KR102256061B1 - 하이알루론산의 가교 방법, 주사용 하이드로젤의 제조방법, 수득한 하이드로젤 및 수득한 하이드로젤의 용도 - Google Patents

하이알루론산의 가교 방법, 주사용 하이드로젤의 제조방법, 수득한 하이드로젤 및 수득한 하이드로젤의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 하이알루론산을 가교하는 방법, 주사용 하이드로젤을 제조하는 방법, 제조된 하이드로젤, 및 이의 용도에 관한 것이다.

Description

하이알루론산의 가교 방법, 주사용 하이드로젤의 제조방법, 수득한 하이드로젤 및 수득한 하이드로젤의 용도{Method for crosslinking hyaluronic acid, method for preparing an injectable hydrogel, hydrogel obtained and use of the obtained hydrogel}
본 발명의 목적은 다음을 제공하는 것이다:
- 하이알루론산, 또는 이의 염 중의 하나, 및 조건적으로 다른 생체적합성 폴리머를 가교하는 방법,
- 상기 가교 방법으로 수득한 주사용 하이드로젤을 제조하는 방법,
- 상기 가교 방법에 따라 수득한 하이드로젤, 및
- 미용 및 의료 분야에서의 상기 가교 방법으로 수득한 하이드로젤의 용도.
하이알루론산은 D-글루큐론산과 N-아세틸글루코사민으로 구성되는 이당 단위체가 반복된 다당체이다. 그 구조는 선형이고 종 특이성이 없다. 하이알루론산은 인간 및 동물 생 유기체에 광범위하게 분포되어 있고, 여기서 예를 들어 수화 수준의 조절 또는 체액이나 조직의 점탄성 유지와 같은 많은 생물학적 기능을 수행한다. 특히, 관절활액, 눈의 유리액 및 피부에 높은 농도로 발견되고 있다. 70 킬로그람의 인간은 약 15 g의 하이알루론산을 포함하고 이의 반은 피부에 있고, 그 양은 나이가 듦에 따라 감소한다.
하이알루론산 젤은 수년간 피부 및 의료의 광범위한 분야에 공지 및 사용되고 있다. 이러한 젤들은 공통적으로 하기에 주사되었다:
- 안 내, 안과 수술하는 동안 눈 안의 공간을 유지하고 눈의 조직을 보호하기 위해,
- 관절 내, 관절염의 경우, 결핍된 관절활액을 보충하고 상기 생물학적 액체의 연골보호 기능을 일시적으로 회복시키기 위해,
- 피부내 또는 피부하, 주름을 채우거나, 얼굴이나 몸의 특정 부위의 부피를 증가시키기 위해.
하이알루론산은 생체 내에서 짧은 반감기를 가진다 (1 주 이내). 미용과 의료 부문에서의 많은 적용 건의 경우, 투여된 주사용 하이드로젤은 가교에 의해 안정화된 하이알루론산을 포함하며, 이는 이러한 다당체의 생체내 생존시간 (또한 잔류시간으로 지칭)을 상당히 증가시키고 따라서 주사된 제품의 효과의 기간을 늘이게 한다. 따라서, 가교에 의한 이러한 변형으로써, 가교된 하이알루론산에 기반한 하이드로젤은 예를 들어 수 개월에 걸쳐 주름을 채울 수 있는 능력을 가지고 있다.
하이알루론산에 기반한 주사용 하이드로젤의 생체 내 잔류시간을 증가시키기 위해, 당해 분야의 숙련자는 하이알루론산의 가교도를 증가시킬 수 있는 다는 것을 안다; 하지만, 상기 분자의 이러한 변형은 젤의 점도 상승을 야기하고 따라서 바늘을 통해 밀어내는 데 어려움이 있고 다음으로 전문가가 원하는 부위로 이러한 젤을 주사하는 데 어려움이 있다. 이것은 필수적으로 하기를 의미한다:
- 만족스러운 배출력을 유지할 목적으로, 하이알루론산의 가교도를 제한하고 따라서 생체 내의 젤의 잔류시간을 제한하는 것,
- 또는 더 큰 직경의 바늘을 사용하여 이 바늘을 통해서 상기 젤을 밀어내는 데 필요한 배출력을 감소시키는 것으로, 이는 처치 환자에 더 큰 고통을 야기하며 주사 부위에 더 큰 외상 (반상 출혈, 붉은 반점, 염증, 부종, ...)을 남긴다.
이러한 문제를 해결하기 위해 많은 해결책이 제시되었고, 연구자들은 적절한 잔류시간 및 점도 특성을 가지고 따라서 바늘을 통해 그 젤을 밀어내기에 만족스러운 수준을 가지는 주사용 제제를 모색하였다. 예를 들어, 하기와 같이 언급된다:
- 통상 갈아서 가교된 젤을 입자로 분해하여 얻은 가교된 하이알루론산의 입자에 기반한 제형; 특허 출원번호 WO 97/04012의 경우와 같이, 이러한 유형의 제형을 수득하기 위한 다양한 제조 방법이 나타나 있다,
- 출원 번호 WO 2005/085329에 설명된 특정 제조방법으로 수득한 상이한 가교체들을 포함하는 가교된 하이알루론산에 기반한 제형
- 가교된 젤의 혼합물로서, 서로 가교되지 않는, 예를 들어, 공유결합으로 서로 결합 되지 않은 혼합물을 포함하는 가교된 하이알루론산에 기반한 제형; 이러한 제형들은 출원 번호 FR　2　924　615에 설명된 특정 제조 방법에 따라 얻어진다, 및
- 가교된 하이알루론산의 입자로서, 하이알루론산의 매트릭스와 같이 가교된 입자로 구성된 가교된 하이알루론산에 기반한 제형; 이러한 제형들은 특허 출원번호 EP　2　011　816 또는 US 2010/0028435에 따라 제조된다.
이러한 해결책들은 그러나 완전히 만족스러운 것은 아니다.
특허 출원번호 WO　97/04012는 입자 형태로 있는 다당류 (하이알루론산일 수 있는)에 기반한 생성물을 얻을 수 있는 특정 제조 방법을 설명한다. 가교된 하이알루론산에 기반한 입자형 젤은 문헌에서 "이중상 젤"로 불리우는 데, 이는 입자의 존재를 특징으로 하며, 이는 윤활 현상으로 배출을 용이하게 할 수 있는 가교되지 않은 하이알루론산의 용액에 분산된, 약 200 마이크로미터 내지 1,000 마이크로미터 이상의 직경을 가지는 입자를 특징으로 한다. 이러한 젤들은 바늘을 통한 젤의 배출이 특히 큰 직경의 입자를 포함하는 생성물과 불규칙적으로 되는 한 전체적으로 만족스럽지 않다; 여기서 운반체의 역할을 하는 비가교된 하이알루론산에 기반한 용액이 생체 내에서 빠르게 재흡수되며, 이는 바람직한 효과가 적어도 부분적 손실된다는 것이고 (특히, 부피감을 나타내기 위한 제품의 주입 후에 충진 손실); 및 최종적으로, 그 제품의 안전성 특성이 임의의 입자를 포함하지 않는 하이알루론산에 기반한 젤보다 그렇게 좋지 않은데 (예를 들어 이차적 효과 수준이 더 크다), 입자들은 이물질에 대한 반응을 조장하고 및/또는 처치된 부위의 기계적 작용하에서 이러한 입자들이 옮겨 다닐 수 있기 때문이다.
특허 출원번호 WO　2005/085329는 특정 제조 방법을 개시한 것으로, 적어도 하나의 폴리머 (하이알루론산일 수 있는)의 일정량을 가교 개시한 후 용액상으로 있는 500,000 Da 이상의 분자량을 가지는 폴리머 (하이알루론산일 수 있는)의 추가량에 반응 혼합물의 희석액을 첨가하여 용액 내 상기 폴리머의 전체 농도를 낮추는 한편 가교 반응을 지속시키고자 하는 것을 특징으로 한다. 이러한 용액은 하이알루론산이 효과적으로 가교되는 가능성을 부여하지 않는다. 실제, 폴리머의 추가량 투입은 희석을 동반하게 되고 따라서 반응 혼합물의 하이알루론산 농도가 감소되게 된다. 하이알루론산 사슬과 가교제 사이에 만날 확률이 따라서 감소되고 가교 반응은 매우 효과적이지는 않다.
특허 출원번호 FR　2　924　615는 동일하거나 상이한 x 폴리머들(하이알루론산일 수 있는)의 균일한 혼합물들을 혼합 전에 가교시키는 것을 특징으로 하는 제조방법을 설명하고 있다. 혼합은 공유 결합을 발생시키지 않고 x 폴리머들을 병치하는 것을 의미한다. 이러한 해법은, 상기 폴리머들이 서로 결합하지 않고 있고 따라서 수득된 젤이 주입된 부위에서, 특히 거기서 매우 심각할 수 있는 기계적 스트레스 작용하에 분리될 수 있기 때문에, 완전히 만족스럽지 않다. 예를 들어, 두툼하게 하기 위해 입술에 주입하는 것을 들 수 있다; 입술은 강한 기계적 스트레스에 처하게 된다. 경험하는 기계적 작용은 이식된 젤을 이동시킬 수 있고 따라서 처치된 부위는 물론 이 부위 주위에 이차적인 효과를 나타낸다.
특허 출원번호 EP　2　011　816은 입자 형태의 적어도 하나의 강하게 가교된 제1 다당체 젤, 및 매트릭스를 형성하는 적어도 하나의 약하게 가교된 다당체 젤을 포함하는 다당류 (하이알루론산일 수 있는)의 주사가능한 젤에 관한 것이다; 상기 적어도 하나의 제1 젤은 적어도 하나의 제2 젤에 공유 결합을 통해 결합되어 있다. 특허 출원번호 WO　97/04012로부터 나온 생성물과는 달리, 강하게 가교된 입자들은 약하게 가교된 다당체 매트릭스에 결합되어 있다; 따라서, 이러한 해법에서의 입자들의 이동은 단기간 및/또는 중간 정도 기간에서는 강하게 제한되나, 장기간에서는 그러지 않다 (약하게 가교된 다당체가 조직으로 재흡수 후, 강하게 가교된 입자들은 이동의 가능성을 지닌 채 배출된다). 이러한 해법은 강하게 가교된 다당체 입자를 포함하기 때문에, 그 생성물의 입자 특성 및 이러한 입자들의 높은 가교도로 인해, 이물체에 대한 반응의 위험이 유의하다 (하이알루론산이 유의하게 변형되어있고, 따라서 생명체가 상기 분자를 인식하지 못하게 만든다).
특허 출원번호 US 2010/0028435는 가교된 하이알루론산에 기반한 제형을 제조하는 방법을 개시하고 있는 것으로, 가교된 하이알루론산 매트릭스에 같이 가교되어진 가교-하이알루론산으로 만든다. 따라서, 특허 출원번호 EP 2 011 816에 대해 했던 동일한 조언이 필요한 부분에 적용된다.
본 발명은 하이알루론산, 또는 이의 염 중의 하나, 또는 조건적으로 다른 생체적합성 폴리머를 가교하는 신규한 방법을 제공함으로써 이러한 여러 단점들을 해결하는 가능성을 제시하는 것으로서, 상기 방법은 특히 하기를 특징으로 하는 하이드로젤을 수득할 수 있게 한다:
- 바늘을 통해 좋게 배출되는 능력이고 따라서 환자에게 통증과 심각한 외상없이 처치할 부위에서 전문가에 의해 용이하게 주입될 수 있는 능력,
- 가교 방법 동안 상기 하이드로젤의 하나 이상의 구성 상이 입자로 전환되지 않음 (그러나 일반적으로 주사력을 저하시키는 입자가 부재함에도 낮은 주사력을 나타낸다); 생성물에 공동 가교된 입자가 없는 것은 유의하게 안정성 특성이 향상될 수 있게 하고 (단기간 및/또는 중/장기간에서 더 적은 부작용 및 합병증), 조직으로 상기 하이드로젤이 합체/이식되는 능력을 향상시키고 (조직 내에서 생성물이 더 고르게 분산되는), 및 또한 유의하게 짧고 덜 복잡한 제조 방법을 결과하게 한다 (왜냐하면 제조는 지루한 분쇄 단계를 포함하지 않기 때문이다).
- 상기 수득된 하이드로젤의 특정 구조로부터 일어나는 현저한 점탄성 특성으로서, 이는 전문가가 해부적 상황, 이를 지배하는 생리적 기작, 및, 적용할 수 있다면, 확인된 부족 상태를 보정하도록 하는 필요한 기계적/유동적 특성을 관찰하면서, 원하는 영역을 처리하는 데 그 예상을 충족시키는 데 특정한 기계/유동학적 특성을 가지는 제품을 그 전문가에게 제시할 수 있게 한다.
- 수득된 하이드로젤의 특정 "다중구조된"　 (및 공동-가교된 입자가 없는) 구조 때문에 처치될 영역의 조직에 간단히 이식되는 능력,
- 처치된 영역 내에서 분리되지 않고 및 따라서, 특히 기계적 스트레스 하에서, 다른 이웃 또는 더 먼 부위로 이동하지 않는 개선된 능력으로 인한, 상기 수득된 하이드로젤의 강화된 안전성,
- "다중구조된" 것으로서 특징되는, 따라서 적용시 활성 및/또는 생물학적 물질의 조절된 방출을 최적화시키는, 수득된 하이드로젤의 매트릭스의 복잡 구조,
- 미용 또는 치료적 처치의 효능을 연장시키고, 이에 따라 의료 또는 외과 과정 당 투여 회수를 제한할 수 있게 하는, 상기 수득된 하이드로젤의 최적화된 잔류시간.
이를 위해, 본 발명의 목적은 하이알루론산, 또는 이의 염 중의 하나, 및 조건적으로, 다른 생체적합성 폴리머들을 가교하는 신규한 방법으로서, 적어도:
a) - 하이알루론산 또는 이의 염 중 하나 및 조건적으로 다른 생체적합성 폴리머들을 수용액에 첨가하여 C1 농도의 하이알루론산을 수득하고,
- 가교제를 Q1 양으로 첨가하고,
-　가교 반응의 온도 T1 및 시간 t1을 조절하여 하이알루론산을 부분적으로 가교시키는 것을 특징으로 하는,
하이알루론산 및 조건적으로는, 부분적으로 가교된 다른 생체적합성 폴리머의 제1 수성 상을 제조하는 단계로서,
부분적으로 가교된 하이알루론산의 제조된 제1 수성상은 일반적으로 전체적으로 입자로 전환되지 않는 단계,
b)　- 하이알루론산 또는 이의 염 중 하나 및 조건적으로 다른 생체적합성 폴리머들을 수용액에 첨가하여 C2농도의 하이알루론산을 얻고,
-　가교제를 Q2 양으로 첨가하고,
- 가교 반응의 온도 T2 및 시간 t2를 조절하여 하이알루론산을 부분적으로 가교시키는 것을 특징으로 하는,
하이알루론산 및 조건적으로는, 부분적으로 가교된 다른 생체적합성 폴리머의 제2 수성 상을 제조하는 단계로서,
부분적으로 가교된 하이알루론산의 제조된 적어도 하나의 제2 수성상은 일반적으로 전체적으로 입자로 전환되지 않는 단계,
c) 적어도 상기 제1의 부분적으로 가교된 하이알루론산 상을 제1 상에 첨가한 후 조건적으로 가교제를 Qm의 추가량으로 첨가하여 상기 적어도 두 개 상을 혼합을 혼합하는 단계,
d) 가교 반응의 온도 Tm 및시간 tm을 조절함으로써, 상기 만들어진 혼합물의 가교를 계속하는 단계를 포함한다.
다음, 유리하게는 수용액으로 희석시킴으로 및/또는 정제하여 미반응 가교제를 제거함으로써 상기 혼합물의 가교 반응을 정지시킨다.
본 발명에 따른 가교 방법은 따라서 하이알루론산 및 조건적으로, 이미 부분적으로 가교된 다른 생체적합성 폴리머들의 적어도 두 개 수성상을 가교하면서 혼합하고, 및 가교 반응을 계속하여 상기 두 개 상을 공유 결합을 통해 결합하는 것을 포함한다.
본 발명은 하이알루론산, 또는 이의 염 중의 하나, 또는 조건적으로 다른 생체적합성 폴리머를 가교하는 신규한 방법을 제공함으로써, 상기 방법은 특히 하기를 특징으로 하는 하이드로젤을 수득할 수 있게 한다.
- 바늘을 통해 좋게 배출되는 능력이고 따라서 환자에게 통증과 심각한 외상없이 처치할 부위에서 전문가에 의해 용이하게 주입될 수 있는 능력,
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 젤의 샘플을 보여주는 사진,
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 젤의 샘플을 보여주는 다른 사진,
도 3는 본 발명의 실시예에 따른 젤의 샘플을 보여주는 또 다른 사진,
도 4는 본 발명의 실시예에 따른 젤의 샘플을 보여주는 또 다른 사진,
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 젤의 샘플을 보여주는 또 다른 사진,
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 젤의 샘플을 보여주는 또 다른 사진,
도 7은 본 발명의 실시예에 따른 젤의 샘플을 보여주는 또 다른 사진이다.
"부분적으로 가교된"은 조건적으로 다른 생체적합성 폴리머들을 포함하는 상기 적어도 2 개 하이알루론산 수성상이 여전히 폴리머 사슬에서 이용가능한 반응 부위를 가지고 있어서, 하이알루론산 및/또는 다른 생체적합성 폴리머들의 새로운 사슬을 가교/연결하는 가교제와 반응할 수 있다는 사실을 의미한다.
본 발명에 따른 가교 방법은 상기 가교 방법의 단계들, 즉 상기 설명된 단계 a, b, c 및 d 동안, 하이알루론산 또는 이의 염들 중 하나, 또는 임의의 다른 폴리머의 가교된 입자를 만들고 및/또는 첨가하는 것을 포함하지 않는다는 것을 특정하는 것은 중요하다. 모든 부분적으로 가교된 상들은, 상기 가교 방법 중에, 예를 들어, 갊으로써 입자로 전혀 전환되지 않는다. 본 발명에 따른 가교 방법은 따라서 하이알루론산의 젤과 같이 가교되는 가교 입자를 가지게 할 가능성을 주지 않는다.
본 발명의 일 구체예에 따라서, 부분적으로 가교된 하이알루론산의 제2 수성상은 부분적으로 가교된 하이알루론산의 제1 수성상보다 더 큰 부분적 가교도를 가진다. 이러한 상세사항은 상기 제1 상 내에서 더 강하게 가교된 제2상의 혼합을 용이하게 할 수 있게 한다.
"부분적 가교도"는 어떤 상을 다른 상과 혼합하기 직전에 그 상의 가교도를 의미한다; 가교도는 오로지 부분적인데 이것이 상들의 혼합하는 동안 가교의 진행이 연속되기 때문이다. 이러한 가교 수준은 가교도를 실험적으로 측정하고 이를 가교의 최대 이론치와 비교함으로써 각 연관 상에 대하여 결정될 수 있다 (이는 도입된 가교 제의 몰수 및 가교할 수 있는 능력을 가진 폴리머 단위체의 몰수의 비율을 평가함으로써 계산될 수 있다). 가교도는 예를 들어, Kenne 등에 의해 설명된 방법(Kenne 등, Modification and cross-linking parameters in hyaluronic acid hydrogels - definitions and analytical methods, Carbohyr. Polym. 2013, 91:410-418)을 사용하여, 간접적으로 (예, 배출력을 측정함으로써, 참조 실시예 2) 또는 직접적으로 (예, 핵자기공명 분광분석법 (NMR)에 의해) 실험적으로 평가될 수 있다.
따라서, 일반적으로, 부분적으로 가교된 상의 "부분적 가교도"는 90% 미만 (이론적으로 계산된 최대 가교도의), 70% 미만, 50% 미만, 30% 미만, 또는 10% 미만이다.
본 발명의 일 구체예에 따라서, 하이알루론산의 농도 C2는 농도 C1이상이다. 이러한 상세한 사항은 상기 더 강하게 농축된 제2 상이 제1 상 내에서 혼합되는 것을 용이하게 할 뿐 아니라, 제1 상 내에서 상기 제2 상이 더 크게 팽창될 수 있도록 하게 한다 (하이알루론산은 물에서 팽창될 수 있는 능력이 있고 농축되어 있기 때문에 더 그러하다). 이것은 다음 제1항 내에서 제2 상의 폴리머 사슬을 얽히게 함으로써 입체적으로 최대로 "박혀있게 하는 것"을 촉진할 수 있게 하고 및 제1 및 제2 상의 폴리머 사슬들을 묶을 가교 반응을 촉진하게 하는 데, 이러한 사슬이 물리적으로 더 가깝고 따라서 이러한 사슬들을 연결하는 반응의 효율이 더 좋기 때문이다.
본 발명의 일 구체예에 따라서, 제1 상에 대한 것보다 제2 상에 대하여 더 큰 부분적 가교도를 얻기 위해 가교제의 양 Q2는 양 Q1 이상이다.
본 발명의 일 구체예에 따라서, 제1 상보다 제2 상에 대하여 더 큰 부분 가교도를 얻기 위해, 가교 온도 T2는 온도 T1 이상이다. 가교 온도 Tm은 그 자체가, T2보다 커서 제1 및 제2 상이 공유 결합을 통해 결합되게 하는 가교 반응의 효율을 최대화시킨다.
본 발명의 일 구체예에 따라서, 제1 상에 대한 것보다 제2 상에 대하여 더 큰 부분 가교도를 수득하기 위해 가교 시간 t2은 시간 t1 이상이다. 가교 시간 tm은 그 자체가, 시간 t1 및 t2보다 길거나 같거나 및 모자랄 수 있다. 이러한 반응 시간 tm은 상기 적어도 두 개 상의 혼합물의 가교를 이루는 데 선택된 온도 Tm에 의존한다.
상기 혼합물을 제조하는 동안, 제1 및 제2 상의 양은 동일하거나 다를 수 있다. 상기 혼합하는 동안, 본 발명에 따라 수득된 하이드로젤에 부여하는 것이 바람직한 특성에 따라, 하나의 상이 다른 것에 비해 적절하게 더 존재하여야 하고, 따라서 이러한 상이 다른 것에 대하여 더 많은 양으로 사용되어야 한다. 따라서, 기계적/유동학적 관점에서, 가장 높은 가교도를 가지는 상은 더 낮은 가교도를 가진 상에 대하여 본 발명에 따른 젤에 주된 탄성과 잔류 특성을 부여한다. 한편, 최저의 가교도를 가지는 상은 이러한 상에 더 작은 배출력을 부여하고 따라서 생성물이 주입되는 것을 더 쉽게 한다. 본 발명에 따른 하이드로젤을 사용하면, 기계적/유동학적 잔류시간 및 주사성 특성에 있어서, 결과되는 특성에서 상승작용이 있다. 이러한 상승작용은 서로에 대해 상호적으로 작용하는 두 개 매개변수가 최적화되기 때문에 얻어진다: 상기 상들 중 하나의 낮은 가교도로 인해 하이드로젤이 주사성은 물론 응집 및 전체적인 유연성이 더 좋게 되고 및 잔류시간과 탄성이 줄어들고 반면 다른 상의 강한 가교도로 인해 잔류시간, 탄성의 편에서 더 향상된 점탄성을 촉진하고, 반대로 주사성, 응집 및 유연성을 감소시킨다. 이러한 상승작용은 따라서, 가교된 폴리머 입자들을 포함하는 조성물에 대해 이전에 설명된 단점들을 피하면서 이들의 단점들을 최소화 시킴으로써 상이한 구성 상들 각각의 장점을 조합하는 가능성을 제시한다. 상기 하이드로젤 내의 각각의 가교된 상의 비율을 최적화함으로써 용이하게 주사할 수 있는 생성물을 얻을 수 있게 하며, 이를 사용하여 주사성, 기계적/유동학적 특성 및 잔류시간에 있어 미용 또는 의료에서의 처치에 요구되는 상이한 필요를 충족시킬 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따라서, 부분적으로 가교된 상이한 상들의 혼합물의 가교는 정제하여 잔류 미반응 가교제를 제거함으로써 중지된다. 이러한 정제는, 예를 들어, 투석조를 사용하거나 흐르는 물에 세척하는 것과 같이, 당해 분야에 숙련자에게 공지된 기술에 따라 수행된다. 바람직하게는, 등가 삼투 용액을 사용하고 적절한 pH를 부여함으로써 투석에 의한 정제가 선택된다. 상기 부분적으로 가교된 상이한 상들의 혼합물의 가교반응의 끝에 및 젤 정제 단계 전에, 가교가 염기성 매체에서 수행될 때 산을 첨가함으로써 및 가교가 산성 매체에서 진행될 때 염기를 첨가함으로써 당해 분야에 공지된 표준 방법에 따라, 수득한 젤을 중성화하는 것이 바람직하다.
본 발명은 하이알루론산 또는 이의 염들 중 하나, 특히 나트륨, 칼슘, 아연, 칼륨염과 같은 생리적 허용 염, 바람직하게는 나트륨 염을 가교하는 것을 다룬다. 하이알루론산은 동물 유래일 수 있거나 세균 발효에 의해 얻을 수 있다. 이는 수 Da 내지 수백만 Da, 바람직하게는 약 0.1 내지 4 백만 Da의 분자량을 가질 수 있다.
본 발명은 또한 하이알루론산과 조합된 다른 생체적합성 폴리머들의 가교에 관한 것이다. 천연 또는 합성된 이러한 폴리머들은 이들이 가교되게 하는 화학적 관능기를 가지고 있어야 하며 생물학적 유체나 조직들과 접촉될 수 있게 되도록 생체적합성이어야 한다. 예를 들어, 다당류, 폴리에스터류, 폴리안하이드라이드류, 폴리포스파젠류, 폴리ε카프로락톤, 폴리락트산 및 이의 유도체, 폴리비닐 산류, 폴리아크릴아마이드류, N비닐 피롤리돈 및 아크릴 폴리머류 및 생물학적 허용 유도체들이 언급될 수 있다.
상기 가교 반응들은 산성 또는 염기 매체, 바람직하게는 8 내지 13 사이의 pH를 가지는 염기성 매체의 수용액에서 수행된다.
상기 상이한 가교 반응에 관여하는 가교제들은 동일하거나 상이할 수 있다. 이러한 것들은 일반적으로 상이한 유형의 이중- 또는 다중-관능성 가교제일 수 있고 및 예를 들어, 디비닐설폰, 이중 또는 다중 관능성 에폭사이드류, 카보디이미드류 및 포름알데하이드류의 군으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 이중- 또는 다중-관능성 에폭사이드류의 군으로부터 선택된 제제이고, 특히 1,4-부탄디올디글리시딜에테르 (BDDE), 디에폭시옥탄 또는 1,2비스-(2,3에폭시프로필)-2,3에틸렌이다. BDDE이 수행될 가교 반응들 각각에 대해 가장 특별히 바람직하다.
상기 가교 온도는 일반적으로 약 15℃ 내지 60℃다. 이것은 부분적으로 가교된 상들에 대하여 바람직하게는 35℃ 미만이고 및 부분적으로 가교된 상이한 상들의 혼합물의 가교에 대하여45℃ 이상이다.
가교 시간은 일반적으로 수 시간, 유리하게는 1 시간 내지 12 시간이다.
상기 부분적으로 가교된 상이한 상들의 혼합물을 가교하는 것은 2 개 상으로 수행되지만, 상이한 부분 가교도를 가지는 2개 이상의 상을 사용하여 수행될 수 있다.
가교될 혼합물 내의 각각의 부분적으로 가교된 상의 무게비는 특히, 선택된 온전한 조성물, 상이한 관련 상들의 부분적 가교도, 및 그 후 모색되는 최종 특성에 따라 강하게 변할 수 있다. 일반적으로, 상기 혼합물에서, 최대 부분적 가교도를 가지는 상의 중량비는 상기 혼합물의 상이한 상들의 총 질량의 약 0.1 내지 99.9 %이고, 약 5 내지 95%이고, 10 내지 90%, 20 내지 80%, 30 내지 70%, 40 내지 60%, 또는45 내지 55%이다.
본 발명에 따른 가교 방법은 선행 기술에 설명된 것들과 상이하다. 이러한 방법들의 어느 것도 가교하는 동안, 하이알루론산 및 조건적으로, 이미 부분적으로 가교된 다른 생체적합성 폴리머들의 적어도 2개 수성상을 혼합한 후, 가교반응을 지속시켜, 상기 가교 방법의 단계 중에, 가교된 하이알루론산 또는 이의 염의 입자, 또는 임의의 다른 폴리머 입자를 제조하고 및/또는 첨가하는 것 없이, 공유 결합을 통해 상기 적어도 2 개 상을 결합하는 것을 포함하지 않는다.
본 발명에 가장 근접한 것으로 간주되는 선행 기술의 관련 문서는 다음과 같다:
- 특허 출원번호 WO　97/04012는 하이알루론산일 수 있는 다당체에 대한 특정 가교 방법을 설명하는 바; 상기 방법은 하기 단계를 포함한다:
o 상기 다당체를 수용액에 넣는 단계,
o 가교제를 첨가하여 가교 반응을 개시하는 단계,
o 가교 반응에 대해 불리한 입체 조건을 형성하는 것으로서, 이러한 조건은 바람직하게는 가교 중에 반응 혼합물을 희석하는 단계, 및
o 상기 가교 반응에 대해 유리한 입체 조건을 재도입하는 것으로서, 이러한 조건은 증발시킴으로써 반응 혼합물을 농축시키는 단계로서 상기 가교반응을 완수한다.
본 발명과는 다르게, 이러한 출원서는 가교하는 동안 부분적으로 가교된 상이한 하이알루론산 상들을 혼합하는 것을 포함하지 않는다. 한편, 본 발명은 가교 반응 동안, 불리한 입체 조건들 (희석과 같은) 및 유리한 입체 조건 (증발과 같은)을 제공하는 것을 특징으로 하지 않는다: 본 발명에 따른 가교는 유리한 조건하에서 수행하여 수율을 최적화시킨다.
- 특허 출원번호 WO　2005/085329는 특정 가교 방법을 설명하는바, 하기 단계를 특징으로 한다:
o 적어도 하나의 소정량의 가교를 개시하는 단계, 및
o 상기 가교 반응을 계속하면서, 500,000 Da 이상의 분자량을 가지는 폴리머의 추가량을 용액에 첨가하고 반응 혼합물을 희석시켜 용액 내의 상기 폴리머의 전체적 농도를 감소시키는 단계.
본 발명과는 달리, 상기 출원은 가교 동안 부분적으로 가교된 상이한 하이알루론산 상들을 혼합하는 것을 포함하지 않는다.
상기 출원은 가교 반응 동안 폴리머를 첨가하는 것을 포함하나, 이 폴리머는 부분적으로든지 전체적으로든지 일차적으로 가교되지 않는다. 한편, 본 발명과는 달리, 이러한 폴리머 첨가는 필수적으로 반응 혼합물의 희석을 동반하게 되고, 불리한 입체적 환경을 제공하는 결과를 낳게 되고 따라서 상기 가교 반응을 효율적으로 지속시키지 않는다.
- 특허 출원번호 FR　2　924　615는 동일하거나 상이한 x 폴리머들이 혼합하기전 가교되고, 이를 균일하게 혼합하는 것을 특징으로 하는 하이드로젤 제조 방법을 설명하고 있다.
본 발명과 달리, 상기 출원은 가교하는 동안 부분적으로 가교된 상이한 하이알루론산 상들을 혼합하는 단계를 포함하지 않는다.
상기 x 폴리머들은 이전에 가교된 것이고 이의 가교 반응은 이들 각각에 대하여 중지된 것으로, 혼합하는 것은 공유 결합을 발생시키지 않고, 이러한 x 폴리머들을 단순히 병치하는 것이다: 이러한 상이한 폴리머들 간에 가교 결합은 없다.
- 특허 출원번호 EP　2　011　816 하기 단계를 포함하는 하이드로젤의 제조 방법을 설명한다:
o 당해 분야의 숙련자에게 공지된 분쇄 기술에 따라 강하게 가교된 제1 다당체의 입자를 제조하여 원하는 입자 크기를 가진 입자를 얻는 단계,
o 이러한 입자들을 현탁하는 단계,
o 적어도 하나의 제2 다당체를 첨가하는 단계, 및
o 상기 적어도 하나의 제2 다당체를 가교도 X2 까지 가교하여 적어도 하나의 제2의 약하게 가교된 다당체를 얻고 상기 적어도 하나의 약하게 가교된 제2 다당체를 상기 입자와 함께 가교하는 단계.
이러한 출원서와는 달리, 본 발명은 가교하는 동안 가교된 입자들을 사용(제조 및/또는 반응 혼합물에 첨가)하지 않는다. 특히, 다음과 같이 본 발명의 가교 방법 동안, 가교된 하이알루론산 입자들을 만들도록 하는 분쇄 단계가 없다:
o 부분적으로 가교된 상의 경우, 가교를 지속하기 위해 이러한 상들을 혼합하기 전, 및
o 부분적으로 가교된 상들을 혼합하기 위해, 가교를 지속하는 동안.
- 특허 출원번호 US　2010/0028435는 특허 출원번호 EP　2　011　816과 유사한 주사가능한 젤을 제조하는 방법을 설명하고 있다.
특허 출원번호 US　2010/0028435의 젤은 하이알루론산의 가교된 입자를 하이알루론산의 젤과 상호 가교시킴으로 얻어진다.
상기 출원서와 달리 (또한 특허 출원번호 EP　2　011　816), 본 발명에 따른 가교 방법은, 상기 가교 방법의 단계들 중에, 하이알루론산 또는 이의 염 중 하나, 또는 임의의 다른 폴리머를 임의로 제조 및/또는 첨가하는 것을 포함하지 않는다. 본 발명에 따른 가교 방법은 따라서 상기 가교된 입자와 하이알루론산의 젤과 상호 가교하지 않는다.
본 발명은 또한, 전술한 가교 방법에 따라 가교된 하이알루론산, 또는 이의 염 중의 하나, 및 조건적으로 다른 생체적합성 폴리머들에 의해 형성된 주사용 하이드로젤을 제조하는 방법에 관한 것이다. 이러한 제조 방법은 적어도 하기 연속 단계들을 포함하는 것을 특징으로 한다:
- 하이알루론산, 또는 이의 염 중의 하나, 및 조건적으로 다른 생체적합성 폴리머들을 전술한 가교 방법에 따라 가교하는 단계,
- 상기 혼합물을 적절한 pH를 가지는 등삼투용액을 사용하여 정제하는 단계,
- 상기 혼합물을 균질화하고 조건적으로 하나 또는 수 개의 다른 생체적합성 폴리머들 및/또는 활성 물질과 같이 유기체에 유익을 제공할 수 있는 하나 또는 수 개 물질을 첨가하는 단계,
- 조건적으로 탈가스화 및/또는 동결건조 하는 단계,
- 주사기 또는 플라스크 또는 임의의 다른 용기에 주입하는 단계, 및
- 멸균하는 단계
본 발명에 따른 주사용 하이드로젤을 주사기에 넣은 후 공지된 임의의 방법으로 및 바람직하게는 오토크래이브하여 멸균하고, 직접 사용 및/또는 판매한다.
본 발명은 또한 전술한 가교 방법에 따라 수득한 하이드로젤에 관한 것이다. 이러한 하이드로젤은 적어도 가교된 하이알루론산 또는 이의 염 중 하나, 및 조건적으로, 다른 생체적합성 폴리머들로 구성되며, 상이한 가교도를 가지는 가교된 하이알루론산의 수 개 상의 혼합물을 특징으로 하며, 상기 상들은 공유결합을 통해 서로 결합된다. 본 발명에 따른 가교 방법에 의해 제조된 하이드로젤은 따라서 공-가교된 입자없이 단일의 "다중구조된" 가교된 상으로 구성된 것을 특징으로 한다.
본 발명의 관점에 따라서, 상기 하이드로젤은 하이알루론산의 유도체에, 즉, 화학적 방식 또는 임의의 다른 방식으로 상기 하이알루론산 분자를 개질한 분자에 기반할 수 있다.
본 발명에 따른 하이드로젤은 바늘을 통해 양호하게 배출될 수 있고 및 따라서 환자에게 통증과 심각한 외상없이 처치될 부위에서 전문가에 의해 용이하게 주사될 수 있다. 이러한 장점은　본 발명에 따른 가교 방법으로부터 나온 "다중구조된" 복합 매트릭스로부터 결과된 것으로서, 생성물 내에 저 가교도를 가지는 상에 의해 유도된 윤활성으로 인하여 더 좋은 주사성을 촉진할 수 있게 한다.
본 발명에 따른 하이드로젤은 공-가교된 입자를 포함하지 않고 이로 구성되지 않는다. 이것은 입자 함유 제품에 비하여 유의하게 향상된 안전특성 (단기 및/또는 중장기에서 더 적은 부작용과 합병증), 및 상기 하이드로젤을 조직 내로 통합/이식하는 향상된 능력 (조직 내에 더 고르게 분포)의 장점을 제공한다.
"다중구조된" 특징으로 인하여, 본 발명에 따른 하이드로젤은 뛰어난 기계적/유동학적 점탄성 (즉, 점성 및 탄성)을 가진다. 본 발명에 따른 하이드로젤 내에 적어도 2개 상이 동일 또는 상이한 비율 및 상이한 가교도로 존재하기 때문에, 이는 전문가가 해부적 상황, 이를 지배하는 생리적 기작, 및, 적용할 수 있다면, 확인된 부족 상태(예를 들어, 광대뼈 주위의 부피감을 주기 위한 강한 탄성)를 보정하도록 하는 필요한 기계적/유동적 특성을 관찰하면서, 원하는 영역을 처리하는 데 그 예상을 충족시키는 데 특정한 기계/유동학적 특성에 대한 필요를 최적으로 충족시킬 수 있게 한다.
본 발명에 따른 하이드로젤은 조직 내에서 "생체 이식"될 수 있는 양호한 능력을 가진다. 이의 "다중구조된" 매트릭스는 조직 내로 상기 생성물을 최적화적으로 주입하게 하는 커다란 유연성을 제공하며, 따라서 주사 후 외상을 제한하고 및 따라서 주사 부위에서 통증과 같은 부작용은 물론 주사 후 염증과 같은 부작용을 제한한다.
상기 하이드로젤의 특정 구조는, 상이한 상들이 서로 공유 결합을 통해 결합되어 있다는 사실을 특징으로 하는바, 또한 분리되지 않는 능력 및 따라서, 특히 처치된 부위의 기계적 스트레스 작용하에, 인접 부위 또는 더 멀리 떨어진 부위로의 이동하지 않는 능력을 향상시킴으로써 투여된 이식물의 안정성을 강화한다.
상기 하이드로젤의 "다중구조된" 매트릭스는 또한 주사가능한 생성물을 유지하면서 높은 가교도를 지닌 상들을 가질 수 있게 하며, 이는 상기 하이드로젤의 더 좋은 잔류 시간을 유도하고 따라서, 미용이나 치료적 처치의 효율을 증대하고, 더구나 의료 또는 외과적 시행당 주입 횟수를 줄일 수 있다.
본 발명의 이식물의 높은 안정성 수준은, 처치될 부위에 의존하여, 적응되고 최적화될 수 있는 기계적/유동학적 및 생체 통합 특성을 부여하는 특정 복합 구조와 연계되어, 유기체에 및 특히 활성 성분 및/또는 세포, 농축된 혈소판, 유전자, DNA 단편물 또는 성장 인자들과 같은 생물학적 실체에 유익을 제공할 수 있는 하나 또는 수개의 물질을 제어된 방출 및/또는 서방에 대하여 우수하게 만든다. 상이한 가교도는 물론 상이한 폴리머 농도를 가지는 상이한 상들이 상기 생성물 내에 존재하기 때문에, 이러한 물질 각각은 상이한 시간에 방출될 수 있고, 따라서 국부적 및 전신적 치료용으로 사용되는 하나 또는 수개의 생물학적 유래의 활성성분이나 화합물의 솔트 아웃 작용 특성을 최적화시킨다.
본 발명에 따른 하이드로젤은 유리하게도, 살아있는 인간이나 동물 유기체의 조직 및/또는 유체 내로 주입함으로써 이식된다.
본 발명에 따른 하이드로젤은 또한 비주사성 형태로 사용될 수 있다. 이 경우, 전문가는 적절한 의료 및/또는 외과적 기구를 사용하여 본 발명의 멸균 생성물을 처치될 부위에 집적함으로써 이식한다.
본 발명에 따른 하이드로젤은 또한, 적절한 제형에 따라서, 예를 들어 피부, 머리털, 손톱, 각막, 이빨, 입술, 내부 또는 외부 점막 및 상처에 국소적 용도의 조성물로서 사용될 수 있다. 이 경우, 처치될 부위에 하나 또는 수개의 유익을 제공할 수 있는 모든 화합물, 예를 들어, 비타민, 항산화제, 수화 분자, 단백질, 약학적 작용을 가지거나 가지지 않은 활성 물질, 세포, 농축 혈소판, 유전자, DNA 단편물 또는 성장 인자와 같은 생물학적 실체물, 착색제, 색소, 향기나는 분자나 방향족 분자와 같은 화합물을 포함할 수 있다. 이러한 화합물들은 상기 하이드로젤에 분산되어 있거나, 상기 하이드로젤의 하나 또는 수개의 폴리머에 결합되어 있거나, 또는 상기 하이드로젤에 분산된 다른 물질 자체에 포함/캡슐화되어 있다.
본 발명의 관점에 따라서, 하이알루론산, 또는 이의 염 중 하나의 총 하이드로젤 농도는 0.01 내지 50 mg/ml이고, 바람직하게는 1 내지 35 mg/ml이고, 유리하게는 8 내지 30 mg/ml이다.
본 발명의 관점에 따라서, 본 발명에 따른 하이드로젤은 부분적으로 또는 전체적으로 동결 건조되어 반고형 또는 분말을 수득한다.
본 발명의 관점에 따라서, 본 발명에 따른 하이드로젤은, 항산화제, 소염제, 방부제, 항균제, 항진균제, 항암제, 국소마취제, 단백질, 호르몬과 같은, 약학적 활성을 가지거나 가지지 않은 천연 또는 합성된 하나 또는 수개의 물질을 단독으로 또는 조합적으로 포함한다. 이러한 활성 물질은 상기 하이드로젤에 분산되어 있거나, 상기 하이드로젤의 하나 또는 수개의 폴리머에 결합되어 있거나, 또는 상기 하이드로젤에 분산된 다른 물질 자체에 포함/캡슐화되어 있다. 후자의 경우, 예를 들어, 소염제와 같은 활성 물질을 폴리락트산 또는 폴리ε카프로락톤으로부터 유래된 폴리머에 기반한 미세구에 캡슐화된 것을 언급할 수 있다.
본 발명의 관점에 따라서, 본 발명에 따른 하이드로젤은 이의 가교된 매트릭스 내에 분산된 리도카인을 포함한다.
본 발명의 관점에 따라서, 본 발명에 따른 하이드로젤은 농축된 혈소판, 유전자, DNA 단편물 또는 성장 인자와 같은 생물학적 유래의 하나 또는 수 개 화합물을 포함한다. 이러한 화합물은 우선적으로는 상기 하이드로젤에 분산되어 있으나, 상기 하이드로젤의 하나 또는 수 개의 폴리머에 결합되거나 또는 상기 하이드로젤에 분산된 다른 물질에 포함/캡슐화될 수도 있다.
본 발명의 관점에 따라서, 본 발명에 따른 하이드로젤은 상기 하이드로젤의 상기 가교된 매트릭스 내에 분산된 폴리머들을 포함한다. 예를 들어, 다당류, 폴리에스테르류, 폴리안하이드라이드류, 폴리포스파젠류, 폴리ε카프로락톤, 폴리락트산류 및 이의 유도체, 폴리비닐산류, 폴리아크릴아마이드류, N비닐 피롤리돈 및 아크릴 폴리머 및 생물학적 허용 유도체의 군으로부터 선택된 폴리머가 거론될 수 있다.
본 발명의 관점에 따라서, 본 발명에 따른 하이드로젤은 상기 하이드로젤의 가교된 매트릭스 내에 분산된 미네랄 물질을 포함한다. 예를 들어, 수산화인회석, 또는 β 트리칼슘 포스페이트와 같은 트리칼슘 포스페이트류를 거론할 수 있다.
본 발명의 관점에 따라서, 본 발명에 따른 하이드로젤은, 환자에 투여 직전에, 유기체에 유익을 제공할 수 있는, 바람직하게는 멸균된 하나 또는 수 개의 다른 물질과 혼합된다. 혼합은 만족스러운 혼합물을 생성하고 및 필요시 멸균성을 유지할 수 있는 하나 또는 수 개의 혼합 기구를 사용하여 적절한 방법에 따라서 최종 사용자, 예를 들어, 전문가나 공인된 요원에 의해 수행된다. 예를 들어, 본 발명에 따른 하이드로젤 및 활성 물질, 생물학적 실체 또는 미네랄 물질과 같은 하나 또는 수 개의 화합물을 하기와 같이 최종 사용자에 의해 혼합되는 것일 수 있다:
- 두 개의 용기 (하나는 본 발명에 따른 하이드로젤이 충진되어 있고 및 다른 하나는 상기 하이드로젤 내에 분산될 화합물로 충진된) 사이를 왔다 갔다 함으로써. 이러한 용기는 예를 들어, 주사기일 수 있다, 및
- 양 쪽 용기 (하나는 본 발명에 따른 하이드로젤로 충전되고 다른 하나는 상기 하이드로젤에 분산될 화합물로 충전된)의 내용물을 동시에 배출하여 환자에 투여하기 전에 다른 용기에서 상기 상이한 화합물들 넣고 및/또는 이들 혼합함으로써.
본 발명은 또한 전술한 가교 방법에 따라 수득한 하이드로젤의 미용 또는 치료 적용으로의 용도에 관한 것이다.
본 발명에 의해 제공되는 장점은 전술한 가교 방법에 따라 얻은 하이드로젤을 미용 및 의료의 많은 부분에 및 특히 하이알루론산에 대하여 문헌에서 이미 언급된 것에 사용할 수 있게 한다 (참조, 예, Volpi 등, Curr. Med. Chem. 2009, 16:171845).
본 발명에 따른 하이드로젤은 따라서 인간 및 동물에서 미용이나 치료 적용에 사용된다. 유리하게는 주입함으로써 환자의 유기체에 이식되는 것이나, 비주사형 형태로 이식될 수도 있고, 이 경우, 처치될 부위에 적절한 의료 및/또는 외과적 장치를 사용하여 전문가에 의해서 집적된다. 최종적으로, 이것은 국소 적용에 의해 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 하이드로젤 특히 하기와 같이 사용된다:
- 부피감을 만드는 것,
- 특정 조직 내에서 공간을 생성하여 이의 최적 작용을 촉진하는 것,
- 생리적 액체나 결손 조직을 치환하는 것,
- 조직의 재생을 자극하거나 촉진하는 것,
- 조직을 보습하고 보호하는 것, 및
- 유기체에 및 특히 활성 성분 및/또는 생물학적 실체에 유익을 공급할 수 있는 물질을 전달하는 것.
예를 들어, 하기 경우에서의 하이드로젤의 사용을 거론할 수 있다:
- 피부의 질을 향상시키거나, 주름을 채우거나 또는 얼굴 (광대뼈, 턱, 입술, 코, ...) 또는 몸의 부피감을 채우기 위한 피부내 또는 피하내 이식성 조성물을 제형화,
- 유기체를 보습하고 및/또는 수화 분자, 단백질, 활성 물질, 생물학적 실체물, 착색제, 색소, 향기나는 분자나 방향족 분자와 같은 상이한 특성의 화합물을 유기체에 공급할 목적의 미용 또는 약용화장품을 제형화,
- 예를 들어, 장기간에 걸쳐 각막을 수화하는 국소 안약 조성물을 제형화,
- 치주 포켓을 채우고 및/또는 치아 주위의 조직의 재생을 자극하는 치과 용도의 국소 또는 이식성 조성물을 제형화,
- 백내장, 녹내장, 노안 또는 유리체의 수술하는 동안 적용할 안내 이식 조성물을 제형화,
- 관절염을 치료하기 위해 결핍된 활액의 점성 보충은 물론 연골의 복원이나 재생의 범위 내에서 정형외과 또는 류마티스 내과에서 적용하기 위한 관절내 이식성 조성물을 제형화,
- 배뇨 또는 배변 장애를 치료하는 데 적용하기 위한 비뇨기과학적 이식성 조성물을 제형화,
- 섬유증을 치료하거나 상처 치료를 개선하기 위한 범위 내에서 의료 및 일반적 외과에서 사용되는 국소 또는 이식성 조성물을 제형화, 및
- 다양한 의료 적용 용도로 적용하기 위한 활성 성분 및/또는 생물학적 실체를 서방 및/또는 제어된 방식으로 방출하는 국소 또는 이식성 약학 조성물을 제형화.
실시예
본 발명은 하기 실시예에 의해 비제한적인 방식으로 설명될 것이다.
소듐 하이알루로네이트, 소듐 카르복시메틸셀룰로즈, 리도카인 하이드로클로라이드, 포스포-칼슘 하이드록시아파타이트 및 본 실시예에서 사용된 다른 화합물들 모두는 고순도이다.
제조된 젤들의 주사성은 1 ml의 유리 주사기(BD Hypak SCF, 1 ml 길이 RF-PRTC)에 포함된 젤을 바늘을 통해 12.5 mm/min 속도로 배출하는 데 필요한 힘 (뉴톤으로)을 측정함으로써 결정되었다.
상기 젤들의 유동학적 특성들은 40 mm의 평면-평면 기하학 및 1000 μm의 간격을 사용하여 AR2000 유동계 (TA Instruments)로 25℃에서 측정되었다.
실시예 1
본 발명에 따른 젤 1의 제조
a) 부분적으로 가교된 상 A의 제조
3.0　MDa와 동일한 분자량 및 13.8%의 습도를 가진 4.70 g의 소듐 하이알루로네이트 (NaHA) 섬유를 칭량하고, 여기에 45.75　g의 1 wt.% NaOH 수용액을 첨가하였다.
상기 섬유의 수화는 스패튤라로 수동으로 균질화할 때 1시간 20분 걸렸다.
1,4부탄디올 디글리시딜에테르 (BDDE)의 용액 1.41 g을 1 wt.% NaOH 용액에 1:5로 희석시켜 상기 반응 매체에 첨가한 후 15분간 수동으로 균질화하였다.
수득한 젤을 세 개 동일한 질량으로 나누어 하기 세 개 분획물을 제조하였다:
- 분획물 1을 30℃의 자동 온도조절 용기에 1 시간 동안 넣은 후 HCl을 함유하는 인산염 완충액으로 희석시켜 20 mg/ml의 NaHA의 농도 및 중성 pH를 얻었다 (= 상 A'). 상 A'를 10분간 기계적으로 균질화하였다 (= 젤 A').
- 분획물 2를 50℃의 자동 온도조절 용기에 2 시간 동안 넣은 후 HCl을 함유하는 인산염 완충액으로 희석시켜 20 mg/ml의 NaHA의 농도 및 중성 pH를 얻었다 (= 상 A"). 상 A"를 10분간 기계적으로 균질화하였다 (= 젤 A").
- 분획물 3을 30℃의 자동 온도조절 용기에 1 시간 동안 넣었다.
A는 상기 수득된 부분적으로 가교된 상으로 한다.
b) 부분적으로 가교된 상 B의 제조
3.0　MDa와 동일한 분자량 및 13.8%의 습도를 가진 5.25 g의 소듐 하이알루로네이트 (NaHA) 섬유를 칭량하고, 여기에 45.75　g의 1 wt.% NaOH 수용액을 첨가하였다.
상기 섬유의 수화는 스패튤라로 수동으로 균질화할 때 1시간 20분 걸렸다.
1,4부탄디올 디글리시딜에테르 (BDDE)의 용액 2.73 g을 1 wt.% NaOH 용액에 1:5로 희석시켜 상기 반응 매체에 첨가한 후 15분간 수동으로 균질화하였다.
수득한 젤을 세 개 동일한 질량으로 나누어 하기 세 개 분획물을 제조하였다:
- 분획물 1을 30℃의 자동 온도조절 용기에 1 시간 동안 넣은 후 HCl을 함유하는 인산염 완충액으로 희석시켜 20 mg/ml의 NaHA의 농도 및 중성 pH를 얻었다 (= 상 B'). 상 B'를 10분간 기계적으로 균질화하였다 (= 젤 B').
- 분획물 2를 50℃의 자동 온도조절 용기에 2 시간 동안 넣은 후 HCl을 함유하는 인산염 완충액으로 희석시켜 20 mg/ml의 NaHA의 농도 및 중성 pH를 얻었다 (= 상 B"). 상 B"를 10분간 기계적으로 균질화하였다 (= 젤 B").
- 분획물 3을 30℃의 자동 온도조절 용기에 1 시간 동안 넣었다.
A는 상기 수득된 부분적으로 가교된 상으로 한다.
c)부분적으로 가교된 상 A 및 B를 혼합하고 및 가교를 지속시킴
9.0 g의 상기 부분적으로 가교된 상 A를 13.0 g의 상기 부분적으로 가교된 상 B에 첨가하고 및 실온에서 15 분간 기계적 혼합을 실시한 후, 50℃의 자동온도 조절 용기에 2 시간 넣었다.
상기 가교된 생성물을 HCl을 포함하는 인산염 완충액에서 pH = 7.0로 중성화시켰고, 여기서, 24 시간 동안 팽창된 후, 인산염 완충액으로 24 시간 투석하여 미반응 BDDE를 제거하였다.
10분간 기계적으로 교반 후, 20 mg/ml의 소듐 하이알루로네이트 농도를 가지는 젤 1을 얻었다.
실시예 2
실시예 1의 젤 1의 특성화
젤 1, A', A", B' 및 B"을 1 ml의 유리 주사기들에 넣고 27G½ 바늘을 통해 12.5 mm/min의 속도로 젤을 배출하는 데 필요한 힘을 하기 표에 나타낸다.
시험된 젤 배출력 (N)
1 23.3
A' 6.1
B' 7.0
A" 6.7
B" 25.1
하기와 같이 나타난다:
- 상기 가교 반응들은 상 A 및 B에 대해 부분적이다. 실제, A" 및 B"의 배출력은 A' 및 B'보다 각각 더 크고, 이는 A' 및 B'보다 더 가교되어 있다는 것을 증명하는 것이고, 및
- 본 발명에 따른 젤 1은 B"의 것보다 더 낮은 배출력을 가지며, 따라서 본 발명에 따른 가교 방법으로 처리되지 않은 젤보다 더 좋은 주사성을 가진다.
젤 1의 1.0 Hz에서의 유동적 점탄특성 G' 및 G"를 또한 측정하였다.
시험된 젤 G' (1.0 Hz), Pa G" (1.0 Hz), Pa
1 96 0.40
실시예 3
본 발명에 따른 젤 2의 제조
a) 부분적으로 가교된 상 C의 제조
약 2.0　MDa의 분자량 및 6.3%의 습도 수준을 가진 4.2 g의 소듐 하이알루로네이트 (NaHA) 분말을 칭량하고, 이에 2.0%의 습도 수준을 가진 0.3 g의 소듐 카르복시메틸셀룰로즈 (42 mPa·s, 2% 수용액, 20℃) 및 33.6 g의 1 wt.% NaOH 수용액을 첨가하였다.
상기 분말의 수화는 스패튤라로 수동으로 균질화할 때 1시간 20분 걸렸다.
H는 상기 수득된 부분적으로 가교된 상으로 한다.
1,4부탄디올 디글리시딜에테르 (BDDE)의 용액 1.80 g을 1 wt.% NaOH 용액에 1:5로 희석시켜 27.0 g의 상 H에 첨가한 후 15분간 수동으로 균질화하고, 상기 반응 혼합물을 50℃의 자동 온도조절 용기에 1시간 30분간 넣었다.
b) 부분적으로 가교된 상 D의 제조
1,4부탄디올 디글리시딜에테르 (BDDE)의 용액 0.10 g을 1 wt.% NaOH 용액에 1:5로 희석시켜 3.0 g의 상 H에 첨가한 후 15분간 수동으로 균질화하고, 상기 반응 혼합물을 50℃의 자동 온도조절 용기에 2시간 넣었다.
c)　부분적으로 가교된 상 C 및 D를 혼합하고 및 가교를 지속시킴
상기 부분적으로 가교된 상 D를 상기 부분적으로 가교된 상 C에 첨가하고 및 실온에서 15 분간 기계적 혼합을 실시한 후, 50℃의 자동온도 조절 용기에 2 시간 30분간 넣었다.
상기 가교된 생성물을 HCl을 포함하는 인산염 완충액에서 pH = 7.0로 중성화시켰고, 여기서, 24 시간 동안 팽창된 후, 인산염 완충액으로 24 시간 투석하여 미반응 BDDE를 제거하였다.
10분간 기계적으로 교반 후, 20 mg/ml의 소듐 하이알루로네이트 농도를 가지는 젤 2를 얻었다.
실시예 4
본 발명에 따른 주사성 제형 1의 제조
실시예 3에서 얻은 젤 2의 질량 25%에, 리도카인 하이드로클로라이드 분말 0.3 wt.%를 첨가하고, 15분간 기계적으로 균질화시켰다.
결과로 얻은 젤을 1 ml 유리 주사기로 도입하였고 그 후 주사기를 121℃에 20 분간 오토클래이브하여 멸균하였다.
실시예 5
본 발명에 따른 주사성 제형 2의 제조
실시예 3에서 얻은 젤 2의 질량 25%에, 30 내지 50 μm이 입자 크기를 가지는 포스포-칼슘 하이드록시아파타이트 분말 30 wt.%를 첨가하고, 15분간 기계적으로 균질화시켰다.
결과로 얻은 젤을 1 ml 유리 주사기로 도입하였고 그 후 주사기를 121℃에 20 분간 오토클래이브하여 멸균하였다.
실시예 6
실시예 4의 주사성 제형 1의 특성화
실시예 4에서 얻은 멸균 제형은 얇은 27G½ 바늘을 통해 용이하게 주사될 수 있는 것으로 발견되었다; 21.3 N의 주사력은 12.5 mm/min 속도에서 측정되었다.
이러한 제형의 pH 및 삼투몰농도는 생리적이다:
- pH = 6.9
- 삼투몰농도 = 290 mOsm/kg H2O
상기 유동학적 특성화는 1.0 Hz의 진동수에서 74 Pa의 탄성 계수 G' 및 0.25의 Tanδ를 결과하게 된다.
이러한 유동학적 특성들은 피부나 피하로 주사할 수 있게 한다는 것이 중요하다.
8 ml의 순수한 물을 포함하는 두 개 10 ml 플라스크 F1 및 F2에 하기를 도입하였다:
- 1 ml의 Restylane® (Galderma Q-Med, Uppsala, Sweden) 젤을 F1에 넣었다; Restylane®은 미용의료계에서 10년 넘게 알려진 20 mg/ml의 가교된 하이알루론산에 기반한 제품이다, 및
- 1 ml의 주사성 제형 1을 F2에 도입.
F1 및 F2를 5 초간 수동으로 교반하였다. 추가로 10초 후에, Restylane® 제품은 물에 완전히 해리되었고 (가교된 하이알루론 입자가 물에 현탁됨), 이는 상기 주사성 제형 1에 대한 경우는 아닌 것으로 물에 항상 젤의 형태로 있는 것으로 나타남. 따라서 주사성 제형 1의 응집성 수준은 Restylane® 제품보다 훨씬 높다.
실시예 7
본 발명에 따른 젤의 생산과 선행 기술 (US 2010/0028435)과의 비교
a) 본 발명에 따른 젤 2의 제조
실시예 3 참조.
b) 미국 특허 출원번호 2010/0028435의 실시예 4에 따른 선행기술 젤 X의 제조
2.0 MDa의 분자량 및 6.3%의 습도 수준을 가지는 3.50 g의 소듐 하이알루로네이트 (NaHA) 분말을 칭량하고 이에 24.0 g의 1 wt.% NaOH 수용액을 첨가하였다.
상기 분말의 수화는 1 시간 걸렸고, 이후 스패튤라로 10분간 균질화하였다.
700 μl의 BDDE를 상기 반응 매체에 첨가한 후 10분간 수동으로 균질화하고, 다음 상기 반응 혼합물을 50℃의 자동 온도조절 용기에 2시간 넣었다.
상기 가교된 생성물을 HCl을 포함하는 인산염 완충액에서 pH = 7.0로 중성화시켰고, 여기서, 24 시간 동안 팽창시켰다 (최종 부피= 92 ml).
수득한 젤을 250 μm의 격자에 연속적으로 통과시켜 입자로 분쇄하였다.
상기 입자를 Xp라고 한다.
약 2.0 MDa의 분자량 및 6.3%의 습도 수준을 가지는 3.50 g의 소듐 하이알루로네이트 (NaHA) 분말을 칭량하고 이에 30.5 g의 1 wt.% NaOH 수용액을 첨가하였다.
상기 분말의 수화는 1 시간 걸렸고, 이후 스패튤라로 10분간 균질화하였다.
263 μl의 BDDE를 상기 반응 매체에 첨가한 후 10분간 수동으로 균질화하고, 다음 상기 반응 혼합물을 50℃의 자동 온도조절 용기에 2시간 넣었다.
상기 가교된 생성물을 Xg라고 한다.
58 g의 입자 Xp 및 24 g의 1 wt.% NaOH 수용액을 상기 가교된 생성물 Xg에 첨가한 후, 스패튤라로 10분간 균질화하고 및 25℃에서 6 시간 가교반응을 지속하였다.
상기 가교된 생성물을 HCl을 포함하는 인산염 완충액에서 pH = 7.0로 중성화시켰고, 여기서, 24 시간 동안 팽창된 후, 인산염 완충액으로 24 시간 투석하여 미반응 BDDE를 제거하였다.
30분간 기계적으로 교반 후, 젤 X를 얻었다.
c) 젤 2 및 젤 X의 제조 공정의 비교
젤 2 및 젤 Y를 1 ml의 유리 주사기에 충진하고 및 27G½의 바늘을 통해 배출하였다 (각 젤에 대해 6 번 시험/작업자에 의한 수동 주사). 젤 2 및 젤 X는 상기 바늘을 통해 용이하게 주사될 수 있었지만, 본 발명에 따른 젤 2는 주사기 내에서 훨씬 더 양호한 균일성을 가지는 것에 주목한다. 사실, 주사하는 동안, 시험하는 작업자는 주사기 플런지에 가해야 할 힘에 대하여 X 젤에서 (본 발명의 젤 2에서는 아닌) 많은 불규칙성을 발견하였다; 불규칙성은 작업자에 의해 "밀어내는 것"으로서 특징된다. 한편, 젤 X에 대해 시험한 6개 주사기 중에서, 두 개는 바늘이 상기 젤에 의해 차단/막혔기 때문에 완전히 배출되지 못하였다 (본 발명에 따른 젤 2의 경우는 아니다).
전술한 바와 같이, 선행기술은 가교된 젤을 입자로 전환하여 생성물의 배출력을 낮추고 따라서 바늘을 통한 주사력을 향상시키도록 교시하고 있다 (강하게 가교된 하이드로젤은 바늘 구멍을 더 잘 통과하는 작은 크기의 입자로 분쇄된다). 놀랍게도, 부분적으로 가교된 상들 (하나는 고도로 가교되었고 다른 하나는 덜 가교된)의 임의의 분쇄 단계로 처리하지 않았으나, 상기 두 개의 부분적으로 가교된 상들을 조합하고 가교한 것으로부터 얻어진 가교된 상을 가지는 본 발명의 젤 2는 용이하게 주사될 수 있고 더 균질한 것으로 나타났다. 본 발명에 따른 복합 "다중구조된" (및 공동-가교 되지 않은) 구조는 생성물을 입자로 전환하도록 분쇄하지 않고, 선행 기술에 설명된 주사성의 문제를 해결할 수 있다.
젤 2 및 젤 X를 제조하는 공정 중에 취한 젤 샘플 상에서 톨루이딘 블루 염색 시험을 실시하여 상기 젤이 입자인지 아닌지를 평가하였다. 이를 위해, 시험될 약 0.1 g의 젤을 유리 슬라이드에 놓고 톨루이딘 블루 수용액 (탈이온수 100g당 0.1 g 톨루이딘 블루) 다섯 방울을 첨가하고, 그 후 제2 유리 슬라이드를 제1 유리 슬라이드에 놓았다. 다음 40X 배율의 현미경으로 관찰하고 화상을 취하였다.
하기의 색깔 시험을 수행하였다:
- 젤 2의 경우: 부분적으로 가교된 상 C와 D (참조 도 1과 2) 및 부분적으로 가교된 상 C와 D (참조 도 3)으로부터 얻은 가교된 생성물에 대하여, 세 개 샘플에 대한 중성 pH로 중성화 후;
- 젤 X의 경우: 입자 Xp (도 4 참조) 및 입자 Xp의 공동-가교화로 얻은 가교된 생성물 (도 5 참조)에 대해, 두 개 샘플에 대한 중성 pH로 중성화 후.
NaHA 가교된 입자들이 명백하게 보이는 도 4 (및 또한 도 5)와는 달리 본 발명의 젤 2에 관한 도 1 내지 3의 젤 구조는 입자성이 아니다. 본 발명의 가교 방법 중에 상기 부분적으로 가교된 상들이 전환되지 않기 때문에, 공동-가교된 NaHA 의 입자를 포함하지 않는 하이드로젤을 얻을 수 있게 된다.
이러한 것은 선행기술 제품, 특히 US 2010/0028435 및 EP　2　011　816에 설명된 제품을 넘어서는 유의한 장점을 나타낸다. 실제, 문헌 및 특허 출원번호 US 2010/0028435와 EP　2　011　816에 설명된 바와 같이, 가교된 입자들은 단기는 물론 장기적으로 부작용과 합병증을 나타낸다 (EP　2　011　816에서, 가교된 입자들은 외부 물질에 대한 다소 강한 반응을 나타내는 것으로 특히 설명되어 있다). 본 발명에서는, 공동-가교된 입자가 부재하여, 생성물이 용이하게 주사될 수 있으면서 더 안전한 특성에 관하여 US 2010/0028435 및 EP　2　011　816에 개시된 발명보다 주된 개선점을 나타낸다.
한편, 이러한 입자와 약하게 가교된 NaHA 매트릭스와의 공동-가교로 인하여 강하게 가교된 입자의 인체 내에서의 이동을 제한하는 것을 청구한다는 것에 유의하는 것이 중요하다. 이것은 단기간에서는 사실일 수 있지만, 약하게 가교된 NaHA의 매트릭스가 재흡수될 때, 고도로 가교된 입자의 이동은 장기간에서는 다시 가능해질 수 있다. 이러한 후자의 요점은, 장기간 동안 공동-가교된 입자의 이동 문제가 나타나지 않는 (본 발명에 따른 하이드로젤은 공동-가교된 입자를 포함하지 않는다) 본 발명에 따른 주사용 하이드로젤의 향상된 안전특성을 확인하여 주는 것이다.
다른 주된 장점은 US 2010/0028435 및 EP　2　011　816로 공지된 공동-가교된 입자의 제품에 비하여 본 발명에 따른 제품의 조직으로의 통합 (생체-통합/생체-이식)성이 더 나은 것이다. 실제, 다양한 과학 출판물 (예, Tran C. 등, In vivo bio-integration of three HA fillers in human skin: a histological study, Dermatology 2014, 228:4754; 또는 Micheels, P. 등, Superficial dermal injection of HA soft tissue fillers: comparative ultrasound study, Dermatol. Surg. 2012, 38:1162-1169)에서 설명된 바와 같이, 입자적, 가교된 NaHA에 기반한 제품(예, US 2010/0028435 및 EP　2　011　816에 설명된 제품)의 피부로의 주사는 비입자성, 가교된 NaHA (본 발명에 따른 하이드로젤과 같이)에 비하여 유의하게 더 불균일적으로 분포되어 있다.
US 2010/0028435 및 EP　2　011　816에 설명된 방법들에 비해, 본 발명에 따른 하이드로젤을 제조하는 방법이 제품 제조에 훨씬 더 짧은 시간을 요한다는 것에 주목하는 것이 중요하다. 본 발명의 젤 2에 대한 제조 시간 (약 55 시간) 및 US 2010/0028435에 따른 젤 X에 대한 제조 시간 (약 85 시간)의 비교는 이러한 점을 설명할 수 있다. 이것은 명백히 경제적인 장점이고, 제조 공정의 시간에 따라 증가하는, 제조하는 동안의 젤의 세균 감염의 위험을 최소화 시킨다.
실시예 8
본 발명에 따른 제의 제조와 선행기술과의 비교 (EP　2　011　816)
a) 본 발명에 따른 젤 2의 제조
실시예 3 참조.
b) 출원번호 EP 2　011　816의 실시예 1에 따른 선행기술 젤 Y의 제조
2.0 MDa의 분자량 및 6.3%의 습도 수준을 가지는 1.00 g의 소듐 하이알루로네이트 (NaHA) 분말을 칭량하고 이에 6.2 g의 1 wt.% NaOH 수용액을 첨가하였다.
상기 분말이 수화하는 데 1 시간 20분 걸렸고, 이후 스패튤라로 10분간 균질화하였다.
0.15 g의 BDDE를 상기 반응 매체에 첨가한 후 10분간 스패튤라로 균질화하고, 다음 상기 반응 혼합물을 50℃의 자동 온도조절 용기에 2시간 30분 동안 넣었다.
상기 가교된 생성물을 탈이온수에 24시간 넣고, 여기서 한 용기당 8 시간씩, 세 개의 연속 용기를 사용하여 미반응 BDDE를 제거하였다.
수득한 젤을 250 μm의 격자에 연속적으로 통과시켜 입자로 분쇄하였다.
상기 입자를 Yp라고 한다.
5.0 g의 입자 Yp를 약 2.0 MDa의 분자량 및 6.3%의 습도 수준을 가지는 0.8 g의 소듐 하이알루로네이트 (NaHA)에 첨가하고, 여기에 2.0 g의 1 wt.% NaOH 수용액을 첨가하였다.
상기 혼합물을 수동으로 30 분간 균질화한 후 0.03 g BDDE를 첨가하고 다시 30분간 균질화 한 후에, 50℃의 자동 온도조절 용기에 2시간 30분간 넣었다.
수득한 가교 생성물을 Yg라고 한다.
상기 가교된 생성물 Yg를 HCl을 포함하는 인산염 완충액에서 pH = 7.0로 중성화시켰고, 여기서, 24 시간 동안 팽창된 후, 인산염 완충액으로 24 시간 투석하여 미반응 BDDE를 제거하였다.
30분간 기계적으로 교반 후, 젤 Y를 얻었다.
c) 젤 2 및 젤 Y의 제조 공정의 비교
실시예 7에서와 같이, 젤 2 및 젤 Y를 1 ml의 유리 주사기에 충진하고 및 27G½의 바늘을 통해 배출하였다. 상기 두 개 젤들은 상기 바늘을 통해 용이하게 주사되었고 실시예 7과 관련하여 설정된 것과 동일한 언급이 적용된다: 본 발명에 따른 젤 2는 상기 바늘을 통한 주사가 젤 Y의 것보다 더 균일하기 때문에 더 균일한 것으로 나타났다. 놀랍게도, 그 주사성을 용이하게 하기 위해 입자로의 분쇄 처리되지 않은 본 발명의 젤 2이지만, 젤 2의 복합 "다중구조된" 구조는 강하게 가교된 상을 입자로 전환시키는 단계로 처리된 젤 Y의 것과 동일하게 적은 배출력을 나타낸다.
실시예 7에서와 같이, 젤 2 및 젤 Y를 제조하는 공정 중에 취한 젤 샘플 상에서 톨루이딘 블루 염색 시험을 실시하였다.
하기의 색깔 시험을 수행하였다:
- 젤 2의 경우: 부분적으로 가교된 상 C와 D (참조 도 1과 2) 및 부분적으로 가교된 상 C와 D (참조 도 3)으로부터 얻은 가교된 생성물에 대하여, 세 개 샘플에 대한 중성 pH로 중성화 후;
- 젤 Y의 경우: 입자 Yp (도 6 참조) 및 입자 Yp의 공동-가교화로 얻은 가교된 생성물 (도 7 참조)에 대해, 두 개 샘플에 대한 중성 pH로 중성화 후.
결론은 실시예 7의 것과 같다. NaHA 가교된 입자들이 명백하게 보이는 도 6 (및 또한 도 7)과는 달리 본 발명의 젤 2에 관한 도 1 내지 3의 젤 구조는 입자성이 아니다.
그러므로, 본 발명은 가교 공정 동안 입자를 형성하도록 분쇄(부분적 또는 전체적)하지 않더라도, 용이하게 주사용 하이드로젤을 얻게 할 수 있다. 따라서, 본 발명에서는, 상기 젤에서의 공동-가교된 입자의 부재로 인하여 유의한 향상이 얻어진다 (EP　2　011　816에서 수득된 젤에 비해):
- 단기 및 장기간의 안전특성이 향상되는바, 특히 EP 2 011 816에서와 같이 장기간 동안 고도로 가교된 입자의 이동이 없다;
- 공동-가교된 입자가 없기 때문에 조직 내로 상기 젤의 생물적-통합이 향상된다 (더 균일하게 분산됨).
최종적으로, 실시예 7에 나타난 바와 같이, 본 발명에 따른 젤의 제조는 제조 공정이 EP 2 011 816에 나타난 것보다 유의하게 빠르고 (본 발명에 따른 젤에 대하여는 약 55 시간, EP 2 011 816에 따른 젤에 대하여는 83 시간), EP 2 011 816에서 요구된 바와 같은 복잡하고 까다로운 하나 또는 수 개의 분쇄 단계를 요하지 않기 때문에 경제적 장점이 있고 입자 및 세균 감염의 위험을 최소화시킨다.

Claims (27)

  1. 하이알루론산 또는 이의 염 중의 하나를 가교하거나, 하이알루론산 또는 이의 염 중의 하나와 다른 생체적합성 폴리머들을 가교하는 신규한 방법으로서, 적어도:
    a)
    - 하이알루론산 또는 이의 염 중 하나를 수용액에 첨가하거나, 하이알루론산 또는 이의 염 중 하나 및 다른 생체적합성 폴리머들을 수용액에 첨가하여 C1 농도의 하이알루론산을 수득하고,
    - 가교제를 Q1 양으로 첨가하고,
    - 가교 반응의 온도 T1 및 시간 t1을 조절하여 하이알루론산을 부분적으로 가교하거나, 하이알루론산과 다른 생체적합성 폴리머들을 부분적으로 가교시키는 것을 특징으로 하는,
    부분적으로 가교된 하이알루론산 또는 부분적으로 가교된 하이알루론산과 다른 생체적합성 폴리머의 제1 수성상을 제조하는 단계로서,
    부분적으로 가교된 하이알루론산 또는 부분적으로 가교된 하이알루론산과 다른 생체적합성 폴리머의 제조된 제1 수성상은 입자로 전환되지 않는 단계,
    b)　
    - 하이알루론산 또는 이의 염 중 하나를 수용액에 첨가하거나, 하이알루론산 또는 이의 염 중 하나 및 다른 생체적합성 폴리머들을 수용액에 첨가하여 C2농도의 하이알루론산을 얻고,
    -　가교제를 Q2 양으로 첨가하고,
    - 가교 반응의 온도 T2 및 시간 t2를 조절하여 하이알루론산을 부분적으로 가교하거나, 하이알루론산과 다른 생체적합성 폴리머들을 부분적으로 가교시키는 것을 특징으로 하는,
    부분적으로 가교된 하이알루론산 또는 부분적으로 가교된 하이알루론산과 다른 생체적합성 폴리머의 제2 수성상을 하나 이상 제조하는 단계로서,
    부분적으로 가교된 하이알루론산 또는 부분적으로 가교된 하이알루론산과 다른 생체적합성 폴리머의 제조된 하나 이상의 제2 수성상은 입자로 전환되지 않는 단계,
    c) 상기 하나 이상의 제2 수성상을 상기 제1 수성상에 첨가한 후 상기 적어도 두 개 상의 혼합물을 제조하는 단계, 및
    d) 가교 반응의 온도 Tm 및시간 tm을 조절함으로써, 상기 제조된 혼합물의 가교를 계속하는 단계를 포함하며,
    상기 가교 방법은 상기 가교 방법의 단계 a, b, c 및 d 의 실시 중에 가교된 하이알루론산 입자 또는 이의 염 중 하나, 또는 임의의 다른 폴리머를 첨가하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 제조된 제2 수성상은 상기 제1 수성 상보다 더 높은 부분 가교도를 갖는 것 및 상기 하이알루론산 농도 C2는 농도 C1이상인 것 중 하나 이상을 만족하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 가교제 양 Q2는 양 Q1 이상인 것, 상기 가교 온도 T2는 온도 T1이상인 것 및 가교 온도 Tm은 온도 T2보다 더 큰 것 중 하나 이상을 만족하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 가교 시간 t2는 시간 t1 이상인 것 및 상기 혼합물 내에서의 제1 및 제2 수성상 각각의 질량은 동일하거나 상이한 것 중 하나 이상을 만족하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 상기 혼합물의 가교는 수용액으로 희석시키는 것 및 투석에 의한 정제를 수행하여 미반응 가교제를 제거하는 것 중 하나 이상을 수행함으로써 중지되는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 가교 반응은 이중- 또는 다중-관능성 에폭사이드류, 디비닐설폰, 카보디이미드류 또는 포름알데하이드류의 군으로부터 선택되는 하나 또는 수 개의 다중관능성 가교제의 작용에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 하이알루론산의 염은 나트륨, 칼슘, 아연, 또는 칼륨염인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 하이알루론산, 또는 이의 염 중의 하나는 0.1 내지 4 백만 Da의 분자량을 가지는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 하이알루론산은 하이알루론산의 유도체 및 하이알루론산 분자를 개질하여 얻은 분자인 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 주사용 하이드로젤을 제조하는 방법으로서,
    - 혼합물을 얻기 위하여 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 방법에 따라 하이알루론산 또는 이의 염 중의 하나를 가교하거나, 하이알루론산 또는 이의 염 중의 하나와 다른 생체적합성 폴리머들을 가교하는 단계,
    - 상기 혼합물을 등-삼투용액을 사용하여 정제하는 단계,
    - 상기 혼합물을 균질화하거나, 하나 또는 수 개의 다른 생체적합성 폴리머들 및 유기체에 유익을 제공할 수 있는 하나 또는 수 개 물질 중 하나 이상을 첨가하여 균질화하는 단계,
    - 주사기 또는 플라스크 또는 임의의 다른 용기에 주입하는 단계, 및
    - 멸균하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항의 방법에 의해 얻어진 하이드로겔로서, 적어도 가교된 하이알루론산 또는 이의 염 중 하나, 또는 적어도 하이알루론산 또는 이의 염 중 하나와 다른 생체적합성 폴리머들이 가교되어 구성되는 하이드로겔로 이루어지는데, 상기 하이드로겔은 상이한 가교도를 가지는 수 개의 가교된 하이알루론산 상들의 혼합물인 것을 특징으로 하는 하이드로젤.
  12. 제11항에 있어서,
    항산화제, 소염제, 방부제, 항균제, 항진균제, 항암제, 국소마취제, 단백질, 호르몬, 국소 마취제, 생물학적 실체를 포함하는 약학적 활성을 가지거나 가지지 않은 하나 또는 수개의 물질을 단독으로 또는 조합적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 하이드로젤.
  13. 제11항에 있어서,
    하이드로젤은 이의 가교된 매트릭스 내에 분산된 리도카인을 포함하는 것 및 상기 매트릭스 내에 분산된 하나 또는 수 개의 미네랄 물질을 포함하는 것 중 하나 이상을 만족하는 것을 특징으로 하는 하이드로젤.
  14. 제 10 항의 방법으로 제조된 주사용 하이드로겔을 포함하는 주사기.
  15. 제형화를 위한 유효성분으로 제 11 항의 하이드로겔을 포함하는 미용 또는 치료적 적용을 위한 조성물.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 c)에서, 상기 혼합물은 가교제를 Qm의 추가량으로 더 첨가하여 제조되는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제6항에 있어서,
    상기 가교 반응은 1,4부탄디올디글리시딜에테르 (BDDE)의 작용에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는, 방법.
  18. 제 10 항에 있어서,
    상기 균질화하는 단계를 수행한 후 주입하는 단계를 수행하기 전에, 탈가스화 및 동결건조 중 하나 이상이 더 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 제 11 항에 있어서,
    상기 상들은 서로 공유 결합을 통해 결합되어 있고, 하이알루론산 또는 이의 염 중 하나의 총 농도는 0.01 내지 50 mg/ml인 것을 특징으로 하는 하이드로젤.
  20. 제형화를 위한 유효성분으로 제 11 항의 하이드로겔을 포함하는 피부의 질을 향상시키거나, 주름을 채우거나 또는 얼굴 또는 몸의 부피감을 회복하기 위한 피부내 또는 피하내 이식성 조성물.
  21. 제형화를 위한 유효성분으로 제 11 항의 하이드로겔을 포함하는 미용 또는 약용화장 조성물.
  22. 제형화를 위한 유효성분으로 제 11 항의 하이드로겔을 포함하는 안과학에서 적용되는 국소 또는 안내 조성물.
  23. 제형화를 위한 유효성분으로 제 11 항의 하이드로겔을 포함하는 치과학에서 적용되는 국소 또는 이식성 조성물.
  24. 제형화를 위한 유효성분으로 제 11 항의 하이드로겔을 포함하는 정형외과학 및 류마티스학에 적용되는 관절내 조성물.
  25. 제형화를 위한 유효성분으로 제 11 항의 하이드로겔을 포함하는 장애를 치료하는 데 적용하기 위한 비뇨기과학적 이식성 조성물.
  26. 제형화를 위한 유효성분으로 제 11 항의 하이드로겔을 포함하는 섬유증을 치료하거나 상처 치료를 개선하기 위한 범위 내에서 의료 및 일반적 외과에서 사용되는 국소 또는 이식성 조성물.
  27. 제형화를 위한 유효성분으로 제 11 항의 하이드로겔을 포함하는 다양한 의료 적용 용도로 적용하기 위한 활성 성분을 서방 및 제어된 방식 중 하나 이상으로 방출하는 국소 또는 이식성 약학 조성물.
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