KR950004899B1 - 모라노린 유도체의 제조법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

[발명의 명칭]

모라노린 유도체의 제조법

[발명의 명칭]

본 발명은 하기식[I]로 표시되는 글루코실 모라노린 유도체의 신규한 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에 관한 화합물 [I]은 당부가시에 우수한 혈당 상승억제 작용등을 가지며, 의약품, 예를들면, 당뇨병 치료약으로서 특히 유용하다.(일본국 특개소 56- 081595호 공보 등).

종래에는 본 발명 화합물을 제조하기 위하여 다음과 같은 방법을 이용하여 왔다.

우선 하기식[III]로 표시되는 모라노린과 사이클로덱스트린 또는 가용성 전분을 함유하는 수용액에, 사이클로덱스트린 글리코실 트랜스퍼라제(EC 2.4.1.19 , cyclo-dextrin glycosyltransferase)를 작용시켜서, 상기식[I] 및 하기식[II]로 표시되는 올리고 글루코실 모라노린 유도체의 혼재물을 제조한다.

[n은 1-5의 정수를 나타냄]

통상적으로, 상기 반응액중에, 목적화합물인 [I]외에도 미반응된 화합물[III], 및 반응이 진행된 화합물[II]가 함유되어 있다.. 반응용액중의 이들의 존재비율은 그 반응조건에 따라 당연히 변화하지만, 이들의 혼재물중에서 화합물[I]만을 선택적으로 정제하는 방법이 필수적인 공정이었다.

본 발명자들의 연구에 의하면, 이 혼재물에 글루코아밀라제(α-1,4 글루칸 글루코하이드로라제 EC 3.2.1.3)을 작용시키므로서, 다량의 화합물[II]를 화합물[I]로 전환시킬 수 있었다(일본국 특개소 57-058890호 공보). 이 방법은 우수한 제조방법임에는 틀림없으나, 상기 글루코아밀라제를 반응시킨후의 혼재물에는 아직 미반응의 화합물[III]이 함유되어 있고, 또한 반응조건에 따라, 4-0-α-D-말토실모라노린 또는 극미량의 화합물[II]가 함유되어 있었다.

이와같이 해서 얻어진 반응액으로 부터 목적 화합물을 얻기위해서는 종래 세파덱스 등의 분자량 분획, 리크로프래프 CN(lichroprep C N(등록상표) Merck Co.) 또는 마이클로 본다 팩-NH₂등의 역상계의 컬럼크로마토그래피등의 방법에 의하지 않으면 안되었다. 본 발명자들은, 상기 결점을 극복할 목적으로 여러가지 연구를 거듭하여, 극성용매를 이용하여 분별결정법을 적용하므로서 상기 기술적 곤난성을 해결할 수 있음을 발견하고 특허출원(일본국 특원소 59-237326호)하였다. 이 방법은 본 발명 화합물인 글루코실 모라노닌외에도, 모라노린 분자중의 질소가 저급알킬로 치환된 것에 공통되는 성질을 이용하는 것이었다.

본 발명자들은 상기한 분별결정법이 갖는 장점을 다시 개량할 목적으로 연구를 속행한 결과, 본 발명 화합물인 N-무치환모노글루코실 모라노린에 대하여 상기 발명과는 비교할 수 없을 정도로 현저하게 우수한 결과를 얻을 수 있는 방법이 있다는 것을 찾아내고 본 발명에 도달한 것이다.

즉, 본 발명의 목적은, 본 발명 화합물을 종래방법보다 높은 수율로, 더 높은 순도로, 또한 용이하게 수득하는데 있다.

본 발명의 제1의 특성은, 상기 화합물 [I], [II] 및 [III]의 혼재물에 극성용매인 메탄올을 사용하여, 소위 분별결정법을 실시하는 점에 있다. N-무치환 모노글루코실 모라노린에 대하여 메탄올을 사용하므로서 본 발명의 특수한 효과를 제공한다는 사실은 본 발명자들에 의해 처음으로 발견된 것이다.

본 발명의 제2의 특성은, 상기 화합물[I], [II] 및 [III]의 혼재물에 분별결정법을 실시하는데 있고, 교반 조작을 행하는데 있다. 상기의 단순한 교반 수법이 본 발명의 절대적인 효과에 기인한다는 물리화학적 사실은, 본 발명자들이 처음 발견한 것이다.

이외에서는 본 발명의 구성에 대하여 상세히 설명한다. 본 발명은 상기한 바와 같이, 화합물[I]을 제조하는 과정에 있어서, 화합물[I], [II] 및 [III]의 혼재물로 부터 매우 우수한 수율로 극히 단순한 방법에 의해 목적물인 화합물[I]만을 취득하는 것이다.

본 발명의 실시에 있어서는, 예를들면, 상기한 바와같이 화합물[III]과 사이클로 덱스트린 또는 가용성 전분을 함유하는 수용액에 사이클로 덱스트린 글리코실 트란스퍼라제를 적용시켜서 화합물 [I] 및 [II]의 혼재물을 제조하고, 다시 글루코아밀라제를 작용시켜서 화합물[II]를 [I] 변화시킨다. 반응용액중의 미반응 화합물[III]이 일반적으로 30% 내외로 혼재하게 된다. 또, 미량의 4-0-α-D-말토실모라노린이나 극미량의 기타 화합물[II]가 함유되어 있지만, 일반적으로 화합물 [II]만의 총량은 전체의 2% 이하이다.

본 발명에 있어서는 예를들면 상기 혼재물을 물속에 가열시키거나 평상온도에서 용해시키고 메탄올을 가한다. 그후, 용액을 필요에 따라 일정한 속도로 임의의 온도에서 교반하므로서 결정이 산출된다.

교반시간은 24시간이 양호한 결과를 산출한다. 또, 교반속도는 200rpm 정도의 회전교반으로 충분한 결과를 얻을 수 있다. 이것보다 빨라도 좋고 이것보다 늦어도 좋다.

산출된 결정은, 여과등의 방법에 의하여 채취할 수 있다. 또, 결정은 필요에 따라서 재결정할 수 있다. 후술하는 바와같이, 이 결정은 화합물[I]과 메탄올과의 분자화합물인 것을 알수 있다.

그리고, 본 명세서에 있어서, 글루코실 모라노린과 메탄올의 「분자화합물」은 메탄올이 글루코실 모라노린과 쉽게 이탈하지 않는 상태에서 결합되어 있으며, 메탄올이 용매화를 생성시킨 글루코실 모라노린의 메탄올 부가물이라고 하는 일종의 새로운 화합물을 의미하는 것으로 한다.

본 발명의 다른 요지는 상기한 바와같이 해서 제조한 화합물[I]과 메탄올의 분자화합물에 에탄올을 사용하는 분별결정법을 적용하는데 있다.

화합물 [I], [II] 및 [III]의 혼재물로 부터 화합물[I]만을 취득하는데 있어서, 화합물 [I]과 메탄올의 분자화합물을 제조하고 이것이 갖고 있는 용해성의 차이를 이용하여 분별하는 방법은 정말 경이적인 효과를 초래하는 것이나, 화합물[I]과 메탄올의 분자화합물로부터 화합물 [I]을 정제, 취득하는 것이 되지 않을 때에는 하등의미도 없다. 화합물 [I]과 메탄올의 분자화합물로 부터 메탄올을 제거하기 위하여서는, 예를들면, 진공하에 60℃에서 24시간 이상 건조시켜도 효과를 얻을 수 없다. 또, 물로부터의 재결정을 실시해도 회수율이 약 35%로 낮고, 공업적인 실용성이 적다.

따라서, 해당 분자 화합물을 물에 용해하고, 강산성 이온 교환수지에 걸어서 충분히 수세하여 메탄올을 제거하고, 그후에 암모니아로 용출하고, 암모니아수를 감압하에 유지하고, 결정을 시키는 것이 필요했다. 이와같은 방법은 극히 번잡하고, 따라서, 상술한 메탄올과의 분자화합물을 경유하여 화합물 [I]을 취득하는 본 발명의 효과를 충분히 활용할 수 없었다.

본 발명의 실시는, 상기 화합물[I]과 메탄올의 분자화합물을 함유하는 반응생성물, 예를들면, 수중에 가열시키고 또는 상온에서 용해시키고, 에탄올을 가한다. 그후, 이 용액은 필요에 따라 일정한 속도로, 임의의 온도에서 교반함으로써 결정을 산출한다. 이 경우에도 약 24시간 정도의 교반으로 양호한 결과를 얻을 수 있다. 또 200rpm 정도의 교반 속도의 회전 교반으로 충분한 결과가 얻어진다. 산출하는 결정은 여과등의 방법에 의하여 채취할 수 있다. 그리고 필요에 따라 감압 건조등의 처리를 할 수 있다.

본 발명자들의 시험에 의하면, 상기 방법에 의하여 얻어지는 결정에는 잔류용매로서 0.03~0.1% 정도의 에탄올 밖에 함유하는 것이 없다. 이 에탄올은 화합물 [I]과 분자화합물을 구성하고 있는 것은 아니고, 또 의약품으로서 허용 가능한 함량이라고 할 수 있다. 또 동시에 메탄올 함량은 50ppm 이하이므로, 실질상으로 화합물 [I]과 메탄올의 분자화합물로 부터 메탄올이 완전히 제거될수 있었던 것이된다.

일반적으로, 어떤 용매와 분자화합물을 제조하면 그 용매에 잘 용해되기 어려운 것을 알수 있다. 화합물[III]과 [I]의 함수 메탄올에 대한 용해도는 거의 동일하지만 화합물 [I]은 시간이 경과할 수록 그 용해도가 감소되는 특이한 성질을 가지는 것을 본 발명자등이 확인하였다. 시간이 경과함에 따라 화합물 [I]이 메탄올과의 분자 화합물을 생성하여 그것에 의하여 용해도가 감소되는 것으로 생각된다.

일반적으로 용매에 대한 용해도는 동일해도 과포화 상태로 안정하게 존재할 수 있는 시간(기정(起晶)시간)의 장단에는 물질에 따라서 차이가 있다. 함수 용매에 대해서는 당류의 기정시간이 일반적으로 긴 것이 보통이다.

본 발명자 등에 의하여 확인된 바와같이 본 발명 화합물에 대해서는 교반이라는 단순한 수법에 의하여 이 기정시간의 단축이라는 특이한 현상이 발생했다. 교반과 기정시간의 단축과의 인과 관계는 쉽게 이루어 알수 없는 것이었다.

본 발명에서는 또한 에탄올에 의한 분별결정법을 사용한다. 이때 에탄올이 어떻게 메탄올을 구축하는지, 또 본 발명 화합물이 왜 메탄올과는 분자화합물을 형성하면서 에탄올과는 분자화합물을 형성하지 않는지에 대해서는 명확한 이유를 설명할 수가 없다.

본 발명에 의하면 단순한 방법에 의하여 매우 순도가 높은 목적 화합물을 얻을 수 있다. 당의 혼재물들중에서 그 하나를 정제하기 위해서는 지금까지는 예를들어 카본컬럼크로마토그래피에 의하여 분리하거나 또는 알칼리 금속형 또는 알칼리토류 금속형의 강산성 카티온 교환수지의 컬럼크로마토그래피에 의한 방법등을 취할 수 있었으나, 어떻든 극히 번잡한 처리를 필수적으로 거쳐야 한다. 본 발명은 이들의 기술적 곤난성을 모두 해결한 것이다.

본 발명은 또 상기와 같이 기정시간을 단축할수 있다는 점에서도 중요하다. 종전에는 대단히 장시간 방치하여 순도와 수율을 높이는 연구를 필요로 했으나 본 발명의 방법에 의하면 수십시간이면 충분하고 그만큼 공업적으로 유리한 방법인 것이다.

본 발명은 또한 분자화합물로서 목적 화합물 중에 극미량 존재함으로써 인체에 유해한 메탄올을 제거할 수 있다는 점에서도 의약품 제조에 유용하다.

(실시예)

이하 시험에, 참고예 및 실시예를 들어 다시 상세히 설명한다.

[시험예]

글루코실 모라노린(GM)과 모라노린(M)의 혼합물의 33.3%(V/V) 함수메탄올 중에서의 M와 GM 각각의 용해량의 시간적 변화와 그것들에 대한 교반효과를 관찰했다.

GM 210mg 및 M 90mg을 50ml의 플라스크에 담아, 물 0.3ml를 첨가하고 60℃에서 용해한다. 메탄올 8.7ml를 첨가하여 5℃와 20℃에서 1개는 정치하고, 다른 1개에 자기교반기를 넣어서 200rpm으로 회전 교반했다. 시간 경과에 따라 액을 샘플링하고 원심분리해서 맑은 상청액을 고속액체 크로마토그래피로 분석했다. 분석조건은 후기하는 참고예 1과 동일하다.

결과를 표 1에 표시했다.

[표 1]

상기 표에서, 정치란 하루에 4~5회 손으로 플라스크를 진탕하여 혼합한 것이다.

상기의 표와 같이 모라노린은 정치, 교반이 다같이 약 10시간까지는 그 용해도에 거의 변화가 없다. 교반했을 경우에는 5℃, 24시간에서 용해량이 감소하는 경향이 있다. 한편 글루코실모라노린은 정치의 경우, 5℃, 20℃에서 다같이 3시간 까지는 거의 변화를 볼수 없는 것이 10시간에는 감소가 나타나고, 차차로 현저해져서 24시간 후에는 초기의 절반 이하가 된다. 또 글루코실 모라노린은 교반했을 경우, 이미 1.5시간을 경과했을 시점에서 1/4정도로 감소되고 있다. 교반이 용해량에 영향을 미치는 것이 명백하다. 또 어느 경우에도, 온도가 용해량에 주는 영향은 적은 것으로 생각된다.

[참고예 1]

(1) 모라노린 21g을 소량의 물에 용해하여 6N 염산으로 pH를 5.7로 조정한다.조정후 물을 첨가하여 350ml로 한다. 가용성 전분 72g을 가열시 용해한다. 용해 후 50℃로 한후, 1000유닛/ml의 사이클로 덱스트린 글리코실 트랜스퍼라제의 조 효소액 350ml를 첨가하여, 50℃에서 2일간 반응시킨다. 반응액후 80℃로 15분간 열처리한 후 글루코아밀라제(天野制藥(株)製, 글루코자임 AF-6) 5.6g을 첨가하여 50℃에서 24시간 반응시킨다. 반응후 80℃에서 15분간 열처리한 후 반응액을 원심 분리하여 맑은 상청액을 다우엑스 50W×2(H⁺)의 컬럼(수지량 500ml)에 통과시키고, 염기성 물질을 흡착시킨다. 충분히 수세한 후, 1N 암모니아수로 용출하여 용출액을 감압하에 농축한 후 강염기성 이온 교환수지(다이어 이온 SA-11A, 수지량 100ml)를 통과시킨다. 충분히 수세한 후, 통과액과 세액을 감압하에 농축 건조해서 분말 34.8g을 얻는다.

이것은 고속액체 크로마토그래피로 분석한 결과, 모라노린(26.1%), 글루코실 모라노린(71.9%), 4-0-(α-D-말토실)모라노린(2%)으로 구성되는 혼합물이었다.

또, 고속액체 크로마토그래피의 조건은 이하와 동일했었다.

Sumipax R741(Nucleosil 5NH₂, 5μm, 4mm I D×25㎝), 전개용매 : 아세토니트릴-물(70 : 30), 유속 : 1ml/min, RI검출(에루마 工學株式會社製, ERC-7510), 데이터 프로세서(日立製作所製, 655-60).

[참고예 2]

참고예 1과 동일하게 모라노린 21g을 반응시켰다. 단, 글루코아밀라제는 7g을 첨가하여 50℃에서 24시간 반응시켰다.

참고예 1과 동일하게 처리하여 분말 31g을 얻었다.

이것은 참고예 1과 동일하게 고속액체 크로마토그래피로 분석한 결과, 모라노린 (29.2%), 글루코실 모라노린(70.0%), 4-O-(α-D-말토실)모라노린(0.8%)으로 구성되는 혼합물이었다.

[실시예 1]

상기 참고예 1에서 얻은 혼합물의 34.7g을 83ml의 물에서 용해하고 자기 교반기에 넣어 약 200rpm로 교반하면서 메탄올 1305ml를 첨가한다. 하룻밤 실온에서 교반을 계속하여 석출한 결과를 여취하고 감압하에서 60℃로 16시간 건조하여 22.4g을 얻는다. 얻은 결정은 메탄올 6.8%(w/w)를 함유하는 것이었으나, 고속액체 크로마토그래피로 분석하면 글루코실 모라노린으로서의 순도는 99.9%이었다.

회수율 83.3%

원소분석치 : C₁₂H₂₃N O₉·0.65CH₃OH로 하여

계산치(%) : C ; 43.90, H ; 7.45, N ; 4.05.

실측치(%) : C ; 43.65, H ; 7.76, N ; 4.15.

¹H-NMR : σ(ppm) : 2.45(1H, dd, J1a, 1e, 12.3Hz, J1a, 2, 10.3Hz, H1a), 2.61~2.71(1H, m, H5), 3.11(1H, dd, J1a, 1e 12.3Hz, J1e, 2, 4.9Hz, H1e), 3.34 (2.4H, s, CH₃OH), 3.35~3.88[11H, m, 4H(-CH₂OH), 5H(-CH-OH), 1H(H-5' )], 5.32(1H, d, 3.7Hz, H-1', 아로메틱 프로톤)

이것을 진공펌프로 감압하에 60℃에서 건조한 후, 잔류메탄올을 측정한 결과, 10시간 건조후에 있어서는 분쇄한 결정으로 7.5%(미분쇄 결정으로도 7.5%, 이하 동일)가 잔류하고, 같은 조건하에서 다시 16시간 후에는 6.6%(6.8%)이 잔류하고, 같은 조건하에 다시 10시간후에는 6.3%(6.9%)이 잔류하고 있었다. 이러한 사실에서 메탄올이 글루코실 모라노린에 강고(强固)히 들어 있음이 명백하고, 이것이 메탄올과의 분자화합물인 것을 뒷받침하고 있다. 또, 잔류 메탄올의 측정은 이하의 가스크로마토그래피에 의해 실시했다.

기종(機種) : 가스크로 MODEL 103C 大倉理化學(株), 컬럼 : G-O, 1m, 온도 : 주입 200℃, 컬럼, 120℃, 캐리어 H₂O환산(μl/min) N₂1.0kg/㎠

[실시예 2]

참고예 1에서 얻은 결정 10g을 물 200ml에 60℃로 용해하고 실온까지 방치 냉각한 후 자기 교반기로 교반하면서 에탄올 90ml를 첨가한다. 하룻밤 실온에서 교반을 계속한 후, 생성된 결정을 여취하여 감압하에 60℃에서 16시간 건조하여 결정 7.5g을 얻었다.

회수율 80.5%

이것의 잔류용매를 실시예 1과 동일한 방법으로 가스크로마토그래피에 의하여 측정하면 에탄올 0.06% 정도를 함유하나 메탄올은 0.005% 이하이고 글루코실모라노린의 순도는 100%이었다(융점 189~192℃).

[실시예 3]

참고예 2에 의하여 얻은 혼합물 10g을 물 15ml에 용해하고, 자기 교반기로 교반하면서 285ml를 첨가한다. 하룻밤 동안 교반한 후 생성된 결정을 여취한다. 감압하에서 60℃에서 10시간 건조하여 결정체 7.1g을 얻었다(회수율 91.7%).

이것을 고속액체 크로마토그래피로 분석하면 모라노린 3.1%, 글루코실 모라노린 96.9%이었다. 또 잔류 메탄올은 6.1%이었다.

[실시예 4]

실시예 3에서 얻은 혼합물 7g을 물 14ml에 60℃로 용해하여 실온까지 방치냉각 한후 실온에서 교반하면서 에탄올 66ml를 첨가한다. 하룻밤동안 교반한 후, 생성된 결정을 모아서 감압하에 60℃에서 16시간 건조하고, 결정 5.3g을 얻었다.

회수율 81.5%.

이것의 잔류 용매를 측정하면, 에탄올 0.05%, 메탄올 0.005% 이하이었다.

또, 글루코실 모라노린으로서의 순도는 100%이었다.

Claims (2)

1. 하기식[I]로 표시되는 글루코실 모라노린, 하기식[II]로 표시되는 올리고글루코실 모라노린 및 하기식[III]으로 표시되는 모라노린의 3개의 혼합물중에 에탄올을 사용하는 분별결정법을 적용하는 것을 특징으로 하는, 하기식[I]으로 표시되는 글루코실 모라노린과 메탄올과의 분자 화합물의 제법.

   

   [식중 n는 1~5의 정수를 표시한다.]

   
2. 하기식[I]로 표시되는 글루코실 모라노린과 메탄올의 분자화합물을 에탄올을 사용하는 분별결정법에 적용하는 것을 특징으로 하는 하기식[I]로 표시되는 글루코실 모라노린의 제법.