JP6491199B2 - ヒアルロン酸の架橋方法；注射用ハイドロゲルの調製方法；得られるハイドロゲル；得られるハイドロゲルの使用 - Google Patents

Description

本発明の目的は、下記の通りである；
−ヒアルロン酸、又はその塩の１つ、及び任意には他の生体適合性ポリマーの架橋方法、
−前記架橋方法に従って得られる注射用ハイドロゲルの調製方法、
−前記架橋方法に従って得られるハイドロゲル、及び
−前記架橋方法に従って得られるハイドロゲルの美容 (aesthetics)及び医学の分野への使用。

ヒアルロン酸は、Ｄ−グルクロン酸及びＮ−アセチルグルコサミンから成る二糖単位の反復により形成される多糖である。その構造は、直鎖状であり、そして何れの種特異性も有さない。ヒアルロン酸は、ヒト及び動物の生存生物に広く分布され、ここでそれは、多くの生物学的機能、例えば水和レベルの制御、又は流体又は組織の粘弾性の維持を果たしている。それは、特に滑膜液、目の硝子体液及び真皮に高濃度で見出される。７０キロのヒトは、約１５ｇのヒアルロン酸を有し、その半分は皮膚に含まれ、この量は加齢と共に減少する。

ヒアルロン酸ゲルは、知られており、そして長年、美容及び医学の分野において使用されて来た。それらのゲルは特に一般的に：
−眼科手術中に、眼内空間を維持し、そして眼の組織を保護するために眼中に、
−関節症の場合、欠損骨膜液を補充し、そして前記生物学的液体の軟骨保護特性を一般的に復元するために、関節中に、
−顔又は身体のしわを埋めるか又は特定領域の量を増加させるために、皮膚中に又は皮膚下に、注射される。

ヒアルロン酸は、生存生物において短い半減期（１週間未満）を有する。美容及び医学における多くの用途の場合、投与される注射用ハイドロゲルは、架橋によって安定化されたヒアルロン酸を含む。それは、インビボにおけるこの多糖の寿命（さらに、レマネンス（remanence）と呼ばれる）をかなり増大させる可能性を提供し、したがって、注射される製品の有効性の期間をかなり増大させる可能性を提供する、したがって、架橋によるこの修飾により、架橋されたヒアルロン酸に基づくハイドロゲルは、数ヶ月にわたって、しわを満たす能力を有する。

ヒアルロン酸に基づく注射可能ハイドロゲルのインビボのレマネンスを高めるために、当業者は、ヒアルロン酸の架橋度を高めることができることを認識しており；しかし分子のこの修飾は、ゲルの粘度の上昇及び従って、針を通してのゲルの押出し、及び結果的に、医師による所望する領域へのゲルの注射の困難性を高める。これは必ず、
−満足する放出力を保持するために、ヒアルロン酸の架橋度 (crosslinking degree)及びインビボでのゲルのレマネンスの制限、又は
−治療される患者への強い痛み、及びまた、注射領域での高い外傷（斑状出血、赤パッチ、炎症、浮腫、等）を生成する、この針を通してのゲルの押出しのために必要とされる放出力を低めるために、より大きな直径の針の使用のいずれかを意味する。

多くの解決策がこの問題を克服するために提案されており、すなわち研究者は、適切なレマネンス及び粘度、及び従って、針を通してのゲルの押出しのための満足するレベルを有する注射用製剤の提供を探求している。

例えば次のものから製造されることが言及されている：
− 一般的に粉砕により、架橋されたゲルを粒子に崩壊することにより得られる架橋ヒアルロン酸の粒子に基づく製剤；種々の調製方法が、国際公開第９７／０４０１２号出願の場合のように、このタイプの製剤を得るために記載されており、
− 国際公開第２００５／０８５８２９号出願に記載される特定の調製方法からの異なった架橋アイデンティディーを含む架橋されたヒアルロン酸に基づく製剤、
− お互い架橋されていない、すなわち共有結合を介してお互い結合されていない架橋されたゲルの架橋されたヒアルロン酸含有混合物に基づく製剤；それらの製剤は、フランス特許出願第２９２４６１５号に記載される特定の調製方法に従って得られ、及び
− 架橋されたヒアルロン酸のマトリックスと共に架橋される、架橋されたヒアルロン酸の粒子から成る、架橋されたヒアルロン酸に基づく製剤；それらの製剤は、欧州特許出願第２０１１８１６号又は米国特許出願第２０１０／００２８４３５号に従って、調製される。

しかしながら、それらの解決策は完全には満足できるものではない。

国際公開第９７／０４０１２号出願は、粒子の形での多糖類（ヒアルロン酸であり得る）に基づく製品を得る可能性を付与する特定の製造方法を記載する。文献においては「二層ゲル」とも呼ばれる、架橋されたヒアルロン酸に基づく粒状ゲルは、潤滑現象による放出を促進する可能性を付与する、架橋されていないヒアルロン酸の溶液に分散される、約２００μｍ〜１，０００μｍの直径を有する粒子の存在により特徴づけられる。それらのゲルは、針を通してのゲルの押出しが、特に大きな直径粒子を含む製品に関して、不規則である限り、完全には満足できるものではなく；ここで、担体の役割を演じる非架橋ヒアルロン酸に基づく溶液は、インビボで急速に再吸収され、ここで前記溶液は所望する効果の少なくとも部分的損失（特に、生成量に専用される製品の注射後の日での充填損失）を包含し；そして最終的に、製品の安全性プロフィールは、異物に対する応答を促進し、そして／又は治療される領域の機械的作用下でそれらの粒子の移動を発生する任意の粒子を含まないヒアルロン酸に基づくゲルよりもあまり良好ではない（すなわち、高いレベルの二次効果を生む）。

国際公開第２００５／０８５３２９号出願は、特定量の少なくとも１つのポリマー（ヒアルロン酸であり得る）の架橋を開始するための工程により、及び次に、架橋反応を続けながら、溶液中、ポリマーのグローバル濃度を低めるために、反応混合物の希釈により、溶液中、５００，０００Ｄａ以上の分子質量を有する、追加量のポリマー（ヒアルロン酸であり得る）を添加することにより、特徴づけられる。この溶液は、ヒアルロン酸の効果的架橋を有する可能性を与えるものではない。実際、追加量のポリマーの添加は、希釈を伴っており、そして従って、反応混合物中のヒアルロン酸濃度の低下を伴う。従って、ヒアルロン酸鎖と架橋剤との間の遭遇の確立は低められ、そして架橋反応は非常に効果的ではない。

フランス特許第２９２４６１５号出願は、同一か又は異なった、それらの混合の前、架橋されたＸポリマー（ヒアルロン酸であり得る）の均質混合物により特徴づけられる製造方法を記載している。混合するとは、Ｘポリマーの並置を意味し、ここで後者のポリマー間での共有結合は生成されない。この解決作は完全には満足できるものではない。なぜならば、ポリマーはお互い結合せず、そして従って、それにより得られるゲルは、そこで非常に有意であり得る機械的応力の作用下で、注射された領域内で解離されるからである。例えば、一定の容積を生成するために唇中に注射される製品の場合が言及され；唇は強い機械的応力を受ける。経験される機械的作用は、移植されたゲルの移動をもたらし、そして従って、治療される領域だけでなくまた、この領域の周囲で二次効果をもたらす。

欧州特許第２０１１８１６号出願は、粒子形での少なくとも１つの第１の強く架橋された多糖ゲル、及び少なくとも１つの弱く架橋された、マトリックス形成多糖ゲルを含む多糖類（ヒアルロン酸であり得る）の注射用ゲルに関し；前記少なくとも１つの第１のゲルは、前記少なくとも１つの第２のゲルに、共有結合を通して結合される。国際公開第９７／０４０１２号出願からの製品とは異なって、強く架橋された粒子は、弱く架橋された多糖マトリックスに結合され；従って、粒子の移動は、短期及び／又は中期、この溶液により強く制限されるが、しかし長期ではそうではない（弱く架橋された多糖が組織中に再吸収された後、移動の可能性を従って、強く架橋された粒子の放出が伴う）。従って、この溶液は、強く架橋される多糖粒子を含むので、異物に対して応答の危険性は、製品の粒状性質及びそれらの粒子の高い架橋度のために、有意である（従って、ヒアルロン酸は有意に修飾され、従って、生物による分子の非認識を促進する）。

米国特許第２０１０／００２８４３５号出願は、架橋されたヒアルロン酸マトリックスに同時架橋される、架橋されたヒアルロン酸粒子から構成される、架橋されたヒアルロン酸に基づく製剤の調製方法を開示する。従って、欧州特許第２０１１８１６号について上記に与えられるコメントと同じコメントが準用される。

本発明は、ヒアルロン酸、又はその塩の１つ、又は任意には他の生物適合性ポリマーを架橋するための新規方法を提案することにより、それらの種々の欠点を解決する可能性を与え、ここで前記方法は、下記により特に特徴づけられるハイドロゲルを得る可能性を与える：
− 針を通して押出され、そして従って、患者についてのこの関連する痛み及び有意な外傷を伴わないで、治療されるべき領域に、医師により容易に注射され得る良好な能力、
− 架橋方法の間、粒子へのハイドロゲルの１又は２以上の構成層の非転換（しかし、注射力を一般的に低める粒子の不在にもかかわらず、低い注射力を示す）；製品中での同時架橋された粒子の不在が、有意に改善された安全性プロフィール（短い及び／又は中位／長い期間、少数の副作用及び合併症）、組織中へのハイドロゲルの統合／移植の増強された能力（組織内への製品のより均等な分布）を導き、そして/また、有意に短く、且つ低い複雑性の生成方法（生成法が退屈な製粉工程を必要としないために）をもたらす、
− その解剖学を観察しながら、所望の領域を治療するために彼らの期待を満たすための特定の機械的／レオロジー特性、それを支配する生理学的機構、及び適用できる場合、確認される不足を修正することができるであろう必要な機械的／レオロジー特性を有する製品を医師に提供する可能性を提供する、得られるハイドロゲルの特定構造に起因する注目すべき粘弾性特性、
− 得られるハイドロゲルの特定の「多構造化された（multistructured）」（及び同時架橋された粒子を有さない）構造のために、治療されるべき領域の組織に単純な手段で移植される能力、
− 治療される領域内で解離しない、及び従って、特に機械的応力の作用下で、他の近隣又はそれ以上の遠方の領域に移動しない良好な能力のために、得られるゲルの強化された安全性、
− 「多構造化された」ものとして、それにより、これが適用される場合、活性及び／又は生物学的物質の制御された放出の最適化を可能にすることを特徴とする、得られるハイドロゲルのマトリックスの複雑な構造、
− 美容又は治療処置の効率を拡張し、従って医学的又は外科的処置当たりの投与回数を制限する可能性を与える、得られるハイドロゲルの最適化されたレマネンス。

このためには、本発明の目的は、ヒアルロン酸、又はその塩の１つ、及び任意には、他の生物適合性ポリマーを架橋するための新規方法であり、ここで前記方法は、下記工程を少なくとも含んで成る：
ａ）
−ヒアルロン酸濃度Ｃ１を得るために、水溶液へヒアルロン酸又はその塩の１つ、及び任意に他の生物適合性ポリマーを添加すること、
−量Ｑ１の架橋剤を添加すること、
−架橋反応の温度Ｔ１及び持続時間ｔ１を調節することによって、ヒアルロン酸の部分的架橋を達成すること
により特徴づけられる、部分的に架橋された、ヒアルロン酸の、及び任意に他の生物適合性ポリマーの第１の水層を調製する工程、
ここで部分的に架橋されたヒアルロン酸の調製された第１の水層は粒子には、転換されず；
ｂ）
−ヒアルロン酸濃度Ｃ２を得るために、水溶液へヒアルロン酸又はその塩の１つ、及び任意に他の生物適合性ポリマーを添加すること、
−量Ｑ２の架橋剤を添加すること、
−架橋反応の温度Ｔ２及び持続時間ｔ２を調節することによって、ヒアルロン酸の部分的架橋を達成すること
により特徴づけられる、部分的に架橋された、ヒアルロン酸の、及び任意に他の生物適合性ポリマーの第２水性層を調製する工程、
ここで部分的に架橋されたヒアルロン酸の調製された第１の水層は粒子には、転換されず；
ｃ）前記少なくとも１つの第２の部分的に架橋されたヒアルロン酸層を、前記第１の層に添加し、そして次に、追加量Ｑｍの架橋剤を任意には添加することにより、前記少なくとも２つの層の混合物を生成する工程；及び
ｄ）架橋反応の温度Tｍ及び持続期間ｔｍを調節することにより事前に製造された混合物の架橋を続ける工程。

次に、混合物の架橋反応が、好都合には、水溶液による希釈により、及び／又は精製を行うことによる未反応の架橋剤の除去により停止される。

従って、本発明の架橋方法は、少なくとも部分的に架橋している、ヒアルロン酸及び任意には他の生物適合性ポリマーの少なくとも２つの水層を、架橋の間、混合し、そして次に、前記少なくとも２つの層を、共有結合を通して結合するために、架橋反応を続けることから成る。

「部分的に架橋された」（partly crosslinked）とは、任意には、他の生物的合成ポリマーを含む、ヒアルロン酸の前記少なくとも２つの水層が、ヒアルロン酸及び／又は他の生物適合性ポリマーの新規鎖を架橋するために、架橋剤と反応することができるポリマー鎖でまだ利用できる反応部位を有する事実を意味する。

本発明の架橋方法は、前記架橋方法の工程の間、すなわち上記のような工程ａ、ｂ、ｃ及びｄの間、ヒアルロン酸又はその塩の１つ、又は任意の他のポリマーの架橋された粒子の調製及び／又は添加を包含しないことを特定することが重要である。すべての部分的に架橋された層は、前記架橋方法の間、例えば粉砕により、粒子に転換される時間はない。従って、本発明の架橋方法は、ヒアルロン酸のゲルと一緒に架橋される架橋粒子を有する可能性は与えない。

本発明の実施形態によれば、部分的に架橋されたヒアルロン酸の第２の水層は、部分的に架橋されたヒアルロン酸の第１の水層の部分的架橋度よりも高いその架橋度を有する。この特殊性は、第１の層内での第２のより強く架橋された層の混合を促進する可能性を与える。

「部分的架橋度」（partial corosslinking degree）とは、別の層とのその混合の直前の層の架橋レベルを意味し；架橋レベルは、それはさらに、層の混合の間、架橋を継続して進行するので、単なる部分的である。この架橋レベルは、架橋度を実験的に測定し、そしてそれと架橋の最大理論的値（導入された架橋度のモル数及び架橋能力を有するポリマーのモル数の割合を評価することにより計算され得る）とを比較することにより、関連する各層について決定され得る。架橋度は、直接的に（例えば、放出力の測定により、実施例２を参照のこと）、又は間接的に（例えば、核磁気共鳴分光法（ＮＭＲ）により、例えばKenne et al. (Kenne et al., Modification and cross-linking parameters in hyaluronic acid hydrogels - definitions and analytical methods, Carbohyr. Polym. 2013, 91:410-418)により記載される方法を用いて）、実験的に評価され得る。

従って、一般的に、部分的に架橋された層の「部分的架橋度」は、９０％未満（理論的に計算された最大値の）、又は７０％未満、又はさらに５０％未満、又はさらに３０％未満、又はさらに１０％未満である。

本発明の実施形態によれば、ヒアルロン酸の濃度Ｃ２は、濃度Ｃ１よりも高いか又は等しい。これは特に、第１の層内でのより強く濃縮された第２の層の混合の促進、又は第１の層内での第２の層のより強い膨潤の獲得（ヒアルロン酸は水中で膨潤する能力を有し、従って、その濃度は重要である）の可能性を提供する。次に、これは、第１の層内での第２の層のポリマー鎖の絡み合いによる最大の立体的「包埋」（embedding）の促進、また第１の層及び第２の層のポリマー鎖を結合するのであろう架橋反応の促進の可能性を、それらの鎖の高い物理的近接性及び従って、それらの鎖を架橋するための反応の良好な効率のために、提供する。

本発明の実施形態によれば、架橋剤Ｑ２の量は、第１の層についての部分的架橋度よりも高い、第２の層についての部分的架橋度を得るために、量Ｑよりも多いか又は等しい。

本発明の実施形態によれば、架橋温度Ｔ２は、第１の層についての部分的架橋度よりも高い、第２の層についての部分的架橋度を得るために、温度Ｔ１よりも高いか又は等しい。架橋温度Ｔｍは、第１の層及び第２の層の共有結合を通しての結合を可能にする架橋反応の効率を最大にするために、それ自体、Ｔ２よりも高い。

本発明の実施形態によれば、架橋持続期間ｔ２は、第１の層についての部分的架橋度よりも高い、第２の層についての部分的架橋度を得るために、その持続期間ｔ１よりも長いか又は等しい。架橋持続期間ｔｍは、それ自体、持続期間ｔ１及びｔ２よりも長いか又は等しいか、又はその持続期間未満であり得る。この持続期間ｔｍは、前記少なくとも２つの層の混合物の架橋を達成するために、選択された温度Ｔｍに依存する。

混合物の調製の間、第１の層及び第２の層の質量は、等しくても、異なっていても良い。得られるハイドロゲルに与えることが所望される性質に依存して、本発明によれば、混合の間、１つの層の存在は、他の層に対して、適切に促進され、そして従って、この層のより大きな質量が、他の層に対して使用されるべきである。従って、機械的／レオロジー観点から、最高架橋度を有する層は、低い架橋度を有する層に対する優勢の弾性及びレマネンス特性を、本発明のゲルに付与することが言及されている。他方では、最低架橋度を有する層は、この層に対して低い放出力を与え、そして従って、放出されるべき製品の容易な使用を可能にする。本発明のハイドロゲルに関しては、従って、相乗効果が、機械的／レオロジー、レマネンス及び注射特性の点で得られる性質に観察される。この相乗効果は、お互い相互作用する次の２種のパラメーターの最適化のために得られる：層の１つの低い架橋度がハイドロゲルの良好な注射能力、並びに凝集性及びグローバル柔軟性を促進し、そしてレマネンス及び弾性を低めるが、ところが他の層の強い架橋度は、レマネンス、弾性に有利な、さらに明白な粘弾性性質を促進し、そして反して、注射能力、凝集性及び柔軟性を低める。従って、この相乗効果は、それらの欠点を最少にすることにより、異なった構成層のそれぞれの利点を組合す可能性を与え、さらに架橋されたポリマー粒子を含む組成物について事前に記載された欠点も回避する。従って、ハイドロゲル内の各架橋された層の割合の最適化は、注射能力、機械的／レオロジー性質及びレマネンスの点から、美容又は医学における治療のために示される異なった必要性を満たすことができる容易に注射できる製品の入手の可能性を与える。

本発明の実施形態によれば、種々の部分的架橋層の混合物の架橋は、残留未反応架橋剤を除去するために、精製の達成により停止される。この精製は、当業者に良く知られている技法、例えば透析浴により、又は連続水流での洗浄により行われる。好ましくは、透析による精製は、等浸透圧溶液を用い、そして適切なｐＨを有することにより選択される。種々の部分的架橋層の混合物の架橋反応の最後で、及びゲル精製工程の前、得られたゲルを、当業界において知られている標準方法に従って、架橋が塩基性媒体下で行われている場合、酸の添加により、及び架橋が酸性媒体下で行われている場合、塩基の添加により、中和することが好都合である。

本発明は、ヒアルロン酸、又はその塩、及び特にその生理学的に許容できる塩、例えばナトリウム、カルシウム、亜鉛、カリウム塩、好ましくはナトリウム塩の架橋を扱う。ヒアルロン酸は、動物起源のものであり得るか、又は細菌発酵により得られる。それは、数Ｄａ〜類百万Ｄａ、好都合には約０．１Ｄａ〜４，０００，０００Ｄａの分子質量を有することができる。

本発明はまた、ヒアルロン酸と組合しての他の生物適合性ポリマーの架橋を扱う。天然又は合成起源のそれらのポリマーは、それらの架橋を可能にする化学機能を有すべきであり、そしてそれらは、生物学的流体又は組織と接触させることができるよう、生物適合性であるべきである。例えば、多糖類、ポリエステル、ポリ無水物、ポリホスファゼン、ポリ−ε−カプロラクトン、ポリ乳酸及びその誘導体、ポリビニル酸、ポリアクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン及びアクリルポリマー、及び生物学的に許容できる誘導体のファミリーが言及され得る。

架橋反応は、酸性又は塩基性媒体、好都合には、好ましくは８〜１３のｐＨを有する塩基性媒体中、水溶液下で実施される。前記溶液のｐＨ値は、同一であっても、異なっても良い。

異なった架橋反応に包含される架橋剤は、同一であっても、異なっていても良い。それらは一般的に、種々のタイプの二又は多官能架橋剤であり、そしてそれらは、例えばジビニルスルホン、二又は多官能エポキシド、カルボジイミド及びホルムアルデヒドから選択され得る。好ましくは、二又は多官能エポキシドのファミリーからの剤は、選択された、及び特に１,４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）、ジエポキシ−オクタン、又は１，２−ビス−（２，３−エポキシプロピル）−２,３−エチレンである。ＢＤＤＥの使用が、各実施される架橋反応のために、特に最も好ましい。

架橋温度は一般的に、約１５℃〜６０℃である。それらは好都合には、部分的架橋層の架橋のためには、３５℃未満であり、そして種々の部分的架橋層の混合物の架橋のためには、４５℃以上である。

架橋持続期間は一般的に、数時間、好都合には、１時間〜約１２時間である。

種々の部分的架橋層の混合物の架橋は、優先的には、２層により実施されるが、しかしそれはまた、異なった部分的架橋度を有する２以上の層によっても実施され得る。

架橋される混合物中の各部分的架橋層の重量割合は、特に、選択される組成物、種々の適切な層の部分的架橋度、及びその後、求められる最終特異性に依存して強く変化することができる。一般的に。混合物においては、最高部分的架橋度を有する層の重量割合は、混合物中の異なった層の合計質量の約０．１〜９９．９％、又はさらに、約５〜９５％、又はさらに、１０〜９０％、又はさらに、２０〜８０％、又はさらに３０〜７０％、又はさらに、４０〜６０％、又はさらに、４５〜５５％である。

本発明の架橋方法は、従来技術に記載されるそれらの方法とは異なる。それらの方法の何れも、すでに部分的に架橋されている、ヒアルロン酸及び任意には、他の生物適合性ポリマーの少なくとも２つの水層を、架橋の間、混合し、そして次に、前記架橋方法の工程において、架橋されたヒアルロン酸又はその塩、又は任意の他のポリマーの製品の調製及び／又は添加を伴わないで、前記少なくとも２つの層を、共有結合を通して結合するために、前記架橋反応を継続することから成る架橋を包含しない。

本発明に最も近いと思われる従来技術の関連資料は、以下の通りである：
−国際公開第９７／０４０１２号出願は、ヒアルロン酸であり得る多糖についての特定の架橋方法を記載し；前記方法は、下記工程を含んで成る：
・水溶液中に多糖を入れる工程、
・架橋剤を添加することにより架橋反応を開始する工程、
・架橋反応のための好ましくない立体的条件を導入する工程、ここでそれらの条件は優先的に、架橋の間、反応混合物の希釈であり、及び
・架橋反応のための好ましい立体的条件を再導入する工程、ここでそれらの条件は、架橋反応を完結するために、蒸発による反応混合物の濃縮である。

本発明とは異なって、この出願は、架橋の間、異なった部分的架橋ヒアルロン酸層の混合を包含しない。他方では、本発明は、架橋反応の間、好ましくない立体的条件（例えば、希釈）及び次に、好ましい立体的条件（例えば、蒸発）を提供することにより特徴づけられていない：本発明の架橋は、収率を最適化するために、好ましい条件下で実施される。

−国際公開第２００５／０８５８２９号出願は、下記工程により特徴づけられる特定の架橋方法を記載する：
・特定量の少なくとも１つのポリマーの架橋を開始するための工程、及び
・溶液中、５００、０００Ｄａ以上の分子質量を有する、追加量のポリマーの添加、及び架橋反応を続けながら、前記溶液中、ポリマーのグローバル濃度を低めるために、反応混合物の希釈工程。

本発明とは異なって、この出願は、架橋の間、種々の部分的架橋ヒアルロン酸層の混合を包含しない。

この出願は、架橋反応の間、ポリマーの添加を包含するが、しかしこのポリマーは、部分的に又は全体的に、予備架橋を受けていない。他方では、本発明とは異なって、このポリマー添加は、好ましくない立体的条件を提供する結果を有する反応混合物の希釈により必ず達成され、そして従って、架橋反応の非常に効果的な継続ではない。

−フランス特許第２９２４６１５号出願は、同一か又は異なっている、それらの混合の前、架橋された、ｘポリマーの均質混合により特徴づけられるハイドロゲルの調製方法を記載している。

本発明とは異なって、この出願は、架橋の間、種々の部分的架橋ヒアルロン酸層の混合物を包含しない。前もって架橋されたｘポリマー、及びそれらの個々のために停止された架橋反応物が、共有結合を生成しないで、それらのｘポリマーの単純な並置を得るために、混合され：それらの種々のポリマー間に架橋は存在しない。

−欧州特許第２０１１８１６号出願は、下記工程を含んで成る、ハイドロゲルの調製方法を記載している：
・所望する粒度を有する粒子を得るために、当業者に知られている粉砕技法に従って、第１の強く架橋された多糖の粒子を調製する工程、
・それらの粒子を懸濁する工程、
・少なくとも１つの第２の多糖を添加する工程、及び
・少なくとも１つの第２の弱く架橋された多糖を得るために、前記少なくとも１つの第２の多糖を、架橋度Ｘ２まで架橋し、そして前記少なくとも１つの弱く架橋された第２の多糖と前記粒子とを一緒に架橋する工程。

この出願とは異なって、本発明は、架橋の間、架橋された粒子の使用（反応混合物における調製及び／又は添加）を包含しない。注目すべきは、下記の本発明の架橋方法の間、架橋されたヒアルロン酸粒子の調製を可能にする粉砕工程が存在しない：
・部分的に架橋された層について、それらの層を混合する前、架橋の継続、
・架橋継続の間、部分的に架橋された層の混合。

−米国特許２０１０／００２８４３５号出願は、欧州特許２０１１８１６号の方法に類似する、注射可能ゲルの調製方法を記載する。

米国特許２０１０／００２８４３５号出願からのゲルは、ヒアルロン酸のゲルによる、ヒアルロン酸の架橋された粒子の相互架橋を達成することにより得られる。

この出願とは異なって（また、欧州特許２０１１８１６号出願とも異なって）、本発明の架橋方法は、前記架橋方法の工程の間、ヒアルロン酸、又はその塩の１つ、又は任意の他のポリマーの架橋された粒子の何れの調製及び／又は添加も包含しない。従って、本発明の架橋方法は、ヒアルロン酸のゲルによる、架橋された粒子の相互架橋を可能にしない。

本発明はまた、前述の架橋方法に従って架橋された、ヒアルロン酸、又はその塩の１つ、及び任意には他の生物適合性ポリマーにより形成される注射用ハイドロゲルの調製方法にも関する。この調製方法は、少なくとも次の連続した工程：
−前述の架橋方法に従って、ヒアルロン酸、又はその塩の１つ及び任意には、他の生物適合性ポリマーを架橋する工程、
−適切なｐＨを有する等浸透溶液によって前記混合物を精製する工程、
−１又は数個の生物適合性ポリマー、及び／又は生物に利益を提供することができる１又は数個の物質、例えば活性物質の任意の活性による前記混合物を均質化する工程、
−任意に脱気及び／又は凍結乾燥する工程、
−注射器、又はフラスコ、又は任意の他の密封容器にコンディション化する (conditioning)工程、及び
−殺菌工程、を包含することを特徴とする。

好都合には、本発明の注射用ハイドロゲルは、注射器にコンディション化(conditioned)され、そして次に、直接的使用及び／又はマーケティングのために、それ自体知られている任意の手段に従って、及び好ましくは、オートクレープ処理により滅菌される。

本発明はまた、前述の架橋方法に従って得られるハイドロゲルにも関する。このハイドロゲルは、共有結合を通してお互い結合される、異なった架橋度を有する架橋されたヒアルロン酸のいくつかの層の混合物により特徴づけられる、少なくとも架橋されたヒアルロン酸又はその塩の１つ、及び任意には、他の生物適合性ポリマーから成る。従って、本発明の架橋方法により得られるハイドロゲルは、同時架橋された粒子を有さない、単一の「多構造化された」（multistructured）架橋層から構成されるものとして特徴づけられ得る。

本発明の側面によれば、ハイドロゲルは、ヒアルロン酸の誘導体に基づかれ、すなわち化学的経路又は任意の他の経路を通して、ヒアルロン酸分子を修飾することにより得られる分子に基づかれ得る。

本発明のハイドロゲルは、針を通して押出される良好な能力、及び従って患者に関して、この関連する痛み及び有意な外傷を伴わないで、治療されるべき領域に、医師により容易に注射できる良好な能力を有する。この利点は、低い架橋度を有する層の製剤内での存在により誘発される潤滑性のために良好な注射性を促進する可能性を与える、本発明の架橋方法から生じる「多構造化された」複合マトリックスに起因する。

本発明のハイドロゲルは、同時架橋された粒子を含まず、且つそれらの粒子からも構成されない。これは、粒子含有製品（短期及び／又は中／長期間での少数の副作用及び合併症）、再び組織中へのハイドロゲルの統合／移植の増強された能力（組織への製品のより均等な分布）を提供する。

その「多構造化された」特徴のために、本発明のハイドロゲルは、著しい機械的／レオロジー粘弾性特性（すなわち、粘性及び弾性の）を有する。等か又は異なった割合での、及び異なった架橋度を有する、少なくとも２層の本発明のハイドロゲル内での存在が、その解剖学を観察しながら、所望する領域を治療するために医師の必要性を最適に満たす可能性、それを支配する生理学的機構、及び適用できる場合、確認される不足の修正を可能にする必要とされる機械的／レオロジー特性（例えば、頬骨の周囲に容積を生成するための強い弾力性）を提供する。

本発明のハイドロゲルは、組織において「生物移植」される良好な能力を有する。その「多構造化される」マトリックスは、組織中の製品の最適化された浸透を可能にし、それにより、注射後の外傷の制限及び従って、注射された領域での痛みのような副作用、また任意の注射に続く炎症反応の制限を可能にする高い柔軟性を提供する。

異なった層が共有結合を通してお互い結合されている事実により特徴づけられる、ハイドロゲルの特異的構造はまた、特に、治療される領域の機械的応力の作用下で、解離せず、従って他の隣接するか又は遠隔領域に移動しない製品の能力を改善することにより、投与されたインプラントの安全性の強化を可能にする。

ハイドロゲルの「多構造化された」マトリックスはまた、ハイドロゲルの良好なレマネンス及び従って、美容又は治療処置の効率の拡張を誘発する注射用製品を維持しながら、高い架橋度の層を有し、さらに医学的又は外科的処置当たりの投与の回数を制限する能力も提供する。

治療されるべき領域に依存して適合され、そして最適化され得る機械／レオロジー及び生物統合特性を特に与えられるその特定の複合構造体によりカップリングされる、本発明からのインプラントの高い安全性レベルは、生物に利益を提供することができる１又は数個の物質、及び特に活性物質及び／又は生物学的実体、例えば細胞、富化された血小板、遺伝子、ＤＮＡ断片又は成長因子の制御にされた及び／又は遅延された放出のための最適な製品にする。異なった架橋度だけではなく、また異なったポリマー濃度を有する、製品内での異なった層の存在は、異なった時点でそれらの物質の個々の放出性を有し、そして従って局所又は一般的処置のための１又は数個の活性成分又は生物学的起源の化合物の塩折及び作用プロフィールを最適化する可能性を提供する。

本発明のハイドロゲルは好都合には、ヒト又は動物生体の組織及び／又は体液中に注射により注射される。

本発明のハイドロゲルはまた、非注射可能形でも使用され得る。この場合、医師は、適切な医学的及び／又は外科的器具により、治療されるべき領域で本発明からの滅菌製品を蓄積することにより、それを注射する。

本発明のハイドロゲルはまた、適切な処方に従って、皮膚、毛髪、爪、目の角膜、歯、唇、の内部又は外部粘膜及び傷上への局所使用のために組成物にも使用され得る。この場合、それは、治療されるべき領域に１又は数個の利点を提供するすべての化合物、例えばビタミン、酸化防止剤、水和分子、タンパク質、薬理学的作用を有するか、又は有さない活性物質、生物学的実体、例えば富化された血小板、遺伝子、ＤＮＡ断片又は成長因子、着色剤、色素、臭気分子又は芳香族分子を含むことができる。それらの化合物は、ハイドロゲルに分散されるか、又はハイドロゲルの１又は数個のポリマーにグラフトされ、又はハイドロゲル内に分散される別の材料自体に含まれ／カルセル化される。

本発明の側面によれば、ヒアルロン酸、又はその塩の１つの総ハイドロゲル濃度は、０．０１〜５０ｍｇ／ｍｌ、好ましくは１〜３５ｍｇ／ｍｌ、好都合には８〜３０ｍｇ／ｍｌである。

本発明の側面によれば、本発明のハイドロゲルは、半固体又は粉末を得るために、部分的に又は完全に凍結乾燥される。

本発明の側面によれば、本発明のハイドロゲルは、薬理学的作用を有するか又は有さない、天然又は合成起源の１又は数個の活性物質、例えば酸化防止剤、抗炎症剤、防腐剤、抗菌剤、抗真菌剤、抗癌剤、局所麻酔薬、タンパク質、ホルモンを、単独で又は組合せとして含む。それらの活性物質は、ハイドロゲルに分散されるか、又はハイドロゲルの１又は数個のポリマーにグラフとされ、又はハイドロゲル内に分散される別の材料自体に含まれ／カプセル化される。後者の場合、例として、ポリ乳酸又はポリ−ε−カプロラクトン由来のポリマーに基づくマイクロスフェアへの活性物質、例えば抗−炎症剤のカプセル化を挙げることができる。

本発明の側面によれば、本発明のハイドロゲルは、その架橋されたマトリックス内に分散されるリドカインを含む。

本発明の側面によれば、本発明のハイドロゲルは、生物学的起源の１又は数個の化合物、例えば細胞、富化された血小板、遺伝子、ＤＮＡ断片又は成長因子を含む。それらの化合物はハイドロゲルに優先的に分散されるが、しかしそれらはまた、ハイドロゲルの１又は数個のポリマーにグラフトされるか、又はハイドロゲル内に分散される別の材料自体に含まれる／カプセル化される。

本発明の側面によれば、本発明のハイドロゲルは、ハイドロゲルの架橋されたマトリックス内に分散されるポリマーを含む。たとえば、多糖類、ポリエステル、ポリ無水物、ポリホスファゼン、ポリ−ε−カプロラクトン、ポリ乳酸及びその誘導体、ポリカルボン酸、ポリアクリルアミド、Ｎ−ビニルピロリドン、及びアクリルポリマー、及び生物学的に許容できる誘導体のファミリーからのポリマーを、列挙することができる。

本発明の側面によれば、本発明のハイドロゲルは、ハイドロゲルの架橋されたマトリックス内に分散されるミネラル物質を含む。例えば、ヒドロキシアパタイト又はリン酸三カルシウム、例えばβ−リン酸三カルシウムを挙げることができる。

本発明の側面によれば、本発明のハイドロゲルは、患者への投与の直前、生物に有益性を提供することができる、好ましくは無菌の１又は数個の他の物質と共に混合される。次に、その混合物は、満足する混合の生成及び必要から、無菌性の保持の可能性を提供する１又は数個の混合装置を用いて、適切な方法に従って、最終使用者により、すなわち実施者又は権限を与えられた担当者により実施される。例えば、本発明のハイドロゲル、及び１又は数個の化合物、例えば活性物質、生物学的実体又はミネラル物質の混合を、最終使用者により、下記のようにして行われることが言及され得る：
−２つの容器（１つは本発明のハイドロゲルにより満たされ、そして他の１つはハイドロゲルに分散されるべき化合物により満たされる）間でラウンドトリップを行うことによる、それらの容器は例えば、注射器であり得る；
−患者への投与の前、異なった化合物を一緒にし、そして／又は別の容器でそれらを混合するために、両容器（１つは本発明のハイドロゲルにより満たされ、そして他の１つはハイドロゲルに分散されるべき化合物により満たされる）の内容物を同時に押出すことによる。

本発明はまた、前述の架橋方法に従って得られたハイドロゲルの美容又は治療用途への使用にも関する。

本発明により提供される利点は、美容及び医療への多くの用途のためへの、及びヒアルロン酸についての文献（例えば、Volpi et al., Curr. Med. Chem. 2009, 16:1718-45を参照のこと）にすでに広く記載されているそれらの用途のためへの、前述の架橋方法に従って得られたハイドロゲルの使用を可能にする。

従って、本発明のハイドロゲルには、ヒト又は動物における美容又は治療用途のために使用される。それは、好都合には、注射により患者の生体内に移植されると共に、それはまた、非注射可能形でも移植され得、この場合、それは適切な医学的及び／又は外科的器具により、実施者により治療されるべき領域で蓄積される。最終的に、それは局所適用により使用され得る。

本発明のハイドロゲルは、特に、下記のために使用される：
−容積を満たすために、
−一定の組織内に空間を生成し、それにより、それらの最適な操作を促進するために、
−生理学的液体又は欠損組織を置換するために、
−前記組織の再生を刺激するか又は促進するために、
−組織を保湿し、そして保護するめに、及び
−生物に利点を提供することができる物質、及び特に活性物質及び／又は生物学的実体を送達するために。

例として、次の場合でのハイドロゲルの使用を挙げることができる：
−皮膚の質を改善するか又は顔又は身体のしわを充填するか又は顔又は身体（頬骨、あご、唇、鼻、等）の容積を復元するための皮内又は皮下移植可能組成物の製剤化、
−生物を保湿し、そして／又は生物に異なった性質の化合物、例えばビタミン、酸化防止剤、水和化分子、活性物質、生物学的実体、着色剤、色素、臭気分子又は芳香族分子を提供する目的を有する化粧品又は薬用化粧品の製剤化、
−長期にわたって角膜を水和するための眼科用局所組成物の製剤化、
−歯周ポケットを満たし、そして／又は歯の周囲の組織の再生を刺激するための歯科使用のための局所又は移植可能組成物の製剤化、
−特に、白内障、緑内障、老眼又は障子体の手術の間の適用のための眼内移植可能組成物の製剤化、
−特に、関節症の治療のみならず、また軟骨の骨再構成又は再生のための欠損滑膜液の粘弾性サプリメントの範囲内で、整形外科又はリウマチ学への適用のための関節内移植可能組成物の製剤化、
−失禁の治療への用途のための、泌尿器科での使用のための移植可能組成物の製剤化、 −線維症の治療の範囲内で、又は創傷の治癒を改善するために医学又は一般的外科で使用される局所又は移植可能組成物の製剤化、及び
−種々の医療用途のための活性物質及び/又は生物学的実体の遅延された及び／又は制御された放出を可能にする局所又は移植可能医薬組成物の製剤化。

本発明は現在、次の実施例により、非制限的手段で例示され得る。

ヒアルロン酸ナトリウム、カルボキシメチルセルロースナトリウム、塩酸リドカイン、リン酸化カルシウムヒドロキシアパタイト、及び実施例に使用される他の全化合物は、高純度を有する。

調製されたゲルの注射可能性は、１２．５ｍｍ／分の速度で、所定の針を通して、１ｍｌのガラス製注射器（BD Hypak SCF, 1 ml long RF-PRTC）に含まれるゲルを排出するための必要とされる力（ニュートンでの）を測定することにより決定された。

ゲルのレオロジー特性は、４０ｍｍの平面−平面形状及び１０００μｍのギャップを用いてＡＲ２０００レオメーター（ＴＡ instruments）により２５℃で測定された。

実施例１：本発明のゲル１の調製
ａ）部分的に架橋された層Ａの調製
３．０ ＭＤａにほぼ等しい分子質量及び１３．８％の湿度レベルを有するヒアルロン酸ナトリウム（ＮａＨＡ）線維４．７０ｇを計量し、これに、１重量％のＮａＯＨ水溶液４５．７５ｇを添加した。

前記線維の水和は、スパチュラを用いた規則的な手動的均質化により、１時間２０分、要した。

１重量％のＮａＯＨ溶液により１：５で希釈された１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）の溶液１．４１ｇを、反応媒体に添加し、続いて、手動均質化を１５分間、行った。

このようにして得られたゲルを、３つの平等な塊状物に分け、次の３種の画分を調整した：
−画分１を、３０℃で１時間、恒温浴中に導入し、そして次に、ＨＣｌ含有リン酸緩衝溶液により希釈し、２０ｍｇ／ｍｌの濃度及び中性ｐＨのＮａＨＡを得た（＝層Ａ’）。層Ａ’を、１０分間、機械的に均質化した（＝ゲルＡ’）。
−画分２を、５０℃で２時間、恒温浴中に導入し、そして次に、ＨＣｌ含有リン酸緩衝溶液により希釈し、２０ｍｇ／ｍｌの濃度及び中性ｐＨのＮａＨＡを得た（＝層Ａ''）。層Ａ''を、１０分間、機械的に均質化した（＝ゲルＡ''）。
−画分３を、３０℃で１時間、恒温浴中に導入した。

得られた部分的架橋層をＡとする。

ｂ）部分的に架橋された層Ｂの調製
３．０ ＭＤａにほぼ等しい分子質量及び１３．８％の湿度レベルを有するヒアルロン酸ナトリウム（ＮａＨＡ）線維５．２５ｇを計量し、これに、１重量％のＮａＯＨ水溶液４５．７５ｇを添加した。

前記線維の水和は、スパチュラを用いた規則的な手動的均質化により、１時間２０分、要した。

１重量％のＮａＯＨ溶液により１：５で希釈された１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）の溶液２．７３ｇを、反応媒体に添加し、続いて、手動均質化を１５分間、行った。

このようにして得られたゲルを、３つの平等な塊状物に分け、次の３種の画分を調整した：
−画分１を、３０℃で１時間、恒温浴中に導入し、そして次に、ＨＣｌ含有リン酸緩衝溶液により希釈し、２０ｍｇ／ｍｌの濃度及び中性ｐＨのＮａＨＡを得た（＝層Ｂ’）。層Ａ’を、１０分間、機械的に均質化した（＝ゲルＢ’）。
−画分２を、５０℃で２時間、恒温浴中に導入し、そして次に、ＨＣｌ含有リン酸緩衝溶液により希釈し、２０ｍｇ／ｍｌの濃度及び中性ｐＨのＮａＨＡを得た（＝層Ｂ''）。層Ａ''を、１０分間、機械的に均質化した（＝ゲルＢ''）。
−画分３を、３０℃で１時間、恒温浴中に導入した。

得られた部分的架橋層をＢとする。

ｃ）部分的架橋層Ａ及びＢの組合せ及び架橋の継続
９．０ｇの部分的架橋層Ａを、１３．０ｇの部分的架橋層Ｂに添加し、そして室温で１５分間、機械的混合にゆだね、その後、５０℃で２時間、恒温浴中に浸漬した。

架橋された製品を、ＨＣｌ含有リン酸緩衝液によりｐＨ７．０に中和し、ここで２４時間、膨潤し、そして次に、未反応のＢＤＤＥを除くために、リン酸緩衝溶液により２４時間、透析した。

１０分間の機械的均質化の後、２０ｍｇ／ｍｌのヒアルロン酸ナトリウム濃度を有するゲルを得た。

実施例２：実施例１のゲルの特徴づけ
ゲル１、Ａ'、Ａ''、Ｂ' 及び Ｂ''を、１ｍｌのガラス注射器中に導入し、そして１２．５ｍｍ／分の速度で２７Ｇ１／２針を通してゲルを押出すために必要とされる力を、下記表に示す。

下記の通りに見える：
−架橋反応は、層Ａ及びＢに関して部分的である。実際、Ａ’’及びＢ’’の排出力は、それぞれＡ’及びＢ’のその力よりも強く、このことは、ゲルＡ’’及びＢ’’がＡ’及びＢ’よりも、より架橋されることを実証し、そして
−本発明のゲル１は、Ｂ’’の排出力よりも弱い排出力を有し、そして従って、本発明の架橋方法にゆだねられなかったゲルよりも、良好な注射可能性を有する。

１．０Ｈｚでのゲル１のレオロジー粘弾性特性をまた測定する。

実施例３：本発明のゲル２の調製
ａ）部分的架橋層Ｃの調製
２．０ＭＤａにほぼ等しい分子質量及び６．３％の湿度レベルを有するヒアルロン酸ナトリウム（ＮａＨＡ）粉末４．２ｇを計量し、これに、２．０％の湿度レベルを有するナトリウムカルボキシメチルセルロース（４２ｍＰａ・ｓ、水中、２％、２０℃での）０．３ｇ及び１重量％のＮａＯＨ水溶液３３．６ｇを添加した。

粉末の水和は、スパチュラを用いた規則的手動均質化により、１時間２０分、要した。

得られた水和層をＨとする。

１重量％所ＮａＯＨ溶液により１：５で希釈された１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）溶液１．８０ｇを、２７．０ｇの層Ｈに添加し、次に、スパチュラを用いた手動的均質化を１５分間、行い、続いて、５０℃で１．５時間、恒温浴中にその混合物を導入した。

ｂ）部分的架橋層Ｄの調製
１重量％所ＮａＯＨ溶液により１：５で希釈された１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）溶液０．１０ｇを、上記で得られた層Ｈ３．０ｇに添加し、次に、スパチュラを用いた手動的均質化を１５分間、行い、続いて、５０℃で２時間、恒温浴中にその混合物を導入した。

ｃ）部分的架橋層Ｃ及びＤの組合せ及び架橋の継続
部分的架橋層Ｄを、部分的架橋層Ｃに添加し、そして室温で１５分間、機械的混合にゆだね、その後、５０℃で２．５時間、恒温浴中に浸漬した。

架橋された製品を、ＨＣｌ含有リン酸緩衝液によりｐＨ７．０に中和し、ここで２４時間、膨潤し、そして次に、未反応のＢＤＤＥを除くために、リン酸緩衝溶液により２４時間、透析した。

１０分間の機械的均質化の後、２０ｍｇ／ｍｌのヒアルロン酸ナトリウム濃度を有するゲル２を得た。

実施例４：本発明の注射用製剤１の調製
実施例３で得られたゲル２の塊状物の２５％に、０．３重量％の塩酸リドカイン粉末を添加し、そして機械的均質化を、１５分間、実施した。

このようにして得られたゲルを、１ｍｌの注射器に導入し、そして次に、注射器を、１２１℃で２０分間、オートクレーブにおいて滅菌した。

実施例５：本発明の注射用製剤２の調製
実施例３で得られたゲル塊状物２の２５％に、３０〜５０μｍの粒度を有する３０重量％のリン酸カルシウムヒドロキシアパタイト粉末を添加し、そして機械的均質化を１５分間、実施した。

このようにして得られたゲルを、１ｍｌの注射器に導入し、そして次に、注射器を、１２１℃で２０分間、オートクレーブにおいて滅菌した。

実施６：実施例４の注射用製剤の特徴づけ
実施例４で得られた滅菌製剤は、薄い２７Ｇ1/2針を通して容易に注射できることが見出され；２１．３Ｎの放出力を、１２．５ｍｍ／分の速度で測定した。

この製剤のｐＨ及びオスモル濃度は、下記で生理学的である：
−ｐＨ＝６．９
−オスモル濃度＝２９０ｍＯｓｍ／ｋｇ Ｈ₂Ｏ

レオロジー特徴づけは、７４Ｐａの弾性率及び１．０Ｈｚの周波数で０．２５の誘電正接（Ｔａｎδ）をもたらした。

それらのレオロジー特性は、真皮又は皮下への注射と適合できることを注目することは重要である。

８ｍｌの精製水を含む２つの１０ｍｌのフラスコＦ１及びＦ２に、次の通りに導入した：
− １ｍｌのRestylane（登録商標）(Galderma Q-Med, Uppsala, Sweden)ゲルをＦ１に導入し；Restylane（登録商標）は、美容医学では１０年以上知られている、２０ｍｇ／ｍｌでの架橋されたヒアルロン酸に基づく製品である、そして
− １ｍｌの注射可能製剤１をＦ2に導入した。

Ｆ１及びＦ２を、５秒間、手動的に攪拌した。さらに１０秒後、Restylane（登録商標）製品は、水において完全に解離されることが見出され（水中、架橋されたヒアルロン酸粒子の懸濁液）、これは、水中、ゲルの形で常に存在する注射用製剤１についての場合ではない。従って、注射可能製剤１の凝集性レベルは、Restylane（登録商標）製品のそのレベルによりもはるかに高い。

実施例７：従来技術（米国特許２０１０／００２８４３５号）と本発明のゲルの製造の比較
ａ）発明のゲル２の調製
実施例３を参照のこと。

ｂ）米国特許２０１０／００２８４３５号の実施例４に従っての従来技術のゲルＸの調製
２．０ＭＤａにほぼ等しい分子質量及び６．３％の湿度レベルを有するヒアルロン酸ナトリウム（ＮａＨＡ）粉末３．５０ｇを計量し、これに、１重量％のＮａＯＨ水溶液２４．０ｇを添加した。

粉末の水和は、１時間を要し、続いてヘラによる１０分間の手動的均質化を実施した。

７００μｌのＢＤＤＥを、反応媒体に添加し、続いてヘラによる１０分間の手動的均質化を実施し、その後、５０℃での２時間、恒温浴に浸漬した。

架橋された製品を、ＨＣｌ含有リン酸緩衝溶液によりｐＨ＝７．０に中和し、ここでそれを２４時間、膨潤した（最終体積＝９２ｍｌ）。

このようにして得られたゲルを、２５０μｍのグリッドを通してそれの連続的通過により、粒子に粉砕した。

得られた粒子を、Ｘｐとする。

２．０ＭＤａにほぼ等しい分子質量及び６．３％の湿度レベルを有するヒアルロン酸ナトリウム（ＮａＨＡ）粉末３．５０ｇを計量し、これに、１重量％のＮａＯＨ水溶液３０．５ｇを添加した。

粉末の水和は、１時間を要し、続いてヘラによる１０分間の手動的均質化を実施した。

２６３μｌのＢＤＤＥを、反応媒体に添加し、続いてヘラによる１０分間の手動的均質化を実施し、その後、５０℃での２時間、恒温浴に浸漬した。

得られた粒子を、Ｘｇとする。

５８ｇの粒子Ｘｐ及び２４ｇの１重量％のＮａＯＨ水溶液を、架橋された製品Ｘｇに添加し、続いて、スパチュラを用いた１０分間の均質化及び２５℃での６時間の架橋反応の継続を行った。

架橋された製品を、ＨＣｌ含有リン酸緩衝溶液によりｐＨ＝７．０に中和し、ここでそれを、２４時間、膨潤し、そして次に、末反応ＢＤＤＥを除くために、それをリン酸緩衝溶液により２４時間、透析した。

３０分間の機械的均質化の後、ゲルＸを得た。

ｃ）ゲル２及びゲルＸの生成工程の比較
ゲル２及びゲルＹを、１ｍｌのガラス注射器に充填し、そして２７Ｇ1/2の針を通して押出した（各ゲル／オペレーターによる手動的注射について６回の試験）。ゲル２及びゲルＸは、針を通して容易に注射可能であったが、しかしながら、本発明のゲル２が注射機内でより良好な均質性を有することが見出されたことを注目することは重要である。実際、注射の間、試験を行うオペレーターは、注射器プランジャーに適用されるべき力に関して、Ｘゲルに多くの不規則性を観察し（本発明のゲル２の場合では存在しない）；不規則性は、オペレーターにより「プッシュ」（pushs）として特徴づけられた。他方では、ゲルＸについて試験される６本の注射器間で、２本の注射器は、針がゲルにより完全にブロックされ／閉塞されたので（本発明のゲル２の場合では存在しない）、完全に排出され得なかった。

上記に記載されたように、従来技術は、架橋されたゲルの粒子への転換が製品の排出力を低め、そして従って、針を通してのその注射可能性を増強することを可能にする（強く架橋されたハイドロゲルは、針の穴を通してより通過しやすくする小さなサイズの粒子に粉砕される）ことを教授する。驚くべきことには、部分的架橋層（その１つは、高く架橋され、そして他は低く架橋されている）の粉砕工程にゆだねられていないが、しかし前記２つの部分的架橋層の組合せ及び架橋から得られる架橋された層を有する、本発明のゲル２はまた、容易に注射でき、且つまた、より均質性であることも見出された。従って、本発明の複雑な「多構造化された」（及び同時架橋なしの）構造は、製品を粒子に転換するためにそれを粉砕しないで、従来技術に記載される注射可能性の問題の対処を可能にする。

トルイジンブルー染色試験を、ゲルの構造が粒状であるか否かを評価するために、ゲル２及びゲルＸの調製工程の間に採取されたゲルサンプルに対して実施した。このために、試験されるべき約０．１ｇのゲルを、ガラススライド上に配置し、そしてトルイジンブルーの水溶液（１００ｇの脱イオン水当たり０．１ｇのトルイジンブルー）５滴を添加し、そして次に、第２のガラススライドを、第１のガラススライド上に配置した。次に。結果を、４０Ｘの倍率で顕微鏡下で観察し、そして写真を投影した。

以下の色彩試験を実施した：
−ゲル２に関して：３種のサンプルについて中性ｐＨへの中和の後、部分的架橋層Ｃ及びＤ（図１及び２を参照のこと）について、及び部分的架橋層Ｃ及びＤから得られる架橋製品（図３を参照のこと）について；
−ゲルＸに関して：２種のサンプルについて中性ｐＨへの中和の後、粒子Ｘｐ（図４を参照のこと）について、及び粒子Ｘｐの同時架橋により得られた架橋製品（図５を参照のこと）について。

ＮａＨＡ架橋粒子が明確に見える図４（及びまた、図５）に比較して、本発明のゲル２に関する図１−３のゲル構造は粒状ではない。本発明の架橋方法の間、部分的架橋層の非転換は、同時架橋されたＮａＨＡの粒子を含まないハイドロゲルの入手を可能にする。

これは、従来技術の製品、及び特に、米国特許第２０１０／００２８４３５号及びまた、欧州特許第２０１１８１６号に記載される製品よりも有意な利点を提供する。実際、文献、及びまた米国特許第２０１０／００２８４３５号及び欧州特許第２０１１８１６号に記載されるように、架橋粒子は、短期及び長期で副作用及び合併症を生む（欧州特許第２０１１８１６号においては、架橋粒子は外来物質に対して多かれ少なかれ、強い反応を発生されるものとして特に記載されている）。本発明においては、従って、同時架橋される粒子の不在が、容易な注射可能性を維持しながら、製品の良好な安全性プロフィールに関して、米国特許第２０１０／００２８４３５号及び欧州特許第２０１１８１６号に開示される発明よりも、主要な改善性を提供する。

他方では、米国特許第２０１０／００２８４３５号及び欧州特許第２０１１８１６号が、弱く架橋されたＮａＨＡマトリックスと共にそれらの粒子の同時架橋のために、身体内での高く架橋される粒子の移動の制限を主張していることを注目することもまた重要である。これは短期では真実であるが、しかし高く架橋された粒子の移動は、架橋された弱架橋ＮａＨＡのマトリックスが再吸収された場合、長期において再び可能になる。この後者の点はさらに、本発明の注射可能ハイドロゲルの改善された安全性プロフィールを確証し、ここで長期での同時架橋された粒子の移動の問題が発生しない（本発明のハイドロゲルは同時架橋された粒子を含まない）。

別の主要な利点は、米国特許第２０１０／００２８４３５号及びまた、欧州特許第２０１１８１６号からの同時架橋された粒子の製品に比較して、本発明の製品の組織中への良好な統合（＝生体統合／生体移植）である。実際、種々の科学出版物（例えば、Tran C. et al., In vivo bio-integration of three HA fillers in human skin: a histological study, Dermatology 2014, 228:4754;又はMicheels, P. et al., Superficial dermal injection of HA soft tissue fillers: comparative ultrasound study, Dermatol. Surg. 2012, 38:1162-1169）に記載されるように、架橋された粒状ＮａＨＡに基づく製品（例えば、米国特許第２０１０／００２８４３５号及び欧州特許第２０１１８１６号に開示される製品）の真皮への注射は、架橋された非粒状ＮａＨＡに基づく製品（本発明のハイドロゲルの場合におけるように）に比較して、有意に一層の不均一な分散性をもたらす。

本発明のハイドロゲルの調製方法は、米国特許第２０１０／００２８４３５号及び欧州特許第２０１１８１６号に記載される方法に比較して、製品の製造のために有意に短い期間を要することを注目することもまた重要である。本発明のゲル２についての製造時間（約５５時間）及び米国特許第２０１０／００２８４３５号のゲルＸの製造時間（約８５時間）の比較は、この点を示すことができる。これは、明確な経済的利点を提供し、そしてまた、製造の間、ゲルの細菌汚染の危険性を最少にし、このことが、製造工程の持続期間を高める。

実施例８：従来技術（欧州特許第２０１１８１６号）と本発明のゲルの製造の比較
ａ）本発明のゲル２の調製
実施例３を参照のこと。

ｂ）欧州特許第２０１１８１６号の実施例１に従っての従来技術のゲルYの調製
２．０ＭＤａにほぼ等しい分子質量及び６．３％の湿度レベルを有するヒアルロン酸ナトリウム（ＮａＨＡ）粉末１．００ｇを計量し、これに、１重量％のＮａＯＨ水溶液６．２ｇを添加した。

粉末の水和は、１時間２０分を要し、続いてスパチュラを用いた手動的均質化を実施した。

０．１５ｇのＢＤＤＥを、反応媒体に添加し、続いてヘラによる１０分間の手動的均質化を実施し、その後、５０℃での２．５時間、恒温浴に浸漬した。

架橋された製品を、脱イオン水に２４時間導入し、ここでそれぞれ８時間の３回の連続浴を使用し、未反応のＢＤＤＥを除去した。

このようにして得られたゲルを、２５０μｍのグリッドを通してそれの連続的通過により、粒子に粉砕し、そして粒子を２時間排水した。

得られた粒子を、Ｙｐとする。

５．０ｇの粒子Ｙｐを、２．０ＭＤａにほぼ等しい分子質量及び６．３％の湿度レベルを有するヒアルロン酸ナトリウム（ＮａＨＡ）粉末０．８ｇに添加し、これに、１重量％のＮａＯＨ水溶液２．０ｇを添加した。

混合物を３０分間、手動的に均質化し、その後、０．０３ｇのＢＤＤＥを添加し、そして次に、再び３０分間、均質化し、その後、反応混合物を、５０℃で２．５時間、恒温浴中に浸漬した。

得られた架橋製品を、Ｙｇとする。

架橋された製品Ｙｇを、ＨＣｌ含有リン酸緩衝溶液によりｐＨ＝７．０に中和し、ここでそれを、２４時間、膨潤し、そして次に、末反応ＢＤＤＥを除くために、それをリン酸緩衝溶液により２４時間、透析した。

３０分間の機械的均質化の後、ゲルＹを得た。

ｃ）ゲル２及びゲルＹの製造工程の比較
実施例７におけるように、ゲル２及びＹを、１ｍｌのガラス注射器中に充填し、そして２７Ｇ1/2の針を通して押出した。２種のゲルは針を通して容易に注射可能であることが見出され、そして実施例７に関して言及されるそれらのコメントと同じコメントが適用される：本発明のゲル２は、針を通してのその注射がゲルＹのものよりも、より規則的であったので、より均質であることが見いさされた。驚くべきことには、本発明のゲル２は、注射可能性を促進するために、粒子への何れの粉砕工程にもゆだねられていないが、ゲル２の複雑な「多構造化された」構造は、粒子へのその強く架橋された層の転換工程にゆだねられたゲルＹの排出力に類似する低放出力を示す。

実施例７におけるように、トルイジンブルー染色を、ゲル２及びＹの調製工程の間に採取されたゲルサンプルに対して行った。

以下の色彩試験を実施した：
−ゲル２に関して：３種のサンプルについて中性ｐＨへの中和の後、部分的架橋層Ｃ及びＤ（図１及び２を参照のこと）について、及び部分的架橋層Ｃ及びＤから得られる架橋製品（図３を参照のこと）について；
−ゲルＹに関して：２種のサンプルについて中性ｐＨへの中和の後、粒子Ｙｐ（図６を参照のこと）について、及び粒子Ｙｐの同時架橋により得られた架橋製品（図７を参照のこと）について。

結論は、実施例７の結論と同じである。ＮａＨＡ架橋された粒子が明確に見える図６（及びまた、図７）に比較して、本発明のゲル２に関する図１−３のゲル構造は、粒状でない。

従って、本発明は、その架橋工程の間、粒子を形成するために、粉砕されなかった（部分的に又は完全に）事実にもかかわらず、容易に注射可能ハイドロゲルの入手を可能にする。従って、ゲルにおける同時架橋された粒子の不在は、次の有意な改善性（欧州特許第２０１１８１６号において得られるゲルに比較して）の達成を可能する：
−短及び長期での安全性プロフィールが改善され、特に欧州特許第２０１１８１６号におけるように、長期での高く架橋された粒子の移動が存在せず；
−組織中へのゲルの生体統合性（より均等な分布）が、同時架橋された粒子の不在のために、増強される。

最終的に、実施例７におけるように、本発明のゲルの製造は、その製造工程が、欧州特許第２０１１８１６号に記載されるその工程よりも有意に早く（欧州特許第２０１１８１６号のゲルについて８３時間に比較して、本発明のゲルについてほぼ５５時間）、そしてそれは、欧州特許第２０１１８１６号において必要とされるそれらの工程のように、１又は数個の複雑で且つ退屈な製粉工程を必要としないので、経済的利点を有し、そして微粒子及び細菌汚染の危険性を最小限にすることを注目することは重要である。

Claims (18)

1. ヒアルロン酸、又はその塩の１つ、及び任意に他の生物適合性ポリマーを架橋するための方法であって、下記工程：
   ａ）
   −ヒアルロン酸濃度Ｃ１を得るために、水溶液へヒアルロン酸又はその塩の１つ、及び任意に他の生物適合性ポリマーを添加すること、
   −量Ｑ１の架橋剤を添加すること、
   −架橋反応の温度Ｔ１及び持続時間ｔ１を調節することによって、ヒアルロン酸の部分的架橋を達成すること
   により特徴づけられる、部分的に架橋された、ヒアルロン酸の、及び任意に他の生物適合性ポリマーの第１の水層を調製する工程、ここで、部分的に架橋されたヒアルロン酸の調製された第１の水層は、粒子へと転換されず；
   ｂ）
   −ヒアルロン酸濃度Ｃ２を得るために、水溶液へヒアルロン酸又はその塩の１つ、及び任意に他の生物適合性ポリマーを添加すること、
   −量Ｑ２の架橋剤を添加すること、
   −架橋反応の温度Ｔ２及び持続時間ｔ２を調節することによって、ヒアルロン酸の部分的架橋を達成すること
   により特徴づけられる、部分的に架橋された、ヒアルロン酸の、及び任意に他の生物適合性ポリマーの第２の水層を調製する工程、ここで、部分的に架橋されたヒアルロン酸の調製された第１の水層は、粒子へと転換されず；
   ｃ）前記少なくとも１つの第２の部分的に架橋されたヒアルロン酸層を、前記第１の層に添加し、その後、追加量Ｑｍの架橋剤を任意に添加することにより、前記少なくとも２つの層の混合物を生成する工程；及び
   ｄ）架橋反応の温度Tｍ及び持続期間ｔｍを調節することにより、事前に製造された混合物の架橋を続ける工程、
   を少なくとも含んで成り、
   前記架橋方法の工程ａ、ｂ、ｃ及びｄの間、架橋されたヒアルロン酸粒子若しくはその塩の１つの添加、又は任意の他のポリマーの添加を包含しないことを特徴とする、方法。
2. 前記部分的に架橋されたヒアルロン酸の第２の水層が、前記部分的に架橋されたヒアルロン酸の第１の水層の架橋の部分的程度よりも高いその程度を有し、そして／又は、前記ヒアルロン酸濃度Ｃ２が前記濃度Ｃ１よりも高いか又は等しいことを特徴とする、請求項１に記載の方法。
3. 前記架橋剤Ｑ２の量が前記量Ｑ１よりも多いか又は等しく、そして／又は、前記架橋温度Ｔ２が前記温度Ｔ１よりも高いか又は等しく、そして前記架橋温度Ｔｍが前記温度Ｔ２よりも高いことを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記架橋持続時間ｔ２が前記持続時間ｔ１よりも長いか又は等しく、そして／又は、前記部分的に架橋されたヒアルロン酸の第１の水層及び第２の水層が等しいか又は異なっていることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。
5. 前記混合物の架橋が、水溶液を用いて希釈することによって、及び／又は、透析により達成される精製を実施することにより未反応の架橋剤を除去することよって、停止されることを特徴とする、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。
6. 前記架橋反応が、１又は数個の多官能架橋剤の作用により実施されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
7. 前記１又は数個の多官能架橋剤は、二官能性又は多官能性エポキシ、ジビニルスルホン、カルボジイミド及びホルムアルデヒドの群から選択されることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
8. 前記架橋反応は、架橋剤１，４−ブタンジオールジグリシジルエーテル（ＢＤＤＥ）の作用により実施されることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
9. 前記ヒアルロン酸の塩が、ナトリウム、カルシウム、亜鉛又はカリウムの塩であることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
10. 前記ヒアルロン酸、又はその塩の１つが、０．１Ｄａ〜４，０００，０００Ｄａの分子質量を有することを特徴とする、請求項１〜９のいずれか１項に記載の方法。
11. 前記ヒアルロン酸がヒアルロン酸の誘導体であり得、すなわち、化学的経路を介して、又はいずれか他の経路を介して、ヒアルロン酸分子を修飾することにより得られる分子であり得ることを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 注射用ハイドロゲルの調製方法であって、少なくとも次の連続した工程：
    −請求項１〜１１のいずれか１項に記載の方法に従って、ヒアルロン酸、又はその塩の１つ、及び任意に他の生物適合性ポリマーを架橋する工程、
    −適切なｐＨを有する等浸透溶液を用いて前記混合物を精製する工程、
    −１又は数個の生物適合性ポリマーを任意に添加して、及び／又は、酸化防止剤、抗炎症剤、防腐剤、抗菌剤、抗真菌剤、抗癌剤、タンパク質、ホルモン、局所麻酔剤、生物学実体及びそれらの組み合わせからなる群から選択される１又は数個の物質を任意に添加して、前記混合物を均質化する工程、
    −任意に脱気及び／又は凍結乾燥する工程、
    −注射器、又はフラスコ、又は任意の他の密封容器にコンディション化する工程、及び
    −殺菌する工程、
    を含むことを特徴とする、方法。
13. 少なくとも架橋されたヒアルロン酸又はその塩の１つ、及び任意に他の生物適合性ポリマーから成り、異なった架橋度を有する、数個の架橋されたヒアルロン酸層の混合物によって特徴づけられ、ここで前記層は互いに共有結合を介して互いに結合される、請求項１２に記載の方法に従って得られるハイドロゲル。
14. 前記ヒアルロン酸又はその塩の１つの全濃度が、０．０１〜５０ｍｇ／ｍｌに含まれる、請求項１３に記載のハイドロゲル。
15. １又は数個の活性物質を含むことを特徴とする、請求項１３又は１４に記載のハイドロゲル。
16. その架橋されたマトリックス内に分散されたリドカインを含み、そして／又は前記架橋されたマトリックス内に分散された１又は数個のミネラル物質を含むことを特徴とする、請求項１３〜１５のいずれか１項に記載のハイドロゲル。
17. 滅菌注射器にコンディション化される、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載のハイドロゲルを含むキット。
18. 美容用途又は治療用途のための組成物の製造のための；又は、皮膚の質を改善するか又は顔又は身体のしわを充填するか又は顔又は身体の容積を復元するための皮内又は皮下移植可能組成物の製剤化のための；化粧又は薬用化粧組成物の製剤化のための；眼科での用途のための局所又は眼内組成物の製剤化のための；歯科での用途のための局所又は移植可能組成物の製剤化のための；整形外科及びリウマチ科での用途のための関節内組成物の製剤化のための；失禁の治療への用途のための、泌尿器科での使用のための移植可能組成物の製剤化のための；線維症の治療の範囲内で、又は創傷の治癒を改善するために薬又は一般的外科で使用される局所又は移植可能組成物の製剤化のための；又は種々の医療用途のための活性物質の遅延された及び／又は制御された放出を可能にする局所又は移植可能医薬組成物の製剤化のための、請求項１３〜１６のいずれか１項に記載のハイドロゲルの使用。

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