WO2018062762A1 - 극차광 재배 녹차 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물 - Google Patents

극차광 재배 녹차 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물 Download PDF

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skin
green tea
extract
shading
composition
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이영란
박준성
이은수
박녹현
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주식회사 아모레퍼시픽
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Definitions

  • the present invention relates to an external composition for skin containing the extract of green tea produced by the method of growing the shade of tea, which is differentiated from the conventional shading method of green tea, and more specifically, the amino acid content by cultivating the shading with a shading rate of 90% or more.
  • the present invention relates to a composition for external application for skin, which contains an extract of this significantly increased shade-shielding green tea, and which can achieve more excellent skin moisturizing, skin protection, anti-aging and the like.
  • Shading cultivation refers to a cultivation method that cultivates by blocking light (shading rate: about 50 ⁇ 70%) for a certain period of time during the growth of tea buds. Shading cultivation slows tea leaf hardening, strengthens greens, reduces catechin content, increases amino acid and deanine content, and reduces the astringency of green tea, making it softer and more greenish.
  • the shading cultivation method has been selected as a method for making, ie, improving aesthetics, taste, etc., and improving its utility as a food.
  • the light shading cultivation method is a cultivation method in which the shading rate is 90% or more, preferably 95% or more, and especially 99% or more in the light shading cultivation method. It is not preferable in terms of productivity and unit cost, and rather, whitening of green tea leaves occurs, which not only causes visual quality deterioration but also decreases the content of catechins. The utility value of green tea grown as a result has dropped significantly.
  • the external composition for external skin containing green tea has been developed mainly on the antioxidant and anti-inflammatory effects derived from catechin, which occupies a large amount of green tea components.
  • green tea contains a variety of amino acids in addition to catechins can exhibit a variety of skin benefits, which can be increased by shading cultivation as described above.
  • the existing shading cultivation method having a shading rate of 50 to 70% has a limit in increasing the content of amino acids, and most of the green tea grown by the shading cultivation method exists only for food use, and is an external preparation for skin. Research on the development of furnaces is insignificant.
  • the conventional extraction method is difficult to maximize the amino acid content because it contains a part of the organic solvent, there is also a need for an extraction method that can be extracted to the maximum amino acids.
  • the present inventors found that the amount of amino acids increased significantly in the case of green tea grown by the method of cultivating the light shade, and when the extract of the green tea cultivated tea was used as an active ingredient of the skin external preparation composition, The present invention has been found to be able to provide more excellent effects in skin moisturizing, skin protection, anti-aging, and the like, compared to the case of containing green tea or extract of green tea cultivated by shading.
  • an object of the present invention is to provide a skin moisturizing, anti-aging, and skin barrier agent composition containing the extract of green tea grown by the method of cultivating light shade.
  • the present invention provides a skin external moisturizing composition for skin moisturizing, anti-aging or skin barrier protection containing an extract of green tea grown with a shading rate of 90% or more.
  • the present invention provides a skin moisturizer, skin anti-aging agent, skin wrinkle improver, skin elasticity enhancer, skin barrier function enhancer of the extract of green tea grown by the method of cultivation of light shielding with a shading rate of 90% or more in the preparation of the external preparation for skin Or to inhibit skin damage or as a skin protectant.
  • the method of the present invention by containing the extract of green tea with a significant increase in the amino acid content by cultivating in a light shielding cultivation method having a light shielding rate of 90% or more, thereby increasing the skin moisturizing ability, better than the existing composition containing green tea extract, anti It may provide an aging or skin barrier protection effect.
  • Figure 1 shows the color of the tea leaves according to the shading rate in the shading cultivation.
  • Figure 2 shows the tea leaves grown in extreme shading for 25 days at 99% shading rate.
  • Figure 3 is a graph showing the amino acid content change in green tea extract according to the shading rate and shading period.
  • Figure 4 is a graph showing the change in catechin content in green tea extract according to the shading rate and shading period.
  • the present invention relates to an external preparation composition for skin containing the extract of green tea grown by the method of cultivating light shade as an active ingredient.
  • the term “ultra shade shading method” means that the shading rate in the shading cultivation method is 90% or more, preferably 95% or more, preferably 98% or more, more preferably 99% or even more. Preferably it means the cultivation method of a plant made 99.9% or more.
  • the method of cultivating the extreme shading of green tea (tea tree; Camellia sinensis L. ) of the present invention has a shading rate of 90% or more for a period of 10 days or more, preferably 10 days to 25 days, more preferably 15 days to 21 days. And, preferably, at least 95%, preferably at least 98%, more preferably at least 99%, even more preferably at least 99.9%.
  • the light-shielding treatment is carried out at 1 core 1 to 1 core 4 leaves of tea tree, and more preferably at 1 core 1 leaf to 1 core 3 leaf, more preferably at 1 core 1 leaf. .
  • the total amino acid content present in green tea can be significantly increased.
  • the extract of green tea cultivated green tea used in the present invention is obtained by using water or a lower alcohol, preferably water or ethanol, as an extractant of the green tea leaf or green tea leaf powder cultivated by the black tea cultivation method.
  • the extract may be used as it is extracted from green tea leaves, or may be used in a powder state prepared by the process of drying and powdering the material obtained by the extraction.
  • the cosmetic composition it is preferable to use water as the extraction solvent.
  • water when water is used as the extraction solvent, the amino acid dissolution rate is increased than when using other extraction solvent.
  • the extraction degree of other components other than amino acids increases, so in the case of low temperature low-speed water extraction (for example, using a Dutch coffee making apparatus), more preferable in terms of selective elution of amino acids. .
  • the extract of the ultra-light green tea is not particularly limited in content, but preferably 0.0001 to 40% by weight, preferably 0.01 to 30% by weight, and more preferably 0.1 to 20% by weight, based on the total weight of the composition. It can be included in the quantity. If the content is less than 0.0001% by weight, it is difficult to expect the action as an active ingredient, and if the content exceeds 40% by weight, the formulation stability is deteriorated, which is not preferable.
  • composition according to the present invention provides a skin moisturizing effect by maintaining skin moisture and increasing water retention through promoting differentiation of keratinocytes or promoting expression of trans glutamine.
  • composition according to the present invention is to inhibit skin damage caused by oxidation or ultraviolet rays, promote collagen production or inhibit the biosynthesis of matrix metalloproteinase 1 (MMP-1) to improve skin wrinkles, increase skin elasticity to prevent skin aging It provides an inhibitory effect.
  • MMP-1 matrix metalloproteinase 1
  • composition according to the present invention provides the effect of protecting the skin by inhibiting skin damage.
  • the skin here includes the scalp or hair. That is, the composition of the present invention also provides the effect of protecting the hair by inhibiting damage to the scalp or hair.
  • composition according to the present invention provides an effect of protecting the skin by inhibiting skin damage caused by oxidation or ultraviolet rays.
  • the skin comprises the scalp or hair. That is, the composition of the present invention also provides the effect of protecting the scalp or hair by inhibiting damage to the scalp or hair by oxidation or ultraviolet light.
  • the present invention provides a skin moisturizer, skin anti-aging agent, skin wrinkle improver, skin elasticity enhancer, skin barrier function enhancer of the extract of green tea grown by the method of cultivation of light shielding with a shading rate of 90% or more in the preparation of the external preparation for skin Or to inhibit skin damage or as a skin protectant.
  • the external preparation composition for skin according to the present invention may be formulated into a cosmetic composition or a pharmaceutical composition.
  • the cosmetic composition according to the present invention may contain a cosmetically or dermatologically acceptable medium or base.
  • a cosmetically or dermatologically acceptable medium or base are all formulations suitable for topical application, for example, emulsions, suspensions, microemulsions, microcapsules, microgranules or ionic (liposomes) obtained by dispersing the oil phase in solutions, gels, solids, pasty anhydrous products, aqueous phases, and It may be provided in the form of a nonionic vesicle dispersant or in the form of a cream, skin, lotion, powder, ointment, spray or cone stick.
  • These compositions can be prepared according to conventional methods in the art.
  • the composition according to the invention can also be used in the form of a foam or in the form of an aerosol composition further containing a compressed propellant.
  • the cosmetic composition of the present invention is a fatty substance, an organic solvent, a dissolving agent, a thickening agent, a gelling agent, a softening agent, an antioxidant, a suspending agent, a stabilizer, a foaming agent, a fragrance, a surfactant, water, an ionic or nonionic type.
  • Cosmetics such as emulsifiers, fillers, metal ion sequestrants, chelating agents, preservatives, vitamins, blockers, wetting agents, essential oils, dyes, pigments, hydrophilic or lipophilic actives, lipid vesicles or any other ingredient commonly used in cosmetics Or an adjuvant commonly used in the field of dermatology.
  • Such adjuvants are introduced in amounts generally used in the cosmetic or dermatological arts.
  • the external preparation composition for skin according to the present invention is not particularly limited in the formulation, for example, softening cream, astringent makeup, nourishing cream, nutrition cream, massage cream, essence, eye cream, eye essence, cleansing cream, cleansing foam It may be formulated into cosmetics such as cleansing water, packs, powders, body lotions, body creams, body oils and body essences.
  • the external preparation composition for skin according to the present invention may be a pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition may further contain pharmaceutical adjuvants such as preservatives, stabilizers, hydrating or emulsifying accelerators, salts for regulating osmotic pressure and / or buffers and other therapeutically useful substances.
  • the pharmaceutical composition may be formulated as a lotion, cream, ointment or gel.
  • the pharmaceutical composition is preferably administered transdermally.
  • Dosage of the ultra-light green tea extract as an active ingredient of the pharmaceutical composition is dependent on the age, sex, weight of the subject to be treated, the specific disease or pathology to be treated, the severity of the disease or pathology, the route of administration and the judgment of the prescriber. Will be different.
  • Dosage determination based on these factors is within the level of skill in the art. Generally dosages range from 0.0001 mg / kg / day to approximately 2000 g / kg / day.
  • Green tea (Camellia sinensis L.) cultivated with a 99% shading rate (Ultra Shade) (5 days, 10 days, 15 days, 20 days, 25 days) was washed with purified water, dried, and then granulated, and 100 g of the light-shielding green tea powder obtained by extraction was put into 1 liter of an aqueous 70% ethanol solution and extracted with stirring for 12 hours, followed by filtering with a filter sheet of No. 2 twice.
  • the extract thus obtained was concentrated under reduced pressure at 50 ° C. using a distillation apparatus equipped with a cooling condenser and dried to obtain 70% ethanol extract (dry weight 30.85 g) of green tea cultivation (99% shading rate).
  • a filter paper was placed on a cylindrical glass barrel with a discharge port at the lower end thereof, and 100 g of light-shielding green tea powder was placed thereon, and a paper filter was placed on the upper end of the powder so that the falling water droplets were evenly soaked on the surface.
  • a bucket equipped with a speed control valve was placed on the cylindrical glass barrel, and purified water and purified water ice were mixed in the bucket to maintain the temperature below 4 ° C.
  • Green tea powder obtained by washing with green water (1 day, 5 days, 10 days, 15 days, 20 days, 25 days, shading period 1 day, 5 days, 10 days, 15 days, 20 days, 25 days), dried, and then granulated 100 g of purified water and ice with purified water were added to 1 liter of cold water made at 4 ° C. or lower, and extracted with stirring for 12 hours.
  • the extract thus obtained was concentrated under reduced pressure at 50 ° C. using a distillation apparatus equipped with a cooling condenser and dried to obtain a super shade cultivation (99% shading) green tea low temperature leachate (dry weight 23.25 g).
  • a light-shielding green tea low temperature low temperature water extract (dry weight 24.66 g) was obtained in the same manner as in Example 2, except that general green tea grown without passing the light shielding treatment was used.
  • the amino acid content was quantified in each of 22 free amino acids by simultaneous analysis, and the sum was made. Dissolve the extract in purified water to make a 10,000ppm solution, take 20 ⁇ L, and then add 70 ⁇ L of AccQ-Tag buffer and 20 ⁇ L of AccQ-Tag derivative reagent and mix to prepare a sample solution (AccQ-Tag buffer and derivative reagent, solvent for UPLC analysis Purchased from Waters). The 22 amino acid mixtures were also appropriately adjusted in concentration according to the content of each amino acid in the extract to proceed with the derivatization reaction as the sample solution.
  • the sample solution and amino acid standard solution were analyzed using a UPLC (Waters, Inc.) system for component analysis (PDA detector, 260 nm), and the stationary phase was 100-2.1 mm (1.7 ⁇ m) of Waters AccQ-Tag Ultra Column.
  • the mobile phase was composed of AccQ-Tag Ultra Eluent A and AccQ-Tag Ultra Eluent B 0-0.54 min, 99.9% A; 7.74-8.5 min, 82.5% A; 8.5-8.7 min, 40.4% A); 8.7 to 10 minutes were used in a composition ratio of 99.9% A.
  • a peak for each amino acid was observed.
  • the content of each amino acid was quantified using the calibration curve method for each peak, and the sum of all detected amino acids was taken as the total amino acid content in the extract.
  • the measurement results are shown in Table 2 and FIG. 1.
  • the amount of amino acid is increased in the case of green tea (Comparative Example 4) grown by a general shading cultivation method, compared to green tea (Comparative Example 2) grown without shading treatment. It can be seen that the content shows a tendency to greatly decrease.
  • the total amino acid content was 3.2% on the 10th day of shading, indicating that the total amino acid content was increased, but thereafter, the total amino acid content was continuously decreased.
  • the shading rate is 70%
  • the greenest is darkest.
  • the total amino acid content was maximum when the shading period was 15 days, and the total amino acid content was increased more than 6 times compared with the case of no shading treatment.
  • the total amino acid content continuously increased in all the growing intervals.
  • the total amino acid content is 0.5% in the non-shielding method, and only 1.6% in the normal shading method, but in the case of the extreme shading method of 99% It can be seen that the 7.1% increase in the content of at least 4.5 times (compared to the general shading cultivation method) to 14.2 times (compared to untreated shading).
  • the green tea grown by the method of cultivating the light shielding having a light shielding rate of 90% or more has a large increase in amino acid content compared to the green tea grown by the light shielding cultivation method or the general light shielding method. It can be seen that the longer the content of the amino acid increases rapidly.
  • the catechin content was determined by quantifying eight catechins (gallocatechin, epigallocatechin, catechin, epicatechin, epigallocatechin gallate, gallocatechin gallate, epicatechin gallate, and catechin gallate), respectively. It was made.
  • the extract was dissolved in 50% methanol to make a 1000 ppm solution, followed by component analysis (Waters, 2996 PDA detector) using HPLC (Waters, 2695 model).
  • the stationary phase was a Kight Chemical's Mightysil RP-18 GP 250-4.6 mm (5 ⁇ m) column, and the mobile phase used the composition ratio shown in Table 3 below. Eight kinds of catechin mixtures were also adjusted according to the content of each catechin in the extract to proceed in the same manner as the sample solution.
  • the green tea grown by the method of cultivation of the extreme shading shows a tendency to decrease the catechin content slightly as the shading rate increases and the shading period increases, but the extent of the decrease is not so large that it is almost the same range. You can see that you are mine.
  • FIGS. 1 and 2 Tea leaves of green tea grown with different shading rates are shown in FIGS. 1 and 2.
  • green tea grown by the general shading method having a shading rate of 70% has the darkest green color.
  • the tea leaves are changed from green to bright white when cultivated at extreme shading with a shading rate of 99%.
  • the shading treatment for tea trees is usually carried out in the first two to three leaves during the period of growing tea buds.
  • the total amino acid content was 12.1% in the 21-day treatment section in the 1-leaf 1-leaf phase, which is much higher than the other shading treatment periods, and in the entire treatment period, the 1-leaf 1 leaf phase was total compared to the other treatment periods. It can be seen that the amino acid content is high.
  • the cultivation to produce tea leaves with different color from the new high-functional tea leaves through polarized light shielding rate is 99%, and the shading treatment period is from 1 to 1 to 3 cores, and the shading treatment period is 21 days. It can be seen that postwar is the best condition.
  • Example 1 (70% ethanol extract of tea-light cultivated green tea) 11.2
  • Example 2 (Ultra Shade Cultivated Green Tea Low Temperature and Low Temperature Water Extract) 18.2
  • Example 5 (cold light green tea low temperature leaching water extract) 14.1
  • Comparative Example 1 (70% ethanol extract of unshielded green tea) 3.7
  • Comparative Example 2 (light-shielding low temperature low-speed water extract of green tea) 5.8
  • Comparative Example 3 General Shading-cultivated Green Tea 70% Ethanol Extract
  • Comparative Example 4 (General Shading Cultivated Green Tea Water Extract) 8.7
  • Table 6 shows that the total amount of amino acids is significantly increased in the case of the ultra shaded green tea extract, compared to the normal shaded green tea extract, and especially when the low temperature low temperature extraction is performed using water as the extraction solvent. Can be.
  • keratinocytes were grown using KGM-gold (Lonza, # 00192151) medium, 25000 cells were seeded in 6-well plates.
  • the extracts of Examples 1 and 2 and Comparative Examples 1 and 3 were each diluted 1000-fold in the medium, treated with cells, and cultured for 1 day, and then the cells were harvested.
  • RNA using Trisol put the collected cells (about 1 X 10 5 ) in the tube, and then added 500 ⁇ l of Trisol to the homogenized cells for 5 minutes at room temperature. 100 ⁇ l of chloroform was added to each tube, shaken by hand for 15 seconds, and left at room temperature for 3 minutes, followed by centrifugation at 4 ° C. and 15000 xg for 15 minutes.
  • RNAase Out was added 2 minutes at 42 °C
  • Superscript III RT was added and reacted at 50 °C 60 minutes.
  • 165 ⁇ l of deionized water was added to 35 ⁇ l of the synthesized cDNA mixture and diluted to 200 ⁇ l in total.
  • Collagenase production inhibitory ability of the present invention was compared with retinoic acid to determine the effect on wrinkle improvement.
  • the degree of collagenase production of cell cultures was measured using a commercially available collagenase measuring instrument (Amersham Pharmacia, USA, Catalog #: RPN 2610).
  • the cell culture solution collected in a 96-well plate uniformly coated with primary collagenase antibody was placed in an incubator for 3 hours.
  • the chromophore-bound secondary collagen antibody was placed in a 96-well plate and reacted for another 15 minutes.
  • color-causing substances (3,3 ', 5,5'-tetramethylbenzidine, sigma) were added to induce color development at room temperature for 15 minutes, and 1M sulfuric acid was added to stop the color reaction.
  • the degree of yellow was different according to the degree of reaction progress.
  • the absorbance of the yellow 96-well plate was measured at 405 nm using an absorbance meter, and the degree of synthesis of collagenase was calculated by Equation 1 below, and the results are shown in Table 9 below. Indicated. At this time, the reaction absorbance of the cell culture liquid collected from the group not treated with the composition was used as a control.
  • the ultra-light green tea extract of the present invention has the effect of inhibiting the substrate metalloprotease (MMP-1).
  • the effect of elastase activity inhibition of the ultra-light green tea extract was compared to EGCG to determine the effect on anti-aging.
  • the elastase and substrate used were purchased commercially from Sigma-Aldrich, USA (Cat. No. E0127).
  • Elastase activity inhibitory activity was tested by the following test method.
  • Ginsenoside Rh4 200 ⁇ L
  • 50 ⁇ L of 20 ⁇ g / mL elastase type III solution were mixed in a 96 mg plate prepared with 10 mg / L Tris-HCL buffer (pH 8.0).
  • 250 ⁇ M of EGCG was used as a positive control and distilled water was used as a non-treated group as a negative control.
  • 100 ⁇ L of 0.4514 mg / mL N-SUCCINYL-ALA-ALA-ALA-p-NITROANILIDE prepared with the above buffer was added and reacted at 25 ° C for 15 minutes. After completion of the reaction, the absorbance at a wavelength of 415 nm was measured. A blank test was performed in the same manner to correct.
  • Equation 2 The calculation method of the elastase activity inhibitory activity is shown in Equation 2 below, the results are shown in Table 10 below.
  • the degree of inhibition of the elastase activity of the green tea extract of the ultra-light green tea extract was similar to the EGCG known as the inhibitor of the elastase activity, indicating that the elastase activity of the green tea extract of the invention was suppressed. It can be confirmed that excellent.
  • keratinocytes were grown using KGM-gold (Lonza, # 00192151) medium, 25000 cells were seeded in 6-well plates.
  • the extracts of Examples 1 and 2 and Comparative Examples 1 and 3 were each diluted 1000-fold in the medium, treated with cells, and cultured for 1 day, and then the cells were harvested.
  • RNA using Trisol put the collected cells (about 1 X 10 5 ) in the tube, and then added 500 ⁇ l of Trisol to the homogenized cells for 5 minutes at room temperature. 100 ⁇ l of chloroform was added to each tube, shaken by hand for 15 seconds, and left at room temperature for 3 minutes, followed by centrifugation at 4 ° C. and 15000 xg for 15 minutes.
  • RNAase Out was added 2 minutes at 42 °C
  • Superscript III RT was added and reacted at 50 °C 60 minutes.
  • 165 ⁇ l of deionized water was added to 35 ⁇ l of the synthesized cDNA mixture and diluted to 200 ⁇ l in total.
  • keratinocytes were grown using KGM-gold (Lonza, # 00192151) medium, 25000 cells were seeded in 6-well plates.
  • the extracts of Examples 1 and 2 and Comparative Examples 1 and 3 were each diluted 1000-fold in the medium, treated with cells, and cultured for 1 day, and then the cells were harvested.
  • RNA using Trisol put the collected cells (about 1 X 10 5 ) in the tube, and then added 500 ⁇ l of Trisol to the homogenized cells for 5 minutes at room temperature. 100 ⁇ l of chloroform was added to each tube, shaken by hand for 15 seconds, and left at room temperature for 3 minutes, followed by centrifugation at 4 ° C. and 15000 xg for 15 minutes.
  • RNAase Out was added 2 minutes at 42 °C
  • Superscript III RT was added and reacted at 50 °C 60 minutes.
  • 165 ⁇ l of deionized water was added to 35 ⁇ l of the synthesized cDNA mixture and diluted to 200 ⁇ l in total.

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Abstract

본 발명은 기존 녹차의 차광 재배와 차별화된 극차광 재배 방법을 통해 생산된 녹차 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 99% 이상의 차광 재배로 재배함으로써 아미노산 함량이 현저하게 증가된 극차광 녹차의 추출물을 함유하여, 보다 우수한 피부 보습, 피부 보호, 항노화 등의 효과를 얻을 수 있는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.

Description

극차광 재배 녹차 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물
본 발명은 기존 녹차의 차광 재배 방법과 차별화된 극차광 재배 방법을 통해 생산된 녹차의 추출물을 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 차광률이 90% 이상인 차광 재배로 재배함으로써 아미노산 함량이 현저하게 증가된 극차광 재배 녹차의 추출물을 함유하여, 보다 우수한 피부 보습, 피부 보호, 항노화 등의 효과를 얻을 수 있는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.
차광 재배라 함은 차의 싹 생육 중의 일정 기간 동안 빛을 차단하여(차광률: 50~70% 정도) 기르는 재배법을 말한다. 차광 재배를 하게 되면, 차 잎의 경화를 지연시키고 녹색을 강하게 하며, 카테킨 함량을 줄이고, 아미노산 및 데아닌 함량을 높일 수 있기 때문에, 녹차의 떫은 맛을 줄여 부드러우면서도 더 진한 녹색을 띄는 녹차를 만들기 위한, 즉 심미성, 맛 등을 향상시켜 식품으로서의 효용을 향상시키기 위한 방법으로 차광 재배 방법이 선택되어 왔다.
반면, 극차광 재배 방법은 차광 재배 방법에서 차광률을 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 특히 99% 이상으로 한 재배 방법으로서, 녹차를 극차광 재배 방법으로 재배하게 되면 녹차의 생산량이 현저하게 떨어져서 생산성 측면 및 단가 측면에서 바람직하지 않고, 오히려 녹차잎의 백화현상이 일어나게 되므로 시각적인 품질 열화 현상이 있을 뿐만 아니라, 카테킨의 함량도 감소하는 경향이 있어 기존 식품으로서의 적용 차원에서는 극차광 재배 방법으로 재배한 녹차의 효용 가치가 현저하게 떨어졌다.
한편, 기존 녹차를 포함하는 피부 외용제 조성물은 녹차의 성분 중 많은 함량을 차지하는 카테킨에서 유래하는 항산화와 항염 효능을 중심으로 개발되어 왔다. 그러나, 녹차에는 카테킨 이외에도 여러 가지 피부 효능을 나타낼 수 있는 다양한 종류의 아미노산이 포함되어 있으며, 이는 상기한 바와 같이 차광 재배에 의해 그 함량을 증가시킬 수 있다.
그러나, 차광률이 50~70%에 해당하는 기존 차광 재배 방법으로는 아미노산의 함량을 증가시키는 데 한계가 있으며, 또한 차광 재배 방법에 의해 재배된 녹차의 용도가 대부분 식품 용도로만 존재할 뿐, 피부 외용제로의 개발에 대한 연구는 미미한 실정이다.
한편, 기존에 사용되는 추출법은 유기 용매를 일부 포함하기 때문에 아미노산 함량을 극대화하는 데 어려움이 있으므로, 아미노산을 극대로 추출할 수 있는 추출법에 대한 필요성도 존재한다.
본 발명자는 극차광 재배 방법으로 재배한 녹차의 경우, 아미노산의 함량이 현저하게 증가함을 발견하였으며, 극차광 재배 녹차의 추출물을 피부 외용제 조성물의 유효성분으로서 사용하게 되면 기존의 무차광으로 재배한 녹차 또는 차광 재배한 녹차의 추출물을 함유하는 경우에 비하여 피부 보습, 피부 보호, 항노화 등에 있어서 보다 우수한 효과를 제공할 수 있음을 발견하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명은 극차광 재배 방법으로 재배한 녹차의 추출물을 함유하는 피부 보습용, 항노화용, 피부 장벽 보호용 피부 외용제 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 차광률을 90% 이상으로 하여 재배한 녹차의 추출물을 함유하는 피부 보습용, 항노화용 또는 피부 장벽 보호용 피부 외용제 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 피부 외용제 조성물의 제조에 있어서, 차광률이 90% 이상인 극차광 재배 방법으로 재배한 녹차의 추출물의 피부 보습제, 피부 항노화제, 피부 주름 개선제, 피부 탄력 개선제, 피부 장벽 기능 강화제 또는 피부 손상 억제 또는 피부 보호제로서의 용도를 제공한다.
본 발명의 방법은, 차광률이 90% 이상인 극차광 재배 방법으로 재배하여 아미노산의 함량을 현저하게 상승시킨 녹차의 추출물을 함유함으로써, 기존 녹차 추출물을 함유하는 조성물에 비하여 보다 우수한 피부 보습력 증가, 항노화 또는 피부 장벽 보호 효과를 제공할 수 있다.
도 1은 차광 재배시 차광률에 따른 찻잎의 색을 나타내는 것이다.
도 2는 99%의 차광률로 25일 동안 극차광 재배한 찻잎을 나타내는 것이다.
도 3은 차광률 및 차광 기간에 따른 녹차 추출물 중의 아미노산 함량 변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 차광률 및 차광 기간에 따른 녹차 추출물 중의 카테킨 함량 변화를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 극차광 재배 방법으로 재배한 녹차의 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 “극차광 재배 방법”이란 용어는, 차광 재배 방법에 있어서 차광률을 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 바람직하게는 98% 이상, 보다 바람직하게는 99%, 훨씬 더 바람직하게는 99.9% 이상으로 하는 식물의 재배 방법을 의미한다.
본 발명의 녹차(차나무; Camellia sinensis L.)의 극차광 재배 방법은 10일 이상의 기간, 바람직하게는 10일 내지 25일, 보다 바람직하게는 15일 내지 21일의 기간 동안 차광률을 90% 이상, 바람직하게는 95% 이상, 바람직하게는 98% 이상, 보다 바람직하게는 99%, 훨씬 더 바람직하게는 99.9% 이상으로 하여 차나무를 재배하는 방법이다.또한, 본 발명의 극차광 재배 방법은 이에 한정되는 것은 아니지만 바람직하게는 차나무의 1심 1엽기 내지 1심 4엽기에 차광 처리하고, 보다 바람직하게는 1심 1엽기 내지 1심 3엽기, 보다 더 바람직하게는 1심 1엽기에 차광 처리한다.
본 발명의 극차광 재배 방법을 이용함으로써, 녹차에 존재하는 총 아미노산 함량을 현저하게 증가시킬 수 있다.
본 발명에 있어서 사용되는 극차광 재배 녹차의 추출물은 극차광 재배 방법으로 재배된 녹차의 잎 또는 녹차잎의 분말을 추출용매로서 물 또는 저급 알코올, 바람직하게는 물 또는 에탄올을 이용하여 수득된다.
추출물은 녹차 잎으로부터 추출된 상태 그대로 사용할 수도 있고, 추출에 의해 얻은 물질을 건조, 분말화의 공정을 통하여 제조한 분말 상태로 사용할 수도 있다.
또한, 화장료 조성물로의 적용을 고려할 때, 바람직하게는 추출 용매로서 물을 사용함이 바람직하다. 특히, 추출 용매로서 물을 사용하게 되면, 다른 추출 용매를 사용하는 경우보다 아미노산 용출률이 증가하게 된다. 또한 침출 또는 열수 추출의 경우에는 아미노산 이외의 다른 성분의 추출 정도가 높아지므로, 아미노산의 선택적인 용출의 측면에서 저온저속 물 추출(예를 들어, 더치커피 제조 기구를 사용)의 경우가 보다 바람직하다.
본 발명에 있어서 극차광 재배 녹차의 추출물은 함량이 크게 제한되지 않지만, 바람직하게는 조성물 총 중량에 대하여 0.0001~40중량%, 바람직하게는 0.01~30중량%, 보다 바람직하게는 0.1~20중량%의 양으로 포함될 수 있다. 함량이 0.0001중량% 미만이면 유효성분으로서의 작용을 기대하기 어려우며, 40중량%를 초과하면 제형 안정성이 나빠지므로 바람직하지 않다.
본 발명에 따른 조성물은 각질 형성세포의 분화 촉진 또는 트랜스 글루타미네이즈 발현 촉진 등을 통해 피부 수분을 유지하고 수분 보유력을 증가시킴으로써 피부 보습 효과를 제공한다.
본 발명에 따른 조성물은 산화 또는 자외선에 의한 피부 손상 억제, 콜라겐 생성 촉진 또는 매트릭스 메탈로프로테이나아제 1(MMP-1)의 생합성을 저해하여 피부 주름을 개선시키고, 피부 탄력을 증가시켜 피부 노화를 억제하는 효과를 제공한다.
본 발명에 따른 조성물은 피부 손상을 억제하여 피부를 보호하는 효과를 제공한다. 여기에서 피부는 두피 또는 모발을 포함한다. 즉, 본 발명의 조성물은 두피 또는 모발의 손상을 억제하여 모발을 보호하는 효과도 제공한다.
본 발명에 따른 조성물은 산화 또는 자외선에 의한 피부 손상을 억제하여 피부를 보호하는 효과를 제공한다. 여기서 피부는 두피 또는 모발을 포함한다. 즉, 본 발명의 조성물은 산화 또는 자외선에 의한 두피 또는 모발의 손상을 억제함으로써 두피 또는 모발을 보호하는 효과도 제공한다.
또한, 본 발명은 피부 외용제 조성물의 제조에 있어서, 차광률이 90% 이상인 극차광 재배 방법으로 재배한 녹차의 추출물의 피부 보습제, 피부 항노화제, 피부 주름 개선제, 피부 탄력 개선제, 피부 장벽 기능 강화제 또는 피부 손상 억제 또는 피부 보호제로서의 용도를 제공한다.
본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 화장료 조성물 또는 약제학적 조성물로 제형화될 수 있다.
본 발명에 따른 화장료 조성물은 화장품학 또는 피부과학적으로 허용가능한 매질 또는 기제를 함유할 수 있다. 이는 국소적용에 적합한 모든 제형으로, 예를 들면, 용액, 겔, 고체, 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는, 이온형(리포좀) 및 비이온형의 소낭 분산제의 형태로, 또는 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱의 형태로 제공될 수 있다. 이들 조성물은 당해 분야의 통상적인 방법에 따라 제조될 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 또한 포말(foam)의 형태로 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 사용될 수 있다.
본 발명의 화장료 조성물은 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 상기 보조제는 화장품학 또는 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다.
본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 그 제형에 있어서 특별히 한정되는 바가 없으며, 예를 들면, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일 및 바디에센스 등의 화장료로 제형화될 수 있다.
본 발명에 따른 피부 외용제 조성물은 약제학적 조성물일 수 있다. 상기 약제학적 조성물은 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 약제학적 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있다. 상기 약제학적 조성물은, 로션, 크림, 연고 또는 젤 등으로 제형화될 수 있다.
상기 약제학적 조성물은, 경피 투여되는 것이 바람직하다.
상기 약제학적 조성물의 유효성분인 극차광 재배 녹차 추출물의 투여량은 치료 받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다.
이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있다. 일반적으로 투여량은 0.0001mg/kg/일 내지 대략 2000g/kg/일 범위이다.
이하, 실시예 및 시험예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예 및 시험예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 하기 실시예 및 시험예에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실시예 1] 극차광 재배(차광률 99%) 녹차 70% 에탄올 추출물 제조
차광률 99%의 극차광 처리를 거쳐 재배된 녹차(Camellia sinensis L.)(차광기간 1일(시작일을 의미함, 이하 동일함), 5일, 10일, 15일, 20일, 25일)를 정제수로 세척하고 건조시킨 다음 세말화하여 얻어진 극차광 녹차 가루 100g을 70% 에탄올 수용액 1리터에 넣고 교반하면서 12시간 추출한 후, 와트만 2번 여과지로 여과시켰다. 이렇게 얻어진 추출액을 냉각 콘덴서가 달린 증류 장치를 이용하여 50℃로 감압 농축하고 건조하여 극차광 재배(차광률 99%) 녹차 70% 에탄올 추출물(건조중량 30.85g)을 얻었다.
[실시예 2] 극차광 재배(차광률 99%) 녹차 저속저온 물 추출물 제조
차광률 99%의 극차광 처리를 거쳐 재배된 녹차(차광기간 1일, 5일, 10일, 15일, 20일, 25일)를 정제수로 세척하고 건조시킨 다음 세말화하여 극차광 녹차 가루를 얻었다. 하단부에 토출구가 있는 원통형 유리통에 와트만 2번 여과지를 깔고, 그 위에 극차광 녹차 가루 100g을 넣은 다음 가루의 상단부에는 종이 필터를 위치시켜 떨어지는 물방울이 고르게 표면에 적셔지도록 하였다. 원통형 유리통 위에 속도 조절이 가능한 밸브가 장착된 물통을 위치시키고, 물통에 정제수와 정제수 얼음을 섞어 넣어 4℃ 이하를 유지하였다. 물통에서 원통형 유리통으로 시간당 약 100mL 속도로 물방울을 떨어뜨리는 과정을 10시간 지속하였다(총 1000 mL 사용하여 추출). 원통형 유리통 하단부에서 토출되는 극차광 녹차 추출액을 모아 냉각 콘덴서가 달린 증류 장치를 이용하여 50℃로 감압 농축하고 동결 건조하여 극차광 재배(차광률 99%) 녹차 저속저온 물 추출물(건조 중량 26.21 g)을 얻었다.
[실시예 3] 극차광 재배(차광률 90%) 녹차 저속저온 물 추출물 제조
차광률을 90%로 하여 재배한 녹차를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 하여 극차광 재배(차광률 90%) 녹차 저속저온 물 추출물(건조 중량 27.61g)을 얻었다.
[실시예 4] 극차광 재배(차광률 95%) 녹차 저속저온 물 추출물 제조
차광률을 95%로 하여 재배한 녹차를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 하여 극차광 재배(차광률 95%) 녹차 저속저온 물 추출물(건조 중량 25.43g)을 얻었다.
[실시예 5] 극차광 재배(차광률 99%) 녹차 저온침출 물 추출물 제조
차광률 100%의 극차광 처리를 거쳐 재배된 녹차(차광기간 1일, 5일, 10일, 15일, 20일, 25일)를 정제수로 세척하고 건조시킨 다음 세말화하여 얻어진 극차광 녹차 가루 100g을 정제수와 정제수 얼음을 섞어 넣어 4℃ 이하로 만든 냉수 1리터에 넣고 교반하면서 12시간 추출한 후, 와트만 2번 여과지로 여과시켰다. 이렇게 얻어진 추출액을 냉각 콘덴서가 달린 증류 장치를 이용하여 50℃로 감압 농축하고 건조하여 극차광 재배(차광률 99%) 녹차 저온침출 물 추출물(건조 중량 23.25g)을 얻었다.
[비교예 1] 무차광처리 녹차 70% 에탄올 추출물 제조
차광 처리를 거치지 않고 재배된 일반 녹차를 정제수로 세척하고 건조시킨 다음 세말화하여 얻어진 무차광처리 녹차 가루 100g을 70% 에탄올 수용액 1리터에 넣고 교반하면서 12시간 추출한 후, 와트만 2번 여과지로 여과시켰다. 이렇게 얻어진 추출액을 냉각 콘덴서가 달린 증류 장치를 이용하여 50℃로 감압 농축하고 건조하여 무차광처리 녹차 70% 에탄올 추출물(건조 중량 33.47g)을 얻었다.
[비교예 2] 무차광처리 녹차 저온저속 물 추출물 제조
차광 처리를 거치지 않고 재배된 일반 녹차를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 하여 무차광처리 녹차 저속저온 물 추출물(건조 중량 24.66g)을 얻었다.
[비교예 3] 일반 차광 재배 녹차 70% 에탄올 추출물 제조
일반적인 차광 처리(차광률 70%)를 거쳐 재배된 일반 차광 재배 녹차를 정제수로 세척하고 건조시킨 다음 세말화하여 얻어진 일반차광 녹차 가루 100g을 70% 에탄올 수용액 1리터에 넣고 교반하면서 12시간 추출한 후, 와트만 2번 여과지로 여과시켰다. 이렇게 얻어진 추출액을 냉각 콘덴서가 달린 증류 장치를 이용하여 50℃로 감압 농축하고 건조하여 일반 차광 재배 녹차 70% 에탄올 추출물(건조중량 31.06 g)을 얻었다.
[비교예 4] 일반 차광 재배 녹차 저온저속 물 추출물 제조
일반적인 차광 처리(차광률 70%)를 거쳐 재배된 녹차를 사용한 것을 제외하고는, 상기 실시예 2와 동일한 방법으로 하여 일반 차광 재배 녹차 저속저온 물 추출물(건조 중량 29.87g)을 얻었다.
[시험예 1] 추출물 내 총 아미노산 및 카테킨 함량 분석(차광률 및 차광 기간에 따른 차이)
상기 실시예 2 내지 4 및 비교예 2 및 4에서 제조한 녹차 추출물(차광률에 따른 처리 조건은 하기 표 1 참조) 내 총 아미노산 및 카테킨 함량을 분석하였다.
차광률에 따른 처리 조건
시험구 평균 조도(Lux) 차광률(%)
무차광 처리 104,433 0
일반 차광 재배 30,560 70
극차광 재배(90%) 1,089 90
극차광 재배(95%) 538 95
극차광 재배(99%) 128 99
1. 총 아미노산 함량 분석
아미노산 함량은 22종의 유리 아미노산을 동시 분석을 통해 각각 정량하여 그 총합으로 하였다. 상기 추출물을 정제수에 녹여 10,000ppm 용액으로 만든 후 20μL를 취한 다음 AccQ-Tag 버퍼 70μL, AccQ-Tag 유도체 시약 20μL를 가하고 혼합하여 검액을 제조한다(AccQ-Tag 버퍼 및 유도체 시약, UPLC 분석용 용매는 Waters社에서 구입해서 사용함). 아미노산 22종 혼합액에 대해서도 추출물 내 각 아미노산의 함량에 따라 적절히 농도를 조절하여 검액과 같은 유도체화 반응을 진행하였다. 검액과 아미노산 표준액을 UPLC(Waters社) System을 이용하여 성분 분석(PDA 검출기, 260nm)을 진행하였고, 고정상은 Waters AccQ-Tag Ultra Column 100-2.1 mm(1.7μm) 사용하였다. 이동상은 AccQ-Tag Ultra Eluent A와 AccQ-Tag Ultra Eluent B를 0~0.54분, 99.9% A; 7.74~8.5분, 82.5% A; 8.5~8.7분, 40.4% A); 8.7~10분, 99.9% A의 조성비로 사용하였다. 그 결과, 각 아미노산별 피크가 관찰되었으며, 해당 피크별로 검량선법을 사용하여 각 아미노산의 함량을 정량하고, 검출된 모든 아미노산의 총합을 추출물 내 총아미노산 함량으로 하였다. 측정 결과는 하기 표 2 및 도 1에 나타내었다.
총 아미노산 함량(단위: %)
차광기간 무차광처리(비교예 2) 70% 차광(비교예 4) 90% 차광(실시예 4) 95% 차광(실시예 5) 99% 차광(실시예 2)
1일 2.6 2.6 2.6 2.6 2.6
5일 2.8 2.8 3.0 3.1 3.3
10일 2.1 3.2 3.9 4.2 4.8
15일 0.7 2.7 4.3 4.6 5.2
20일 0.8 2.4 3.6 5.0 6.9
25일 0.5 1.6 3.0 5.7 7.1
상기 표 2를 보면, 일반 차광 재배법으로 재배한 녹차(비교예 4)의 경우 차광처리하지 않고 재배한 녹차(비교예 2)에 비하여 아미노산의 함량이 증가하기는 하지만, 차광기간이 길어질수록 아미노산의 함량이 크게 감소하는 경향을 나타낸다는 것을 확인할 수 있다.
무차광처리 녹차의 경우, 찻잎이 성장을 하면서 생육 초기에는 2.6%이고, 5일 경과 후에는 2.8%로 약간 증가하는 것으로 보이나, 그 이후에는 총 아미노산 함량이 지속적으로 감소하는 경향을 나타낸다.
일반 차광 재배 방법(차광률 70%)의 경우, 총 아미노산 함량이 차광 10일째에는 3.2%인 것으로 나타나 총 아미노산 함량이 증가하였으나, 그 이후에는 총 아미노산 함량이 지속적으로 감소하는 경향을 나타낸다. 또한 도 1에 나타낸 바와 같이 차광률이 70% 때가 가장 녹색이 짙은 것을 알 수 있다.
차광률을 90%로 한 극차광 재배 방법의 경우, 차광 기간이 15일 경과한 때 총 아미노산 함량이 최대이었으며, 이때 총 아미노산 함량이 무차광처리 경우에 비하여 6배 이상 증가하였다.
특히, 차광률을 95% 이상으로 한 극차광 재배 방법의 경우, 모든 재배 구간에서 지속적으로 총 아미노산 함량이 증가하였다.
구체적으로, 차광 기간이 25일 경과한 때 총 아미노산 함량이 무차광 재배 방법 경우에는 0.5%이고, 일반 차광 재배 방법의 경우에는 1.6%에 불과하지만, 차광률이 99%인 극차광 재배 방법의 경우에는 7.1%로 최소 4.5배(일반 차광 재배 방법 대비) 내지 14.2배(무처리차광 대비)의 함량 증대가 이루어졌음을 확인할 수 있다.
따라서, 차광률이 90% 이상인 극차광 재배 방법으로 재배한 녹차는, 무차광처리 재배 또는 일반 차광 재배 방법으로 재배한 녹차와 비교하여 아미노산 함량이 크게 증가하며, 차광률이 95% 이상이면 차광기간이 길어질수록 오히려 아미노산의 함량이 급격하게 증가한다는 것을 확인할 수 있다.
2. 카테킨 함량 분석
카테킨 함량은 8종의 카테킨(갈로카테킨, 에피갈로카테킨, 카테킨, 에피카테킨, 에피갈로카테킨 갈레이트, 갈로카테킨 갈레이트, 에피카테킨 갈레이트, 카테킨 갈레이트)을 동시 분석을 통해 각각 정량하여 그 총합으로 하였다. 상기 추출물을 50% 메탄올에 녹여 1,000ppm 용액으로 만든 후 HPLC(Waters사, 2695 model)를 이용하여 성분 분석(Waters사, 2996 PDA 검출기)을 진행하였다. 고정상은 Kanto Chemical의 Mightysil RP-18 GP 250-4.6mm(5μm) 칼럼을 이용하였고, 이동상은 하기 표 3에 기재한 조성비를 사용하였다. 카테킨 8종 혼합액에 대해서도 추출물 내 각 카테킨의 함량에 따라 적절히 농도를 조절하여 검액과 같은 방법으로 진행하였다.
시간(분) A: 0.1% 아세트산 용액 B: 아세토니트릴
0 90 10
10 90 10
30 85 15
42 80 20
44 5 95
45 5 95
49 90 10
50 90 10
그 결과, 각 카테킨별 피크가 관찰되었으며, 해당 피크별로 검량선법을 사용하여 각 카테킨의 함량을 정량하고, 검출된 모든 카테킨의 총합을 추출물 내 총카테킨 함량으로 하였다. 측정 결과는 하기 표 4에 나타내었다.
총 카테킨 함량(단위: %)
차광기간 무차광 처리 70% 차광 90% 차광 95% 차광 99% 차광
1일 17 17 17 17 17
5일 16 16 14 15 15
10일 15 15 14 14 15
15일 14 12 13 12 12
20일 14 12 12 12 11
25일 13 11 11 12 10
상기 표 4를 보면, 극차광 재배 방법에 의하여 재배된 녹차는 차광률이 높아지고, 차광기간이 길어짐에 따라 카테킨 함량이 약간 감소하는 경향을 나타내기는 하지만, 그 감소 정도가 크지 않아 거의 동일한 수준의 범위 내인 것을 확인할 수 있다.
3. 차광률에 따른 찻잎 색 비교
차광률을 달리하여 재배한 녹차의 찻잎을 도 1 및 2에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이 차광률이 70%인 일반 차광 재배 방법으로 재배한 녹차의 경우가 가장 녹색이 짙은 것을 알 수 있다.
또한, 차광률 99%로 극차광 재배하게 되면, 찻잎이 녹색에서 선명한 백색으로 변하게 되는 것을 확인할 수 있다.
[시험예 2] 최적 차광 처리 시기 결정
일반적인 차광 재배시, 차나무에 대한 차광 처리는 보통 차싹이 자라는 시기 중 1심 2엽기 내지 3엽기에 수행된다.
차광률에 따라서 아미노산을 비롯한 유용성 성분의 함량이 극대화되고, 찻잎의 색이 백색으로 바뀐다는 선행 실험 결과를 바탕으로 최적의 차광 처리 시기를 결정하기 위해서, 하기 평가를 실행하였다.
99% 차광 처리를 차싹이 자라는 시기별(1심 1엽기, 1심 2엽기, 1심 3엽기, 1심 4엽기, 1심 5엽기)로 처리를 하였고 처리 기간에 따른 총 아미노산 함량에 대하여 분석을 하였다. 결과는 하기 표 5에 나타내었다.
99% 차광률로 차광 처리를 한 차나무에서 차광 처리 시기에 따른 총 아미노산 함량 변화
차광 처리 시기/처리 기간 총 아미노산 함량(%)
1일 7일 14일 21일 27일
1심 1엽기 2.6 5.3 8.1 12.1 4.6
1심 2엽기 2.6 4.7 5.2 4.9 2.1
1심 3엽기 2.6 4.1 4.9 3.2 1.6
1심 4엽기 2.6 3.4 3.6 2.4 1.2
1심 5엽기 2.6 2.3 1.9 1.1 0.8
상기 표 5를 보면, 총 아미노산 함량은 1심 1엽기에서 21일 처리구간에서 12.1%로 다른 차광 처리 시기보다 월등히 높은 함량을 나타내며, 또한 모든 처리 기간에서 1심 1엽기가 다른 처리시기에 비해서 총 아미노산 함량이 높게 나타난다는 것을 알 수 있다.
1심 1엽기에서는 차광 처리 기간이 21일까지는 지속적으로 총 아미노산 함량이 증가하였으며, 그 이후 급격히 함량이 감소되었다. 이는 다른 차광 처리 시기도 각각의 차이는 있지만, 아미노산 함량이 일정 기간 동안 상승하다가 급격히 감소하는 양상을 나타내었다.
이러한 결과를 보았을 때 극차광을 통한 새로운 고기능성 찻잎과 차별성 있는 색을 찻잎을 생산하기 위한 재배는 차광률 99%, 차광 처리 시기는 1심 1엽기 내지 1심 3엽기, 차광 처리 기간은 21일 전후가 가장 뛰어난 조건임을 알 수 있다.
[시험예 3] 추출물 내 총 아미노산 함량 분석(차광재배 및 추출용매에 따른 차이)
상기 실시예 1, 2 및 6(각각 차광기간 21일) 및 비교예 1(21일 생육) 내지 4(차광기간 21일)를 사용한 것을 제외하고는 상기 시험예 1과 동일한 방법으로 녹차 추출물 내 총 아미노산 함량을 분석하였다. 분석 결과는 하기 표 6에 나타내었다.
시료명 총 아미노산(%)
실시예 1(극차광 재배 녹차 70% 에탄올 추출물) 11.2
실시예 2(극차광 재배 녹차 저속저온 물 추출물) 18.2
실시예 5(극차광 재배 녹차 저온침출 물 추출물) 14.1
비교예 1(무차광처리 녹차 70% 에탄올 추출물) 3.7
비교예 2(무차광처리 녹차 저온저속 물 추출물) 5.8
비교예 3(일반 차광 재배 녹차 70% 에탄올 추출물) 5.9
비교예 4(일반차광 재배 녹차 물 추출물) 8.7
상기 표 6을 보면, 극차광재배 녹차 추출물의 경우 일반 차광재배 녹차 추출물에 비하여 총 아미노산 함량이 현저하게 증가하며, 특히 추출용매로서 물을 사용하여 저속저온 추출한 경우 아미노산의 추출량이 더 증가한다는 것을 알 수 있다.
[시험예 4] 보습 유전자 발현 확인
본 발명에 따른 극차광 재배 녹차 추출물이 피부 보습력과 관련된 것으로 공지되어 있는 2가지 유전자, 즉 로리크린, 인볼루크린의 발현에 미치는 영향을 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
각질형성세포를 KGM-gold(Lonza, #00192151) 배지를 이용하여 성장시킨 후에, 6웰 플레이트에 25000개의 세포를 씨딩하였다. 그 다음날, 실시예 1~2와 비교예 1 및 3 각각의 추출물을 배지에 각각 1000배 희석시킨 후, 세포에 처리하고, 1일간 배양한 후에 세포를 수거하였다. 트리솔을 이용하여 RNA를 추출하기 위하여, 튜브에 수거한 세포(약 1 X 105개)를 넣은 다음, 여기에 트리솔 500μl씩을 넣고 세포를 상온에서 5분간 균질화시켰다. 각각의 튜브에 클로로포름을 100μl씩 넣고 손으로 15초간 흔들어 섞어준 후, 상온에서 3분간 방치한 다음, 4℃ ,15000 x g에서 15분간 원심분리를 하였다. 상층액만 새 튜브로 옮긴 후에, 이소프로필 알코올을 250μl씩 넣고 잘 섞어준 다음, 상온에서 10분간 방치한 후, 4℃ ,15000 x g에서 10분간 원심분리를 하였다. 펠렛만 남기고 상층액은 모두 버린 후에 75% 알코올을 500μl씩 넣고 볼텍싱(vortexing)한 다음, 4℃ ,7500 x g에서 5분간 원심분리를 하였다. 펠렛만 남기고 상층액을 조심히 버린 후에, 펠렛을 잘 말린 후 탈이온수를 넣어 RNA를 녹인 후에 260nm에서 정량을 하였다. 총 RNA를 이용하여 cDNA를 합성하기 위해, 총 RNA 4μg에 올리고 dT 2μl을 넣고 70℃에서 10분 반응한 후에 재빨리 식혔다. DTT, dNTP, 10x RT 완충액, MgCl2, RNAase Out를 넣고 42℃에서 2분 후, Superscript III RT를 넣고 50℃에서 60분 반응시켰다. 합성된 cDNA혼합액35μl에 탈이온수 165μl을 넣어 총 200μl로 희석하였다. qPCR을 진행하기 위해, cDNA혼합액 5μl + 탈이온수 4μl + Taqman 프라이머(대조군 유전자; RPLP0, 실험군 유전자; loricrin, involucrin) 각 1μl + Taqman 2X Universal PCR Master Mix(ABI제품, #4304437) 10μl을 섞어 총 20μl를 각각의 PCR 튜브에 각각 넣고 실시간 PCR장비(ABI제품, 모델명: 7500fast)에 로딩하였다. 리액션 셋업은 다음과 같다: 1. 홀딩단계: 95℃(10분), 2. 싸이클링단계: 95℃(15초)+ 60℃(60초), 총 40싸이클 반복하였다. 이 때 사용된 Taqman 프라이머는 리포터역할 형광분자 FAM, 퀜처 NFQ-MGB 로 구성된 상용 프라이머를 이용하였다.
결과는 표 7 및 8에 나타내었다.
loricrin 대조군 비교예1(ppm) 비교예3(ppm) 실시예1(ppm) 실시예2(ppm)
6 12 25 6 12 25 6 12 25 6 12 25
평균(AVR) 1.00 1.04 1.92 3.00 1.14 2.45 3.56 1.27 2.74 4.45 1.44 2.98 4.96
표준편차(STD) 0.04 0.14 0.26 0.25 0.15 0.15 0.08 0.08 0.17 0.45 0.09 0.11 0.17
involucrin 대조군 비교예1(ppm) 비교예3(ppm) 실시예1(ppm) 실시예2(ppm)
6 12 25 6 12 25 6 12 25 6 12 25
평균(AVR) 1.00 0.69 0.83 0.94 0.47 1.02 1.23 0.51 1.25 1.99 0.68 1.59 2.31
표준편차(STD) 0.04 0.05 0.00 0.02 0.01 0.03 0.09 0.03 0.07 0.02 0.00 0.04 0.05
표 7 및 8을 보면, 녹차 추출물을 처리하면 2가지 유전자에서 모두 발현량이 증가하는 것을 확인할 수 있으며, 특히 극차광 재배 녹차 추출물을 처리한 경우 일반 녹차 추출물보다 현저하게 우수한 효능을 보임을 알 수 있다.
[시험예 5] 콜라게나아제(MMP-1) 저해능
본 발명의 콜라게나아제 생성 저해능을 레티노익산과 비교하여 주름 개선에 미치는 효과를 측정하였다.
2.5%의 우태아 혈청이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Media) 배지가 들어있는 96공 평판배양기(96-well microtiter plate)에 인간의 섬유아세포를 5,000 세포/공(well)이 되도록 넣고, 70~80% 정도 자랄 때까지 CO2 5%, 37℃ 배양기(incubator)에서 배양하였다. 실시예 1~2 와 비교예 1 및 3 각각의 추출물 또는 레티노익산을 10㎍/ml 농도로 24시간 동안 처리한 다음, 세포배양액을 채취하였다.
상업적으로 이용가능한 콜라게나아제 측정기구(미국 아머샴파마샤 사, Catalog #: RPN 2610)를 이용하여 채취한 세포배양액의 콜라게나아제 생성 정도를 측정하였다. 먼저 1차 콜라게나아제 항체가 균일하게 도포된 96-공 평판(96-well plate)에 채취한 세포 배양액을 넣고 3시간 동안 항원-항체 반응을 항온조에서 실시하였다. 3시간 후 발색단이 결합된 2차 콜라겐 항체를 96-공 평판(96-well plate)에 넣고 다시 15분간 반응시켰다. 15분 후 발색유발물질(3,3', 5,5'-tetramethylbenzidine, sigma)을 넣어 실온에서 15분간 발색을 유발시키고, 다시 1M 황산을 넣어 발색반응을 중지시키면 반응액의 색깔은 노란색을 띠게 되며 반응 진행의 정도에 따라 노란색의 정도가 다르게 나타났다.
노란색을 띠는 96-공 평판(96-well plate)의 흡광도를 흡광계를 이용하여 405nm에서 측정하고, 하기 수학식 1에 의해 콜라게나아제의 합성 정도를 계산하였으며, 그 결과는 하기 표 9에 나타내었다. 이때 조성물을 처리하지 않은 군에서 채취한 세포 배양액의 반응 흡광도를 대조군으로 하였다.
Figure PCTKR2017010378-appb-M000001
화합물 발현정도(%)
비처리군 100
레티노익산 75
비교예1 73
비교예3 77
실시예1 73
실시예2 76
상기 표 9의 결과에서, 극차광 재배 녹차 추출물의 콜라게나아제 발현 정도가 콜라게나아제 발현 저해제로 알려져 있는 레티노익산과 비교하여서도 콜라게나아제 발현 저해 효과가 비슷한 수준임을 알 수 있다.
이와 같은 결과를 통하여, 본 발명의 극차광 재배 녹차 추출물은 기질 메탈로 프로테아제(MMP-1)를 저해시키는 효과를 가짐을 확인할 수 있다.
[시험예 6] 엘라스타아제 활성 억제 효능 측정
극차광 재배 녹차 추출물의 엘라스타아제 활성 저해능을 EGCG와 비교하여 항노화에 미치는 영향을 측정하였다. 사용된 엘라스타아제와 기질은 미국 시그마알드리치 사로부터 상업적으로 구매하였다(Cat.No. E0127).
하기의 시험방법으로 엘라스타아제 활성 저해작용을 시험하였다.
96웰 플레이트에서 10mg/L Tris-HCL 완충액(pH 8.0)으로 조제한 것에 진세노사이드 Rh4(200μL) 및 20㎍/mL 엘라스타아제·타입 III 용액 50μL를 혼합하였다. EGCG 250μM은 양성 대조군으로 사용하였으며 음성 대조군인 비처리군은 증류수를 사용하였다. 그 후, 상기 완충액으로 조제한 0.4514㎎/mL N-SUCCINYL-ALA-ALA-ALA-p-NITROANILIDE 100μL를 첨가하고, 25℃에서 15분 반응시켰다. 반응종료 후, 파장 415㎚에 있어서의 흡광도를 측정하였다. 동일한 방법으로 공시험을 행하여 보정하였다.
엘라스타아제 활성 저해작용의 계산방법은 하기 수학식 2과 같으며, 결과는 하기 표 10에 나타내었다.
Figure PCTKR2017010378-appb-M000002
A: 시험물질 무첨가, 효소 첨가에서의 파장 415㎚에 있어서의 흡광도
B: 시험물질 무첨가, 효소 무첨가에서의 파장 415㎚에 있어서의 흡광도
C: 시험물질 첨가, 효소 첨가에서의 파장 415㎚에 있어서의 흡광도
D: 시험물질 첨가, 효소 무첨가에서의 파장 415㎚에 있어서의 흡광도
화합물 억제정도(%)
비처리군 0
EGCG 65
비교예1 70
비교예3 66
실시예1 67
실시예2 69
상기 표 10에 나타낸 바와 같이, 극차광 재배 녹차 추출물의 엘라스타아제 활성 억제 정도가 엘라스타아제 활성 억제제로 알려져 있는 EGCG와 비슷한 수준으로 나타나 발명의 극차광 재배 녹차 추출물의 엘라스타아제 활성 억제 효과가 우수함을 확인할 수 있다.
[시험예 7] 장벽 기능 강화 유전자 발현 확인
본 발명에 따른 극차광 재배 녹차 추출물이 피부 장벽 기능 강화와 관련된 것으로 공지되어 있는 카스파제-14 유전자 발현에 미치는 영향을 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
각질형성세포를 KGM-gold(Lonza, #00192151) 배지를 이용하여 성장시킨 후에, 6웰 플레이트에 25000개의 세포를 씨딩하였다. 그 다음날, 실시예 1~2와 비교예 1 및 3 각각의 추출물을 배지에 각각 1000배 희석시킨 후, 세포에 처리하고, 1일간 배양한 후에 세포를 수거하였다. 트리솔을 이용하여 RNA를 추출하기 위하여, 튜브에 수거한 세포(약 1 X 105개)를 넣은 다음, 여기에 트리솔 500μl씩을 넣고 세포를 상온에서 5분간 균질화시켰다. 각각의 튜브에 클로로포름을 100μl씩 넣고 손으로 15초간 흔들어 섞어준 후, 상온에서 3분간 방치한 다음, 4℃ ,15000 x g에서 15분간 원심분리를 하였다. 상층액만 새 튜브로 옮긴 후에, 이소프로필 알코올을 250μl씩 넣고 잘 섞어준 다음, 상온에서 10분간 방치한 후, 4℃ ,15000 x g에서 10분간 원심분리를 하였다. 펠렛만 남기고 상층액은 모두 버린 후에 75% 알코올을 500μl씩 넣고 볼텍싱(vortexing)한 다음, 4℃ ,7500 x g에서 5분간 원심분리를 하였다. 펠렛만 남기고 상층액을 조심히 버린 후에, 펠렛을 잘 말린 후 탈이온수를 넣어 RNA를 녹인 후에 260nm에서 정량을 하였다. 총 RNA를 이용하여 cDNA를 합성하기 위해, 총 RNA 4μg에 올리고 dT 2μl을 넣고 70℃에서 10분 반응한 후에 재빨리 식혔다. DTT, dNTP, 10x RT 완충액, MgCl2, RNAase Out를 넣고 42℃에서 2분 후, Superscript III RT를 넣고 50℃에서 60분 반응시켰다. 합성된 cDNA혼합액35μl에 탈이온수 165μl을 넣어 총 200μl로 희석하였다. qPCR을 진행하기 위해, cDNA혼합액 5μl + 탈이온수 4μl + Taqman 프라이머(대조군 유전자; RPLP0, 실험군 유전자; loricrin, involucrin) 각 1μl + Taqman 2X Universal PCR Master Mix(ABI제품, #4304437) 10μl를 섞어 총 20μl를 각각의 PCR 튜브에 각각 넣고 실시간 PCR장비(ABI제품, 모델명: 7500fast)에 로딩하였다. 리액션 셋업은 다음과 같다: 1. 홀딩단계: 95℃(10분), 2. 싸이클링단계: 95℃(15초)+ 60℃(60초), 총 40싸이클 반복하였다. 이 때 사용된 Taqman 프라이머는 리포터역할 형광분자 FAM, 퀜처 NFQ-MGB 로 구성된 상용 프라이머를 이용하였다.
결과는 표 11에 나타내었다.
caspase14 대조군 비교예1(ppm) 비교예3(ppm) 실시예1(ppm) 실시예2(ppm)
6 12 25 6 12 25 6 12 25 6 12 25
평균(AVR) 1.00 1.80 2.26 2.86 2.02 2.54 2.98 2.20 2.95 3.36 2.31 3.07 3.74
표준편차(STD) 0.04 0.05 0.19 0.17 0.23 0.28 0.10 0.11 0.05 0.04 0.08 0.19 0.11
표 11을 보면, 녹차 추출물을 처리하면 카스파제-14유전자에서 모두 발현량이 증가하는 것을 확인할 수 있으며, 특히 극차광 재배 녹차 추출물을 처리한 경우 일반 녹차 추출물보다 우수한 효능을 보임을 알 수 있다.
[시험예 8] 피부 손상 억제 또는 피부 보호 유전자 발현 확인
본 발명에 따른 극차광 재배 녹차 추출물이 피부 손상 억제 또는 피부 보호와 관련된 것으로 공지되어 있는 히스티다제 유전자 발현에 미치는 영향을 다음과 같은 방법으로 확인하였다.
각질형성세포를 KGM-gold(Lonza, #00192151) 배지를 이용하여 성장시킨 후에, 6웰 플레이트에 25000개의 세포를 씨딩하였다. 그 다음날, 실시예 1~2와 비교예 1 및 3 각각의 추출물을 배지에 각각 1000배 희석시킨 후, 세포에 처리하고, 1일간 배양한 후에 세포를 수거하였다. 트리솔을 이용하여 RNA를 추출하기 위하여, 튜브에 수거한 세포(약 1 X 105개)를 넣은 다음, 여기에 트리솔 500μl씩을 넣고 세포를 상온에서 5분간 균질화시켰다. 각각의 튜브에 클로로포름을 100μl씩 넣고 손으로 15초간 흔들어 섞어준 후, 상온에서 3분간 방치한 다음, 4℃ ,15000 x g에서 15분간 원심분리를 하였다. 상층액만 새 튜브로 옮긴 후에, 이소프로필 알코올을 250μl씩 넣고 잘 섞어준 다음, 상온에서 10분간 방치한 후, 4℃ ,15000 x g에서 10분간 원심분리를 하였다. 펠렛만 남기고 상층액은 모두 버린 후에 75% 알코올을 500μl씩 넣고 볼텍싱(vortexing)한 다음, 4℃ ,7500 x g에서 5분간 원심분리를 하였다. 펠렛만 남기고 상층액을 조심히 버린 후에, 펠렛을 잘 말린 후 탈이온수를 넣어 RNA를 녹인 후에 260nm에서 정량을 하였다. 총 RNA를 이용하여 cDNA를 합성하기 위해, 총 RNA 4μg에 올리고 dT 2μl을 넣고 70℃에서 10분 반응한 후에 재빨리 식혔다. DTT, dNTP, 10x RT 완충액, MgCl2, RNAase Out를 넣고 42℃에서 2분 후, Superscript III RT를 넣고 50℃에서 60분 반응시켰다. 합성된 cDNA혼합액35μl에 탈이온수 165μl를 넣어 총 200μl로 희석하였다. qPCR을 진행하기 위해, cDNA혼합액 5μl + 탈이온수 4μl + Taqman 프라이머(대조군 유전자; RPLP0, 실험군 유전자; loricrin, involucrin) 각 1μl + Taqman 2X Universal PCR Master Mix(ABI제품, #4304437) 10μl를 섞어 총 20μl를 각각의 PCR 튜브에 각각 넣고 실시간 PCR장비(ABI제품, 모델명: 7500fast)에 로딩하였다. 리액션 셋업은 다음과 같다: 1. 홀딩단계: 95℃(10분), 2. 싸이클링단계: 95℃(15초)+ 60℃(60초), 총 40싸이클 반복하였다. 이 때 사용된 Taqman 프라이머는 리포터역할 형광분자 FAM, 퀜처 NFQ-MGB 로 구성된 상용 프라이머를 이용하였다. 결과는 표 12에 나타내었다.
histidase 대조군 비교예1(ppm) 비교예3(ppm) 실시예1(ppm) 실시예2(ppm)
6 12 25 6 12 25 6 12 25 6 12 25
평균(AVR) 1.00 0.79 0.95 1.12 0.80 1.03 1.26 0.88 1.13 1.57 0.91 1.23 1.75
표준편차(STD) 0.04 0.09 0.08 0.08 0.02 0.12 0.03 0.11 0.14 0.03 0.05 0.06 0.10
표 12를 보면, 녹차 추출물을 처리하면 히스티다제 유전자에서 모두 발현량이 증가하는 것을 확인할 수 있으며, 특히 극차광 재배 녹차 추출물을 처리한 경우 일반 녹차 추출물보다 우수한 효능을 보임을 알 수 있다.

Claims (15)

  1. 차광률이 90% 이상인 극차광 재배 방법으로 재배한 녹차의 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 보습용 피부 외용제 조성물.
  2. 차광률이 90% 이상인 극차광 재배 방법으로 재배한 녹차의 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 항노화용 피부 외용제 조성물.
  3. 차광률이 90% 이상인 극차광 재배 방법으로 재배한 녹차의 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 주름 개선용 피부 외용제 조성물.
  4. 차광률이 90% 이상인 극차광 재배 방법으로 재배한 녹차의 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 탄력 개선용 피부 외용제 조성물.
  5. 차광률이 90% 이상인 극차광 재배 방법으로 재배한 녹차의 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 장벽 기능 강화용 피부 외용제 조성물.
  6. 차광률이 90% 이상인 극차광 재배 방법으로 재배한 녹차의 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 손상 억제 또는 피부 보호용 피부 외용제 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유효성분의 함량은 조성물 총 중량에 대하여 0.0001~40중량%임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 추출물은 추출용매로서 물을 사용하여 저속저온추출된 것임을 특징으로 하는 피부 외용제 조성물.
  9. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 영양크림, 마사지크림, 에센스, 아이크림, 아이에센스, 클렌징크림, 클렌징폼, 클렌징워터, 팩, 파우더, 바디로션, 바디크림, 바디오일 및 바디에센스로 이루어진 군으로부터 선택되는 제형을 가지는 것임을 특징으로 하는 피부 외용제 화장료 조성물.
  10. 피부 외용제 조성물의 제조에 있어서, 차광률이 90% 이상인 극차광 재배 방법으로 재배한 녹차의 추출물의 피부 보습제로서의 용도.
  11. 피부 외용제 조성물의 제조에 있어서, 차광률이 90% 이상인 극차광 재배 방법으로 재배한 녹차의 추출물의 피부 항노화제로서의 용도.
  12. 피부 외용제 조성물의 제조에 있어서, 차광률이 90% 이상인 극차광 재배 방법으로 재배한 녹차의 추출물의 피부 주름 개선제로서의 용도.
  13. 피부 외용제 조성물의 제조에 있어서, 차광률이 90% 이상인 극차광 재배 방법으로 재배한 녹차의 추출물의 피부 탄력 개선제로서의 용도.
  14. 피부 외용제 조성물의 제조에 있어서, 차광률이 90% 이상인 극차광 재배 방법으로 재배한 녹차의 추출물의 피부 장벽 기능 강화제로서의 용도.
  15. 피부 외용제 조성물의 제조에 있어서, 차광률이 90% 이상인 극차광 재배 방법으로 재배한 녹차의 추출물의 피부 손상 억제 또는 피부 보호제로서의 용도.
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