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PROCEDE DE PREPARATION DE DERIVES DE LA MORANOLINE
La présente invention concerne un nouveau pro- eede de preparation de crfstaux d'un dérivé de la glucosylmoranoline représenté par la formule generale (III) :
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(dans laquelle R est l'hydrogene ou un groupe alkyle inférieur).
Le groupe alkyle inferieur dans R, dans le composé (III) de l'invention est de préférence un groupe alkyle ramifié ou non ramifié ayant de 1 à 5 atomes de carbone.
Le composé (III) de la presente invention présente une excellente action inhibitrice contre l'augmentation
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de la glycémie lorsque le sang est chargé de sucre, et il est tres utile comme produits pharmaceutiques par exemple comme remedes contre le diabète sucré (voir brevet japonais No 56/081595 etc...).
Dans la préparation du compose (III) de l'invention, on a utilisd le procédé suivant.
On fait d'abord réagir une solution aqueuse contenant un dérivé de la moranoline répondant ä la formule générale (I)
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(dans laquelle R est tel que précédemment défini) et de la cyclodextrine ou amidon.) soluble avec de la cyclodextrine glycolsyltransférase (EC 2. 4. 1. 19) pour préparer un m61ange de (III) et d'une oligoglucosylmoranoline representee par la formule générale (II)
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(dans laquelle R tel que précédemment défini et n un entier de 1 ä
En plus du composé (III) désigné, la solution réactionnelle obtenue contient habituellement les composés (I) et (II) n'ayant pas réagi.
Le rapport de ces composés dans la solution réactionnelle varie évidemment en fonction des conditions de reaction utilisées et, comme la présence d'une substance unique est indispensable dans l'utilisation comme médicament, un procédé de purification sélective de (III) à partir du melange est une opération essentielle.
La demanderesse a trouve que (II) pouvait etre transformé en (III) avec un rendement tres élevé en traitant le mélange par la glucoamylase (alpha-l, 4-glucaneglu- cohydrolase EC 3. 2. 1. 3) (voir brevet japonais NO 57/058890). Bien qu'un tel procédé soit un procédé de préparation excellent, le produit obtenu après traitement par la glucoamylase contient toujours du (I) n'ayant pas réagi, et aussi,
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dans certaines conditions reactionnelles, une faible quantitg de (11).
Pour préparer le composé désiré à partir de cette solution réactionnelle, il était nécessaire d'effectuer des fractionnements de masses moléculaires en utilisant du Sephadex etc..., ou une chromatographie sur colonne du type à phase inversée en utilisant du Lichroprep CN (marque déposée; Merck Co.) ou du Micro Bondapak-NH (marque déposee : Waters Co.). Cependant, un tel stade d'isolement utilisant ces opérations sur colonne, était long et coüteux et il était difficile techniquement.
Les moyens de la présente invention dans lesquels (III) est obtenu sous forme cristalline ä partir d'un melange de (III) et de (I) ou d'un mélange de (III), de (11) et de (I) peuvent généralement être considérés comme identiques aux moyens permettant d'obtenir un sucre de- terminé ä partir d'un mélange d'o1igosucres. Cependant, la cristallisation fractionnée des sucres est en général tres
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difficile, et il est connu, par exemple, que la séparation du maltose d'un mélange de glucose, de maltose et de maltotriose est impossible.
Pour separer un sucre unique d'un melange de sucres, on a proposé plusieurs procédés consistant par exemple ä séparer des monosaccharides au moyen d'une chromatographie sur colonne de Sephadex, en effectuant la chromatographie sur une colonne de carbone ou un procédé utilisant une chromatographie sur colonne de résine échangeuse de cations fortement acide du type métal alcalin ou métal alcalino-terreux.
En tout cas, il est inévitable d'effectuer des stades de traitement très fastidieux.
Compte tenu de la technique antérieure indiquée ci-dessus, la demanderesse a effectué des études poussées en portant son attention sur les deux points suivants : (1) purifier seulement (III) sélectivement ä partir d'un melange de (I), (III) et (II) avec un rendement élevé ; et (2) obtenir (111) avec une qualité constante dans la purification de (III) et elle a réussi à obtenir certaines améliorations et appliquant une cristallisation fractionnée particuliere utili-. sant des propriétés de solvants polaires, pour laquelle une
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demande de brevet a déjà été déposée de brevet japonais NO 59/237326).
(demandeMême après avoir réalisé l'invention ci-dessus, la demanderesse a continué ä ameliorer les techniques concernant cette invention, et elle a eu la grande chance d'aboutir ä la présente invention qui presente un effet remarquable.
En resume, l'invention consiste à dissoudre un mélange des composés (I),' (III) et (II) ci-dessus dans un solvant polaire, puis ä y ajouter un acide arylsulfonique lui-mdme ou sa solution dans un solvant polaire approprié (tel que le méthanol), et ä recueillir les cristaux qui
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s'en séparent.
Un tel procédé est basé sur une découverte physicochimique de la demanderesse selon laquelle, lorsqufon ajoute un acide arylsulfonique ä ce solvant, le compose (ill) de la présente invention cristallise le premier avant (I) et (II) qui co-existent dans le solvant polaire.
La présente invention sera illustrée plus en détail ci-dessous.
Comme solvant polaire, on peut utiliser dans la présente invention tous les types de solvants, parmi lesquels l'eau le méthanol, l'ethanol, l'isopropanol ou d'autres solvants miscibles ä l'eau, isolement ou conjointement.
Comme exemples de l'acide arylsulfonique utilisé dans la présente invention, on citera, en plus de l'acide benzènesulfonique substitué ou non substitué, des acides arylsulfoniques dicycliques ou tricycliques substitués par des groupes alkyle ou non substitués. L'utilisation d'un acide benzènesulfonique substitué ou non substitué est particulièrement préparée.
Comme exemples des acides arylsulfoniques utilisables, on citera l'acide benzènesulfonique, l'acide p-to- luènesulfonique, l'acide 2, 4-diméthylbenzènesulfonique etc.
Lorsqu'on applique la présente invention, on peut en atteindre l'objectif saus augmenter ni diminuer la température après dissolution dans le solvant, contrairement à la cristallisation fractionnée classique. En general, (III) est susceptible de se décomposer par chauffage en milieu acide pour donner (I) et en conséquence, le point ci-dessus est un des plus grands avantages de la presente invention.
Lorsqu'on applique la présente invention, le melange de (I), (III) et (II) est, par exemple, dissous ou mis en suspension dans le solvant polaire ci-dessus, en chauffant ou ä la température ambiante, après quoi on ajoute l'autre solvant polaire pour la dissolution de la sus-
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pension. Apres dissolution, on ajoute la solution avec l'acide arylsulfonique ci-dessus ä la temperature ambiante. Puis on laisse la solution reposer pendant un certain temps de telle sorte que des cristaux s'en séparent. Les cristaux peuvent etre recueillis par exemple par filtration, et ils peuvent si nécessaire être recristallises.
Les cristaux obtenus sont traités par un procédé classique, par exemple en utilisant une resine échangeuse d'ions fortement basique, apres quoi on peut en eliminer l'acide arylsulfonique.
Conformément ä la presente invention, le taux de récupération, la pureté, etc..., peuvent varier fortement en fonction des conditions utilisées, mais dans les conditions optimales, le composé (III) desire peut etre obtenu ä partir d'un melange de (I), (III) et (II) avec un taux de récupération non inférieur a 97, 2 % et avec une pureté non inférieure ä 98, 7 % par une seule Operation de cristallisation fractionnée. En conséquence, lorsqu'on répète ce procédé, il est possible d'obtenir des cristaux purs avec une pureté allant jusqu 99, 97 % a 100 %.
On a constate que, dans la presente invention, le taux de récupération est meilleur lorsque R est un groupe méthyle que lorsque R est l'hydrogene dans (III). Par conséquent, le procédé de la presente invention est applicable lorsque, par exemple, le compose (III) dans lequel Rest lthydro9ène est méthylé pour préparer le compose dans lequel R est un groupe méthyle.
La raison de l'effet particulier de la présente invention et le mécanisme par lequel il est obtenu ne sont pas encore élucidés. Cependant, dans le procédé de l'invention, les dérivés de la moranoline de la présente invention sont supposes former des sels d'amine quaternaire avec les acides arylsulfoniques de la prêsente invention dans un solvant, et en consequence, on suppose qu'il y a une difference specifique dans les solubilites de ces sels dans un
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solvant et que ce resultat peut. conduire à l'effet utile de la présente invention.
La présente invention présente cet effet utile que le composé désiré est obtenu sous une forme cristalline de haute purete. Ceci permet d'obtenir une substance chimique unique nécessaire pour l'utilisation comme médicaments.
La présente invention sera illustrée plus en detail au moyen des exemples de reference et des exemples de travail.
EXEMPLE DE REFERENCE 1 (1) On dissout de la moranoline (8, 5 g) dans une faible quantité d'eau et on ajuste la solution ä pH 5, 7 avec de l'acide chlorhydrique 6N. Puis on y ajoute de l'eau pour faire 50 ml. On dissout de l'alpha-cyclodextrine (34 g) dans 2 330 ml de solution d'enzyme brute ä 1 000 unités/ml de cyclodextrine glycosyltransférase, puis on y ajoute la solution aqueuse de moranoline pour réajuster le pH à 5, 7. On agite ä 400C pendant deux jours pour effectuer la réaction.
On centrifuge la solution ayant réagi et on fait passer le
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liquide surnageant ä travers une colonne de 100 ml de Dowex 50W x 2 pour adsorber les substances basiques. On lave soigneusement la colonne à l'eau, on l'élue avec de l'ammoniaque ont et on concentre l'eluat ä sec sous vide, ce (H+)qui donne 42, 0 g d'une poudre d'oligoglucosylmoranolines mélangées.
(2) On dissout la poudre d'oligoglucosylmoranolines ci-dessus (42, 0 g) dans une faible quantité d'eau et on agite la solution ä pH 5, 1 avec de l'acide chlorhydrique 6N.
On amène le volume à 4 370 ml par addition d'eau. On y ajoute 250 mg de glucoamylase (fabriquée par Seikagaky Kogyo KK ; 30 unités/mg) et on fait reagir le mélange en agitant à soue pendant 24 heures. On filtre la solution réactionnelle et on
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fait passer le filtrat à travers une resine powex x 2 (100 ml) de telle sorte que la substance basique y soit
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SOWadsorbée. Celle-ci est lavée soigneusement à l'eau, fluée avec de l'ammoniaque Q, 5N et l'éluat est traité par du carbone active, après quoi on concentre et sèche sous vide, ce qui donne 18, 6 g de poudre.
Celle-ci est soumise ä une analyse par chromatographie liquide ä hautes performances, et se revele être composée de 14 % de moranoline, 84 % de 4-0-alpha-D-glucosylmoranoline et 2 % de 4-0-alpha-D-maltosylmoranoline.
Les conditions utilisées pour la chromatographie
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liquide ä hautes performances sont les suivantes Sumipax R 741 (Nucleosil 5NH2 microns, 4 mm de DI x 25 cm) : acétonitrile-eau (65 : 35) 1 ml/mn par RI (au moyen d'un ERC-7510 fabrique par Eimer Kogyo KK) ; Machine de traitement de l'information (modele 655-60 fabriquée par Hitachi Ltd.).
EXEMPLE DE REFERENCE 2
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(1) De la N-méthylmoranoline (10 est dissoute dans une faible quantité d'eau et la solution est ajustée ä pH 5, 7 avec de l'acide chlorhydrique 3N. De l'amidon soluble (640 g) est dissous dans 7 550 ml d'eau chaude, la solution est refroidie ä 400C et la solution aqueuse de N-méthylmoranoline y est ajoutée. On mélange 400 ml de solution d'enzyme brute à 2 000 unités/ml de cyclodextrine glycosyltransférase et on reajuste le melange à pH 5, 7. On agite le mélange ä 400C pendant deux jours pour effectuer la réaction.
Après la réaction, on ajuste la température ä 50 C, puis on l'ajuste ä pH 5, 2 avec de l'acide chlorhydrique concentre et on ajoute 1 g de glucoamylase (Glucozyme AF6) puis on agite ä SOOC pendant 24 heures pour effectuer la réaction. On centrifuge la solution réactionnelle et on fait passer le liquide surnageant ä travers une colonne de Dowex 50W x 2 (H (quantité de résine : 300 ml) de telle sorte que la substance basique est adsorbée sur celle-ci.
Cette substance basique est lavée soigneusement ä l'eau, éluée avec de l'ammoniaque 0,5N, l'éluat est concentre et
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séché sous vide, puis dissous dans du méthanol, la solution est traitée par du carbone actif et concentree sous vide pour donner 16, 7 g de poudre.
On analyse cette poudre par chromatographie liquide à hautes performances de la meme manière que dans
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l'Exemple de Référence 1, et l'on trouve qu'elle est composee de 37, % de N-méthylmoranoline et de 62, % de 4-0-alpha-D-glucosyl-N-méthyl-moranoline.
2EXEMPLE DE REFERENCE 3
On dissout de l'amidon soluble (24 9) dans 280m1 d'eau chaude et on y ajoute une solution de 1 146 mg de N-
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éthylmoranoline dans 5 ml d'eau (apres quoi on ajuste le pH ä 5, 7). On refroidit Åa la temperature ambiante, on ajoute 15 ml de solution d'enzyme brute à 2 000 unités/ml de cyclodextrine glycosyltransférase et on réajuste le melange à pH 5,7. On le fait réagir en agitant à 400C pendant trois jours. Après la reaction, on l'ajuste ä pH 5, 2 avec de l'acide chlorhydrique concentré, puis on y ajoute 75 mg de glucoamylase (Glucozyme AF-6), et on fait réagir le mélange à 50 C pendant 24 heures.
On centrifuge la solution réactionnelle et on passer le liquide surnageant à travers une co- :. lonne de Dowex 50W x 2 ( quantité de résine 60 ml), de sorte que la substance basique est adsorbée sur celle-ci. on lave soigneusement cette substance ä l'eau, on l'élue avec de l'ammoniaque 0, 5N, on concentre l'eluat et on le seche sous vide puis on le dissout dans du méthanol, on traite la solution méthanolique par du charbon actif, on la concentre et on la sèche sous vide, ce qui donne 2,3 g de pou-
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On analyse cette poudre par chromatographie liquide ä hautes performances comme dans l'Exemple de Refe- rence 1 et l'on trouve qu'elle est composée de 19 % de N- éthylmoranoline et de 81 % de 4-O-alpha-D-glucosyl-N-éthylmoranoline.
EXEMPLE 1
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On dissout le melange (18, 6 g) obtenu dans l'Exemple de Reference 1 dans 125 ml d'éthanolchaud et on refroidit la solution à la température ambiante. On y ajoute 13,5 g d'acide p-toluènesulfonique (p-CH2C6H4SO3H.H2O).
On laisse reposer le melange à SOC pndant trois jours après addition de 125 ml d'acétone. On recueille les cristaux obtenus par filtration et on les lave doucement avec de l'ethanol froid, après quoi on les seche, ce qui donne 11, 3 g de cristaux. Le taux de recuperation est de 72, 8 %.
On analyse les cristaux obtenus par chromatographie sur couche mince de gel de silice (article 5554 fabrique par Merck & Co.) ; l'eluant est un melange n-propanol : ammoniaque concentrée : eau dans un rapport 6 : 2 : 1, colore par une solution aqueuse de permanganate de potassium)
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et l'on trouve que les cristaux sont composés uniquement de p-toluenesulfonate de 4-0-alpha-D-glucosyl-moranoline 0, 26).
On sèche ces cristaux ä 700C pendant 10 heures sous vide et on mesure leus données physiques.
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F = 127-131"C./o7 %, eau).
Analyse élémentaire : C12H23N09'CHJ
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(C19H31N012S) Caiculd H : 6, N : 2, (RfTrouvé c : 45, 50 H : 6, 71 N : 2, 67
On dissout les cristaux dans de l'eau, on traite
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la solution par une resine échangeuse d'ions fortement ba- -, sique, l'Amberlite IRA-410 pour eliminer l'acide p-toluènesulfonique, et on l'analyse par chromatographie liquide a hautes performances dans les memes conditions que ci-dessus, ce qui confirme qu'ils sont constitues de 4-0-alpha-D-glucosylmoranoline ä 99, 2 % de pureté.
On sèche ces cristaux sous vide a 700C pendant 10 heures pour mesurer leurs données physiques.
F = 189-192 C. [α]D25= +128,6 (c = 1,0 %, eau).
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Analyse dldmentaire : 12239*O? Calculé C : 44, H : 7, N : 4, 06Trouvé C : 44, 17 H : 7, 54 N : 4, 31
EXEMPLE 2 on dissout le melange (l g) obtenu dans l'Exemple de Reference 2 dans 30 ml d'ethanol chaud, on y dissout 1, lg d'acide benzènesulfonique (C6HSS03H. H20) et on laisse reposer la solution a SOC pendant 3 jours. On recueille les cristaux obtenus par filtration et on les lave doucement avec de l'ethanol froid, puis on les sèche, ce qui donne 650 mg de cristaux Le taux de recuperation est de 70,7 %.
On analyse les cristaux obtenus par chromatographie sur couche mince de gel de silice (Article 554 fabrique par Merck & Co. ; l' luant utilise est un melange n-pro- panol : ammoniaque concentrée : eau dans un rapport de mélange de 6 : 2 : 1 ; coloré par une solution aqueuse de permanganate de potassium) et l'on confirme que les cristaux sont uniquement composés de benzenesulfonate de 4-0-alpha-
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D-g1ucosyl-N-rnéthylmoranoline (Rf = 0, On seche ces cristaux pendant heures et on les soumet à une mesure des données physiques.
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F = 142-145"C/ < 7o D Analyse
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(CHNOS) Calcul H : N : Trouvé N :
On dissout les cristaux dans de l'eau, on traite la solution avec de l'Amberlite IRA-410 (OH-), une résine échangeuse d'ions fortement basique, pour éliminer l'acide benzènesulfonique, et on l'analyse par chromatographie liquide ä hautes perforamnces dans les conditions indiquées ci-dessus ce qui confirme qulil s'agit d'une 4-0-alpha-Dglucosyl-N-méthylmoranoline à 99, 2 % de pureté.
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On sèche ce compose ä 700C pendant 10 heures sous vide et on le soumet à une mesure des données physiques.
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F = 172, OC. \7= = 1, %, eau) D Analyse elementaire ! HeNOq Calculé C : 46, +104, 7" (cTrouvé C : 45,74 H : 7,60 N : 4,08
EXEMPLE 3
On dissout le melange 9) obtenu dans l'Exemple de Référence 2 dans 200 ml de méthanol et on agite la solution avec une solution de 4,5 g d'acide p-toluènesulfonique dans du méthanol. Puis on laisse reposer le melange pendant une nuit à 5"C. On recueille les cristaux obtenus, on les lave doucement avec du méthanol froid et on les sèche, ce qui donne 4,6 g de cristaux. Le taux de récupération est ae 97, 2 %.
On dissout une partie (environ 100 mg) des cristaux dans de l'eau, on la fait passer à travers 5 ml d'Amberlite IRA-410 (OH), une résine échangeuse d'ions fortement basique, pour éliminer l'acide p-toluenesulfonique,
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on la lave à l'eau, puis on concentre sous vide ä la fois la soluticn qui a traversé et le liquide de lavage et on les analyse par chromatographie liquide à hautes performances dans les memes conditions que ci-dessus, ce qui confirme qu'il s'agit de la 4-0-alpha-D-glucosyl-N-rnéthylmorsnüire as 98, 7 % de pureté.
On fait passer le produit (4, travers 70 ml d'Amberlite IRA-410 (OH-), quoi. on le lave a l'eau. On réunit la solution qui a traverse et le li- quide de lavage, on en élimine l'eau sous vide, et l'on obtient 2,7 g de solide. On dissout ce solide dans 50ml de méthanol, on l'agite avec une solution de 1,7 g d'aci- de p-toluènesulfonique dans 50 ml de méthanol, et on le laisse reposer une nuit ä 5 C.
On recueille les cristaux obtenus et on les lave doucement avec de l'éthanol froid, après quoi on
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lesseche, ce qui donne 3, 9 g de cristaux.
On répète l'operation encore une fois, ce qui donne 3,6 g de p-toluenesulfonate de 4-0-alpha-D-glucosyl- N-methyl-moranoline.
On traite ce composé par l'Amberlite IRA-410 (OH-) de la même manière que ci-dessus, on l'analyse par chroma- tographie liquide ä hautes performances et l'on trouve que la pureté est de 99, 97 %. On la sèche ä 80 C pendant 10 heu-
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res sous vide et on mesure les données physiques.
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F = 223-225"C./a7 74, Analyse élémentaire: < HNOg. ) 3
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20H32 Calculé C : H : N : Trouvé H : N :
EXEMPLE 4
On dissout le mélange obtenu dans l'Exemple de Référence 2 (5g) dans 50 ml de méthanol, on y ajoute une solution de 6,6 g d'acide 2,4-diméthylbenzènesulfonique dans 50 ml de methanol, et on l'agite avec 100 ml supplémentaires d'6thanol. On le laisse reposer à 50C pendant trois jours. On recueille les cristaux obtenus, on les lave doucement avec de l'ethanol froid et on les seche, ce qui donne 3, 5 g de cristaux. Le taux de recuperation est de 72, 0 %.
On traite une partie (100 mg) des cristaux par de l'Amberlite IRA-410 (OH-), comme dans l'Exemple 3, et on l'analyse par chromatographie liquide ä hautes performances ce qui confirme qu'il s'agit de la 4-0-alpha-Dglucosyl-N-méthylmoranoline à 95,8 % de purete.
En vue d'une analyse supplémentaire, on dissout le produit (500 mg) dans un mélange chaud de 7 ml de metanol et de 0, 4 ml d'eau et on laisse reposer la solution pendant une nuit ä la température ambiante. On recueille les cristaux obtenus et on les sèche, ce qui donne 330 mg
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cristaux.
On les sèche ä 70De pendant 10 heures sous vide et on les soumet à une mesure des données physiques.
F = 219-221"C./ (c = 1, 1
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CH3 Analyse 616dentaire : C.-. rNOq. )
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(CHOSt Calculé C : 47, H : 6, N : 2, Trouvé C : 47, H : te résu1tat de l'analyse par chromatographie liquide a hautesperformances dans les mêmes conditions que ci-dessus révèle que sa pureté est de 99, EXEMPLE 5 On dissout le melange (2, ple de Reference 3 dans 20 ml de methanol et 1, p-toluenesulfonique et on y ajoute du méthanol. On en elimine le méthanol sous vide et on dissout ä nouveau le residu dans un melange chaud de 100 ml de méthanol et de 100 ml d'ethanol. On concentre la solution sous vide, après guoi des cristaux commencent a apparaitre et, ä ce stade, on arrête la concentration et on laisse reposer ä 50C pendant deux jours.
On recueille les cristaux, on les lave doucement avec de l'ethanol froid et on les seche, ce qui donne 2, Le taux de recuperation est de 76, F = 173-1780C. = 1, D
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Analyse dlmentaire : C14H27NOg. S03H
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.. HNOS) Calculd C H : 6, N : 2, Trouvé C : 47, H : 7, N : 2, On traite une partie (100 mg) des cristaux par de l'Amberlite IRA-410 (OH-), une resine echangeuse d'ions fortement basique, de la meme manière que dans l'Exemple 3,
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et on l'analyse par chromatographie liquide ä hautes performances ce qui confirme qu'il s'agit d'une 4-0-alpha-D-glu- cosyl-N-éthyl-moranoline à 99, 0 % de pureté. On la sèche à 700C pendant 10. heures sous vide et on mesure les données physiques.
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F = = +83, Analyse élémentaire: : NOq. 2 H20 Calculé C Trouvé C EXEMPLE 4
118-120"C./"a 7 bn dissout de la 4-0-alpha-D-glucosylmoranoline (5 g) dans 13, 3 g de formaldéhyde ä 35 % et on chauffe sous reflux la solution à 1100C pendant trois heures. Apres la réaction, on élimine l'eau et le formaldéhyde sous vide, on dissout le residu dans 150 ml de méthanol, puis on ajoute 8, 8 g de borohydrure de sodium dans un bain de glace et on agite le mélange pendant une nuit ä la temperature ambiante. Après la réaction, on ajoute 40 ml d'acide acétique, on concentre le mélange sous vide et on fait passer le concentré ä travers 200 ml d'Amberlite IRA-410 (OH-), une rêsine échangeuse d'ions fortement basique.
On fait ensuite passer la solution qui a traversé ä travers 200 ml de Dowex 50 W x 2 (H+), une résine échangeuse d'ions fortement acide, pour provoquer l'adsorption. Celle-ci est soigneusement lavée à l'eau éluée avec de l'ammoniaque 0,5 N, l'eluat est evapore pour éliminer le solvant sous vide et le résidu est seche, ce qui donne 4,5 g de poudre.
On analyse cette poudre par chromatographie liquide à hautes performances de la meine manière que dans l'Exemple 1 et l'on trouve qu'elle est composée de 32,9 % de 4-0-alpha-D-glucosylmoranoline n'ayant pas réagi et de
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67, de 4-0-alpha-D-glucosyl-N-méthylmoranoline.
EXEMPLE 6
On dissout la poudre (4, 5 g) obtenue dans l'Exemple de Reference 4 ci-dessus dans 120 ml de méthanol
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et on la laisse reposer une nuit à la température ambiante, après addition de 4 g d'acide p-toluènesulfonique. On recueille les cristaux obtenus par filtraticnet on les sèche, ce qui donne 5, 1 g de cristaux.
On analyse ces cristaux par chromatographie liquide à hautes performances comme ci-dessus et on trouve qu'ils sont composés de 1, 8 % de 4-Q-alpha-D-glucosylmora- noline n'ayant pas réagi et de 98,2 % de 4-O-alpha-D-glucosyl-N-méthylmoranoline.
Pour obtenir un produit pur, on le dissout ä nouveau dans de l'eau, on fait passer la solution ä travers 50 ml d'Amberlite IRA-410 (OH-), une résine echangeuse d'ions fortement basique, puis on la lave ä l'eau, on reunit l'eau de lavage avec la solution qui a traversé, on en fait évaporer l'eau sous vide, on dissout le résidu dans du méthanol, on ajoute ä la solution 2, 3 g d'acide p-tolue- nesulfonique, on laisse reposerle mélange une nuit à la température ambiante, et on recueille les cristaux obtenus par filtration et on les sèche, ce qui donne 4,3 g du produit.
On analyse ce produit par chromatographie liquide ä hautes performances de la meme manière que ci-dessus, et l'on trouve qu'il s'agit de la 4-0-alpha-D-glucosyl-N- methylmoranoline pure.
La presente invention n'est pas limitée aux exemples de réalisation qui viennent dletre décrits, elle est au contraire susceptible de modifications et de variantes qui apparaitront ä l'homme de l'art.