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PROCEDE DE PREPARATION DE DERIVES DE LA MORANOLINE
La présente invention concerne un nouveau procéde de préparation d'un dérivé de la glucosylmoranoline représenté par la formule I suivante
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Le composé I de la présente invention présente une action inhibitrice marquee contre l'augmentation de la glycémie par ingestion de sucre, et il est très utile comme produit pharmaceutique, par exemple comme agent thérapeutique pour le diabète sucré (voir demande de brevet japonais 56/081595).
Le procédé suivant a été utilisé pour la preparation du compose de la presente invention.
On fait agir une solution aqueuse contenant de la moranoline répondant a la formule III
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et de la cyclodextrine ou de l'amidon soluble sur de la cyclodextrine glycosyltransférase (EC 2. 4. 1. 19) pour préparer un melange d'oligoglucosylmoranolines représenté par la formule (II)
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{in (dans laquelle n est un entier de 1 à 5) et de (I).
Dans la solution réactionnelle ci-dessus, du (III) n'ayant pas réagi et du (II) ayant réagi a l'exces sont generalement presents en plus du (I) désiré. Le rapport de ces composes dans la solution réactionnelle peut évidemment varier en fonction des conditions réactionnelles. En tout cas, il est indispensable de purifier sélectivement le (I) désiré à partir du mélange.
Conformément à l'etude de la demanderesse, le (II) peut etre transformé en (I) avec un rendement élevé en traitant le melange par la glucoamylase (alpha-1, 4glucaneglucohydrolase EC 3. 2. 1. 3.) (voir demande de brevet japonais 57/058890). Bien que ce procédé soit un bon
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procédé de préparation, du (III) n'ayant pas réagi est toujours présent dans le. melange après le traitement par la glucoamylase, et en outre, de la 4-o-alpha-V-maltosylmora- noline et une tres faible quantite de (II) sont egalement présentes dans certaines conditions réactionnelles.
Pour obtenir le compose desire à partir d'une telle solution reactionnelle, il était nécessaire d'utiliser un fractionnement par masses moleculaires en utilisant du Sephadex ou un produit analogue ou une chromatographie sur colonne en phase inversée en utilisant du Lichroprep CN (marque déposée : Merck Co.) ou du Microbonda pack-NH2. Pour surmonter les inconvenientsci-dessus, la demanderessea effectué des études poussées. et elle a trouvé que l'utilisation de la cristallisation fractionnée en utilisant un solvant polaire était efficace pourtourner cette difficulté technique, et elle a déposé une demande de brevet (voir demande de brevet japonais 59/237326).
Ce procédé est une application des propriétés qui sont communes aux moranolines dans lesquelles l'atome d'azote est substitue par un groupe alkyle inférieur, en plus de la glucosylmoranoline de la présente invention.
La demanderesse a poursuivi les études en vue d'améliorer les avantages de la cristallisation fractionnée ci-dessus, et elle a trouvé qu'en ce qui concerne les monoglucosylmoranolines N-non substituees de la presente invention, il existe un procédé qui donne des résultats bien suprieurs que ceux de l'invention ci-dessus, et elle a réalisé la présente invention.
Ainsi, un des buts de la présente invention est de fournir le composé de la présente invention avec un rendement plus levé, une purete plus élevée et sans difficulté.
La première caractéristique de la presente invention est de soumettre un mélange des composes (I), (11) et (III) ci-dessus a une "cristallisation fractionnée" en utilisant du méthanol, qui. est un solvant polaire. La de-
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manderesse a trouvé tout d'abord que l'utilisation de methanol sur des monoglucosylmoranolines N-non substituées donne un effet caractéristique de la présente invention.
La seconde caractéristique de la présente invention est d'effectuer une opération d'agitation lorsqu'on soumet le mélange de (I), (II) et (III) une cristallisation fractionnée. Le fait physico-chimique qu'une opération aussi simple que l'agitation conduise à un resultat marque de la présente invention a été découvert pour la première fois par la demanderesse.
Le contenu de la présente invention sera illustre plus en detail ci-dessous.
Comm il a déjà été indique, la presente invention concerne la préparation du compose (I) desire avec un
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rendement tres élevé et dans une Operation très simple A partir d'un melange de (I), (11) et (III) au cours de la preparation de (I}.
Lorsqu'on effectue la présente invention, on fait agir la cyclodextrine glucosyltransférase sur une solution aqueuse contenant du (III) et de la cyclodextrine ou de l'amidon soluble pour préparer un mélange de (Il et de (II), puis on la traite par la glucoamylase pour transformer (II) en (I). En général, la solution réactionnelle contient environ 30 % de (III) n'ayant pas réagi, ainsi qu'une faible quantité de 4-0-alpha-D-maltosylmoranoline et une très faible quantité d'autres (II). Mais en général, 1a quantité totale de (II) ne dépasse pas 2 % du tout.
Dans la présente invention, le melange ci-dessus est par exemple chauffé dans de l'eau ou dissous dans de l'eau à la température ambiante, et on y ajoute du méthanol.
Puis on agite la solution, si nécessaire, à une certaine vitesse et à une certaine température, de telle sorte que les cristaux gsseparent.
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Un bon résultat est obtenu en agitant pendant 24 h, et un resultat suffisant est obtenu en agitant à environ 200 tr/mn. Evidemment, la vitesse d'agitation peut etre plus élevée ou plus faible que celle-ci.
Les cristaux qui se séparent peuvent etre recueillis, par exemple par filtration. Les cristaux peuvent être recristallises si necessaire. Comme il sera indiqué plus loin, il est connu que ces cristaux sont un composé moléculaire de (I) avec le méthanol.
L'expression "composé moléculaire" de la gluco- sylmoranolihe avec le méthanol signifie ici que du metanol se combine avec la glucosylmoranoline dans un état tel qu'ils ne soient pas séparés aisément, et qu'il s'agit d'un compose nouveau, un composé d'addition de la glucosylmoranoline avec le méthanol, dans lequel le méthanol est un compose solvatant.
Une autre caractéristique de la présente invention est d'utiliser une cristallisation fractionnée dans laquelle de l'étahno1 est utilise pour donner un composé moleculaire de (I) avec le méthanol talque préparé ci-dessus.
Les moyens de fractionnement utilisant la dif- ference de solubilité d'un composé moléculaire de (I) avec le méthanol dans la séparation de (I) d'un melange de (I), (II) et (III) donnent un resultat marque, mais il serait sans signification si (I) n'était pas séparé à l'état pur d'un compose moléculaire de (I) avec le méthanol.
Pour l'elimination du méthanol du compose moleculaire de (I) avec le méthanol, il est inefficace de le chauffer sous vide pendant 24 h. La recristallisation dans l'eau donne un taux de récupération d'environ 35 % seulement, et elle est moins pratique du point de vue industriel.
En conséquence, il a été nécessaire de dissoudre ce composé moleculaire dans de l'eau, d'eliminer le
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méthanol en le traitant par une resine échangeuse d'ions fortement acide, puis. en Le lavant soigneusement Åa l'eau, puis d'éluer la résine avec de l'ammoniaque et de faire évaporer l'ammoniaque sous vide pour donner des cristaux.
Un tel procédé est tres fastidieux, et en conséquence, il n'est pas possible d'utiliser pleinement l'effet de la présente invention d'obtention de (I) enpassant par un composé moleculaire de celui-ci avec le méthanol.
Lorsqu'on effectue la présente invention, le produit de réaction contenant un-composé moleculaire de (I) avec le-méthanol est par exemple chauffé dans de l'eau ou dissous dans de l'eau à la temperature ambiante, et de l'ethanol lui est ajouté. Puis la solution est agitée si nécessaire à une certaine vitesse et â une certaine temperature pour donner des cristaux à partir de celle-ci. Dans ce cas, on obtient de bons résultats en agitant pendant 24 h environ. En ce qui concerne la vitesse d'agitation, une vitesse de rotation d'environ 200 tr/mn donne un résultat suffisant. Les cristaux qui se separent peuvent être recueillis, par exemple par filtration. Les cristaux peuvent etre recristallises si necessaire. En outre, si nécessaire, on peut appliquer un chauffage sous vide ou d'autres moyens.
Conformement aux essais effectués par la demanderesse, les cristaux obtenus par le procédé ci-dessus ne contiennent que 0, 03 à 0, 1 % d'éthanol comme solvant residuel. Cet ethanol ne constitue pas un composé moleculaire avec (1), et en outre, sa quantité est telle qu'il est acceptable comme médicament. Comme la teneur en méthanol ne dépasse pas 50 ppm, le méthanol peut etre éliminé de maniere pratiquement complete du composé moléculaire de (I) avec le méthanol.
11 est connu qu'en général les composés moleculaires contenant un solvant comme constituant ne sont pas aisement solubles dans ce solvant. Les solubilités
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de (III) et de (I) dans le méthanol aqueux sont presque les mêmes, et il a été confirme par. la demanderesse qu'avec le temps, la solubilité de (I) diminue. On suppose que ceci est du au fait que (I) produit un compose moleculaire avec le méthanol au cours du temps, de sorte que sa solubilité diminue.
11 est connu qu'en général, meme lorsque les solubilités dans les solvants sont les memes, il existe une difference entre les substances en ce qui concerne le temps pendant lequel elles peuvent exister dans un état stable à l'état sursaturé, ce temps étant connu sous le nom de temps d'amorçage de la cristallisation. En général, pour les sucres dans des solvants aqueux, ce temps est long. Comme l'a confirmé la demanderesse, le phénomène caractéristique seIon lequel ce temps d'amorçage de la cristallisation est raccourci par une simple opération d'agitation s'observe avec le composé de la présente invention. 11 n'est pas aise de prévoir les relations entre l'agitation et le raccourcissement du temps d'amorçage de la cristallisation.
Dans la présente invention, la cristallisation fractionnée par l'ethanol est en outre appliquée, mais la raison pour laquelle l'éthanol chasse le méthanol et pour laquelle le composé de la présente invention ne forme pas un compose moleculaire avec l'ethanol tandis qu'il le fait avec le méthanol n'est pas suffisamment claire.
Conformément à la présente invention, il est possible de preparer le compose de haute pureté désiré par un procédé simple. Pour la purification d'un sucre à partir d'un mélange de sucres, celui-ci a été séparé par exemple par chromatographie sur une colonne de carbone, ou par chromatographie sur colonne en utilisant une resine echangeuse de cations fortement acide du type métal alcalin ou métal alcalinoterreux, mais en tout cas, il était indispensable de passer par des stades très compliqués.
La présente invention a completement résolu tous ces pro-
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blêmes techniques.
La présente invention est également importante en ce que, comme il a déjà été indiqué, le temps d'amorça- ge de la cristallisation est réduit. 11 était necessaire de laisser reposer le mélange réactionnel pendant une durée prolongée pour augmenter à la fois la pureté et le rendement, alors que, dans la presente invention, il suffit de 10 fois plusieurs heures ( ?), et par conséquent, le procede de la presente invention est industriellement avantageux.
Le procédé de la présente invention est également utile dans la fabrication de médicaments en ce sens que le méthanol, qui est nuisible pour l'organisme humain et qui est présent dans le composé desire en faible quantité, peut etre éliminé sous la forme d'un composé moleculaire.
Les exemples et exemples de travail ci-dessous sont donnés à titre d'illustrations supplémentaires de la présente invention.
Exemple d'essai
Les modifications des quantites de glucosylmoranoline (GM) et de moranoline (M) dissoutes au cours du temps, et I'effet de l'agitation sur celles-ci dans du methanol aqueux à 33, 3 % (v/v) contenant un mélange de GM et de M ont été examinees.
De la GM (210 mg) et 90 mg de M ont été introduits dans un ballon de 50 ml et ont été DISSOUS dans 0, 3
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ml d'eau à 60oC. Du méthanol (8, 7 roll y a été ajoute, et la température a été maintenue à 5C ou a 200C. Pour chacune de ces températures, un ballon a été laisse au repos et un autre a été agité à 200 tr/mn au moyen d'un barreau d'agitateur magnétique introduit dans celui-ci. De la solution a été prélevée périodiquement, centrifugée et le liquide surnageant a été analysé par chromatographie liquide à hautes performances. Les conditions analytiques étaient
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les memes que celles indiquées dans l'exemple de référence 1 ci-apres. Les résultats sont donnés dans le tableau 1.
Tahbleau1
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<tb>
<tb> Tempe <SEP> Substance <SEP> quantité <SEP> dissoute <SEP> (g/litre)
<tb> écoulé <SEP> 5 C <SEP> 20'C
<tb> (beures) <SEP> agitation <SEP> repos <SEP> agitation <SEP> repos
<tb> 0 <SEP> @ <SEP> 10,0 <SEP> 10,0 <SEP> 10,0 <SEP> 10,0
<tb> GM <SEP> 23, <SEP> 0 <SEP> 23, <SEP> 0 <SEP> 23, <SEP> 0 <SEP> 23, <SEP> 0
<tb> 1,5 <SEP> @ <SEP> 10,2 <SEP> ,8 <SEP> 10,5 <SEP> 9,7
<tb> GM <SEP> 5. <SEP> 5 <SEP> 22. <SEP> 1 <SEP> 6. <SEP> 2 <SEP> 21, <SEP> 1
<tb> 3,0 <SEP> @ <SEP> 10,1 <SEP> 10,1 <SEP> 11, <SEP> 4 <SEP> 9, <SEP> 9
<tb> GM <SEP> 4,2 <SEP> 22,0 <SEP> 4,4 <SEP> 21,3
<tb> 10,0 <SEP> @ <SEP> 9,9 <SEP> 10,0 <SEP> 10,2 <SEP> 9,8
<tb> GM <SEP> 3,1 <SEP> 19,0 <SEP> 3,2 <SEP> 18,2
<tb> 24, <SEP> 0 <SEP> K <SEP> 6. <SEP> 6 <SEP> 10. <SEP> 1 <SEP> 10. <SEP> 5 <SEP> 9.
<SEP> 7
<tb> GM <SEP> 3,2 <SEP> 9,7 <SEP> 3,1 <SEP> 7,9
<tb>
Dans le tableau, le terme "repos" signifie que le ballon a été agite à la main 4 à 5 fois par jour pour mélanger le contenu.
IL ressort du tableau que, dans le cas de la moranoline, il ne s'est produit presque aucune modification de la solubilite jusqu'à 10 h tant à l'état "agité" et qu'au "repos". Dans le cas de l'agitation, on a observé une tendance a une diminution de la solubilité 5 C pendant 24 h.
Au contraire, dans le cas de la glucosylmoranoline, il ne s'est produit presque aucune modification jus- qu'à 3 h tant pour 5 C que pour 20 C à l'état de "repos", tandis qu'à 10 h, on a observe une diminution et, avec une tendance progressivement remarquable, la quantité s'est
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abaissee ik la moitié de la quantité initiale au bout de 24 h.
En outre, la quantite. s'est de ja abaissee ä un quart au bout d'une heure et demi, lorsqu'on agitait, dans le cas de la glucosylmoranoline. Par conséquent, l'effet de l'agitation
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sur la quantitedissoute est très net. En tout cas, il est vraisemblable que l'effet de la temperature sur la solubilite est faible.
Exemple de reference 1 (l) On dissout de la moranoline (21 g) dans une faible quantité d'eau, et on ajuste la solution a pH 5, 7 avec de l'acide chlorhydrique 6N. Après l'ajustement, on ajoute de l'eau pour faire 350 ml. On y dissout de l'amidon soluble (72 g) alors que la solution est encore chaude. On maintient ensuite la solution à 50'C, on y ajoute 350 ml de solution d'enzyme brute à 1 000 unités/ml de cyclodextrine glycosyl-transférase, et on fait réagir le mélange à 50 C pendant deux jours. Après la réaction, on chauffe le mélange à 80 C pendant 15 mn, on y ajoute 5, 6 g de glucoamylase (Glucozyme AF-6, fabrique par l'Amano Seiyaku KK), et on fait réagir le mélange à 50 C pendant 24 h.
Après réaction on le chauffe à SOC pendant 15 mn, on le centrifuge, on fait passer le fluide surnageant à travers une colonne de Dowex 50W x 2 (H+) (dans laquelle la quantité de résine est de 500 ml), et on absorbe la substance basique avec celle-ci. On lave soigneusement la colonne à l'eau, on l'élue avec de l'ammoniaque IN, on concentre l'eluat sous vide et on fait passer la solution concentree à travers une colonne de résine échangeuse d'ions fortement basique (Diaion SA-llA, la quantité de resine étant de 100 ml). On lave soigneusement cette résine avec de l'eau et on réunit la solution qui a traversé et l'eau de lava-
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ge, apres quoi on concentre sous vide à sec, et l'on obtient 34, 8 g de poudre.
On analyse cette poudre par chromatographie liquide à hautes performances, et l'on trouve qu'il s'agit
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d'un melange comprenant 26, 1 % de moranoline, 71, 9 % de glucosylmoranoline et 2 % de 4-0- (alpha-D-maltosyl)-moranoline.
Les conditions utilisées pourla chromatographie liquide à hautes performances étaient les suivantes : Sumipax R741 (Nucleosil 5NH2. 5 microns, 4 mm de DI x 25 cm).
Eluant : acétonitrile-eau (70:30) ; débit : 1 ml/mn ; detec- tion RI (ERC-7510 fabriqué par Elmer Kogyo KK) ; machine de traitement de l'information : Type 655-60 fabriqué par Hitachi Ltd.
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Exemple de Référence 2 On soumet de la moranoline (21 g) & la même reaction que dans l'Exemple de Reference l, excepte que l'on utilise 7 g de glucoamylase et qu'on effectue la réac- tion à 50 C pendant 24 heures.
On traite le produit de la réaction de la meme manière que dans l'exemple de référence 1, ce qui donne 31 g de poudre.
On analyse cette poudre de la même manière que dans l'Exemple de Référence 1, par chromatographie liquide à hautes performances, et l'on trouve qu'il s'agit d'un mélange comprenant 29, 2 % de moranoline, 70, 0 % de glucosylmorano-
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line et 0, 8 % de 4-o- (alpha-D-maltosyl) moranoline.
Exemple 1 On dissout un melange (34, 7 g) obtenu dans l'Exemple de Référence 1 dans 83 ml d'eau, on y place un agitateur magnetique et on ajoute 1 305 ml de nÖTancLL en agi- tant à 200 tr/mn environ. On agite ce melange a la température ambiante pendant une nuit, et on recueille les cristaux qui s'en séparent par une filtration suivie d'un séchage sous vide à 60 C pendant 16 h, ce qui fournit 22, 4g de cristaux. Les cristaux obtenus contiennent 6, 8 % (P/P) de méthanol et l'analyse par chromatographie liquide à hautes performances montre que leur titre en glucosylmo-
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ranoline est de 99, 9 %. Le taux de recuperation est de 83, 3%.
(a) o24 +114. 3* (c : 1, 07 % eau).
Compo6. 6Imentaire : calcul pour C < aHND. O, 65CHOH : . calc., (%) : C 43, 90, H 7, 45, B 4, 05 trouv6 < %) : C 43. 65, H 7. 76, 5 4, 15 1H-R N : < ? < ppjD) ; 2, 45 (IH, dd, Jla, le. 12, 3Hz, Jla, 2, 10, 3Hz, MIA), 2, ôIN 2. 71 < lH, m. H5), 3, 11 < lH, dd, Jla, le 12, 3Hz. Jle, 2, 4, 9Hz, Hle), 3, 34 (2. 4H.
6, CHAL OH), 3, 353. 88 [11H, m, 4H < -CS & OH). 5H (-chez OH), IH (H-4). 1H (H-5')], 5, 32 MH, d, 3, 7Hz, H-l', proton nombre)
On sèche ces cristaux sous vide à 600C et on détermine la quantité de méthanol residuel. Après un séchage de 10h, celle-ci est de 7, 5 % et de 7, 5 % dans les cristaux pulverses et non pulvérisés, respectivement. Au bout de 16 h, les quantités sont de 6, 6 % et de 6, 8 %, respectivement ; et au bout de 10 heures supplémentaires, elles sont de 6, 3 % et de 6, 9 % respectivement. 11 ressort de ces résultats que le méthanol est très fortement incorporé AL la glucosylmoraline, ce qui suggère que la substance est un compose moleculaire avec le méthanol.
La détermination du méthanol residuel a ete effectuée par chromatographie en phase gazeuse dans les conditions suivantes.
Apparell : Gas-Chro Model 103C (fabriqué par l'Okura Rikagaku KK) ; Colonne : G-0,1 m ; Température : injection
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200*C, colonne 120*C. Gaz porteur : 1, 0 kg/cm* d'azote calculs en eau (10 m1crolitres/mn)..
Exemple 2
On dissout les cristaux (10 g) obtenus dans l'exemple 1 dans 20 ml d'eau à 600C on refroidit la solution en la laissant reposer jusqu'à la température am-
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biante, et on y ajoute 90 ml d'ethanol, en agitant avec un agitateur magnétique. On agite ce mélange pendant une nuit, on recueille par filtration les cristaux gui s'en séparent, on les sèche à 60 C pendant 16 h sous vide, et i'on obtient 7, 5 g de cristaux. Taux de récupération=80, 5%.
On détermine le solvant résiduel qui s'y trouve
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par chromatographie en phase gazeuse de la meme manière que dans l'Exemple 1, et l'on trouve environ 0, 06 % d'ethanol.
Cependant, la teneur en methanol n'est pas superieure à 0, 005 %,. et la purete de. la glucosylmoranoline est de 100 %.
Exemple 3
On dissout le mélange (10 g) obtenu dans l'Exemple de Référence 2 dans 15 ml d'eau, et l'on ajoute 285 ml de méthanol, en agitant au moyen d'un agitateur magnétique.
On agite ce melange pendant une nuit et on recueille par filtration les cristaux qui s'en separent. On les sèche sous vide a 600C pendant 10 h, ce qui donne 7, 1 g de cristaux. taux de récupération = 91, 7 %.
On analyse ces cristaux par chromatographie liquide à hautes performances, et l'on trouve qu'ils contiennent 3, 1 % de moranoline et 96, 9 % de glucosylmoranoline. On detecte également 6, 1 % de méthanol résiduel.
Exemple 4
On dissout le melange (7g) obtenu dans l'exemple 3 dans 14 ml d'eau à 60 C, on laisse refroidir la solution jusqu'à la temperature ambiante et l'on ajoute 66 ml d'ethanol, en agitant, à la température ambiante. On continue a agiter pendant une nuit, on recueille les cristaux qui se séparent on les sèche à 60 C pendant 16 h sous vide, et l'on obtient 5, 3 g de cristaux. Taux de
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recuperation = 81, 5 %
On détermine la teneur en solvant résiduel du produit, et l'on trouve qu'elle est de 0,05 % d'éthanol et de 0, 005 % au maximum de methanol. En ce qui concerne la glucosylmoranoline, la pureté est de 100 %.