KR102464344B1

KR102464344B1 - 연어 유래 프로테오글리칸을 유효성분으로 포함하는 dtc 유전자 개인 맞춤형 색소 침착 방지용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102464344B1
Application number: KR1020220016331A
Authority: KR
Inventors: 김지은; 심현우; 이정노; 박성민; 김은석; 이태현
Original assignee: 주식회사 코씨드바이오팜; 상하이 산전 바이오로지칼 알앤디 코퍼레이션
Priority date: 2022-02-08
Filing date: 2022-02-08
Publication date: 2022-11-04

Abstract

본 발명은 개인 유전자 특성으로 인해 발생할 수 있는 색소침착을 방지하는 데 도움을 주는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로는 OCA2 및 MC1R 유전자에 의해 발현되는 색소 침착을 일으키는 단백질의 생성을 저해하고, 멜라닌 합성을 억제하는 연어 유래 프로테오글리칸을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 화장료 조성물은 연어 유래 프로테오글리칸을 포함하여 개인 유전자 특성으로 인해 발생할 수 있는 색소 침착을 예방하고, 멜라닌 합성을 억제하여 색소 침착을 효과적으로 개선할 수 있다.

Description

연어 유래 프로테오글리칸을 유효성분으로 포함하는 DTC 유전자 개인 맞춤형 색소 침착 방지용 화장료 조성물{Cosmetic Composition for Prohibiting Skin Pigmentation by Personal DTC Gene Comprising Proteoglycan From Salmon as Active Ingredient}

본 발명은 개인 유전자 특성으로 인해 발생할 수 있는 색소 침착을 방지하는 데 도움을 주는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 OCA2 및 MC1R 유전자에 의해 유전적으로 발생할 수 있는 색소 침착을 억제하고 피부 미백에 효과적인 연어 유래 프로테오글리칸을 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물에 관한 것이다.

최근 개성을 중시하는 소비 트렌드의 확산으로 맞춤형에 대한 소비자의 관심과 수요가 증가하고 있다. 현대 소비문화는 대중의 니즈에 휩쓸리던 시대를 지나 개인의 개성과 가치에 따라 자신만의 취향을 추구하는 시대로 접어들고 있다. 이에 따라 산업 전반에서 ‘맞춤형 제품’을 겨냥한 다양한 제품과 마케팅이 쏟아져나오고 있다.

이러한 소비트렌드에 따라 화장품 업계에도 맞춤형 화장품 시장이 형성되고 있다. 맞춤형 화장품은 소비자의 피부 상태를 진단하고, 소비자의 요구사항에 맞추어 제품을 생산 판매하는 형태이며, 2018년 3월에 화장품법이 개정됨에 따라 그 범위가 더 명확해졌다. 또한 맞춤형화장품 업무에 종사하는 맞춤형화장품 조제관리사 제도를 도입함에 따라 소비자의 관심과 니즈가 더욱 증가하는 추세이다.

보건복지부에서 2016년부터 국민의 보건과 건강을 위해 유전형에 따라 생활 습관 개선 등에 도움을 주고자 12개 항목에 대한 DTC (Direct to Customer) 검사를 허용해 왔다. 표 1은 DTC 검사 항목 및 유전자명을 나타낸다.

번호	검사항목(유전자수)	유전자명
1	체질량지수(3)	FTO, MC4R, BDNF
2	중성지방농도(8)	GCKR,DOCK7, ANGPTL3, BAZ1B, TBL2,MLXIPL, LOC108375745, TRIB1
3	콜레스테롤(8)	CELSR2, SORT1, HMGCR, ABO, ABCA1, MYL2, LIPG, CETP
4	혈당(8)	CDKN2A/B, G6PC2, GCK, GCKR, GLIS3, MTNR1B, DGKB-TMEM195, SLC30A8
5	혈압(8)	NPR3, ATP2B1, NT5C2, CSK, HECTD4, GUCY1A3, CYP17A1, FGF5
6	색소침착(2)	OCA2, MC1R
7	탈모(3)	chr20p11, IL2RA, HLA-DQB1
8	모발굵기(1)	EDAR
9	피부노화(1)	AGER
10	피부탄력(1)	MMP1
11	비타민C농도(1)	SLC23A1
12	카페인대사(2)	AHR, CYP1A1-CYP1A2

DTC 유전자 검사는 의료기관이 아닌 유전자 검사기관이 소비자가 보낸 검체를 수집하여 분석하는 것을 의미한다. 단순히 분석에 그치지 않고 검사 결과에 따른 맞춤형 라이프 스타일을 제공함에 따라 소비자의 관심이 증가하고 있다. 최근 검사 허용 항목이 최대 70 항목까지 확대됨에 따라 소비자의 관심은 더욱 증가할 것으로 예측된다.

따라서 화장품 업계에서도 주름, 미백, 모발, 비만 등에 맞춤형 화장품을 제공하고 있으나, 유전자의 발현, 변형 등의 문제점을 해결하기 위한 수단은 전무한 실정이다. DTC 유전자 검사항목 중 화장품에 적용할 수 있는 항목은 색소침착, 탈모, 모발굵기, 노화 등이 있으며, 색소 침착과 관련된 유전자로는 OCA2 및 MC1R이 검사항목에 있다.

현재의 색소 침착 방지 화장품은 멜라닌의 생성 기전에 있어 주요한 역할을 하는 타이로시나제의 활성 저해, 타이로시나제 mRNA 발현 저해, DOPA 산화 활성 저해, 또는 세포의 멜라닌 생성 저해 정도를 시험하는 데에 한정되어 있다.

따라서 개인 DTC 유전자에 따른 맞춤형 화장품을 개발을 위해서는 단순 멜라닌의 생성이나 멜라닌의 생성 기전에 관여하는 인자들의 활성 조절 소재에 한정하지 않고 유전자 수준에서의 조절을 통한 소재 개발이 필요하다.

색소 침착과 관련된 유전자 중 OCA2(oculocutaneous albinism Ⅱ) 유전자는 티로신(tyrosine)의 수송에 관여하는 막 단백질로서, OCA2 유전자 발현 이상 및 변이가 있는 경우, 멜라닌이 정상적으로 생성되지 않아 백색증을 유발한다. MC1R(melanocortin-1 receptor)은 두 가지 멜라닌 색소인 phaeomelanin(붉은색 또는 황색)과 eumelanin(검정색 또는 갈색)의 발현에 중요한 역할을 하는 호르몬 수용체이다. MC1R 유전자 발현 이상 및 변이가 있는 경우, 흑색종 피부암 발생 위험을 크게 증가시키는 것으로 알려져 있다. 이와 같이 개인 색소침착 유전자인 OCA2 및 MC1R의 변형이나 이상 발현을 통해 멜라닌 합성 조절에 이상을 일으켜 피부의 색 또는 염증에 결정적인 영항을 미친다.

현재의 맞춤형 화장품은 소비자의 피부 측정이나 피부상태, 개인의 라이프스타일 등을 파악하여 피부 상태에 적합한 화장품을 제공하는 것을 의미한다. 일반적으로 정해져 있는 기본 제형에 제형의 변화가 없는 범위 내에서 소비자가 원하는 특정 성분을 혼합하여 제공된다. 개개인에 맞춘 다양한 화장품을 제조하기 위해서는 각 특성에 맞는 다양한 원료가 필요하다. 하지만 현재는 다양한 원료가 출시되어 있지 않기 때문에 일반적으로 알려진 특정 기능성 화장품 원료만을 혼합하는 실정이다.

한국등록특허 제10-1777368호는 월계화 추출물을 유효성분으로 포함하고, 타이로시나아제 유전자 발현을 억제하여 뛰어난 색소 침착 저해 효과를 나타내는 피부 미백용 화장료 조성물을 개시한다.

한국공개특허 제10-2010-0106029호는 알파-시뉴클레인 유전자의 발현 또는 작용을 억제하는 물질을 포함하는 피부 미백용 조성물을 개시한다.

이에 본 발명에서는 개인 특성에 따른 유전자의 변형이나 발현을 조절하여 피부의 색소 침착을 억제할 수 있는 피부 미백용 화장료 조성물을 제공하고자 한다. 본 발명은 유전자 정보, 즉 DTC 유전자 연구를 통해 각 개인에 맞는 개인 맞춤형 색소 침착 방지용 화장료 조성물을 제공하고자 한다. 따라서, 본 발명은 개인 유전 특성에 따른 유전자의 문제로 야기되는 피부 문제를 해결하는 데 발판이 될 수 있을 것이다.

본 발명의 목적은, DTC유전자 검사 항목 중 색소 침착에 관련된 OCA2 및 MC1R 유전자에 의해 발현되는 단백질의 생성을 억제하여 개인 피부 특성에 맞는 소재를 개발하는 것으로, 개인이 유전자 검사를 통해 발현 이상이나 유전자의 변형으로부터 야기되는 문제를 해결할 수 있다. 따라서, 개인의 유전자 검사를 통해 개별 유전자의 이상으로 야기되는 피부 문제의 해결책으로서 우선적으로 사용할 수 있다. 본 발명에서는 연어 유래 프로테오글리칸을 개발하고 이를 적용한 화장료 조성물을 제공하는 데 목적이 있다.

또한, 본 발명은 OCA2 및 MC1R 유전자에 의해 발현되는 단백질의 생성을 억제하는 연어 유래 프로테오글리칸의 제조 방법을 제공하고자 한다.

상기한 과제는, 연어 유래 프로테오글리칸을 유효성분으로 포함하고, 개인 유전자 특성에 의해 유발되는 색소 침착을 방지하는 피부 미백용 화장료 조성물에 의해 달성된다.

바람직하게는, 상기 연어 유래 프로테오글리칸은, 연어의 코연골에 정제수를 첨가하여 열수추출하는 단계; 상기 열수추출액에 효소 반응을 통해 가수분해하는 단계; 상기 가수분해물에 에탄올을 투입하여 침전된 당단백질을 회수하는 단계; 상기에서 얻어진 당단백질을 동결건조하여 분말화하는 단계; 상기 분말에 대해 크기 배제 크로마토그래피를 수행하여 분획을 수득하는 단계; 및 상기 분획을 동결건조하여 연어 유래 프로테오글리칸 분말을 수득하는 단계를 포함하는 방법으로 제조될 수 있다.

또한 바람직하게는, 상기 연어 유래 프로테오글리칸은 OCA2 및 MC1R 유전자에 의해 발현되어 색소 침착을 촉진하는 단백질의 생성을 효과적으로 억제할 수 있다.

또한 바람직하게는, 상기 연어 유래 프로테오글리칸은 멜라닌 합성 억제 효과를 나타낸다.

또한 바람직하게는, 상기 연어 유래 프로테오글리칸은 화장료 조성물 총 중량 대비 0.1 내지 30.0 중량%로 함유될 수 있다.

또한 바람직하게는, 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형으로 이루어진 군에서 선택된 기초화장료 제형; 마스크팩용 제형; 바디워시용 제형; 필링젤; 수중유형 또는 유중수형 메이크업베이스; 파운데이션; 스킨커버; 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우 펜슬로 이루어진 군에서 선택된 색조화장료 제형; 또는 두피용 제형일 수 있다.

본 발명에 따른 연어 유래 프로테오글리칸을 유효성분으로 포함하는 화장료 조성물은 DTC 유전자 검사 항목 중 색소 침착에 관련된 OCA2 및 MC1R 유전자에 의해 발현되는 단백질의 생성을 효과적으로 억제하여 개인 유전자에 의해 발생하는 피부 색소 침착을 완화하는 데 우수한 효과를 나타낸다.

도 1은 본 발명의 연어 유래 프로테오글리칸의 입도 분포 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 비교예 1의 기존에 식품 원료로 사용되고 있는 연어 유래 프로테오글리칸의 입도 분포 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 연어 유래 프로테오글리칸의 OCA2 유전자에 의해 발현되는 단백질 생성의 억제 효과를 도시한 것이다.
도 4는 본 발명의 연어 유래 프로테오글리칸의 MC1R 유전자에 의해 발현되는 단백질 생성의 억제 효과를 도시한 것이다.
도 5는 OCA2 및 MC1R 유전자에 의해 증가될 수 있는 멜라닌 생성률이 본 발명에 따른 연어 유래 프로테오글리칸에 의해 억제되는 것을 도시한 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 하기의 정의를 가지며 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미에 부합된다. 또한, 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.

용어 "약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이라는 말은 제시된 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

본 발명은 연어 유래 프로테오글리칸을 유효성분으로 포함하는 DTC 유전자 개인 맞춤형 색소 침착 방지용 화장료 조성물에 관한 것이다.

프로테오글리칸(Proteoglycan)은 코어단백질과 Glycosaminoglycan 당사슬이 줄기, 가지와 같은 일정 양식으로 결합하고 있는 분자의 총칭이다. 인간을 포함하는 모든 동물의 연골과 피부 등에 풍부하게 존재하는 것으로 알려져 있다. 프로테오글리칸은 콜라겐 및 히알루론산과 더불어 인체 내의 세포와 세포를 결합시켜 주고, 세포에 영양분을 공급해주는 역할을 하여 차세대 미용 소재로 각광받고 있는 소재이다.

본 발명의 일 실시예에 따르면, 프로테오글리칸은 아래의 단계를 포함하는 방법에 의하여 제조될 수 잇다:

(a) 연어의 코연골에 정제수를 첨가하여 50~100℃의 온도에서 2~5시간 동안 열수추출하는 단계; (b) 상기 (a) 단계에서 얻어진 열수추출액에 효소 반응을 통해 가수분해물을 제조하는 단계; (c) 상기 (b) 단계에서 얻어진 가수분해물에 95 %(v/v) 에탄올을 투입하여 침전된 당단백질을 회수하는 단계; (d) 상기 (c) 단계에서 얻어진 침전물(당단백질)을 건조하여 분말화하는 단계; (e) 상기 (d) 단계에서 얻어진 분말에 대해 크기 배제 크로마토그래피를 수행하여 분획을 수득하는 단계; 및 (f) 상기 (e) 단계에서 얻어진 분획을 건조하여 연어 유래 프로테오글리칸 분말을 얻는 단계를 포함하는 방법으로 제조한다.

본 발명에 있어서, 상기 연어 유래 프로테오글리칸은 연어 코연골에 정제수를 가한 후, 50~100℃의 온도에서 2~5시간 동안 열수추출함으로써 제조되는 것을 특징으로 할 수 있다.

이어서 상기 열수추출액에 가수분해 효소를 처리하여 40~50℃의 온도에서 가수분해시킴으로써 제조되는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 가수분해 효소는 식품 등급의 산성 단백질 분해 효소, 중성 단백질 분해 효소 중에 단일 혹은 혼합물을 이용하여 제조될 수 있다. 바람직하게는 알칼라제(Alcalase), 펩신(Pepsin), 트립신(Trypsin), 브로멜라인(Bromelain) 및 파파인(Papain)으로 이루어지는 군으로부터 선택된 적어도 하나 이상의 효소를 가하여 반응시키는 것을 특징으로 할 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 온도 조건에서, 상기 가수분해 효소로 상기 열수추출액을 가수분해시키면, 단당류, 아미노산 등의 단량체, 또는 다당류, 폴리펩타이드, 또는 더 작은 단위의 당단백질 등이 가수분해물로 생성될 수 있다.

또한, 크기 배제 크로마토그래피는 용해된 분자를 미세다공성 충전제가 담긴 컬럼을 통과시키면서 분자의 크기별로 분리하는 크로마토그래피 기술이다. 분자량이 큰 물질은 먼저 용출되고, 작은 분자량의 물질은 느리게 용출되는 특징이 있다. 따라서, 크기 배제 크로마토그래피를 수행함으로써 저분자 물질을 수득할 수 있으며, 크기 분포가 일정한 시료를 수득할 수 있다. 크기 배제 크로마토그래피를 통해 정제함으로서 피부 흡수율 및 제형 안정성이 우수한 물질을 얻을 수 있는 효과가 있다. 바람직하게는, 본 발명에 따른 방법으로 제조된 연어 유래 프로테오글리칸은 입도 크기가 5,000 nm 이하일 수 있고, 바람직하게는 3,000 nm 이하이다.

또한, 상기 연어 유래 프로테오글리칸은 OCA2 및 MC1R 유전자에 의해 발현되는 단백질의 생성을 효과적으로 억제하며, 멜라닌 합성 억제 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 DTC 유전자 개인 맞춤형 색소 침착 방지용 화장료 조성물이다.

또한, 상기 연어 유래 프로테오글리칸은 화장료 조성물 총 중량 대비 0.01 내지 30.0 중량% 함유될 수 있다. 바람직하게는, 화장료 조성물 총 중량 대비 0.1 내지 10.0 중량% 함유되는 것이 좋다. 상기 연어 유래 프로테오글리칸의 함량이 0.01 중량% 미만인 경우에는 효과가 미미하며, 30.0 중량%를 초과하는 경우에는 함유량 증가에 대한 효과 증대 정도가 미미하고, 제형상의 안전 및 안정성에 문제가 있으며, 경제적이지 않다.

한편, 본 발명의 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 일예로, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형 중 선택되는 어느 하나의 기초 화장료 제형; 스킨; 로션; 아이크림; 수딩젤; 연고; 마스크팩용 제형; 바디워시용 제형; 필링젤; 수중유형 및 유중수형 메이크업베이스; 파운데이션; 스킨커버; 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우 펜슬류 중 선택되는 어느 하나의 색조화장료 제형; 두피용 제형; 중에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 화장 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제 예컨대 친수성 또는 친유성 활성제, 보존제, 항산화제, 용매, 방향제, 충전제, 차단제, 안료, 흡취제, 염료, 컨디셔닝제 등을 함유할 수 있다. 이들 다양한 보조제의 양은 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 양이며 다만, 어떠한 경우라도 보조제 및 그 비율은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 악영향을 미치지 않도록 선택될 것이다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복하여 사용할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다.

한편, 하기 실험예에 의하면 상기 본 발명의 연어 유래 프로테오글리칸은 효과적으로 OCA2 및 MC1R 유전자에 의해 발현되는 단백질의 생성을 억제하고, 멜라닌 합성을 억제하여 색소 침착 방지에 도움을 주는 것을 확인하였다.

이하, 본 발명에 대해 하기 실시예에서 더욱 상세히 설명하고자 한다. 다만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 한정되는 것은 아니고, 그와 등가의 기술적 사상의 변형까지를 포함한다.

실시예 1: 연어 유래 프로테오글리칸 제조

연어 코연골에 중량 대비 10배의 정제수를 첨가한 후 냉각 콘덴서가 부착된 추출기에서 80℃의 온도로 3시간 동안 가열하여 추출하였다. 상기 열수추출액을 40~45 ℃ 의 온도로 유지하고, pH 7~9로 조절하여 알칼라제와 트립신을 1:1로 혼합한 효소를 상기 열수추출액 중량의 1% 투입하였다. 6시간 동안 교반하여 효소 반응시키고, 400 메쉬 여과포로 여과하였다. 95 %(v/v) 에탄올을 상기 여과액의 동량 부피만큼 넣어 4℃ 온도의 냉장실에서 24시간 동안 보관하였다. 원심분리를 통해 상등액을 버리고 침전물만 회수한 후, 동결건조하여 분말화하였다. 그 후, 정제수를 이동상으로 하여 크기 배제 크로마토그래피를 수행하였으며, 3개의 분획(PG-S-1 ~ PG-S-3)으로 나누었다. PG-S-3 분획을 동결건조하여 실시예 1의 연어 유래 프로테오글리칸을 수득하였다.

비교예 1: 식품 원료로써의 연어 유래 프로테오글리칸

기존에 식품 원료로서 판매 중인 연어 유래 프로테오글리칸을 구입하여 비교예 1로 하였다.

실험예 1: 입도 분포 분석

상기 실시예 1에서 수득한 연어 유래 프로테오글리칸과 상기 비교예 1의 식품 원료로써의 연어 유래 프로테오글리칸의 입도 분포 측정을 실시하였다. 각 시료를 1 wt%의 농도로 정제수에 용해한 후, 입도분석기(ELSZ 2000ZS, Otsuka 社)를 사용하여 입도 분포를 측정한 결과를 하기 도 1 및 도 2에 나타내었다. 도 1에 도시된 바와 같이, 실시예 1의 연어 유래 프로테오글리칸은 2860.1 nm의 입도 크기와 0.415의 Polydispersity Index(P.I.) 값을 나타내었다. 도 2에 도시된 바와 같이, 비교예 1의 연어 유래 프로테오글리칸은 입도 크기 13118.2 nm 및 P.I. 값 1.158을 나타내었다. 상기 결과를 통해 실시예 1의 연어 유래 프로테오글리칸은 식품 원료로써 활용되고 있는 기존의 연어 유래 프로테오글리칸에 비해 저분자이며, P.I. 값이 더 낮아 단분산의 분포를 나타냄을 확인하였다. 따라서, 실시예 1의 연어 유래 프로테오글리칸은 기존의 프로테오글리칸에 비해 더 높은 피부흡수율 및 제형 안정성을 나타낼 것으로 판단된다.

실험예 2: OCA2 유전자에 의해 발현되는 단백질 생성의 억제 효과

마우스 유래 멜라닌 형성(B16F10) 세포를 6 well plate에 3 x 10⁵ cells/well로 분주하고 37^oC, 5% CO₂ 세포 배양기에서 하루 동안 세포를 안정화시켰다. α-MSH을 처리하여 자극을 유발한 후 시료를 농도별로 처리하고 24 시간 동안 반응시킨 후 scraper를 이용하여 세포를 수집하였다. 1 x 세포 용해 버퍼(cell lysis buffer)를 이용하여 단백질을 분리하고 BCA assay로 단백질을 정량한 후 일정량의 단백질을 10% SDS-PAGE 겔에서 전기영동 시켰다. Gel상의 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인에 전이(transfer)시키고 5% 스킴밀크(skim milk)를 이용하여 1시간 동안 blocking하였다. 1 x TTBS 용액으로 3 회 세척하고 1차 항체(TRPV1)를 4^oC에서 오버나잇(over night) 반응시킨 후, HRP가 결합된 2차 항체를 실온에서 2 시간 동안 반응시켰다. 그 후, 1 x TTBS로 3 회 세척하고 ECL용액을 반응시켜 Chemi Doc 기기로 밴드를 검출하였다. 베타-액틴(β-actin)의 발현을 기준으로 정량하여 OCA2 발현 억제율을 계산하였으며 Image J 1.47 software를 이용하여 수치화하였다. 그 결과는 도 3에 나타내었다.

도 3에 도시되는 바와 같이 실시예 1의 연어 유래 프로테오글리칸은 1%의 농도부터 유의적으로 OCA2 발현을 억제하였으며, 최대 67%의 OCA2 발현을 억제하였다. 반면, 비교예 1의 프로테오글리칸은 3%의 농도까지 OCA2 발현 억제에 있어 유의미한 결과를 확인할 수 없었다.

실험예 3: MC1R 유전자에 의해 발현되는 단백질 생성의 억제 효과

마우스 유래 멜라닌 형성(B16F10) 세포를 6-well plate에 3 x 10⁵ cells/well로 분주하고 37^oC, 5% CO₂ 세포 배양기에서 하루 동안 세포를 안정화시켰다. α-MSH을 처리하여 자극을 유발한 후 시료를 농도별로 처리하고 24 시간 동안 반응시킨 후 스크래퍼(scraper)를 이용하여 세포를 수집하였다. 1 x 세포 용해 버퍼(cell lysis buffer)를 이용하여 단백질을 분리하고 BCA assay로 단백질을 정량한 후 일정량의 단백질을 10% SDS-PAGE 겔에서 전기영동 시켰다. Gel상의 분리된 단백질을 PVDF 멤브레인에 전이(transfer)시키고 5% 스킴밀크(skim milk)를 이용하여 1시간 동안 blocking하였다. 1 x TTBS 용액으로 3 회 세척하고 1차 항체(TRPV1)를 4^oC에서 오버나잇(over night) 반응시킨 후, HRP가 결합된 2차 항체를 실온에서 2 시간 동안 반응시켰다. 그 후, 1 x TTBS로 3 회 세척하고 ECL용액을 반응시켜 Chemi Doc 기기로 밴드를 검출하였다. 베타-액틴(β-actin)의 발현을 기준으로 정량하여 MC1R 발현 억제율을 계산하였으며 Image J 1.47 software를 이용하여 수치화하였다. 그 결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 도시되는 바와 같이 실시예 1의 연어 유래 프로테오글리칸은 0.3%의 농도부터 유의적으로 MC1R 발현을 억제하였으며, 최대 76%의 MC1R 발현을 억제하였다. 반면, 비교예 1의 프로테오글리칸은 3%의 농도까지 유의미한 MC1R 발현 억제 활성을 보이지 않았다.

실험예 4: 멜라닌 생성 억제 효과

마우스 유래 멜라닌 형성(B16F10) 세포를 96-well plate에 2.5x10³ cells/well로 분주한 후, 37℃, 5% CO₂ 세포 배양기에서 하루 동안 세포를 안정화시켰다. 시료를 농도별로 희석하여 처리하고 양성대조군으로는 미백제로 잘 알려진 알부틴을 처리하였다. 자극제로 α-melanocyte stimulating hormone(MSH)를 처리한 후 72시간 동안 반응시켰다. 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 이용하여 405 nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한, 세포생존율 분석을 위해 5 mg/ml 농도의 MTT 시약을 각 well에 20 ul씩 첨가하고 세포 배양기에서 1~2시간 동안 반응시켰다. 상층액을 모두 제거하고 DMSO 100 ul를 각 well에 첨가하여 세포를 완전히 용해시킨 후 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. untreated 세포에 대비하여 백분율로 계산하여 세포 독성을 확인하였다. 그 결과를 하기 도 5에 나타내었다.

도 5에 도시되는 바와 같이 실시예 1의 연어 유래 프로테오글리칸은 1%의 농도부터 유의적으로 멜라닌 생성을 감소시켰으며, 최대 65.4%의 멜라닌 생성을 감소시킴을 확인하였다. 반면, 비교예 1의 프로테오글리칸의 경우 유의미한 결과를 보이지 않았다.

제조예 1 : 피부 미백용 화장료 조성물 제조

상기 실시예 1의 연어 유래 프로테오글리칸을 1 중량% 포함하는 색소 침착 방지용 화장료 조성물은 하기 표의 조성으로 설명하나, 여러 가지 제형으로 응용 가능하다. 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 한다.

본 제형예의 화장료 조성물은 아래 표 2의 함량에 따라 화장료를 제조하였다.

구분	성분	제조예 1 (중량%)	비교제조예 1 (중량%)	비교제조예2 (중량%)
A	실시예 1	1.0	-	-
	비교예 1	-	1.0	-
	EDTA-2Na	0.02	0.02	0.02
	정제수	to 100	to 100	to 100
B	세토스테아릴알코올	2.0	2.0	2.0
	글리세릴스테아레이트	1.5	1.5	1.5
	마이크로크리스탈린	0.7	0.7	0.7
	스쿠알란	5.0	5.0	5.0
	유동파라핀	3.0	3.0	3.0
	트리옥타노인	5.0	5.0	5.0
	폴리솔베이트	1.2	1.2	1.2
	솔비탄스테아레이트	0.5	0.5	0.5
	토코페릴아세테이트	0.2	0.2	0.2
	사이클로메치콘	3.0	3.0	3.0
	BHT	0.05	0.05	0.05
C	향,방부제	적량	적량	적량
	합계	100	100	100

실험예 5 : 피부 미백용 화장료 조성물의 피부 미백 효능 분석

본 실험예에서는 연어 유래 프로테오글리칸을 유효성분으로 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물(제조예 1)과 비교예 1을 함유하는 화장료 조성물(비교제조예 1) 및 실시예 1 또는 비교예 1을 함유하지 않는 화장료 조성물(비교제조예 2)을 비교하여 연어 유래 프로테오글리칸의 피부 미백 효능을 알아보고자 하였다.

임상 실험을 위하여, MC1R 유전자의 발현율이 60% 이상인 피험자 30명을 무작위로 10명씩 3개 그룹(A, B 및 C)으로 나눈 후, A 그룹을 대상으로 제조예 1의 화장료 조성물을, B 그룹을 대상으로 비교제조예 1의 화장료 조성물을, C 그룹을 대상으로 비교제조예 2의 화장료 조성물을 각각 1일 2회씩 8주간 도포하였다. 이후, 피부색의 변화를 분광광도계(spectrophotometer, Minolta CM600-d)를 이용하여 색의 밝기 변화(ΔL)를 측정하고, 복수의 숙련자에 의한 객관적 육안관찰과 피검자에 의한 주관적 육안관찰을 실시하여 미백 효과를 측정하였다.

그 결과를 하기 표 3에 나타내었다. 이때, 미백 효능 정도를 다음의 미백 효능 평가 기준에 따라 분류하여 평가하였다.

<미백효능 평가 기준>

-3: 매우,악화, -2: 악화, -1: 약간 악화, 0: 변화 없음, 1: 약간 개선, 2: 개선, 3: 매우 개선

피검자	피부색의밝기변화(ΔL)			숙련자의 객관적 평가(ΔL)			피검자의 주관적 평가(ΔL)
피검자	A 그룹	B 그룹	C 그룹	A 그룹	B 그룹	C 그룹	A 그룹	B 그룹	C 그룹
1	3.1	0.3	0.2	2	1	0	2	1	0
2	2.7	0.6	0.1	1	1	1	1	0	1
3	3.2	0.3	0.5	3	1	0	2	0	0
4	3.9	0.7	0.2	1	0	0	1	1	0
5	3.7	0.2	0.7	2	1	1	2	1	1
6	3.1	0.4	0.3	1	0	1	1	0	1
7	2	0.5	0.2	2	1	0	2	1	1
8	3.4	0.1	0.1	1	0	0	1	1	0
9	2.8	0.2	0.1	2	0	0	0	0	1
10	3.4	0.5	0.3	1	0	0	1	1	0
평균	3.13	0.38	0.27	1.60	0.50	0.30	1.30	0.60	0.50

실험 결과, 연어 유래 프로테오글리칸을 포함하는 색소 침착 방지용 화장료 조성물을 도포한 A 그룹의 평균 ΔL 값은 3.13(p<0.05) 이었고, 비교제조예 1의 화장료 조성물을 도포한 B 그룹의 평균 ΔL 값은 0.38(p<0.05) 및 비교제조예 2의 화장료 조성물을 도포한 C 그룹의 평균 ΔL 값은 0.27(p<0.05)이었다.

한편, 숙련자에 의한 객관적 평가에서 A 그룹은 1.6, B 그룹은 0.5 및 C 그룹은 0.3이었으며, 피검자에 의한 주관적 평가에서는 A 그룹은 1.3, B 그룹은 0.6 및 C 그룹은 0.50으로 나타났다. 이를 통해, 본 발명의 연어 유래 프로테오글리칸을 유효성분으로 포함하는 색소 침착 방지용 화장료 조성물의 미백 효능이 우수한 것을 확인하였다.

이제까지 본 발명에 대한 구체적인 실시예들을 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

연어 유래 프로테오글리칸을 유효성분으로 포함하는 피부 미백용 화장료 조성물로서,
상기 연어 유래 프로테오글리칸은 OCA2 및 MC1R 유전자에 의해 발현되어 색소 침착을 촉진하는 단백질의 생성을 억제하여 색소 침착을 방지하고,
상기 연어 유래 프로테오글리칸은 입도 크기가 5,000 nm 이하인 것을 특징으로 하는, 피부 미백용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 연어 유래 프로테오글리칸은,
연어의 코연골에 정제수를 첨가하여 열수추출하는 단계;
상기 열수추출액에 효소 반응을 통해 가수분해하는 단계;
상기 가수분해물에 에탄올을 투입하여 침전된 당단백질을 회수하는 단계;
상기에서 얻어진 당단백질을 동결건조하여 분말화하는 단계;
상기 분말에 대해 크기 배제 크로마토그래피를 수행하여 분획을 수득하는 단계; 및
상기 분획을 동결건조하여 연어 유래 프로테오글리칸 분말을 수득하는 단계를 포함하는 방법으로 제조된 것인, 피부 미백용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 연어 유래 프로테오글리칸은 멜라닌 합성 억제 효과를 나타내는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 연어 유래 프로테오글리칸은 화장료 조성물 총 중량 대비 0.1 내지 30.0 중량%로 함유되는 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형으로 이루어진 군에서 선택된 기초화장료 제형; 마스크팩용 제형; 바디워시용 제형; 필링젤; 수중유형 또는 유중수형 메이크업베이스; 파운데이션; 스킨커버; 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우 펜슬로 이루어진 군에서 선택된 색조화장료 제형; 또는 두피용 제형인 것을 특징으로 하는 피부 미백용 화장료 조성물.
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