KR20130130337A - 녹차 추출 펩타이드, 이의 제조방법 및 이를 함유하는 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Thr-Asn-Thr-Leu-Ser-Asn의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드, 녹차에 물을 가하여 추출한 수용성 성분에 알코올을 첨가하여 침전물을 침전시키는 단계를 포함하는 녹차 추출물의 제조방법 및 상기 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 피부 외용제, 화장료 및 약학 조성물을 제공한다. 본 발명에 따른 펩타이드는 피부에 안전함과 동시에, 우수한 피부 항노화, 피부 미백 및 피부 보습 효능을 가지고, 산화에 강하여 산업화에 바로 적용할 수 있다.

Description

녹차 추출 펩타이드, 이의 제조방법 및 이를 함유하는 조성물{PEPTIDE EXTRACTED FROM CAMELLIA SINENSIS, METHOD FOR PRODUCING THE SAME AND COMPOSITION CONTAINING THE SAME}

본 발명은 녹차 추출 펩타이드, 이의 제조방법 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것으로, 보다 구체적으로 피부 항노화, 미백 및 보습 효능을 가지는 신규한 아미노산 서열을 가지는 녹차 추출 펩타이드, 이의 제조방법 및 이를 함유하는 조성물에 관한 것이다.

차나무는 카멜리아(Camellia) 속으로 분류되는 82종 중 하나로 현재 아시아를 중심으로 아프리카, 남아메리카, 오세아니아 등의 50여개 국가에서 재배되고 있다. 차의 종류는 차나무 잎의 가공방법에 의하여 크게 비발효차, 반발효차, 발녹차, 후발효차로 구분되며, 이중 비발효차는 차나무에 함유된 폴리페놀 옥시다제를 열처리에 의하여 불활성화물 시킨 것으로, 다른 차에 비하여 플라보놀(flavonol), 플라바논(flavanone), 플라보노이드(flavonoid) 등의 폴리페놀(Polyphenol) 류를 많이 함유하고 있어 강한 항산화력을 나타내며, 이러한 물질들은 차 건조중량의 약 30%를 차지한다.

　비발효인 녹차의 다양한 효과들에 대하여 연구가 진행되고 있는데, 그중 녹차에 함유된 폴리페놀의 효과에 의하여 식도암, 폐암, 전립선암 등에 대한 항암효과가 연구 보고되고 있다. 또한 녹차에 함유된 데아닌은 차에 함유된 아미노산 중 하나로, 차의 맛의 품질에 영향을 준다. 또한 긴장 이완과 학습시 집중력 향상에 효과가 있는 것으로 알려져 있다.

　차의 건강에 대한 이로움은 오랜 역사를 통해서 증명이 되어왔으며, 최근의 연구에 의하면 차에 함유된 폴리페놀에 의하여 피부의 자외선 보호효과와 피부암 억제 효과가 있음이 밝혀졌고. 녹차 추출물이 피부의 섬유아세포를 활성산소로부터 보호함이 증명되었다. 이렇듯 녹차의 피부효능에 대한 연구가 최근에 밝혀지기 시작하며, 녹차를 이용한 화장품 및 의학용으로 산업화하는 시도들이 생기고 있다. 하지만 이러한 폴리페놀류의 단점은 산화에 취약하여, 산업화에 바로 적용할 수 없다는 단점이 있으며, 안정화를 위한 공정을 추가시 비용이 상승하게 되어 제품 적용성이 떨어지게 된다.

그러나 종래 녹차의 폴리페놀류 이외에 녹차의 펩타이드 및 당단백질에 대한 연구는 없었다.　식물에 함유된 물질 중 산화에 안정하며, 구조가 단순하여 피부효능이 높을 것으로 기대되는 물질의 구조가 바로 펩타이드이다. 식물에서의 펩타이드는 신호전달 물질로 작용하며, 특히 식물의 성장과 분화, 외부의 자극에 의한 반응에 관여한다고 알려져 있다.

한편, 최근 여러 화학물질 등에 의한 피부의 부작용을 줄이면서도 피부에 항노화, 미백 또는 보습효과 등에 있어서 상기의 문제를 해결하기 위하여 천연물을 사용한 화장품 등 피부 외용제 조성물이 많이 개발되고 있다. 이에 본 발명자들은 이제까지 널리 알려지지 않은 녹차 추출 펩타이드에 있어서 피부 외용제로서의 응용 가능성을 연구하였다.

등록특허 제407,037호

상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 본 발명은 녹차로부터 신규한 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 추출하고, 이 펩타이드를 함유하여 피부 항노화, 피부 미백 및 피부 보습 효능을 가지는 조성물을 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

상기와 같은 목적을 해결하기 위하여 본 발명은 Thr-Asn-Thr-Leu-Ser-Asn의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 펩타이드는 녹차에서 추출된 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 펩타이드는 피부 항노화 효능을 가지는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 펩타이드는 피부 미백 효능을 가지는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 펩타이드는 피부 보습 효능을 가지는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 녹차에 물을 가하여 추출한 수용성 성분에 알코올을 첨가하여 침전물을 침전시키는 단계를 포함하는 녹차 추출물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 제조방법은, 녹차에 물을 가하여 수용성 성분을 추출하고 분리하는 단계; 상기 수용성 성분에 알코올을 첨가하여 폴리페놀 및 클로로필을 제거하고 침전물을 얻는 단계; 및 상기 침전물을 건조하는 단계를 포함하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 건조는 30 내지 40℃에서 열풍 건조하는 것일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물, 화장료 조성물 또는 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 펩타이드는 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 20중량%로 함유되는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 피부 항노화, 피부 미백 또는 피부 보습용일 수 있다.

본 발명에 따른 펩타이드는 피부에 안전함과 동시에, 우수한 피부 항노화, 피부 미백 및 피부 보습 효능을 가지고, 산화에 강하여 산업화에 바로 적용할 수 있으므로, 다양한 피부 외용제 조성물, 화장료 조성물 및 약학 조성물에 적용될 수 있다.

도 1은 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드의 GPC 크로마토그램이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예에 따른 펩타이드의 HPLC 크로마토그램이다.

이하에서는, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 본 발명을 용이하게 실시할 수 있도록 하기 위하여, 본 발명의 바람직한 실시예들에 관하여 상세히 설명하기로 한다.

본 발명은 Thr-Asn-Thr-Leu-Ser-Asn의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 제공한다. 상기 펩타이드는 신규한 펩타이드로서, 분자량이 약 738.74684이다. 본 명세서에서 용어 "펩타이드(peptide)"는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다.

상기 펩타이드는 녹차에서 추출된 것일 수 있다. 본 발명에서 녹차는 카멜리아 시넨시스(Camellia sinensis)라는 학명으로 불리기도 한다. 본 발명에서 사용되는 녹차는 구체적으로는 녹차줄기 또는 녹차잎일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 본 발명의 녹차 추출물의 제조방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명의 녹차 추출물의 제조방법은 녹차에 물을 가하여 추출한 수용성 성분에 알코올을 첨가하여 침전물을 침전시키는 단계를 포함한다.

상기 녹차 추출물은 Thr-Asn-Thr-Leu-Ser-Asn의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 포함할 수 있다. 그러나 특별히 이에 한정되는 것은 아니다. 즉, 상기 녹차 추출물은 Thr-Asn-Thr-Leu-Ser-Asn의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드 이외의 펩타이드를 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 Thr-Asn-Thr-Leu-Ser-Asn의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드는 차의 폴리페놀류를 제외한 당단백질과 펩타이드의 에탄올 침전 방법을 사용하여 추출할 수 있다. 이하, 보다 구체적으로 본 발명의 녹차 추출물의 제조방법을 서술한다.

먼저, 녹차에 물을 가하여 수용성 성분을 추출하고 분리한다. 예를 들어, 녹차잎에 물을 가하여 가열시 녹차의 수용성 성분이 물에 용해되어 분리 가능하다. 이렇게 얻어진 수용성 성분을 여과할 수 있다.

그 다음, 상기 수용성 성분에 알코올을 첨가하여 폴리페놀 및 클로로필을 제거하고 침전물을 얻는다. 상기 알코올은 특별히 한정되는 것은 아니나, 메탄올, 에탄올, 프로판올일 수 있고, 바람직하게는 메탄올일 수 있다. 수용성 성분에 알코올 첨가시, 침전물이 생성되고, 폴레페놀 및 클로로필은 상등액에 잔류한다. 이 상등액을 제거하고 침전물을 취한다.

마지막으로, 상기 침전물을 건조한다. 이때 건조는 당업계에 알려진 건조 방법이면 특별히 제한되는 것은 아니다.

상기 건조는 특히 30 내지 40℃에서 열풍 건조하는 것이 바람직하다. 30℃ 미만 또는 40℃ 초과에서는 침전물 내 존재하는 단백질의 열변성이 발생할 수 있다. 생성된 건조물을 분말로 균질화할 수 있다.

상기의 제조방법으로 추출된 녹차 추출물은 Thr-Asn-Thr-Leu-Ser-Asn의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 포함한다. 이 펩타이드는 Thr-Asn-Thr-Leu-Ser-Asn (분자량 약 738.74684)의 6개의 아미노산 서열을 갖는 것이다. 이는 후술할 시험예에서 확인할 수 있다.

본 발명에 따른 펩타이드는 피부 항노화 효능, 피부 미백 효능 및 피부 보습 효능을 가진다. 구체적으로, 본 발명에 따른 펩타이드는 멜라닌 생성 억제 효과를 가진다. 이는 후술할 시험예에서 확인할 수 있다.

본 발명은 Thr-Asn-Thr-Leu-Ser-Asn의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물, 화장료 조성물 및 약학 조성물을 제공한다. 상기 피부 외용제는 피부 외부에서 도포되는 어떠한 것이라도 포함될 수 있는 총칭이며, 다양한 제형의 화장품 및 의약품이 여기에 포함될 수 있다.

상기 조성물은 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 20중량%의 펩타이드를 함유하는 것일 수 있다. 이는 유효성분으로서 펩타이드의 함량이 0.01중량% 미만이면 상기 성분에 의한 효능 및 효과가 미약하고, 20중량%를 초과하면 피부 안정성 또는 제형상의 문제가 있기 때문이다.

상기 피부 외용제 조성물, 화장료 조성물 및 약학 조성물은 각각 피부 항노화, 피부 미백 또는 피부 보습용일 수 있다. 본 발명에 따른 펩타이드는 우수한 피부 항노화 효능, 피부 미백 효능 및 피부 보습 효능을 가질 뿐 아니라, 피부 안정성이 있고, 펩타이드의 특성 상 산화에 강하여 조성물 적용에 유리하다.

구체적으로, 본 발명의 조성물은 피부 외용제 조성물일 수 있고, 보다 구체적으로는 항노화용 피부 외용제 조성물로서 사용될 수 있으며 이는 피부 탄력을 증진시키고 주름을 개선시키는 효과가 뛰어나다.

또한, 본 발명의 조성물은 미백용 피부 외용제 조성물로서 사용될 수 있으며, 이는 멜라닌의 생성을 억제함으로써 우수한 미백 효과를 제공할 수 있다.

나아가, 본 발명의 조성물은 보습용 피부 외용제 조성물로서 사용될 수 있으며, 이는 피부 장벽 기능을 강화시키고 피부 각질형성세포의 분화를 유도시킬 수 있다. 따라서 표피 분화의 불완전함으로 생기는 피부건조증 또는 건선 등을 예방 또는 개선하는 피부 외용제 조성물로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 피부 외용제 조성물을 화장료 조성물의 형태로 제형화할 경우, 유연화장수, 수렴화장수, 영양화장수, 아이 크림, 영양 크림, 마사지 크림, 클렌징 크림, 클렌징 폼, 클렌징 워터, 파우더, 에센스 또는 팩 등의 형태로 제형화될 수 있으며, 그 제형이 특별히 한정되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에 의한 조성물은 지방 물질, 유기용매, 용해제, 농축제, 겔화제, 연화제, 항산화제, 현탁화제, 안정화제, 발포제(foaming agent), 방향제, 계면활성제, 물, 이온형 또는 비이온형 유화제, 충전제, 금속이온봉쇄제, 킬레이트화제, 보존제, 비타민, 차단제, 습윤화제, 필수 오일, 염료, 안료, 친수성 또는 친유성 활성제, 지질 소낭 또는 화장품에 통상적으로 사용되는 임의의 다른 성분과 같은 화장품학 또는 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제를 함유할 수 있다. 상기 보조제는 화장품학 또는 피부과학 분야에서 일반적으로 사용되는 양으로 도입된다. 또한, 본 발명의 조성물은 피부 개선 효과를 증가시키기 위하여 피부 흡수 촉진 물질을 함유할 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 조성물은 약학 조성물일 수 있다. 상기 약학 조성물에는 방부제, 안정화제, 수화제 또는 유화 촉진제, 삼투압 조절을 위한 염 및/또는 완충제 등의 약제학적 보조제 및 기타 치료적으로 유용한 물질을 추가로 함유할 수 있으며, 통상적인 방법에 따라 다양한 경구 투여제 또는 비경구 투여제 형태로 제형화할 수 있다.

상기 경구 투여제는 예를 들면, 정제, 환제, 경질 및 연질 캅셀제, 액제, 현탁제, 유화제, 시럽제, 분제, 산제, 세립제, 과립제, 펠렛제 등이 있으며, 이들 제형은 유효 성분 이외에 계면 활성제, 희석제(예: 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 만니톨, 솔비톨, 셀룰로오스 및 글리신), 활택제(예: 실리카, 탈크, 스테아르산 및 그의 마그네슘 또는 칼슘염 및 폴리에틸렌 글리콜)를 함유할 수 있다. 정제는 또한 마그네슘 알루미늄 실리케이트, 전분페이스트, 젤라틴, 트라가칸스, 메틸셀룰로오스, 나트륨 카복시메틸셀룰로오스 및 폴리비닐피롤리딘과 같은 결합제를 함유할 수 있으며, 경우에 따라 전분, 한천, 알긴산 또는 그의 나트륨 염과 같은 붕해제, 흡수제, 착색제, 향미제, 및 감미제 등의 약제학적 첨가제를 함유할 수 있다. 상기 정제는 통상적인 혼합, 과립화 또는 코팅 방법에 의해 제조될 수 있다. 또한, 상기 비경구 투여 형태로 경피 투여형 제형일 수 있으며, 예를 들어 주사제, 점적제, 연고, 로션, 겔, 크림, 스프레이, 현탁제, 유제, 좌제(坐劑), 패취 등의 제형일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 유효 성분의 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 약물의 1일 투여 용량은 투여하고자 하는 대상의 미만 진행 정도, 발병 시기, 연령, 건강상태, 합병증 등의 다양한 요인에 따라 달라지지만, 성인을 기준으로 할 때 일반적으로는 상기 조성물 1㎍/kg 내지 200mg/kg, 바람직하게는 50㎍/kg 내지 50mg/kg을 1일 1 내지 3회 분할하여 투여할 수 있으며, 상기 투여량은 어떠한 방법으로도 본 발명의 범위를 한정하는 것이 아니다.

이하의 실시를 통하여 본 발명이 더욱 상세하게 설명된다. 단, 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로서 이들만으로 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1] 녹차 추출 펩타이드의 제조

본 발명에 사용된 녹차 추출 펩타이드 제조하는 방법은 건조된 녹차 100g을 측량하여 정제수(80℃)를 5배 가하여 추출하였다. 온도를 유지하며 2시간 가열 교반하고, 상온으로 식힌 후에, 수용성 성분만 분리하고, Adventech No.131을 이용하여 1차 여과하였다. 1차 여과물에 95% 에탄올을 전체 중량대비 40%를 교반하며 천천히 첨가하고, 이때 발생하는 침전물은 제거하였다. 이후 다시 전체 중량대비 2배에 해당하는 에탄올을 천천히 교반하며 첨가하고, 상등액의 클로로필은 제거하였다. 침전된 것만 모아 열풍 건조하였다. 열풍 건조시에는 30-40℃를 유지시켜주어, 단백질 열변성을 방지하였다. 열풍 건조 후 최종 수율은 녹차 중량대비 3%이며, 분말로 균질화하여 이를 실험에 사용하였다.

[시험예 1] 단백질 분해 및 아미노산 분석

상기 실시예 1에서 제조된 펩타이드를 포함하는 분말을 가지고 HLPC에 의한 아미노산 분석을 실시하였다.

1-1. 단백질 분해

단백질 분해는　브로멜라인(Bromelain)을 이용하여, pH6-7, 온도 50℃에서 오버나이트(overnight)하여 단백질 분해하고, 85℃ 30분 가온하여 효소 실활시킨 후 상온으로 냉각하였다. 그후 규조토 여과 후 동결건조하여 단백질 분해물을 제조하였다.

1-2. 아미노산 분석

공시험액, 아미노산 표준혼합액 및 상기 1-1.에서 분해물이 함유된 검액을 20 μL씩 준비하여, HPLC 바이알에 넣고 AccQ-Tag amino acids derivatization kit의 유도체화 시액 중 보레이트 버퍼 70 μL, 밀 시약(Flour reagent) 2A 20 μL를 넣어 잘 흔들어 섞어 1분간 실온에 방치 후 55 ℃에서 10분간 반응시켜 형광 유도체화하여 검액으로 하였으며 검액과 표준액은 3회 반복 측정하였다.

분석 컬럼은 ACQUITY UPLC AccQ-Tag Ultra C18컬럼(2.1×100 mm, 1.7 μm)을 사용하였으며 이동상은 AccQ-Tag Ultra Eluent A, B를 이용하여 농도구배조건으로 분석하였으며 분리조건은 하기 표 1에 나타내었다.

시간(분)	A(%)	B(%)
0	99.1	0.1
0.54	99.1	0.1
4.75	93.5	6.5
7.74	82.5	17.5
8.50	82.5	17.5
8.70	40.4	59.6
8.90	99.1	0.1
10.0	99.1	0.1
유속	0.7mL/분
주입량	1㎕
컬럼온도	60 ℃
검출	PDA 260 nm

A : AccQ-Tag Ultra Eluent A(버퍼),

B : AccQ-Tag Ultra Eluent B(아세토니트릴 내 1 % 포름산)

그 결과를 하기 표 2에 나타냈다. 전체 아미노산 농도는 35987.4㎍/g으로 분석되었고, 가장 많은 아미노산은 Glutamic acid로 14073.9㎍/g,　39.11%로 분석되었고, 녹차에만 존재하는 Theanine은 7533.9㎍/g으로 두 번째로 많은 20.93%를 차지하였다. 신경전달 물질로 알려진 GABA는 1176.4㎍/g, 3.27%로 분석되었다. Glycine를 포함한 11개종의 아미노산은 1% 미만으로 분석되었다.

아미노산	농도 (μg/g)	분포비율(%)
총아미노산 함량	35987.4	100.00%
Glu	14073.9	39.11%
The	7533.9	20.93%
Asp	5698.7	15.84%
Arg	2495.6	6.93%
GABA	1176.4	3.27%
Tyr	663.3	1.84%
Gln	608	1.69%
Cys	551.3	1.53%
Ala	469.5	1.30%
Ser	461.3	1.28%
Thr	392.1	1.09%
Gly	298.3	0.83%
Lys	292.5	0.81%
Pro	269.9	0.75%
Val	264.6	0.74%
Ile	234.5	0.65%
Phe	151.1	0.42%
Met	117.1	0.33%
Leu	110.9	0.31%
His	91.4	0.25%
Trp	25.8	0.07%
Asn	7.5	0.02%

[시험예 2] GPC (Gel permeation chromatography) 분석

상기 실시예 1에서 제조된 펩타이드를 포함하는 분말을 이용하여 분자 특성을 분석하기 위하여 GPC 분석을 실시하였다. 시료는 물에 완전용해 시킨 후, 0.45㎛ 나일론 필터로 여과하여 사용하였다. 측정기기는 Waters GPC System, 펌프 Waters 515, 검출기 Waters 410 Differentia Refractometer를 사용하였으며, 용매는 0.1 M NaNO₃, 컬럼 및 분석조건은 TSKgel G4000PWxl + TSKgel G2500PWxl (7.8×300 mm), 온도는 35℃, 유속 1.0 mL/분, 주입량 100㎕, 데이터처리 EMPOWER, 표준물질은 PEG/PEO를 사용하여 분석하였다.

LC 컬럼에서 정제된 시료에 대한 아미노산 서열을 결정하기 위하여 건조된 시료를 20%(v/v) 아세토니트릴/물 용매 20㎕로 녹인 후, 바이오브렌(biobrene) 이 코팅되어져 있는 마이크로-필터에 시료를 분주 및 건조를 하였고 에드만 분해(edman degradation)에 의한 N말단 아미노산 서열결정방법을 기반으로 분석되어지는 automatic amino acid sequencer ABI492 system (Applied Biosystems, Foster City, CA)을 이용하여 펄스드-리퀴드(pulsed-liquid) 방법으로 N말단으로부터 순차적으로 아미노산을 결정하였다. (Ref-1,2) 이때, 분석 장비에 대한 확인(validation) 은 베타-락토글로불린 표준 단백질 10 pmol을 시료 분석과 동일과정으로 분석하였을 때, PTH (Phenylthiodation)-amino acid 의 반복적인 수율은 93% 이상을 유지하고, 최초 유리된 PTH-아미노산의 수율은 50% 이상을 유지하는 조건 하에서 분석을 실시하였다.

총 두 번에 걸쳐 분석(1차 분석 및 2차 분석)을 하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었고, 1차 분석의 GPC 크로마토그램 결과를 하기 표 4및 도 1에 나타내었다. 수평균 분자량은 평균 886, 중량평균분자량은 25218, 최대피크분자량은 890으로 분석이 되었으며, 다분산 지수인 Mw/Mn은 28.46으로 일반적인 중합 폴리머가 2정도인 것에 비하여, 매우 높은 것을 알 수 있다. 이를 통해 다양한 구조의 당단백질 및 펩타이드가 혼합되어 있음을 추축해 볼 수 있다.

구분	Mn	Mw	Mp	Mw/Mn
1차 분석	881	24613	895	27.94
2차 분석	891	25822	885	28.98
SD	7.07	854.89	7.07	-
CV	0.8	3.39	0.79	-
average	886	25218	890	28.46

GPC 결과. Mn:수평균분자량, Mw:중량평균분자량, Mp:최대피크분자량, Mw/Mn:분산도, Standard: PEG/PEO

피크	Mn	Mw	Mp	Mw /Mn	% Area	RT (min)
피크 1	14586	77829	17206	5.335873	30.79	13.971
피크 2	690	690	895	1.375176	63.84	17.011
피크 3	286	286	283	1.00021	5.37	19.744

도 1의 분석피크를 분석해 보면 1차 분석 GPC 분석에서는 크게 세 개의 피크(Peak)가 관찰되었다. 피크 1은 Mn 14586, Mw 77829, Mp 17206으로 Mw/Mn　비율이 5.34정도가 되었다. 하지만 피크 2와 피크 3에서는 다분산 지수가 각각 1.375, 1.000으로 단분자 형태를 가짐을 확인할 수 있었다. 피크 2는 Mn 690, Mw 949, Mp 895이며, 피크 3은 Mn 286, Mw 286, Mp 283으로 분석이 되었다. 2차 GPC 분석도 1차 분석 결과와 거의 유사하게 분석되었다.

[시험예 3] 녹차 펩타이드 프랙션(Fraction)의 분리 및 아미노산 서열 분석

상기 실시예 1에서 얻은 분말 20mg을 증류수 1mL에 완전히 녹인 후, 20㎕를 HPLC C18 컬럼 로딩(loading)해서 리텐션 타임(retention time) 16.148분에서 분리된 프랙션(Fraction)을 펩타이드 서열 분석을 하였다. HPLC 크로마토그램을 도 2에 도시하였다.

도 2에서 분리된 시료들 가운데 리텐션 타임 이 16.146 분에서 확인된 시료 대하여 결정된 아미노산 서열은 Thr-Asn-Thr-Leu-Ser-Asn(분자량 738.74684)으로 6개의 아미노산 서열로 결정이 되었다. 이를 하기 표 5에 나타내었다. 분석된 아미노산은 피크2(도 1)에 포함된 펩타이드로 판단된다. 이러한 펩타이드는 친수성이며, 안정도가 높은 특징을 가지고 있고, 분자량이 1000 이하로 피부 흡수도 역시 높다.

[시험예 4] 멜라닌 생성 억제 효과

상기 실시예 1에서 제조된 펩타이드에 대하여 멜라닌 생성 억제 실험을 실시하였다. 인간 멜라노마 세포인 HM3KO 세포(Y. Funasaka, Department of dermatology, Kobe university school of medicine, 5-1 Kusunoki-cho 7-chrome, Chuo-ku, Kobe 650, Japan)를 우태아혈청이 10% 들어간 MEM(Minimum Essential Medium)에 넣어 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 배양하였다. 이렇게 배양한 세포를 세포수가 각 플라스크 당 3×10⁵이 되게 75 플라스크에 깔고, 하룻밤 동안 세포가 기벽에 붙기를 기다린 다음, 세포가 잘 붙은 것을 확인한 후 배지를 본 발명에 따른 녹차 펩타이드 및 양성 대조군으로서 알부틴이 각각 10 ppm 들어 있는 새배지로 갈아주었다. 대조군은 DMSO가 들어 있는 배지를 사용하였다. 이런 식으로 2-3일에 한번씩 시료가 들어 있는 새배지로 갈아주면서 세포가 플라스크에 꽉 찰 때까지 배양하였다. 세포가 다 성장하면 모아서 대조구와 각각 처리구의 세포 색깔을 비교하였다. 또한, 배양액을 제거하고 PBS로 세척한 후 1N 수산화나트륨으로 녹여 500nm에서 흡광도를 측정한 후 하기 수학식 1에 따라 멜라닌 생성 억제율을 계산하였으며, 그 결과를 하기 표 6에 나타내었다.

[수학식 1]

멜라닌 생성 억제율(%) = 100 × (각 시험물질의 흡광도/대조군의 흡광도)

시험 물질	멜라닌 생성 억제율(%)
녹차 펩타이드	31.5
알부틴(Arbutin)	28.3

상기 표 6의 결과로부터 녹차 펩타이드를 사용 시, 미백 효과가 매우 우수한 것으로 알려진 알부틴보다 멜라닌 생성 억제율이 높음을 알 수 있었다.

[제조예 1 및 비교제조예 1~3]

하기 표 7에 기재된 조성에 따라 제조예 1 및 비교제조예 1~3의 화장료를 제조하였다. 그 제조과정을 상세히 살펴보면, 원료 1~8을 혼합하고 70℃에서 용해하여 수상파트로 하였다. 한편, 원료 9~14를 70℃에서 용해하여 오일파트로 하였다. 오일파트를 상기 수상파트에 첨가하고 호모믹서(일본 Tokushu Kika 社)로 교반하여 1차 유화하고, 원료 15 및 16을 첨가하여 점증하였다. 기포를 제거한 후, 실온으로 냉각하여 제조예 1 및 비교제조예 1~3의 화장료를 제조하였다(단위: 중량%).

성분	제조예 1	비교제조예1	비교제조예2	비교제조예3
1. 정제수	잔량	잔량	잔량	잔량
2. 글리세린	3.0	3.0	3.0	3.0
3. 부틸렌 글라이콜	5.0	5.0	5.0	5.0
4. 베타 글루칸	5.0	5.0	5.0	5.0
5. 히아루론산 추출물	3.0	3.0	3.0	3.0
6. 카보머	0.1	0.1	0.1	0.1
7. 녹차펩타이드	3	-	-	0.05
8. 알부틴	-	-	3	-
9. 카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드	8.0	8.0	8.0	8.0
10. 하이드로지네이티드 폴리데센	5.0	5.0	5.0	5.0
11. 세테아릴 글루코사이드	1.5	1.5	1.5	1.5
12. 소르비탄 스테아레이트	0.4	0.4	0.4	0.4
13. 세테아릴 알코올	1.0	1.0	1.0	1.0
14. 방부제	적량	적량	적량	적량
15. 향	적량	적량	적량	적량
16. 트리에탄올 아민	0.1	0.1	0.1	0.1

[시험예 5] 인체 피부에 대한 미백 효과

인체 피부에 대한 미백 효과와 피부 자극성을 알아보기 위하여, 평균연령 32.8세의 건강한 30명의 남성 및 여성을 대상으로 피검자의 윗팔뚝 부위에 직경 1.5 cm의 구멍 6개가 뚫린 불투명 테이프를 부착한 뒤, 각 피검자의 최소 홍반량(Minimal Erythema Dose)의 1.5~2배 정도의 자외선(UVB)을 조사하여 피부의 흑화를 유도하고, 시험물질들을 도포하여 두 달 후에 색차계를 이용하여 피부의 명암을 측정하였다. 이들 피검자들에게 상기 제조예 1 및 비교제조예 1~3의 화장료를 아침, 저녁 2회씩 매일 바르게 하였다.

효과의 판정은 피부의 명암을 나타내는 "L"값을 구하여 결정하였다. 참고로, 인위적으로 태우지 않은 한국인 피부색은 일반적으로 50-70의 값을 나타낸다. 색차계(미놀타 CR2002)를 사용하여 피부의 흑백 정도를 측정하여 효과를 판정하였다. 색을 표시하는 데에는 L*a*b* 표색계를 사용하나, 본 발명에서는 주로 L* 값(명도)을 지표로 하였다. L* 값은 표준 백판으로 교정하며, 측정은 1개 부위에 5회 이상 측정을 되풀이함으로써 색소 침착부를 균등하게 측정하였다. 도포 시작시점과 완료시점에서의 피부색의 차이(△L*)를 하기 수학식 2에 따라 계산하였고, 이를 하기 표 3에 나타내었다. 미백효과는 시료 도포 부위와 대조군 부위의 △L*의 비교로 판정하는데, △L* 값이 2 정도일 경우는 침착된 색소의 미백화가 뚜렷한 경우이고, 1.5정도 이상이면 미백효과가 있다고 판정할 수 있다.

[수학식 2]

ㅿL* = 도포 개시 두 달 후의 L* 값 - 도포 개시할 때 L* 값

시험물질을 도포하여 효과가 있는 경우는 L값이 점차 증가하게 되며 시험물질들 사이의 비교는 도포 개시시점과 완료시점(도포개시 두 달 후)에서의 피부색의 차이(△L)를 상기 수학식 2에 따라 계산하였고, 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.

[시험예 6] 인체 피부에 대한 피부 자극감 조사

상기 시험예 5의 피검자들을 대상으로 제조예 1 및 비교제조예 1~3의 화장료를 두 달 동안 사용하도록 한 후 피부 자극감을 비교하였다. 이때, 판단 기준은 피검자들이 자극감의 정도에 따라 점수를 1~5까지 부여하여 비교한 것으로, 1에 가까울수록 자극이 없고, 5에 가까울 수록 자극이 많은 것을 의미하며, 각각의 평균점수를 하기 표 8에 나타내었다.

시험물질	미백 효과(ΔL)	피부 자극감
제조예 1	2.58	0.95
비교제조예 1	0.02	1.14
비교제조예 2	2.12	2.3
비교제조예 3	0.09	1.19

상기 표 8의 결과에서 알 수 있듯이, 본 발명에 의한 녹차 펩타이드를 함유하는 제조예 1의 화장료에서 비교제조예 1~3 보다 미백 효과가 우수한 동시에 피부 자극이 낮아지는 것을 확인할 수 있었다.

[시험예 7] 피부 보습 효능 실험

1회 도포 시 피부 보습지속력을 알아보기 위하여, 건조를 호소하거나, 건성 피부라고 생각되는 30~40대 성인 남녀 50명에게 제조예 1 및 비교제조예 1의 화장료 조성물을 얼굴 및 전박 내측에 도포하도록 한 후, 24시간 동안 코니오미터(corneometer; CM820 courage Khazaka electronic GmbH, Germany)를 이용하여 피부 수분량을 측정하였다. 코니오미터는 피부의 표피내에 존재하는 수분의 양을 센서를 이용하여 수분의 이온정도를 측정하고 이를 수치화하여 수분의 양을 계산함으로써 보습력을 측정하는 것이며, 측정방법은 하기와 같다.

1) 측정하고자 하는 피부 부위에 코니오미터 프로브를 올려놓았다.

2) 프로브를 피부에 누르면 센서를 통하여 피부의 전기 전도도(capacitance)를 수치화하여 화면에 표시되었다.

3) 측정부위를 달리하여, 측정을 반복하였다.

4) 한번 측정 후, 킴와이프 같은 휴지로 센서를 닦은 후, 다시 측정하였다.

상기 방법으로 미리 도포 시작 전 항온, 항습 조건(24℃, 습도 40%)에서 코니오미터를 이용하여 피부 수분량을 측정하여 기본 값으로 삼고, 12시간, 24시간 경과 후의 변화를 측정하였다. 그 결과는 하기 표 9에 나타내었다.

	피부 수분량(%)
시료	도포 전	12시간 후	24시간 후
제조예 1	17.6	26.8	25.9
비교제조예 1	18.1	24.7	17.4

상기 표 9의 결과에서, 비교제조예 1을 도포한 경우는 도포 후 12시간 경과 후에는 피부 수분량이 어느 정도 증가하였지만, 24시간 경과 후에는 도포 전의 상태로 되돌아감을 알 수 있다. 반면, 녹차 펩타이드를 함유하는 피부 외용제 조성물인 제조예 1을 피부에 도포할 경우, 그 보습력이 24시간 이상 지속되고 피부 수분 함량 증가 효과 또한 비교 제조예 1에 비하여 현저하게 높음을 확인할 수 있었다.

[시험예 8] 피부 건조증 개선 효과에 대한 평가

상기 시험예 7을 종료한 시점에 시험 대상자에 대하여 제조예 1 및 비교제조예 1을 사용하고 난 후의 피부 건조증 개선 효과에 대한 설문조사를 통하여 주관적인 효능 평가를 시행하였다. 설문조사는 피부 건조함 개선 효과 정도에 대하여 만족도를 매우 양호, 양호, 보통 및 미흡으로 구분하여 표시하도록 하였으며, 그 결과를 하기 표 10에 나타내었다.

	시료 응답자 수
	매우 양호	양호	보통	미흡
제조예 1	16	26	5	3
비교제조예 1	5	18	20	7

상기 표 10의 결과에서, 비교제조예 1 경우보다 본 발명에 의한 녹차 펩타이드를 함유하는 피부 외용제 조성물인 제조예 1의 경우가 피부 건조증 개선 효과가 우수함을 알 수 있다.

[시험예 9] 피부 탄력 향상 효능 확인

사람에서의 피부 탄력 향상 효과를 확인하기 위하여 상기 제조예 1과 비교제조예 1 및 2의 제형으로 다음과 같이 평가하였다.

30~40대의 건강한 여성 110명을 각각 제조예 1 과 비교제조예 1 및 2의 3개 군에 대해 10명씩 11조로 나누어 제조예 1와 비교제조예 1 및 3을 매일 1회씩 12주간 안면 왼쪽에 도포하게 한 후, 피부탄력 측정기(Cutometer SEM 575, C+K Electronic Co., Germany)를 이용하여 피부탄력을 측정하였다. 그 결과는 하기 표 11에 나타내었다. 표 11의 결과값은 Cutometer SEM 575의 ΔR8(R8(왼쪽)-R8(오른쪽)) 값으로 기재하였는데, R8 값은 피부 점탄성(viscoelasticity)의 성질을 나타낸다.

실험제품	피부탄력효과
제조예 1	0.31
비교제조예 1	0.09
비교제조예 2	0.11

상기 표 11에 나타난 바와 같이, 본 발명의 녹차 펩타이드를 함유된 제조예 1는 비교제조예 1 및 2를 도포한 군에 비하여 피부 탄력성이 더 증가되었다. 따라서, 본 발명의 녹차 펩타이드를 함유하는 조성물은 피부 탄력 향상에 매우 효과적임을 확인할 수 있다.

[시험예 10] 피부 주름 개선 효능 확인

본 발명의 조성물에 의한 사람에서의 주름 개선 효과를 확인하기 위하여 상기 제조예 1 과 비교제조예 1 및 3을 이용하였다.

상기 제조예 1 과 비교제조예 1 및 3의 주름 개선 효과를 확인하기 위하여 다음과 같이 평가하였다. 40대의 건강한 여성 110명을 각각 제조예 1 과 비교제조예 1 및 3의 3개 군에 대해 10명씩 11조로 나누어 제조예 1과 비교제조예 1 및 3의 제형을 매일 1회씩 12주간 안면에 도포하게 한 후, 실리콘을 이용하여 레플리카를 떠서 주름의 상태를 피부측정기(visiometer, SV600, Courage+Khazaka electronic GmbH, Germany)로 측정하여 화상 분석하였다. 그 결과는 하기 표 12에 나타내었다. 하기 표 12의 값은, 도포 12주 후의 각각의 변수(parameter)값에서 도포 전 변수값을 뺀 것의 평균을 나타낸 것이다.

사용 8주 후

임상 결과	R1	R2	R3	R4	R5
제조예 1	-16.3	-12.59	-8.6	-4.27	-3.13
비교제조예 1	0.19	0.03	0.01	-0.84	0.26
비교제조예 3	-3.7	-3.6	-0.08	-2.31	-0.97

R1: 주름 등고선의 최고치와 최저치의 차이값

R2: 주름 등고선을 임의로 5칸씩 나눈 후 그 중 R1값 들의 평균

R3: 5개씩 나눈 R1값 중 최고 값

R4: 주름 등고선의 베이스라인(baseline)에서 각 각의 꼭대기와 계곡의 값을 뺀 평균값

R5: 주름 등고선의 베이스라인(baseline)에서 각 각의 주름 윤곽을 뺀 값의 차이 값

상기 표 12에서 나타낸 바와 같이, 제조예 1의 피부 외용제 조성물은 피부 주름 개선 효과가 아주 우수함을 알 수 있었다.

<110> AMOREPACIFIC CORPORATION <120> PEPTIDE EXTRACTED FROM CAMELLIA SINENSIS, METHOD FOR PRODUCING THE SAME AND COMPOSITION CONTAINING THE SAME <130> 12P245/IND <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 6 <212> PRT <213> Camellia sinensis <400> 1 Thr Asn Thr Leu Ser Asn 1 5

Claims (15)

1. Thr-Asn-Thr-Leu-Ser-Asn의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드.
2. 제 1항에 있어서,
   상기 펩타이드는 녹차에서 추출된 것인 펩타이드.
3. 제 1항에 있어서,
   상기 펩타이드는 피부 항노화 효능을 가지는 것인 펩타이드.
4. 제 1항에 있어서,
   상기 펩타이드는 피부 미백 효능을 가지는 것인 펩타이드.
5. 제 1항에 있어서,
   상기 펩타이드는 피부 보습 효능을 가지는 것인 펩타이드.
6. 녹차에 물을 가하여 추출한 수용성 성분에 알코올을 첨가하여 침전물을 침전시키는 단계를 포함하는 녹차 추출물의 제조방법.
7. 제 6항에 있어서,
   상기 녹차 추출물은 Thr-Asn-Thr-Leu-Ser-Asn의 아미노산 서열을 가지는 펩타이드를 포함하는 것인 녹차 추출물의 제조방법.
8. 제 6항에 있어서,
   상기 제조방법은,
   녹차에 물을 가하여 수용성 성분을 추출하고 분리하는 단계;
   상기 수용성 성분에 알코올을 첨가하여 폴리페놀 및 클로로필을 제거하고 침전물을 얻는 단계; 및
   상기 침전물을 건조하는 단계;를 포함하는 것인 녹차 추출물의 제조방법.
9. 제 8항에 있어서,
   상기 건조는 30 내지 40℃에서 열풍 건조하는 것인 녹차 추출물의 제조방법.
10. 제 6항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 녹차 추출물은 피부 항노화, 피부 미백 및 피부 보습 효능 중 하나 이상을 가지는 것인 녹차 추출물의 제조방법.
11. 상기 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 피부 외용제 조성물.
12. 상기 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 화장료 조성물.
13. 상기 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항의 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 약학 조성물.
14. 제 11항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 펩타이드는 조성물 총 중량에 대하여 0.01 내지 20중량%로 함유되는 것인 조성물.
15. 제 11항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 조성물은 피부 항노화, 피부 미백 또는 피부 보습용인 조성물.

Images