TWI784971B - 含有極度遮光栽培的綠茶的萃取物的皮膚外用劑組合物及用途 - Google Patents

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Abstract

本發明涉及一種含有綠茶萃取物的皮膚外用劑組合物，所述綠茶是藉由與現有綠茶的遮光栽培方法有差別的極度遮光栽培方法生產的，更詳細而言，涉及一種含有極度遮光栽培的綠茶的萃取物而能夠獲得更加優異的皮膚保濕、皮膚保護、抗老化等效果的皮膚外用劑組合物，所述極度遮光栽培的綠茶是藉由遮光率為99%以上的遮光栽培來進行栽培，從而使得氨基酸含量得到顯著增加。

Description

含有極度遮光栽培的綠茶的萃取物的皮膚外用劑組合物及用 途
本發明涉及一種含有綠茶萃取物的皮膚外用劑組合物，所述綠茶是藉由與現有綠茶的遮光栽培方法有差別的極度遮光栽培方法生產的，更詳細而言，涉及一種含有極度遮光栽培的綠茶的萃取物而能夠獲得更加優異的皮膚保濕、皮膚保護、抗老化等效果的皮膚外用劑組合物，所述極度遮光栽培的綠茶是藉由遮光率為90%以上的遮光栽培來進行栽培，從而使得氨基酸含量得到顯著增加。
所謂遮光栽培是指在茶苗的生長發育過程中進行一定期間的遮光處理(遮光率：50~70%左右)來進行培育的栽培方法。進行遮光栽培時，能夠延遲茶葉的硬化，使綠色加深，減少兒茶素的含量，提高氨基酸及茶胺酸的含量，因此，一直以來選擇使用遮光栽培方法，以用於減少綠茶的澀味，從而製備柔和且呈更深的綠色的綠茶，即，提高美觀性、味道等，從而提升作為食品的效用。
另一方面，極度遮光栽培方法是在遮光栽培方法中將遮光率設為90%以上、較佳為95%以上、更佳為99%以上的栽培方法，如果採用極度遮光栽培方法來栽培綠茶，則會顯著降低綠茶的生產量，因此在生產性方面和成本方面不優良，並且反而會引起綠茶葉的白化現象，從而不僅存在視覺上的品質劣化現象，而且還有兒茶素的含量減少的傾向，因此在現有食品中的使用方面，採用極度遮光栽培方法栽培的綠茶的效用價值顯著降低。
另外，一直以來，以源自兒茶素的抗氧化和抗炎功效為中心來開發了現有的含有綠茶的皮膚外用劑組合物，在綠茶成分中兒茶素佔有很大的量。但是，在綠茶中，除了兒茶素之外，還含有能夠顯示出各種皮膚功效的多種氨基酸，如上所述可以藉由遮光栽培來增加其含量。
但是，採用遮光率相當於50~70%的現有的遮光栽培方法時，在增加氨基酸的含量方面是有限的，此外，大部分藉由遮光栽培方法進行栽培的綠茶的用途僅為食品用途，對於作為皮膚外用劑來開發的研究非常少。
另外，現有技術中採用的萃取法中包含一部分有機溶劑，因此在極大化氨基酸含量方面存在困難，因此，還需要能夠極大地萃取出氨基酸的萃取法。
本發明人發現在採用極度遮光栽培方法來栽培的綠茶中，氨基酸的含量得到顯著增加，並且發現使用極度遮光栽培的綠茶的萃取物作為皮膚外用劑組合物的有效成分時，與現有的含有無遮光栽培的綠茶或遮光栽培的綠茶 的萃取物的情況相比，在皮膚保濕、皮膚保護、抗老化等方面能夠提供更加優異的效果，從而完成了本發明。
因此，本發明的目的在於提供一種用於皮膚保濕、抗老化、保護皮膚屏障的皮膚外用劑組合物，其含有藉由極度遮光栽培方法來栽培的綠茶的萃取物。
為了實現上述目的，本發明提供一種用於皮膚保濕、抗老化或保護皮膚屏障的皮膚外用劑組合物，其含有以90%以上的遮光率來栽培的綠茶的萃取物。
此外，本發明提供在皮膚外用劑組合物的製備中，綠茶的萃取物作為皮膚保濕劑、皮膚抗老化劑、皮膚皺紋改善劑、皮膚彈性改善劑、皮膚屏障功能強化劑、或者抑制皮膚損傷或皮膚保護劑的用途，所述綠茶是藉由遮光率為90%以上的極度遮光栽培方法進行栽培的。
本發明的方法中，含有藉由遮光率為90%以上的極度遮光栽培方法來進行栽培而使氨基酸的含量得到顯著增加的綠茶的萃取物，因此與現有的含有綠茶萃取物的組合物相比，能夠提供更加優異的皮膚保濕力的增加、抗老化或皮膚屏障保護效果。
第1圖示出了遮光栽培時基於遮光率的茶葉的顏色。
第2圖示出了以99%的遮光率進行極度遮光栽培25天的茶葉。
第3圖為示出基於遮光率及遮光時間的綠茶萃取物中的氨基酸含量變化的圖表。
第4圖為示出基於遮光率及遮光時間的綠茶萃取物中的兒茶素含量變化的圖表。
較佳實施方式
本發明涉及一種含有綠茶的萃取物作為有效成分的皮膚外用劑組合物，所述綠茶是藉由極度遮光栽培方法進行栽培的。
本發明中使用的術語“極度遮光栽培方法”是指在遮光栽培方法中將遮光率設為90%以上、較佳為95%以上、更佳為98%以上、又更佳為99%以上、再更佳為99.9%以上的植物的栽培方法。
本發明的綠茶(茶樹；Camellia sinensis L.)的極度遮光栽培方法是指在10天以上的期間，較佳地在10天至25天的期間，更佳地在15天至21天的期間，將遮光率設為90%以上，較佳為95%以上，更佳為98%以上，又更佳為99%，再更佳為99.9%以上來栽培茶樹的方法。此外，本發明的極度遮光栽培方法並不限定於此，但是較佳地在茶樹的一芽一葉期至一芽四葉期進行遮光處理，更佳地在一芽一葉期至一芽三葉期，又更佳地在一芽一葉期進行遮光處理。
藉由利用本發明的極度遮光栽培方法，能夠顯著增加綠茶中的總氨基酸含量。
本發明中使用的極度遮光栽培綠茶的萃取物是採用以下方法獲得的：將藉由極度遮光栽培方法進行栽培的綠茶的葉子或綠茶葉的粉末，利用水或低級醇作為萃取溶劑，較佳為利用水或乙醇來獲得。
就萃取物而言，可以直接以從綠茶葉中萃取的狀態來使用，也可以以藉由萃取獲得的物質經過乾燥、粉末化工序而製備的粉末狀態來使用。
此外，考慮到在化妝品組合物中使用的情況下，較佳地使用水作為萃取溶劑。尤其，使用水作為萃取溶劑時，與使用其他萃取溶劑相比，會增加氨基酸的溶出率。此外，在浸出或熱水萃取的情況下，除氨基酸之外的其它成分的萃取程度也會增加，因此，從氨基酸的選擇性溶出方面考慮，低溫低速的水萃取(例如，使用冰滴咖啡(dutch coffee)製備器具)的方法更為較佳的方法。
在本發明中，極度遮光栽培綠茶的萃取物的含量不受特別限制，相對於組合物的總重量，可以較佳地包含0.0001~40重量%，更佳地包含0.01~30重量%，又更佳地包含0.1~20重量%。如果含量小於0.0001重量%，則難以期待作為有效成分的作用，如果含量超過40重量%，則劑型的穩定性會變差，因此不為較佳的含量。
本發明的組合物藉由促進角質形成細胞的分化或促進轉穀氨醯胺酶的表達等來維持皮膚水分，並增強保水能力，從而提供皮膚保濕效果。
本發明的組合物藉由抑制氧化或紫外線引起的皮膚損傷、促進膠原蛋白的生成或阻礙基質金屬蛋白酶1(MMP-1)的生物合成，從而改善皮膚皺紋，並增強皮膚彈性，由此提供抑制皮膚老化的效果。
本發明的組合物抑制皮膚損傷，從而提供保護皮膚的效果。其中，皮膚包括頭皮或毛髮。即，本發明的組合物抑制頭皮或毛髮的損傷，從而還提供保護毛髮的效果。
本發明的組合物抑制氧化或紫外線引起的皮膚損傷，從而提供保護皮膚的效果。其中，皮膚包括頭皮或毛髮。即，本發明的組合物藉由抑制氧化或紫外線引起的頭皮或毛髮的損傷，從而提供保護頭皮或毛髮的效果。
此外，本發明提供在皮膚外用劑組合物的製備中，綠茶的萃取物作為皮膚保濕劑、皮膚抗老化劑、皮膚皺紋改善劑、皮膚彈性改善劑、皮膚屏障功能強化劑、或者抑制皮膚損傷或皮膚保護劑的用途，所述綠茶是藉由遮光率為90%以上的極度遮光栽培方法進行栽培的。
本發明的皮膚外用劑組合物可以劑型化為化妝品組合物或藥學組合物。
本發明的化妝品組合物可以含有化妝品學或皮膚科學上可接受的介質或基劑。其作為適合用於局部的所有劑型，可以提供為以下形態，例如，溶液、凝膠、固體、無水糊狀物、水相中分散油相而獲得的乳狀液、懸浮液、微乳狀液、微膠囊、微顆粒或離子型(脂質體)及非離子型的囊泡分散劑的形態，或者是霜、化妝水、乳液、粉、軟膏、噴霧或遮瑕棒的形態。可以採用本領域中通常使用的方法來製備這些組合物。本發明的組合物還可以以泡沫(foam)的形態或進一步含有壓縮的推進劑的氣霧劑組合物的形態來使用。
本發明的化妝品組合物可以含有脂肪物質、有機溶劑、增溶劑、濃縮劑、凝膠化劑、軟化劑、抗氧化劑、懸浮劑、穩定劑、發泡劑(foaming agent)、芳香劑、表面活性劑、水、離子型或非離子型乳化劑、填充劑、金屬離子屏蔽劑、螯合劑、保存劑、維生素、阻斷劑、潤濕劑、精油、染料、顏料、親水性或親油性活性劑、脂質囊泡或化妝品中通常使用的任意的其它成分等化妝品學或皮膚科學領域中通常使用的助劑。所述助劑以化妝品學或皮膚科學領域中通常使用的量來引入。
本發明的皮膚外用劑組合物的劑型沒有特別的限定，例如，可以劑型化為柔膚化妝水、收斂化妝水、營養化妝水、營養霜、按摩霜、精華液、眼霜、眼部精華液、潔膚霜、潔膚泡沫、潔膚水、面膜、粉、身體乳液、身體霜、身體油及身體精華液等化妝品。
本發明的皮膚外用劑組合物可以是藥學組合物。所述藥學組合物可以進一步含有防腐劑、穩定劑、水分散性粉劑(water-dispersible powder)或乳化促進劑、用於調節滲透壓的鹽及/或緩衝劑等藥學助劑，以及其它在治療上有效的物質。所述藥學組合物可以劑型化為乳液、霜、軟膏或凝膠等。
所述藥學組合物較佳地進行經皮施用。
作為所述藥學組合物的有效成分的極度遮光栽培綠茶的萃取物的施用量會根據接受治療的對象的年齡、性別、體重和需要治療的特定疾病或病理狀態、疾病或病理狀態的嚴重程度、施用途徑及處方者的判斷有所不同。
基於這種因素的施用量的決定是在所屬技術領域中具有通常知識者的水平範圍內。通常，施用量為0.0001mg/kg/日至約2000g/kg/日範圍。
具體實施方式
下面，藉由實施例及試驗例進一步具體說明本發明的構成及效果。但是，這些實施例及試驗例僅僅是以例示的目的提供，以有助於對本發明的理解，本發明的範疇及範圍並不受限於下述實施例及試驗例。
[實施例1]極度遮光栽培(遮光率為99%)綠茶的70%乙醇萃取物的製備
將經過遮光率為99%的極度遮光處理來栽培的綠茶(Camellia sinensis L.)(遮光時間為1天(表示開始日，以下相同)、5天、10天、15天、20天、25天)用精製水清洗後進行乾燥，然後進行粉末化，從而獲得極度遮光綠茶粉末，將100g的所述極度遮光綠茶粉末加入到1L的70%的乙醇水溶液中進行攪拌，同時進行萃取12小時，然後用沃特曼2號濾紙進行過濾。對這樣獲得的萃取液，利用帶有用於冷卻的冷凝器的蒸餾裝置以50℃進行減壓濃縮並進行乾燥，從而獲得極度遮光栽培(遮光率為99%)綠茶的70%乙醇萃取物(乾燥重量為30.85g)。
[實施例2]極度遮光栽培(遮光率為99%)綠茶的低速低溫水萃取物的製備
將經過遮光率為99%的極度遮光處理來栽培的綠茶(遮光時間為1天、5天、10天、15天、20天、25天)用精製水清洗後進行乾燥，然後進行粉末化，從而獲得極度遮光綠茶粉末。在下端部有排出口的圓筒形玻璃桶中鋪上沃特曼2號濾紙，並在其上面加入100g的極度遮光綠茶粉末，然後在粉末的上端部放置濾紙，使得滴落的水珠均勻地潤濕表面。在圓筒形玻璃桶的上面設置安裝有可調節速度的閥的水桶，並在水桶中混合放入精製水和精製水冰塊，使其維持在4℃以下。使得從水桶中以每小時約100ml的速度滴落水珠至圓筒形玻璃桶中的過程持續10小時(共使用1000ml來進行萃取)。收集從圓筒形玻璃桶下端部排出的極度遮光綠茶萃取物，並利用帶有用於冷卻的冷凝器的蒸餾裝置以50℃進行減壓濃縮並進行冷凍乾燥，從而獲得極度遮光栽培(遮光率為99%)綠茶的低速低溫水萃取物(乾燥重量為26.21g)。
[實施例3]極度遮光栽培(遮光率為90%)綠茶的低速低溫水萃取物的製備
除了使用以90%的遮光率來栽培的綠茶之外，採用與上述實施例2相同的方法獲得了極度遮光栽培(遮光率為90%)綠茶的低速低溫水萃取物(乾燥重量為27.61g)。
[實施例4]極度遮光栽培(遮光率為95%)綠茶的低速低溫水萃取物的製備
除了使用以95%的遮光率來栽培的綠茶之外，採用與上述實施例2相同的方法獲得了極度遮光栽培(遮光率為95%)綠茶的低速低溫水萃取物(乾燥重量為25.43g)。
[實施例5]極度遮光栽培(遮光率為99%)綠茶的低溫浸出水萃取物的製備
將經過遮光率為99%的極度遮光處理來栽培的綠茶(遮光時間為1天、5天、10天、15天、20天、25天)用精製水清洗後進行乾燥，然後進行粉末化，從而獲得極度遮光綠茶粉末，將100g的所述極度遮光綠茶粉末加入到1L的冷水中進行攪拌，同時進行萃取12小時，然後用沃特曼2號濾紙進行過濾，其中所述冷水是藉由混合精製水和精製水冰塊來製備的4℃以下的冷水。對這樣獲得的萃取液，利用帶有用於冷卻的冷凝器的蒸餾裝置以50℃進行減壓濃縮並進行乾燥，從而獲得極度遮光栽培(遮光率為99%)綠茶的低溫浸出水萃取物(乾燥重量為23.25g)。
[比較例1]無遮光處理綠茶的70%乙醇萃取物的製備
將沒有經過遮光處理來栽培的普通綠茶用精製水清洗後進行乾燥，然後進行粉末化，從而獲得無遮光處理綠茶粉末，將100g的所述無遮光處理綠茶粉末加入到1L的70%的乙醇水溶液中進行攪拌，同時進行萃取12小時，然後用沃特曼2號濾紙進行過濾。對這樣獲得的萃取液，利用帶有用於冷卻的冷凝器的蒸餾裝置以50℃進行減壓濃縮並進行乾燥，從而獲得無遮光處理綠茶的70%乙醇萃取物(乾燥重量為33.47g)。
[比較例2]無遮光處理綠茶的低溫低速水萃取物的製備
除了使用沒有經過遮光處理來栽培的普通綠茶之外，採用與上述實施例2相同的方法獲得了無遮光處理綠茶的低速低溫水萃取物(乾燥重量為24.66g)。
[比較例3]普通遮光栽培綠茶的70%乙醇萃取物的製備
將經過普通的遮光處理(遮光率為70%)來栽培的普通遮光栽培綠茶用精製水清洗後進行乾燥，然後進行粉末化，從而獲得普通遮光綠茶粉末， 將100g的所述普通遮光綠茶粉末加入到1L的70%的乙醇水溶液中進行攪拌，同時進行萃取12小時，然後用沃特曼2號濾紙進行過濾。對這樣獲得的萃取液，利用帶有用於冷卻的冷凝器的蒸餾裝置以50℃進行減壓濃縮並進行乾燥，從而獲得普通遮光栽培綠茶的70%乙醇萃取物(乾燥重量為31.06g)。
[比較例4]普通遮光栽培綠茶的低溫低速水萃取物的製備
除了使用經過普通的遮光處理(遮光率為70%)來栽培的綠茶之外，採用與上述實施例2相同的方法獲得了普通遮光栽培綠茶的低速低溫水萃取物(乾燥重量為29.87g)。
[試驗例1]萃取物中的總氨基酸及兒茶素含量的分析(基於遮光率及遮光時間的差異)
對上述實施例2至實施例4及比較例2及比較例4中製備的綠茶萃取物(基於遮光率的處理條件參見下述表1)中的總氨基酸含量及兒茶素含量進行分析。
Figure 106133771-A0305-02-0011-1
1.總氨基酸含量的分析
就氨基酸含量而言，藉由對22種游離氨基酸同時進行分析，並分別進行定量，將其總和作為氨基酸含量。將上述萃取物溶解於精製水中，從而製備成10,000ppm的溶液，然後取20μL後加入70μL的AccQ-Tag緩衝液和20μL的AccQ-Tag衍生試劑進行混合，從而製備試驗液(AccQ-Tag緩衝液及衍生試劑、 用於UPLC分析的溶劑購自沃特世(Waters)公司並使用)。對於22種氨基酸的混合液，根據萃取物中的各個氨基酸的含量來適當地調節濃度，從而進行與試驗液相同的衍生化反應。使用UPLC(Waters公司)系統對試驗液和氨基酸標準溶液進行成分分析(PDA檢測器，260nm)，使用Waters AccQ-Tag Ultra Column 100-2.1mm(1.7μm)作為固定相。流動相是以下述組成比使用了AccQ-Tag Ultra Eluent A和AccQ-Tag Ultra Eluent B，所述組成比為：0~0.54分鐘，99.9%的A；7.74~8.5分鐘，82.5%的A；8.5~8.7分鐘，40.4%的A；8.7~10分鐘，99.9%的A。其結果，觀察到各個氨基酸的峰，使用校準曲線法，根據相應的各個峰，對各個氨基酸的含量進行定量，並將檢測出的所有氨基酸的總和作為萃取物中的總氨基酸含量。測量結果示於下述表2及第1圖中。
Figure 106133771-A0305-02-0012-2
從上述表2可以確認，藉由普通遮光栽培方法進行栽培的綠茶(比較例4)與未經過遮光處理來栽培的綠茶(比較例2)相比，雖然氨基酸的含量有所增加，但隨著遮光時間變長，氨基酸的含量顯示出大幅減少的傾向。
在無遮光處理綠茶的情況下，茶葉在生長的同時，生長初期的總氨基酸含量為2.6%，經過5天後為2.8%，顯示為略微增加，但之後總氨基酸含量顯示出持續減少的傾向。
在普通遮光栽培方法(遮光率為70%)的情況下，在進行遮光的第10天時，總氨基酸含量顯示為3.2%，由此總氨基酸含量得到增加，但之後總氨基酸含量顯示出持續減少的傾向。此外，如第1圖所示，可以知道在遮光率為70%時，綠色最深。
在遮光率為90%的極度遮光栽培方法的情況下，在遮光時間經過15天時，總氨基酸含量達到最高，此時，與無遮光處理的情況相比，總氨基酸含量增加了6倍以上。
尤其，在遮光率為95%以上的極度遮光栽培方法的情況下，總氨基酸含量在所有的栽培區間持續增加。
具體地，可以確認遮光時間經過25天時，無遮光栽培方法情況下的總氨基酸含量為0.5%，普通遮光栽培方法情況下的總氨基酸含量僅為1.6%，但遮光率為99%的極度遮光方法情況下的總氨基酸含量為7.1%，含量至少增加了4.5倍(與普通遮光栽培方法相比)乃至14.2倍(與無遮光處理相比)。
因此，可以確認藉由遮光率為90%以上的極度遮光栽培方法進行栽培的綠茶與藉由無遮光處理栽培或普通遮光栽培方法進行栽培的綠茶相比，氨基酸含量大幅增加，當遮光率為95%以上時，遮光時間越長，氨基酸的含量反而急劇增加。
2.兒茶素含量的分析
就兒茶素含量而言，藉由對8種兒茶素(沒食子兒茶素(gallocatechin)、表沒食子兒茶素(epigallocatechin)、兒茶素、表兒茶素(epicatechin)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(gallocatechin gallate)、表兒茶素沒食子酸酯(epicatechin gallate)、兒茶素沒食子酸酯(catechin gallate))同時進行分析，並分別進行定 量，將其總和作為兒茶素含量。將上述萃取物溶解於50%的甲醇中，從而製備成1,000ppm的溶液，然後利用HPLC(Waters公司，2695型號(model))進行成分分析(Waters公司，2996 PDA檢測器)。使用關東化學株式會社(Kanto Chemical)的Mightysil RP-18 GP 250-4.6mm(5μm)色譜柱作為固定相，流動相使用下述表3中記載的組成比。對8種兒茶素的混合液，根據萃取物中的各個兒茶素的含量來適當地調節濃度，並採用與試驗液相同的方法進行。
Figure 106133771-A0305-02-0014-3
其結果，觀察到各個兒茶素的峰，使用校準曲線法，根據相應的各個峰，對各個兒茶素的含量進行定量，並將檢測出的所有兒茶素的總和作為萃取物中的總兒茶素含量。測量結果示於下述表4中。
Figure 106133771-A0305-02-0014-4
從上述表4可以確認，藉由極度遮光栽培方法進行栽培的綠茶中，隨著遮光率變高、遮光時間變長，兒茶素的含量會顯示出稍微減少的傾向，但其減少程度不大，幾乎在相同的水平範圍內。
3.基於遮光率的茶葉顏色的比較
藉由改變遮光率來進行栽培的綠茶的茶葉示於第1圖及第2圖中。
如第1圖所示，可以知道藉由遮光率為70%的普通遮光栽培方法進行栽培的綠茶顯示的綠色最深。
此外，以99%的遮光率進行極度遮光栽培的情況下，可以確認茶葉由綠色變成明顯的白色。
[試驗例2]最佳遮光處理時期的決定
在進行普通遮光栽培時，通常在茶苗生長的時期中的一芽二葉期至三葉期進行對茶樹的遮光處理。
根據遮光率，包括氨基酸在內的有效成分的含量被極大化，並且茶葉的顏色變成白色，基於上述先前的實驗結果進行了以下評價，以用於決定最佳遮光處理時期。
在茶苗生長的各個時期(一芽一葉期、一芽二葉期、一芽三葉期、一芽四葉期、一芽五葉期)進行了99%的遮光處理，並對基於處理時間的總氨基酸含量進行了分析。結果示於下述表5中。
Figure 106133771-A0305-02-0015-5
Figure 106133771-A0305-02-0016-6
從上述表5可以知道，在一芽一葉期的21天處理區間的總氨基酸含量為12.1%，與其它遮光處理時期相比顯示出顯著高的含量，此外，在所有處理時間中，與其它處理時期相比，一芽一葉期的總氨基酸含量高。
在一芽一葉期中，遮光處理時間至21天時，總氨基酸含量持續增加，之後其含量急劇減少。這種現象在其它遮光處理時期也存在各自的差異，但顯示出氨基酸含量在一定時間內上升後又急劇減少的狀態。
從這樣的結果可以知道，對於藉由極度遮光栽培來生產新型高功能性茶葉和顏色有差別的茶葉的栽培來說，最佳條件為：遮光率為99%，遮光處理時期為一芽一葉期至一芽三葉期，遮光處理時間為21天左右。
[試驗例3]萃取物中的總氨基酸含量的分析(基於遮光栽培及萃取溶劑的差異)
除了使用上述實施例1、2及5(遮光時間分別為21天)及比較例1(生長21天)至比較例4(遮光時間為21天)之外，採用與上述試驗例1相同的方法來分析了綠茶萃取物中的總氨基酸的含量。分析結果示於下述表6中。
Figure 106133771-A0305-02-0016-7
Figure 106133771-A0305-02-0017-8
從上述表6可以知道，相比於普通遮光栽培綠茶的萃取物，極度遮光栽培綠茶的萃取物的總氨基酸含量顯著增加，尤其是使用水作為萃取溶劑進行低速低溫萃取的情況下，氨基酸的萃取量進一步增加。
[試驗例4]保濕基因表達的確認
採用以下方法確認了本發明的極度遮光栽培綠茶的萃取物對與皮膚保濕力相關的2種公知的基因，即對兜甲蛋白和外皮蛋白的表達所產生的影響。
利用KGM-gold(龍沙(Lonza)公司，#00192151)培養基使角質形成細胞生長，然後在6孔板中接種25000個細胞。次日，分別將實施例1~2和比較例1及3的萃取物在培養基中分別稀釋1000倍，然後對細胞進行處理，培養1天後收集細胞。為了使用Trizol來萃取RNA，在試管中加入收集的細胞(約為1×105個)，然後在其中分別加入500μl的Trizol，並在常溫下對細胞進行5分鐘的均質化。在各個試管中分別加入100μl的氯仿，並用手搖晃15秒使其混合後在常溫下放置3分鐘，然後在4℃、15000×g下進行離心分離15分鐘。僅將上清液移到新的試管中，然後分別加入250μl的異丙醇使其混合均勻後在常溫下放置10分鐘，然後在4℃、15000×g下進行離心分離10分鐘。僅保留團塊(pellet)，將上清液全部去除，然後分別加入500μl的75%的乙醇並進行渦流處理(vortexing)，然後在4℃、7500×g下進行離心分離5分鐘。僅保留團塊，小心去除上清液後，將團塊充分進行乾燥，然後加入去離子水使RNA溶解，之後在260nm下進行定量。為了利用總RNA來合成cDNA，在4μg的總RNA中加入2μl的Oligo dT，並在70℃下進行反應10分鐘，然後迅速冷卻。加入DTT、dNTP、10×RT緩衝液、MgCl2及重組核糖核酸酶抑制劑(RNAase Out)並在42℃下經過2分鐘後加入Superscript III RT，在50℃下進行反應60分鐘。在合成的35μl的cDNA混合液中加入165μl的去離子水 稀釋至共200μl。為了進行qPCR，混合5μl的cDNA混合液+4μl的去離子水+各1μl的Taqman引子(對照組基因為RPLP0，實驗組基因為兜甲蛋白(loricrin)、外皮蛋白(involucrin))+10μl的Taqman 2X Universal PCR Master Mix(ABI公司產品，#4304437)，將共20μl分別加入到各個PCR試管中，並裝載於實時PCR裝置(ABI公司產品，型號名稱：7500fast)。反應設置(reaction set up)如下：1.保持(Holding)步驟：95℃(10分鐘)，2.循環(Cycling)步驟：95℃(15秒)+60℃(60秒)，共重複40個循環。此時，所使用的Taqman引子是利用了由起報告作用的螢光分子FAM、淬滅基團(quencher)NFQ-MGB構成的常規引子。
結果示於表7及表8中。
Figure 106133771-A0305-02-0018-10
Figure 106133771-A0305-02-0018-11
從表7及表8可以確認，使用綠茶萃取物進行處理時，兩種基因的表達量均得到增加，尤其是使用極度遮光栽培綠茶的萃取物進行處理的情況下，相比於普通綠茶萃取物顯示出顯著優異的功效。
[試驗例5]阻礙膠原酶(MMP-1)的能力
將本發明的阻礙膠原酶生成的能力與視黃酸進行比較，測量了對改善皺紋方面起到的效果。
在裝有含2.5%的胎牛血清的DMEM(達爾伯克改良伊格爾培養基(Dulbecco's Modified Eagle's Media))培養基的96孔平板培養器(96-well microtiter plate)中以5,000細胞/孔(well)的量加入人成纖維細胞，並在5%的CO2、37℃的培養器(incubator)中進行培養，直至長到70~80%左右。使用實施例1~2和比較例1及3的萃取物或視黃酸以10μg/ml的濃度分別處理24小時，然後採集細胞培養液。
使用商業上可利用的膠原酶測量儀器(美國Amersham Pharmacia公司，目錄(Catalog)#：RPN 2610)對採集的細胞培養液的膠原酶生成程度進行測量。首先，在均勻塗布膠原酶一抗的96孔平板(96-well plate)中加入採集的細胞培養液，並在恆溫槽中進行抗原-抗體反應3小時。3小時後，將結合有發色團的膠原酶二抗加入96孔平板(96-well plate)中，再次反應15分鐘。15分鐘後，加入顯色誘發物質(3,3',5,5'-四甲基聯苯胺(3,3',5,5'-tetramethylbenzidine)，西格瑪(Sigma))後在室溫下誘發顯色15分鐘，然後再次加入1M的硫酸使顯色反應終止，則反應液的顏色呈黃色，並且根據反應進行的程度，所顯示的黃色的程度會不同。
利用分光光度計在405nm下測量呈黃色的96孔平板(96-well plate)的吸光度，並根據下述數學式1來計算膠原酶的合成程度，其結果示於下述表9中。此時，將從未使用組合物進行處理的組中採集的細胞培養液的反應吸光度作為對照組。
[數學式1]
Figure 106133771-A0305-02-0020-12
Figure 106133771-A0305-02-0020-14
從上述表9的結果可以知道，極度遮光栽培綠茶的萃取物的膠原酶表達程度與已知為膠原酶表達抑制劑的視黃酸進行比較時，阻礙膠原酶表達的效果顯示出相似的水平。
藉由這種結果可以確認，本發明的極度遮光栽培綠茶的萃取物具有阻礙基質金屬蛋白酶(MMP-1)的效果。
[試驗例6]抑制彈性蛋白酶活性的功效的測量
將極度遮光栽培綠茶的萃取物的阻礙彈性蛋白酶活性的能力與EGCG進行比較，測量了對抗老化產生的影響。使用的彈性蛋白酶和底物是以商業方式購自美國西格瑪奧德裡奇公司(Sigma-Aldrich)(Cat.No.E0127)。
採用以下試驗方法對阻礙彈性蛋白酶活性的作用進行試驗。
在96孔平板中調製的10mg/L的三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-HCL)緩衝液(pH為8.0)中混合人身皂苷Rh4(200μL)及50μL的20μg/mL的III型彈性蛋白酶溶液。使用250μM的EGCG作為陽性對照組，作為陰性對照組的非處理組使用了蒸餾水。之後，加入以所述緩衝液調製的100μL的0.4514mg/mL的N-琥珀醯-Ala-Ala-Ala-對硝基苯胺(N-SUCCINYL-ALA-ALA-ALA-p- NITROANILIDE)，在25℃下進行反應15分鐘。反應結束後，測量波長415nm下的吸光度。採用相同的方法進行空白試驗並進行校正。
阻礙彈性蛋白酶活性的作用的計算方法如下述數學式2所示，結果示於下述表10中。
[數學式2]彈性蛋白酶活性的阻礙率(%)={1-(C-D)/(A-B)}×100
A：沒有添加試驗物質，添加酶時在波長415nm下的吸光度。
B：沒有添加試驗物質，沒有添加酶時在波長415nm下的吸光度。
C：添加試驗物質，添加酶時在波長415nm下的吸光度。
D：添加試驗物質，沒有添加酶時在波長415nm下的吸光度。
Figure 106133771-A0305-02-0021-15
如上述表10中所示，極度遮光栽培綠茶的萃取物的抑制彈性蛋白酶活性的程度與已知為彈性蛋白酶活性抑制劑的EGCG顯示出相似的水平，由此可以確認，本發明的極度遮光栽培綠茶的萃取物的抑制彈性蛋白酶活性的效果優異。
[試驗例7]屏障功能強化基因表達的確認
採用以下方法確認了本發明的極度遮光栽培綠茶的萃取物對公知為與皮膚屏障功能強化相關的半胱天冬酶-14(caspase-14)基因的表達產生的影響。
利用KGM-gold(Lonza公司，#00192151)培養基使角質形成細胞生長，然後在6孔板中接種25000個細胞。次日，分別將實施例1~2和比較例1及3的萃取物在培養基中分別稀釋1000倍，然後對細胞進行處理，培養1天後收集細胞。為了使用Trizol來萃取RNA，在試管中加入收集的細胞(約為1×105個)，然後在其中分別加入500μl的Trizol，並在常溫下對細胞進行5分鐘的均質化。在各個試管中分別加入100μl的氯仿，並用手搖晃15秒使其混合後在常溫下放置3分鐘，然後在4℃、15000×g下進行離心分離15分鐘。僅將上清液移到新的試管中，然後分別加入250μl的異丙醇使其混合均勻後在常溫下放置10分鐘，然後在4℃、15000×g下進行離心分離10分鐘。僅保留團塊，將上清液全部去除，然後分別加入500μl的75%的乙醇並進行渦流處理，然後在4℃、7500×g下進行離心分離5分鐘。僅保留團塊，小心去除上清液後，將團塊充分進行乾燥，然後加入去離子水使RNA溶解，之後在260nm下進行定量。為了利用總RNA來合成cDNA，在4μg的總RNA中加入2μl的Oligo dT，並在70℃下進行反應10分鐘，然後迅速冷卻。加入DTT、dNTP、10×RT緩衝液、MgCl2及重組核糖核酸酶抑制劑並在42℃下經過2分鐘後加入Superscript III RT，在50℃下進行反應60分鐘。在合成的35μl的cDNA混合液中加入165μl的去離子水稀釋至共200μl。為了進行qPCR，混合5μl的cDNA混合液+4μl的去離子水+各1μl的Taqman引子(對照組基因為RPLP0，實驗組基因為兜甲蛋白、外皮蛋白)+10μl的Taqman 2X Universal PCR Master Mix(ABI公司產品，#4304437)，將共20μl分別加入到各個PCR試管中，並裝載於實時PCR裝置(ABI公司產品，型號名稱：7500fast)。反應設置(reaction set up)如下：1.保持步驟：95℃(10分鐘)，2.循環步驟：95℃(15秒)+60℃(60秒)，共重複40個循環。此時，所使用的Taqman引子是利用了由起報告作用的螢光分子FAM、淬滅基團NFQ-MGB構成的常規引子。
結果示於下述表11中。
Figure 106133771-A0305-02-0023-16
從表11的結果可以確認，使用綠茶萃取物進行處理時，在半胱天冬酶-14基因中表達量均得到增加，並且可以知道尤其是在使用極度遮光栽培綠茶的萃取物進行處理的情況下，相比於普通綠茶萃取物顯示出優異的功效。
[試驗例8]抑制皮膚損傷或保護皮膚的基因表達的確認
採用以下方法確認了本發明的極度遮光栽培綠茶的萃取物對公知為與抑制皮膚損傷或保護皮膚相關的組氨酸酶基因的表達產生的影響。
利用KGM-gold(Lonza公司，#00192151)培養基使角質形成細胞生長，然後在6孔板中接種25000個細胞。次日，分別將實施例1~2和比較例1及3的萃取物在培養基中分別稀釋1000倍，然後對細胞進行處理，培養1天後收集細胞。為了使用Trizol來萃取RNA，在試管中加入收集的細胞(約為1×105個)，然後在其中分別加入500μl的Trizol，並在常溫下對細胞進行5分鐘的均質化。在各個試管中分別加入100μl的氯仿，並用手搖晃15秒使其混合後在常溫下放置3分鐘，然後在4℃、15000×g下進行離心分離15分鐘。僅將上清液移到新的試管中，然後分別加入250μl的異丙醇使其混合均勻後在常溫下放置10分鐘，然後在4℃、15000×g下進行離心分離10分鐘。僅保留團塊，將上清液全部去除後，分別加入500μl的75%的乙醇並進行渦流處理，然後在4℃、7500×g下進行離心分離5分鐘。僅保留團塊，小心去除上清液後，將團塊充分進行乾燥，然後加入去離子水使RNA溶解，之後在260nm下進行定量。為了利用總RNA來合成cDNA，在4μg的總RNA中加入2μl的Oligo dT，並在70℃下進行反應10分鐘，然後迅速冷卻。加入DTT、dNTP、10×RT緩衝液、MgCl2及重組核糖核酸酶抑制劑並在42℃下經過2 分鐘後加入Superscript III RT，在50℃下進行反應60分鐘。在合成的35μl的cDNA混合液中加入165μl的去離子水稀釋至共200μl。為了進行qPCR，混合5μl的cDNA混合液+4μl的去離子水+各1μl的Taqman引子(對照組基因為RPLP0，實驗組基因為兜甲蛋白、外皮蛋白)+10μl的Taqman 2X Universal PCR Master Mix(ABI公司產品，#4304437)，將共20μl分別加入到各個PCR試管中，並裝載於實時PCR裝置(ABI公司產品，型號名稱：7500fast)。反應設置(reaction set up)如下：1.保持步驟：95℃(10分鐘)，2.循環步驟：95℃(15秒)+60℃(60秒)，共重複40個循環。此時，所使用的Taqman引子是利用了由起報告作用的螢光分子FAM、淬滅基團NFQ-MGB構成的常規引子。結果示於下述表12中。
Figure 106133771-A0305-02-0024-17
從表12的結果可以確認，使用綠茶萃取物進行處理時，在組氨酸酶基因中表達量均得到增加，並且可以知道尤其是在使用極度遮光栽培綠茶的萃取物進行處理的情況下，相比於普通綠茶萃取物顯示出優異的功效。

Claims (10)

  1. 一種用於皮膚保濕、皮膚抗老化、改善皮膚皺紋、改善皮膚彈性、強化皮膚屏障功能、抑制皮膚損傷或保護皮膚的皮膚外用劑組合物，其是藉由遮光率為90%以上的極度遮光栽培方法進行栽培的綠茶的低溫低速萃取物作為有效成分，其中所述極度遮光栽培方法在茶樹的一芽一葉期至一芽四葉期進行遮光處理10天至25天，所述綠茶的低溫低速萃取物是在4℃以下的溫度下，以每小時100mL的速度，使用水作為萃取溶劑來進行萃取而得。
  2. 如請求項1所述之皮膚外用劑組合物，其中相對於該皮膚外用劑組合物的總重量，該有效成分的含量為0.0001~40重量%。
  3. 如請求項1所述之皮膚外用劑組合物，其中該萃取物是藉由使用水作為萃取溶劑來進行低速低溫萃取的。
  4. 如請求項1所述之皮膚外用劑組合物，其具有選自柔膚化妝水、收斂化妝水、營養化妝水、營養霜、按摩霜、精華液、眼霜、眼部精華液、潔膚霜、潔膚泡沫、潔膚水、面膜、粉、身體乳液、身體霜、身體油及身體精華液中的劑型。
  5. 一種藉由遮光率為90%以上的極度遮光栽培方法進行栽培的綠茶的低溫低速萃取物在製備皮膚保濕外用劑組合物的用途，其中所述極度遮光栽培方法在茶樹的一芽一葉期至一芽四葉期進行遮光處理10天至25天，所述綠茶的低溫低速萃取物是在4℃以下的溫度下，以每小時100mL的速度，使用水作為萃取溶劑來進行萃取而得。
  6. 一種藉由遮光率為90%以上的極度遮光栽培方法進行栽培的綠茶的低溫低速萃取物在製備皮膚抗老化外用劑組合物的用途，其中所述極度遮光栽培方法在茶樹的一芽一葉期至一芽四葉期進行遮光處 理10天至25天，所述綠茶的低溫低速萃取物是在4℃以下的溫度下，以每小時100mL的速度，使用水作為萃取溶劑來進行萃取而得。
  7. 一種藉由遮光率為90%以上的極度遮光栽培方法進行栽培的綠茶的低溫低速萃取物在製備皮膚皺紋改善外用劑組合物的用途，其中所述極度遮光栽培方法在茶樹的一芽一葉期至一芽四葉期進行遮光處理10天至25天，所述綠茶的低溫低速萃取物是在4℃以下的溫度下，以每小時100mL的速度，使用水作為萃取溶劑來進行萃取而得。
  8. 一種藉由遮光率為90%以上的極度遮光栽培方法進行栽培的綠茶的低溫低速萃取物在製備皮膚彈性改善外用劑組合物的用途，其中所述極度遮光栽培方法在茶樹的一芽一葉期至一芽四葉期進行遮光處理10天至25天，所述綠茶的低溫低速萃取物是在4℃以下的溫度下，以每小時100mL的速度，使用水作為萃取溶劑來進行萃取而得。
  9. 一種藉由遮光率為90%以上的極度遮光栽培方法進行栽培的綠茶的低溫低速萃取物在製備皮膚屏障功能強化外用劑組合物的用途，其中所述極度遮光栽培方法在茶樹的一芽一葉期至一芽四葉期進行遮光處理10天至25天，所述綠茶的低溫低速萃取物是在4℃以下的溫度下，以每小時100mL的速度，使用水作為萃取溶劑來進行萃取而得。
  10. 一種藉由遮光率為90%以上的極度遮光栽培方法進行栽培的綠茶的低溫低速萃取物在製備皮膚損傷抑制或皮膚保護外用劑組合物的用途，其中所述極度遮光栽培方法在茶樹的一芽一葉期至一芽四葉期進行遮光處理10天至25天，所述綠茶的低溫低速萃取物是在4℃以下的溫度下，以每小時100mL的速度，使用水作為萃取溶劑來進行萃取而得。
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