SE469941B - Förfarande för framställning av glukosylmoranolinderivat - Google Patents

Description

469 941 10 15 20 25 30 35 2 cH2on cflgou cnzofl o ---o -nn on an nu no o 0 on ou n ou. un) (där n är ett heltal l - 5) och (I).

I ovan erhållna reaktionslösning ingår jämte oreagerad (III) och överreagerad (II) den önskade föreningen (I). Det rådande förhållandet mellan dessa föreningar i reaktionslösningen kan naturligtvis variera beroende på reaktionsbetingelserna. Det har i varje fall varit omöjligt att selektivt rena den önskade föreningen (I) ur blandningen.

Enligt studier som utförts kan (II) överföras till (I) i högt utbyte genom att behandla blandningen med glukoamylas (n-1.4-glukanglukohydrolas EC 3.2.l.3) (jämför JP B4 57/058890). Aven om en sådan metod är en bra framställ- ningsmetod finns oreagerad (III) fortfarande närvarande i blandningen efter behandlingen med glukoamylas och dessutom ingår under vissa reaktionsbetingelser även 4-0-u-D- -maltosylmoranolin och en mycket liten mängd av (II).

För att erhålla den önskade föreningen ur en sådan reaktions- lösning har det“varit nödvändigt att använda molekylviktfrak- tioneringsteknik med användning av 'Sephadex®' eller lik- nande eller kolonnkronatografi med reverserat fassystem med användning av 'Lichroprepg CN' (Merck Co) eller 'Micro- bonda' pack-NH2. För att övervinna ovannämnda nackdelar har omfattande studier utförts och det har visat sig att med tillämpning av fraktionerad kristallisation och användning av polärt lösningsmedel kan man effektivt undanröja de tekniska svårigheterna. som följdes av inlämning av en patentansökan 10 15 20 25 30 35 469 941 (JP A2 59/237326). Denna metod är en tillämpning av egen- skaperna som är gemensamma för moranoliner, vari kväveatomen är substituerad med lägre alkyl förutom glukosylmoranolinen enligt uppfinningen (problem som löses medelst föreliggande uppfinning).

Studierna har nu fortsatt när det gällt att förbättra fördel- arna med ovannämnda fraktionerade kristallisation och det har visat sig att vad gäller N-osubstituerade monoglukosylmorano- liner finns en metod, som ger betydligt bättre resultat än vad som ovan uppnåtts och detta har lett fram till föreliggande uppfinning.

Syftet med uppfinningen är sålunda att tillhandahålla ifråga- varande förening i högt utbyte, i högre enhet och utan problem.

Detta mål uppnås enligt ett första särdrag av uppfinningen genom att en blandning av ovannämnda föreningar (I). (II) och (III) underkastas s.k. fraktionerad kristallisation med an- vändning av metanol som är ett polärt lösningsmedel. Det har för första gången visat sig att användningen av metanol och N-osubstituerade monoglukosylmoranoliner ger en effekt, som är unik för uppfinningen.

Det andra särdraget hos uppfinningen är att en omröringsopera- tion utföres när man utsätter blandningen av (I), (II) och (III) för fraktionerad kristallisation. Det fysikalisk-kemiska faktum att en sådan mycket enkel operation som omröring resul- terar i ett påtagligt förbättrat resultat har för första gång- en påvisats genom uppfinningen.

Uppfinningens omfattning belyses närmare nedan.

Som ovan nämnts avser uppfinningen framställningen av den önskade föreningen (I) 1 mycket högt utbyte och på mycket enkelt sätt ur en blandning av (I), (II) och (III) under loppet av framställningen av (I). 469 941 10 15 20 25 30 35 Vid genomförande av förfarandet enligt uppfinningen omsâtts cyklodextringlukosyltransferas i t.ex. en vattenlösning inne- hållande (III) och cyklodextrin eller löslig stärkelse för framställning av en blandning av (I) och (II) och därefter be- handlas ned glukoamylas för överförande av (II) till (I).

Reaktionslösningen innehåller vanligen ca 30 % oreagerad (III) liksom en liten mängd 4-O-a-D-maltosylmoranolin och en mycket liten mängd av annan (II). Vanligen är emellertid den totala mängden av (II) ej mer än 2 % av det hela.

Enligt vatten uppfinningen upphettas t.ex. ovan angiven blandning i eller löses i vatten vid normal temperatur och metanol tillsättes. Därefter omröres lösningen vid behov vid viss hastighet och viss temperatur, varpå kristaller utkristalli- serar.

Bra resultat uppnås genom omröring under 24 tim och nöjaktigt resultat uppnås genom omröring vid ca 200 varv/min. Omrörings- hastigheten kan naturligtvis vara högre eller lägre än denna.

Utkristalliserade kristaller kan uppsamlas t.ex. genom filtre- ring. Kristallerna kan vid behov omkristalliseras. Som nedan framgår är det känt att kristallerna är molekylära föreningar av (I) och metanol.

Uttrycket 'molekylär förening' av glukosylmoranolin med meta- nol avser i detta sammanhang att metanol kombineras med gluko- sylmoranolin på sådant sätt att de ej utan svårigheter kan separeras och att den är en ny förening av en addukt av gluko- sylmoranolin och metanol. vari metanol bildar en solvation.

Ett annat särdrag hos uppfinningen år att tillämpa fraktiohe- rad kristallisation, varvid etanol används på en molekylär förening av (I) med metanol tillverkad enligt ovan.

Fraktioneringsmetoden utnyttjande skillnaden i lösligheter hos en molekylär förening av (I) med metanol vid separeringen av (I) ur en blandning av (I). (II) och (III), ger påtagligt 10 15 20 25 30 35 469 941 resultat men det är meningslöst såvida (I) ej separeras i rent tillstånd ur en molekylär förening av (I) med metanol.

Vid avlâgsnandet av metanol ur en molekylär förening av (I) med metanol är torkning därav vid 60°C under 24 tim eller mera i vakuum ej verkningsfull. Omkristallisation ur vatten ger endast ca 35 % utbyte och det är mindre än vad som är genom- förbart ur industriell synpunkt.

Det var sålunda nödvändigt att den molekylära föreningen löses i vatten, metanol avlägsnas genom behandling med ett starkt surt jonbytarharts följt av noggrann tvättning med vatten, varefter hartset elueras med ammoniakvatten och ammoniakvatt- net indunstas i vakuum för erhållande av kristaller. En sådan metod är mycket besvärlig och det var följaktligen ej möjligt att till fullo utnyttja effekten av föreliggande uppfinning att framställa (I) via en molekylär förening av den med meta- nol.

Vid genomförande av föreliggande uppfinning upphettas t.ex. reaktionsprodukten innehållande en molekylär förening av (I) ned metanol i vatten eller löses i vatten vid rumstemperatur och etanol sättes därtill. Därefter onröres lösningen vid be- hov vid viss hastighet och viss temperatur för erhållande av kristaller därur. I detta fall uppnås bra resultat genom on- röring under ca 24 tim. Vad beträffar omröringshastigheten kan roterande omröring vid ca 200 varv/min ge nöjaktiga resultat.

De utseparerade kristallerna kan uppsamlas genom t.ex. filtre- ring. Kristallerna kan omkristalliseras vid behov. Vidare kan om så erfordras torkning företas i vakuum eller på annat sätt.

Enligt undersökningar som utförts innehåller kristallerna er- hållna enligt ovan beskriven metod endast 0,03 - 0,1 % etanol som restlösningsmedel. Etanolen konstituerar ej någon moleky- lär förening med (I) och vidare föreligger den 1 sådan mängd att den är acceptabel som farmaceutiskt medel. Eftersom meta- nolhalten ej är högre än 50 ppm kan metanol helt avlägsnas ur den lolekylâra föreningen av (I) med metanol 1 betydande on- fattning. ' 47-*- Q'\ 10 15 20 25 30 35 Det är allmänt känt att en molekylär förening med ett lös- ningsmedel som en komponent ej är så lättlöslig i nämnda lös- ningsmedel. Lösligheterna för (III) och (I) i vattenhaltig metanol är ungefär densamma och det har genom uppfinningen be- kräftats att lösligheten för (I) sjunker med tiden. Det antas att detta beror på det faktum att (I) bildar en molekylär för- ening med metanol allteftersom tiden går varigenom lösligheten avtar.

Det är känt att när lösligheterna i lösningsmedel är desamma föreligger i allmänhet en skillnad mellan ämnena beträffande den tid, under vilken de kan existera i stabilt tillstånd under övermättat tillstånd, vilken tid benâmnes kristallisa- tionsinitieringstid. I allmänhet är denna tid för sockerarter i vattenhaltiga lösningsmedel lång. Såsom bekräftats genom föreliggande uppfinning har man med ifrågavarande förening uppnått det karakteristiska fenomenet att kristallisationsini- tieringstíden förkortas genom en enkel omröringsoperation. Det är ej lätt att anta förhållandet mellan omröringen och den förkortade kristallisationsinitieringstiden.

Enligt uppfinningen tillämpas vidare fraktionerad kristallisa- tion med etanol men anledningen till varför etanol utestänger metanol och varför den enligt uppfinningen framtagna för- eningen ej bildar en molekylär förening med etanol men ej med metanol är ej klar.

Enligt uppfinningen är det möjligt att framställa den önskade föreningen i högre enhet med en enkel metod. Vid rening av en sockerart ur en blandning av sockerarter kan den separeras genom t.ex. kolkolonnkromatografi eller kolonnkronatografi med användning av starkt surt katjonbytarharts av alkali- metall- eller jordalkalimetalltyp men det har varit oundvik- ligt att använda mycket komplicerade steg. Uppfinningen har helt löst dessa tekniska problem.

Uppfinningen âr också betydelsefull genom att som redan nämnts kristallisationsinitieringstiden nedbringas. Det har tidigare 'l 10 15 20 25 469 941 varit nödvändigt att låta reaktionsblandningen stå under mycket lång tid för att öka såväl renhet som utbyte men enligt uppfinningen räcker det med enbart tio gånger flera timmar och uppfinningen är som sådan industriellt mycket gynnsam.

Förfarandet enligt uppfinningen är också tillämpbart vid den farmaceutiska framställningen genom det faktum att metanol, som är skadlig för människokroppen och som är närvarande i den önskade föreningen i små mängder, kan avlägsnas i en form av en molekylär förening.

Uppfinningen belyses närmare med referensexempel och ut- föringsexenpel.

Testexenpel Han iakttog förändringarna i lösta mängder av var och en av glukosylmoranolin (GH) och moranolin (H) med tid som förflutit och effekten av omröringen därpå i 33 volym% vattenhaltig metanol innehållande en blandning av GH och H.

GH (210 mg) och 90 mg H togs upp i en kolv rymmande 50 ml och löstes i 0,3 ml vatten vid 60°C. Metanol (8,7 ml) tillsattes och det hela hölls vid 5°C eller vid 20°C. En av var och en av dem fick stå en tid och en annan omrördes vid 200 varv/min med användning av magnetomrörare som placerats däri. Lösningen togs ut periodiskt. centrifugerades och övervätskan analy- serades medelst high performance vâtskekromatografi. De ana- lytiska betingelserna var desamma som 1 referensexempel 1 nedan. Resultaten framgår av tabell 1. 469 941 5 10 15 20 25 30 35 Tabell 1 Löst mängd (g/1) ~\ Tid son Substans 5°C 20°C förflutit (h) onrört stått olrört stått 1 0 H 10.0 10.0 10,0 10,0 GH 23.0 23.0 23,0 23,0 1,5 H 10,2 9.8 10.5 9,7 GH 5.5 22.1 6,2 21.1 3.0 H 10,1 10,1 11,4 9,9 GH 4.2 22.0 4,4 21,3 10.0 H 9.9 10,0 10,2 9.8 GH 3.1 19,0 3,2 18,2 24.0 H 6.8 10.1 10.5 9,7 GH 3.2 9.7 3,1 7,9 I tabellen :enas ned 'stâtt' att innehållet 1 kolven skakades manuellt under 4 - 5 gånger om dagen för onröring av innehål- let.

Det framgår av tabellen att i fallet ned noranolin knappast ingen förändring alls förelåg vad gäller löslighet under de tillstånd. Efter omröring förelåg en tendens att lösligheten vid 5°C under 10 första tim såväl i 24 tim ökade. 'omrört' som i 'stâtt' I fallet ned glukosylmoranolin förelåg däremot knappast ingen förändring inom de tre första tinnarna vare sig vid 5°C eller 20°C 1 tillstånd 'stâtt' nedan efter 10 tim en minskning före- låg med successiv påtaglig tendens, varvid längden sjönk till hälften av den ursprungliga efter 24 til. Vidare hade mängden 10 15 20 25 30 35 469 941 sjunkit till l/4 efter 1,5 tim efter omröring i fallet med glukosylmoranolin. Effekten av omröringen på den upplösta mängden framgår sålunda uppenbart. I samtliga fall framgår att effekten av temperaturen på lösligheten är ringa.

Referensexempel 1 (1) Horanolin (21 g) löstes i en liten mängd vatten och lös- ningen instâlles på pH 5,7 med GN saltsyra. Efter inställ- ningen tillsattes vatten till 350 ml. Löslig stärkelse (72 g) löstes däri medan lösningen fortfarande var varm. Därefter hölls lösningen vid 50°C. 350 ml oren enzymlösning av 1000 en- heter/ml cyklodextringlukosyltransferas tillsattes och bland- ningen fick reagera vid 50°C under 2 dag. Efter reaktionen upphettades blandningen vid 80°C under 15 min. 5,6 g gluko- amylas ('Glucozyme AF-6 tillverkad av Amano Seiyaku KK) till- sattes och blandningen fick reagera vid 50°C under 24 tim.

Efter reaktionen upphettades blandningen vid 80°C under 15 min. centrifugerades och övervätskan överfördes till en kolonn med 'Dowex@ SOW' x 2 (H+) (där mängden harts var 500 ml). och den basiska substansen absorberades därmed.

Kolonnen tvättades väl med vatten, eluerades med lN ammoniak i vatten, eluatet koncentrerades i vakuum och den koncentrerade lösningen matades genom en kolonn med starkt basiskt jonbytar- harts ('Diaion SA-llA'. mängden harts 100 ml). Denna tvättades väl med vatten och såväl genommatad lösning som tvättvatten konbinerades och koncentrerades i vakuum till torrhet, vari- genom erhölls 34,8 g pulver.

Detta analyserades genom high performance vätskekromatografi och befanns vara en blandning av 26,1 % moranolin, 71,9 % glukosylmoranolin och 2 % 4-0-(a-D-maltosyl)-moranolin.

Betingelserna vid high performance vätskekromatografin var följande: 'Sumipax R74l' (Nucleosil SNH2, 5 um, 4 mm ID x 25 cm).

Framkallare: acetonitril-vatten (70:30); strömningshastighet 1 ml/min; RI-detektering (BRC-7510 tillverkad av Elmer Kogyo KK); dataprocessor: typ 655-60 tillverkad av Hitachi Ltd. 4-69 941 10 15 20 25 30 35 10 Referensexempel 2 Horanolin (21 g) underkastades samma reaktion som i referens- exempel 1 med undantag av att 7 g glukoamylas användes och reaktionen utfördes vid 50°C under 24 tim. 'a ¶ Reaktionsprodukten behandlades på samma sätt som i referens- exempel l och gav 31 g pulver.

Detta analyserades på samma sätt som i referensexempel 1 genom high performance vâtskekromatografi och befanns vara en bland- ning av 29,2 % moranolin, 70.0 % glukosylmoranolin och 0.8 % 4-0-(a-D-maltosy1)moranolin.

Exempel 1 En blandning (34.7 g) erhâllen i referensexenpel 1 löstes i 83 ll vatten, magnetomrörare placerades däri och 1305 ml neta- nol tillsattes under omröring vid ca 200 varv/min. Denna om- rördes vid rumstemperatur över natten och kristallerna som separerade uppsamlades genom filtrering och torkades i vakuum vid 60°C under 16 tim och gav 22.4 g kristaller. De resulter- ande kristallerna innehöll 6,8 viktt metanol och vid analys genom high performance vâtskekromatografi var renheten i form av glukosylmoranolin 99.9 %. Den utvunna mängden var 83,3 %. [a]š4 + 1l4.3° (c. 1,07 % vatten).

Elementaranalys beräknad för C12H23N09 .0,65 CH3OH: Ber. (2): C 43.90. H 7.45, N 4.05 Funnet (%): C 43.65. H 7,76, N 4,15 ln - min: a (ppm: 2.45 (in. aa. Jia. ie. 12.3 Hz. Jia. 2. 10.3 Hz. Hla). 2.61 ~ 2,71 (lH, 1. H5), 3,11 (IH. dd, Jla. le 12.3 Hz. Jle. 2. 4.9 Hz. Hle), 3.34 (2.4H. s. CH30H). 3,35 ~ 3.88 (1lH. m, 4H (-CHZOH). SH (-CHOH). lH (H-4). lH (H-5')). 5.32 (lH. d. 3.7 Hz. H-l'. anonerisk proton). m1* Produkten torkades i vakuun vid 60°C och mängden resterande metanol uppnâttes. Efter torkning 1 10 tim innehöll den 7,5 % i form av såväl pulveriserade som icke pulveriserade kristal- 10 15 20 25 30 35 4-69 941 ll ler. efter 16 tim var halterna 6.6 resp. 6,8 % och efter ytterligare 10 tim var de 6,3 resp. 6,9 %. Av dessa fakta framgår att metanolen var ganska starkt knuten till glukosyl- moranolin. vilket gör det troligt att substanserna är i mole- kylâr förening med metanol.

Uppmätning av restmetanol genomfördes genom gaskromatografi under följande betingelser.

Apparatur: 'Gas-Chro Model l03C' (tillverkad av Okura Rikagaku KK): kolonn: G-0.1 m; temperatur: injektion 200°C. kolonn l20°C; bärare: 1,0 kg/cm2 kväve räknat som vatten (10 ul/min).

Exempel 2 Kristallerna (10 g) erhållna i exempel 1 löstes i 20 ml vatten vid 60°C, lösningen fick svalna genom att stå till dess rums- temperatur uppnâtts och 90 ml etanol tillsattes under omröring ned magnetomrörare. Omröringen skedde över natten och därvid separerade kristaller uppsamlades genom filtrering, torkades vid 60'C under 16 tim i vakuum och 7,5 g kristaller erhölls.

Utvunnen mängd 80,5 %.

Restlösningsmedlen som fanns uppmättes medelst gaskromatografi på samma sätt som i exempel 1 och ca 0,06 % etanol återfanns.

Hetanolhalten var emellertid ej högre än 0,005 % och renheten av glukosylmoranolin var 100 %.

Exempel 3 .

Blandningen (10 g) erhållen 1 referensexempel 2 löstes i 15 ml vatten och 285 ml metanol tillsattes under omröring med magnetomrörare. Omröring företogs över natten och kristaller som separerade uppsamlades genom filrering. De torkades 1 vakuum vid 60°C under 10 tim och gav 7,1 g kristaller. Utvun- nen mângd 91.7 %.

Analys företogs medelst high performance vätskekromatografi och produkten befanns innehålla 3,1 2 moranolin 96.9 % gluko- sylnoranolin. Aven 6.1 % restmetanol detekterades. 469 941 10 12 Exempel 4 Blandningen (7 g) erhållen i exempel 3 löstes i 14 ml vatten vid 60°C, lösningen fick svalna tills den antagit rumstempera- tur. varefter 66 ml etanol tillsattes under omröring vid rums- temperatur. Blandningen fick stå över natten och kristaller som separerade uppsamlades, torkades vid 60°C under 16 tim i vakuum och 5,3 g kristaller erhölls. Utvunnen mängd 81.5 %.

Restlösningsnedel i produkten uppnâttes och befanns vara 0.05 % etanol och högst 0,005 % metanol. Renheten av glukosyl- moranolin var 100 %.

Claims (1)

10 15 20 25 30 469 941 13 Patentkrav

1. Förfarande för framställning av en molekylär förening av metanol och glukosylmoranolin representerad av formel (I) CHQOH CHQOH NH HO 0 OH OH k ä n n e t e c k n a t av att fraktionerad kristallisation med användning av metanol tillämpas under omröring på en blandning av följande tre föreningar, nämligen glukosyl- moranolin representerad av formel (I), oligoglukosylmoranolin representerad av formel (II) CH20H CH20H \ CH20H O O NH OH __}