KR102303815B1 - 치아씨로부터 분리한 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 피부 장벽 강화 및 보습용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 치아씨 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 피부장벽 강화 및 피부 보습용 화장료 조성물에 관한 것이다. 상기 화장료 조성물은 프롤린, 라이신 및 하이드록시프롤린을 포함하고, 분자량이 500 Da 미만인 저분자량의 펩타이드를 함유하고, 피부섬유아세포 증식 효과, 콜라겐 합성 촉진 효과와 피부 보습 효과를 가진다.

Description

치아씨로부터 분리한 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 피부 장벽 강화 및 보습용 화장료 조성물{Cosmetic Composition For Enhancing Skin Barrier and moisture Containing Peptides from Chiaseed As Active Ingredient}

본 발명은 치아씨로부터 분리한 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 화장료용 조성물에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 치아씨 펩타이드를 화장료 조성물 총 중량 대비 0.1 내지 30.0 중량%를 함유하는 피부 장벽 강화 및 보습 강화 효과가 우수한 화장료 조성물에 관한 것이다.

피부는 물리적, 화학적 외부 자극으로부터 신체를 보호하는 중요한 역할을 하는 신체 기관이다. 피부의 구조는 표피, 진피, 피하조직의 3개의 층으로 나뉘며 그 중에서도 표피는 외부로부터 각질층, 과립층, 유극층, 기저층의 4개 층으로 구분되는데 각질층의 세포들은 벽돌과 같은 역할을 하고 있어 세포 사이에 존재하는 지질들이 몰타르와 같은 역할로 피부 장벽을 이루고 있다. 각질층은 체내로부터 수분 증발을 억제하고, 외부로부터 유해물질의 침입을 차단한다.

피부의 수분양은 70% 이상이 진피층에 존재하며 표피층으로 갈수록 감소하여 약 10% ~ 30%가 된다. 그러나 극심한 환경 변화와 불규칙한 생활 습관, 신체적 노화로 인해 표피의 수분양이 10% 이하가 되면 표면이 거칠게 되며 윤기를 잃어 칙칙하게 보이는 등의 현상이 발생하게 되면서 피부 보습에 관한 중요성이 점점 커지고 있다.

건강한 사람의 각질세포에는 고농도의 자연보습인자(Natural Moisturizing Factor, NMF)가 존재하며, 이는 피부의 수분 함유를 돕는 기능을 한다. 하지만, 피부의 이러한 기능에도 불구하고, 실내난방, 오염된 대기 및 자외선 등의 외부 환경에 의한 자극이나 마찰, 면도 및 세안 등의 물리화학적 자극으로 인해 피부 세포 성장이 저해됨으로써 불균형이 생겨 피부 장벽이 무너지게 된다. 이를 방지하기 위해 피부 장벽 강화 및 보습 강화의 필요성이 중요시되고 있으며, 이에 대한 효능을 세포수준에서 확인하기 위한 다양한 연구가 진행되고 있다.

피부는 탄력성을 지닌 고체의 성질과 점성을 가지는 유체의 성질을 동시에 지닌 복잡한 신체 기관으로 이런 피부의 기계적인 특성을 점탄성이라 한다. 피부의 점탄성은 주로 진피 층에서 일어나는데 이는 진피세포외 기질의 대부분을 차지하며 피부의 강도와 점탄성 유지에 중요한 역할을 하는 콜라겐 때문이다. 콜라겐은 피부 건조 중량의 75%를 차지하는 주요 구조 단백질로 진피층의 주세포인 섬유아세포(fibroblast)에서 생성된 후 세포외 기질로 분비되어 삼중 나선(triple helix) 구조를 통해 피부의 탄력성 유지 기능을 한다. 그러므로 콜라겐이 부족할 경우 피부는 탄력과 보습이 떨어지고 주름이 생기는 등 피부 노화가 나타난다.

체내 콜라겐은 20여 가지 유형으로 나누어지는데, 피부 진피에는 콜라겐 type Ⅰ가 80～85%, 콜라겐 type Ⅲ가 10～15%의 비율을 차지한다. 콜라겐 단백질에 다량 존재하는 주요 아미노산인 프롤린(proline)과 라이신(lysine)은 삼중 나선구조를 형성하여 피부 탄력을 유지시키는 기능을 하며, Gly-X-Y 형태의 아미노산 배열에 위치하는 규칙성에 의해 그 구조를 안정화시킨다. 이렇게 피부 구조에 영향을 주는 콜라겐 type Ⅰ과 Ⅲ의 합성은 콜라겐의 주요 구성 아미노산인 프롤린 또는 하이드록시프롤린과 라이신이 관여하는 것으로 생각되어진다.

피부의 세포 성장과 보습력을 적절하게 유지하는 것은 매우 중요하다. 이를 위하여 화장품에는 피지와 유사한 성분이나 NMF 성분, 또는 폴리올과 같은 보습제 등이 첨가되어 사용된다. 예를 들어, 수용성 폴리올로서 수산기(OH group)가 3개 이상인 글리세린, 솔리톨 등은 뛰어난 보습력을 나타내나 끈적임이 심하여 사용할 때 불쾌감을 느끼게 하며, 수산기가 2개인 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜 등은 피부의 부작용이 발생하기도 한다. 또한, 다른 천연보습인자인 피롤리돈 카르복실산 나트륨(PCA-Na), 젖산나트륨(Sodium lactate), 요소 등은 전해성이 강해 화장료의 유화안정성을 해치는 문제점이 있으며, 콜라겐, 엘라스틴 등도 보습능력이 있다고 하나 흡수력의 한계가 있어 피부 장벽을 강화하기 위한 천연 화장료 조성물에 대한 개발이 필요한 실정이다.

펩타이드를 포함하는 보습 효과를 갖는 조성물에 대한 선행문헌들이 공지되어 있다. 한국등록특허 제2149202호는 ZAG 단백질 유래 펩타이드를 포함하는 피부 건조증의 예방 또는 치료용 의약 조성물을 개시한다.

한국등록특허 제10-1074776호는 치아 씨앗 표면에 존재하는 단백다당체 층을 분리하여 폴리머를 제조하는 방법과 이를 함유하는 조성물을 개시한다. 상기 조성물은 보습효과 등을 갖는다.

본 발명은 치아씨로부터 분리한 펩타이드가 피부 섬유아세포 성장에 대한 생리활성이 뛰어나고 콜라겐 합성을 촉진하며, 피부 보습에 대한 효과를 확인함으로써 피부 장벽을 강화하고 보습 효과가 뛰어난 치아씨 펩타이드를 함유한 화장료 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 치아씨 펩타이드를 유효성분으로 함유하는 피부 장벽 강화 및 피부 보습용 화장료 조성물을 제공한다.

바람직하게는, 상기 치아씨 펩타이드는 분자량이 500 Da 미만인 저분자량 펩타이드를 포함할 수 있다.

또한 바람직하게는, 상기 치아씨 펩타이드는 프롤린, 라이신 및 하이드록시프롤린을 포함할 수 있다.

또한 바람직하게는, 상기 치아씨 펩타이드는 피부 섬유아세포 증식 효과 또는 콜라겐 합성 촉진 효과를 갖는다.

또한 바람직하게는, 상기 치아씨 펩타이드는 화장료 조성물 총 중량 대비 0.1 내지 30.0 중량%로 함유될 수 있다.

또한 바람직하게는, 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형으로 이루어진 군에서 선택된 기초화장료 제형; 마스크팩용 제형; 바디워시용 제형; 필링젤; 수중유형 또는 유중수형 메이크업베이스; 파운데이션; 스킨커버; 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우 펜슬로 이루어진 군에서 선택된 색조화장료 제형; 또는 두피용 제형일 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물은 치아씨로부터 분리된 프롤린, 하이드록시프롤린 및 라이신을 포함한 저분자 펩타이드를 포함하여, 피부 섬유아세포 증식 효과와 콜라겐 합성 촉진 효과가 우수하고 피부 보습 효과가 뛰어나고 피부 장벽 강화 효과가 우수하다.

도 1은 치아씨 펩타이드의 아미노산 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 치아씨 펩타이드의 아미노산 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 치아씨 펩타이드의 하이드록시프롤린 분석 결과를 나타낸 것이다.
도 4는 치아씨 펩타이드의 분자량을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 치아씨 펩타이드의 피부 섬유아세포 증식 효과를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 6은 치아씨 펩타이드의 콜라겐 합성 촉진 효과를 측정한 결과를 나타낸 것이다.

본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 하기의 정의를 가지며 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미에 부합된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다.

용어 "약"이라는 것은 참조 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이에 대해 30, 25, 20, 15, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1% 정도로 변하는 양, 수준, 값, 수, 빈도, 퍼센트, 치수, 크기, 양, 중량 또는 길이를 의미한다.

본 명세서를 통해, 문맥에서 달리 필요하지 않으면, "포함하다" 및 "포함하는"이란 말은 제시된 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군을 포함하나, 임의의 다른 단계 또는 구성요소, 또는 단계 또는 구성요소들의 군이 배제되지는 않음을 내포하는 것으로 이해하여야 한다.

본 발명은 치아씨에서 분리된 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부 장벽 개선 및 피부 보습용 화장료 조성물에 관한 것이다.

치아(chia, Salvia hispanica)는 멕시코 중남부와 과테말라에 자생하는 박하과에 속하는 현화식물의 종이다. 씨앗을 수확하기 위해 경작되며 남아메리카, 멕시코 서부, 미국 남서부 지역에서 수세기에 걸쳐 음식과 기능성 식품으로 흔히 쓰이고 있다. 치아씨는 친수성 성질을 갖고 있으며 약 12배의 수분을 흡수하는 능력이 있다. 치아씨 100 g당 영양성분을 살펴보면 탄수화물이 약 42 g, 지방 30 g, 단백질 16 g, 기타 미네랄 성분을 포함하고 있으며 리놀렌산과 같은 오메가 3 지방산이 약 25~30% 함유하고 있다. 또한 치아씨는 밀, 옥수수, 쌀, 귀리 등 다른 곡식과 달리 비교적 높은 함량의 단백질을 함유하고 있으며, 강력한 항염 효과가 있다고 알려져 있다.

본 발명에서 유효성분으로 포함된다는 의미는 본 발명의 화장료 조성물로부터 피부 장벽 강화와 피부 보습 효과를 나타낼 수 있는 정도로, 화장료 조성물에 치아씨 펩타이드가 첨가되는 것을 의미하고, 성분 전달 및 안정화 등을 위하여 다양한 성분을 부성분으로 첨가하여 다양한 형태로 제형화(formulation)되는 것을 포함하는 의미이다.

본 발명의 화장료 조성물에 있어서 상기 치아씨 펩타이드는 당 업계에 공지된 통상의 방법에 따라, 즉 통상적인 용매와 온도 및 pH의 조건 하에서 통상적인 단백질 분해 효소를 사용하여 제조될 수 있다. 바람직하게는, 1~4가 알코올 및 정제수를 단일 혹은 혼합한 용매에 20~60℃의 온도에서 pH 5 이하로 맞추어 식품 등급의 산성 단백질 분해 효소, 중성 단백질 분해 효소 중에 단일 혹은 혼합물을 이용하여 제조될 수 있다. 바람직하게는 100% 정제수 용매에 40 ~ 45℃의 온도에서 pH 2~4로 조절하여 파파인, 펩신을 중량 대비 1:1(중량비)로 혼합한 효소를 이용한 분해 과정을 포함하여 제조될 수 있다.

또한, 본 발명의 치아씨 펩타이드는 상술한 추출 방법뿐만 아니라 이를 통상적인 정제 과정을 거친 물질도 포함한다. 바람직하게는, 1~4가 알코올 용매 구획, 원심분리, 정밀 여과막, 한외여과막 분리 및 다양한 크로마토그래피에 의한 분리 등 다양한 정제 방법을 통해 얻어진 물질도 본 발명에 포함된다.

또한, 본 발명의 치아씨 펩타이드는 상술한 추출 및 정제 방법뿐만 아니라 이를 통상적인 건조 과정을 거친 물질도 포함한다. 바람직하게는, 농축, 열풍건조, 분무건조 및 동결건조 등 다양한 건조 방법을 통해 얻어진 물질도 본 발명에 포함된다.

본 발명의 상기 명시된 제조 방법으로 제조된 치아씨 펩타이드는 저분자량 펩타이드를 포함한다. 바람직하게는, 분자량 범위가 500 Da 미만을 나타내는 물질이 본 발명에 포함된다.

본 발명에서 치아씨 펩타이드는 프롤린, 하이드록시프롤린 및 라이신을 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 조성물에 있어서 치아씨 펩타이드는 피부 섬유아세포 증식 효과와 콜라겐 합성 촉진 효과를 나타내며, 피부 보습 효과를 나타내는 것을 특징으로 한다.

상기 치아씨 펩타이드를 화장료 조성물 총 중량 대비 0.1 내지 30.0 중량% 함유될 수 있다. 바람직하게는, 화장료 조성물 총 중량 대비 0.1~10.0 중량% 함유되는 것이 좋다. 상기 추출물의 함량이 0.1 중량% 미만인 경우에는 효과가 미미하며, 30.0 중량%를 초과하는 경우에는 함유량 증가에 대한 효과 증대 정도가 미미하고, 제형상의 안전 및 안정성에 문제가 있으며, 경제적이지 않다.

한편, 본 발명의 조성물은 당 업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 일예로, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형 중 선택되는 어느 하나의 기초 화장료 제형; 스킨; 로션; 아이크림; 수딩젤; 연고; 마스크팩용 제형; 바디워시용 제형; 필링젤; 수중유형 및 유중수형 메이크업베이스; 파운데이션; 스킨커버; 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우 펜슬류 중 선택되는 어느 하나의 색조화장료 제형; 두피용 제형; 중에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 화장 분야에서 통상적으로 사용되는 보조제 예컨대 친수성 또는 친유성 활성제, 보존제, 항산화제, 용매, 방향제, 충전제, 차단제, 안료, 흡취제, 염료, 컨디셔닝제 등을 함유할 수 있다. 이들 다양한 보조제의 양은 당해 분야에서 통상적으로 사용되는 양이며 다만, 어떠한 경우라도 보조제 및 그 비율은 본 발명에 따른 화장료 조성물의 바람직한 성질에 악영향을 미치지 않도록 선택될 것이다.

또한, 본 발명의 화장료 조성물은 본 발명 이외의 다른 화장료 조성물과 중복하여 사용할 수 있다. 또한 본 발명에 따른 화장료 조성물은 통상적인 사용방법에 따라 사용될 수 있으며, 사용자의 피부 상태 또는 취향에 따라 그 사용횟수를 달리할 수 있다.

한편, 본 발명에 따른 치아씨 펩타이드를 함유하는 화장료 조성물은 피부 섬유아세포 증식 효과와 콜라겐 합성 촉진 효과가 우수하고 피부 보습 효과를 나타낸다. 또한, 천연 소재를 사용하기 때문에 인체에 무해하며, 안전성이 우수한 화장료 조성물이다.

이하, 제조예 및 실시예를 들어서 본 발명을 상세하게 설명하지만, 제조예 및 실시예에 의해 본 발명의 권리범위가 제한되는 것은 아니다.

[제조예 1] 치아씨 펩타이드의 제조

상기 치아씨 펩타이드 분말은 이하 방법을 통해 제조된다.

(1) 치아씨의 분말화: 치아씨를 분쇄 및 파쇄기를 이용하여 분말화 한다.

(2) 단백질의 효소 분해: 상기 치아씨 분말을 중량 대비 20배의 정제수에 침지하여 40~45℃의 온도를 유지하고, pH 2~4로 조절하여 파파인과 펩신을 1:1로 혼합한 효소를 치아씨 분말 중량의 0.5~2% 투입한다. 6h 동안 교반하여 효소 분해 반응시키고, 30min 동안 끓여 활성을 없앤 다음 1M의 citric acid를 첨가하여 pH 5~7로 조절한다. 상온에서 24시간 방치한 다음 400 mesh 이하의 여과망을 통과하여 침전물을 제거하고, 원심 분리하여 상층액을 얻는다.

(3) 분리 정제: 상층액을 감압, 농축하여 부피 대비 1/10으로 줄인다. 농축액의 1:1 비율로 에탄올을 첨가하여 저온에서 24시간 방치한 다음 원심 분리하여 상층액을 얻는다.

(4) 여과: 분리한 상층액을 0.1 ~ 0.5㎛의 정밀 여과막을 통과하여 여과액을 얻는다.

(5) 건조: 여과액을 -40℃ ~ 40℃에서 동결 건조하여 치아씨 펩타이드 분말을 얻는다.

[비교제조예 1] 치아씨 용매 추출물의 제조

상기 치아씨 용매 추출물은 이하 방법을 통해 제조된다.

(1) 치아씨의 분말화: 치아씨를 분쇄 및 파쇄기를 이용하여 분말화 한다.

(2) 용매 추출: 상기 치아씨 분말을 중량 대비 20배의 정제수에 침지하여 상온에서 300 rpm 속도로 교반 추출한다.

(3) 여과: 추출액을 400 mesh망을 통과하여 여과하고, 여액을 7000 rpm에서 15분 간 원심 분리한 다음 상층액을 얻는다.

(4) 건조: 상층액을 -40℃ ~ 40℃에서 동결 건조하여 치아씨 추출물 분말을 얻는다.

[실험예 1] 아미노산 분석

피부의 콜라겐 합성에 중요한 역할을 하는 프롤린과 라이신의 유무를 확인하기 위해 HPLC를 이용한 아미노산 분석을 실시하였다.

(1) 시료의 전처리: 제조예 1의 치아씨 펩타이드를 적당량 취하여 6N HCl을 넣고 120도에서 24시간 동안 가수분해한 다음 정제수로 희석하여 0.45 μm 실린지 필터로 여과한다.

(2) 분석 조건

- Column: Cation column

- Detector: UV/Vis detector 340 nm, 450 nm/Fluorescence 266 nm, 305 nm

- Mobile Phase: 40mM Sodiumphosphate(Di basic) 0.1% Phosphoric acid(A)

Acetonitrile/Methanol/DW=45/45/10(B)

Time	A	B
0.0	100	0
1.9	100	0
18.1	43	57
18.6	20	80
22.3	20	80
23.2	100	0
26.0	100	0

- Flow: 1.5 ml/min

- Temperature: 40℃

치아씨 펩타이드의 아미노산 분석에 대한 결과를 도 1 및 2에 나타내었다. 치아씨 펩타이드의 프롤린, 라이신의 함량은 각각 5.97, 22.48 mg/L로 확인하였다. 콜라겐 형성에 중요한 역할을 하는 프롤린, 라이신이 포함되어 있으므로 피부 장벽을 강화하는 데 도움을 줄 수 있다.

[실험예 2] 하이드록시프롤린 분석

피부의 콜라겐 합성에 중요한 역할을 하는 하이드록시프롤린의 유무를 확인하기 위해 HPLC를 이용한 아미노산 분석을 실시하였다.

(1) 시료의 전처리: 제조예 1의 치아씨 펩타이드를 적당량 취하여 정제수로 희석하여 0.45 μm 실린지 필터로 여과한다.

(2) 분석 조건

- Column: 안지름 약 4.6 mm, 길이 약 25cm인 스테인레스관에 5 ㎛의 고성능액체크로마토그래프용 옥타데실실릴화한 실리카 겔을 충전한 것

- Detector: UV/Vis detector 203 nm

- Mobile Phase: Water

No.	Time	Flow	정제수(%)
1	0	0.4	100
2	10	0.4	100

- Flow: 0.4 ml/min

- Temperature: 30℃

치아씨 펩타이드의 하이드록시프롤린 분석에 대한 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3을 보면, 치아씨 펩타이드의 하이드록시프롤린의 함량은 평균 0.35 중량%로 확인하였다. 콜라겐 형성에 중요한 역할을 하는 하이드록시프롤린이 포함되어 있으므로 피부 장벽을 강화하는 데 도움을 줄 수 있다.

[실험예 3] 분자량 분석

치아씨 펩타이드의 분자량을 확인하기 위하여 MALDI-TOF MS를 활용하여 분석을 실시하였다.

제조예 1의 치아씨 펩타이드의 건조된 시료를 50 %(v/v) 메탄올/물 혼합액에 용해시킨 다음 1 μl을 취하여 1 μl의 SA(Sinapinic acid) matrix(50% [v/v] 0.1% TFA 아세토니트릴/50% 물)과 혼합하였다. 혼합물을 스테인레스 스틸 MALDI 플레이트 상에 스폿(spot)하고, 상온에서 건조시켰다. 분석은 Microflex LRF MALDI-TOF 질량 분석 및 Bruker UltrafleXtreme(Bruker Daltonics, bremen, Germany)를 이용하여 반사 모드(reflector mode)로 수행하였다.

각 이온의 강도는 제 1 동위 원소 피크 영역에서 제 3 동위 원소 피크 영역으로 합산하여 계산하였다. 스펙트럼 획득 및 처리는 FlexAnalysis 소프트웨어(ver. 3.3, Bruker Daltonics, Bremen, Germany)를 사용하여 수행하였으며 그 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에 도시되는 바와 같이, 치아씨 펩타이드의 분자량은 500 da 이하로 확인되어 저분자 펩타이드를 함유하고 있는 것을 확인하였다.

[실험예 4] 피부 섬유아세포 증식 평가

인간 섬유아(human dermal fibroblast, HDFn) 세포를 96 well plate에 1x104 cells/well로 분주하고, 5% CO2가 공급되는 37℃ 배양기에서 하루 동안 배양시킨 다음 0.2% FBS가 함유된 배지로 교환하고, 계열 희석된 시료를 농도별로 처리하여 37℃ 배양기에서 48 시간 동안 반응시킨다. MTT 시약을 각 well에 20 ul씩 첨가하여 배양기에서 2 시간 동안 반응시킨 후 상층액을 모두 제거한 다음 DMSO 100 ul를 첨가하여 완전히 세포를 용해시키고 550 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 시험물질의 유의성 여부는 Two sample t-test를 통해 생물학적 통계기준(유의수준(α): 1%)에 맞추어 확인하였으며 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 도시되는 바와 같이, 제조예 1와 비교제조예 1을 각각 처리하였을 때 제조예 1에서 유의한 효과를 보였으며 최대 100 ug/ml의 농도로 처리했을 때 약 33% 증가한 것으로 확인하여 치아씨 펩타이드의 피부 섬유아세포 증식 효과를 확인하였다.

[실험예 5] 콜라겐 생성 촉진 효과

1) 세포배양 및 검액의 처리: 피부 섬유아세포를 10% FBS가 함유된 F12/DMEM 배지로 24 well plate에 1×105cells/well로 450 ml씩 분주하고 인큐베이터에서 24 시간 동안 배양한 다음 각 well에 시료를 농도별로 첨가한 후 5% CO2, 37℃ 인큐베이터에서 24 시간 동안 반응시켰다. 그 후에 상등액을 취하여 콜라겐 양을 Procollagen type I peptide EIA kit(Takara, Japan)을 이용하여 측정하였다. BCA 정량법을 이용하여 단백질 양을 확인한 후 단위 세포당 콜라겐 양으로 보정하였다. 세포를 PBS를 이용하여 세척한 뒤 protease inhibitor가 포함된 1X RIPA buffer를 처리하여 세포를 용해시킨 다음 세포를 분해하고, 원심 분리하여 상등액은 회수한다.

2) 단백질 정량: 회수한 상등액에 BCA 용액(A:B=50:1)을 가하여 30 분 동안 반응시킨 후 540 nm에서 ELISA reader로 흡광도를 측정하여 측정된 값을 0 ~ 2 mg/ml 농도범위의 알부민(albumin)을 이용한 표준검량선에 대입하여 단백질 양을 구하고, 아래의 계산식에 따라 총 단백질 양을 구하였다.

3) 콜라겐양 측정: Antibody-POD conjugate solution를 웰(well)에 넣은 다음 표준액과 분리한 상등액을 넣고 인큐베이터에서 3시간 배양하였다. 웰에서 반응액을 제거한 다음 PBS로 4회 세척하였다. 발색시약을 넣어 상온에서 15분간 반응시킨 다음 1N 황산을 첨가하여 492 nm에서 흡광도를 측정하였다. 이를 계산한 뒤 대조군과 비교하여 콜라겐 합성율을 구한 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 도시되는 바와 같이, 제조예 1와 비교제조예 1을 각각 처리하였을 때 제조예 1에서 유의한 효과를 보였으며 최대 100 ug/ml의 농도로 처리했을 때 약 65% 증가한 것으로 확인하여 치아씨 펩타이드의 콜라겐 합성 촉진 효과를 확인하였다.

[실시예 1 및 비교예 1, 2] 치아씨 펩타이드를 이용한 제품 제조

치아씨 펩타이드를 함유한 화장료 조성물을 하기의 표 3의 조성 및 함량으로 통상의 방법에 따라 제조하였다.

no.	원료명	함량(중량%)
		실시예 1	비교예 1	비교예 2
1	치아씨 펩타이드(제조예 1)	1.0	-	-
2	치아씨 용매 추출물(비교제조예 1)	-	-	1.0
3	글리세린	5.0	5.0	5.0
4	부틸렌글라이콜	5.0	5.0	5.0
5	EDTA-2Na	0.02	0.02	0.02
6	세토스테아릴알코올	2.0	2.0	2.0
7	글리세릴스테아레이트	1.5	1.5	1.5
8	마이크로크리스탈린	0.7	0.7	0.7
9	스쿠알	5.0	5.0	5.0
10	폴리솔베이트	1.2	1.2	1.2
11	솔비탄스테아레이트	0.5	0.5	0.5
12	토코페릴아세테이트	0.2	0.2	0.2
13	사이클로메치콘	3.0	3.0	3.0
14	BHT	0.05	0.05	0.05
14	방부제	미량	미량	미량
15	정제수	잔량	잔량	잔량
	계	100.0	100.0	100.0

[실험예 6] 경피 수분 손실량 측정

피부 질환이 없는 20~40대 18명을 대상으로 1조 당 6명씩 3개조로 나누고, 각 조별로 상기 실시예 1과 비교예 1 및 2의 화장료를 얼굴 및 전박부에 도포하게 하였다. 미리 도포 시작 전 항온, 항습 조건(24℃, 습도 40%)에서 경피 수분 손실량 측정기(Tewameter TM 210, Courage and Khazaka, Germany)를 이용하여 피부 수분 증발량를 측정하였고 도포 1시간, 2시간, 4시간, 6시간 후에 측정하여 그 감소율(%)을 평가하였다. 그 결과는 하기 표 4에 나타내었다.

(단위: g/m2/h)	0시간	1시간	2시간	4시간	6시간
실시예 1	14.1	13.9	13.2	11.5	8.4
비교예 1	17.5	17.2	15.9	14.4	13.5
비교예 2	16.8	17.3	14.2	12.9	12.0

표 4에 도시되는 바와 같이, 치아씨 펩타이드를 함유한 실시예 1은 비교예 1 및 2에 비하여 경피 수분 감소율이 낮은 것으로 확인하였다.

Claims (6)

1. 치아씨 펩타이드를 유효성분으로 포함하는 피부장벽 강화 및 피부 보습용 화장료 조성물로서,
   상기 치아씨 펩타이드는 프롤린, 라이신 및 하이드록시프롤린을 포함하는 것을 특징으로 하는 피부장벽 강화 및 피부 보습용 화장료 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 치아씨 펩타이드는 분자량이 500 Da 미만인 저분자량 펩타이드를 포함하는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
3. 제1항에 있어서, 상기 치아씨 펩타이드는 피부 섬유아세포 증식 효과 또는 콜라겐 합성 촉진 효과를 갖는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
4. 제1항에 있어서, 상기 치아씨 펩타이드는 화장료 조성물 총 중량 대비 0.1 내지 30.0 중량%로 함유되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
5. 제1항에 있어서, 상기 화장료 조성물은 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 화장수, 젤, 수용성 리퀴드, 크림, 에센스, 계면활성제-함유 클렌징, 오일, 수중유(O/W)형 및 유중수(W/O)형으로 이루어진 군에서 선택된 기초화장료 제형; 마스크팩용 제형; 바디워시용 제형; 필링젤; 수중유형 또는 유중수형 메이크업베이스; 파운데이션; 스킨커버; 립스틱, 립그로스, 페이스파우더, 투웨이케익, 아이새도, 치크칼라 및 아이브로우 펜슬로 이루어진 군에서 선택된 색조화장료 제형; 또는 두피용 제형인 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
6. 삭제

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