CH671766A5

CH671766A5 -

Info

Publication number: CH671766A5
Application number: CH1429/87A
Authority: CH
Inventors: Yoji Ezure; Masaji Yamamoto; Shigeaki Maruo; Makoto Sugiyama
Original assignee: Nippon Shinyaku Co Ltd
Priority date: 1986-04-15
Filing date: 1987-04-13
Publication date: 1989-09-29
Also published as: DE3712799A1; IT1206061B; NL8700731A; KR950004899B1; FR2601019B1; SE8701317L; DE3712799C2; GB8708193D0; SE8701317D0; IT8747798A0; FR2601019A1; ES2005160A6; AT392474B; GB2190081A; ATA95587A; US4806633A; JPS62242692A; BE1000157A5; GB2190081B; KR870010070A

Description

DESCRIPTION

La présente invention concerne un nouveau procédé de préparation d'un dérivé de la glucosylmoranoline représenté par la formule I suivante

CH2OH CH2OH

(I)

(dans laquelle n est un entier de 1 à 5) et de (I).

35 Dans la solution réactionnelle ci-dessus, du (III) n'ayant pas réagi et du (II) ayant réagi à l'excès sont généralement présents en plus du (I) désiré. Le rapport de ces composés dans la solution réactionnelle peut évidemment varier en fonction des conditions réac-tionnelles. En tout cas, il est indispensable de purifier sélectivement 40 le (I) désiré à partir du mélange.

Conformément à l'étude de la titulaire, le (II) peut être transformé en (I) avec un rendement élevé en traitant le mélange par la glucoamylase (alpha-1,4-glucaneglucohydrolase EC 3.2.1.3) (voir demande de brevet japonais 57/058890). Bien que ce procédé soit un 45 bon procédé de préparation, du (III) n'ayant pas réagi est toujours présent dans le mélange après le traitement par la glucoamylase et, en outre, de la 4-O-alpha-D-maltosylmoranoline et une très faible quantité de (II) sont également présentes dans certaines conditions réactionnelles.

so Pour obtenir le composé désiré à partir d'une telle solution réactionnelle, il était nécessaire d'utiliser un fractionnement par masses moléculaires en utilisant du Sephadex ou un produit analogue ou une Chromatographie sur colonne en phase inversée en utilisant du Lichroprep CN (marque déposée: Merck Co) ou du Microbonda-55 pack-NH2. Pour surmonter les inconvénients ci-dessus, la titulaire a effectué des études poussées, et elle a trouvé que l'utilisation de la cristallisation fractionnée en utilisant un solvant polaire était efficace pour tourner cette difficulté technique, et elle a déposé une demande de brevet (voir demande de brevet japonais 59/237326). Ce procédé 60 est une application des propriétés qui sont communes aux moranoli-nes dans lesquelles l'atome d'azote est substitué par un groupe alkyle inférieur, en plus de la glucosylmoranoline de la présente invention.

La titulaire a poursuivi les études en vue d'améliorer les avantages de la cristallisation fractionnée ci-dessus, et elle a trouvé qu'en ce 65 qui concerne les monoglucosylmoranolines N non substituées de la présente invention, il existe un procédé qui donne des résultats bien supérieurs à ceux de l'invention ci-dessus, et elle a réalisé la présente invention.

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Ainsi, un des buts de la présente invention est de fournir le composé de la présente invention avec un rendement plus élevé, une pureté plus élevée et sans difficulté.

La première caractéristique de la présente invention est de soumettre un mélange des composés (I), (II) et (III) ci-dessus à une «cristallisation fractionnée» en utilisant du méthanol, qui est un solvant polaire. La titulaire a trouvé tout d'abord que l'utilisation de méthanol sur des monoglucosylmoranolines N non substituées donne un effet caractéristique de la présente invention.

La seconde caractéristique de la présente invention est d'effectuer une opération d'agitation lorsqu'on soumet le mélange de (I), (II) et (III) à une cristallisation fractionnée. Le fait physico-chimique qu'une opération aussi simple que l'agitation conduise à un résultat marqué de la présente invention a été découvert pour la première fois par la titulaire.

Le contenu de la présente invention sera illustré plus en détail ci-dessous.

Comme il a déjà été indiqué, la présente invention concerne la préparation du composé (I) désiré avec un rendement très élevé et dans une opération très simple à partir d'un mélange de (I), (II) et (III) au cours de la préparation de (I).

Lorsqu'on effectue la présente invention, on fait agir la cyclodextrine glycosyltransférase sur une solution aqueuse contenant du (III) et de la cyclodextrine ou de l'amidon soluble pour préparer un mélange de (I) et de (II), puis on la traite par la glucoamylase pour transformer (II) en (I). En général, la solution réactionnelle contient environ 30% de (III) n'ayant pas réagi, ainsi qu'une faible quantité de 4-O-alpha-D-maltosylmoranoline et une très faible quantité d'autres (II). Mais en général, la quantité totale de (II) ne dépasse pas 2% du tout.

Dans la présente invention, le mélange ci-dessus est par exemple chauffé dans de l'eau ou dissous dans de l'eau à la température ambiante, et on y ajoute du méthanol. Puis on agite la solution, si nécessaire, à une certaine vitesse et à une certaine température, de telle sorte que les cristaux se séparent.

Un bon résultat est obtenu en agitant pendant 24 h, et un résultat suffisant est obtenu en agitant à environ 200 tours/min. Evidemment, la vitesse d'agitation peut être plus élevée ou plus faible que celle-ci.

Les cristaux qui se séparent peuvent être recueillis, par exemple par filtration. Les cristaux peuvent être recristallisés si nécessaire. Comme il sera indiqué plus loin, il est connu que ces cristaux sont un composé moléculaire de (I) avec le méthanol.

L'expression «composé moléculaire» de la glucosylmoranoline avec le méthanol signifie ici que du méthanol se combine avec la glucosylmoranoline dans un état tel qu'ils ne soient pas séparés aisément, et qu'il s'agit d'un composé nouveau, un composé d'addition de la glucosylmoranoline avec le méthanol, dans lequel le méthanol est un composé solvatant.

Une autre caractéristique de la présente invention est d'utiliser une cristallisation fractionnée dans laquelle de l'éthanol est utilisé pour donner un composé moléculaire de (I) avec le méthanol tel que préparé ci-dessus.

Les moyens de fractionnement utilisant la différence de solubilité d'un composé moléculaire de (I) avec le méthanol dans la séparation de (I) d'un mélange de (I), (II) et (III) donnent un résultat marqué, mais il serait sans signification si (I) n'était pas séparé à l'état pur du composé moléculaire de (I) avec le méthanol.

Pour l'élimination du méthanol du composé moléculaire de (I) avec le méthanol, il est inefficace de le chauffer sous vide à 60° C pendant 24 h ou plus. La recristallisation dans l'eau donne un taux de récupération d'environ 35% seulement, et elle est moins pratique du point de vue industriel.

En conséquence, il a été nécessaire de dissoudre ce composé moléculaire dans de l'eau, d'éliminer le méthanol en le traitant par une résine échangeuse d'ions fortement acide, puis en le lavant soigneusement à l'eau, puis d'éluer la résine avec de l'ammoniaque et de faire évaporer l'ammoniaque sous vide pour donner des cristaux. Un tel procédé est très fastidieux et, en conséquence, il n'est pas possible d'utiliser pleinement l'effet de la présente invention d'obtention de (I) en passant par un composé moléculaire de celui-ci avec le méthanol.

5 Lorsqu'on effectue la présente invention, le produit de réaction contenant un composé moléculaire de (I) avec le méthanol est par exemple chauffé dans de l'eau ou dissous dans de l'eau à la température ambiante, et de l'éthanol lui est ajouté. Puis la solution est agitée si nécessaire à une certaine vitesse et à une certaine tempéra-io ture pour donner des cristaux à partir de celle-ci. Dans ce cas, on obtient de bons résultats en agitant pendant 24 h environ. En ce qui concerne la vitesse d'agitation, une vitesse de rotation d'environ 200 tours/min donne un résultat suffisant. Les cristaux qui se séparent peuvent être recueillis, par exemple par filtration. Les cristaux 15 peuvent être recristallisés si nécessaire. En outre, si nécessaire, on peut appliquer un chauffage sous vide ou d'autres moyens.

Conformément aux essais effectués par la titulaire, les cristaux obtenus par le procédé ci-dessus ne contiennent que 0,03 à 0,1% d'éthanol comme solvant résiduel. Cet éthanol ne constitue pas un 20 composé moléculaire avec (I) et, en outre, sa quantité est telle qu'il est acceptable comme médicament. Comme la teneur en méthanol ne dépasse pas 50 ppm, le méthanol peut être éliminé de manière pratiquement complète du composé moléculaire de (I) avec le méthanol.

25 II est connu qu'en général, les composés moléculaires contenant un solvant comme constituant ne sont pas aisément solubles dans ce solvant. Les solubilités de (III) et de (I) dans le méthanol aqueux sont presque les mêmes, et il a été confirmé par la titulaire qu'avec le temps, la solubilité de (I) diminue. On suppose que cela est dû au 30 fait que (I) produit un composé moléculaire avec le méthanol au cours du temps, de sorte que sa solubilité diminue.

Il est connu qu'en général, même lorsque les solubilités dans les solvants sont les mêmes, il existe une différence entre les substances en ce qui concerne le temps pendant lequel elles peuvent exister dans 35 un état stable à l'état sursaturé, ce temps étant connu sous le nom de temps d'amorçage de la cristallisation. En général, pour les sucres dans des solvants aqueux, ce temps est long. Comme l'a confirmé la titulaire, le phénomène caractéristique selon lequel ce temps d'amorçage de la cristallisation est raccourci par une simple opération 40 d'agitation s'observe avec le composé de la présente invention. Il n'est pas aisé de prévoir les relations entre l'agitation et le raccourcissement du temps d'amorçage de la cristallisation.

Dans la présente invention, la cristallisation fractionnée par l'éthanol est en outre appliquée, mais la raison pour laquelle l'étha-45 noi chasse le méthanol et pour laquelle le composé de la présente invention ne forme pas un composé moléculaire avec l'éthanol tandis qu'il le fait avec le méthanol n'est pas suffisamment claire.

Conformément à la présente invention, il est possible de préparer le composé de haute pureté désiré par un procédé simple. Pour la 50 purification d'un sucre à partir d'un mélange de sucres, celui-ci a été séparé par exemple par Chromatographie sur une colonne de carbone, ou par Chromatographie sur colonne en utilisant une résine échangeuse de cations fortement acide du type métal alcalin ou métal alcalino-terreux, mais, en tout cas, il était indispensable de 55 passer par des stades très compliqués. La présente invention a complètement résolu tous ces problèmes techniques.

La présente invention est également importante en ce que,

comme il a déjà été indiqué, le temps d'amorçage de la cristallisation est réduit. Il était nécessaire de laisser reposer le mélange réactionnel 60 pendant une durée prolongée pour augmenter à la fois la pureté et le rendement, alors que, dans la présente invention, il suffit de 10 fois plusieurs heures (?) -et, par conséquent, le procédé de la présente invention est industriellement avantageux.

Le procédé de la présente invention est également utile dans la 65 fabrication de médicaments en ce sens que le méthanol, qui est nuisible pour l'organisme humain et qui est présent dans le composé désiré en faible quantité, peut être éliminé sous la forme d'un composé moléculaire.

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Les exemples et exemples de travail ci-dessous sont donnés à titre d'illustrations supplémentaires de la présente invention.

Exemple d'essai

Les modifications des quantités de glucosylmoranoline (GM) et de moranoline (M) dissoutes au cours du temps, et l'effet de l'agitation sur celles-ci dans du méthanol aqueux à 33,3% (v/v) contenant un mélange de GM et de M ont été examinés.

De la GM (210 mg) et 90 mg de M ont été introduits dans un ballon de 50 ml et ont été dissous dans 0,3 ml d'eau à 60° C. Du méthanol (8,7 ml) y a été ajouté, et la température a été maintenue à 5° C ou à 20° C. Pour chacune de ces températures, un ballon a été laissé au repos et un autre a été agité à 200 tours/min au moyen d'un barreau d'agitateur magnétique introduit dans celui-ci. De la solution a été prélevée périodiquement, centrifugée, et le liquide surnageant a été analysé par Chromatographie liquide à hautes performances. Les conditions analytiques étaient les mêmes que celles indiquées dans l'exemple de référence 1 ci-après. Les résultats sont donnés dans le tableau 1.

Tableau I

Temps écoulé (heures)

Substance

Quantité dissoute (g/litre)

5°

C

20

3C

agitation repos agitation repos

0

M

10,0

GM

23,0

1,5

M

10,2

9,8

10,5

9,7

GM

5,5

22,1

6,2

21,1

3,0

M

10,1

11,4

9,9

GM

4,2

22,0

4,4

21,3

10,0

M

9,9

10,0

10,2

9,8

GM

3,1

19,0

3,2

18,2

24,0

M

6,8

10,1

10,5

9,7

GM

3,2

9,7

3,1

7,9

Dans le tableau, le terme «repos» signifie que le ballon a été agité à la main 4 ou 5 fois par jour pour mélanger le contenu.

Il ressort du tableau que, dans le cas de la moranoline, il ne s'est produit presque aucune modification de la solubilité jusqu'à 10 h tant à l'état «agité» qu'au «repos». Dans le cas de l'agitation, on a observé une tendance à une diminution de la solubilité à 5° C pendant 24 h.

Au contraire, dans le cas de la glucosylmoranoline, il ne s'est produit presque aucune modification jusqu'à 3 h tant pour 5° C que pour 20° C à l'état de «repos», tandis qu'à 10 h, on a observé une diminution, et, avec une tendance progressivement remarquable, la quantité s'est abaissée à la moitié de la quantité initiale au bout de 24 h. En outre, la quantité s'est déjà abaissée à un quart au bout d'une heure et demie, lorsqu'on agitait, dans le cas de la glucosylmoranoline. Par conséquent, l'effet de l'agitation sur la quantité dissoute est très net. En tout cas, il est vraissemblable que l'effet de la température sur la solubilité est faible.

Exemple de référence 1

1) On dissout de la moranoline (21 g) dans une faible quantité d'eau, et on ajuste la solution à pH 5,7 avec de l'acide chlorhydrique 6N. Après l'ajustement, on ajoute de l'eau pour faire 350 ml. On y dissout de l'amidon soluble (72 g) alors que la solution est encore chaude. On maintient ensuite la solution à 50° C, on y ajoute 350 ml de solution d'enzyme brute à 1000 unités/ml de cyclodextrine glyco-syltransférase, et on fait réagir le mélange à 50° C pendant 2 jours. Après la réaction, on chauffe le mélange à 80° C pendant 15 min, on y ajoute 5,6 g de glucoamylase (Glucozyme AF-6, fabriqué par l'Amano Seiyaku KK), et on fait réagir le mélange à 50° C pendant 24 h. Après réaction, on le chauffe à 80° C pendant 15 min, on le centrifuge, on fait passer le fluide surnageant à travers une colonne de Dowex 50W x 2 (H+) (dans laquelle la quantité de résine est de 500 ml), et on absorbe la substance basique avec celle-ci. On lave soigneusement la colonne à l'eau, on l'élue avec de l'ammoniaque IN, on concentre l'éluat sous vide et on fait passer la solution concentrée à travers une colonne de résine échangeuse d'ions fortement basique (Diaion SA-11A, la quantité de résine étant de 100 ml). On lave soigneusement cette résine avec de l'eau et on réunit la solution qui a traversé et l'eau de lavage, après quoi on concentre sous vide à sec, et l'on obtient 34,8 g de poudre.

On analyse cette poudre par Chromatographie liquide à hautes performances, et l'on trouve qu'il s'agit d'un mélange comprenant 26,1 % de moranoline, 71,9% de glucosylmoranoline et 2% de 4-0-(alpha-D-maltosyl)-moranoline.

Les conditions utilisées pour la Chromatographie liquide à hautes performances étaient les suivantes:

Sumipax R741 (Nucleosil 5NH2, 5 microns, 4 mm de DI x 25 cm).

Eluant: acétonitrile-eau (70:30); débit: 1 ml/min; détection RI (ERC- 7510 fabriqué par Elmert Kogyo KK); machine de traitement de l'information: Type 655-60 fabriqué par Hitachi Ltd.

Exemple de référence 2

On soumet de la moranoline (21 g) à la même réaction que dans l'exemple de référence 1, excepté que l'on utilise 7 g de glucoamylase et qu'on effectue la réaction à 50° C pendant 24 h.

On traite le produit de la réaction de la même manière que dans l'exemple de référence 1, ce qui donne 31 g de poudre.

On analyse cette poudre de la même manière que dans l'exemple de référence 1, par Chromatographie liquide à hautes performances, et l'on trouve qu'il s'agit d'un mélange comprenant 29,2% de moranoline, 70,0% de glucosylmoranoline et 0,8% de 4-0-(alpha-D-mal-tosyl)moranoline.

Exemple 1

On dissout un mélange (34,7 g) obtenu dans l'exemple de référence 1 dans 83 ml d'eau, on y place un agitateur magnétique et on ajoute 1305 ml de méthanol, en agitant à 200 tours/min environ. On agite ce mélange à la température ambiante pendant une nuit, et on recueille les cristaux qui s'en séparent par une filtration suivie d'un séchage sous vide à 60° C pendant 16 h, ce qui fournit 22,4 g de cristaux. Les cristaux obtenus contiennent 6,8% (P/P) de méthanol, et l'analyse par Chromatographie liquide à hautes performances montre que leur titre en glucosylmoranoline est de 99,9%. Le taux de récupération est de 83,3%.

[a]o +114,3° (c: 1,07% eau).

Analyse élémentaire pour C12H23N09 • 0,65CH3OH:

Calculé: C 43,90 H 7,45 N4,05%

Trouvé: C 43,65 H 7,76 N4,15%

'H-RMN: S (ppm); 2,45 (1H, dd, Jla, le, 12,3Hz, Jla, 2, 10,3Hz, H1A), 2,61 ~2,71 (1H, m, H5), 3,11 (1H, dd, Jla, le, 12,3Hz, Jle, 2, 4,9Hz, Hle), 3,34 (2,4H, s, CH3OH),

3,35~3,88 [11H, m, 4H (~CH2OH), 5H (-CH2OH), IH (H-4), IH (H-5')], 5,32 (1H, d, 3,7Hz, H-l', proton anomère)

On sèche ces cristaux sous vide à 60° C et on détermine la quantité de méthanol résiduel. Après un séchage de 10 h, celle-ci est de 7,5% et de 7,5% dans les cristaux pulvérisés et non pulvérisés, respectivement. Au bout de 16 h, les quantités sont de 6,6% et 6,8%, respectivement; et au bout de 10 h supplémentaires, elles sont de 6,3% et de 6,9%, respectivement. Il ressort de ces résultats que le méthanol est très fortement incorporé à la glucosylmoranoline, ce qui suggère que la substance est un composé moléculaire avec le méthanol.

La détermination du méthanol résiduel a été effectuée par Chromatographie en phase gazeuse dans les conditions suivantes.

Appareil: Gas-Chro Model 103C (fabriqué par l'Okura Rika-gaku KK); colonne: G-0,1 m; température: injection 200° C,

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

60

65

5

671 766

colonne 120° C; gaz porteur: 1,0 kg/cm3 d'azote calculé en eau (10 microlitres/min).

Exemple 2

On dissout les cristaux (10 g) obtenus dans l'exemple 1 dans 5 20 ml d'eau à 60° C, on refroidit la solution en la laissant reposer jusqu'à la température ambiante, et on y ajoute 90 ml d'éthanol, en agitant avec un agitateur magnétique. On agite ce mélange pendant une nuit, on recueille par filtration les cristaux qui s'en séparent, on les sèche à 60° C pendant 16 h sous vide, et l'on obtient 7,5 g de cris- I0 taux. Taux de récupération = 80,5%.

On détermine le solvant résiduel qui s'y trouve par Chromatographie en phase gazeuse de la même manière que dans l'exemple 1, et l'on trouve environ 0,06% d'éthanol. Cependant, la teneur en méthanol n'est pas supérieure à 0,005%, et la pureté de la glucosylmo- 15 ranoline est de 100%.

Exemple 3

On dissout le mélange (10 g) obtenu dans l'exemple de référence 2 dans 15 ml d'eau, et l'on ajoute 285 ml de méthanol, en agitant au 2o moyen d'un agitateur magnétique. On agite ce mélange pendant une nuit et on recueille par filtration les cristaux qui s'en séparent. On les sèche sous vide à 60° C pendant 10 h, ce qui donne 7,1 g de cristaux. Taux de récupération = 91,7%.

On analyse ces cristaux par Chromatographie liquide à hautes performances, et l'on trouve qu'ils contiennent 3,1% de moranoline et 96,9% de glucosylmoranoline. On détecte également 6,1% de méthanol résiduel.

Exemple 4

On dissout le mélange (7 g) obtenu dans l'exemple 3 dans 14 ml d'eau à 60° C, on laisse refroidir la solution jusqu'à la température ambiante et l'on ajoute 66 ml d'éthanol, en agitant, à la température ambiante. On continue à agiter pendant une nuit, on recueille les cristaux qui se séparent, on les sèche à 60° C pendant 16 h sous vide, et l'on obtient 5,3 g de cristaux. Taux de récupération = 81,5%.

On détermine la teneur en solvant résiduel du produit, et l'on trouve qu'elle est de 0,05% d'éthanol et de 0,005% au maximum de méthanol. En ce qui concerne la glucosylmoranoline, la pureté est de 100%.

R

Claims

671 766 2 REVENDICATIONS

1— 0-

caractérisé en ce qu'on soumet à une cristallisation fractionnée, en utilisant du méthanol, un mélange des trois constituants suivants: la glucosylmoranoline représentée par la formule (I), l'oligoglucosyl-moranoline représentée par la formule:

CH2OH

K. N

HO

OH

/

OH

dans laquelle n est un entier de 1 à 5, et la moranoline représentée par la formule:

CHîOH

HO

Le composé I de la présente invention présente une action inhibi-trice marquée contre l'augmentation de la glycémie par ingestion de sucre, et il est très utile comme produit pharmaceutique, par exemple comme agent thérapeutique pour le diabète sucré (voir demande de brevet japonais 56/081595).

Le procédé suivant a été utilisé pour la préparation du composé de la présente invention.

On fait agit une solution aqueuse contenant de la moranoline répondant à la formule III

CH2OH

(III)

et de la cyclodextrine ou de l'amidon soluble sur de la cyclodextrine glycosyltransférase (EC 2.4.1.19) pour préparer un mélange d'oligo-glucosylmoranolines représenté par la formule (II)

CH2OH

AI

0—1

V" )

OH

OH 'n

(II)

(III)

1. Procédé de préparation d'un composé moléculaire du métha-nol avec la glucosylmoranoline, représentée par la formule:

CH2OH

CHzOH

OH

(I)

2. Procédé de préparation de la glucosylmoranoline représentée par la formule:

CH2OH CH2OH

(I)

caractérisé en ce qu'on soumet le composé moléculaire du méthanol avec la glucosylmoranoline obtenu par le procédé selon la revendication 1 à une cristallisation fractionnée en utilisant de l'éthanol.