BR112015031026B1

BR112015031026B1 - método para reticulação de ácido hialurônico ou um dos seus sais ou outros polímeros biocompatíveis; método para preparação de um hidrogel injetável; hidrogel; kit e uso

Info

Publication number: BR112015031026B1
Application number: BR112015031026-5A
Authority: BR
Inventors: Bénédicte Vincente Tauzin
Original assignee: Anteis S.A.
Priority date: 2013-06-11
Filing date: 2014-06-10
Publication date: 2020-07-07
Also published as: AU2014280544A1; DK3007737T3; SG11201510103YA; EP3007737B1; CN105358186A; EP3007737A1; ES2647227T3; WO2014199022A1; US9782490B2; MX365329B; RU2015154035A; PL3007737T3; FR3006689A1; JP2016527338A; CA2914417A1; HK1221669A1; KR20160031465A; US20160144043A1; CA2914417C; RU2015154035A3

Abstract

RESUMO MÉTODO PARA RETICULAÇÃO DE ÁCIDO HIALURÔNICO OU UM DOS SEUS SAIS OU OUTROS POLÍMEROS BIOCOMPATÍVEIS; MÉTODO PARA PREPARAÇÃO DE UM HIDROGEL INJETÁVEL; HIDROGEL E SEU USO E KIT A presente invenção refere-se a um método para reticular ácido hialurônico, um método para preparar um hidrogel injetável, o hidrogel assim obtido e seu uso. 1/1

Description

[0001]O objetivo da presente invenção é: um método para a reticulação do ácido hialurônico, ou um dos seus sais, e, opcionalmente, outros polímeros biocompativeis; um método para a preparação de um hidrogel injetável obtido de acordo com o referido método de reticulação; um hidrogel obtido de acordo com o referido método de reticulação; e a utilização do hidrogel obtido de acordo com o referido método de reticulação nos campos da medicina e da estética.

[0002] O ácido hialurônico é um polissacarideo formado pela repetição de uma unidade de dissacarideo consistindo em ácido D-glucurônico e N-acetilglucosamina. A estrutura é linear e sem qualquer especificidade de espécie. O ácido hialurônico está amplamente distribuído em organismos vivos animais e humanos, nos quais ele cumpre muitas funções biológicas, tais como, por exemplo, o controle do nivel de hidratação ou a manutenção da viscoelasticidade de flúidos ou tecidos. Ele é encontrado particularmente em uma concentração elevada no liquido sinovial, no humor vitreo do olho, e na derme. Um ser humano de 70 quilos possui cerca de 15 gramas de ácido hialurônico, metade do qual está contida na pele, e este valor diminui com o envelhecimento.

[0003] Os géis de ácido hialurônico são conhecidos e têm sido utilizados em amplos campos da medicina e da estética por muitos anos. Estes géis, em particular, são geralmente inj etados: nos olhos, durante intervenções cirúrgicas oftalmológicas, a fim de manter o espaço intra-ocular e proteger os tecidos do olho ; nas articulações, no caso de artrose, para completar o liquido sinovial deficiente e restaurar temporariamente as propriedades condroprotetoras do referido liquido biológico; na pele, ou sob a mesma, a fim de preencher rugas ou aumentar o volume de certas áreas do rosto ou do corpo.

[0004] O ácido hialurônico possui uma meia-vida curta em organismos vivos (menos de 1 semana). No caso de muitas aplicações na estética e na medicina, o hidrogéis injetáveis administrados contêm ácido hialurônico estabilizado por reticulação, o que oferece a possibilidade de aumentar consideravelmente o tempo de vida (também chamado remanência) deste polissacarideo in vivo e, consequentemente, a duração da eficácia do produto injetado. Assim, por meio desta alteração por reticulação, um hidrogel à base de ácido hialurônico reticulado possui, por exemplo, a capacidade de preencher rugas durante um periodo de vários meses.

[0005] A fim de aumentar a remanência in vivo de um hidrogel injetável à base de ácido hialurônico, um especialista na técnica está ciente de que ele/ela pode aumentar o grau de reticulação do ácido hialurônico; mas esta modificação da molécula gera um aumento na viscosidade do gel e, por conseguinte, as dificuldades em extrudi-las através de uma agulha e, subsequentemente, injetar este gel na área desejada pelo médico. Isto necessariamente implica tanto em: limitar o grau de reticulação do ácido hialurônico e, por conseguinte, a remanência do gel ín vivo, com a finalidade de manter uma força de ejeção satisfatória, ou utilizar agulhas com um diâmetro maior, a fim de ser capaz de reduzir a força de ejeção necessária para extrudir o gel através desta agulha, o que gera uma dor maior para o paciente tratado e também maior trauma (equimoses, mancha vermelha, inflamação, edema, ... ) na área da injeção.

[0006] Muitas soluções foram propostas para superar este problema, os trabalhadores buscando fornecer formulações injetáveis possuindo remanência e propriedades de viscosidade adequadas e, por conseguinte, niveis satisfatórios para extrudir o gel através de uma agulha. Pode-se citar, por exemplo: as formulações à base de partículas de ácido hialurônico reticulado, obtidas pela desintegração do gel reticulado em partículas, geralmente por moagem; vários métodos de preparação têm sido descritos para a obtenção deste tipo de formulação, como é o caso do pedido de patente WO 97/04012; as formulações à base de ácido hialurônico reticulado contendo misturas de géis reticulados que não são reticulados uns com os outros, ou seja, não ligados uns aos outros por meio de ligações covalentes; estas formulações são obtidas de acordo com um método de preparação especifico descrito no pedido de patente FR 2 924 615; e as formulações à base de ácido hialurônico reticulado, que consistem em partículas de ácido hialurônico reticulado que são reticulados juntos com uma matriz de ácido hialurônico reticulado; estas formulações são preparadas de acordo com o pedido de patente EP 2 011 816 ou o pedido US 2010/0028435.

[0007] Estas soluções, contudo, não são totalmente satisfatórias.

[0008] O pedido de patente WO 97/04012 descreve um método de fabricação especifico que possibilita a obtenção de produtos à base de polissacarideos (que podem ser o ácido hialurônico) sob a forma de partículas. Géis de partículas à base de ácido hialurônico reticulado, também chamados de "géis bifásicos" na literatura, são caracterizados pela presença de partículas com um diâmetro compreendido entre cerca de 200 micrometres e mais de 1.000 micrometres, dispersos em uma solução de ácido hialurônico não reticulado que possibilita a facilitação da ejeção por um fenômeno de lubrificação. Estes géis não são totalmente satisfatórios na medida em que a extrusão do gel através de uma agulha é irregular, em particular com produtos que contêm partículas de grande diâmetro; em que a solução à base de ácido hialurônico não reticulado que atua no papel de um transportador é rapidamente reabsorvido in vivo, o que envolve uma perda pelo menos parcial do efeito desejado (destacadamente, uma perda de preenchimento nos dias seguintes à injeção, para os produtos que são dedicados a produzir volume); e, finalmente, em que o perfil de segurança do produto não é tão bom (isto é, um nivel maior de efeitos secundários) quanto com um gel à base de ácido hialurônico não contendo quaisquer partículas que possam promover a resposta a um corpo estranho e/ou gerar a migração destas partículas sob a ação mecânica da área tratada.

[0009] O pedido de patente WO 2005/085329 descreve um processo de fabricação especifico, que é caracterizado por uma etapa para iniciar a reticulação de uma quantidade determinada de pelo menos um polimero (que pode ser ácido hialurônico) e, em seguida, por acrescentar uma quantidade adicional de polimero (que pode ser ácido hialurônico) com uma massa molecular de mais de 500.000 Da em solução à diluição da mistura da reação, de modo a diminuir a concentração geral do polimero na solução enquanto a reação de reticulação continua. Esta solução não possibilita uma reticulação eficaz do ácido hialurônico. Com efeito, o acréscimo de uma quantidade adicional do polimero é acompanhado pela diluição e, consquentemente, uma diminuição da concentração de ácido hialurônico na mistura da reação. A probabilidade de um encontro entre as cadeias de ácido hialurônico e o agente de reticulação é, portanto, reduzida, e a reação de reticulação não é muito eficaz.

[0010] O pedido de patente FR 2 924 615 descreve um método de fabricação caracterizado pela mistura homogênea de x polímeros (que podem ser o ácido hialurônico), idênticos ou diferentes, reticulados antes da sua mistura. Por mistura entende-se uma justaposição de x polímeros sem gerar ligações covalentes entre eles. Esta solução não é completamente satisfatória, uma vez que os polímeros não são ligados uns aos outros e, por conseguinte, o gel assim obtido pode ser dissociado no interior da zona injetada, destacadamente sob a ação da tensão mecânica, que pode ser altamente significativa no mesmo. Pode-se mencionar, por exemplo, o caso de um produto injetado nos lábios com a finalidade de gerar volume; os lábios estando sujeitos a fortes tensões mecânicas. A ação mecânica sofrida pode gerar a migração do gel implantado e, portanto, efeitos secundários na área tratada e também em torno dela.

[0011] O pedido de patente EP 2 011 816 refere-se a géis injetáveis de polissacarídeos (que podem ser o ácido hialurônico) que compreendem pelo menos um primeiro gel de polissacarídeo fortemente reticulado e sob a forma de partículas, e pelo menos um gel de polissacarídeo fracamente reticulado formando uma matriz; o referido pelo menos um primeiro gel sendo ligado através de ligações covalentes com o referido pelo menos um segundo gel. Ao contrário dos produtos do pedido de patente WO 97/04012, as partículas reticuladas são fortemente ligadas à matriz do polissacarídeo fracamente reticulado; a migração das partículas é, portanto, fortemente limitada com esta solução a curto e/ou médio prazo, mas não a longo prazo (liberação de partículas fortemente reticuladas, com a possibilidade de migração, após o polissacarídeo fracamente reticulado ter sido reabsorvido para o tecido). Uma vez que esta solução compreende partículas de polissacarideos, que estão fortemente reticuladas, o risco de uma resposta a um corpo estranho é, portanto, significativo por causa da natureza em partículas do produto e do elevado grau de reticulação destas partículas (o ácido hialurônico é, portanto, significativamente modificado, promovendo assim o não reconhecimento da molécula pelo organismo).

[0012] O pedido de patente US 2010/0028435 divulga um método para a preparação de formulações à base de ácido hialurônico reticulado, que são feitas de partículas de ácido hialurônico reticulado que são co-reticuladas a uma matriz de ácido hialurônico reticulado. Assim, os mesmos comentários feitos acima para o pedido de patente EP 2 011 816 são aplicáveis mutatís mutandis.

[0013] A presente invenção possibilita a resolução destes diferentes inconvenientes, propondo um novo método para a reticulação do ácido hialurônico, ou um dos seus sais, ou, opcionalmente, outros polímeros biocompativeis, tal método possibilitando a obtenção de um hidrogel que é particularmente caracterizado por: uma boa capacidade de ser extrudido através de agulhas e, portanto, capaz de ser facilmente injetado por um profissional na área a ser tratada, sem que isso implique em dores e trauma significativo para o paciente; não haver conversão de uma ou mais fases constituintes do hidrogel em partículas durante o processo de reticulação (mas apresentando baixas forças de injeção, apesar da ausência de partículas que, geralmente, reduzem a força de injeção); não haver partículas co-reticuladas no produto, ocasionando uma melhora significativa do perfil de segurança (menos efeitos colaterais e complicações a curto e/ou médio/longo prazo), uma maior capacidade de integração/implantação do hidrogel no tecido (distribuição mais uniforme do produto no tecido), e também um método de produção significativamente mais curto e menos complexo (porque a produção não envolve etapas tediosas de moagem); notáveis propriedades visco-elásticas decorrentes da estrutura especifica do hidrogel obtido, que possibilitam propor ao profissional um produto com determinadas propriedades mecânicas/reológicas para atender seus/suas expectativas no tratamento da área desejada, enquanto observa sua anatomia, os mecanismos fisiológicos que a governam e, se for o caso, as propriedades mecânicas/reológicas necessárias que lhe permitirão corrigir a deficiência verificada; uma capacidade de ser implantado de modo simples nos tecidos da área a ser tratada, por causa da estrutura especifica "multiestruturada" (e sem partículas co- reticuladas) do hidrogel obtido; a segurança reforçada do hidrogel obtido, por causa de uma melhor capacidade de não se dissociar dentro da área tratada e, por conseguinte, não migrar para outras áreas vizinhas ou mais remotas, em particular sob a ação de esforços mecânicos; uma complexa estrutura de matriz do hidrogel obtido, a qual é caracterizada como sendo "multiestruturada", permitindo assim a otimização da liberação controlada das substâncias ativas e/ou biológicas, quando aplicável; a remanência otimizada do hidrogel obtido, a fim de prolongar a eficácia do tratamento terapêutico ou estético, possibilitando assim limitar o número de administrações por procedimento médico ou cirúrgico.

[0014] Para este fim, o objetivo da invenção é um novo método para a reticulação do ácido hialurônico, ou um dos seus sais, e, opcionalmente, outros polímeros biocompativeis, compreendendo pelo menos as etapas de: a) preparar uma primeira fase aquosa de ácido hialurônico e, opcionalmente, de outros polímeros biocompativeis, parcialmente reticulada, caracterizada por: • adicionar o ácido hialurônico ou um dos seus sais e, opcionalmente, outros polímeros biocompativeis, em uma solução aquosa, a fim de obter uma concentração Cl de ácido hialurônico, • adicionar uma quantidade Q1 de agente de reticulação, • obter a reticulação parcial do ácido hialurônico, controlando a temperatura TI e a duração tl da reação de reticulação, em que a primeira fase aquosa de ácido hialurônico parcialmente reticulado preparada geralmente não é convertida em partículas; b) preparar pelo menos uma segunda fase aquosa de ácido hialurônico e, opcionalmente, de outros polímeros biocompativeis, parcialmente reticulada, caracterizada por: • adicionar o ácido hialurônico ou um dos seus sais e, opcionalmente, outros polímeros biocompativeis, em uma solução aquosa, a fim de obter uma concentração C2 de ácido hialurônico, • adicionar uma quantidade Q2 de agente de reticulação, • obter a reticulação parcial do ácido hialurônico por meio do controle da temperatura T2 e da duração t2 da reação de reticulação, em que a pelo menos uma segunda fase aquosa de ácido hialurônico parcialmente reticulado preparada geralmente não é convertida em partículas; c) adicionar a pelo menos uma segunda fase de ácido hialurônico parcialmente reticulado à primeira fase e, em seguida, realizar a mistura das referidas pelo menos duas fases, opcionalmente, por meio da adição de uma quantidade adicional do agente de reticulação Qm; d) continuar a reticulação da mistura previamente feita, por meio do controle da temperatura Tm e da duração tm da reação de reticulação.

[0015] A reação de reticulação da mistura é então interrompida, idealmente por diluição com uma solução aquosa e/ou pela remoção do agente de reticulação não reagido mediante a realização de purificação.

[0016] O método de reticulação de acordo com a invenção consiste, portanto, em misturar durante a reticulação pelo menos as duas fases aquosas de ácido hialurônico e, opcionalmente, de outros polímeros biocompativeis, que já tenham sido parcialmente reticuladas, e, em seguida, continuar a reação de reticulação a fim de se ligar às referidas pelo menos duas fases através de ligações covalentes.

[0017] Por "parcialmente reticulado"entende-se o fato de que as referidas pelo menos 2 fases aquosas de ácido hialurônico, opcionalmente contendo outros polímeros biocompativeis, ainda possuem locais de reação disponíveis nas cadeias poliméricas que podem reagir com um agente de reticulação para reticular/ligar (bridging) novas cadeias de ácido hialurônico e/ou de outros polímeros biocompativeis.

[0018] É importante especificar que o método de reticulação de acordo com a invenção não envolve a preparação e/ou adição de partículas reticuladas de ácido hialurônico, ou de um dos seus sais, ou de qualquer outro polimero, durante as etapas do referido método de reticulação, ou seja, durante as etapas a, b, c e d, como descrito acima. Todas as fases parcialmente reticuladas não são em momento algum convertidas em partículas durante o referido método de reticulação através de, por exemplo, moagem. O método de reticulação de acordo com a invenção, portanto, não oferece a possibilidade de se ter partículas reticuladas sendo reticuladas juntas com um gel de ácido hialurônico.

[0019] De acordo com uma forma de realização da invenção, a segunda fase aquosa de ácido hialurônico parcialmente reticulada possui um maior grau de reticulação parcial do que o da primeira fase aquosa de ácido hialurônico parcialmente reticulada. Esta particularidade confere a possibilidade de facilitar a mistura da segunda fase mais fortemente reticulada dentro da primeira fase.

[0020] Por "grau de reticulação parcial"entende-se o nivel de reticulação da fase imediatamente antes da sua mistura com outra fase; o nivel de reticulação é apenas parcial, uma vez que irá continuar a se desenvolver com a continuação da reticulação durante a mistura das fases. Este nivel de reticulação pode ser determinado para cada fase relevante medindo-se experimentalmente o grau de reticulação e comparando-o com o grau máximo teórico de reticulação (que pode ser calculado através da avaliação da relação entre o número de moles do agente de reticulação introduzido e do número de moles das unidades de polimero que possuem a capacidade de reticulação). O grau de reticulação pode ser experimentalmente avaliado, quer indiretamente (por exemplo, através da medição da força de ejeção, ver exemplo 2) ou diretamente (por exemplo, por espectrometria de ressonância magnética nuclear (RMN), por exemplo, utilizando o método descrito por Kenne et al. (Kenne et al., Modification and cross-linking parameters in hyaluronic acid hydrogels definitions and analytical methods, Carbohyr. Polym. 2013, 91:410-418) .

[0021] Assim, em geral, o "grau de reticulação parcial"da fase parcialmente reticulada é inferior a 90% (do máximo do grau de reticulação calculado teoricamente), ou inferior a 70%, ou ainda inferior a 50%, ou ainda inferior a 30%, ou ainda inferior a 10%.

[0022] De acordo com uma forma de realização da invenção, a concentração C2 de ácido hialurônico é maior ou igual à concentração Cl. Esta particularidade confere a possibilidade de facilitar a mistura da segunda fase mais fortemente concentrada dentro da primeira fase, mas também de se obter um maior inchaço da segunda fase dentro da primeira fase (o ácido hialurônico possuido a capacidade de inchar em água, e ainda mais por sua concentração ser significativa) . Isto, em seguida, confere a possibilidade de promover a máxima "incorporação" estérica pelo entrelaçamento das cadeias de polimero da segunda fase no interior do primeira, mas também promove a reação de reticulação que irá se ligar as cadeias de polimero da primeira e da segunda fases, por causa da maior proximidade fisica destas cadeias e, por conseguinte, uma melhor eficiência da reação para ligar estas cadeias.

[0023] De acordo com uma forma de realização da invenção, a quantidade de agente de reticulação Q2 é maior ou igual à quantia Ql, de modo a obter um grau de reticulação parcial maior para a segunda fase do que para a primeira fase.

[0024] De acordo com uma forma de realização da invenção, a temperatura T2 de reticulação é maior ou igual à temperatura Tl, de modo a se obter um maior grau de reticulação parcial para a segunda fase do que para a primeira. A temperatura de reticulação Tm, em si, é maior que T2, de modo a maximizar a eficiência da reação de reticulação, permitindo que as primeira e segunda fases sejam ligadas através de ligações covalentes.

[0025] De acordo com uma forma de realização da invenção, a duração de reticulação t2 é maior ou igual à duração tl, de modo a se obter um maior grau de reticulação parcial para a segunda fase do que para a primeira. A duração de reticulação tm, em si, pode ser maior, igual, ou ainda menor do que as durações tl e t2. Esta duração tm depende da temperatura selecionada Tm para a realização da mistura de reticulação das referidas pelo menos duas fases.

[0026] Durante a preparação da mistura, as massas da primeira e da segunda fases podem ser iguais ou diferentes. Dependendo das propriedades que se deseja dar ao hidrogel obtido, de acordo com a presente invenção, durante a mistura, a presença de uma fase deve ser promovida apropriadamente em relação à outra e, por conseguinte, uma massa maior desta fase deve ser utilizada, em relação à outra. Assim, pode-se afirmar que, do ponto de vista mecânico/reológico, a fase que possui o maior grau de reticulação confere ao gel de acordo com a invenção propriedades dominantes de elasticidade e remanência no que diz respeito à fase que possui um menor grau de reticulação. Por outro lado, a fase que possui o menor grau de reticulação oferece uma força de ejeção menor para esta fase e, portanto, maior facilidade do produto em ser injetado. Com o hidrogel de acordo com a invenção, observa-se, por conseguinte, a sinergia nas propriedades resultantes em termos de características mecânicas/reológicas, de remanência e de injetabilidade. Esta sinergia é obtida devido à otimização dos dois parâmetros que atuam mutuamente um no outro: o baixo grau de reticulação de uma das fases promove uma melhor injetabilidade, bem como a coesão e a flexibilidade global do hidrogel, e reduz a remanência e a elasticidade, enquanto que o forte grau de reticulação da outra fase promove a remanência, uma natureza viscoelástica ainda mais pronunciada em favor da elasticidade, e reduz ao contrário a injetabilidade, a coesão e a flexibilidade. Por conseguinte, esta sinergia oferece a possibilidade de combinar as vantagens de cada uma das diferentes fases constitutivas, minimizando os seus inconvenientes, ao mesmo tempo evitando as desvantagens descritas anteriormente com as composições que possuem partículas de polímero reticuladas. A otimização das proporções de cada fase reticulada dentro do hidrogel, portanto, oferece a possibilidade de obtenção de um produto facilmente injetável com o qual é possível satisfazer as diferentes necessidades expressas para o tratamento na estética ou na medicina em termos de injetabilidade, propriedades mecânicas/reológicas, e remanência.

[0027] De acordo com uma forma de realização da invenção, a reticulação da mistura das diferentes fases parcialmente reticuladas é interrompida pela obtenção da purificação a fim de remover o agente de reticulação residual que não reagiu. Esta purificação é realizada de acordo com técnicas bem conhecidas a um perito na arte, tais como, por exemplo, com um banho de diálise ou por lavagem com um fluxo de água continuo. De preferência, a purificação por diálise é selecionada utilizando-se uma solução iso-osmolar e que possua um pH adequado. No final da reação de reticulação da mistura das diferentes fases parcialmente reticuladas e antes da etapa de purificação do gel, pode ser vantajoso neutralizar o gel obtido, de acordo com os métodos convencionais conhecidos no campo, por exemplo pela adição de um ácido quando a reticulação foi realizada em um meio básico, ou por adição de uma base quando a reticulação foi realizada em um meio ácido.

[0028] A invenção lida com a reticulação de ácido hialurônico ou de um dos seus sais, e, em particular, os seus sais fisiologicamente aceitáveis, tais como sódio, cálcio, zinco, sais de potássio, idealmente sal de sódio. O ácido hialurônico pode ser de origem animal ou obtido por fermentação bacteriana. Ele pode ter uma massa molecular de alguns Da até vários milhões Da, idealmente cerca de 0,1 a 4 milhões Da.

[0029] A invenção diz também respeito à reticulação de outros polímeros biocompativeis, em combinação com o ácido hialurônico. Estes polímeros, de origem natural ou sintética, devem ter funções químicas que lhes permita reticular, e devem ser biocompativeis, a fim de que possam ser postos em contato com fluidos ou tecidos biológicos. Pode-se mencionar, por exemplo, a familia de polissacarldeos, poliésteres, polianidridos, polifosfazenos, poli-s-caprolactona, ácidos poliláctico e seus derivados, ácidos de polivinilo, poliacrilamidas, N-vinil pirrolidona e os polímeros acrílicos e derivados biologicamente aceitáveis.

[0030] As reações de reticulação são realizadas em soluções aquosas em meio ácido ou básico, idealmente em um meio básico de preferência, entre 8 e 13. Os valores de pH das soluções podem ser idênticos ou diferentes.

[0031] Os agentes de reticulação que estão envolvidos nas várias reações de reticulação podem ser idênticos ou diferentes. Eles são, geralmente, agentes de reticulação bi- ou poli-funcionais de diferentes tipos e podem, por exemplo, ser selecionados a partir de divinilsulfona, epóxis bi- ou poli-funcionais, carbodiimidas e formaldeidos. São preferivelmente selecionados os agentes da familia de epóxis bi- ou poli-funcionais, nomeadamente éter diglicidilico de 1,4-butanodiol (BODE), diepoxi-octano ou 1,2-bis-(2,3- epoxipropil)-2,3-etileno. A utilização de BODE é mais particularmente preferida para cada uma das reações de reticulação a ser realizada.

[0032] As temperaturas de reticulação estão geralmente compreendidas entre cerca de 15°C e 60°C. Elas são, idealmente, inferiores a 35°C durante a reticulação das fases parcialmente reticuladas e superior a 45°C durante a reticulação da mistura de diferentes fases parcialmente reticuladas.

[0033] As durações de reticulação são, geralmente, de várias horas, idealmente superiores a 1 hora até cerca de 12 horas.

[0034] A reticulação da mistura das diferentes fases parcialmente reticuladas é preferencialmente realizada com 2 fases, mas também pode ser realizada com mais de 2 fases com diferentes graus de reticulação parciais.

[0035] As proporções em peso de cada fase parcialmente reticulada na mistura a ser reticulada podem variar fortemente, destacavelmente em função da composição exata selecionada, dos graus de reticulação parciais das diferentes fases relevantes, e das propriedades finais desejadas. Geralmente, na mistura, a proporção de peso da fase que possui o maior grau de reticulação parcial está compreendido entre cerca de 0,1 e 99, 9%, ou ainda entre cerca de 5 e 95%, ou ainda entre 10 e 90%, ou ainda entre 20 e 80%, ou ainda entre 30 e 70%, ou ainda entre 40 e 60%, ou ainda entre 45 e 55% da massa total das diferentes fases da mistura.

[0036] O método de reticulação de acordo com a invenção é diferente dos descritos na técnica anterior. Nenhum destes métodos envolve a reticulação consistindo em misturar, durante a reticulação, pelo menos 2 fases aquosas de ácido hialurônico e, opcionalmente, de outros polímeros biocompativeis, que já foram parcialmente reticulados, e, em seguida, continuar a reação de reticulação a fim de ligar as referidas pelo menos 2 fases através ligações covalentes, sem a preparação e/ou adição de artigos de ácido hialurônico reticulado, ou de um sal deste, ou de qualquer outro polímero, nas etapas do referido método de reticulação.

[0037] Os documentos relevantes da técnica anterior considerados como sendo os mais próximos à presente invenção são os seguintes: O pedido de patente WO 97/04012 descreve um método de reticulação especifico para um polissacarideo que pode ser o ácido hialurônico; um método que compreende as etapas de: • colocar o polissacarideo em uma solução aquosa, • iniciar a reação de reticulação através da adição de um agente de reticulação, • introduzir condições estéricas desfavoráveis para a reação de reticulação, tais condições possuindo, preferencialmente, uma diluição da mistura de reação durante a reticulação, e • reintroduzir condições estereoquimicas favoráveis para a reação de reticulação, tais condições possuindo, preferencialmente, uma concentração da mistura de reação por evaporação a fim de completar a reação de reticulação.

[0038] Diferente da presente invenção, este pedido de patente não envolve a mistura de diferentes fases de ácido hialurônico parcialmente reticulado durante a reticulação. Por outro lado, a presente invenção não é caracterizada por proporcionar condições estéricas desfavoráveis (tal como uma diluição) e, em seguida, condições estéricas favoráveis (tais como uma evaporação) durante a reação de reticulação: a reticulação, de acordo com a invenção, é realizada sob condições favoráveis, de modo a otimizar o rendimento. O pedido de patente WO 2005/085329 descreve um método de reticulação especifico, que é caracterizado por: • uma etapa para iniciar a reticulação de uma quantidade determinada de pelo menos um polimero, e • acrescentar uma quantidade adicional de polimero com uma massa molecular de mais de 500.000 Da em solução, com diluição da mistura de reação, de modo a diminuir a concentração global do polimero na solução, enquanto a reação de reticulação continua.

[0039] Diferente da presente invenção, este pedido de patente não envolve a mistura de diferentes fases de ácido hialurônico parcialmente reticulado durante a reticulação.

[0040] Este pedido de patente envolve a adição de um polimero durante a reação de reticulação, mas tal polimero não tendo sido sujeito a reticulação preliminar seja parcial ou total. Por outro lado, diferente da presente invenção, esta adição de polimero é necessariamente acompanhada pela diluição da mistura de reação, o que tem como consequência proporcionar condições esféricas desfavoráveis e, por conseguinte, uma continuação não muito eficaz da reação de reticulação. O pedido de patente FR 2 924 615 descreve um método para a preparação de um hidrogel caracterizado pela mistura homogênea de x polímeros, idênticos ou diferentes, reticulados antes da sua mistura.

[0041] Diferente da presente invenção, esta aplicação não envolve a mistura de diferentes fases de ácido hialurônico parcialmente reticulado durante a reticulação.

[0042] Os x polímeros, previamente reticulados e cuja reação de reticulação foi interrompida para cada um deles, são misturados a fim de obter uma simples justaposição destes x polímeros sem gerar ligações covalentes: não há reticulação entre estes diferentes polímeros. 0 pedido de patente EP 2 011 816 descreve um método para a preparação de um hidrogel compreendendo as etapas de: • preparação de partículas de um primeiro polissacarideo fortemente reticulado de acordo com técnicas de moagem conhecidas por um especialista na técnica, a fim de se obter partículas com um tamanho de grão desejado, • suspensão destas partículas, • adição de pelo menos um segundo polissacarideo, e • reticulação do referido pelo menos um segundo polissacarideo até um grau de reticulação X2 para a obtenção de pelo menos um segundo polissacarideo fracamente reticulado, e reticulação do referido pelo menos um segundo polissacarideo fracamente reticulado com as referidas partículas.

[0043] Diferente deste pedido de patente, a presente invenção não envolve a utilização de partículas reticuladas (preparação e/ou adição na mistura de reação) durante a reticulação. Destacadamente, não há uma etapa de moagem permitindo a preparação das partículas de ácido hialurônico reticulado durante o método de reticulação da presente invenção para: • as fases parcialmente reticuladas, antes de misturar essas fases para continuar a reticulação, e • misturar as fases parcialmente reticuladas, durante a continuação da reticulação. 0 pedido de patente US 2010/0028435 descreve um método para a preparação de um gel injetável semelhante ao do pedido de patente EP 2 011 816.

[0044] 0 gel do pedido de patente US 2010/0028435 é obtido através da realização da reticulação mútua das partículas reticuladas de ácido hialurônico com um gel de ácido hialurônico.

[0045] Diferente deste pedido de patente (mas também diferente do pedido de patente EP 2 011 816), o método de reticulação de acordo com a invenção não envolve qualquer preparação e/ou adição de partículas reticuladas de ácido hialurônico, ou de um dos seus sais, ou de qualquer outro polímero, durante as etapas do referido método de reticulação. O método de reticulação de acordo com a invenção, por conseguinte, não permite a reticulação mútua das partículas reticuladas com um gel de ácido hialurônico.

[0046] A invenção também se refere a um método para a preparação de um hidrogel injetável formado por ácido hialurônico ou um dos seus sais, e, opcionalmente, outros polímeros biocompativeis, reticulado de acordo com o método de reticulação descrito anteriormente. Este método de preparação é caracterizado por compreender pelo menos as seguintes etapas sucessivas: reticulação do ácido hialurônico, ou um dos seus sais, e, opcionalmente, outros polímeros biocompativeis, de acordo com o método de reticulação descrito anteriormente, purificação da mistura por meio de uma solução iso- osmolar, tendo um pH apropriado, homogeneização da mistura com, opcionalmente, a adição de um ou vários outros polímeros biocompativeis e/ou de uma ou várias substâncias que possa proporcionar um beneficio para o organismo, como substâncias ativas, de desgaseificação opcional e/ou liofilização, condicionamento em uma seringa ou frasco ou qualquer outro recipiente hermético, e esterilização.

[0047] Idealmente, o hidrogel injetável de acordo com a invenção é condicionado em seringas, e, em seguida, é esterilizado de acordo com qualquer meio conhecido per se, e, preferencialmente, por tratamento em autoclave, para utilização direta e/ou para comercialização.

[0048] A invenção também se refere a um hidrogel obtido de acordo com o método de reticulação descrito anteriormente. Este hidrogel é constituído, pelo menos, por ácido hialurônico reticulado, ou um dos seus sais, e, opcionalmente, outros polímeros biocompativeis, caracterizado por uma mistura de várias fases de ácido hialurônico reticulado possuindo 5 diferentes graus de reticulação, as referidas fases sendo ligadas umas às outras através de ligações covalentes. O hidrogel obtido pelo método de reticulação de acordo com a invenção pode, portanto, ser caracterizada como sendo composta por uma única fase reticulada "multiestruturada" sem partículas co-reticuladas.

[0049] De acordo com um aspecto da invenção, o hidrogel pode ter base em um derivado de ácido hialurônico, ou seja, com base na molécula obtida pela modificação por uma via quimica, ou qualquer outra via, da molécula de ácido hialurônico.

[0050] O hidrogel de acordo com a invenção possui uma boa capacidade de ser extrudido através de agulhas e, portanto, de ser facilmente injetado por um profissional na área a ser tratada sem que isso envolva dor e trauma significativos para o paciente. Esta vantagem resulta da matriz de complexo "multiestruturada" resultante do método de reticulação de acordo com a invenção, o que possibilita a promoção de uma melhor injetabilidade devido à lubrificação induzida pela presença no interior do produto de uma fase que possui um menor grau de reticulação.

[0051] O hidrogel de acordo com a invenção não inclui e nem é composto por partículas co-reticuladas. Isto oferece a vantagem de um perfil de segurança significativamente melhorado em comparação com produtos contendo partículas (menos efeitos secundários e complicações a curto e/ou médio/longo prazo) e uma maior capacidade de integração/implantação do hidrogel no tecido (distribuição mais uniforme do produto no tecido).

[0052] Devido à sua característica "multiestruturada", o hidrogel de acordo com a invenção possui notáveis propriedades mecânicas/reológicas de viscoelasticidade (isto é, de viscosidade e elasticidade). A presença dentro do hidrogel de acordo com a invenção de pelo menos 2 fases em proporções iguais ou diferentes, e com diferentes graus de reticulação, possibilita satisfazer idealmente as necessidades dos profissionais para tratar a área desejada, enquanto observando a sua anatomia, os mecanismos fisiológicos que a governam, e, se aplicável, as propriedades mecânicas/reológicas necessárias que lhe permitirão corrigir a deficiência verificada (por exemplo, uma forte elasticidade para gerar o volume em torno de uma maçã do rosto).

[0053] O hidrogel de acordo com a invenção possui uma boa capacidade de ser "bio-implantado" em tecidos. A sua matriz "multiestruturada" proporciona uma grande flexibilidade que permite a infiltração otimizada do produto para dentro dos tecidos, permitindo assim limitar o trauma pós-injeção e, portanto, limitando os efeitos colaterais, como a dor na área injetada, bem como a reação inflamatória após qualquer inj eção.

[0054] A estrutura especifica do hidrogel, caracterizada pelo fato das diferentes fases serem ligadas umas às outras através de ligações covalentes, também permite o reforço da segurança do implante administrado ao melhorar a capacidade de não dissociação do produto e, por conseguinte, de migrar em direção a outras áreas vizinhas ou mais remotas, destacadamente sob a ação de esforços mecânicos da área tratada.

[0055] A matriz "multiestruturada" do hidrogel também oferece a possibilidade de possuir fases com um elevado grau de reticulação ao mesmo tempo preservando um produto injetável, o que induz a uma melhor remanência do hidrogel e, por conseguinte, a uma extensão da eficiência do tratamento estético ou terapêutico, mas limitando ainda o número de administrações por procedimento médico ou cirúrgico.

[0056] O elevado nivel de segurança do implante da presente invenção, juntamente com a sua estrutura complexa especifica, destacadamente fornecendo-lhe propriedades mecânicas/reológicas e de bio-integração que podem ser adaptadas e otimizadas, dependendo da área a ser tratada, faz com ela que seja um produto preferido para a liberação controlada e/ou retardada de uma ou várias substâncias que possam proporcionar um beneficio para o organismo, e particularmente para substâncias ativas e/ou entidades biológicas tais como células, plaquetas enriquecidas, genes, fragmentos de DNA ou fatores de crescimento. A presença de diferentes fases no interior do produto, tais fases com diferentes graus de reticulação, mas também com diferentes concentrações do polimero, possibilitam a liberação de cada uma destas substâncias em tempos diferentes e, portanto, otimizam a relargagem e o perfil de ação de um ou vários ingredientes ativos ou compostos de origem biológica para tratamentos locais ou gerais.

[0057] O hidrogel de acordo com a invenção é idealmente implantado por injeção nos tecidos e/ou fluidos de organismos humanos ou animais vivos.

[0058] O hidrogel de acordo com a invenção também pode ser utilizado em uma forma não-injetável. Neste caso, o profissional implanta o produto estéril da presente invenção depositando-o na área a ser tratada por meio de instrumentos médicos e/ou cirúrgicos adequados.

[0059] O hidrogel de acordo com a invenção também podem ser utilizado em composições para uso tópico, de acordo com uma formulação adequada, por exemplo, sobre a pele, os cabelos, as unhas, a córnea do olho, os dentes, os lábios, as mucosas internas ou externas feridas. Neste caso, ele pode conter todos os compostos que podem fornecer um ou vários benefícios para a área a ser tratada, tais como, por exemplo, vitaminas, antioxidantes, moléculas hidratantes, proteínas, substâncias ativas, possuindo ou não uma ação farmacológica, entidades biológicas tais como células, plaquetas enriquecidas, genes, fragmentos de DNA ou fatores de crescimento, agentes corantes, pigmentos, moléculas odoríferas ou moléculas aromáticas. Estes compostos podem ser dispersos no hidrogel, ou enxertados para um ou vários dos polímeros do hidrogel, ou estar contidos/encapsulados em outro material que esteja disperso dentro do hidrogel.

[0060] De acordo com um aspecto da invenção, a concentração total de ácido hialurônico ou de um dos seus sais no hidrogel está compreendida entre 0,01 e 50 mg/ml, de preferência entre 1 e 35 mg/ml, e idealmente entre 8 e 30 mg/ml .

[0061] De acordo com um aspecto da invenção, o hidrogel de acordo com a invenção é parcial ou totalmente liofilizado a fim de se obter um semi-sólido ou um pó.

[0062] De acordo com um aspecto da invenção, o hidrogel de acordo com a invenção contém uma ou várias substâncias ativas de origem natural ou sintética, possuindo ou não uma ação farmacológica, tais como, por exemplo, antioxidantes, anti- inflamatórios, anti-sépticos, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, agentes anticancerigenos, anestésicos locais, proteínas, hormônios, seja isoladamente ou em conjunto. Estas substâncias ativas podem estar dispersas no hidrogel, ou enxertadas em um ou vários polímeros de hidrogel, ou contidas/encapsuladas em outro material que esteja disperso dentro do hidrogel. No último caso, como um exemplo, pode-se mencionar a encapsulação de uma substância ativa, tal como um anti-inflamatório, em microesferas com base em um polímero derivado do ácido poliláctico ou poli-s-caprolactona.

[0063] De acordo com um aspecto da invenção, o hidrogel de acordo com a invenção contém lidocaina dispersa dentro de sua matriz reticulada.

[0064] De acordo com um aspecto da invenção, o hidrogel de acordo com a invenção contém um ou vários compostos de origem biológica, tais como células, plaquetas enriquecido, genes, fragmentos de DNA ou fatores de crescimento. Estes compostos são preferencialmente dispersos no hidrogel, mas também podem ser enxertados em um ou vários dos polímeros do hidrogel, ou contidos/encapsulados em outro material que esteja disperso dentro do hidrogel.

[0065] De acordo com um aspecto da invenção, o hidrogel de acordo com a invenção contém polímeros que se encontram dispersos no interior da matriz reticulada do hidrogel. Pode-se mencionar, por exemplo, os polímeros da familia de polissacarideos, poliésteres, polianidridos, polifosfazenos, poli-s-caprolactona, ácidos polilácticos e seus derivados, ácidos de polivinilo, poliacrilamidas, N-vinil pirrolidona e os polímeros acrílicos e derivados biologicamente aceitáveis.

[0066] De acordo com um aspecto da invenção, o hidrogel de acordo com a invenção contém substâncias minerais que estão dispersas dentro da matriz reticulada do hidrogel. Pode-se mencionar, por exemplo, a hidroxiapatita ou fosfatos de tricálcio como o p fosfato de tricálcio.

[0067] De acordo com um aspecto da invenção, o hidrogel de acordo com o invento é misturado com uma ou várias outras substâncias, preferencialmente estéreis, que podem fornecer um benefício para o organismo, imediatamente antes da sua administração a um paciente. A mistura é então realizada pelo utilizador final, ou seja, por um médico ou por pessoal autorizado, de acordo com um método adequado, utilizando um ou vários dispositivos de mistura que possibilitem produzir uma mistura satisfatória e reter a esterilidade, se necessário. Por exemplo, pode-se mencionar a mistura pelo utilizador final do hidrogel de acordo com a invenção e de um ou vários compostos como substâncias ativas, entidades biológicas ou substâncias minerais: através da realização de percursos cíclicos entre dois recipientes (um cheio com o hidrogel de acordo com a invenção e o outro cheio com o composto a ser disperso no hidrogel), tais recipientes podendo ser, por exemplo, seringas, e extrudindo simultaneamente o conteúdo de ambos os recipientes (um cheio com o hidrogel de acordo com a invenção e o outro cheio com o composto a ser disperso no hidrogel), a fim de reunir os diferentes compostos e/ou misturá-los em outro recipiente antes da administração para o paciente.

[0068] A invenção também se relaciona com a utilização do hidrogel obtido de acordo com o método de reticulação descrito anteriormente para aplicações terapêuticas ou estéticas.

[0069] As vantagens proporcionadas pela presente invenção tornam possível a utilização do hidrogel obtido de acordo com o método de reticulação descrito anteriormente em muitas aplicações na estética e na medicina e, em particular, para as já amplamente descritas na literatura para o ácido hialurônico (ver, por exemplo, Volpi et al., Curr. Med. Chem. 2009, 16:1718-1745) .

[0070] O hidrogel de acordo com a invenção é, por conseguinte, utilizado para aplicações terapêuticas ou estéticas em seres humanos ou em animais. Ele é idealmente implantado no organismo do paciente por injeção, mas também pode ser implantado sob forma não-injetável, e, neste caso, ele é depositado na área a ser tratada por um profissional, por meio dos instrumentos médicos e/ou cirúrgicos apropriados. Por fim, ele pode ser utilizado através de aplicação tópica.

[0071] O hidrogel de acordo com a invenção é particularmente utilizado para: preencher volumes, gerar espaços dentro de certos tecidos, promovendo assim seu funcionamento ideal, substituir liquidos fisiológicos ou tecidos deficientes, estimular ou promover a regeneração de tecidos, hidratar e proteger tecidos, e entregar substâncias que possam fornecer um beneficio para o organismo e, destacadamente, susbtâncias ativas e/ou entidades biológicas.

[0072] Como um exemplo, pode ser feita menção dos usos do hidrogel nos seguintes casos: formulação de uma composição intradermicamente ou subcutaneamente implantável para melhorar a qualidade da pele, ou preencher rugas, ou restaurar volumes faciais (maçãs do rosto, queixo, lábios, nariz, etc.) ou do corpo, formulação de um cosmético ou cosmecêuticos com a finalidade de hidratação e/ou de fornecer para o organismo compostos de diferentes naturezas, tais como vitaminas, antioxidantes, moléculas hidratantes, substâncias ativas, entidades biológicas, agentes corantes, pigmentos, moléculas odoríferas ou moléculas aromáticas, formulação de uma composição oftalmológica tópica para, por exemplo, a hidratação da córnea a longo prazo, formulação de uma composição tópica ou implantável para utilização dentária para, por exemplo, o enchimento dos bolsos parodontais e/ou para estimular a regeneração dos tecidos ao redor do dente, formulação de uma composição implantável intraocularmente, particularmente para aplicação durante a cirurgia da catarata, do glaucoma, da presbiopia ou do vitreo, formulação de composições implantáveis intra- articularmente para aplicações na ortopedia ou na reumatologia, particularmente no âmbito da visco-suplementação do liquido sinovial deficiente para o tratamento da artrose, mas também para a reconstituição óssea ou a regeneração de cartilagem, formulação de uma composição implantável urologicamente para aplicações no tratamento de incontinência urinária ou fecal, formulação de uma composição tópica ou implantável para uso na medicina ou na cirurgia geral no âmbito do tratamento da fibrose ou para melhorar a cicatrização de feridas, e formulação de uma composição farmacêutica tópica ou implantável que permita a liberação controlada e/ou retardada de substâncias ativas e/ou entidades biológicas para diferentes aplicações médicas.

EXEMPLOS

[0073] A invenção será agora ilustrada, de modo não limitativo, pelos exemplos seguintes.

[0074] O hialuronato de sódio, a carboximetilcelulose de sódio, o cloridrato de lidocaina, a hidroxiapatita de fosfo- cálcio, e o conjunto dos outros compostos utilizados nos exemplos possuem um elevado grau de pureza.

[0075] A injetabilidade dos géis preparados foi determinada medindo-se a força (em Newtons) requerida para ejetar o gel contido em uma seringa de vidro de 1 ml (BD Hypak SCF, 1 ml RF-PRTC longa) através de uma determinada agulha a uma taxa de 12,5 mm/min.

[0076] As propriedades reológicas dos géis foram medidas a 25°C por meio de um reômetro AR2000 (TA Instruments), utilizando uma geometria plano-plano de 40 mm e um intervalo de 1000 um.

Exemplo 1 Preparação de um gel 1 de acordo com a invenção a) Preparação de uma fase A parcialmente reticulada

[0077] Foram pesados 4,70g de fibras de hialuronato de sódio (NaHA) com uma massa molecular aproximadamente igual a 3,0 MDa e com um nivel de humidade de 13,8%, aos quais foram adicionados 45,75g de uma solução aquosa de NaOH a 1% em peso.

[0078] A hidratação das fibras levou lh20min, com uma homogeneização manual regular com uma espátula.

[0079] Foram adicionados ao meio de reação l,41g de uma solução de éter diglicidilico de 1, 4-butanodiol (BODE) diluida a 1:5 em uma solução de NaOH a 1% em peso, seguidos de homogeneização manual por 15 min.

[0080] O gel assim obtido foi dividido em três volumes iguais para preparar as três frações seguintes: A fração 1 foi introduzida em um banho termostático a 30°C durante lh, e então foi diluida com uma solução tampão de fosfato contendo HCI para obter uma concentração de NaHA de 20 mg/ml e um pH neutro (= fase A' ) . A fase A' foi homogeneizada mecanicamente durante 10 min (= gel A'). A fração 2 foi introduzida em um banho termostático a 50°C durante 2h, e foi então diluida com uma solução tampão de fosfato contendo HCI para obter uma concentração de NaHA de 20 mg/ml e um pH neutro (= fase A") . A fase A" foi homogeneizada mecanicamente durante 10 min ( = gel A"). A fração 3 foi introduzida em um banho termostático a 30 °C durante lh.

[0081] Seja A a fase parcialmente reticulada obtida.

b) Preparação de uma fase B parcialmente reticulada

[0082] Foram pesados 5,25g de hialuronato de sódio (NaHA) fibras com uma massa molecular aproximadamente igual a 3,0 MDa e com um nivel de humidade de 13,8%, aos quais foram adicionados 45, 75g de uma solução aquosa de NaOH a 1% em peso.

[0083] A hidratação das fibras levou lh20min, com homogeneização manual regular com uma espátula.

[0084] Foram adicionados à mistura de reação 2,73g de uma solução de éter diglicidilico de 1,4-butanodiol (BODE) diluida a 1:5 em uma solução de NaOH a 1% em peso, seguidos por 15 min de homogeneização manual com uma espátula.

[0085] O gel assim obtido foi dividido em três volumes iguais para preparar as três frações seguintes: A fração 1 foi introduzida em um banho termostático a 30°C durante lh, e foi então diluida com uma solução tampão de fosfato contendo HCI para obter uma concentração de NaHA de 20 mg/ml e um pH neutro (= fase B') . A fase B' foi homogeneizada mecanicamente durante 10 min (= gel de B'). A fração 2 foi introduzida em um banho termostático a 50°C durante 2h, e foi então diluida com uma solução tampão de fosfato contendo HCI para obter uma concentração de NaHA de 20 mg/ml e um pH neutro (= fase B") . A fase B" foi homogeneizada mecanicamente durante 10 min (= gel B"). A fração 3 foi introduzida em um banho termostático a 30°C durante lh.

[0086] Seja B a fase parcialmente reticulada obtida.

c) Combinação das fases A e B parcialmente reticuladas e continuação da reticulação

[0087] Foram adicionados 9, 0g da fase A parcialmente reticulada a 13,0g da fase B parcialmente reticulada, os quais foram submetidos à agitação mecânica durante 15min à temperatura ambiente antes da imersão em um banho termostático a 50°C durante 2h.

[0088] 0 produto reticulado foi neutralizado a pH = 7,0 em uma solução tampão de fosfato contendo HCI, na qual foi deixado inchando durante 24h e, em seguida, dialisado durante 24h com uma solução de tampão fosfato a fim de remover BODE que não reagiu.

[0089] Após homogeneização mecânica durante 10 min, obteve-se um gel 1 com uma concentração de hialuronato de sódio 20 mg/ml.

Exemplo 2 Caracterização do gel 1 do Exemplo 1

[0090] Os géis 1, A', A", B' e B" foram introduzidos em seringas de vidro de Iml, e as forças necessárias para a extrusão dos géis através de uma agulha 27G% a uma velocidade de 12,5 mm/min estão indicadas na tabela abaixo.

[0091] Observa-se que: as reações de reticulação são parciais para as fases A e B. Na realidade, as forças de ejeção de A" e B" são maiores do que as de A 'e B', respectivamente, demonstrando que os géis de A" e B" são mais reticulados do que A' e B', e o gel 1 de acordo com a invenção possui uma força de ejeção menor do que a de B" e, portanto, possui uma inj etabilidade melhor do que a do gel que não tenha sido submetido à reticulação com o método de acordo com a invenção.

[0092] As propriedades de viscoelasticidade reológica G' e G" do gel 1 a 1,0Hz foram igualmente medidas.

Exemplo 3 Preparação de um gel 2 de acordo com a invenção a) Preparação de uma fase C parcialmente reticulada

[0093] Foram pesados 4,2g de hialuronato de sódio (NaHA) em pó com uma massa molecular aproximadamente igual a 2,0 MDa e com um nivel de humidade de 6,3%, aos quais foi adicionado 0,3g de carboximetilcelulose de sódio (42 mPa.s, 2% em água, a 20°C) com um nivel de humidade de 2,0%, e 33, 6g de uma solução aquosa de NaOH a 1% em peso.

[0094] A hidratação do pó levou lh20min, com homogeneização manual regular com uma espátula.

[0095] Seja H a fase hidratada obtida.

[0096] Foi adicionado l,80g de uma solução de éter diglicidilico de 1,4-butanodiol (BODE), diluida a 1:5 em uma solução de NaOH a 1% em peso, a 27,0g da fase H, e então realizou-se uma homogeneização manual com uma espátula durante 15min, seguida pela introdução da mistura da reação em um banho termostático a 50°C durante lh30min.

[0097] Foi adicionado 0,10g de uma solução de éter diglicidilico de 1,4-butanodiol (BODE), diluida a 1:5 em uma solução de NaOH a 1% em peso, a 3,0g da fase H obtida acima, e então realizou-se uma homogeneização manual com uma espátula durante 15min, seguida pela introdução da mistura da reação em um banho termostático a 50°C durante 2h.

c) Combinação das fases C e D parcialmente reticuladas e continuação da reticulação

[0098] A fase parcialmente reticulada D foi adicionada à fase parcialmente reticulada 0 e submetida à agitação mecânica durante 15min à temperatura ambiente antes da imersão em um banho termostático a 50°C durante 2h30min.

[0099] O produto reticulado foi neutralizado a pH = 7,0 em uma solução tampão de fosfato contendo HCI, na qual foi deixada inchando durante 24h e, em seguida, dialisada durante 24h com uma solução de tampão de fosfato a firn de remover BODE que não reagiu.

[0100] Após homogeneização mecânica durante lOmin, obteve-se um gel 2 com uma concentração de hialuronato de sódio 20 mg/ml.

Exemplo 4 Preparação de uma formulação injetável 1 de acordo com a invenção

[0101] Em 25% da massa do gel 2 obtido no Exemplo 3, 0,3% em peso de pó de cloridrato de lidocaina foi adicionado, e foi realizada a homogeneização mecânica durante 15min.

[0102] O gel assim obtido foi introduzido em seringas de vidro de Iml, e, em seguida, as seringas foram esterilizadas em autoclave a 121°C durante 20min.

Exemplo 5 Preparação de uma formulação injetável 2 de acordo com a invenção

[0103] Em 25% da massa do gel obtido no Exemplo 3, 30% em peso de um pó de hidroxiapatita de fosfo-cálcio com um tamanho de partícula entre 30 e 50mm foram adicionados, e foi realizada a homogeneização mecânica durante 15min.

[0104] O gel assim obtido foi introduzido em em seringas de vidro de Iml, e estas seringas foram então esterilizadas em autoclave a 121°C durante 20min.

Exemplo 6 Caracterização da formulação injetável 1 do Exemplo 4

[0105] A formulação estéril obtida no Exemplo 4 mostrou-se como sendo facilmente injetável através de uma agulha 27G% fina; uma força de injeção de 21,3N tendo sido medida a uma velocidade de 12,5 mm/min.

[0106] O pH e a osmolaridade desta formulação são fisiológicas: pH = 6,9 Osmolaridade = 290 mOsm/kg H20

[0107] As caracterizações reológicas resultaram em um módulo elástico G' de 74Pa e uma Tanõ de 0,25 a uma frequência de 1,0Hz.

[0108] É importante notar que estas características reológicas são compatíveis com a injeção para dentro da derme ou subcutaneamente.

[0109] Em dois frascos de lOml, Fl e F2, contendo 8ml de água purificada, foram introduzidos: Iml de gel Restylane® (Galderma Q-Med, Uppsala, Suécia) em El; Restylane® é um produto à base de ácido hialurônico reticulado a 20 mg/ml conhecido há mais de 10 anos na medicina estética, e Iml da formulação injetável 1 em F2.

[0110] A Fl e a F2 foram agitadas manualmente durante 5 segundos. Após mais 10 segundos, observou-se que o produto Restylane® foi completamente dissociado em água (suspensão de partículas hialurônicas reticuladas em água), o que não é o caso para a formulação injetável 1, que sempre foi sob a forma de um gel em água. O nivel de coesividade da formulação injetável 1 é, por conseguinte, muito maior do que a do produto Restylane®.

Exemplo 7 Comparação da produção de um gel de acordo com a invenção com a técnica anterior (US 2010/0028435) a) Preparação de um gel 2 de acordo com a Invenção

[0111] Ver Exemplo 3.

b) Preparação de um gel X da técnica anterior de acordo com o Exemplo 4 do pedido de patente US 2010/0028435

[0112] Foram pesados 3,50g de hialuronato de sódio (NaHA) em pó, com uma massa molecular aproximadamente igual a 2,0 MDa e com um nivel de humidade de 6,3%, aos quais foram adicionados 24,0g de uma solução aquosa de NaOH a 1% em peso.

[0113] A hidratação do pó levou lh, seguida de homogeneização manual durante lOmin com uma espátula.

[0114] Adicionou-se 700pl de BODE ao meio de reação, seguido de homogeneização manual durante lOmin com uma espátula, antes da imersão em um banho termostático a 50°C durante 2h.

[0115] O produto reticulado foi neutralizado a pH = 7,0 em uma solução tampão de fosfato contendo HCI, na qual foi deixado inchando durante 24h (volume final = 92ml).

[0116] O gel assim obtido foi triturado em partículas por meio de passagens em série através de uma rede de 250pm.

[0117] Seja Xp as partículas obtidas.

[0118] Foram pesados 3,50g de hialuronato de sódio (NaHA) em pó, com uma massa molecular aproximadamente igual a 2,0 MDa e com um nivel de humidade de 6,3%, aos quais foram adicionados 30,5g de uma solução aquosa de NaOH a 1% em peso.

[0119] A hidratação do pó levou lh, seguida por uma homogeneização manual por lOmin com uma espátula.

[0120] Adicionou-se 263pl de BODE ao meio de reação, seguido por uma homogeneização manual durante lOmin com uma espátula, antes da imersão em um banho termostático a 50°C durante 2h.

[0121] Seja Xg o produto reticulado obtido.

[0122] Foram adicionados 58g de partículas Xp e 24g de uma solução aquosa de NaOH a 1% em peso ao produto reticulado Xg, seguido por homogeneização com uma espátula durante lOmin, e pela continuação da reação de reticulação durante 6h a 25°C.

[0123] O produto reticulado foi neutralizado a pH = 7,0 em uma solução tampão de fosfato contendo HCI, na qual foi deixado inchando durante 24h, e, em seguida, dialisado durante 24h com uma solução tampão de fosfato a fim de remover BODE que não reagiu.

[0124] Após homogeneização mecânica durante 30min, obteve-se um gel X.

c) Comparação dos processos de produção do gel 2 e do gel X

[0125] O gel 2 e o gel X foram colocados em seringas de vidro de Iml e extrudidos através de agulhas de 27G% (6 testes para cada gel/injeção manual por um operador). O gel 2 e o gel X foram facilmente injetáveis através da agulha, no entanto, é importante observar que o gel 2 de acordo com a invenção mostrou possuir uma homogeneidade muito melhor no interior da seringa. De fato, durante as injeções, o operador que realiza o teste observou muitas irregularidades com o gel X (não foi o caso com o gel 2 da invenção) no que diz respeito à força que deve ser aplicada ao êmbolo da seringa; irregularidades caracterizadas pelo operador como "pushs". Por outro lado, entre as seis seringas testadas com o gel X, duas seringas não puderam ser completamente descarregadas porque a agulha estava completamente bloqueada/obstruida pelo gel (não foi o caso com o gel 2 de acordo com a invenção).

[0126] Como descrito acima, a técnica anterior ensina que a conversão de um gel reticulado em partículas permite reduzir a força de ejeção do produto e, assim, aumentar a sua injetabilidade através de uma agulha (o hidrogel fortemente reticulado é triturado em partículas de tamanho pequeno que estão mais suscetíveis a passar através do furo da agulha). Surpreendentemente, o gel 2 da invenção, que não foi submetido a qualquer passo de trituração das fases parcialmente reticuladas (uma dos quais é altamente reticulada e a outra sendo menos reticulada), mas possui uma fase reticulada resultante da mistura e da reticulação das referidas duas fases parcialmente reticuladas, mostrou ser igualmente facilmente injetável, e também mais homogêneo. A complexa estrutura "multiestruturada" (e sem co-reticulação) de acordo com a invenção, portanto, torna possivel resolver o problema de injetabilidade descrito na técnica anterior, sem ter de triturar o produto para convertê-lo em partículas.

[0127] Ensaios de coloração de azul de toluidina foram realizados em amostras de gel tomadas durante o processo de preparação do gel 2 e do gel X a fim de avaliar se a estrutura do gel é em partículas ou não. Para isto, cerca de 0,lg do gel a ser testado foi colocado sobre uma lâmina de vidro, e foram adicionadas cinco gotas de uma solução aquosa de azul de toluidina (0,lg de azul de toluidina para cada 100g de água desionizada), e, em seguida, uma segunda lâmina de vidro foi colocada sobre a primeira lâmina de vidro. O resultado foi então observado sob um microscópio a uma ampliação de 40x, e uma foto foi tirada.

[0128] Os seguintes teste de coloração foram realizados: Para o gel 2: para as fases parcialmente reticuladas C e D (ver Figuras 1 e 2) e para o produto reticulado obtido a partir das fases parcialmente reticuladas C e D (ver Figura 3), depois da neutralização até um pH neutro para três amostras; Para o gel X: para as partículas Xp (ver Figura 4) e para o produto reticulado obtido pela co-reticulação das partículas Xp (ver Figura 5) , depois da neutralização até um pH neutro para duas amostras.

[0129] Em contraste com a Figura 4 (e também a Figura 5), em que partículas reticuladas de NaHA estão claramente visíveis, a estrutura de gel das Figuras 1 a 3, relativas ao gel 2 de acordo com a invenção, não é em partículas. A não-conversão das fases parcialmente reticuladas durante o processo de reticulação do invento permite a obtenção de um hidrogel que não contém partículas de NaHA co-reticulado.

[0130] Isto representa uma vantagem significativa em relação aos produtos da técnica anterior, e especialmente sobre os produtos descritos em US 2010/0028435 e também em EP 2 011 816. Com efeito, tal como descrito na literatura e também nos pedidos de patente US 2010/0028435 e EP 2 011 816, as partículas reticuladas geram efeitos colaterais e complicações, tanto a curto prazo como a longo prazo(em EP 2 011 816, as partículas reticuladas são especificamente descritas como gerando reações mais ou menos fortes contra corpos estranhos). Na presente invenção, a ausência de partículas co-reticuladas representa, assim, uma grande melhoria sobre as invenções divulgadas em US 2010/0028435 e EP 2 011 816 no diz respeito a um melhor perfil de segurança do produto enquanto que permanecendo facilmente injetável.

[0131] Por outro lado, também é importante observar que US 2010/0028435 e EP 2 011 816 reivindicam limitar a migração de partículas altamente reticuladas no interior do corpo devido à co-reticulação destas partículas com uma matriz de NaHA fracamente reticulado. Isto é verdade a curto prazo, mas a migração de partículas altamente reticuladas torna-se novamente possível a longo prazo, quando a matriz de reticulação de NaHA fracamente reticulado tiver sido reabsorvida. Este último ponto corrobora mais o melhor perfil de segurança do hidrogel injetável de acordo com a invenção, onde não ocorre o problema da migração de partículas co- reticuladas a longo prazo (o hidrogel de acordo com a invenção não contém partículas co-reticuladas).

[0132] Outra importante vantagem é a melhor integração (= bio-integração/bio-implantação) nos tecidos do produto de acordo com a invenção em comparação com os produtos de partículas co-reticuladas conhecidos de US 2010/0028435 e também de EP 2 011 816. De fato, conforme descrito em diversas publicações científicas (por exemplo, Tran C. et al, In vivo bio-integration of three HA fillers in human skin: a histological study, Dermatology 2014, 228:4754; or Micheels, P. et al., Superficial dermal injection of HA soft tissue fillers: comparative ultrasound study, Dermatol. Surg. 2012, 38:1162-1169), a injeção de produtos à base de NaHA reticulado e em partículas na derme (por exemplo, dos produtos divulgados em US 2010/0028435 e EP 2 011 816) são distribuídos significativamente mais heterogêneos em comparação com produtos à base de NaHA reticulado não particulado, (como no caso do hidrogel de acordo com a invenção).

[0133] Também é importante observar que o método de preparação de um hidrogel de acordo com a invenção requer um tempo significativamente mais curto para a fabricação de um produto em comparação com os métodos descritos em US 2010/0028435 e EP 2 011 816. A comparação do tempo de fabricação para o gel e da invenção (aproximadamente 55h) e para o gel X de acordo com US 2010/0028435 (aproximadamente 85h) pode ilustrar este ponto. Isto fornece uma clara vantagem econômica e também minimiza o risco de contaminação bacteriana do gel durante a fabricação, o gual aumenta com a duração do processo de fabricação.

Exemplo 8 Comparação da produção de um gel de acordo com a invenção com a técnica anterior (EP 2 011 816) a) Preparação de um gel 2 de acordo com a invenção

[0134] Ver Exemplo 3.

b) Preparação de um gel Y da técnica anterior de acordo com o Exemplo 1 do pedido de patente EP 2 011 816

[0135] Foi pesado l,00g de hialuronato de sódio (NaHA) em pó, com uma massa molecular aproximadamente igual a 2,0 MDa e com um nivel de humidade de 6,3%, ao gual foram adicionados 6,2g de uma solução aguosa de NaOH a 1% em peso.

[0136] A hidratação do pó levou lh20min, com homogeneização manual regular com uma espátula.

[0137] Foi adicionado 0,15g de BODE ao meio de reação, seguido de homogeneização manual durante lOmin com uma espátula, antes da imersão em um banho termostático a 50°C durante 2h30min.

[0138] O produto reticulado foi introduzido em água desionizada durante 24h, em três banhos sucessivos de 8h cada, a fim de remover BODE que não reagiu.

[0139] O gel assim obtido foi triturado em partículas por passagem em série do mesmo através de uma rede de 250pm, e as partículas foram deixadas drenando durante 2h.

[0140] Sejam Yp as partículas obtidas.

[0141] Foram adicionados 5.0g de partículas Yp a 0,8g de hialuronato de sódio (NaHA) em pó, com uma massa molecular aproximadamente igual a 2,0 MDa e com um nivel de humidade de 6,3%, aos quais foram adicionados 2,0g de uma solução aquosa de NaOH a 1% em peso.

[0142] A mistura foi homogeneizada manualmente durante 30min antes da adição de 0,03g de BODE e, em seguida, novamente homogeneizada durante 30min antes da imersão da mistura de reação em um banho termostático a 50°C durante 2h30min.

[0143] Seja Yg o produto reticulado obtido.

[0144] O produto reticulado Yg foi neutralizado a pH = 7,0 em uma solução tampão de fosfato contendo HCI, em que foi deixada inchando durante 24h, e, em seguida, dialisada durante 24h com uma solução tampão de fosfato a fim de remover BODE que não reagiu.

[0145] Após homogeneização manual por 30min, um gel Y foi obtido.

c) Comparação dos processos de produção do gel 2 e do gel Y

[0146] Tal como no Exemplo 7, os géis 2 e Y foram colocados em seringas de vidro de Iml e extrudidos através de uma agulha de 27G%. Verificou-se que os dois géis foram facilmente injetáveis através da agulha, e as mesmas observações que as definidas em relação ao Exemplo 7 se aplicam: o gel 2 de acordo com a invenção mostrou-se mais homogêneo já que sua injeção através da agulha foi mais estável do que a do gel Y. Surpreendentemente, contudo, o gel 2 da invenção, que não foi submetido a qualquer etapa de moagem em partículas a fim de facilitar a sua injetabilidade, possui uma estrutura complexa "multiestruturada" que exibe uma baixa força de ejeção similar àquela do gel Y, o qual foi submetido a uma etapa de conversão de sua fase fortemente reticulada em partículas.

[0147] Tal como no Exemplo 7, foi realizada a coloração com azul de toluidina em amostras de gel tomadas durante o processo de preparação do gel 2 e do gel Y.

[0148] Os seguintes testes de coloração foram realizados: Para o gel 2: para as fases parcialmente reticuladas C e D (ver Figuras 1 e 2) e para o produto reticulado obtido a partir das fases parcialmente reticuladas C e D (ver Figura 3), depois da neutralização até um pH neutro para três amostras; Para o gel Y: para as partículas Yp (ver Figura 6) e para o produto reticulado obtido por co-reticulação das partículas Yp (ver Figura 7), depois da neutralização até um pH neutro para duas amostras.

[0149] A conclusão é a mesma que a do Exemplo 7. Em contraste com a Figura 6 (e também a Figura 7), na qual partículas reticuladas de NaHA estão claramente visiveis, a estrutura do gel das figuras 1 a 3, relativas ao gel 2 de acordo com a invenção, não é particulada.

[0150] Por conseguinte, a presente invenção permite que se obtenha facilmente um hidrogel injetável, apesar do fato dele não ter sido triturado (parcial ou completamente) para formar partículas durante o seu processo de reticulação. Assim, a ausência de partículas co-reticuladas no gel permite (em comparação com o gel obtido em EP 2 011 816) uma melhoria sensível: o perfil de segurança a curto e longo prazo é melhorado, não havendo, em particular, migração de partículas altamente reticuladas a longo prazo como em EP 2 011 816; a bio-integração do gel nos tecidos é aumentada (distribuição mais homogênea) devido à ausência de partículas co-reticuladas.

[0151] Por fim, tal como no Exemplo 7, é importante observar que a fabricação do gel de acordo com a invenção possui uma vantagem econômica e minimiza o risco de contaminação bacteriana e de partículas, uma vez que o processo de fabricação é significativamente mais rápido do que o descrito em EP 2 011 816 (cerca de 55h para o gel de acordo com a invenção, em comparação com 83h para o gel de acordo com EP 2 011 816) , e sem a necessidade de uma ou várias etapas complexas e tediosas de moagem como as exigidas em EP 2 011 816.

Claims

1. Método para a reticulação de ácido hialurônico, ou um dos seus sais, e, opcionalmente, outros polímeros biocompativeis, caracterizado por compreender pelo menos as etapas de: a) preparar uma primeira fase aquosa de ácido hialurônico e, opcionalmente, de outros polímeros biocompativeis, parcialmente reticulada, em que: adiciona-se o ácido hialurônico, ou um dos seus sais, e, opcionalmente, outros polímeros biocompativeis, em uma solução aquosa, a fim de obter uma concentração Cl de ácido hialurônico, adiciona-se uma quantidade Q1 de agente de reticulação, alcança-se a reticulação parcial do ácido hialurônico por meio do controle da temperatura TI e da duração tl da reação de reticulação, em que a primeira fase aquosa de ácido hialurônico parcialmente reticulado preparada não é convertida em partículas; b) preparar pelo menos uma segunda fase aquosa de ácido hialurônico e, opcionalmente, de outros polímeros biocompativeis, parcialmente reticulada, em que: adiciona-se ácido hialurônico, ou um dos seus sais, e, opcionalmente, outros polímeros biocompativeis, em uma solução aquosa, a fim de obter uma concentração C2 de ácido hialurônico, adiciona-se uma quantidade Q2 de agente de reticulação, alcança-se a reticulação parcial do ácido hialurônico por meio do controle da temperatura T2 e da duração t2 da reação de reticulação, em que a pelo menos uma segunda fase aquosa de ácido hialurônico parcialmente reticulado preparada não é convertido em partículas; c) adicionar pelo menos uma segunda fase de ácido hialurônico parcialmente reticulado na primeira fase e, em seguida, produzir uma mistura das referidas pelo menos duas fases, opcionalmente, pelo acréscimo de uma quantidade adicional de agente de reticulação Qm; e d) continuar a reticulação da mistura previamente realizada, através do controle da temperatura Tm e da duração tm da reação de reticulação, em que o método de reticulação não envolve a adição de partículas reticulados de ácido hialurônico, ou um dos seus sais, ou qualquer outro polímero, durante as etapas A, B, C e D do referido método de reticulação.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a segunda fase aquosa do ácido hialurônico parcialmente reticulado possuir um grau de reticulação parcial maior do que o da primeira fase aquosa do ácido hialurônico parcialmente reticulado, e/ou pela concentração C2 do ácido hialurônico ser maior ou igual à concentração Cl.

3. Método, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado por a quantidade Q2 de agente de reticulação ser maior ou igual à quantidade Ql, e/ou pela temperatura T2 de reticulação ser maior ou igual à temperatura Tl, e pela temperatura Tm de reticulação ser maior do que a temperatura T2.

4. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por a duração T2 da reticulação ser maior ou igual à duração Tl, e/ou pelas respectivas massas da primeira e da segunda fases aquosas parcialmente reticuladas de ácido hialurônico na mistura serem iguais ou diferentes.

5. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por a reticulação da mistura ser interrompida por diluição com uma solução aquosa, e/ou através da remoção do agente de reticulação não reagido através da realização de purificação seguida por diálise.

6. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por as reações de reticulação serem realizadas pela ação de um ou vários agentes de reticulação polifuncionais, selecionados, por exemplo, a partir do grupo de epoxis bi- ou poli-funcionais, divinilsulfona, carbodiimidas ou formaldeido, as reações de reticulação sendo realizadas preferivelmente realizadas por ação do agente de reticulação éter diglicidilico de 1,4-butanodiol (BODE).

7. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por os sais de ácido hialurônico serem os de sódio, de cálcio, de zinco ou de potássio.

8. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por o ácido hialurônico, ou um dos seus sais, possuir uma massa molecular compreendida entre 0, 1 e 4 milhões Da.

9. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado por o ácido hialurônico poder ser um derivado de ácido hialurônico, ou seja, uma molécula obtida pela modificação da molécula de ácido hialurônico por via quimica, ou qualquer outra via.

10. Método para a preparação de um hidrogel injetável, caracterizado por compreender pelo menos as seguintes etapas sucessivas: reticulação do ácido hialurônico, ou de um dos seus sais, e, opcionalmente, de outros polímeros biocompativeis, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9, purificação da mistura por meio de uma solução iso- osmolar e que possua um pH adequado, homogeneização da mistura, opcionalmente com a adição de um ou vários outros polímeros biocompativeis e/ou uma ou várias substâncias que possam proporcionar um beneficio para o organismo, tais como substâncias ativas, desgaseificação opcional e/ou liofilização, acondicionamento em uma seringa ou em um frasco ou em qualquer outro recipiente hermético, e esterilização.

11. Hidrogel obtido conforme método definido pela reivindicação 10, que consiste pelo menos em um ácido hialurônico reticulado ou um dos seus sais e, opcionalmente, outros polímeros biocompativeis, caracterizado por uma mistura de várias fases de ácido hialurônico reticulado possuindo diferentes graus de reticulação, as referidas fases ligadas umas às outras através de ligações covalentes, em que a concentração total de ácido hialurônico ou de um dos seus sais esteja compreendida, por exemplo, entre 0,01 e 50 mg/ml.

12. Hidrogel, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado por compreender uma ou várias substâncias ativas que possuam ou não uma ação farmacológica, tais como, por exemplo, antioxidantes, anti-inflamatórios, anti-sépticos, agentes antibacterianos, agentes antifúngicos, agentes anti- cancerigenos, proteínas, hormônios, anestésicos locais, entidades biológicas, isoladamente ou em conjunto.

13. Hidrogel, de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 e 12, caracterizado por conter lidocaina dispersa dentro de sua matriz reticulada, e/ou por conter uma ou várias substâncias minerais dispersas dentro da matriz reticulada.

14. Kit caracterizado por compreender um hidrogel conforme definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 13 acondicionado em seringas estéreis.

15. Uso de um hidrogel conforme definido em qualquer uma das reivindicações 11 a 13 caracterizado por ser para o preparo de uma composição para aplicações terapêuticas ou de estética, ou para a formulação de uma composição intradermicamente ou subcutaneamente implantável para melhorar a qualidade da pele ou preencher rugas ou restaurar volumes do rosto ou do corpo, para a formulação de uma composição cosmética ou cosmecêuticos, para a formulação de uma composição de uso tópico ou intra-ocular, para aplicações em oftalmologia, para a formulação de uma composição tópica ou implantável para aplicações em odontologia, para a formulação de uma composição intra-articular para aplicações em ortopedia e reumatologia, para a formulação de uma composição implantável em urologia, para aplicações no tratamento de incontinência, para a formulação de uma composição tópica ou implantável utilizada em medicina ou cirurgia geral dentro do âmbito do tratamento da fibrose ou para melhorar a cicatrização de feridas, para a formulação de uma composição farmacêutica tópica ou implantável permitindo a liberação retardada e/ou controlada de substâncias ativas para várias aplicações médicas.