pode ser realizada a quente, a uma temperatura entre 25 e 65°C. 8. Enchimento das seringas, de vidro ou de material polimérico, com o produto obtido. 9. Esterilização a quente de vapor saturado a uma temperatura entre 120 e 124°C (Preferivelmente 121.5 ± 1°C) por pelo menos 10 minutos.

[035] Alguns exemplos de preparação no novo enchimento de acordo com a invenção estão descritos a seguir, à guisa de exemplo e não de limitação.

Exemplo 1: Síntese de HBC 500 (HA 500-730 kDa) processo A

[036] 0,075 mol de HA com um peso molecular de 500-730 kDa, produzido por fermentação, são dispersos em 215 ml de uma solução 0,25M NaOH contendo 1,41 ml de BDDE. A mistura é a seguir aquecida para 42°C e reagida por 3 horas, sendo a seguir hidratada por 24 h com 300 ml de uma solução contendo uma quantidade estequiométrica de HCl a fim de ajustar o pH para pH neutro. O volume total é composto de 750 ml e precipitado com 2,5 volumes de etanol obtendo-se um precipitado filtrável, decantável. A mistura é lavada com etanol a 75% até purificação exaustiva, verificado por medição da condutividade específica dos solventes de lavagem, que deverão estar abaixo de 30 μS/cm, sendo secos sob vácuo a 40°C por 5 dias. O produto HBC 500 é obtido com um rendimento em peso de 87%.

Exemplo 2: Síntese de HBC 1000 (HA 1MDa) processo A

[037] 1.60 g de HA com um peso molecular médio de 1 MDa, produzido por fermentação é disperso em 20 ml de de uma solução 0,25M de NaOH contendo 75 μl de BDDE. A mistura é a seguir aquecida a 42°C e reagida por 2 horas. A mistura é hidratada por 24h com 20 ml de uma solução contendo uma quantidade estequiométrica de HCl para ajuste do pH a pH neutro. O volume total é composto em 75 ml e o HBC é precipitado com 2,5 volumes de etanol obtendo-se um precipitado filtrável, decantável. A mix é lavada com 75% de etanol até purificação exaustiva, que foi verificado medindo-se a condutividade específica dos solventes de lavagem, que deveriam estar abaixo de 30 μS/cm, sendo seca sob vácuo a 40°C por 5 dias.O produto HBC 1000 é obtido com um rendimento em peso de 90%.

Exemplo 3: Síntese de HBC 200 (HA 200 kDa) processo A

[038] 2.55 g de HA com um peso molecular médio de 200 KDa, produzido por fermentação, são dispersos em 20 ml de uma solução 0,25M de NaOH contendo 63 μl de BDDE. A mistura é a seguir aquecida para 42°C sendo reagida por 150 mit. A mistura é a seguir hidratada por 24h com 20 ml de uma solução contendo uma quantidade estequiométrica de HCl. O volume total é composto em 75 ml e precipitado com 2.5 volumes de etanol obtendo-se um precipitado filtrável, decantável. A mistura é lavada com 75% de etanol até purificação exaustiva, o que se verificou por medição da condutividade específica dos solventes de lavagem, que deveria ser abaixo de 30 μS/cm, sendo seca sob vácuo a 40°C por 5 dias. O produto HBC 200 é obtido com um rendimento em peso de 85%.

Exemplo 4: Preparação de gel ACP:HBC 500 na relação de 50:50 processo A

[039] 1.00 g de HBC 500, preparado como descrito no exemplo 1, é misturado com 1.00 g de éster interno HA ACP. O pó é hidratado com 100 ml de 0.9% de solução salina estéril peso/volume a uma temperatura de 8°C por 16 horas. O gel obtido é aquecido para 48°C sendo filtrado por meio de peneira metálica com uma malha de 0.17 mm, sendo a seguir, distribuído entre seringas de vidro de 1 ml, que a seguir passam por um ciclo de esterilização com vapor saturado a uma temperatura de 121°C por 10 minutos. É obtido um gel estéril homogêneo adequado para administração local.

Exemplo 5: preparação de gel ACP:HBC 1000 , na relação de 30:70 processo A

[040] 1.40 g de HBC 1000, preparado no exemplo 2, é misturado com 0.60 g de éster interno HA ACP . O pó é hidratado com 100 ml de solução salina estéril a 0,9% p/v a uma temperatura de 8°C por 16 horas. O gel obtido é aquecido a 48°C sendo filtrado por peneira metálica com uma malha de 0,17 mm, sendo a seguir distribuído entre seringas de vidro de 1 ml, as quais passam por um ciclo de esterilização com vapor saturado a uma temperatura de 121°C por 10 minutos. Obtém-se um gel estéril homogêneo para administração local.

Exemplo 6: preparação de gel ACP:HBC 500, na relação de 25:75 processo A

[041] 1.875 g de HBC 500, preparado no exemplo 1 é misturado com 0.625 g de ACP de éster interno de HA . O pó é hidratado com 100 ml de solução salina estéril a 0,9% p/v a uma temperatura de 8°C por 16 horas. O gel obtido é aquecido para 48°C sendo filtrado por peneira metálica com tamanho de malha de 0,19 mm, sendo a seguir distribuído entre seringas de vidro de 1 mm, com subsequente ciclo de esterilização com vapor saturado a uma temperatura de 121°C por 12 minutos, obtendo-se um gel homogêneo estéril adequado para administração local.

Exemple 7: preparação de gel ACP:HBC 1000 , na relação de 75:25 processo A

[042] 0.50 g de HBC 1000, preparado como descrito no exemplo 2, é misturado com 1.50 g de ACP de éster interno de HA. O pó é hidratado com 100 ml de solução salina estéril a 0,9% p/v a uma temperatura de 8°C por 24 horas. O gel obtido é aquecido para 42°C e filtrado por peneira metálica com tamanho de malha de 0,17 mm, sendo a seguir distribuído entre seringas de vidro de 2 ml com subsequente ciclo de esterilização com vapor saturado a uma temperatura de 121°C por 12 minutos, obtendo-se um gel homogêneo estéril, adequado para administração local.

Exemplo 8: preparação de gel HYADD:HBC 500, na relação de 60:40 processo A

[043] 1,20 g de HBC 500, preparado como descrito no exemplo 1, é misturado com 0,80 g de hexadecilamida de HA (HYADD). O pó é hidratado com 100 ml de solução salina estéril a 0,9% p/v a uma temperatura de 8°C por 24 horas. O gel obtido é aquecido para 52°C e filtrado por peneira metálica com tamanho de malha de 0,17 mm, sendo a seguir distribuído entre seringas de vidro de 1 ml com subsequente ciclo de esterilização com vapor saturado a uma temperatura de 121°C por 11 minutos, obtendo-se um gel homogêneo estéril, adequado para administração local.

Exemplo 9: preparação de gel HYADD:HBC 500 , na relação de 40:60 processo A

[044] 8.0 g de de sal de sódio de HA com um peso molecular médio de 500-730 kDa, produzido por fermentação são dispersos em 40 ml de uma solução 0,25M de NaOH contendo 0,44 ml de BDDE. A mistura é aquecida a 41.5°C por 2 horas e 40 minutos, sendo a seguir hidratada durante a noite com 100 ml de uma solução 0,1 M de HCl e 200 ml de água. 50 ml de uma solução saturada de NaCl são adicionados sendo a mistura deixada intumescer durante a noite. No próximo dia, 170 ml de acetona e 30 ml de solução saturada de NaCl são adicionados, sendo a mistura precipitada por adição lenta de 1 litro de etanol. O precipitado é lavado com o mesmo solvente até os resíduos de NaCl serem eliminados, a seguir seco ao forno a 35°C sob vácuo até os solventes residuais serem eliminados. O pó de HBC assim obtido é misturado na relação de 5:3 com HYADD, preparado como descrito na patente EP1853279. Os pós misturados são hidratados com solução salina compondo uma concentração total de 20 mg/ml (correspondente a 12,5 mg/ml de HBC e 7,5 mg/ml de HYADD4). O produto é deixado intumescer durante a noite a 5°C, e no próximo dia é filtrado através de uma membrana plana com uma velocidade de retenção de matéria particulada nominal de 100 μm. Seringas de vidro de 1 l são enchidas com o produto assim obtido e esterilizadas em um ciclo com F0=13 a 121,5°C.

Exemplo 10: Enchimento cutâneo e tolerabilidade de gel HYADD:HBC no modelo de administração intradérmico a coelhos

[045] A finalidade do experimento foi avaliar o enchimento cutâneo, a arremetida de quaisquer eventos adversos macroscópicos e a resposta de tecido induzida pelo gel de HYADD:HBC gel (preparado como descrito no exemplo 9) injetado em tecido intradérmico de coelho, por comparação com o enchimento comercial BELOTERO®.

[046] Para a referida avaliação, os geles testados foram adminis trados intradermicamente a coelhos macho NZW-KBL pesando 1.8-2.3 kg. Projeto do Experimento:

[047] Os animais foram anestesiados por administração intrave nosa de cetamina e xilaxina. Foram usados 3 animais para cada enchimento testado dia 0 = T0 - injeção das amostras (1 ml de hidrogel por amostra) após raspagem do dorso dos coelhos; - medição da inchação de todos os coelhos e observação macroscópica para eventos adversos. Dia 7: T7 - Medição do volume de inchação e observação macroscópica para eventos adversos.

[048] O volume de inchação foi calculado com a fórmula: (2/3 x π) x (r1) x (r2) x (r3) em que: (r1), (r2) e (r3) representam a largura, comprimento e altura da inchação, respectivamente, medidos com um instrumento de calibração. Resultados:

[049] O enchimento inovador não ocasionou qualquer evento inflamatório nas dermes tratadas.

[050] Os resultados obtidos para o tempo de residência são mostrados na figura 1: a proporção de inchação avaliada nas primeiras semanas de tratamento (expressa como mm3) demonstrou que o gel, de acordo com a invenção é capaz de induzir um maior volume de inchação na pele do que o controle, permanecendo alto mesmo após 7 dias, novamente a uma extensão muito maior do que o enchimento comercial usado em comparação. Esta descoberta confirma claramente que os novos enchimentos produzem imediatamente uma hidratação dérmica significativa e seu efeito é atribuído à presença do derivado HYADD que, devido a suas características químicas reológicas, provou ser essencial para promoção de imediato enchimento cutâneo permanecendo estável com o tempo.

Exemplo 11: Síntese de HBC 500 (HA 500-730 kDa) processo B

[051] 18.75 g de sal de sódio de HA com um peso molecular de 500-730 kDa, produzido por fermentação são dispersos em 133 ml de uma solução 0,25M de NaOH contendo 885 μl de BDDE. A mistura é então aquecida para 45°C por 2,5 horas. A mistura é hidratada durante a noite com 0,62 L de uma solução contendo uma quantidade estequiométrica de HCl, 2,65g de NaCl e 2,7g de cloridrato de lidocaína, agitação lenta.

Exemplo 12: preparação de gel ACP:HBC 500 , na relação de 25:75 processo B

[052] 6.25 g éster interno de ácido hialurônico ACP 200 são solubilizados em 250 ml de uma solução contendo 4,4 g de NaCl sob lenta agitação. Quando a hidratação estiver terminada, o gel é combinado com o gel obtido de acordo com o exemplo 11, em uma misturadora equipada com um sistema para misturar semi-sólidos, até a homogeneidade. O gel obtido é extrusado por meio de um filtro de membrana plana com uma velocidade de retenção de matéria particulada nominal de 70 μm. O produto assim obtido é introduzido em seringas de vidro e esterilizadas em um ciclo com F0=13 a 121.5°C.

Exemplo 13: preparação de gel HYADD:HBC 500, na relação de 25:75 processo B

[053] 6.25 g de hexadecilamida de HYADD são solubilizados em 250 ml de uma solução contendo 4.4 g de NaCl sob lenta agitação. Quando a hidratação estiver terminada o gel é combinado com o gel obtido de acordo com o exemplo 1 em uma misturadora equipada com um sistema de misturação orbital até a homogeneidade. O gel obtido é extrusado por um filtro de membrana plana com uma velocidade de retenção de matéria particulada nominal de 70 μm. O produto assim obtido é introduzido em seringas de vidro e esterilizado em um ciclo com F0=13 a 121.5°C.

Exemplo 14: Síntese de HBC 500 (HA 500-730 kDa) processo B

[054] 125 g de sal de sódio de HA com um peso molecular de 500 730 kDa, produzido por fermentação são dispersos em 1.33 l de uma solução 0,25M de NaOH contendo 9,4 ml de BDDE. A mistura é aquecida a 45°C por 2.5 horas. A mix é hidratada durante a noite com uma solução de 6,2 l contendo uma quantidade estequiométrica de HCl, 26,5 g de NaCl e 27 g de cloridrato de lidocaína sob lenta agitação. Exemplo 15: preparação de gel ACP:HBC 500, na relação de 50:50 processo B

[055] 125 g de éster interno de ácido hialurônico ACP200 são solubilizados em uma solução de 2,5 l contendo 44 g de NaCl sob lenta agitação. Quando a hidratação está completa o gel é combinado com o gel obtido de acordo com o exemplo 14, em um mixer equipado com um sistema orbital dotado de brunidor e raspador. O gel obtido é extrusado por um filtro de membrana plana com uma velocidade de retenção de material particulada nominal de 45 μm. O produto assim obtido é introduzido em seringas de vidro e esterilizado em um ciclo com F0=13 a 121.5°C.

Exemplo 16: enchimento cutâneo e tolerabilidade de gel ACP:HBC no modelo intradérmico de administração a coelhos

[056] Este experimento foi realizado conforme descrito no Exemplo 10, usando-se um gel preparado como descrito nos exemplos 11-12 e comparando-o com o controle Belotero® e ainda com um segundo enchimento comercial, Regenyal Idea.

[057] Para este experimento, o Depositante não apenas determinou o volume de inchação de pele ocasionado pelo tratamento, mas também avaliou o tempo de residência total do gel/enchimento de acordo com invenção ocasionado pelo tratamento, em comparação dom dois enchimentos comerciais bem conhecidos que representam o elemento comparador final, pois ambos consistem em HA reticulado com BDDE.

[058] A inchação da pele nos coelhos tratados foi medida quinzenalmente (com observação macroscópica quanto a eventos adversos) por no máximo 96 dias.

Resultados:

[059] A figura 2 mostra os resultados obtidos: as descobertas descritas supra foram confirmadas ou seja, a hidratação imediata da derme tratada (principalmente nos primeiros 7 dias) até uma extensão surpreendentemente maior do que nos controles; além disso, a dimensão de inchação de pele ficou mais evidente e o tempo de residência maior do que aquele dos dois comparadores comerciais. No final do experimento, o enchimento inovador de acordo com invenção ainda se encontrava presente, enquanto os dois controles quase já tinham desaparecido.

[060] Os métodos descritos no presente podem, obviamente, ser modificados de vários modos. Essas modificações não devem ser consideradas fora do espírito e prospectos da invenção; sendo que, todas as modificações que se evidenciarão aos de prática comum na técnica estão incluídas no escopo das reivindicações apensas.

Claims

1. Biomateriais, caracterizados pelo fato de serem obteníveis através da mistura de: - derivado autorreticulado de ácido hialurônico (ACP) com - o derivado (HBC) de ácido hialurônico reticulado com éter diglicidílico de 1,4-butanodiol (BDDE), na razão em peso entre 10:90 e 90:10 como novos enchimentos e/ou como produtos de moldagem corporal.

2. Biomateriais de acordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo fato de que a razão em peso é de 90:10 a 50:50, como enchimentos de biorrevitalização.

3. Biomateriais de acordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo fato de que a razão em peso é de 10:90 a 50:50 com um efeito intensificador de volume.

4. Biomateriais de acordo com a reivindicação 3, caracterizados pelo fato de que a razão em peso é de 25:75.

5. Processo de misturar ACP com HBC, caracterizado pelo fato de que HBC é preparado por um processo compreendendo as seguintes etapas: a. dissolução em solução alcalina de diepóxido BDDE em uma razão estequiométrica de 2,5 a 25% em moles das unidades de repetição de ácido hialurônico, seguida por b. dispersão de ácido hialurônico (HÁ) na solução referida no parágrafo a) a temperatura ambiente; c. disparo da reação por ativação térmica da solução referida no parágrafo b) sendo aquecida a uma temperatura entre 35 e 55°C entre 2 e 36 horas; d. extrusão da massa obtida através de uma peneira de metal, a fim de reduzi-la a partículas com um tamanho de aproximadamente 600 μm; e. hidratação do gel obtido diluindo-o com água por um fator de 3 a 20; f. correção de pH para neutro com uma solução aquosa de HCl; g. precipitação com um solvente orgânico solúvel em água até que o produto seja obtido em forma de pó; h. lavagem com solventes orgânicos contendo água; i. secagem sob vácuo até que os solventes residuais sob 400 ppm tenham sido eliminados e seja obtido um pó de HBC; em que o processo de misturar compreende as seguintes etapas: j. mistura de pó de ACP com pó de HBC na razão de ACP:HBC entre 90:10 e 10:90; k. hidratação com solução salina ou tampão de fosfato, levando a uma concentração de HA total entre 12 e 27 mg/ml; l. extrusão a uma temperatura entre 25 e 65°C através de uma peneira com uma malha entre 50 e 500 μm; m. enchimento de seringa; n. esterilização a quente a partir de vapor saturado a uma temperatura entre 120 e 124°C por pelo menos 10 minutos.

6. Processo de misturar ACP com HBC, em que HBC é preparado por um processo compreendendo as seguintes etapas: a. dissolução em solução alcalina de diepóxido BDDE em uma razão estequiométrica de 2,5 a 25% em moles das unidades de repetição de ácido hialurônico, seguida por b. dispersão de HA na solução referida no parágrafo a), a temperatura ambiente; c. disparo da reação por ativação térmica da solução referida no parágrafo b) sendo aquecida a uma temperatura entre 35 e 55°C entre 2 e 36 horas; d. correção de pH para neutro com uma solução aquosa de HCl; e. hidratação do gel obtido diluindo-o com água por um fator de 3 a 20; em que o processo de misturar compreende as seguintes etapas: f. mistura de ACP em gel ou pó com HBC em forma de gel em uma razão de ACP:HBC entre 90:10 e 10:90; g. trituração e homogeneização passando através de um filtro com um coeficiente de retenção de matéria particulada entre 25 e 150 μm; h. enchimento de seringa; i. esterilização por calor com vapor saturado a uma temperatura entre 120 e 124°C por pelo menos 10 minutos.

7. Processo de acordo com a reivindicação 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que o HA usado para a preparação dos derivados de HBC e ACP possui um peso molecular médio entre 400 e 3 x 106 Da, preferivelmente entre 1 x 105 Da e 1 x 106 Da, e mais preferivelmente entre 200.000 e 1 x 106 Da.

8. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o solvente orgânico solúvel em água é selecionado dentre etanol, metanol, isopropanol, n-propanol, dioxano, acetonitrila, acetona e/ou misturas dos mesmos.

9. Biomateriais, caracterizados pelo fato de serem obtidos pelo processo como definido na reivindicação 6, em que a razão em peso de ACP:HBC é 25:75.

10. Biomateriais de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizados pelo fato de que o veículo é solução salina.

11. Biomateriais de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizados pelo fato de que contêm lidocaína.

12. Biomateriais de acordo com a reivindicação 9, caracteri-zados pelo fato de que contêm lidocaína, em que o veículo consiste em solução salina.

13. Uso dos biomateriais como definidos em qualquer uma das reivindicações precedentes, caracterizado pelo fato de que ser como novos enchimentos e/ou como novos produtos para moldagem corporal, no tratamento de imperfeições da pele, em dermatologia, em dermocosmetologia e/ou em cirurgia estética.