WO2015060429A1 - ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法および測定キット - Google Patents

ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法および測定キット Download PDF

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陽介 鉞
敦 一柳
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    • G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
    • G01N2333/908—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)

Definitions

  • the present invention relates to a method for measuring hemoglobin A1c in a sample and a reagent kit for measurement used in the method.
  • Glycated proteins are produced by non-enzymatic covalent bond formation between the aldehyde group of aldoses (monosaccharides and derivatives thereof that potentially have aldehyde groups) such as glucose, and Amadori transfer It is.
  • aldehyde group of aldoses monosaccharides and derivatives thereof that potentially have aldehyde groups
  • Amadori transfer It is.
  • the amino group of a protein include an ⁇ -amino group at the amino terminus and an ⁇ -amino group of a lysine residue side chain in the protein.
  • Known glycated proteins generated in vivo include glycated hemoglobin in which hemoglobin in blood is glycated, glycated albumin in which albumin is glycated, and the like.
  • HbA1c hemoglobin A1c
  • ⁇ -chain a protein in which glucose is bound to the ⁇ -amino group of Val (valine) at the N-terminus (amino terminus) of the hemoglobin “ ⁇ -chain”. Since the HbA1c concentration in blood reflects the average blood glucose level over a certain period in the past, the value of HbA1c is an important index in the diagnosis and management of diabetes symptoms.
  • Amadoriase catalyzes a reaction that oxidizes iminodiacetic acid or its derivative (also called “Amadori compound”) in the presence of oxygen to produce glyoxylic acid or ⁇ -ketoaldehyde, an amino acid or peptide, and hydrogen peroxide. It is a general term for enzymes to be used. Amadoriase is known as a useful enzyme for measuring HbA1c by an enzymatic method. As a substrate oxidized by amadoriase, for example, ⁇ -fructosyl valyl histidine (hereinafter referred to as ⁇ FVH) is known.
  • ⁇ FVH ⁇ -fructosyl valyl histidine
  • Amadoriase has been found so far in bacteria, yeasts and fungi, such as the genus Coniochaeta, Eupenicillium, Pyrenochaeta, Arthrinium, Curvularia. , Neocosmospora genus, Cryptococcus genus, Phaeosphaeria genus, Aspergillus genus, Emericella genus, Ulocladium genus, Penicillium F arium ), Achaetomiella, Achaetomium, Thielavia, Chaetomium, Gerasinospora, Microascus, Leptosphaeria, Ophiobolus, Pleospora, Conioketidium (Co Amadoriases from the genera niochaetidium, Pichia, Debaryomyces, Corynebacterium, Agrobacterium, Arthrobacter are reported (for example, (See Patent Documents 1, 6 to 15 and Non-Patent Document
  • amadoriase may be described by expressions such as ketoamine oxidase, fructosyl amino acid oxidase, fructosyl peptide oxidase, and fructosylamine oxidase depending on the literature.
  • HbA1c As a method for measuring HbA1c quickly and conveniently using various amadoriases as described above, HbA1c is decomposed with a protease or peptidase (hereinafter referred to as protease) excision enzyme, and the ⁇ -chain amino terminus of HbA1c is used.
  • protease peptidase
  • a method is known in which a specific measurement substance is liberated and the liberated measurement substance is quantified using the amadoriase as described above (see, for example, Patent Documents 1 to 7).
  • HbA1c was digested with Glu-C protease, and glycated ⁇ -fructosyl hexapeptide ( ⁇ -fructosyl hexapeptide comprising ⁇ -amino acid-terminal valine)
  • ⁇ F6P ktosylvalylhistidyl leucylthreonylprolyl glutamic acid
  • This method is a method for measuring HbA1c with an enzyme in accordance with the HbA1c measurement method (see Non-patent Document 10) defined by IFCC (International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine).
  • Proteases and the like show the action of hydrolyzing proteins, so that enzymes that are proteins are also hydrolyzed by proteases and the like. Therefore, amadoriase is also hydrolyzed by protease and inactivated, and as a result, the reaction of consuming glycated peptide and oxygen to produce hydrogen peroxide is inhibited. As a countermeasure against this, it is conceivable to increase the prescription amount of amadoriase and finish the measurement before the amadoriase is completely inactivated. This is not preferable in nature.
  • peroxidase when HbA1c is measured by quantifying hydrogen peroxide generated by the action of amadoriase on a glycated peptide, peroxidase may be used for the quantification of hydrogen peroxide. In this case, peroxidase is also undesirably hydrolyzed by protease and the like and deactivated.
  • an automatic analyzer for HbA1c measurement by an enzyme.
  • various biological markers such as HbA1c are simultaneously measured using one sample.
  • each biomarker is measured using an enzyme or an antibody, if a protease or the like is contaminated, the enzyme or antibody contained in each biomarker measurement reagent is hydrolyzed, and a biomarker other than HbA1c is accurately measured.
  • the reagent set in the automatic analyzer does not originally contain protease or the like.
  • the problem to be solved by the present invention is to find an amadoriase that generates hydrogen peroxide by oxidizing the ⁇ chain of HbA1c, and to construct a method for measuring HbA1c using the same.
  • the present invention includes the following.
  • a method for measuring hemoglobin A1c in a sample wherein amadoriase directly acting on hemoglobin A1c is allowed to act on the sample, and hydrogen peroxide or oxygen consumed by the action is measured.
  • the amadoriase that directly acts on hemoglobin A1c has a specific activity of 0.1 U / mg or more with respect to ⁇ -fructosylvalylhistidyl leucylthreonylprolylglutamic acid ( ⁇ F6P). The method described.
  • the amadoriase that directly acts on hemoglobin A1c has a specific activity of 0.1 U / mg or more with respect to ⁇ -fructosylvalylhistidyl leucylthreonylprolylglutamic acid ( ⁇ F6P), and an amadoriase selected from the group consisting of (i) to (iii), (i) a position corresponding to a position selected from the group consisting of (a) to (j) below of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 when the amino acid sequence of Amadoriase is aligned with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • the amadoriase amino acid sequence has a substitution of one or more amino acid residues, (A) position 62 of SEQ ID NO: 1, (B) position 63 of SEQ ID NO: 1, (C) position 102 of SEQ ID NO: 1, (D) position 106 of SEQ ID NO: 1, (E) position 110 of SEQ ID
  • amino acid at a position corresponding to two or more positions is an amino acid residue described in each of (a) to (j), and ⁇ -fructosylvalylhistidyl leucylthreonylprolyl 5.
  • the method according to 4 which is an amadoriase having a specific activity of 0.1 U / mg or more with respect to glutamic acid ( ⁇ F6P).
  • the amadoriase that directly acts on the hemoglobin A1c is selected from the group consisting of (a) to (j) of the amino acid described in SEQ ID NO: 1 when the amino acid sequence of Amadoriase is aligned with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid at a position corresponding to three or more positions is an amino acid residue described in each of (a) to (j), and ⁇ -fructosylvalylhistidyl leucylthreonylprolyl 6.
  • the amadoriase that directly acts on hemoglobin A1c is selected from the group consisting of amino acids (a) to (j) of the amino acid described in SEQ ID NO: 1 when the amino acid sequence of Amadoriase is aligned with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1.
  • amino acid at a position corresponding to 4 or more positions is an amino acid residue described in each of (a) to (j), and ⁇ -fructosylvalylhistidyl leucylthreonylprolyl 7.
  • the amadoriase that directly acts on hemoglobin A1c is selected from the group consisting of amino acids (a) to (j) of the amino acid described in SEQ ID NO: 1 when the amino acid sequence of Amadoriase is aligned with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid at a position corresponding to 5 or more positions is an amino acid residue described in each of (a) to (j), and ⁇ -fructosylvalylhistidyl leucylthreonylprolyl 8.
  • the amadoriase that directly acts on the hemoglobin A1c is selected from the group consisting of (a) to (j) of the amino acid described in SEQ ID NO: 1 when the amino acid sequence of Amadoriase is aligned with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1.
  • amino acid at the position corresponding to 6 or more positions is an amino acid residue described in each of the above (a) to (j), and ⁇ -fructosylvalylhistidyl leucylthreonylprolyl 9.
  • Amadoriases that directly act on hemoglobin A1c are genus Coniochaeta, Eupenicillium, Pyrenochaeta, Arthrinium, Curvularia, Neocosmospora 1 to 9, derived from the genus Cryptococcus, Phaeosphaeria, Aspergillus, Emericella, Ulocladium, or Penicillium Measuring method of hemoglobin A1c in the sample.
  • Amadoriase directly acting on hemoglobin A1c is Coniochaeta sp., Eupenicillium terrenum, Pyrenochaeta sp., Arthrinium sp.
  • Neocosmospora vasinfecta Cryptococcus neoformans, Phaeosphaeria nodorum, Aspergillus nidulans, U.
  • amadoriase directly acting on hemoglobin A1c is an amadoriase selected from the group consisting of: (i) Amadoriase having an amino acid sequence in which one or several amino acid substitutions, deletions or additions have been made to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 141 or 143.
  • the full-length amino acid sequence of the amadoriase has a sequence identity of 70% or more with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 141 or 143, and positions 10 to 32, 36 of SEQ ID NO: 141 -41st, 49-52th, 54-58th, 73-75th, 84-86th, 88-90th, 120-122, 145-150, 156-162, 164-170, 180 182nd, 202th to 205th, 207th to 211th, 214th to 224th, 227th to 230th, 236th to 24th, 243th to 248th, 258th to 261st, 266th to 268th, 270th to 273th, 275 ⁇ 287, 295 to 297, 306 to 308, 310 to 316, 324 to 329, 332 to 334, 341 to 344, 346 to 355, 357 to In the homology
  • Amadoriase further comprises the following amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, (I) 262th asparagine, (Ii) 257th valine, (Iii) glutamic acid at position 249 (iv) glutamic acid at position 253, (V) 337th glutamine, (Vi) glutamic acid at position 340, (Vii) aspartic acid at position 232; (Viii) aspartic acid at position 129, (Ix) aspartic acid at position 132, (X) glutamic acid at position 133, (Xi) glutamic acid at position 44, (Xii) 256th glycine, (Xiii) glutamic acid at position 231 and (xiv) glutamic acid at position 81, Having a substitution of one or more amino acid residues at a position corresponding to an amino acid selected from the group consisting of optionally 3 amino acid residues from the carboxyl terminus may be deleted; 12.
  • the measuring
  • a reagent kit for measuring hemoglobin A1c in a sample comprising the following components (1) and (2):
  • the amadoriase that directly acts on hemoglobin A1c has a specific activity of 0.1 U / mg or more with respect to ⁇ -fructosylvalylhistidyl leucylthreonylprolylglutamic acid ( ⁇ F6P).
  • ⁇ F6P ⁇ -fructosylvalylhistidyl leucylthreonylprolylglutamic acid
  • the amadoriase that directly acts on hemoglobin A1c has a specific activity of 0.1 U / mg or more with respect to ⁇ -fructosylvalylhistidyl leucylthreonylprolylglutamic acid ( ⁇ F6P), and an amadoriase selected from the group consisting of (i) to (iii), (i) a position corresponding to a position selected from the group consisting of (a) to (j) below of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 when the amino acid sequence of Amadoriase is aligned with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1
  • the amadoriase amino acid sequence has a substitution of one or more amino acid residues, (A) position 62 of SEQ ID NO: 1, (B) position 63 of SEQ ID NO: 1, (C) position 102 of SEQ ID NO: 1, (D) position 106 of SEQ ID NO: 1, (E) position 110 of SEQ ID
  • amadoriase directly acting on hemoglobin A1c aligns the amino acid sequence of amadoriase with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1, from the group consisting of the following amino acids (a) to (j) of SEQ ID NO: 1
  • the amino acid at a position corresponding to one or more selected positions is an amino acid residue described in each of the following, and ⁇ -fructosyl valyl histidyl leucyl threonyl prolyl glutamic acid ( ⁇ F6P)
  • An amadoriase having a specific activity of 0.1 U / mg or more (A) the amino acid at the position corresponding to position 62 of SEQ ID NO: 1 is alanine, aspartic acid, asparagine, glutamine, glutamic acid, glycine, valine, leucine, isoleucine, cysteine, serine, threonine or proline; (B) the amino acid at the position corresponding to position
  • the amadoriase that acts directly on hemoglobin A1c is selected from the group consisting of (a) to (j) of the amino acids described in SEQ ID NO: 1 when the amino acid sequence of Amadoriase is aligned with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1. And the amino acid at a position corresponding to two or more positions is an amino acid residue described in each of (a) to (j), and ⁇ -fructosylvalylhistidyl leucylthreonylprolyl 18.
  • the amadoriase that directly acts on hemoglobin A1c is selected from the group consisting of (a) to (j) of the amino acids described in SEQ ID NO: 1 when the amino acid sequence of Amadoriase is aligned with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid at a position corresponding to three or more positions is an amino acid residue described in each of (a) to (j), and ⁇ -fructosylvalylhistidyl leucylthreonylprolyl 19.
  • the amadoriase that directly acts on hemoglobin A1c is selected from the group consisting of (a) to (j) of the amino acids described in SEQ ID NO: 1 when the amino acid sequence of Amadoriase is aligned with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1. And the amino acid at a position corresponding to 4 or more positions is an amino acid residue described in each of (a) to (j), and ⁇ -fructosylvalylhistidyl leucylthreonylprolyl 20.
  • the amadoriase directly acting on hemoglobin A1c is selected from the group consisting of amino acids (a) to (j) of amino acids described in SEQ ID NO: 1 when the amino acid sequence of Amadoriase is aligned with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1. And the amino acid at a position corresponding to 5 or more positions is an amino acid residue described in each of (a) to (j), and ⁇ -fructosylvalylhistidyl leucylthreonylprolyl 21.
  • the amadoriase directly acting on hemoglobin A1c is selected from the group consisting of (a) to (j) of the amino acids described in SEQ ID NO: 1 when the amino acid sequence of Amadoriase is aligned with the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1. And the amino acid at the position corresponding to 6 or more positions is an amino acid residue described in each of the above (a) to (j), and ⁇ -fructosylvalylhistidyl leucylthreonylprolyl
  • Amadoriase which acts directly on the hemoglobin A1c to generate hydrogen peroxide, includes the genus Coniochaeta, Eupenicillium, Pyrenochaeta, Arthrinium, Carbraria (Curvularia), Neocosmospora, Cryptococcus, Phaeosphaeria, Aspergillus, Emericella, Ulocladium, or Penicillium
  • Coniochaeta Eupenicillium
  • Pyrenochaeta Pyrenochaeta
  • Arthrinium Carbraria (Curvularia)
  • Neocosmospora Neocosmospora
  • Cryptococcus Phaeosphaeria
  • Aspergillus Emericella
  • Ulocladium or Penicillium
  • Penicillium The kit according to any one of 14 to 22, which is derived from a genus.
  • Amadoriase having an action of directly acting on hemoglobin A1c to generate hydrogen peroxide (i) an amadoriase having an amino acid sequence in which one or several amino acid substitutions, deletions or additions have been made to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 141 or 143, or (ii) In the amadoriase of (i), the full-length amino acid sequence of the amadoriase has a sequence identity of 70% or more with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 141 or 143, and positions 10 to 32, 36 of SEQ ID NO: 141 -41st, 49-52th, 54-58th, 73-75th, 84-86th, 88-90th, 120-122, 145-150, 156-162, 164-170, 180 182nd, 202th to 205th, 207th to 211th, 214th to 224th, 227th to 230th, 236th to 24th, 243th to 248
  • amino acid in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is further produced by the amadoriase having the action of directly acting on hemoglobin A1c and generating hydrogen peroxide, (I) 262th asparagine, (Ii) 257th valine, (Iii) glutamic acid at position 249 (iv) glutamic acid at position 253, (V) 337th glutamine, (Vi) glutamic acid at position 340, (Vii) aspartic acid at position 232; (Viii) aspartic acid at position 129, (Ix) aspartic acid at position 132, (X) glutamic acid at position 133, (Xi) glutamic acid at position 44, (Xii) 256th glycine, (Xiii) glutamic acid at position 231 and (xiv) glutamic acid at position 81, Having a substitution of one or more amino acid residues at a position corresponding to an amino acid selected from the group
  • an amadoriase selected from the group consisting of: (i) When the amino acid sequence of Amadoriase is aligned with the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, the amino acid at the position corresponding to position 68 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is asparagine, or the amino acid shown in SEQ ID NO: 1 An amadoriase wherein the amino acid at the position corresponding to position 356 in the sequence is threonine and has activity against ⁇ -fructosyl hexapeptide ( ⁇ F6P); (ii) From the amino acid sequence in which one or several amino acids in the position other than the position corresponding to position 68 or position 356 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 are substituted, deleted or added in the amadoriase of (i) above And an amadoriase having activity against ⁇ F6P, (iii) In the amadoriase of (i), the amino acid at the position
  • the present invention it is possible to provide an amadoriase that can quantify HbA1c quickly, simply, accurately and satisfactorily. If such an amadoriase is used, the measuring method and measuring kit of HbA1c by the enzyme method can be provided without prescribing protease or the like. In the present invention, since it is not necessary to formulate a protease or the like, the kit can be simplified, the reaction efficiency and measurement accuracy can be increased, and furthermore, an undesirable reaction to other protein reagents by the protease or the like can be avoided.
  • FIG. 1-1 It is a continuation of FIG. 1-2. It is a continuation of FIG. 1-3. This is continued from FIG. It is the 2nd figure which illustrates the identity in the amino acid sequence of various well-known amadoriases, and a similar amino acid. In addition to Co, Et, Py, Ar, Cc, and Nv, Cn, Pn, An, En, Ul, and Pj were aligned. This is continued from FIG. 2-1. It is a continuation of FIG. 2-2. This is continued from FIG. 2-3. It is a continuation of FIG.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of measuring HbA1c after diluting a sample containing HbA1c with an n-dodecyl- ⁇ -D-maltoside solution.
  • FIG. 6 is a diagram showing the results of HbA1c measurement after diluting a sample containing HbA1c with an n-tetradecyl- ⁇ -D-maltoside solution. It is a figure which shows the relationship between the elapsed time after mixing a sample diluent (reagent D1) and a measurement reagent, and a light absorbency at the time of measuring HbA1c using a modified
  • reagent D1 sample diluent
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of HbA1c measurement using amadoriase 25 after diluting a sample containing HbA1c with an n-dodecyl- ⁇ -D-maltoside solution (reagent D1) containing hydrochloric acid. It is a figure which shows the result of having diluted the sample containing HbA1c with the polyoxyethylene (20) cetyl ether solution (reagent D2) containing hydrochloric acid, and having performed HbA1c measurement.
  • FIG. 4 is a diagram showing the results of HbA1c measurement using amadoriase 28 after diluting a sample containing HbA1c with an n-dodecyl- ⁇ -D-maltoside solution (reagent D1) containing hydrochloric acid. It is a figure which shows the relationship between the elapsed time after mixing a sample diluent (reagent G1) and the reagent for a measurement, and a light absorbency when HbA1c is measured using a modified amadoriase. When 300 seconds have elapsed, the amadoriase solution is added.
  • the glycated protein in the present invention refers to a non-enzymatically glycated protein.
  • Glycated proteins exist both in vivo and externally. Examples of existing in vivo include glycated hemoglobin and glycated albumin in blood. Among glycated hemoglobins, the ⁇ -chain amino-terminal valine of hemoglobin is glycated. Glycated hemoglobin is particularly referred to as hemoglobin A1c (HbA1c). Examples that exist outside the body include foods and beverages such as liquid seasonings in which proteins, peptides and sugars coexist, and infusions.
  • the glycated peptide in the present invention refers to a non-enzymatically glycated peptide derived from a glycated protein, a peptide that is directly non-enzymatically glycated, a peptide that is generated as a result of degradation of a glycated protein by a protease, A glycated (poly) peptide constituting a glycated protein is included.
  • a glycated peptide may be referred to as a fructosyl peptide.
  • the amino group on the side of the peptide to be glycated includes an ⁇ -amino group at the amino terminus, an ⁇ -amino group on the side chain of a lysine residue inside the peptide, and the glycated peptide in the present invention refers to More specifically, it is an ⁇ -glycated peptide ( ⁇ -fructosyl peptide).
  • the ⁇ -glycated peptide is formed by releasing it from a glycated protein in which the N-terminal ⁇ -amino acid is glycated by some means, for example, limited decomposition with a protease or the like.
  • the corresponding ⁇ -glycated peptide refers to a glycated peptide cut out from the ⁇ chain of HbA1c in which the N-terminus is glycated.
  • the ⁇ chain of HbA1c composed of 146 amino acids also corresponds to the ⁇ -glycated peptide.
  • the measurement substance on which the amadoriase of the present invention acts is HbA1c, more specifically, the ⁇ chain of HbA1c.
  • the measurement substance on which the amadoriase of the present invention acts is ⁇ F6P cleaved from the ⁇ chain of HbA1c, specifically, ⁇ -fructosyl valyl histidyl leucyl threonyl prolyl glutamic acid.
  • the measurement substance on which the amadoriase of the present invention acts is ⁇ FVH ( ⁇ -fructosyl valylhistidine) or ⁇ FV ( ⁇ -fructosyl valine).
  • Amadoriase is also called ketoamine oxidase, fructosyl amino acid oxidase, fructosyl peptide oxidase, or fructosylamine oxidase, which oxidizes iminodiacetic acid or its derivative (Amadori compound) in the presence of oxygen to produce glyoxylic acid or ⁇ - It refers to an enzyme that catalyzes a reaction that produces ketoaldehyde, an amino acid or peptide, and hydrogen peroxide.
  • Amadoriase is widely distributed in nature and can be obtained by searching for microorganisms, enzymes of animal or plant origin. The microorganism can be obtained from, for example, filamentous fungi, yeast, or bacteria.
  • amadoriase of the present invention acts directly on HbA1c.
  • amadoriase directly acts on HbA1c.
  • amadoriase acts on the fructosyl group at the N-terminal of the ⁇ chain of HbA1c, and 2-keto-D glucose and hydrogen peroxide, It means that the ⁇ chain of hemoglobin is generated.
  • this does not exclude that the amadoriase reacts with a fructosyl peptide derived from the ⁇ chain of HbA1c, such as ⁇ F6P.
  • the amadoriase of the present invention not only directly acts on HbA1c but also has reactivity with a fructosyl peptide derived from the ⁇ chain of HbA1c, such as ⁇ F6P.
  • Amadoriase variant The present invention is based on wild type amadoriase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 40, SEQ ID NO: 54, or SEQ ID NO: 62, or SEQ ID NO: 89, or SEQ ID NO: 99, ⁇ F6P
  • a variant of Amadoriase that is reactive to HbA1c and acts directly on HbA1c is provided.
  • a variant is used interchangeably with a variant, and means that a part of amino acids is substituted, deleted or added when the amino acid sequence of amadoriase is compared with a wild-type sequence. The addition here includes insertion.
  • the present invention further relates to ⁇ F6P based on a wild type amadoriase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 145 or SEQ ID NO: 149.
  • a wild type amadoriase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 113, SEQ ID NO: 115, SEQ ID NO: 117, SEQ ID NO: 119, SEQ ID NO: 121, SEQ ID NO: 123, SEQ ID NO: 145 or SEQ ID NO: 149.
  • variants of amadoriase that are reactive to and act directly on HbA1c.
  • a variant of amadoriase that directly acts on HbA1c can be obtained based on other wild-type amadoriases derived from the genus Coniochaeta.
  • the modified amadoriase of the present invention may further have a mutation that modifies other properties of the enzyme as long as it has reactivity with ⁇ F6P and acts directly on HbA1c.
  • the amadoriase of the present invention is a variant of amadoriase that directly acts on HbA1c, which is produced based on the amadoriase derived from the genus Coniochaeta having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1.
  • one or several amino acids means 1 to 15, preferably 1 to 10, more preferably 1 to 5, more preferably 1 to 4 amino acid sequences with a total length exceeding 400 amino acids. More preferably, it refers to 1 to 3, more preferably 1 or 2 amino acids.
  • one or several amino acids are 1 to 10, preferably 1 to 7, preferably 1 to 5, preferably 1 to 4, More preferably, it refers to 1 to 3, more preferably 1 or 2 amino acids.
  • one or several amino acids are 1 to 5, preferably 1 to 4, preferably 1 to 3, more preferably 1 or 2.
  • An amino acid refer to one or two amino acids when referring to a sequence having a total length of less than 40 amino acids.
  • hybridization solution 50% formamide, 6-10 ⁇ SSC (0.15-1.5M NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.0), 5 ⁇ Denhardt solution, 1% SDS, 10% dextran sulfate, 10 ⁇ g / ml denatured salmon sperm DNA, 50 mM phosphate buffer (pH 7.5)), and incubation at about 42 ° C. to about 50 ° C., followed by about 65 ° C. to about 70 ° C. using 0.1 ⁇ SSC, 0.1% SDS The conditions for washing can be mentioned.
  • mutant of the present invention is, for example, Eupenicillium, Pyrenecata, Arsulium, Carbraria, Neocosmosspora as long as the conditions relating to substrate specificity and / or amino acid sequence described in the claims are satisfied.
  • Cryptococcus spp. Feosferia spp.
  • Produced based on amadoriase derived from other species such as Pleospora, Conioketidium, Pichia, Corynebacterium, Agrobacterium, or Arthrobacter.
  • a variant based on Coniochaeta sp. NISL 9330-derived amadoriase may have one or more amino acid substitutions at the following positions.
  • the one or more amino acid substitutions used for the modified amadoriase are 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 Or 18 amino acid substitutions, for example 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 or 15 amino acid substitutions, for example 1, 2, 3, 4, 5 6, 7, 8, 9 or 10 amino acid substitutions, for example 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 8 amino acid substitutions.
  • the one or more amino acid substitutions used with respect to the amadoriase variant are 1, 2, 3, 4, 5, 6, or 7 amino acid substitutions.
  • NISL 9330-derived amadoriase (SEQ ID NO: 1), preferably (a) arginine at position 62 , Asparagine or aspartic acid, glutamine, glutamic acid, glycine, valine, leucine, isoleucine, cysteine, serine, threonine or proline.
  • leucine at position 63 is replaced with histidine or alanine.
  • glutamic acid at position 102 is substituted with lysine.
  • aspartic acid at position 106 is replaced with alanine, lysine or arginine.
  • glutamine at position 110 is replaced with leucine or tyrosine.
  • alanine at position 113 is substituted with lysine or arginine.
  • alanine at position 355 is substituted with serine.
  • alanine at position 419 may be substituted with lysine.
  • aspartic acid at position 68 may be substituted with asparagine.
  • alanine at position 356 may be substituted with threonine.
  • a variant based on amadoriase from Phaeosphaeria nodorum may have one or more amino acid substitutions at the following positions: (A) Serine at position 62 (b) Leucine at position 63 (c) Lysine at position 102 (d) Aspartic acid at position 106 (e) Glycine at position 110 (f) Alanine at position 113 (g) Alanine at position 351 (H) Serine at position 416 (i) Aspartic acid at position 68 (j) Alanine at position 352
  • serine at position 62 may not be optionally substituted.
  • the serine at position 62 can be substituted with alanine, aspartic acid, asparagine, glutamine, glutamic acid, glycine, valine, leucine, isoleucine, cysteine, threonine or proline.
  • leucine at position 63 is replaced with histidine.
  • the lysine at position 102 may not be substituted.
  • the aspartic acid at position 106 is replaced with lysine.
  • glycine at position 110 is replaced with leucine.
  • the alanine at position 113 is replaced with lysine.
  • alanine at position 351 is substituted with serine.
  • serine at position 416 may be substituted with lysine.
  • aspartic acid at position 68 may be substituted with asparagine.
  • alanine at position 352 may be substituted with threonine.
  • Neocosmospora vasinfecta derived amadoriase may have one or more amino acid substitutions at the following positions: (A) Arginine at position 62 (b) Leucine at position 63 (c) Glutamic acid at position 102 (d) Glycine at position 106 (e) Glutamic acid at position 110 (f) Lysine at position 113 (g) Serine at position 355 ( h) alanine at position 420 (i) aspartic acid at position 68 (j) alanine at position 356
  • arginine at position 62 is alanine, aspartic acid, asparagine, It can be substituted with glutamine, glutamic acid, glycine, valine, leucine, isoleucine, cysteine, se
  • leucine at position 63 is replaced with histidine.
  • glutamic acid at position 102 is substituted with lysine.
  • glycine at position 106 is replaced with lysine.
  • glutamic acid at position 110 is replaced with leucine.
  • the lysine at position 113 may not be substituted.
  • the serine at position 355 may not be substituted.
  • alanine at position 420 may be substituted with lysine.
  • aspartic acid at position 68 may be substituted with asparagine.
  • (j) alanine at position 356 may be substituted with threonine.
  • a variant based on an amadoriase from Aspergillus nidulans may have one or more amino acid substitutions at the following positions: (A) Arginine at position 61 (b) Leucine at position 62 (c) Glutamic acid at position 101 (d) Glycine at position 105 (e) Lysine at position 109 (f) Serine at position 112 (g) Alanine at position 355 ( h) Alanine at position 420 (i) Aspartic acid at position 67 (j) Asparagine at position 356
  • arginine at position 61 is alanine, aspartic acid, asparagine, It can be substituted with glutamine, glutamic acid, glycine, valine, leucine, isoleucine, cysteine, serine, thre
  • leucine at position 62 is replaced with histidine.
  • glutamic acid at position 101 is substituted with lysine.
  • glycine at position 105 is substituted with lysine.
  • the lysine at position 109 is replaced with leucine.
  • serine at position 112 is replaced with lysine.
  • alanine at position 355 is replaced with serine.
  • alanine at position 420 may be substituted with lysine.
  • aspartic acid at position 67 may be substituted with asparagine.
  • asparagine at position 356 may be replaced with threonine.
  • a variant based on amadoriase from Eupenicillium terrenum may have one or more amino acid substitutions at the following positions: (A) Arginine at position 62 (b) Leucine at position 63 (c) Glutamic acid at position 102 (d) Asparagine at position 106 (e) Lysine at position 110 (f) Threonine at position 113 (g) Alanine at position 355 ( h) Glycine 419 (i) Aspartic acid 68 , Glutamine, glutamic acid, glycine, valine, leucine, isoleucine, cysteine, serine, threonine or proline.
  • leucine at position 63 is replaced with histidine.
  • glutamic acid at position 102 is substituted with lysine.
  • asparagine at position 106 is replaced with lysine.
  • the lysine at position 110 is replaced with leucine.
  • the threonine at position 113 is replaced with lysine.
  • alanine at position 355 is replaced with serine.
  • glycine at position 419 may be substituted with lysine.
  • aspartic acid at position 68 may be substituted with asparagine.
  • asparagine at position 356 may be replaced with threonine.
  • a variant based on fructosyl amino acid oxidase from Cryptococcus neoformans may have one or more amino acid substitutions at the following positions: (A) Arginine at position 62 (b) Isoleucine at position 63 (c) Glutamic acid at position 102 (d) Serine at position 106 (e) Serine at position 110 (f) Alanine at position 113 (g) Alanine at position 355 ( h) Alanine at position 420 (i) Aspartic acid at position 68 (j) Asparagine at position 356 Fructosyl amino acid oxidase (CnFX, SEQ ID NO: 89 or 149) derived from the above Cryptococcus neoformans, preferably (a) Arginine at position 62 Can be substituted with alanine, aspartic acid, asparagine, glutamine, glutamic acid, glycine, valine, leucine, isoleu
  • (b) isoleucine at position 63 is replaced with histidine.
  • (c) glutamic acid at position 102 is substituted with lysine.
  • serine at position 106 is substituted with lysine.
  • the serine at position 110 is replaced with leucine.
  • the alanine at position 113 is replaced with lysine.
  • alanine at position 355 is replaced with serine.
  • alanine at position 420 may be substituted with lysine.
  • aspartic acid at position 68 may be substituted with asparagine.
  • asparagine at position 356 may be replaced with threonine.
  • a variant based on ketoamine oxidase (SEQ ID NO: 113) from Pyrenochaeta sp. May have one or more amino acid substitutions at the following positions: (A) Arginine at position 62 (b) Leucine at position 63 (c) Lysine at position 102 (d) Aspartic acid at position 106 (e) Alanine at position 110 (f) Threonine at position 113 (g) Alanine at position 353 (H) Alanine at position 418 (i) Aspartic acid at position 68 (j) Alanine at position 354 In the ketoamine oxidase (SEQ ID NO: 113) derived from Pyrenochaeta sp.
  • Aspartic acid asparagine, glutamine, glutamic acid, glycine, valine, leucine, isoleucine, cysteine, serine, threonine or proline can be substituted.
  • leucine at position 63 is replaced with histidine.
  • lysine at position 102 may not be substituted.
  • the aspartic acid at position 106 is replaced with lysine.
  • the alanine at position 110 is replaced with leucine.
  • the threonine at position 113 is replaced with lysine.
  • alanine at position 353 is substituted with serine.
  • alanine at position 418 may be substituted with lysine.
  • aspartic acid at position 68 may be substituted with asparagine.
  • alanine at position 354 may be substituted with threonine.
  • a variant based on ketoamine oxidase (SEQ ID NO: 115) from Arthrinium sp. May have one or more amino acid substitutions at the following positions: (A) Arginine at position 62 (b) Leucine at position 63 (c) Lysine at position 102 (d) Alanine at position 106 (e) Glutamine at position 110 (f) Threonine at position 113 (g) Alanine at position 356 ( h) Alanine at position 421 (i) Aspartic acid at position 68 (j) Alanine at position 357 In the above-mentioned ketoamine oxidase derived from Arthrinium sp.
  • Arginine at position 62 is preferably alanine It can be substituted with acid, asparagine, glutamine, glutamic acid, glycine, valine, leucine, isoleucine, cysteine, serine, threonine or proline.
  • leucine at position 63 is replaced with histidine.
  • lysine at position 102 may not be substituted.
  • alanine at position 106 is substituted with lysine.
  • glutamine at position 110 is replaced with leucine.
  • the threonine at position 113 is replaced with lysine.
  • alanine at position 356 is substituted with serine.
  • alanine at position 421 may be substituted with lysine.
  • aspartic acid at position 68 may be substituted with asparagine.
  • alanine at position 357 may be substituted with threonine.
  • a variant based on ketoamine oxidase (SEQ ID NO: 117) from Curvularia clavata may have one or more amino acid substitutions at the following positions: (A) Arginine at position 62 (b) Leucine at position 63 (c) Glutamic acid at position 102 (d) Aspartic acid at position 106 (e) Alanine at position 110 (f) Alanine at position 113 (g) Alanine at position 353 (H) Alanine at position 418 (i) Aspartic acid at position 68 (j) Alanine at position 354
  • arginine at position 62 is alanine or asparagine It can be substituted with acid, asparagine, glutamine, glutamic acid, glycine, valine, leucine, isoleucine, cysteine, serine, threonine or proline.
  • leucine at position 63 is replaced with histidine.
  • glutamic acid at position 102 is substituted with lysine.
  • the aspartic acid at position 106 is replaced with lysine.
  • the alanine at position 110 is replaced with leucine.
  • the alanine at position 113 is replaced with lysine.
  • alanine at position 353 is substituted with serine.
  • alanine at position 418 may be substituted with lysine.
  • aspartic acid at position 68 may be substituted with asparagine.
  • (j) alanine at position 354 may be substituted with threonine.
  • a variant based on ketoamine oxidase (Cc95FX, SEQ ID NO: 99) with 95% amino acid sequence identity with ketoamine oxidase (SEQ ID NO: 117) from Curvularia clavata has one or more amino acid substitutions at the following positions:
  • leucine at position 63 is replaced with histidine.
  • glutamic acid at position 102 is substituted with lysine.
  • the aspartic acid at position 106 is replaced with lysine.
  • the alanine at position 110 is replaced with leucine.
  • the alanine at position 113 is replaced with lysine.
  • alanine at position 353 is substituted with serine. In some cases (h) serine at position 418 may be substituted with lysine. In some cases (i) aspartic acid at position 68 may be substituted with asparagine. In some cases, (j) alanine at position 354 may be substituted with threonine.
  • a variant based on fructosyl peptide oxidase (SEQ ID NO: 119) from Emericella nidulans may have one or more amino acid substitutions at the following positions: (A) Arginine at position 61 (b) Leucine at position 62 (c) Glutamic acid at position 101 (d) Lysine at position 105 (e) Arginine at position 109 (f) Serine at position 112 (g) Alanine at position 355 ( h) Alanine at position 420 (i) Aspartic acid at position 67 (j) Asparagine at position 356
  • arginine at position 61 is alanine or asparagine.
  • leucine at position 62 is replaced with histidine.
  • glutamic acid at position 101 is replaced with lysine.
  • lysine at position 105 may not be substituted.
  • arginine at position 109 is replaced with leucine.
  • serine at position 112 is replaced with lysine.
  • alanine at position 355 is replaced with serine.
  • alanine at position 420 may be substituted with lysine.
  • aspartic acid at position 67 may be substituted with asparagine.
  • asparagine at position 356 may be replaced with threonine.
  • a variant based on fructosyl amino acid oxidase (SEQ ID NO: 121) from Ulocladium sp. May have one or more amino acid substitutions at the following positions: (A) Arginine at position 62 (b) Leucine at position 63 (c) Lysine at position 102 (d) Aspartic acid at position 106 (e) Alanine at position 110 (f) Alanine at position 113 (g) Alanine at position 353 (H) Alanine at position 418 (i) Aspartic acid at position 68 (j) Alanine at position 354 In the fructosyl amino acid oxidase derived from Ulocladium sp.
  • Arginine at position 62 is alanine.
  • aspartic acid, asparagine, glutamine, glutamic acid, glycine, valine, leucine, isoleucine, cysteine, serine, threonine or proline can be substituted.
  • leucine at position 63 is replaced with histidine.
  • lysine at position 102 may not be substituted.
  • the aspartic acid at position 106 is replaced with lysine.
  • the alanine at position 110 is replaced with leucine.
  • the alanine at position 113 is replaced with lysine.
  • alanine at position 353 is substituted with serine.
  • alanine at position 418 may be substituted with lysine.
  • aspartic acid at position 68 may be substituted with asparagine.
  • alanine at position 354 may be substituted with threonine.
  • a variant based on fructosyl amino acid oxidase (SEQ ID NO: 123) from Penicillium janthinellum may have one or more amino acid substitutions at the following positions: (A) Arginine at position 62 (b) Leucine at position 63 (c) Glutamic acid at position 102 (d) Serine at position 106 (e) Lysine at position 110 (f) Aspartic acid at position 113 (g) Alanine at position 355 (H) Serine at position 419 (i) Aspartic acid at position 68 (j) Asparagine at position 356 Fructosyl amino acid oxidase derived from Penicillium janthinellum (SEQ ID NO: 123), preferably (a) Arginine at position 62 is alanine or Aspartic acid, asparagine, glutamine, glutamic acid, glycine, valine, leucine, isoleucine, cysteine, serine, threonine or proline
  • leucine at position 63 is replaced with histidine.
  • glutamic acid at position 102 is substituted with lysine.
  • serine at position 106 is substituted with lysine.
  • the lysine at position 110 is replaced with leucine.
  • the aspartic acid at position 113 is replaced with lysine.
  • alanine at position 355 is replaced with serine.
  • serine at position 419 may be substituted with lysine.
  • aspartic acid at position 68 may be substituted with asparagine.
  • asparagine at position 356 may be replaced with threonine. The same applies to fructosyl amino acid oxidase derived from Penicillium chrysogenum.
  • the amadoriase that acts directly on hemoglobin A1c of the present invention preferably recognizes the ⁇ chain of hemoglobin A1c as a substrate, As an action, the ⁇ chain of hemoglobin A1c is oxidized to produce hydrogen peroxide, Having an optimum pH range of pH 6-8, Having a working pH range of pH 5-9, The working temperature is 25 ⁇ 40 °C, The molecular weight on SDS-PAGE may be about 45-55 KDa, for example about 48-50 KDa.
  • amadoriase that does not show any activity against HbA1c is excluded from the amadoriase mutants or modifications of the present invention.
  • amadoriase genes In order to obtain genes encoding these amadoriases (hereinafter also simply referred to as “amadoriase genes”), generally used gene cloning methods are used. For example, chromosomal DNA or mRNA can be extracted from microbial cells having the ability to produce amadoriase and various cells by a conventional method, for example, a method described in Current Protocols in Molecular Biology (WILEY Interscience, 1989). Furthermore, cDNA can be synthesized using mRNA as a template. A chromosomal DNA or cDNA library can be prepared using the chromosomal DNA or cDNA thus obtained.
  • a suitable probe DNA is synthesized, and using this, a method for selecting the amadoriase gene from a chromosomal DNA or cDNA library, or a suitable primer DNA based on the amino acid sequence. And amplifying DNA containing the gene fragment of interest encoding amadoriase by an appropriate polymerase chain reaction (Polymerase Chain Reaction, PCR method) such as 5'RACE method or 3'RACE method. Can be ligated to obtain a DNA containing the full length of the target amadoriase gene.
  • PCR method Polymerase Chain Reaction
  • a preferred example of the gene encoding the amadoriase obtained in this way is the amadoriase gene derived from the genus Coniocaeta (Japanese Patent Laid-Open No. 2003-235585).
  • amadoriase gene derived from Phaeosphaeria genus can be mentioned.
  • Amadoriase gene derived from Neocosmospora genus can be mentioned.
  • Amadoriase gene derived from Aspergillus genus can be mentioned.
  • Amadoriase gene derived from Cryptococcus genus can be mentioned.
  • amadoriase genes are linked to various vectors as usual.
  • a recombinant plasmid pKK223-3-CFP-T7 International Publication No. 2007/12579 containing DNA encoding an amadoriase gene derived from Coniochaeta sp. NISL 9330, GenElute Plasmid Miniprep Kit (manufactured by Sigma-Alcrich)
  • a recombinant plasmid pKK223-3-CFP-T7 containing a DNA encoding the amadoriase gene can be obtained by extraction and purification.
  • amadoriase genes derived from other organisms those skilled in the art can obtain DNA by the same procedure according to conventional methods. Specifically, Escherichia coli carrying a recombinant plasmid pUTE100K′-EFP-T5 (International Publication No. 2007/1225779) containing a DNA encoding the amadoriase gene derived from Eupenicillium terrenum ATCC 18547 strain is cultured, and GenElute Plasmid Miniprep By using Kit, a recombinant plasmid pUTE100K′-EFP-T5 containing DNA encoding the amadoriase gene can be obtained by extraction from cells and purification.
  • a recombinant plasmid pET22b-AnFX containing DNA encoding the amadoriase gene can be obtained by extraction and purification.
  • a recombinant plasmid pET22b-CnFX International Publication No.
  • a recombinant plasmid pET22b-CnFX containing the encoding DNA can be obtained by extraction and purification. Further, by culturing Escherichia coli carrying a recombinant plasmid pET22b-NvFX (International Publication No.
  • a recombinant plasmid pET22b-NvFX containing the encoding DNA can be obtained by extraction and purification.
  • the vector that can be used in the present invention is not limited to the above plasmid, and any other vector known to those skilled in the art such as bacteriophage, cosmid, and the like can be used. Specifically, for example, pBluescript II SK + (Stratagene) is preferable.
  • amadoriase gene mutation treatment The mutation process of the amadoriase gene can be performed by any known method depending on the intended mutant form. That is, a wide variety of methods such as a method of contacting and acting an amadoriase gene or a recombinant DNA incorporating the gene and a mutagen agent; an ultraviolet irradiation method; a genetic engineering method; or a method using a protein engineering method. Can be used.
  • Examples of the mutagen used in the mutation treatment include hydroxylamine, N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine, nitrous acid, sulfite, hydrazine, formic acid, and 5-bromouracil. be able to.
  • the various conditions for the contact and action are not particularly limited as long as it is possible to adopt conditions according to the type of drug used and the like and a desired mutation can be actually induced in the amadoriase gene.
  • a desired mutation can be induced by contact and action at a reaction temperature of 20 to 80 ° C. for 10 minutes or more, preferably 10 to 180 minutes, preferably at a drug concentration of 0.5 to 12M.
  • a reaction temperature 20 to 80 ° C. for 10 minutes or more, preferably 10 to 180 minutes, preferably at a drug concentration of 0.5 to 12M.
  • Even in the case of performing ultraviolet irradiation it can be carried out according to a conventional method as described above (Hyundai Kagaku, 024-30, June 1989 issue).
  • a method generally known as Site-Specific Mutagenesis can be used.
  • Kramer method Nucleic Acids Res., 12, 9441 (1984): Methods Enzymol., 154, 350 (1987): Gene, 37, 73 (1985), Eckstein method (Nucleic Acid Res. 49 (Nucleic Acid Res. 49)). (1985): Nucleic Acids Res., 13, 8765 (1985): Nucleic Acids Res, 14, 9679 (1986), Kunkel method (Proc. Natl. Acid. Sci. US, 48, 1982). ): Methods Enzymol., 154, 367 (1987)).
  • a technique known as a general PCR method can also be used (see Technique, 1, 11 (1989)).
  • a desired modified amadoriase gene can also be directly synthesized by an organic synthesis method or an enzyme synthesis method.
  • the determination or confirmation of the DNA base sequence of the amadoriase gene obtained by the above method can be performed by using, for example, a multicapillary DNA analysis system Applied Biosystems 3130xl Genetic Analyzer (manufactured by Life Technologies).
  • the amadoriase gene obtained as described above is incorporated into a vector such as a bacteriophage, a cosmid, or a plasmid used for transformation of prokaryotic cells or eukaryotic cells by a conventional method, and a host corresponding to each vector is selected by a conventional method.
  • a microorganism belonging to the genus Escherichia as a host for example, using the obtained recombinant DNA, for example, Escherichia coli K-12 strain, preferably Escherichia coli JM109 strain, Escherichia coli DH5 ⁇ strain (both manufactured by Takara Bio Inc.), etc. Transform or transduce them to obtain the respective strain.
  • amino acid sequence homology, identity or similarity The homology, identity, or similarity of amino acid sequences is determined by GENETYX (GENETYX) maximum matching and search homology programs, DNASIS Pro (Hitachi Solutions) maximum matching and multiple alignment, or CLUSTAL W multiple It can be calculated by a program such as alignment.
  • GENETYX GENETYX
  • DNASIS Pro Haitachi Solutions
  • CLUSTAL W multiple CLUSTAL W multiple It can be calculated by a program such as alignment.
  • amino acid sequence identity when two or more amadoriases are aligned, the amino acid positions that are identical in the two or more amadoriases can be examined. Based on such information, the same region in the amino acid sequence can be determined.
  • the percent identity means that the total number of amino acids in the region that can be aligned when performing alignment of two or more amino acid sequences using an algorithm such as Blosum62 is used as the denominator.
  • the percentage when the number of positions occupied by the same amino acid is used as a molecule. Therefore, usually, when there is a region where no identity is found in two or more amino acid sequences, for example, when there is an additional sequence in one amino acid sequence where no identity is found at the C-terminal, there is no region with the identity. Cannot be used to calculate% identity because it cannot be aligned.
  • amino acid positions that are similar in two or more amadoriases can be examined.
  • CLUSTALW can be used to align multiple amino acid sequences.
  • Blosum62 is used as an algorithm, and amino acids that are judged to be similar when multiple amino acid sequences are aligned are called similar amino acids.
  • amino acid substitutions may be due to substitutions between such similar amino acids.
  • the term “homology region” refers to a region in which, when two or more amadoriases are aligned, the amino acids at corresponding positions of a reference amadoriase and a comparison amadoriase are the same or consist of similar amino acids. It is a region composed of 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, or 10 or more consecutive amino acids. For example, in FIG. 1, an amadoriase having a sequence identity of 74% or more of the full-length amino acid sequence was aligned. Among these, the 10th to 32nd positions are composed of the same or similar amino acids based on Coniochaeta sp.
  • Amadoriase represented by SEQ ID NO: 1 and thus correspond to the homology region. Similarly, 36 to 41, 49 to 52, 54 to 58, 73 to 75, 84 to 86, 88 to 90, 120 to 122 with respect to Coniochaeta sp. Amadoriase represented by SEQ ID NO: 1.
  • the homology region of amadoriase is from positions 11 to 32, 36 to 41, 50 to 52, 54 to 58, and 84 to 86 based on ConiochaetaConsp.
  • Amadoriase represented by SEQ ID NO: 1. , 88-90, 145-150, 157-168, 202-205, 207-212, 215-225, 236-248, 258-261, 266-268, 270-273 275-287, 347-354, 357-363, 370-383, 385-387, and 405-410.
  • the homology region of amadoriase is positions 11 to 18, 20 to 32, 50 to 52, 54 to 58, 266 to 268, based on Coniochaeta sp.
  • the Amadoriase mutant of the present invention has 50% or more, preferably 60% or more, preferably 70% or more, preferably 75% or more, preferably 80% when aligned with an amadoriase having the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1. It has a full-length amino acid sequence identity of preferably 85% or more, more preferably 90% or more, more preferably 95% or more, and most preferably 99% or more, and high reactivity with ⁇ F6P. Furthermore, the amino acid sequence in the homology region of the amadoriase variant of the present invention is 80%, preferably 85%, preferably 90%, preferably 95%, preferably 98% with the amino acid sequence of the homology region in SEQ ID NO: 1. More preferably, it has a sequence identity of 99% or more.
  • the homology region of amadoriase is positions 10-32, 36-41, 49-52, 54-58, 73-75, 84-86 relative to the amadoriase of SEQ ID NO: 141. , 88-90, 120-122, 145-150, 156-162, 164-170, 180-182, 202-205, 207-211, 214-224, 227-230 236-241, 243-248, 258-261, 266-268, 270-273, 275-287, 295-297, 306-308, 310-316, 324-329 332, 334, 341, 344, 346, 355, 357, 363, 370, 383, 385, 387, 389, 394, A region consisting of amino acid sequences of positions 05-410 and 423-431, preferably positions 11-32, 36-41, 50-52, 54-58, 84-86, 88-90, 145-150, 157-168, 202-205, 207-212,
  • the amadoriase of the present invention comprises (i) an amadoriase having an amino acid sequence in which one or several amino acid substitutions, deletions or additions are made to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 141, or (ii) In the amadoriase of the above (i), the full-length amino acid sequence of the amadoriase has 70% or more sequence identity with the amino acid sequence of SEQ ID NO: 141, and positions 10 to 32 and 36 to 41 of SEQ ID NO: 141 , 49-52, 54-58, 73-75, 84-86, 88-90, 120-122, 145-150, 156-162, 164-170, 180-182 , 202-205, 207-211, 214-224, 227-230, 236-241, 243-248, 258-261, 266-268, 270-273, 275-287 , 295-297, 306-308, 310-316, 324-329, 332-334, 341-344
  • the amadoriase of the present invention has 95% or more sequence identity between the amino acid sequence in the homology region defined in (ii) above and the amino acid sequence in the homology region at the corresponding position of the amadoriase Amadoriase.
  • the amadoriase of the present invention includes the following amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, in addition to or independently of the above, (I) aspartic acid at position 68, and (ii) alanine at position 356, Having a substitution of one or more amino acid residues at a position corresponding to an amino acid selected from the group consisting of:
  • the amadoriase of the present invention includes the following amino acids in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1, (I) 262th asparagine, (Ii) 257th valine, (Iii) glutamic acid at position 249 (iv) glutamic acid at position 253, (V) 337th glutamine, (Vi) glutamic acid at position 340, (Vii) aspartic acid at position 232; (Viii) aspartic acid at position 129, (Ix) aspartic acid at position 132, (X) glutamic acid at position 133, (Xi) glutamic acid at position 44, (Xii) 256th glycine, (Xiii) glutamic acid at position 231 and (xiv) glutamic acid at position 81, Having a substitution of one or more amino acid residues at a position corresponding to an amino acid selected from the group consisting of:
  • the amadoriase of the present invention includes the following amino acids
  • the homologous amino acid residues in the sequence of each amadoriase sequence regardless of insertions or deletions in the amino acid sequences.
  • the homologous position is considered to exist at the same position in the three-dimensional structure, and it can be estimated that the homologous position has a similar effect on the specific function of the target amadoriase.
  • the amino acid “position corresponding to arginine at position 62 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1” refers to the confirmed amino acid sequence of Amadoriase, and the amino acid of Amadoriase derived from the genus Coniochaeta shown in SEQ ID NO: 1. It means the amino acid corresponding to the arginine at position 62 of the amadoriase of SEQ ID NO: 1 when compared with the sequence. Thereby, the amino acid sequence can be aligned and specified by the above-mentioned method of specifying “corresponding amino acid residue”.
  • amino acid at “position corresponding to arginine at position 62 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1” is auporicillium ⁇ ⁇ terrenum-derived amadoriase (SEQ ID NO: 40 and 145), Pyrenochaeta sp.-derived ketoamine oxidase (SEQ ID NO: 113) Ketoamine oxidase derived from Arthrinium sp.
  • the amino acid “position corresponding to leucine at position 63 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1” refers to the confirmed amino acid sequence of Amadoriase, the amino acid of Amadoriase derived from the genus Coniochaeta shown in SEQ ID NO: 1 It means the amino acid corresponding to leucine at position 63 of the amadoriase of SEQ ID NO: 1 when compared with the sequence. Thereby, the amino acid sequence can be aligned and specified by the above-mentioned method of specifying “corresponding amino acid residue”.
  • amino acid at “position corresponding to leucine at position 63 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1” is auporicillium terrenum-derived amadoriase (SEQ ID NOs: 40 and 145), Pyrenochaeta sp.-derived ketoamine oxidase (SEQ ID NO: 113) Ketoamine oxidase derived from Arthrinium sp.
  • the amino acid “position corresponding to glutamic acid at position 102 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1” refers to the confirmed amino acid sequence of Amadoriase, the amino acid of Amadoriase derived from the genus Coniochaeta shown in SEQ ID NO: 1 When compared with the sequence, it means the amino acid corresponding to glutamic acid at position 102 of the amadoriase of SEQ ID NO: 1. Thereby, the amino acid sequence can be aligned and specified by the above-mentioned method of specifying “corresponding amino acid residue”.
  • the amino acid of “position corresponding to glutamic acid at position 102 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1” is Auporicillium terrenum-derived amadoriase (SEQ ID NOs: 40 and 145), Curvularia clavata-derived ketoamine oxidase (SEQ ID NO: 117), In the case of ketoamine oxidase derived from Neocosmospora vasinfecta (SEQ ID NO: 54), fructosyl amino acid oxidase derived from Cryptococcus neoformans (SEQ ID NO: 89 and 149), fructosyl amino acid oxidase derived from Penicillium janthinellum (SEQ ID NO: 123), glutamic acid at position 102, Pyrenochaeta sp Derived from ketoamine oxidase (SEQ ID NO: 113), ketoamine oxidase derived from Arthrinium sp.
  • fructosyl peptide oxidase derived from Phaeosphaeria nodorum (SEQ ID NO: 38), Ulocladium sp.
  • fructosyl amino acid oxidase SEQ ID NO: 121
  • lysine at position 102 fructosyl peptide oxidase (SEQ ID NO: 119) derived from Emericella nidulans
  • glutamic acid at position 101 in the fructosyl amino acid oxidase SEQ ID NO: 62 and 147) derived from Aspergillus nidulans It is.
  • the amino acid at “position corresponding to aspartic acid at position 106 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1” refers to the confirmed amino acid sequence of Amadoriase, which is the Amadoriase derived from the genus Coniochaeta shown in SEQ ID NO: 1.
  • it means an amino acid corresponding to aspartic acid at position 106 of the amadoriase of SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence can be aligned and specified by the above-mentioned method of specifying “corresponding amino acid residue”.
  • amino acid at “position corresponding to aspartic acid at position 106 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1” is asparagine at position 106 in the amadoriase derived from Eupenicillium terrenum (SEQ ID NOs: 40 and 145), ketoamine derived from Pyrenochaeta sp. 106 for oxidase (SEQ ID NO: 113), ketoamine oxidase derived from Curvularia clavata (SEQ ID NO: 117), fructosyl peptide oxidase derived from Phaeosphaeria nodorum (SEQ ID NO: 38), fructosyl amino acid oxidase derived from Ulocladium sp.
  • the amino acid at “position corresponding to glutamine at position 110 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1” refers to the confirmed amino acid sequence of Amadoriase, the amino acid of Amadoriase derived from the genus Coniochaeta shown in SEQ ID NO: 1 When compared with the sequence, it means the amino acid corresponding to glutamine at position 110 of the amadoriase of SEQ ID NO: 1. Thereby, the amino acid sequence can be aligned and specified by the above-mentioned method of specifying “corresponding amino acid residue”.
  • amino acid “position corresponding to glutamine at position 110 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1” is auporicillium terrenum-derived amadoriase (SEQ ID NOs: 40 and 145), Penicillium janthinellum-derived fructosyl amino acid oxidase (SEQ ID NO: 123) In lysine at position 110, ketoamine oxidase from Pyrenochaeta sp. (SEQ ID NO: 113), ketoamine oxidase from Curvularia clavata (SEQ ID NO: 117), and fructosyl amino acid oxidase from Ulocladium sp.
  • SEQ ID NO: 121 in position 110 Of alanine of Arthrinium sp. (SEQ ID NO: 115), glutamine at position 110, and ketoamine oxidase (SEQ ID NO: 54) from Neocosmospora vasinfecta, glutamate at position 110, fructosyl from Cryptococcus neoformans Serine at position 110 for amino acid oxidase (SEQ ID NOs: 89 and 149), glycine at position 110 for Phaeosphaeria nodorum-derived fructosyl peptide oxidase (SEQ ID NO: 38), position 109 for fructosyl peptide oxidase derived from Emericella nidulans (SEQ ID NO: 119) Arginine, a fructosyl amino acid oxidase derived from Aspergillus nidulans (SEQ ID NOs: 62 and 147), is lysine at position 109.
  • the amino acid “position corresponding to alanine at position 113 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1” refers to the confirmed amino acid sequence of Amadoriase, and the amino acid of Amadoriase derived from the genus Coniochaeta shown in SEQ ID NO: 1. It means the amino acid corresponding to alanine at position 113 of the amadoriase of SEQ ID NO: 1 when compared with the sequence. Thereby, the amino acid sequence can be aligned and specified by the above-mentioned method of specifying “corresponding amino acid residue”.
  • amino acid “position corresponding to alanine at position 113 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1” is auporicillium terrenum-derived amadoriase (SEQ ID NOs: 40 and 145), Pyrenochaeta sp.-derived ketoamine oxidase (SEQ ID NO: 113) Arthrinium sp.-derived ketoamine oxidase (SEQ ID NO: 115), threonine at position 113, Curvularia clavata-derived ketoamine oxidase (SEQ ID NO: 117), Cryptococcus neoformans-derived fructosyl amino acid oxidase (SEQ ID NOs: 89 and 149), Phaeosphaeria Nodrum-derived fructosyl peptide oxidase (SEQ ID NO: 38), Ulocladium sp.-derived fructosyl amino acid oxidase (SEQ ID NO: 121), a
  • the amino acid “position corresponding to alanine at position 355 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1” refers to the confirmed amino acid sequence of Amadoriase, and the amino acid of Amadoriase derived from the genus Coniochaeta shown in SEQ ID NO: 1 When compared with the sequence, it means the amino acid corresponding to alanine at position 355 of the amadoriase of SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence can be aligned and specified by the above-mentioned method of specifying “corresponding amino acid residue”.
  • amino acid “position corresponding to alanine at position 355 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1” is auporicillium terrenum-derived amadoriase (SEQ ID NO: 40 and 145), Cryptococcus neoformans-derived fructosyl amino acid oxidase (SEQ ID NO: 89 and 149), fructosyl amino acid oxidase derived from Aspergillus nidulans (SEQ ID NO: 62 and 147), fructosyl peptide oxidase derived from Emericella nidulans (SEQ ID NO: 119), and fructosyl amino acid oxidase derived from Penicillium janthinellum (SEQ ID NO: 123) Alanine, Pyrenochaeta ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ sp.-derived ketoamine oxidase (SEQ ID NO: 113), Curvularia clavata-
  • the amino acid “position corresponding to alanine at position 419 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1” refers to the confirmed amino acid sequence of Amadoriase and the amino acid of Amadoriase derived from the genus Coniochaeta shown in SEQ ID NO: 1. It means the amino acid corresponding to alanine at position 419 of the amadoriase of SEQ ID NO: 1 when compared with the sequence. Thereby, the amino acid sequence can be aligned and specified by the above-mentioned method of specifying “corresponding amino acid residue”.
  • amino acid at “position corresponding to alanine at position 419 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1” is a glycine at position 419 in the amadoriase derived from Eupenicillium terrenum (SEQ ID NOs: 40 and 145), a ketoamine oxidase derived from Pyrenochaeta sp.
  • the amino acid at “position corresponding to aspartic acid at position 68 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1” is the determined amino acid sequence of Amadoriase, which is the amino acid sequence of the genus Amadoriase derived from the genus Coniochaeta shown in SEQ ID NO: 1.
  • Amadoriase is the amino acid sequence of the genus Amadoriase derived from the genus Coniochaeta shown in SEQ ID NO: 1.
  • it means the amino acid corresponding to aspartic acid at position 68 of the amadoriase of SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence can be aligned and specified by the above-mentioned method of specifying “corresponding amino acid residue”.
  • amino acid “position corresponding to aspartic acid at position 68 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1” is auporicillium ⁇ ⁇ terrenum-derived amadoriase (SEQ ID NOs: 40 and 145), Pyrenochaeta sp.-derived ketoamine oxidase (SEQ ID NO: 113). ), Ketoamine oxidase derived from Arthrinium sp.
  • the amino acid “position corresponding to alanine at position 356 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1” is the confirmed amino acid sequence of Amadoriase, and the amino acid of Amadoriase derived from the genus Coniochaeta shown in SEQ ID NO: 1 It means an amino acid corresponding to alanine at position 356 of the amadoriase of SEQ ID NO: 1 when compared with the sequence.
  • the amino acid sequence can be aligned and specified by the above-mentioned method of specifying “corresponding amino acid residue”.
  • amino acid “position corresponding to alanine at position 356 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1” is an asparagine at position 356 in the amadoriase derived from Eupenicillium terrenum (SEQ ID NOs: 40 and 145), a ketoamine oxidase derived from Pyrenochaeta sp. (SEQ ID NO: 113) alanine at position 354, ketoamine oxidase from Arthrinium sp.
  • ketoamine oxidase (SEQ ID NO: 115), alanine at position 357, ketoamine oxidase from Curvularia clavata (SEQ ID NO: 117), alanine at position 354, Neocosmospora vasinfecta
  • ketoamine oxidase (SEQ ID NO: 54) derived from alanine at position 356
  • fructosyl amino acid oxidase derived from Cryptococcus neoformans
  • asparagine in position 356 a fructosyl peptide oxidase derived from Phaeosphaeria nodorum Ase (SEQ ID NO: 38) alanine at position 352
  • fructosyl amino acid oxidase from Aspergillus nidulans (SEQ ID NOs: 62 and 147), asparagine at position 356, and fructosyl peptide oxidase from Emericella nidul
  • the amadoriase mutant of the present invention may be a single mutant or a multiple mutant having two or more amino acid substitutions.
  • the present inventors surprisingly found that amadoriase substituted with amino acids at positions corresponding to positions 62, 63, 102, 106, 110, 113, and 355 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1. It was found to show activity against HbA1c. Furthermore, the present inventors have surprisingly found that amadoriase substituted with amino acids at positions 68 and 356 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 has an increased activity against ⁇ F6P.
  • mutations at these positions (62/63/102/106/110/113/355/419 and 68/356), mutations that alter the substrate specificity of amadoriase, or change the substrate specificity of amadoriase Sometimes called amino acid substitution.
  • the amadoriase of the present invention has a specific activity (U / mg) for ⁇ F6P of 0.1 U / mg or more, 0.2 U / mg or more, 0.3 U / mg or more, 0.4 U / mg or more, 0.5 U / mg or more, 0.6 U / mg or more, 0.7 U / mg or more, 0.8 U / mg or more, 0.9 U / mg or more, for example, 1 U / mg or more.
  • the amadoriase may have 1 or more, 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, or 10 or more amino acid substitutions that change the substrate specificity.
  • Such an amadoriase of the present invention directly acts on HbA1c and can be used in the HbA1c measurement method of the present invention.
  • the amadoriase of the present invention having a specific activity (U / mg) for ⁇ F6P of 0.1 U / mg or more, when the amino acid sequence of amadoriase is aligned with the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1, (A) Arginine at position 62 of SEQ ID NO: 1, (B) leucine at position 63 of SEQ ID NO: 1, (C) glutamic acid at position 102 of SEQ ID NO: 1, (D) aspartic acid at position 106 of SEQ ID NO: 1, (E) glutamine at position 110 of SEQ ID NO: 1, (F) alanine at position 113 of SEQ ID NO: 1, (G) alanine at position 355 of SEQ ID NO: 1, (H) alanine at position 419 of SEQ ID NO: 1, (i) aspartic acid at position 68 of SEQ ID NO: 1; and (j) alanine at position 356 of SEQ ID NO: 1,
  • A Arginine at
  • amino acid at “position corresponding to position 62 arginine of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1” is serine at position 62 in the fructosyl peptide oxidase derived from Phaeosphaeria nodorum (SEQ ID NO: 38). From the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1, this is equivalent to the amino acid at the position corresponding to arginine at position 62 being serine, that is, substituted with serine.
  • SEQ ID NO: 38 fructosyl peptide oxidase derived from Phaeosphaeria nodorum
  • the amadoriase of the present invention having a specific activity (U / mg) against ⁇ F6P of 0.1 U / mg or more is selected from the group consisting of the following (a) to (j) of the amino acids described in SEQ ID NO: 1.
  • amino acids at the position corresponding to the amino acid at the position are described in each of the following: 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more, 9 or more, for example 10
  • the Amadoriase mutant of the present invention includes those in which the amino acid at the position corresponding to position 60 of SEQ ID NO: 1 is glycine.
  • Aspergillus nidulans-derived amadoriase is obtained by replacing the amino acid at position 59 in SEQ ID NO: 147 corresponding to position 60 in SEQ ID NO: 1 with serine in the wild type, but substituting it with glycine (SEQ ID NO: 62). It may be used as an amadoriase which is the basis for the variants of the invention. The same applies to Penicillium janthinellum (Pj) -derived amadoriase (SEQ ID NO: 123).
  • the present inventors have confirmed that the tolerance to the surfactant can be improved by substituting the amino acid residue of amadoriase.
  • the amadoriase of the present invention may optionally further have such an amino acid substitution.
  • amino acid substitution that brings about the improvement of the surfactant resistance
  • Substitution of glutamine at position 337 for example, substitution with lysine or arginine.
  • Substitution of glutamic acid at position 340 for example, substitution with proline.
  • Substitution of aspartic acid at position 232 for example, substitution with lysine or arginine.
  • Substitution of aspartic acid at position 129 for example, substitution with lysine or arginine.
  • Substitution of aspartic acid at position 132 for example, substitution with lysine or arginine.
  • Substitution of glutamic acid at position 133 for example, substitution with alanine, methionine, lysine, arginine.
  • Substitution of glutamic acid at position 44 for example, substitution with proline.
  • Substitution of glycine at position 256 for example, substitution with lysine or arginine.
  • Substitution of glutamic acid at position 81 for example, substitution with lysine or arginine.
  • the variant of amadoriase with improved surfactant resistance only needs to have at least one amino acid substitution as described above, and may have a plurality of amino acid substitutions. For example, it may have 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 or 14 of the above amino acid substitutions.
  • position corresponding to glutamic acid at position 44 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 refers to the confirmed amino acid sequence of Amadoriase, the amino acid sequence of Amadoriase derived from the genus Coniochaeta shown in SEQ ID NO: 1 Is the amino acid corresponding to glutamic acid at position 44 of the amadoriase of SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence can be identified by FIG. 1 in which the amino acid sequences are aligned by the above-described method of identifying the “corresponding amino acid residue”.
  • position corresponding to glutamic acid at position 81 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 means that the confirmed amino acid sequence of amadoriase is compared with the amino acid sequence of Amadoriase derived from the genus Coniochaeta shown in SEQ ID NO: 1. Means an amino acid corresponding to glutamic acid at position 81 of the amadoriase of SEQ ID NO: 1. This can also be identified from FIG. 1 in which the amino acid sequences are aligned by the above method.
  • the “position corresponding to glutamic acid at position 133 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1” means that the confirmed amino acid sequence of amadoriase is compared with the amino acid sequence of Amadoriase derived from the genus Coniochaeta shown in SEQ ID NO: 1. Means an amino acid corresponding to glutamic acid at position 133 in the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1. This can also be identified from FIG. 1 in which the amino acid sequences are aligned by the above method.
  • ketoamine oxidase derived from alanine at position 133 in the ketoamine oxidase derived from Curvularia clavata in position 133, glutamic acid in position 133, in ketoamine oxidase derived from Neocosmospora vasinfecta, in alanine at position 133, in the fructosyl amino acid oxidase from fructosyl amino acid oxidase 13 in the form of Cryptococcus neoformans
  • Phthasphaeria nodorum-derived fructosyl peptide oxidase is glutamic acid at position 131
  • Aspergillus nidulans-derived fructosyl amino acid oxidase is glutamic acid at position 132
  • Emeralella nidulans-derived fructosyl peptide oxidase is at position 132.
  • the “position corresponding to glutamic acid at position 253 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1” means that the confirmed amino acid sequence of amadoriase is compared with the amino acid sequence of Amadoriase derived from the genus Coniochaeta shown in SEQ ID NO: 1. Means an amino acid corresponding to glutamic acid at position 253 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1. This can also be identified from FIG. 1 in which the amino acid sequences are aligned by the above method.
  • ketoamine oxidase derived from glutamic acid at position 253 in ketoamine oxidase derived from Curvularia clavata, glutamic acid in position 251; in ketoamine oxidase derived from Neocosmospora vasinfecta, valine at position 253; in fructosyl amino acid derived from cructococcus neoformans oxidase; , 249th arginine in Phaeosphaeria nodorum derived fructosyl peptide oxidase, 253rd alanine in Aspergillus nidulans fructosyl amino acid oxidase, 253rd alanine in Emeralella nidulans fructosyl peptide oxidase, locladium sp.
  • the fructosyl amino acid oxidase derived from glutamic acid at position 251 in ketoamine oxidase derived from Curvularia
  • the “position corresponding to glycine at position 256 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1” means that the confirmed amino acid sequence of amadoriase is compared with the amino acid sequence of Amadoriase derived from the genus Coniochaeta shown in SEQ ID NO: 1. Means an amino acid corresponding to glycine at position 256 of the amadoriase of SEQ ID NO: 1. This can also be identified from FIG. 1 in which the amino acid sequences are aligned by the above method.
  • asparagine Pyrenochaeta sp., which is 256th in the amadoriase derived from Eupenicillium terrenum.
  • ketoamine oxidase derived from aspartic acid at position 254, Arthrium sp. Glycine at position 256 in the ketoamine oxidase derived from, 254th asparagine in the ketoamine oxidase derived from Curvularia clavata, glycine in the 256th position in ketoamine oxidase derived from Neocosmospora vasinfecta, and fructosyl amino acid glutamine glutamin oxidase derived from Cryptococcus neoformans in the 56th position.
  • the fructosyl amino acid oxidase derived from Penicillium janthinelum is aspartic acid at position 256.
  • the position corresponding to valine at position 257 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 means that the confirmed amino acid sequence of amadoriase is compared with the amino acid sequence of Amadoriase derived from the genus Coniochaeta shown in SEQ ID NO: 1. Means the amino acid corresponding to the valine at position 257 of the amadoriase of SEQ ID NO: 1. This can also be identified from FIG. 1 in which the amino acid sequences are aligned by the above method.
  • Phthaosphaeria nodorum-derived fructosyl peptide oxidase is serine at position 253
  • Aspergillus nidulans-derived fructosyl amino acid oxidase is threonine at position 257
  • Emeralella nidulans-derived fructosyl peptide oxidase is threonine at position 257
  • Ulo ladium sp Ulo ladium sp.
  • the valine at position 255 In the fructosyl amino acid oxidase derived from valine, the valine at position 255, and in the fructosyl amino acid oxidase derived from Penicillium janthinelum, it is valine at position 257.
  • the position corresponding to asparagine at position 262 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 means that the confirmed amino acid sequence of amadoriase is compared with the amino acid sequence of Amadoriase derived from the genus Coniochaeta shown in SEQ ID NO: 1. Means the amino acid corresponding to asparagine at position 262 of the amadoriase of SEQ ID NO: 1. This can also be identified from FIG. 1 in which the amino acid sequences are aligned by the above method.
  • ketoamine oxidase derived from asparagine at position 260 Arthrinium sp.
  • the ketidine oxidase derived from histidine at position 262 the ketoamine oxidase derived from Curvularia clavata asparagine at position 260, the ketoamine oxidase derived from Neocosmospora vasinfecta histidine at position 262, and the fructosyl oxidase derived from ascites oxidase 26 at the position Cryptococcus neoformans oxidase.
  • the 260th position is asparagine
  • in the fructosyl amino acid oxidase derived from Penicillium janthinelum it is aspartic acid at position 262.
  • the position corresponding to glutamine at position 337 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 means that the confirmed amino acid sequence of amadoriase is compared with the amino acid sequence of Amadoriase derived from the genus Coniochaeta shown in SEQ ID NO: 1. Means the amino acid corresponding to glutamine at position 337 of the amadoriase of SEQ ID NO: 1. This can also be identified from FIG. 1 in which the amino acid sequences are aligned by the above method.
  • fructosyl amino acid oxidase derived from threonine at position 335 in the fructosyl amino acid oxidase derived from Penicillium janthinelum, it is lysine at position 337.
  • the position corresponding to glutamic acid at position 340 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 means that the confirmed amino acid sequence of amadoriase is compared with the amino acid sequence of Amadoriase derived from the genus Coniochaeta shown in SEQ ID NO: 1. Means an amino acid corresponding to glutamic acid at position 340 of the amadoriase of SEQ ID NO: 1. This can also be identified from FIG. 1 in which the amino acid sequences are aligned by the above method.
  • ketoamine oxidase derived from Eupenicillium terrenum glutamic acid at position 340, Pyrenochaeta sp.
  • ketoamine oxidase derived from glutamic acid at position 338 Arthrium sp.
  • glutamic acid in position 340 in ketoamine oxidase derived from Neocosmospora vasinfecta, in the form of proline at position 340 in fructosyl amino acid derived from Cryptococcus neoformans.
  • Phthasphaeria nodorum-derived fructosyl peptide oxidase is lysine at position 336
  • Aspergillus nidulans-derived fructosyl amino acid oxidase is glutamic acid at position 340
  • Fructosyl peptide oxidase from Emericella nidulans is at position 340.
  • the fructosyl amino acid oxidase derived from Penicillium janthinelum is glutamic acid at position 340.
  • the position corresponding to aspartic acid at position 129 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 means that the confirmed amino acid sequence of amadoriase is compared with the amino acid sequence of Amadoriase derived from the genus Coniochaeta shown in SEQ ID NO: 1 And amino acid corresponding to aspartic acid at position 129 of the amadoriase of SEQ ID NO: 1. This can also be identified from FIG. 1 in which the amino acid sequences are aligned by the above method.
  • the position corresponding to aspartic acid at position 132 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 means that the confirmed amino acid sequence of amadoriase is compared with the amino acid sequence of Amadoriase derived from the genus Coniochaeta shown in SEQ ID NO: 1 Further, it means an amino acid corresponding to aspartic acid at position 132 of the amadoriase of SEQ ID NO: 1. This can also be identified from FIG. 1 in which the amino acid sequences are aligned by the above method.
  • the position corresponding to glutamic acid at position 231 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 means that the confirmed amino acid sequence of amadoriase is compared with the amino acid sequence of Amadoriase derived from the genus Coniochaeta shown in SEQ ID NO: 1. Means the amino acid corresponding to glutamic acid at position 231 of the amadoriase of SEQ ID NO: 1. This can also be identified from FIG. 1 in which the amino acid sequences are aligned by the above method.
  • ketoamine oxidase derived from glutamic acid at position 231 In the case of ketoamine oxidase derived from glutamic acid at position 231; in the case of ketoamine oxidase derived from Curvularia clavata, glutamic acid in position 229; in ketoamine oxidase derived from Neocosmospora vasinfecta; glutamic acid in position 231; , Histidine at position 227 for fructosyl peptide oxidase derived from Phaeosphaeria nodorum, glutamic acid at position 231 for fructosyl amino acid oxidase derived from Aspergillus nidulans, position 231 for fructosyl peptide oxidase derived from Emericella nidulans Glutamic acid, Ulocladium sp. It is glutamine at position 229 in the fructosyl amino acid oxidase derived from it, and glutamic acid at position 2
  • the position corresponding to aspartic acid at position 232 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 means that the confirmed amino acid sequence of amadoriase is compared with the amino acid sequence of the amadoriase derived from Coniochaeta genus shown in SEQ ID NO: 1 Further, it means an amino acid corresponding to aspartic acid at position 232 of the amadoriase of SEQ ID NO: 1. This can also be identified from FIG. 1 in which the amino acid sequences are aligned by the above method.
  • ketoamine oxidase derived from glutamic acid at position 232 in ketoamine oxidase derived from Curvularia clavata aspartic acid in position 230, in ketoamine oxidase derived from Neocosmospora vasinfecta, glutamic acid in position 232 from position 2 of fructosylamino acid derived from Cryptococcus neoformans oxidase Glycine, Phthaosphaeria nodorum-derived fructosyl peptide oxidase, glutamic acid at position 228, Aspergillus nidulans-derived fructosyl amino acid oxidase, glutamic acid at position 232, and Fructosyl peptide oxidase from Emeralella nidulans, position 232 Glutamic acid, Ulocladium sp.
  • the position corresponding to glutamic acid at position 249 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 means that the confirmed amino acid sequence of amadoriase is compared with the amino acid sequence of Amadoriase derived from the genus Coniochaeta shown in SEQ ID NO: 1. Means the amino acid corresponding to glutamic acid at position 249 of the amadoriase of SEQ ID NO: 1. This can also be identified from FIG. 1 in which the amino acid sequences are aligned by the above method.
  • Phthaosphaeria nodorum-derived fructosyl peptide oxidase is glutamic acid at position 245, Aspergillus nidulans-derived fructosyl amino acid oxidase is alanine at position 249, and Emeralella nidulans-derived fructosyl peptide oxidase is at position 249.
  • This mutation is sometimes referred to as a mutation that improves the surfactant resistance of amadoriase or an amino acid substitution that improves the surfactant resistance of amadoriase.
  • the amadoriase of the present invention may have mutations that further improve surfactant resistance in addition to mutations that alter substrate specificity.
  • amadoriase of the present invention may further lack three amino acid residues from the carboxyl terminus in addition to the above substitution.
  • the sequence of 3 residues at this position consists of a proline at position 435, a lysine at position 436, and a leucine at position 437. Can be identified from FIG.
  • the 3 amino acids at the carboxyl terminal consist of alanine at position 435, histidine at position 436, and leucine at position 437, and Pyrenochaeta sp.
  • the ketoamine oxidase derived from the above the three amino acids at the carboxyl terminus are composed of alanine at position 438, lysine at position 439, and leucine at position 440, and Artrinium sp.
  • the 3 amino acids at the carboxyl end consist of histidine at position 450, the lysine at position 451, and the leucine at position 452.
  • the 3 amino acids at the carboxyl end are serine at position 438, position 439
  • the fructosyl peptide oxidase derived from Phaeosphaeria nodorum consists of 3 amino acids at the carboxyl terminus consisting of alanine at position 435, asparagine at position 436 and leucine at position 437, and fructosyl amino acid oxidase derived from Aspergillus nidulans. So, the three amino acids at the carboxyl terminus are alanine at position 436, lysine at position 437, and methionine at position 438.
  • Emericella nidulans of 3 amino acids at position 436 of the carboxyl terminal is fructosyl peptide oxidase derived from alanine, consists 437 of lysine and position 438 methionine, Ulocladium sp.
  • the 3 amino acids at the carboxyl terminal consist of alanine at position 439, the lysine at position 440, and the leucine at position 441.
  • the 3 amino acids at the carboxyl terminal are at the alanine at position 435, It consists of lysine at position 436 and leucine at position 437.
  • deletion of these carboxyl terminal amino acid residues related to amadoriase is sometimes referred to as deletion that improves the thermal stability of amadoriase.
  • the amadoriase of the invention may have a deletion that improves thermal stability in addition to a mutation that changes substrate specificity, a mutation that improves surfactant resistance.
  • this strain may be cultured by a normal solid culture method, but a liquid culture method is adopted. It is preferable to culture.
  • the present invention provides a method for producing amadoriase, comprising a step of culturing a strain having an ability to produce amadoriase under conditions capable of expressing amadoriase protein, and a step of isolating amadoriase from the culture or culture medium.
  • a host cell transformed with a vector incorporating a gene encoding the amadoriase of the present invention can be used.
  • the condition under which the amadoriase protein can be expressed means that the amadoriase gene is transcribed and translated, and a polypeptide encoded by the gene is produced.
  • Examples of the medium for culturing the above strain include, for example, yeast extract, tryptone, peptone, meat extract, corn steep liquor or one or more nitrogen sources such as soybean or wheat bran leachate, sodium chloride, dihydrogen phosphate. Add one or more inorganic salts such as potassium, dipotassium hydrogen phosphate, magnesium sulfate, magnesium chloride, ferric chloride, ferric sulfate or manganese sulfate, and add sugar raw materials, vitamins, etc. as necessary. Used.
  • the amount of the target enzyme produced by adding a substrate on which the amadoriase can act or a similar compound such as glycated amino acid, glycated peptide, glycated protein degradation product, or glycated protein such as glycated hemoglobin or glycated albumin. can be improved.
  • Culturing is carried out at a culture temperature of 20 to 42 ° C., preferably at a culture temperature of about 25 to 37 ° C. for 4 to 24 hours, more preferably at a culture temperature of about 25 to 37 ° C. for 8 to 16 hours, deep aeration and agitation, It is preferable to carry out by culture, stationary culture or the like.
  • the cells are subjected to ultrasonic disruption treatment, grinding treatment, or the like, or the enzyme is extracted using a lytic enzyme such as lysozyme, or shaken or left in the presence of toluene or the like for lysis. This enzyme can be discharged out of the cells. Then, this solution is filtered, centrifuged, etc.
  • a normal enzyme collecting means For example, the cells are subjected to ultrasonic disruption treatment, grinding treatment, or the like, or the enzyme is extracted using a lytic enzyme such as lysozyme, or shaken or left in the presence of toluene or the like for lysis. This enzyme can be discharged out of the cells. Then, this solution is filtered, centrifuged, etc.
  • nucleic acid is removed with streptomycin sulfate, protamine sulfate, manganese sulfate or the like, and then ammonium sulfate, alcohol, acetone or the like is added thereto.
  • the fraction is collected and the precipitate is collected to obtain a crude enzyme of amadoriase.
  • amadoriase purified enzyme preparation from the crude enzyme of the above amadoriase, for example, gel filtration method using Sephadex, Superdex or Ultrogel, ion exchange carrier, hydrophobic carrier, adsorption elution method using hydroxyapatite, Select electrophoresis method using polyacrylamide gel, sedimentation method such as sucrose density gradient centrifugation, affinity chromatography method, fractionation method using molecular sieve membrane or hollow fiber membrane, etc.
  • gel filtration method using Sephadex, Superdex or Ultrogel ion exchange carrier
  • hydrophobic carrier hydrophobic carrier
  • adsorption elution method using hydroxyapatite for example, gel filtration method using polyacrylamide gel, sedimentation method such as sucrose density gradient centrifugation, affinity chromatography method, fractionation method using molecular sieve membrane or hollow fiber membrane, etc.
  • amadoriase of the present invention Reactivity of the amadoriase of the present invention to HbA1c
  • the amadoriase obtained by the above means can act directly on HbA1c as a result of mutation in its amino acid sequence by genetic modification or the like.
  • the amadoriase of the present invention may also have improved reactivity with ⁇ F6P compared to that before modification. Specifically, the ratio of “reactivity to ⁇ F6P” when “reactivity to ⁇ FVH” is 1 may be increased as compared with that before modification.
  • ⁇ F6P / ⁇ FVH which indicates the ratio of reactivity to ⁇ F6P when the reactivity to ⁇ FVH is 1, is 10% or more, preferably 20% or more, more preferably 30% relative to that before modification. As described above, more preferably 40% or more may be improved.
  • ⁇ F6P / ⁇ FV which indicates the ratio of reactivity to ⁇ F6P when the reactivity to ⁇ FV is 1, is 10% or more, preferably 20% or more, more preferably 30% relative to that before modification. % Or more, more preferably 40% or more. “Reactivity to ⁇ FV” may be expressed as “ ⁇ FV oxidation activity”.
  • an amadoriase of the present invention that directly acts on HbA1c is, for example, an amadoriase produced by E. coli JM109 (pKK223-3-CFP-T7-H35).
  • an amadoriase directly acts on HbA1c without treating HbA1c with a protease or the like, thereby enabling the realization of an enzyme measurement system for directly measuring HbA1c in a sample, which is very advantageous for industrial use.
  • Method for measuring amadoriase activity Various methods can be used as a method for measuring the activity of amadoriase. As an example, a method for measuring amadoriase activity used in the present invention will be described below.
  • Examples of the method for measuring the enzyme activity of amadoriase in the present invention include a method for measuring the amount of hydrogen peroxide produced by the reaction of the enzyme and a method for measuring the amount of oxygen consumed by the enzyme reaction.
  • a method for measuring the amount of hydrogen peroxide will be described.
  • ⁇ FV, ⁇ FVH, or ⁇ F6P is used as a substrate unless otherwise specified.
  • the enzyme titer is defined as 1 U for the amount of enzyme that produces 1 ⁇ mol of hydrogen peroxide per minute when measured using ⁇ FV, ⁇ FVH, or ⁇ F6P as a substrate.
  • the specific activity (U / mg) is the enzyme titer (U) per 1 mg of enzyme.
  • U the enzyme titer
  • the same enzyme titer as that of an enzyme with a specific activity of 1 U / mg can be obtained by increasing the amount of the enzyme 10 times.
  • ⁇ F6P active to ⁇ F6P
  • a specific activity (U / mg) against ⁇ F6P of 0.1 U / mg or more, 0.2 U / mg or more, 0.3 U / mg or more, 0.4U / mg or more, 0.5U / mg or more, 0.6U / mg or more, 0.7U / mg or more, 0.8U / mg or more, 0.9U / mg or more, for example, 1U / mg or more Shall be included.
  • glycated peptide such as ⁇ FV and ⁇ FVH
  • ⁇ FV and ⁇ FVH those synthesized and purified based on the method of Sakagami et al.
  • Can be used see JP 2001-95598 A.
  • glycated hemoglobin (HbA1c) with endoproteinase Glu-C
  • ⁇ -glycated hexapeptide derived from the ⁇ chain subunit of glycated hemoglobin (HbA1c) (fructosyl Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu) Is released (Clin. Chem., 43, 1994-1951 (1997)).
  • HbA1c glycated hemoglobin
  • a synthetic substrate fructosyl Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu manufactured by Peptide Institute
  • Peptide Institute which is the same substance as this ⁇ -glycated hexapeptide
  • Reagent 1 Preparation of reagent (Preparation example of reagent for measuring activity of amadoriase against ⁇ F6P, ⁇ FVH or ⁇ FV)
  • Reagent 1 0.1 M phosphate buffer pH 6.5 containing 5 U / ml peroxidase, 0.49 mM 4-aminoantipyrine 5.0 kU peroxidase (manufactured by Kikkoman) and 100 mg of 4-aminoantipyrine (manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) are dissolved in 0.1 M potassium phosphate buffer (pH 6.5) and adjusted to a volume of 1000 ml. .
  • Reagent 2 A 15 mM TOOS solution 500 mg of TOOS (sodium N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) -m-toluidine, manufactured by Dojindo Laboratories) was dissolved in ion-exchanged water to make 100 ml. Constant volume.
  • Reagent 3 Substrate solution (30 mM; final concentration 1 mM) ⁇ F6P (manufactured by Peptide Institute) 257.1 mg, or ⁇ FVH (manufactured by Kikkoman) 124.9 mg, or ⁇ FV (manufactured by Kikkoman) 83.8 mg is dissolved in ion-exchanged water and made up to a volume of 10 ml.
  • Activity measurement method (an example of a method for measuring the activity of amadoriase on ⁇ F6P, ⁇ FVH or ⁇ FV) 2.7 ml of reagent 1, 100 ⁇ l of reagent 2, and 100 ⁇ l of enzyme solution are mixed and pre-warmed at 37 ° C. for 5 minutes. Thereafter, 100 ⁇ l of Reagent 3 was added and mixed well, and the time course of absorbance at 555 nm was observed with a spectrophotometer (U-3010A, manufactured by Hitachi High-Technologies Corporation), and the amount of change per minute in absorbance at 555 nm ( ⁇ As) is measured.
  • a spectrophotometer U-3010A, manufactured by Hitachi High-Technologies Corporation
  • the amount of change per minute ( ⁇ A0) in absorbance at 555 nm is measured in the same manner as described above except that 100 ⁇ l of ion-exchanged water is added instead of 100 ⁇ l of reagent 3.
  • the number of micromoles of hydrogen peroxide produced per minute at 37 ° C. is defined as the activity unit (U) in the enzyme solution and is calculated according to the following formula.
  • HbA1c solution HbA1c certified practical reference material JCCRM423 manufactured by National Institute for Laboratory Medicine
  • Reagent A1 Sample pretreatment solution 5.0% n-dodecyl- ⁇ -D-maltoside (manufactured by Dojindo Laboratories)
  • Reagent A2 Sample pretreatment solution 5.0% n-tetradecyl- ⁇ -D-maltoside (manufactured by Sigma-Aldrich)
  • Reagent B leuco dye, peroxidase solution 150 mM potassium phosphate buffer, pH 6.5 0.30 mM N- (carboxymethylaminocarbonyl) -4,4′-bis (dimethylamino) diphenylamine sodium (DA-64, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 15 U / ml peroxidas
  • sample diluent (sometimes referred to as “sample diluent” in this specification)
  • 25 ⁇ l of the sample dilution is diluted with 50 ⁇ l of the reagent.
  • the leuco dye When hydrogen peroxide is generated in the solution, the leuco dye is colored by the action of peroxidase, and the absorbance of light at 751 nm increases. Based on the results obtained according to the HbA1c concentration of the sample, the HbA1c concentration (NGSP value) of the sample and the absorbance difference ⁇ A of light at 751 nm before and after the quantitative reaction of hydrogen peroxide can be plotted on a graph.
  • ⁇ A is calculated according to the following formula.
  • ⁇ A (absorbance 5 minutes after addition of reagent C1) ⁇ (absorbance immediately before addition of reagent C1 ⁇ 0.75)
  • the volume of the reaction solution is increased 1.33 times by the addition of the reagent C1, and therefore the absorbance immediately before the addition of the reagent C1 multiplied by 0.75 is regarded as the absorbance immediately after the addition of the reagent C1.
  • HbA1c Example of quantification method of acid-treated HbA1c
  • a reagent for measuring HbA1c having the following composition is prepared, and HbA1c is measured using Bio Majesty JCA-BM1650 (manufactured by JEOL).
  • HbA1c solution HbA1c certified practical reference material JCCRM423 (manufactured by National Institute for Laboratory Medicine) Total hemoglobin concentration 133 g / l, HbA1c concentration 3 level (NGSP value 5.6%, 7.7%, 10.5%)
  • Reagent D Sample pretreatment solution 8.3% n-dodecyl- ⁇ -D-maltoside (Dojindo Laboratories) or polyoxyethylene (20) cetyl ether (Brij58, Wako Pure Chemical Industries) 0.1 M hydrochloric acid reagent E: leuco dye solution 30 mM Tris-potassium phosphate buffer pH 9.0 290 mM potassium phosphate buffer, pH 6.5 0.16 mM N- (carboxymethylaminocarbonyl) -4,4′-bis (dimethylamino) diphenylamine sodium (DA-64, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.)
  • Reagent F1 Peroxidase, amadoriase
  • ⁇ A can be calculated according to the following equation.
  • ⁇ A (absorbance 5 minutes after addition of reagent F1) ⁇ (absorbance immediately before addition of reagent F1 ⁇ 0.75) (Example of quantification method of surfactant-treated HbA1c)
  • a reagent for measuring HbA1c having the following composition is prepared, and HbA1c is measured using Bio Majesty JCA-BM1650 (manufactured by JEOL).
  • HbA1c solution HbA1c certified practical reference material JCCRM423 manufactured by National Institute for Laboratory Medicine
  • Reagent G1 Sample pretreatment solution 0.80% tetradecyltrimethylammonium bromide (manufactured by Tokyo Chemical Industry)
  • Reagent G2 Sample pretreatment solution 0.70% hexadecyltrimethylammonium bromide (manufactured by Tokyo Chemical Industry)
  • Reagent H1 Leuco dye solution 120 mM MOPS-NaOH buffer pH 6.5 1.6% n-dodecyl- ⁇ -D-maltoside (Dojindo Laboratories) 0.16 mM N- (carboxymethylaminocarbonyl) -4,4′-bis (dimethylamino) diphenylamine sodium (DA-64, manufactured by Wako Pure Chemical Industries,
  • ⁇ A can be calculated according to the following equation.
  • HbA1c oxidase (Amadoriase) is allowed to act on a sample containing HbA1c.
  • the action time is, for example, 5 seconds or more, 10 seconds or more, or 20 seconds or more, less than 180 minutes or less than 150 minutes, such as 0.5 to 120 minutes, preferably 0.5 to 60 minutes, more preferably 1 to 30 minutes. It can be. When the action time is too short, HbA1c in the sample cannot be measured sufficiently, and good measurement cannot be performed.
  • the action time is too long, in addition to the problem that the measurement time is extended and the efficiency of the measurement process is poor, the sample and the measurement reagent are exposed to the measurement conditions for a long time.
  • the problem of causing decomposition and modification of components occurs.
  • a change in concentration due to a decrease in sample volume resulting from drying over a long period of time can cause an error.
  • HbA1c oxidase action time is 0.5 to 60 minutes, more preferably 1 to 30 minutes, and even more preferably 1 to 10 minutes.
  • the working temperature depends on the optimum temperature of the enzyme used, it is, for example, 20 to 45 ° C., and the temperature used for normal enzyme reaction can be appropriately selected.
  • a suitable amount of amadoriase used in the present invention depends on the amount of the substrate contained in the sample solution.
  • the final concentration is 0.1 to 50 U / mL, preferably 0.2 to 10 U / mL. What is necessary is just to add so that it may become.
  • the pH at the time of action is preferably adjusted using a buffering agent so that the optimum pH of the amadoriase is taken into consideration, but is not limited to this as long as the pH is operable.
  • the pH is 3 to 11, particularly preferably pH 5 to 9, such as pH 6 to 8.
  • buffering agents include, for example, N- [tris (hydroxymethyl) methyl] glycine, phosphate, acetate, carbonate, tris (hydroxymethyl) -aminomethane, borate, citrate, dimethylglutamic acid Salt, tricine, HEPES, MES, Bis-Tris, ADA, PIPES, ACES, MOPSO, BES, MOPS, TES, DIPSO, TAPSO, POPSO, HEPPSO, EPPS, Tricine, Bicine, TAPS, phthalic acid, tartaric acid, etc.
  • a surfactant (n-octyl- ⁇ -D-glucoside, n-octyl- ⁇ -D-thioglucoside, n-type) may be used as a solubilizer, stabilizer, reactivity improver, HbA1c modifier, etc.
  • the surfactant used in the present invention is not particularly limited as long as it is a surfactant that enables the method for measuring HbA1c of the present invention, and is a nonionic surfactant or an ionic surfactant such as a cationic surfactant.
  • Surfactant, anionic surfactant, amphoteric surfactant, etc. are mentioned. In this specification, when referring to a surfactant, this expression includes one or more surfactants unless otherwise specified.
  • nonionic surfactant examples include polyoxyethylene alkyl ether, fatty acid sorbitan ester, alkyl polyglucoside, fatty acid diethanolamide, alkyl monoglyceryl ether and the like.
  • Cationic surfactants include, for example, alkyl trimethyl ammonium salts, dialkyl dimethyl ammonium salts, alkyl benzyl dimethyl ammonium salts, pyridinium salts such as alkyl pyridinium salts, phosphonium salts such as alkyl phosphonium salts, imidazolium salts such as alkyl imidazolium. Salts, isoquinonium salts, such as alkylisoquinonium salts.
  • Examples of the cationic surfactant of the present invention include quaternary ammonium salts (I), pyridinium salts (II) and phosphonium salts (III) represented by the following general formula.
  • R 1 to R 4 may be the same or different and each represents a substituted or unsubstituted C 1 to C 20 alkyl, alkenyl, aryl, or benzyl, and Z- represents a monovalent anion. . ]
  • R 5 represents a substituted or unsubstituted C 1 to C 20 alkyl, and each R a may be the same or different, and is a hydrogen atom or a substituted or unsubstituted C 1 to C 20 alkyl; Represents alkenyl, aryl or benzyl, n represents an integer of 1 to 5, and Z- represents a monovalent anion.
  • R 6 to R 9 may be the same or different and each represents a substituted or unsubstituted C 1 to C 20 alkyl, alkenyl, aryl or benzyl, and Z- represents a monovalent anion. .
  • Examples of the quaternary ammonium salt include octyltrimethylammonium chloride (OTAC) and bromide (OTAB), decyltrimethylammonium chloride and bromide (DTAB), dodecyltrimethylammonium chloride and bromide, tetradecyltrimethylammonium chloride (TTAC) and bromide.
  • TTAB hexadecyltrimethylammonium chloride
  • CTAC hexadecyltrimethylammonium chloride
  • STAB octadecyltrimethylammonium chloride and bromide
  • BDDAB benzyldodecyldimethylammonium chloride and bromide
  • BDTAC benzyltetradecyldimethylammonium chloride
  • BCDAC benzyl cetyl dimethyl Ammonium chloride
  • BCDAC dioctyl dimethyl ammonium chloride
  • pyridinium salts include 1-decylpyridinium chloride and bromide, 1-dodecylpyridinium chloride (1-DPC) and bromide, 1-tetradecylpyridinium chloride and bromide, 1-hexadecylpyridinium chloride (1-CPC) and bromide (1-CPB), N-cetyl-2-methylpyridinium chloride and bromide, N-cetyl-3-methylpyridinium chloride and bromide, N-cetyl-4-methylpyridinium chloride (4Me-1-CPC) and bromide, -Octadecylpyridinium chloride and bromide, 1-eicosylpyridinium chloride and bromide.
  • 1-decylpyridinium chloride and bromide 1-dodecylpyridinium chloride (1-DPC) and bromide
  • 1-tetradecylpyridinium chloride and bromide 1-
  • Examples of the phosphonium salt include tetraethylphosphonium chloride and bromide, tributylmethylphosphonium chloride and bromide and iodide, tetrabutylphosphonium chloride and bromide, tetra-n-octylphosphonium chloride and bromide, tributyldodecylphosphonium chloride and bromide, tributylhexadecylphosphonium And chloride and bromide (TBCPB), methyltriphenylphosphonium chloride and bromide and iodide, tetraphenylphosphonium chloride and bromide.
  • TCPB tributylhexadecylphosphonium And chloride and bromide
  • Anion paired cationic surfactants Z - is for example Cl -, Br -, I - it may be like.
  • anionic surfactant examples include linear alkylbenzene sulfonate, alkyl sulfate, alpha-olefin sulfonate, polyoxyethylene alkyl ether sulfate, ⁇ -sulfo fatty acid ester salt, and alkali metal salt of natural fatty acid. Is mentioned.
  • An example of such a surfactant is sodium dodecyl sulfate (SDS).
  • amphoteric surfactants examples include alkyl dimethylamine oxide and alkyl carboxybetaine.
  • the present invention provides a method for measuring HbA1c by measuring a product or a consumable by the action of amadoriase, but it is a product that can be easily measured, and hydrogen peroxide is preferable as a measurement target.
  • Hydrogen peroxide produced by the action of amadoriase may be detected by a chromogenic substrate or the like, and examples of the chromogenic substrate used in the present invention include ADOS (N-ethyl-N- () in addition to 4-aminoantipyrine.
  • 2-hydroxy-3-sulfopropyl) -m-anisidine 2-hydroxy-3-sulfopropyl) -m-anisidine
  • ALOS N-ethyl-N- (2-hydroxy-3-sulfopropyl) aniline
  • TOOS N-ethyl-N- (2-hydroxy-3) -Sulfopropyl) -m-toluidine sodium
  • DA-67 (10- (carboxymethylaminocarbonyl) -3,7-bis (dimethylamino) -phenocyanazine
  • DA-64 N- (carboxymethylaminocarbonyl)- 4,4′-bis (dimethylamino) -diphenylamine) and the like.
  • ADOS, ALOS, and TOOS develop color when condensed with 4-aminoantipyrine.
  • DA-64 and DA-67 do not require 4-aminoantipyrine and develop color only by prescribing alone.
  • the color reaction is catalyzed by peroxidase.
  • the measurement of hydrogen peroxide is preferably performed simultaneously with the step of generating hydrogen peroxide, and is preferably performed simultaneously with the action of amadoriase.
  • dissolved oxygen is mentioned as a consumable to measure, The amount of dissolved oxygen in a reaction liquid can be measured using a dissolved oxygen meter etc.
  • the present invention provides a reagent for measuring the above-mentioned amadoriase and hydrogen peroxide, and a reagent for measuring HbA1c to which a buffering agent or the like is added if desired.
  • a buffering agent or the like e.g., a surfactant, salts, buffers, pH adjusters, preservatives and the like can be appropriately selected and added to the reagent.
  • the above-described reagent for measuring HbA1c of the present invention may be prepared by containing each reagent in a different container. For example, it may be provided as a liquid product, a frozen product of the liquid product, or a freeze-dried product.
  • measuring reagents may be used in a dry product or dissolved state, or may be used by impregnating a carrier on a thin film, for example, a sheet-impregnated paper.
  • the enzymes used for the measuring reagent can be used repeatedly after being immobilized by a conventional method.
  • the reagent for measuring HbA1c of the present invention does not contain a protease or the like for cleaving an ⁇ -fructosyl peptide from a glycated protein.
  • an optimal one may be selected according to the components contained therein, but for example, the measurement can be set to be performed at 20 to 45 ° C.
  • the time required for the measurement can be appropriately selected depending on various measurement conditions. For example, 0.5 to 60 minutes, preferably 0.5 to 30 minutes, and more preferably 1 to 10 minutes are preferable.
  • the degree of color development (change in absorbance) of the measurement reagent can be measured with a spectrophotometer, and compared with the standard absorbance, the glycated peptide or glycated protein contained in the sample can be measured.
  • a normal automatic analyzer can also be used for the measurement.
  • the HbA1c measurement method of the present invention may be qualitative, but may be a quantitative measurement method.
  • the quantitative measurement method of HbA1c refers to a method of determining the concentration of HbA1c in a sample. That is, one embodiment of the present invention provides a method for quantifying HbA1c in a sample, comprising using amadoriase.
  • This quantification method includes a step of bringing a sample containing HbA1c into contact with the amadoriase of the present invention, and a step of measuring a product or a consumer due to the action of the amadoriase on HbA1c.
  • HbA1c here may be in a natural state or in a denatured state.
  • the contact used for the quantification method includes any embodiment in which the amadoriase and the sample are physically combined so that the amadoriase of the present invention can catalyze the oxidation reaction of HbA1c.
  • a mode in which a solution sample containing HbA1c is added to or dropped from the amadoriase of the present invention supported on a solid phase carrier is also included.
  • the sample used in the HbA1c measurement method of the present invention can be any biological sample that may contain glycated hemoglobin, for example, a sample derived from blood, body fluid, lymph fluid or the like.
  • the sample can be appropriately processed.
  • denatured HbA1c may be used for the reaction with amadoriase.
  • the modified HbA1c can be obtained by mixing with an appropriate surfactant, obtained by heat treatment, obtained by addition of a surfactant and heat treatment, or obtained by modification treatment with an acid / alkali.
  • the heat treatment may be performed at a temperature and time sufficient to denature all or part of HbA1c.
  • the treatment temperature can be, for example, 60 ° C. or higher, 70 ° C. or higher, 80 ° C. or higher, 90 ° C.
  • the treatment time can be, for example, 10 seconds or more, 20 seconds, 30 seconds or more, 1 minute or more, or 2 minutes or more.
  • the surfactant are as described above, and these can be added at an appropriate concentration.
  • the absorbance of the detected luminescent substrate decreases proportionally as the amount of HbA1c added decreases.
  • this concentration is sometimes referred to as a detection limit concentration.
  • a calibration curve can be prepared in advance by performing regression analysis such as the least square method from measured values such as absorbance of a control containing HbA1c having a known concentration. By plotting the measured value of the sample whose HbA1c concentration is unknown with respect to the prepared calibration curve, the HbA1c concentration in the sample can be quantified.
  • HbA1c in a sample can be quantified satisfactorily using a Coniochaeta-derived amadoriase mutant such as CFP-T7-H35. This is a surprising finding. Refer to FIGS. 4-1 and 4-2. CFP-T7-H35 also shows activity against ⁇ F6P. Therefore, those skilled in the art may be able to use other amadoriases exhibiting good activity against ⁇ -fructosyl oligopeptides such as ⁇ F6P directly on HbA1c based on these findings and use them for quantitative measurement. I understand that there is.
  • amadoriase having high specific activity for ⁇ -fructosyl oligopeptide acts on HbA1c in the same manner and has a high probability of being used for quantitative measurement thereof.
  • those skilled in the art can appropriately set conditions such as the amount of enzyme (enzyme concentration) and reaction time for such quantitative measurement.
  • the method described above can be used to determine whether an amadoriase acts directly on HbA1c.
  • Candidate amadoriases include various natural amadoriases or variants thereof, such as amadoriase having ⁇ FV activity, amadoriase having ⁇ FVH activity, amadoriase having ⁇ F6P activity, amadoriase exhibiting activity against ⁇ -fructosyl peptide, or modifications thereof Body, for example, those described in the above (modified form of amadoriase).
  • Candidate amadoriases can be screened for direct action on HbA1c. Alternatively, the candidate amadoriase may be first selected as to whether it has ⁇ FV activity, ⁇ FVH activity, ⁇ F6P activity, etc., and then those having the activity may directly act on HbA1c or be secondarily selected.
  • the screening can be performed on a crude enzyme extract prepared from a biological sample or a purified product thereof.
  • an amadoriase gene showing activity against ⁇ -fructosyl peptide may be obtained by a conventional method, an enzyme may be produced using a gene recombination technique, and this may be used for selection.
  • Conventional methods include purification of amadoriase exhibiting activity against ⁇ -fructosyl peptide, determination of its amino acid sequence, design of PCR primers based on the sequence information, and acquisition of a gene, and known amadoriase Examples include, but are not limited to, methods for obtaining genes from genome libraries or cDNA libraries of organisms for which PCR primers are designed based on sequence information. See also (Acquisition of gene encoding amadoriase) above.
  • An appropriate mutation is introduced into the obtained amadoriase gene using a conventional gene recombination technique, and it can be examined whether the obtained mutant directly acts on HbA1c.
  • an appropriate mutation is introduced into the obtained amadoriase gene using a gene recombination technique to produce a long chain ⁇ -fructosyl peptide, for example, a variant exhibiting activity against ⁇ F6P, which is then expressed against ⁇ F6P, for example. It can also be examined whether it has a specific activity of 0.1 U / mg or more and / or whether it acts directly on HbA1c.
  • the amino acid at position (a) corresponding to position 62 in the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 is substituted with alanine, asparagine or aspartic acid, (b) at the position corresponding to position 63.
  • Substituting an amino acid with histidine or alanine (c) substituting an amino acid at a position corresponding to position 102 with lysine, and (d) an amino acid at a position corresponding to position 106 with alanine, lysine or arginine.
  • amadoriase to be used may be introduced with a mutation that improves the surfactant resistance and / or may be deleted so as to improve the thermal stability. Moreover, as long as it has activity with respect to HbA1c, the mutation which changes the other characteristic of an enzyme can also be introduce
  • the HbA1c measurement kit of the present invention may include other known stabilizers and contaminant elimination systems, if necessary, in addition to the above-described HbA1c measurement reagent.
  • HbA1c containing the amadoriase of the present invention by appropriately modifying the techniques used in various conventional reagents and kits for the purpose of measuring HbA1c by enzymatic methods using proteases that act on HbA1c Can be used in kits.
  • the kit for measuring HbA1c of the present invention does not require such a protease. That is, in one embodiment, the kit for measuring HbA1c of the present invention does not contain a protease or the like for cleaving an ⁇ -fructosyl peptide from HbA1c.
  • Example 1 (1) Preparation of recombinant plasmid pKK223-3-CFP-T7 DNA Escherichia coli JM109 (pKK223-3-CFP-T7) strain having a recombinant plasmid of the amadoriase gene (SEQ ID NO: 2) derived from the genus Coniochaeta (International Publication No. 1) 2007/125779) 3 ml of LB-amp medium [1% (w / v) bactotripton, 0.5% (w / v) peptone, 0.5% (w / v) NaCl, 50 ⁇ g / ml ampicillin] and cultured with shaking at 37 ° C. for 16 hours to obtain a culture.
  • SEQ ID NO: 2 amadoriase gene
  • the culture was collected by centrifugation at 10,000 ⁇ g for 1 minute to obtain bacterial cells. From this cell, the recombinant plasmid pKK223-3-CFP-T7 was extracted and purified using GenElute Plasmid Miniprep Kit (manufactured by Sigma-Aldrich), and 2.5 ⁇ g of the recombinant plasmid pKK223-3-CFP was purified. -T7 DNA was obtained.
  • the base sequence of DNA encoding amadoriase in the plasmid was determined using a multi-capillary DNA analysis system Applied Biosystems 3130xl Genetic Analyzer (manufactured by Life Technologies), and the arginine at position 62 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 was alanine.
  • a recombinant plasmid (pKK223-3-CFP-T7-H1) encoding a modified amadoriase substituted with the above was obtained.
  • Table 1 shows the oxidative activity against ⁇ FV, ⁇ FVH and ⁇ F6P, and ⁇ F6P / ⁇ FVH and ⁇ F6P / ⁇ FV when ⁇ FVH oxidation activity is defined as 100 for each amadoriase.
  • CFP-T7 showed ⁇ FV oxidation activity and ⁇ FVH oxidation activity but not ⁇ F6P oxidation activity. As a result, it was found that CFP-T7 was extremely specific for ⁇ -fructosyl dipeptide and did not act on ⁇ -fructosyl hexapeptide.
  • mutant CFP-T7-H1 exhibited ⁇ F6P oxidation activity in addition to ⁇ FV and ⁇ FVH oxidation activity.
  • a recombinant plasmid (pKK223) encoding a modified amadoriase in which arginine at position 62 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was substituted with alanine and glutamine at position 110 was replaced with leucine, phenylalanine, or tyrosine.
  • pKK223 a recombinant plasmid encoding a modified amadoriase in which arginine at position 62 in the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was substituted with alanine and glutamine at position 110 was replaced with leucine, phenylalanine, or tyrosine.
  • E. coli JM109 strain transduced with pKK223-3-CFP-T7-H2, pKK223-3-CFP-T7-H3, or pKK223-3-CFP-T7-H4 is cultured by the method described in (3) above.
  • 0.6 ml of a crude enzyme solution containing various modified amadoriases (CFP-T7-H2, CFP-T7-H3, CFP-T7-H4) was prepared.
  • the oxidation activity for ⁇ FV, ⁇ FVH, and ⁇ F6P was measured by the method shown in B: Activity measurement method.
  • B Activity measurement method.
  • the same measurement was performed using an enzyme solution containing CFP-T7-H1 produced from Escherichia coli JM109 (pKK223-3-CFP-T7-H1).
  • Table 2 shows the oxidation activity for ⁇ FV, ⁇ FVH and ⁇ F6P, and ⁇ F6P / ⁇ FVH and ⁇ F6P / ⁇ FV when ⁇ FVH oxidation activity is defined as 100 for each amadoriase.
  • CFP-T7-H2 and CFP-T7-H4 further increased the reactivity (substrate specificity) to ⁇ F6P compared to CFP-T7-H1.
  • the oxidation activity for ⁇ F6P was measured by the method shown in B: Activity measurement method.
  • B Activity measurement method.
  • the same measurement was performed using an enzyme solution containing CFP-T7-H2 produced from Escherichia coli JM109 (pKK223-3-CFP-T7-H2).
  • Table 3 shows the ratio of ⁇ F6P oxidation activity of each crude enzyme solution containing amadoriase when the ⁇ F6P oxidation activity of the crude enzyme solution containing CFP-T7-H2 is defined as 100.
  • CFP-T7-H2-62N and CFP-T7-H6 have higher ⁇ F6P oxidation activity than CFP-T7-H2.
  • the wild-type enzyme whose amino acid at position 62 is arginine does not show activity against ⁇ F6P.
  • mutants in which arginine at position 62 is substituted with glutamine or glutamic acid also have improved activity against ⁇ F6P.
  • alanine, asparagine, aspartic acid, glutamine and glutamic acid, which are substituted amino acids showing activity against ⁇ F6P are amino acids having a relatively small molecular weight.
  • a modified amadoriase having ⁇ F6P activity can be obtained by substituting position 62 with glycine, valine, leucine, isoleucine, cysteine, serine, threonine and proline having the same low molecular weight.
  • alanine, asparagine, aspartic acid, glutamine, glutamic acid, glycine, valine, leucine, isoleucine, cysteine, serine, threonine and proline may be collectively referred to as amino acids having a small molecular weight.
  • CFP-T7-H6 has significantly improved ⁇ F6P oxidation activity and improved reactivity to ⁇ F6P (substrate specificity) compared to CFP-T7-H2.
  • a recombinant plasmid encoding amadoriase (pKK223-3-CFP-T7-H7, pKK223-3-CFP-T7-H8, pKK223-3-CFP-T7-H9), and an amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1
  • pKK223-3-CFP-T7-H7 or pKK223-3-CFP-T7-H8, or pKK223-3-CFP-T7-H9, or pKK223-3-CFP-T7-H10, or pKK223-3-CFP- E. coli JM109 strain transduced with T7-H11, or pKK223-3-CFP-T7-H12, or pKK223-3-CFP-T7-H13, or pKK223-3-CFP-T7-H14 is described in (3) above.
  • the modified amadoriase (CFP-T7-H7, CFP-T7-H8, CFP-T7-H9, CFP-T7-H10, CFP-T7-H11, CFP-T7-H12, CFP-T7) 0.6 ml of a crude enzyme solution containing -H13, CFP-T7-H14) was prepared.
  • the oxidation activity for ⁇ F6P was measured by the method shown in B: Activity measurement method.
  • B Activity measurement method.
  • the same measurement was performed using an enzyme solution containing CFP-T7-H6 produced from Escherichia coli JM109 (pKK223-3-CFP-T7-H6).
  • Table 5 shows the ⁇ F6P oxidation activity of each crude enzyme solution containing amadoriase when the ⁇ F6P oxidation activity of the crude enzyme solution containing CFP-T7-H6 is defined as 100.
  • CFP-T7-H10, CFP-T7-H11, CFP-T7-H12, CFP-T7-H13, and CFP-T7-H14 all have a significantly improved ⁇ F6P oxidation activity ratio than CFP-T7-H6. Some things have improved dramatically.
  • ⁇ FV was obtained by the method shown in B: Activity measurement method above.
  • ⁇ FVH and ⁇ F6P were measured for oxidation activity.
  • the oxidation activity with respect to each substrate, ⁇ F6P / ⁇ FVH and ⁇ F6P / FV when ⁇ FVH oxidation activity is taken as 100 are shown in Table 6.
  • CFP-T7-H11, CFP-T7-H12, CFP-T7-H13, and CFP-T7-H14 are more reactive to ⁇ F6P than CFP-T7-H6 (substrate specificity) It has become clear that there is a significant improvement.
  • the arginine at position 62 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is substituted with aspartic acid, the aspartic acid at position 106 is replaced with lysine, the glutamine at position 110 is replaced with leucine, and the alanine at position 113 is also lysine, or Recombinant plasmids (pKK223-3-CFP-T7-H20, pKK223-3-CFP-T7-H21) encoding modified amadoriase substituted with arginine were obtained.
  • Escherichia coli JM109 strain transduced with pKK223-3-CFP-T7-H20 or pKK223-3-CFP-T7-H21 is cultured by the method described in (3) above, and various modified amadoriases (CFP-T7-H20) are cultured. 0.6 ml of a crude enzyme solution containing CFP-T7-H21) was prepared.
  • CFP-T7-H20 and CFP-T7-H21 have improved reactivity (substrate specificity) to ⁇ F6P than CFP-T7-H11.
  • arginine at position 62 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 is substituted with aspartic acid, aspartic acid at position 106 is replaced with lysine, glutamine at position 110 is replaced with leucine, and alanine at position 113 is replaced with lysine, Furthermore, recombinant plasmids (pKK223-3-CFP-T7-H24, pKK223-3-CFP-T7-) encoding a modified amadoriase in which leucine at position 63 is substituted with alanine, aspartic acid, histidine, or lysine. H25, pKK223-3-CFP-T7-H26, pKK223-3-CFP-T7-H27).
  • E. coli strain JM109 transduced with pKK223-3-CFP-T7-H24, or pKK223-3-CFP-T7-H25, or pKK223-3-CFP-T7-H26, or pKK223-3-CFP-T7-H27 Then, 0.6 ml of a crude enzyme solution containing various modified amadoriases (CFP-T7-H24, CFP-T7-H25, CFP-T7-H26, CFP-T7-H27) cultured by the method described in (3) above. Prepared.
  • the oxidation activity for ⁇ F6P was measured by the method shown in B: Activity measurement method.
  • B Activity measurement method.
  • the same measurement was performed using an enzyme solution containing CFP-T7-H20 produced from Escherichia coli JM109 (pKK223-3-CFP-T7-H20).
  • Table 8 shows the ⁇ F6P oxidation activity of the crude enzyme solutions containing each amadoriase when the ⁇ F6P oxidation activity of the crude enzyme solution containing CFP-T7-H20 is defined as 100.
  • CFP-T7-H24 and CFP-T7-H26 have improved reactivity (substrate specificity) to ⁇ F6P than CFP-T7-H20.
  • the oligonucleotides of SEQ ID NOS: 30 to 33 and KOD-Plus- were used for PCR reaction under the same conditions as in (2) above. Transformation of E. coli JM109 and determination of the DNA sequence encoding amadoriase in the plasmid DNA retained by the growing colonies were performed.
  • arginine at position 62 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is aspartic acid
  • leucine at position 63 is histidine
  • aspartic acid at position 106 is lysine
  • glutamine at position 110 is leucine
  • 113 A recombinant plasmid (pKK223-3-CFP-T7-H28) encoding a modified amadoriase in which the alanine at position is substituted with lysine and the glutamic acid at position 102 is substituted with lysine
  • the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 1 Arginine at position 62 is replaced with aspartic acid
  • leucine at position 63 is replaced with histidine
  • aspartic acid at position 106 is replaced with lysine
  • glutamine at position 110 is replaced with leucine
  • alanine at position 113 is replaced with lysine.
  • E. coli JM109 strain transduced with pKK223-3-CFP-T7-H26, pKK223-3-CFP-T7-H28, or pKK223-3-CFP-T7-H29 is cultured by the method described in (3) above.
  • 0.6 ml of a crude enzyme solution containing various modified amadoriases (CFP-T7-H26, CFP-T7-H28, CFP-T7-H29) was prepared.
  • the oxidation activity for ⁇ F6P was measured by the method shown in B: Activity measurement method.
  • B Activity measurement method.
  • the same measurement was performed using an enzyme solution containing CFP-T7-H26 produced from Escherichia coli JM109 (pKK223-3-CFP-T7-H26).
  • Table 10 shows the ⁇ F6P oxidation activity of each crude enzyme solution containing amadoriase when the ⁇ F6P oxidation activity of the crude enzyme solution containing CFP-T7-H26 is 100.
  • CFP-T7-H28 and CFP-T7-H29 have higher reactivity (substrate specificity) to ⁇ F6P than CFP-T7-H26.
  • arginine at position 62 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is aspartic acid
  • leucine at position 63 is histidine
  • glutamic acid at position 102 is lysine
  • aspartic acid at position 106 is lysine
  • 110 A recombinant plasmid (pKK223-3-CFP-T7-H35) encoding a modified amadoriase in which the glutamine at the position is replaced by leucine, the alanine at the 113th position is replaced by lysine, and the alanine at the 355th position is replaced by serine Got.
  • E. coli JM109 strain transduced with pKK223-3-CFP-T7-H35 was cultured by the method described in (3) above to prepare 0.6 ml of a crude enzyme solution containing CFP-T7-H35, which is a modified amadoriase. .
  • the oxidation activity for ⁇ F6P was measured by the method shown in B: Activity measurement method.
  • B Activity measurement method.
  • the same measurement was performed using an enzyme solution containing CFP-T7-H20 produced from Escherichia coli JM109 (pKK223-3-CFP-T7-H28).
  • Table 12 shows the ⁇ F6P oxidation activity of each crude enzyme solution containing amadoriase when the ⁇ F6P oxidation activity of the crude enzyme solution containing CFP-T7-H26 is defined as 100.
  • the oligonucleotides of SEQ ID NOs: 4 and 10 and KOD-Plus- were used for PCR reaction under the same conditions as in (2) above, E. coli JM109 And the nucleotide sequence of the DNA encoding amadoriase in the plasmid DNA retained by the growing colony was determined.
  • a recombinant plasmid (pKK223-3-CFP-T7-62D) encoding a modified amadoriase in which arginine at position 62 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 was replaced with aspartic acid was obtained.
  • E. coli JM109 strain transduced with pKK223-3-CFP-T7-62D was prepared.
  • PCR was performed using the recombinant plasmid pKK223-3-CFP-T7-H35 DNA as a template, the oligonucleotides of SEQ ID NO: 193, SEQ ID NO: 194, and KOD-Plus- under the same conditions as in (2) above.
  • arginine at position 62 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is aspartic acid
  • leucine at position 63 is histidine
  • glutamic acid at position 102 is lysine
  • aspartic acid at position 106 is lysine
  • 110 A recombinant plasmid encoding a modified amadoriase in which the glutamine at the position is replaced with leucine, the alanine at the 113th position is replaced with lysine, the alanine at the 355th position is replaced with serine, and the aspartic acid at the 68th position is replaced with asparagine pKK223-3-CFP-T7-H36) was obtained.
  • PCR was performed under the same conditions as in (2) above using the recombinant plasmid pKK223-3-CFP-T7-H36 DNA as a template, the oligonucleotides of SEQ ID NO: 195, SEQ ID NO: 196, and KOD-Plus-.
  • arginine at position 62 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 1 is aspartic acid
  • leucine at position 63 is histidine
  • glutamic acid at position 102 is lysine
  • aspartic acid at position 106 is lysine
  • 110 The glutamine at the position was replaced with leucine
  • the alanine at the 113th position was replaced with lysine
  • the alanine at the 355th position was replaced with serine
  • the aspartic acid at the 68th position was replaced with asparagine
  • the alanine at the 356th position was replaced with threonine.
  • a recombinant plasmid (pKK223-3-CFP-T7-H37) encoding a modified amadoriase was obtained.
  • CFP-DH1 type CFP-T7-H36
  • the 1305 bp gene (including the stop codon TAA) shown in SEQ ID NO: 200, which encodes the amino acid sequence of SEQ ID NO: 199 and whose codons are optimized for E. coli expression, is a total synthesis by PCR of gene fragments, which is a standard method. Obtained by. At this time, an EcoRI site and a HindIII site were added to the 5 ′ end and 3 ′ end of SEQ ID NO: 200, respectively.
  • the grown colonies were inoculated into LB-amp medium and cultured with shaking, and plasmid DNA was isolated by the same method as in (1) above.
  • the nucleotide sequence of the DNA encoding the amadoriase in the plasmid was determined using a multicapillary DNA analysis system Applied Biosystems 3130xl Genetic Analyzer (manufactured by Life Technologies). In fact, the CFP- was found at the multicloning site of the pKK223-3 vector. It was confirmed that a recombinant plasmid pKK223-3-CFP-DH1 DNA into which the DH1 gene had been inserted was obtained.
  • a recombinant plasmid (pKK223-3-CFP-DH2) encoding a modified amadoriase in which the alanine at position 356 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 199 was replaced with threonine was obtained.
  • Example 2 (Production and purification of various amadoriases) (Production and purification of modified amadoriase from the genus Coniochaeta) E. coli JM109 (pKK223-3-CFP-T7), E. coli JM109 (pKK223-3-CFP-T7-62D), E. coli producing the wild-type amadoriase derived from the genus Coniochaeta, and the modified amadoriase obtained as described above JM109 (pKK223-3-CFP-T7-H20), E. coli JM109 (pKK223-3-CFP-T7-H21), and E.
  • coli JM109 (pKK223-3-CFP-T7-H35) were added at a final concentration of 0.1 mM. Inoculated into 120 ml of LB-amp medium supplemented with IPTG, and cultured at 25 ° C. for 16 hours. Each of the obtained cultured cells was washed with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), suspended in the same buffer solution, subjected to ultrasonic disruption, and centrifuged at 20,000 ⁇ g for 10 minutes. After separation, 24 ml of a crude enzyme solution was prepared.
  • the prepared crude enzyme solution was adsorbed to 1.35M (NH 4) Butyl Toyopearl 650C resin (Tosoh Corporation) of 12ml equilibrated with 2SO 4 10 mM potassium phosphate buffer containing (pH 7.0), then 120ml of the same buffer resin was washed with, followed by 84ml of 1.05M (NH 4) 2SO 4 the amadoriase adsorbed on the resin was eluted were collected with 10mM potassium phosphate buffer (pH7.0) containing.
  • the obtained crude enzyme solution containing amadoriase was transferred to a dialysis tube (Spectra / Por MWCO: 12,000-14,000) and dialyzed in 10 volumes of 5 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) three times. (NH 4 ) 2 SO 4 was completely removed from the crude enzyme solution containing amadoriase. Subsequently, a crude enzyme solution containing amadoriase was applied to HiScreen Capto Q ImpRes (manufactured by GE Healthcare) equilibrated with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) to bind the amadoriase to the anion exchange resin. .
  • E. coli JM109 (pKK223-3-CFP-T7-H36), E. coli JM109 (pKK223-3-CFP-T7-H37), and E. coli JM109 (pKK223-3) producing the modified amadoriase obtained in [Example 1] -CFP-DH2) was inoculated into 200 ml of LB-amp medium supplemented with IPTG to a final concentration of 0.1 mM, and cultured at 25 ° C. for 16 hours. Each of the obtained cultured cells was washed with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), suspended in the same buffer solution, subjected to ultrasonic disruption, and centrifuged at 20,000 ⁇ g for 10 minutes.
  • 10 mM potassium phosphate buffer pH 7.0
  • the enzyme solution was applied to bind amadoriase to the anion exchange resin.
  • 20 column volume integration was carried out with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.5) containing 30 mM NaCl concentration to elute contaminating proteins, and then 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.7 containing 80 mM NaCl).
  • the protein bound to the resin was eluted, and the fraction showing amadoriase activity was collected.
  • a column packed with Q-sepharose FF (manufactured by GE Healthcare) was equilibrated with 2 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0), and then the prepared crude enzyme solution containing CFP-DH2 was applied to remove the amadoriase. Binding to ion exchange resin. Thereafter, 20 column volume integration of 4 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0) was carried out to elute contaminating proteins, and then bound to the resin with 4 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0) containing 30 mM NaCl. The eluted protein was eluted, and the fraction showing amadoriase activity was collected.
  • the obtained fractions showing amadoriase activity were concentrated with Amicon Ultra Ultra-30K (Millipore) and purified with HiLoad 26/60 Superdex200.
  • a 10 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5) containing 150 mM NaCl was used for equilibration and elution of the resin.
  • the purity of each eluted fraction was evaluated by SDS-PAGE, and fractions containing no contaminating protein were collected and used as purified samples of CFP-T7-H36, CFP-T7-H37 and CFP-DH2.
  • SEQ ID NO: 36 is the amino acid sequence of Aspergillus oryzae RIB40-derived fructosyl amino acid oxidase (hereinafter referred to as FAOAo2).
  • a recombinant plasmid (hereinafter referred to as pUC19-) into which the gene (SEQ ID NO: 37) encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 36 has been inserted.
  • FAOAo2 is produced by expression in E. coli DH5 ⁇ (referred to as FAOAo2), and FAOAo2 has been shown to act on fructosyl hexapeptide (see WO 2008/108385).
  • E. coli DH5 ⁇ (pUC19-FAOAo2) having the ability to produce FAOAo2 was inoculated into an LB-amp medium supplemented with IPTG to a final concentration of 0.1 mM, and cultured at 25 ° C. for 16 hours. Each of the obtained cultured cells was washed with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5), suspended in the same buffer solution, subjected to ultrasonic disruption, and centrifuged at 20,000 ⁇ g for 10 minutes. Separated to prepare a crude enzyme solution.
  • the prepared crude enzyme solution is adsorbed on Q Sepharose Fast Flow resin (manufactured by GE Healthcare) equilibrated with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5), and then 10 mM Tris-HCl buffer (containing 50 mM NaCl) ( The resin was washed with pH 8.5), and FAOAo2 adsorbed on the resin was then eluted and recovered with 10 mM Tris-HCl buffer (pH 8.5) containing 100 mM NaCl.
  • the obtained FAOAo2 crude enzyme solution was applied to a HiLoad 26/600 Superdex 200 column equilibrated with 20 mM MES-NaOH buffer solution (pH 7.0) containing 150 mM NaCl, and FAOAo2 was eluted with the same buffer solution. The fractions indicating were collected. The obtained fraction was analyzed by SDS-PAGE to confirm that it was purified to a purity free from other contaminating proteins, and was used as a purified FAOAo2 preparation.
  • SEQ ID NO: 38 is the amino acid sequence of Phaeosphaeria nodorum-derived fructosyl peptide oxidase (hereinafter referred to as PnFX) (see Biotechnology and Bioengineering, 106, 358-366, 2010).
  • PnFX Phaeosphaeria nodorum-derived fructosyl peptide oxidase
  • the gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 38 was obtained by total synthesis of cDNA by total synthesis by PCR of gene fragments, which is a conventional method.
  • the gene synthesized above is treated with two types of restriction enzymes, NdeI site and BamHI (Takara Bio), and inserted into the NdeI-BamHI site of pET-22b (+) Vector (Novagen). Then, the recombinant plasmid pET22b-PnFX was obtained, and the E. coli BL21 (DE3) strain was transformed under the same conditions as above to obtain the E. coli BL21 (DE3) (pET22b-PnFX) strain.
  • the prepared crude enzyme solution of PnFX was purified according to the method described in the above-mentioned non-patent literature (Biotechnology and Bioengineering, 106, 358-366, 2010). That is, the crude enzyme solution was fractionated with ammonium sulfate, dialyzed with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0), purified by anion exchange chromatography (in this example, using Q Sepharose Fast Flow), and gel Purification was performed by filtration chromatography (HiLoad 26/600 Suprdex 200 was used in this example). The obtained fraction was analyzed by SDS-PAGE to confirm that it had been purified to a purity free from other contaminating proteins, and was used as a purified PnFX preparation.
  • CFP-T7 showed activity to oxidize ⁇ FV and ⁇ FVH, but did not show activity to oxidize ⁇ F6P.
  • CFP-T7-H35 exhibited ⁇ F6P oxidation activity in addition to ⁇ FV and ⁇ FVH, and the specific activity of the ⁇ F6P oxidation reaction reached a high level of 4.27 U / mg.
  • CFP-T7-62D The specific activities of CFP-T7-62D, CFP-T7-H20, and CFP-T7-H21 with respect to ⁇ F6P are 0.018 U / mg, 0.850 U / mg, and 0.795 U / mg, respectively. Even in the measurement method that excludes the influence of protease / peptidase, sufficiently high reactivity to ⁇ F6P was shown.
  • CFP-T7-H36 and CFP-T7-H37 with respect to ⁇ F6P are 4.65 U / mg and 7.19 U / mg, respectively, and the specific activity of CFP-T7-H35 before introduction of amino acid substitution (4.27 U / mg). mg), it improved with each additional amino acid substitution.
  • CFP-DH2 also showed higher specific activity (5.30 U / mg) than CFP-T7-H35 (Table 13-2).
  • amadoriase having no such mutation remains active even after treatment with the surfactant, and HbA1c can be measured using an appropriate amount of enzyme.
  • an amadoriase with improved surfactant resistance or an amadoriase with improved thermal stability is used, the amount of enzyme required for the measurement can be reduced.
  • fructosyl peptide oxidase gene derived from Eupenicillium terrenum SEQ ID NO: 40 is the amino acid sequence of Eupenicillium terrenum-derived fructosyl peptide oxidase (hereinafter referred to as EFP-T5), and the gene (sequence) encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 40 No. 41) can be produced by Escherichia coli carrying the recombinant plasmid pUTE100K′-EFP-T5, and EFP-T5 has been confirmed to exhibit ⁇ FV and ⁇ FVH oxidation activity (WO 2007/12579) And International Publication No. 2008/018094).
  • EFP-T5 Eupenicillium terrenum-derived fructosyl peptide oxidase
  • a recombinant plasmid (pUTE100K'-EFP-T5-62D) encoding the EFP-T5 gene in which the arginine at position 62 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 40 was replaced with aspartic acid was obtained.
  • arginine at position 62 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 40 was converted to aspartic acid using pUTE100K′-EFP-T5-62D as a template and the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOs: 44 and 45.
  • a recombinant plasmid (pUTE100K′-EFP-T5-62D / 106K) encoding the EFP-T5 gene in which asparagine at position 106 was replaced with lysine was obtained.
  • the arginine at position 62 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 40 is A recombinant plasmid (pUTE100K'-EFP-T5-62D / 106K / 110L) encoding the EFP-T5 gene in which aspartic acid was substituted with asparagine at position 106 with lysine and lysine at position 110 with leucine was obtained. .
  • pUTE100K′-EFP-T5-62D / 106K / 110L was used as a template, and synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOs: 48 and 49 were used.
  • the pUTE100K′-EFP-T5-62D / 106K / 110L / 113K was used as a template and the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOs: 50 and 51 were used.
  • a recombinant plasmid (pUTE100K′-EFP-T5-62D / 106K / 110L / 113K / 355S) was obtained.
  • the pUTE100K′-EFP-T5-62D / 106K / 110L / 113K / 355S was used as a template, and the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOs: 52 and 53 were used.
  • Arginine at position 62 is replaced with aspartic acid
  • leucine at position 63 is replaced with histidine
  • asparagine at position 106 is replaced with lysine
  • lysine at position 110 is replaced with leucine
  • threonine at position 113 is replaced with lysine
  • alanine at position 355 is replaced with serine.
  • a recombinant plasmid (pUTE100K′-EFP-T5-62D / 63H / 106K / 110L / 113K / 355S) encoding the EFP-T5 gene was obtained.
  • ketoamine oxidase gene derived from Neocosmospora vasinfecta is the amino acid sequence of ketoamine oxidase derived from Neocosmospora vasinfecta (hereinafter referred to as NvFX), and the gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 54 (SEQ ID NO: 55) It has been confirmed that NvFX exhibits ⁇ FV and ⁇ FVH oxidation activity (see International Publication No. 2012/018094).
  • the recombinant plasmid pET22b-NvFX was used as a template, and synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOs: 56 and 57, KOD-Plus- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) were used.
  • PCR reaction, transformation of E. coli JM109 and determination of the nucleotide sequence of the DNA encoding the NvFX mutant in the plasmid DNA retained by the growing colonies were performed.
  • arginine at position 62 of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 54 is converted to aspartic acid
  • a recombinant plasmid (pET22b-NvFX-62D / 106K / 110L) encoding the NvFX gene in which arginine at position 106 was replaced with lysine and glutamic acid at position 110 was replaced with leucine was obtained.
  • E. coli BL21 (DE3) strain was transformed under the same conditions as in Example 1 to obtain E. coli BL21 (DE3) (pET22b-NvFX-62D / 106K / 110L) strain.
  • SEQ ID NO: 62 is a fructosyl amino acid oxidase derived from Aspergillus nidulans obtained by substituting serine at position 59 with glycine in order to confer fructosyl peptide oxidase activity (hereinafter referred to as AnFX)
  • AnFX The recombinant plasmid pET22b-AnFX inserted with the gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 62 (SEQ ID NO: 63) can be produced by Escherichia coli, and AnFX exhibits ⁇ FV and ⁇ FVH oxidation activities It has been confirmed (see International Publication No. 2012/018094).
  • the recombinant plasmid pET22b-AnFX was used as a template, and synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOS: 64 and 65, KOD-Plus- (manufactured by Toyobo Co., Ltd.) were used.
  • synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOS: 64 and 65, KOD-Plus- manufactured by Toyobo Co., Ltd.
  • arginine at position 61 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 62 was converted to aspartic acid using pET22b-AnFX-61D / 105K as a template and synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOs: 68 and 69.
  • a recombinant plasmid (pET22b-AnFX-61D / 105K / 109L) encoding the AnFX gene in which glycine at position 105 was replaced with lysine and lysine at position 109 was replaced with leucine was obtained.
  • E. coli BL21 (DE3) strain was transformed under the same conditions as in Example 1 to obtain E. coli BL21 (DE3) (pET22b-AnFX-61D / 105K / 109L) strain.
  • pET22b-AnFX-61D / 105K / 109L was used as a template, and the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOS: 112 and 70 were used.
  • a recombinant plasmid (pET22b-AnFX-61D / 105K / 109L / 112K) encoding an AnFX gene in which glycine at position 105 is replaced by lysine, lysine at position 109 is replaced by leucine, and serine at position 112 is replaced by lysine. )
  • pET22b A recombinant plasmid encoding an AnFX gene in which glycine at position 105 is replaced by lysine, lysine at position 109 is replaced by leucine, serine at position 112 is replaced by lysine, and alanine at position 355 is replaced by serine.
  • pET22b-AnFX-61D / 105K / 109L / 112K / 355S was used as a template, and synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOs: 73 and 74 were used, and position 61 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 62 was used. Arginine was replaced with aspartic acid, leucine at position 62 was replaced with histidine, glycine at position 105 was replaced with lysine, lysine at position 109 was replaced with leucine, serine at position 112 was replaced with lysine, and alanine at position 355 was replaced with serine.
  • a recombinant plasmid (pET22b-AnFX-61D / 62H / 105K / 109L / 112K / 355S) encoding the gene was obtained.
  • Arginine at position 61 is aspartic acid, leucine at position 62 is histidine, glutamic acid at position 101 is lysine, glycine at position 105 is lysine, lysine at position 109 is leucine, serine at position 112 is lysine, 355 A recombinant plasmid (pET22b-AnFX-61D / 62H / 101K / 105K / 109L / 112K / 355S) encoding the substituted AnFX gene in which the alanine at the position was replaced with serine was obtained.
  • E. coli BL21 (DE3) strain was transformed under the same conditions as in Example 1 to obtain E. coli BL21 (DE3) (pET22b-AnFX-61D / 62H / 101K / 105K / 109L / 112K / 355S) strain.
  • serine at position 62 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 38 is converted to aspartic acid using pET22b-PnFX-62D / 106K as a template and the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOS: 81 and 82.
  • a recombinant plasmid (pET22b-PnFX-62D / 106K / 110L) encoding the PnFX gene in which aspartic acid at position 106 was replaced with lysine and glycine at position 110 was replaced with leucine was obtained.
  • serine at position 62 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 38 is aspartic acid using pET22b-PnFX-62D / 106K / 110L as a template and the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOS: 83 and 84.
  • a recombinant plasmid (pET22b-PnFX-62D / 106K / 110L / 113K) encoding a PnFX gene in which aspartic acid at position 106 is replaced with lysine, glycine at position 110 is replaced with leucine, and alanine at position 113 is replaced with lysine. )
  • E. coli BL21 (DE3) strain was transformed under the same conditions as in Example 1 to obtain E. coli BL21 (DE3) (pET22b-PnFX-62D / 106K / 110L / 113K) strain.
  • serine at position 62 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 38 is obtained using pET22b-PnFX-62D / 106K / 110L / 113K as a template and the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOs: 85 and 86.
  • -PnFX-62D / 106K / 110L / 113K / 351S ).
  • pET22b-PnFX-62D / 106K / 110L / 113K / 351S was used as a template, and synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOs: 87 and 88 were used, and position 62 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 38 was used.
  • a recombinant plasmid (pET22b-PnFX-62D / 63H / 106K / 110L / 113K / 351S) encoding the gene was obtained.
  • E. coli BL21 (DE3) strain was transformed under the same conditions as in Example 1 to obtain E. coli BL21 (DE3) (pET22b-PnFX-62D / 63H / 106K / 110L / 113K / 351S) strain.
  • SEQ ID NO: 89 is the amino acid sequence of fructosyl amino acid oxidase derived from Cryptococcus neoformans (hereinafter referred to as CnFX), and the gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 89 (SEQ ID NO: 90) can be produced by Escherichia coli carrying the recombinant plasmid pET22b-CnFX, and CnFX has been confirmed to exhibit ⁇ FV and ⁇ FVH oxidation activities (see International Publication No. 2012/018094).
  • the recombinant plasmid pET22b-CnFX prepared as described above was used as a template, and synthetic oligonucleotides SEQ ID NOS: 91 and 92, KOD-Plus- (Toyobo Co., Ltd.)
  • SEQ ID NOS: 91 and 92 synthetic oligonucleotides
  • KOD-Plus- KOD-Plus-
  • a recombinant plasmid (pET22b-CnFX-62D) encoding a CnFX gene in which arginine at position 62 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 89 was replaced with aspartic acid was obtained.
  • arginine at position 62 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 89 was converted to aspartic acid using pET22b-CnFX-62D / 106K as a template and the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOs: 95 and 96.
  • a recombinant plasmid (pET22b-CnFX-62D / 106K / 110L) encoding a CnFX gene in which serine at position 106 was replaced with lysine and serine at position 110 was replaced with leucine was obtained.
  • the arginine at position 62 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 89 is asparagine.
  • a recombinant plasmid (pET22b-CnFX-62D / 106K / 110L / 113K) encoding a CnFX gene in which serine at position 106 is replaced with lysine, serine at position 110 with leucine, and alanine at position 113 with lysine. )
  • E. coli BL21 (DE3) strain was transformed under the same conditions as in Example 1 to obtain E. coli BL21 (DE3) (pET22b-CnFX-62D / 106K / 110L / 113K) strain.
  • SEQ ID NO: 99 is an amadoriase having an amino acid sequence showing 95% sequence identity with Curvularia clavata-derived ketoamine oxidase (hereinafter referred to as Cc95FX).
  • the gene encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 99 was obtained by total synthesis of cDNA by total synthesis by PCR of gene fragments, which is a conventional method. At this time, an NdeI site and a BamHI site were added to the 5 ′ end and 3 ′ end of SEQ ID NO: 100, respectively.
  • the gene synthesized above is treated with two types of restriction enzymes, NdeI site and BamHI (Takara Bio), and inserted into the NdeI-BamHI site of pET-22b (+) Vector (Novagen). Then, the recombinant plasmid pET22b-Cc95FX was obtained, and Escherichia coli BL21 (DE3) was transformed under the same conditions as described above to obtain Escherichia coli BL21 (DE3) (pET22b-Cc95FX).
  • pET22b-Cc95FX-62D / 106K was used as a template and the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOS: 105 and 106 were used to convert arginine at position 62 of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 99 into aspartic acid.
  • a recombinant plasmid (pET22b-Cc95FX-62D / 106K / 110L) encoding the Cc95FX gene in which aspartic acid at position 106 was replaced with lysine and alanine at position 110 was replaced with leucine was obtained.
  • arginine at position 62 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 99 was converted to asparagine using pET22b-Cc95FX-62D / 106K / 110L as a template and the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOs: 107 and 108.
  • arginine at position 62 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 99 using pET22b-Cc95FX-62D / 106K / 110L / 113K as a template and using the synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOs: 109 and 110 Is a recombinant plasmid encoding a Cc95FX gene in which aspartic acid is substituted with aspartic acid at position 106 with lysine, alanine at position 110 with leucine, alanine at position 113 with lysine, and alanine at position 353 with serine.
  • pET22b-Cc95FX-62D / 106K / 110L / 113K / 353S was obtained.
  • pET22b-Cc95FX-62D / 106K / 110L / 113K / 353S was used as a template, and synthetic oligonucleotides of SEQ ID NOS: 111 and 102 were used, and position 62 of the amino acid sequence described in SEQ ID NO: 99 was used.
  • Arginine was replaced with aspartic acid
  • leucine at position 63 was replaced with histidine
  • aspartic acid at position 106 was replaced with lysine
  • alanine at position 110 was replaced with leucine
  • alanine at position 113 was replaced with lysine
  • alanine at position 353 was replaced with serine.
  • a recombinant plasmid (pET22b-Cc95FX-62D / 63H / 106K / 110L / 113K / 353S) encoding the Cc95FX gene was obtained.
  • E. coli BL21 (DE3) strain was transformed under the same conditions as in Example 1 to obtain E. coli BL21 (DE3) (pET22b-Cc95FX-62D / 63H / 106K / 110L / 113K / 353S) strain.
  • Example 4 (Production and purification of various amadoriases) (Production and purification of fructosyl peptide oxidase from Eupenicillium terrenum) E. coli JM109 (pUTE100K′-EFP-T5), E. coli JM109 (pUTE100K′-EFP-T5-62D), E.
  • EFP-T5 producing wild-type EFP-T5 and modified EFP-T5 obtained as described above (PUTE100K'-EFP-T5-62D / 63H / 106K / 110L / 113K / 355S) was inoculated into LB-amp medium supplemented with IPTG to a final concentration of 0.1 mM and cultured at 25 ° C. for 16 hours. did.
  • Each of the obtained cultured cells was washed with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), suspended in the same buffer solution, subjected to ultrasonic disruption, and centrifuged at 20,000 ⁇ g for 10 minutes. Separated to prepare a crude enzyme solution.
  • ammonium sulfate was added to a 35% saturation concentration and stirred, and centrifuged at 20,000 ⁇ g for 10 minutes to collect the supernatant. Subsequently, ammonium sulfate was additionally added to the obtained supernatant to a 70% saturation concentration and stirred, centrifuged at 20,000 ⁇ g for 10 minutes, the supernatant was discarded, and the precipitate was 10 mM phosphoric acid. It was dissolved in potassium buffer (pH 7.0).
  • the obtained crude enzyme solution of wild type or modified EFP-T5 was dialyzed with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 6.5), and then equilibrated with the same buffer, 4 ml of Q Sepharose Fast Flow resin (GE Healthcare). The protein not adsorbed on the resin was eluted with the same buffer. Subsequently, the obtained wild-type or modified EFP-T5M crude enzyme solution was dialyzed with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0), and then equilibrated with the same buffer, HiLoad 26/10 Q Sepharose HP column.
  • the obtained crude enzyme solution containing wild-type or modified EFP-T5 was applied to a HiLoad 26/600 Superdex 200 column equilibrated with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0) containing 150 mM NaCl. Wild-type or modified EFP-T5 was eluted with a buffer, and a fraction showing fructosyl amino acid oxidase activity (amadriase activity) was collected. The obtained fraction was analyzed by SDS-PAGE to confirm that it was purified to a purity free from other contaminating proteins, and used as a purified sample of wild-type or modified EFP-T5.
  • E. coli BL21 (DE3) (pET22b-NvFX) and E. coli BL21 (DE3) (pET22b-NvFX-62D / 106K / 110L) producing the wild-type NvFX and the modified NvFX obtained as described above were terminated.
  • Each of the obtained cultured cells was washed with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0), suspended in the same buffer solution, subjected to ultrasonic disruption, and centrifuged at 20,000 ⁇ g for 10 minutes. Separated to prepare a crude enzyme solution.
  • the prepared crude enzyme solution was adsorbed on Q Sepharose Fast Flow resin (manufactured by GE Healthcare) equilibrated with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0), and then 10 mM potassium phosphate buffer (containing 20 mM NaCl) ( The resin was washed with pH 8.0), and then the wild-type or modified NvFX adsorbed on the resin was eluted and collected with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0) containing 300 mM NaCl.
  • the obtained crude enzyme solution containing wild-type NvFX or modified NvFX was applied to a HiLoad 26/600 Superdex 200 column equilibrated with 20 mM MES-NaOH buffer solution (pH 7.0) containing 150 mM NaCl. Wild-type NvFX or modified NvFX was eluted with the solution, and a fraction showing fructosyl amino acid oxidase activity (amadoriase activity) was collected. The obtained fraction was analyzed by SDS-PAGE to confirm that it was purified to a purity free from other contaminating proteins, and used as a purified sample of wild type or modified NvFX.
  • Each of the obtained cultured cells was washed with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0), suspended in the same buffer solution, subjected to ultrasonic disruption, and centrifuged at 20,000 ⁇ g for 10 minutes. Separated to prepare a crude enzyme solution.
  • the prepared crude enzyme solution was adsorbed to SP Sepharose Fast Flow resin (manufactured by GE Healthcare) equilibrated with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0), and then 10 mM potassium phosphate buffer (containing 20 mM NaCl) ( The resin was washed with pH 6.0), and then the modified AnFX adsorbed on the resin was eluted and collected with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 6.0) containing 100 mM NaCl.
  • the obtained crude enzyme solution containing modified AnFX was applied to a HiLoad 26/600 Superdex 200 column equilibrated with 20 mM MES-NaOH buffer solution (pH 7.0) containing 150 mM NaCl, and modified AnFX with the same buffer solution. And fractions showing fructosyl amino acid oxidase activity (amadoriase activity) were collected. The obtained fraction was analyzed by SDS-PAGE to confirm that it was purified to a purity free from other contaminating proteins, and was used as a purified sample of modified AnFX.
  • E. coli BL21 (DE3) (pET22b-PnFX-62D / 106K / 110L / 113K) and E. coli BL21 (DE3) (pET22b-PnFX-62D / 63H / 106K / 110L) producing the modified AnFX obtained as described above / 113K / 351S) was purified according to the purification method of wild-type PnFX described above.
  • E. coli BL21 (DE3) (pET22b-CnFX) and E. coli BL21 (DE3) (pET22b-CnFX-62D / 106K / 110L / 113K) that produce wild-type CnFX and modified CnFX obtained as described above were used.
  • Each of the obtained cultured cells was washed with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0), suspended in the same buffer solution, subjected to ultrasonic disruption, and centrifuged at 20,000 ⁇ g for 10 minutes. Separated to prepare a crude enzyme solution.
  • the prepared crude enzyme solution was adsorbed on Q Sepharose Fast Flow resin (manufactured by GE Healthcare) equilibrated with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0), and then 10 mM potassium phosphate buffer (containing 20 mM NaCl) ( The resin was washed with pH 8.0), and then the wild-type or modified CnFX adsorbed on the resin was eluted and recovered with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 8.0) containing 300 mM NaCl.
  • the obtained crude enzyme solution containing wild-type CnFX or modified CnFX was applied to a HiLoad 26/600 Superdex 200 column equilibrated with 20 mM MES-NaOH buffer solution (pH 7.0) containing 150 mM NaCl. Wild-type CnFX or modified CnFX was eluted with the solution, and a fraction showing fructosyl amino acid oxidase activity (amadoriase activity) was collected. The obtained fraction was analyzed by SDS-PAGE to confirm that it was purified to a purity free from other contaminating proteins, and used as a purified sample of wild type or modified CnFX.
  • Each of the obtained cultured cells was washed with 10 mM potassium phosphate buffer (pH 7.0), suspended in the same buffer solution, subjected to ultrasonic disruption, and centrifuged at 20,000 ⁇ g for 10 minutes. Separated to prepare a crude enzyme solution.
  • Cc95FX As a result of introduction into the prepared amadoriase (Cc95FX; Comparative Example 8) showing 95% sequence identity with Curvularia clavata-derived ketoamine oxidase, Cc95FX was newly given reactivity to ⁇ F6P as expected, and Cc95FX-62D In / 63H / 106K / 110L / 113K / 355S, ⁇ F6P oxidation activity exceeded ⁇ FVH oxidation activity.
  • the effect of amino acid substitution that imparts or enhances the reactivity to ⁇ F6P to Coniochaeta-derived amadoriase described in the present specification is not limited to Coniochaeta-derived amadoriase. If it was an amadoriase showing 74% or more sequence identity with Coniochaeta-derived amadoriase as shown, reactivity to ⁇ F6P was imparted or enhanced in the same manner.
  • Amadoriase 30 in which the mutation 61D / 105K / 110L was introduced into AnFX showed a specific activity of 0.1 or more with respect to ⁇ F6P. That is, it was possible to obtain a modified amadoriase exhibiting a specific activity of 0.1 or more with respect to ⁇ F6P by introducing a triple mutation into the enzyme.
  • mutations that improve the activity of amadoriase on ⁇ F6P are not limited to any particular mutation, and are not limited to any particular combination, and are shown in the 62, 63, 102, 106, 110, as shown herein.
  • mutations at positions, 113, 355, 419, 68 and 356, and other positions that improve activity against ⁇ F6P can be used in any combination.
  • amadoriase having activity against ⁇ F6P can be used in the method for measuring HbA1c of the present invention.
  • Example 5 Quantification of HbA1c
  • a reagent for measuring HbA1c having the following composition was prepared, and HbA1c was measured as described below using Bio Majesty JCA-BM1650 (manufactured by JEOL).
  • HbA1c solution HbA1c certified practical reference material JCCRM423-8 manufactured by National Institute for Laboratory Science
  • Reagent A1 Sample pretreatment solution 5.0% n-dodecyl- ⁇ -D-maltoside (manufactured by Dojindo Laboratories)
  • Reagent A2 Sample pretreatment solution 5.0% n-tetradecyl- ⁇ -D-maltoside (manufactured by Sigma-Aldrich)
  • Reagent B leuco dye, peroxidase solution 150 mM potassium phosphate buffer, pH 6.5 0.30 mM N- (carboxymethylaminocarbonyl) -4,4′-bis (dimethylamino) diphenylamine sodium (DA-64, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 15 U / ml peroxide solution
  • ⁇ A was calculated according to the following formula.
  • ⁇ A (absorbance 5 minutes after addition of reagent C1 or C2) ⁇ (absorbance immediately before addition of reagent C1 or C2 ⁇ 0.75)
  • a value obtained by multiplying the absorbance immediately before the addition of the reagent C1 or the reagent C2 by 0.75 is immediately after the addition of the reagent C1 or the reagent C2.
  • the absorbance was taken as.
  • the results when the sample was diluted with the reagent A1 are shown in FIG. 4-1, and the results when the sample was diluted with the reagent A2 are shown in FIG.
  • Example 6 Quantification of HbA1c pretreated with acid
  • a reagent for measuring HbA1c having the following composition was prepared, and HbA1c was measured as described below using Bio Majesty JCA-BM1650 (manufactured by JEOL).
  • a nonionic surfactant solution adjusted to acidity was used as a pretreatment liquid for the HbA1c sample.
  • HbA1c solution HbA1c certified practical reference material JCCRM423-8 (manufactured by National Institute for Laboratory Science) Total hemoglobin concentration 133 g / l, HbA1c concentration 3 level (NGSP value 5.56%, 7.74%, 10.48%) Or HbA1c certified practical reference material JCCRM 423-9b (manufactured by National Institute for Laboratory Medicine) Total hemoglobin concentration 133 g / l, HbA1c concentration 3 level (NGSP value 5.61%, 7.71%, 10.55%)
  • Reagent D1 Sample pretreatment solution 8.3% n-dodecyl- ⁇ -D-maltoside (manufactured by Dojindo Laboratories) 0.1M hydrochloric acid reagent
  • D2 Sample pretreatment solution 8.3% Polyoxyethylene (20) cetyl ether (Brij58, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 0.1 M hydrochloric acid reagent E: leuco dye solution 30 mM
  • FIG. 5-1 the relationship between the elapsed time after mixing the sample diluted with the reagent D1 and the reagent E and the absorbance is shown in FIG. 5-1.
  • the CFP-T7-H35 solution reagent F1
  • NGSP value the HbA1c concentration of the sample was plotted on the horizontal axis and the absorbance difference ⁇ A of 751 nm light before and after the quantitative reaction of hydrogen peroxide was plotted on the vertical axis.
  • ⁇ A was calculated according to the following formula.
  • ⁇ A (absorbance 5 minutes after addition of reagent F1 or F2) ⁇ (absorbance immediately before addition of reagent F1 or F2 ⁇ 0.75)
  • the value obtained by multiplying the absorbance immediately before the addition of the reagent F1 or F2 by 0.75 is the absorbance immediately after the addition of the reagent F1 or F2.
  • HbA1c concentration ⁇ A regardless of whether reagent D1 or reagent D2 was used for sample dilution. Therefore, when measuring a denatured HbA1c using amadoriase exhibiting ⁇ F6P oxidation activity, it was shown that HbA1c can be quantified quickly and accurately even if the HbA1c is denatured by acid treatment. It was also shown that the type of nonionic surfactant is not limited when a nonionic surfactant coexists in the acidic solution for modification.
  • an amadoriase for directly measuring HbA1c can be used as long as it exhibits a certain reactivity to ⁇ F6P. It has also been shown that it is not limited.
  • Example 7 Quantification of HbA1c pretreated with ionic surfactant
  • a reagent for measuring HbA1c having the following composition was prepared, and HbA1c was measured as described below using Bio Majesty JCA-BM1650 (manufactured by JEOL).
  • an ionic surfactant solution was used as a pretreatment liquid for the HbA1c sample.
  • HbA1c solution HbA1c certified practical reference material JCCRM 423-9b manufactured by Laboratory Medicine Reference Material Organization
  • Reagent G1 Sample pretreatment solution 0.80% tetradecyltrimethylammonium bromide (manufactured by Tokyo Chemical Industry)
  • Reagent G2 Sample pretreatment solution 0.70% hexadecyltrimethylammonium bromide (manufactured by Tokyo Chemical Industry)
  • Reagent H1 Leuco dye solution 120 mM MOPS-NaOH buffer pH 6.5 1.6% n-dodecyl- ⁇ -D-maltoside (Dojindo Laboratories) 0.16 mM N- (carboxymethylaminocarbonyl) -4,4′-bis (dimethylamino) diphenylamine sodium (DA-64, manufactured by Wako
  • the relationship between the elapsed time after mixing the reagent H1 and the absorbance of the sample diluted with the reagent G1 is shown in FIG. 7-1, and in this case, the excess time immediately after the addition of the CFP-DH2 solution (reagent I1) was shown. An increase in absorbance associated with the generation of hydrogen oxide was confirmed. From the measurement results of each HbA1c sample, a graph was prepared in which the HbA1c concentration (NGSP value) of the sample was plotted on the horizontal axis and the absorbance difference ⁇ A of 751 nm light before and after the quantitative reaction of hydrogen peroxide was plotted on the vertical axis.
  • NGSP value HbA1c concentration
  • ⁇ A was calculated according to the following formula.
  • ⁇ A (absorbance 5 minutes after addition of reagent I1 or I2) ⁇ (absorbance immediately before addition of reagent I1 or I2 ⁇ 0.75)
  • the absorbance immediately before the addition of the reagent I1 or I2 is obtained by multiplying the absorbance immediately before the addition of the reagent I1 or I2 by 0.75.
  • HbA1c concentration ⁇ A regardless of whether reagent G1 or reagent G2 was used for sample dilution. Therefore, when measuring a denatured HbA1c using amadoriase exhibiting ⁇ F6P oxidation activity, it was shown that HbA1c can be quantified quickly and accurately even if HbA1c is denatured with an ionic surfactant. Moreover, it was also shown that the type of ionic surfactant used for the modification of HbA1c is not limited when carrying out this measurement.
  • CFP-T7-H35 also used a glycated peptide ( ⁇ F6P) having a long peptide chain that could not be used as a substrate by the wild-type enzyme (CFP-T7).
  • ⁇ F6P glycated peptide
  • CFP-T7-H35 direct measurement of HbA1c was attempted without going through a treatment step with protease or the like for cutting out ⁇ F6P from HbA1c.
  • a sample as described in Example 5 was used.
  • the HbA1c concentration in the medium could be determined.
  • Amadoriase that acts directly on HbA1c has not been discovered so far, and there are no reports of it. Therefore, it is a surprising finding that amadoriase using ⁇ F6P as a substrate acts directly on HbA1c.
  • amadoriase using ⁇ F6P as a substrate directly acts on HbA1c
  • other amadoriases having activity against ⁇ F6P as well as CFP-T7-H35 can also directly bind the ⁇ chain of HbA1c.
  • the possibility of using as a substrate is suggested.
  • an amadoriase having a high specific activity with respect to ⁇ F6P acts directly on HbA1c in the same manner as the amadoriase of the present invention. Therefore, it is considered that there is a high probability that it can be used for quantitative measurement of HbA1c.
  • the findings of the present invention are not limited to showing that amadoriase having ⁇ F6P activity can directly act on HbA1c.
  • ⁇ -fructosyl oligopeptides such as ⁇ F3P, ⁇ F4P, ⁇ F5P, ⁇ F7P, ⁇ F8P, ⁇ F10P
  • any amadoriase exhibiting activity against ⁇ F16P or the like may directly act on HbA1c.
  • the HbA1c measurement method using the amadoriase of the present invention does not require treatment with HbA1c protease or the like, and HbA1c can be quantified quickly, simply, and with good accuracy.
  • the method of denaturing HbA1c is not particularly limited. Thereby, the direct measurement of HbA1c by the enzyme method is realized, and industrial utility value is expected.
  • Amadoriase nucleotide sequence SEQ ID NO: 123 Penicillium janthinellum (Pj) Amadoriase amino acid sequence SEQ ID NO: 124 Penicillium janthinellum (Pj) Amadoriase nucleotide sequence SEQ ID NO: 125 Aspergillus fumigatus Amadoriase I amino acid sequence SEQ ID NO: 126 Amadoriase I nucleotide sequence SEQ ID NO: 127 Aspergillus oryzae FAOAo1 amino acid sequence SEQ ID NO: 128 FAOAo1 nucleotide sequence SEQ ID NO: 129 Aspergillus fumigatus Amadoriase II amino acid sequence No.
  • Amadoriase II nucleotide sequence SEQ ID NO: 131 Aspergillus terreus FAOD-A amino acid sequence SEQ ID NO: 132 FAOD-A nucleotide sequence SEQ ID NO: 133 CFP-T7-H20 (R62D, D106K, Q110L, A113K) Coniochaeta sp.
  • Amino acid sequence SEQ ID NO: 152 CFP-T7- H1 nucleotide sequence SEQ ID NO: 153 (Amadoriase 26) CFP-T7-62D (R62D) Coniochaeta sp.
  • Amino acid sequence SEQ ID NO: 158 CFP-T7-H2 Base sequence SEQ ID NO: 159 (Amadoriase 4) CFP-T7-H4 (R62A, Q110Y ) Coniochaeta sp.
  • Amino acid sequence SEQ ID NO: 160 CFP-T7-H4 nucleotide sequence SEQ ID NO: 161 (Amadoriase 5) CFP-T7-H2-62N (R62N, Q110L) Coniochaeta sp.
  • Amino acid sequence SEQ ID NO: 162 CFP-T7-H2-62N Base sequence SEQ ID NO: 163 (Amadoriase 6) CFP-T7-H6 (R62D, Q110L) Coniochaeta sp.
  • Amino acid sequence SEQ ID NO: 164 CFP-T7-H6 Base sequence SEQ ID NO: 165 (Amadoriase 12) CFP-T7-H10 (R62D, D106A) , Q110L) Coniochaeta sp.
  • Amino acid sequence SEQ ID NO: 178 CFP-T7-H24 nucleotide sequence SEQ ID NO: 179 (Amadoriase 21) CFP-T7-H26 (R62D, L63H, D106K, Q110L, A113K) Coniochaeta sp.
  • Amino acid sequence SEQ ID NO: 180 CFP -T7-H26 nucleotide sequence SEQ ID NO: 181 (Amadoriase 23) CFP-T7-H28 (R62D, L63H, E102K, D106K, Q110L, A113K) Coniochaeta sp.
  • Amino acid sequence SEQ ID NO: 182 CFP-T7-H28 nucleotide sequence SEQ ID NO: 183 ( Amadoriase 24) CFP-T7-H29 (R62D, L63H, D106K, Q110L, A113K, A419K) Coniochaeta sp.
  • NISL 9330 modified amadoriase 36, CFP-T7-H36 (CFP-T7-R62D / L63H / D68N / E102K / D106K / Q110L / A113K / A355S / E44P / E133A / E253K / V257C / N262H / Q337K / E340P / ⁇ P435 / ⁇ K436 / ⁇ L437) amino acid sequence SEQ ID NO: 200 nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 199 PCR primer SEQ ID NO: 203 amino acid sequence of CFP-DH2 (derived from Coniochaeta sp. NISL 9330) (Amadoriase 39) SEQ ID NO: 204 A nucleotide sequence encoding the amino acid sequence of SEQ ID NO: 203

Abstract

　ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）のβ鎖に作用し、過酸化水素を生成することを特徴とするアマドリアーゼを提供し、それを用いたＨｂＡ1cの測定方法および測定試薬キットを提供する。　αＦ６Ｐに対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有しＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端を酸化して過酸化水素を生成することを特徴とするアマドリアーゼを用いたＨｂＡ1cの測定方法および該アマドリアーゼを含む測定試薬キット。　ＨｂＡ１ｃを迅速、簡便に、かつ、精度よく定量できる測定方法、測定キットを提供できる。

Description

ヘモグロビンＡ１ｃの測定方法および測定キット
　本発明は、試料中のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法、およびその測定方法に用いられる測定用試薬キットに関する。
　糖化タンパク質は、グルコースなどのアルドース（アルデヒド基を潜在的に有する単糖およびその誘導体）のアルデヒド基と、タンパク質のアミノ基が非酵素的に共有結合を形成し、アマドリ転移することにより生成したものである。タンパク質のアミノ基としてはアミノ末端のα－アミノ基、タンパク質中のリジン残基側鎖のε－アミノ基が挙げられる。生体内で生じる糖化タンパク質としては血液中のヘモグロビンが糖化された糖化ヘモグロビン、アルブミンが糖化された糖化アルブミンなどが知られている。
　これら生体内で生じる糖化タンパク質の中でも、糖尿病の臨床診断分野において、糖尿病患者の診断や症状管理のための重要な血糖コントロールマーカーとして、ヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）が注目されている。ＨｂＡ１ｃは、へモグロビン「β鎖」のＮ末端（アミノ末端）のＶａｌ（バリン）の、α－アミノ基にグルコースが結合したタンパク質である。血液中のＨｂＡ１ｃ濃度は、過去の一定期間の平均血糖値を反映することから、ＨｂＡ１ｃの値は糖尿病の症状の診断や管理において重要な指標となっている。
　このＨｂＡ１ｃを迅速かつ簡便に測定する方法として、従来、アマドリアーゼを用いる数種類の酵素的方法が知られている。
　アマドリアーゼは、酸素の存在下で、イミノ２酢酸若しくはその誘導体（「アマドリ化合物」とも言う）を酸化して、グリオキシル酸若しくはα－ケトアルデヒド、アミノ酸若しくはペプチド、および過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素の総称である。アマドリアーゼは、ＨｂＡ１ｃを酵素的方法により測定するために有用な酵素として知られている。アマドリアーゼにより酸化される基質としては、例えば、α－フルクトシルバリルヒスチジン（以降αＦＶＨと表す）が知られている。
　アマドリアーゼはこれまでに、細菌、酵母、真菌から見出されており、例えば、コニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、ペニシリウム(Penicillium)属、フザリウム(Fusarium)属、アカエトミエラ(Achaetomiella)属、アカエトミウム(Achaetomium)属、シエラビア(Thielavia)属、カエトミウム(Chaetomium)属、ゲラシノスポラ(Gelasinospora)属、ミクロアスカス(Microascus)属、レプトスフェリア(Leptosphaeria)属、オフィオボラス(Ophiobolus)属、プレオスポラ(Pleospora)属、コニオケチジウム(Coniochaetidium)属、ピチア(Pichia)属、デバリオマイセス(Debaryomyces)属、コリネバクテリウム(Corynebacterium)属、アグロバクテリウム(Agrobacterium)属、アルスロバクター(Arthrobacter)属由来のアマドリアーゼが報告されている（例えば、特許文献１、６～１５、非特許文献１～９参照。）。これらの属のことを本明細書においてコニオカエタ(Coniochaeta)属等と呼ぶことがある。なお、上記報告例の中で、アマドリアーゼは、文献によってはケトアミンオキシダーゼやフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼ等の表現で記載されている場合もある。
　上述のような各種のアマドリアーゼを用いて、ＨｂＡ１ｃを迅速かつ簡便に測定する方法としては、プロテアーゼまたはペプチダーゼ（以下、プロテアーゼ等という）の切り出し用酵素でＨｂＡ１ｃを分解し、ＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端より特定の測定用物質を遊離させ、遊離した測定用物質を、上述のようなアマドリアーゼを用いて定量する方法が知られている（例えば、特許文献１～７参照）。
　具体的には、ＨｂＡ１ｃを特定のプロテアーゼ等で分解し、そのβ鎖アミノ末端よりαＦＶＨを遊離させたのちに、遊離したαＦＶＨを定量する方法が知られており、この測定方法が、現在のＨｂＡ１ｃ酵素的測定法の主流となっている。
　さらに、アマドリアーゼを用いたＨｂＡ１ｃの測定方法としては、ＨｂＡ１ｃをＧｌｕ－Ｃプロテアーゼを用いて消化し、糖化されたβ鎖アミノ末端のバリンを含む６アミノ酸からなるα－フルクトシルヘキサペプチド（α－フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸、以降αＦ６Ｐと表す）を遊離させたのちに、遊離したαＦ６Ｐを定量する方法がある（例えば、特許文献１６、１７参照。）。この方法は、ＩＦＣＣ（International Federation of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine）により定められたＨｂＡ１ｃ測定法（非特許文献１０参照）に則った、酵素によるＨｂＡ１ｃの測定方法である。
　しかしながら、前述のアマドリアーゼを用いたＨｂＡ１ｃの測定方法では、プロテアーゼまたはペプチダーゼ（以下、プロテアーゼ等という）によりＨｂＡ１ｃを消化し、そのβ鎖アミノ末端のバリンを含む糖化ペプチドを遊離させる工程を欠かすことはできない。したがって、ＨｂＡ１ｃの測定試薬キットには必ずプロテアーゼ等を処方する必要があるが、これは以下に述べる理由により本来好ましいことではない。
　プロテアーゼ等はタンパク質を加水分解する作用を示すため、タンパク質である酵素もまたプロテアーゼ等により加水分解される。したがって、アマドリアーゼもまたプロテアーゼにより加水分解されて失活し、その結果、糖化ペプチドと酸素を消費して過酸化水素を生成する反応が阻害される。これに対する対処法としては、アマドリアーゼの処方量を増やし、アマドリアーゼが完全に失活する前に測定を終えることが考えられるが、アマドリアーゼの増量は、プロテアーゼ等がＨｂＡ1cよりもアマドリアーゼを優先的に加水分解することに繋がり、本来好ましくはない。
　また、糖化ペプチドにアマドリアーゼを作用させて生じる過酸化水素を定量してＨｂＡ1cを測定する場合には、過酸化水素の定量にパーオキシダーゼを用いることがある。この場合、パーオキシダーゼもまたプロテアーゼ等により加水分解されて失活するため、好ましくない。
　また別の側面として、酵素によるＨｂＡ１ｃ測定には自動分析装置を使用することが一般的であり、この場合、一つの試料を用いてＨｂＡ１ｃを始めとする様々な生体マーカーを同時測定する。この際、各生体マーカーは酵素もしくは抗体を利用して測定するため、プロテアーゼ等がコンタミネーションすると、各生体マーカー測定試薬に含まれる酵素もしくは抗体が加水分解され、ＨｂＡ１ｃ以外の生体マーカーが正確に測定できない恐れがある。したがって、自動分析装置にセットする試薬には、本来プロテアーゼ等が含まれていないことが好ましい。
　以上の理由により、アマドリアーゼで直接ＨｂＡ１ｃのβ鎖を酸化して過酸化水素を生成させるアマドリアーゼと、それを利用したＨｂＡ１ｃ測定法が求められていたが、そのような酵素活性を示すアマドリアーゼはこれまでに見出されていなかった。
国際公開第２００４／１０４２０３号 国際公開第２００５／４９８５７号 特開２００１－９５５９８号公報 特公平０５－３３９９７号公報 特開平１１－１２７８９５号公報 国際公開第９７／１３８７２号 特開２０１１－２２９５２６号公報 特開２００３－２３５５８５号公報 特開２００４－２７５０１３号公報 特開２００４－２７５０６３号公報 特開２０１０－３５４６９号公報 特開２０１０－５７４７４号公報 国際公開第２０１０／４１７１５号 国際公開第２０１０／４１４１９号 国際公開第２０１１／１５３２５号 国際公開第２００４／３８０３４号 国際公開第２００８／１０８３８５号
Ｂｉｏｃｈｅｍ．　Ｂｉｏｐｈｙｓ．　Ｒｅｓ．　Ｃｏｍｍｕｎ．　３１１，　１０４－１１，　２００３ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｂｉｏｅｎｇ．　１０６，　３５８－６６，　２０１０ Ｊ．　Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｅｎｇ．　１０２，　２４１－３，　２００６ Ａｐｐｌ．　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　７４，　８１３－９，　２００７ Ｅｕｒ．　Ｊ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　２４２，　４９９－５０５，　１９９６ Ｍａｒ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　６，　６２５－３２，　２００４ Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　６６，　１２５６－６１，　２００２ Ｂｉｏｓｃｉ．　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｂｉｏｃｈｅｍ．　６６，　２３２３－２９，　２００２ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２７，　２７－３２，　２００５ Ｊｅｐｐｓｓｏｎ　ＪＯ，　ｅｔ　ａｌ；Ａｐｐｒｏｖｅｄ　ＩＦＣＣ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｍｅｔｈｏｄ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔ　ｏｆ　ＨｂＡ１ｃ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｂｌｏｏｄ．　Ｃｌｉｎ．　Ｃｈｅｍ．　Ｌａｂ．　Ｍｅｄ．　４０，　７８－８９，２００２
　本発明が解決しようとする課題は、ＨｂＡ１ｃのβ鎖を酸化して過酸化水素を生成させるアマドリアーゼを見出し、それを利用したＨｂＡ1c測定法を構築することにある。
　本発明者らは、前記課題解決のために鋭意研究を重ねた結果、コニオカエタ(Coniochaeta)属等に由来するアマドリアーゼに数個のアミノ酸置換が導入された改変型アマドリアーゼが、ＨｂＡ１ｃを酸化して過酸化水素を生成させる活性を有することを見出し、それを利用したＨｂＡ1c測定法を実現して本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は以下を包含する。
[１]　試料にヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼを作用させ、その作用によって生じる過酸化水素もしくは消費される酸素を測定することを特徴とする、試料中のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。 
[２]　前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、α－フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するものである、１に記載の方法。 
[３]　前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、α－フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有し、かつ、以下の(i)～(iii)からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
(i)　アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸配列の以下（ａ）から（j）よりなる群から選択される位置に対応する位置で当該アマドリアーゼのアミノ酸配列が１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を有するアマドリアーゼ、
（ａ）配列番号１の６２位、
（ｂ）配列番号１の６３位、
（ｃ）配列番号１の１０２位、
（ｄ）配列番号１の１０６位、
（ｅ）配列番号１の１１０位、
（ｆ）配列番号１の１１３位、
（ｇ）配列番号１の３５５位、
（ｈ）配列番号１の４１９位、
（ｉ）配列番号１の６８位、
（ｊ）配列番号１の３５６位、
(ii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における６２位、６３位、１０２位、１０６位、１１０位、１１３位、３５５位、４１９、６８位及び３５６位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなるアマドリアーゼ、
(iii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１の第１０位～３２位、３６～４１位、４９～５２位、５４～５８位、６３～６５位、７３～７５位、８４～８６位、８８～９０位、１２０～１２２位、１４５～１５０位、１５６～１６２位、１６４～１７０位、１８０～１８２位、２０２～２０５位、２０７～２１１位、２１４～２２４位、２２７～２３０位、２３６～２４１位、２４３～２４８位、２５８～２６１位、２６６～２６８位、２７０～２７３位、２７５～２８７位、２９５～２９７位、３０６～３０８位、３１０～３１６位、３２４～３２９位、３３２～３３４位、３４１～３４４位、３４６～３５５位、３５７～３６３位、３７０～３８３位、３８５～３８７位、３８９～３９４位、４０５～４１０位及び４２３～４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有するアマドリアーゼ、
である、１又は２に記載の方法。 
[４]　前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の以下（a）から（j）よりなる群から選択される１つまたはそれ以上の位置に対応する位置のアミノ酸が以下の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α－フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼ、
（a）配列番号１の６２位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、スレオニン又はプロリンである、
（b）配列番号１の６３位に対応する位置のアミノ酸がアラニン又はヒスチジンである、
（c）配列番号１の１０２位に対応する位置のアミノ酸がリジンである、
（d）配列番号１の１０６位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、リジン又はアルギニンである、
（e）配列番号１の１１０位に対応する位置のアミノ酸がロイシン又はチロシンである、
（f）配列番号１の１１３位に対応する位置のアミノ酸がリジン又はアルギニンである、
（g）配列番号１の３５５位に対応する位置のアミノ酸がセリンである、
（h）配列番号１の４１９位に対応する位置のアミノ酸がリジンである、
(i) 配列番号１の６８位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンである、
(j) 配列番号１の３５６位に対応する位置のアミノ酸がスレオニンである、
である、３に記載の方法。 
[５]　前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の（a）から（j）よりなる群から選択される２以上の位置に対応する位置のアミノ酸が、当該（a）から（j）の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α－フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼである、４に記載の方法。 
[６]　前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の（a）から（j）よりなる群から選択される３以上の位置に対応する位置のアミノ酸が、当該（a）から（j）の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α－フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼである、５に記載の方法。 
[７]　前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の（a）から（j）よりなる群から選択される４以上の位置に対応する位置のアミノ酸が、当該（a）から（j）の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α－フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼである、６に記載の方法。 
[８]　前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の（a）から（j）よりなる群から選択される５以上の位置に対応する位置のアミノ酸が、当該（a）から（j）の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α－フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼである、７に記載の方法。 
[９]　前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の（a）から（j）よりなる群から選択される６以上の位置に対応する位置のアミノ酸が、当該（a）から（j）の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α－フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼである、８に記載の方法。 
[１０]　ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼがコニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、またはペニシリウム(Penicillium)属由来である、１～９のいずれかに記載の試料中のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。 
[１１]　ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼがコニオカエタ　エスピー(Coniochaeta sp.)、ユーペニシリウム　テレナム(Eupenicillium terrenum)、ピレノケータ　エスピー(Pyrenochaeta sp.)、アルスリニウム　エスピー(Arthrinium sp.)、カーブラリア　クラベータ(Curvularia clavata)、ネオコスモスポラ　バシンフェクタ(Neocosmospora vasinfecta)、クリプトコッカス　ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、フェオスフェリア　ノドラム(Phaeosphaeria nodorum)、アスペルギルス　ニードランス(Aspergillus nidulans)、エメリセラ　ニードランス(Emericella nidulans)属、ウロクラディウム　エスピー(Ulocladium sp.)、またはペニシリウム ヤンシネラム(Penicillium janthinelum)もしくはペニシリウム クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）由来である、１～１０のいずれかに記載の試料中のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。 
[１２]　ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、以下からなる群より選択されるアマドリアーゼである、１に記載の試料中のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。 
(i)　配列番号１４１又は１４３に示すアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸の置換、欠失又は付加がなされたアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ。 
(ii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１４１又は１４３のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１４１の第１０位～３２位、３６～４１位、４９～５２位、５４～５８位、７３～７５位、８４～８６位、８８～９０位、１２０～１２２位、１４５～１５０位、１５６～１６２位、１６４～１７０位、１８０～１８２位、２０２～２０５位、２０７～２１１位、２１４～２２４位、２２７～２３０位、２３６～２４１位、２４３～２４８位、２５８～２６１位、２６６～２６８位、２７０～２７３位、２７５～２８７位、２９５～２９７位、３０６～３０８位、３１０～３１６位、３２４～３２９位、３３２～３３４位、３４１～３４４位、３４６～３５５位、３５７～３６３位、３７０～３８３位、３８５～３８７位、３８９～３９４位、４０５～４１０位及び４２３～４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有するアマドリアーゼ。
[１３]　アマドリアーゼがさらに、配列番号１に示すアミノ酸配列における以下のアミノ酸、
（i）２６２位のアスパラギン、
（ii）２５７位のバリン、
（iii）２４９位のグルタミン酸
（iv）２５３位のグルタミン酸、
（v）３３７位のグルタミン、
（vi）３４０位のグルタミン酸、
（vii）２３２位のアスパラギン酸、
（viii）１２９位のアスパラギン酸、
（ix）１３２位のアスパラギン酸、
（x）１３３位のグルタミン酸、
（xi）４４位のグルタミン酸、
（xii）２５６位のグリシン、
（xiii）２３１位のグルタミン酸、及び
（xiv）８１位のグルタミン酸、
よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を有し、かつ
　場合によりカルボキシル末端からの3アミノ酸残基を欠失していてもよい、３～１２のいずれかに記載の測定方法。
[１４]　以下の（１）および（２）の成分を含むことを特徴とする、試料中のヘモグロビンＡ１ｃの測定用試薬キット。
（１）ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用して、過酸化水素を生成する作用を有するアマドリアーゼ。
（２）過酸化水素を測定するための試薬。
[１５]　前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、α－フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するものである、１４に記載のキット。
[１６]　前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、α－フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有し、かつ、以下の(i)～(iii)からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
(i)　アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸配列の以下（ａ）から（j）よりなる群から選択される位置に対応する位置で当該アマドリアーゼのアミノ酸配列が１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を有するアマドリアーゼ、
（ａ）配列番号１の６２位、
（ｂ）配列番号１の６３位、
（ｃ）配列番号１の１０２位、
（ｄ）配列番号１の１０６位、
（ｅ）配列番号１の１１０位、
（ｆ）配列番号１の１１３位、
（ｇ）配列番号１の３５５位、
（ｈ）配列番号１の４１９位、
（ｉ）配列番号１の６８位、
（ｊ）配列番号１の３５６位、
(ii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における６２位、６３位、１０２位、１０６位、１１０位、１１３位、３５５位、４１９、６８位及び３５６位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなるアマドリアーゼ、
(iii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１の第１０位～３２位、３６～４１位、４９～５２位、５４～５８位、６３～６５位、７３～７５位、８４～８６位、８８～９０位、１２０～１２２位、１４５～１５０位、１５６～１６２位、１６４～１７０位、１８０～１８２位、２０２～２０５位、２０７～２１１位、２１４～２２４位、２２７～２３０位、２３６～２４１位、２４３～２４８位、２５８～２６１位、２６６～２６８位、２７０～２７３位、２７５～２８７位、２９５～２９７位、３０６～３０８位、３１０～３１６位、３２４～３２９位、３３２～３３４位、３４１～３４４位、３４６～３５５位、３５７～３６３位、３７０～３８３位、３８５～３８７位、３８９～３９４位、４０５～４１０位及び４２３～４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有するアマドリアーゼ、
である、１４又は１５に記載のキット。
[１７]　前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の以下（a）から（j）よりなる群から選択される１つまたはそれ以上の位置に対応する位置のアミノ酸が以下の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α－フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼ、
（a）配列番号１の６２位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、スレオニン又はプロリンである、
（b）配列番号１の６３位に対応する位置のアミノ酸がアラニン又はヒスチジンである、
（c）配列番号１の１０２位に対応する位置のアミノ酸がリジンである、
（d）配列番号１の１０６位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、リジン又はアルギニンである、
（e）配列番号１の１１０位に対応する位置のアミノ酸がロイシン又はチロシンである、
（f）配列番号１の１１３位に対応する位置のアミノ酸がリジン又はアルギニンである、
（g）配列番号１の３５５位に対応する位置のアミノ酸がセリンである、
（h）配列番号１の４１９位に対応する位置のアミノ酸がリジンである、
(i) 配列番号１の６８位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンである、
(j) 配列番号１の３５６位に対応する位置のアミノ酸がスレオニンである、
である、１６に記載のキット。
[１８]　前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の（a）から（j）よりなる群から選択される２以上の位置に対応する位置のアミノ酸が、当該（a）から（j）の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α－フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼである、１７に記載のキット。
[１９]　前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の（a）から（j）よりなる群から選択される３以上の位置に対応する位置のアミノ酸が、当該（a）から（j）の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α－フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼである、１８に記載のキット。
[２０]　前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の（a）から（j）よりなる群から選択される４以上の位置に対応する位置のアミノ酸が、当該（a）から（j）の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α－フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼである、１９に記載のキット。
[２１]　前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の（a）から（j）よりなる群から選択される５以上の位置に対応する位置のアミノ酸が、当該（a）から（j）の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α－フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼである、２０に記載のキット。
[２２]　前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の（a）から（j）よりなる群から選択される６以上の位置に対応する位置のアミノ酸が、当該（a）から（j）の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α－フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼである、２１に記載のキット。
[２３]　前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用して、過酸化水素を生成する作用を有するアマドリアーゼが、コニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、またはペニシリウム(Penicillium)属由来である、１４～２２のいずれかに記載のキット。
[２４]　前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用して、過酸化水素を生成する作用を有するアマドリアーゼが、
(i)　配列番号１４１又は１４３に示すアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸の置換、欠失又は付加がなされたアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、または
(ii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１４１又は１４３のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１４１の第１０位～３２位、３６～４１位、４９～５２位、５４～５８位、７３～７５位、８４～８６位、８８～９０位、１２０～１２２位、１４５～１５０位、１５６～１６２位、１６４～１７０位、１８０～１８２位、２０２～２０５位、２０７～２１１位、２１４～２２４位、２２７～２３０位、２３６～２４１位、２４３～２４８位、２５８～２６１位、２６６～２６８位、２７０～２７３位、２７５～２８７位、２９５～２９７位、３０６～３０８位、３１０～３１６位、３２４～３２９位、３３２～３３４位、３４１～３４４位、３４６～３５５位、３５７～３６３位、３７０～３８３位、３８５～３８７位、３８９～３９４位、４０５～４１０位及び４２３～４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有するアマドリアーゼ
である、１４～２３のいずれかに記載のキット。
[２５]　前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用して、過酸化水素を生成する作用を有するアマドリアーゼがさらに配列番号１に示すアミノ酸配列における以下のアミノ酸、
（i）２６２位のアスパラギン、
（ii）２５７位のバリン、
（iii）２４９位のグルタミン酸
（iv）２５３位のグルタミン酸、
（v）３３７位のグルタミン、
（vi）３４０位のグルタミン酸、
（vii）２３２位のアスパラギン酸、
（viii）１２９位のアスパラギン酸、
（ix）１３２位のアスパラギン酸、
（x）１３３位のグルタミン酸、
（xi）４４位のグルタミン酸、
（xii）２５６位のグリシン、
（xiii）２３１位のグルタミン酸、及び
（xiv）８１位のグルタミン酸、
よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を有し、かつ
　場合によりカルボキシル末端からの3アミノ酸残基を欠失していてもよい、１６～２４のいずれかに記載のキット。
[２６]　以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
(i)　アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における６８位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンであるか、配列番号１に示すアミノ酸配列における３５６位に対応する位置のアミノ酸がスレオニンであり、かつα－フルクトシルヘキサペプチド（αＦ６Ｐ）に対する活性を有するアマドリアーゼ、
(ii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における６８位又は３５６位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつαＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ、
(iii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における６８位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンであるか、配列番号１に示すアミノ酸配列における３５６位に対応する位置のアミノ酸がスレオニンであり、かつ、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１の第１０位～３２位、３６～４１位、４９～５２位、５４～５８位、６３～６５位、７３～７５位、８４～８６位、８８～９０位、１２０～１２２位、１４５～１５０位、１５６～１６２位、１６４～１７０位、１８０～１８２位、２０２～２０５位、２０７～２１１位、２１４～２２４位、２２７～２３０位、２３６～２４１位、２４３～２４８位、２５８～２６１位、２６６～２６８位、２７０～２７３位、２７５～２８７位、２９５～２９７位、３０６～３０８位、３１０～３１６位、３２４～３２９位、３３２～３３４位、３４１～３４４位、３４６～３５５位、３５７～３６３位、３７０～３８３位、３８５～３８７位、３８９～３９４位、４０５～４１０位及び４２３～４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有し、αＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ。
[２７]　ヘモグロビンＡ１ｃが、変性したヘモグロビンＡ１ｃである、[１]～[１３]のいずれかに記載の方法。 
[２８]　変性が加熱処理、界面活性剤処理、酸若しくは塩基処理又はそれらの組み合わせによるものである、[２７]に記載の方法。
　本明細書は本願の優先権の基礎である日本国特許出願2013-222774号の明細書および／または図面に記載される内容を包含する。
　本発明によれば、ＨｂＡ１ｃを迅速、簡便に、かつ、精度よく良好に定量できるアマドリアーゼを提供できる。このようなアマドリアーゼを用いれば、プロテアーゼ等を処方することなくＨｂＡ１ｃの酵素法による測定方法、測定キットを提供できる。本発明はプロテアーゼ等を処方する必要がないため、キットを簡素化でき、反応効率や測定精度を高めることができ、さらにはプロテアーゼ等による他のタンパク質試薬への望ましくない反応を回避できる。
各種公知のアマドリアーゼのアミノ酸配列における同一性を例示する１番目の図である。Co（Coniochaeta sp.）、Et（Eupenicillium terrenum）、Py（Pyrenochaeta sp.）、Ar（Arthrinium sp.）、Cc（Curvularia clavata）、Nv（Neocosmospora vasinfecta）のほか、Cn（Cryptococcus neoformans）、Pn（Phaeosphaeria nodorum）、An（Aspergillus nidulans）、En（Emericella nidulans）、Ul（Ulocladium sp.）及びPj（Penicillium janthinelum）をアライメントした。 図１－１のつづきである。 図１－２のつづきである。 図１－３のつづきである。 図１－４のつづきである。 各種公知のアマドリアーゼのアミノ酸配列における同一性及び類似アミノ酸を例示する２番目の図である。Co、Et、Py、Ar、Cc、Nvのほか、Cn、Pn、An、En、Ul及びPjをアライメントした。 図２－１のつづきである。 図２－２のつづきである。 図２－３のつづきである。 図２－４のつづきである。 改変型アマドリアーゼを使用してＨｂＡ１ｃを測定した場合の、試料希釈液（試薬Ａ２）と測定用試薬を混合してからの経過時間と吸光度の関係を示す図である。３００秒が経過した時点でアマドリアーゼ溶液が添加される。 ＨｂＡ１ｃを含む試料をｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド溶液で希釈して、ＨｂＡ１ｃ測定を行った結果を示す図である。 ＨｂＡ１ｃを含む試料をｎ－テトラデシル－β－Ｄ－マルトシド溶液で希釈して、ＨｂＡ１ｃ測定を行った結果を示す図である。 改変型アマドリアーゼを使用してＨｂＡ１ｃを測定した場合の、試料希釈液（試薬Ｄ１）と測定用試薬を混合してからの経過時間と吸光度の関係を示す図である。３００秒が経過した時点でアマドリアーゼ溶液が添加される。 ＨｂＡ１ｃを含む試料を、塩酸を含むｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド溶液（試薬Ｄ１）で希釈し、アマドリアーゼ２５を用いてＨｂＡ１ｃ測定を行った結果を示す図である。 ＨｂＡ１ｃを含む試料を、塩酸を含むポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル溶液（試薬Ｄ２）で希釈して、ＨｂＡ１ｃ測定を行った結果を示す図である。 ＨｂＡ１ｃを含む試料を、塩酸を含むｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド溶液（試薬Ｄ１）で希釈し、アマドリアーゼ２８を用いてＨｂＡ１ｃ測定を行った結果を示す図である。 改変型アマドリアーゼを使用してＨｂＡ１ｃを測定した場合の、試料希釈液（試薬Ｇ１）と測定用試薬を混合してからの経過時間と吸光度の関係を示す図である。３００秒が経過した時点でアマドリアーゼ溶液が添加される。 ＨｂＡ１ｃを含む試料を、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイド溶液（試薬Ｇ１）で希釈して、ＨｂＡ１ｃ測定を行った結果を示す図である。 ＨｂＡ１ｃを含む試料を、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド溶液（試薬Ｇ２）で希釈して、ＨｂＡ１ｃ測定を行った結果を示す図である。
　以下、本発明を詳細に説明する。
（糖化タンパク質、ヘモグロビンA1c）
　本発明における糖化タンパク質とは、非酵素的に糖化されたタンパク質を指す。糖化タンパク質は生体内、外を問わず存在し、生体内に存在する例としては、血液中の糖化ヘモグロビン、糖化アルブミンなどがあり、糖化ヘモグロビンの中でもヘモグロビンのβ鎖アミノ末端のバリンが糖化された糖化ヘモグロビンを特にヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）と言う。生体外に存在する例としては、タンパク質やペプチドと糖が共存する液状調味料などの飲食品や輸液などがある。
（糖化ペプチド、フルクトシルペプチド）
　本発明における糖化ペプチドとは、糖化タンパク質由来の非酵素的に糖化されたペプチドを指し、ペプチドが直接非酵素的に糖化されたものや、プロテアーゼ等により糖化タンパク質が分解された結果生じたものや糖化タンパク質を構成する（ポリ）ペプチドが糖化されたものが含まれる。糖化ペプチドをフルクトシルペプチドと表記することもある。糖化タンパク質において、糖化を受けるペプチド側のアミノ基としては、アミノ末端のα－アミノ基、ペプチド内部のリジン残基側鎖のε－アミノ基などが挙げられるが、本発明における糖化ペプチドとは、より具体的には、α－糖化ペプチド（α－フルクトシルペプチド）である。α－糖化ペプチドは、Ｎ末端のα－アミノ酸が糖化された糖化タンパク質から何らかの手段、例えば、プロテアーゼ等による限定分解などにより遊離させて形成される。例えば、対象の糖化タンパク質がヘモグロビンＡ１ｃ（ＨｂＡ１ｃ）である場合、該当するα－糖化ペプチドは、Ｎ末端が糖化されているＨｂＡ１ｃのβ鎖から切り出される糖化されたペプチドを指す。１４６残基のアミノ酸により構成されているＨｂＡ１ｃのβ鎖もまたα－糖化ペプチドに該当する。
　ある実施形態において本発明のアマドリアーゼが作用する測定物質は、ＨｂＡ１ｃ、より具体的にはＨｂＡ１ｃのβ鎖である。別の実施形態において本発明のアマドリアーゼが作用する測定物質はＨｂＡ１ｃのβ鎖から切り出されるαＦ６Ｐであり、具体的には、α－フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸である。別の実施形態において本発明のアマドリアーゼが作用する測定物質はαＦＶＨ（α－フルクトシルバリルヒスチジン）またはαＦＶ（α－フルクトシルバリン）である。
（アマドリアーゼ）
　アマドリアーゼは、ケトアミンオキシダーゼ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ、フルクトシルペプチドオキシダーゼ、フルクトシルアミンオキシダーゼともいい、酸素の存在下で、イミノ２酢酸若しくはその誘導体（アマドリ化合物）を酸化して、グリオキシル酸若しくはα－ケトアルデヒド、アミノ酸若しくはペプチド、および過酸化水素を生成する反応を触媒する酵素のことをいう。アマドリアーゼは、自然界に広く分布しており、微生物や、動物若しくは植物起源の酵素を探索することにより、得ることができる。微生物においては、例えば、糸状菌、酵母、若しくは細菌等から得ることができる。
　本発明のアマドリアーゼはＨｂＡ１ｃに直接作用する。本明細書において、アマドリアーゼがＨｂＡ１ｃに直接作用する、とは、アマドリアーゼが、酸素の存在下で、ＨｂＡ１ｃのβ鎖のＮ末端のフルクトシル基に作用し、2-ケト-Dグルコースおよび過酸化水素、ヘモグロビンのβ鎖が生じることをいう。ただしこれは当該アマドリアーゼがＨｂＡ１ｃのβ鎖由来のフルクトシルペプチド、例えばαＦ６Ｐに反応することを排除するものではない。すなわち、ある実施形態において本発明のアマドリアーゼは、ＨｂＡ１ｃに直接作用するのみならず、ＨｂＡ１ｃのβ鎖由来のフルクトシルペプチド、例えばαＦ６Ｐに対しても反応性を有する。
（アマドリアーゼ改変体）
　本発明は、配列番号１、配列番号３８、配列番号４０、配列番号５４、又は配列番号６２、又は配列番号８９、又は配列番号９９に示すアミノ酸配列を有する野生型アマドリアーゼに基づき作製される、αＦ６Ｐに対して反応性を有し、かつＨｂＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼの改変体を提供する。本明細書において改変体とは変異体と交換可能に用いられ、アマドリアーゼのアミノ酸配列を野生型の配列と比較したときに、一部のアミノ酸が置換、欠失又は付加されているものをいう。ここでいう付加には挿入も包含されるものとする。
　本発明はさらに、配列番号１１３、配列番号１１５、配列番号１１７、配列番号１１９、配列番号１２１、配列番号１２３又は配列番号１４５又は配列番号１４９に示すアミノ酸配列を有する野生型アマドリアーゼに基づき、αＦ６Ｐに対して反応性を有し、かつＨｂＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼの改変体を提供する。
　また、本発明の知見に基づき、コニオカエタ(Coniochaeta)属等に由来する他の野生型アマドリアーゼに基づき、ＨｂＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼの改変体を取得することができる。
　本発明のアマドリアーゼ改変体は、αＦ６Ｐに対して反応性を有し、かつＨｂＡ１ｃに直接作用する限り、酵素の他の特性を改変する変異をさらに有しうる。
（Coniochaeta sp. NISL 9330由来アマドリアーゼに基づく改変体）
　ある実施形態において本発明のアマドリアーゼは、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するコニオカエタ属由来のアマドリアーゼに基づき作製された、ＨｂＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼの改変体である。
　配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５（一重変異体）、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、及び配列番号１６３（二重変異体）、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３（三重変異体）、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１７５、配列番号１８９（四重変異体）、配列番号１７７、配列番号１７９（五重変異体）、配列番号１４３、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８７、配列番号１９１（六重変異体）、配列番号１４１又は配列番号１８５（七重変異体）のアミノ酸配列と高い配列同一性（例えば、５０％以上、好ましくは６０％以上、好ましくは７０％以上、好ましくは７５％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上、最も好ましくは９９％以上）のアミノ酸配列を有し、かつαＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼは、ＨｂＡ１ｃに直接作用しうる。例えば配列番号１４１のアミノ酸配列を有するアマドリアーゼは、αＦ６Ｐに対する活性を有し、かつＨｂＡ１ｃに直接作用する。
　配列番号１５１、配列番号１５３、配列番号１５５（一重変異体）、配列番号１５７、配列番号１５９、配列番号１６１、及び配列番号１６３（二重変異体）、配列番号１３７、配列番号１３９、配列番号１６５、配列番号１６７、配列番号１６９、配列番号１７１、配列番号１７３（三重変異体）、配列番号１３３、配列番号１３５、配列番号１７５、配列番号１８９（四重変異体）、配列番号１７７、配列番号１７９（五重変異体）、配列番号１４３、配列番号１８１、配列番号１８３、配列番号１８７、配列番号１９１（六重変異体）、配列番号１４１又は配列番号１８５（七重変異体）のアミノ酸配列において、１又は数個のアミノ酸が改変若しくは変異、または、欠失、置換、付加および／または挿入されたアミノ酸配列を有し、かつαＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼは、ＨｂＡ１ｃに直接作用しうる。ここで１又は数個のアミノ酸とは、全長が４００アミノ酸を超えるアミノ酸配列について言う場合は１～１５個、好ましくは１～１０個、より好ましくは１～５個、より好ましくは１～４個、より好ましくは１～３個、さらに好ましくは１又は２個のアミノ酸をいう。また、１又は数個のアミノ酸とは、全長が２００～４００アミノ酸の配列について言う場合は、１～１０個、好ましくは１～７個、好ましくは１～５個、好ましくは１～４個、より好ましくは１～３個、さらに好ましくは１又は２個のアミノ酸をいう。１又は数個のアミノ酸とは、全長が４０アミノ酸以上、２００アミノ酸未満の配列について言う場合は、１～５個、好ましくは１～４個、好ましくは１～３個、さらに好ましくは１又は２個のアミノ酸をいう。１又は数個のアミノ酸とは、全長が４０アミノ酸未満の配列について言う場合は、１又は２個のアミノ酸をいう。
　また、配列番号１５２、配列番号１５４、配列番号１５６（一重変異体）、配列番号１５８、配列番号１６０、配列番号１６２、及び配列番号１６４（二重変異体）、配列番号１３８、配列番号１４０、配列番号１６６、配列番号１６８、配列番号１７０、配列番号１７２、配列番号１７４（三重変異体）、配列番号１３４、配列番号１３６、配列番号１７６、配列番号１９０（四重変異体）、配列番号１７８、配列番号１８０（五重変異体）、配列番号１４４、配列番号１８２、配列番号１８４、配列番号１８８、配列番号１９２（六重変異体）、配列番号１４２又は配列番号１８６（七重変異体）に示す塩基配列に相補的な配列と、ストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によりコードされ、かつαＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼはＨｂＡ１ｃに直接作用しうる。ここでストリンジェントな条件下でのハイブリダイゼーションはSambrookら, Molecular Cloning第２版、（Cold Spring Harbor Laboratory press）やCurrent protocols in molecular biology（Frederick M. Ausubel ら, 編, 1987）等に記載されている。ストリンジェントな条件として例えば、ハイブリダイゼーション液（50％ホルムアミド、6～10×SSC(0.15～1.5M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、5×Denhardt溶液、1％ SDS、10％ デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いて約42℃～約50℃でインキュベートし、その後0.1×SSC、0.1％ SDSを用いて約65℃～約70℃で洗浄する条件を挙げることができる。また別のストリンジェントな条件において、ハイブリダイゼーション液として50％ホルムアミド、5×SSC(0.15M NaCl, 15mM sodium citrate, pH 7.0)、1×Denhardt溶液、1％SDS、10％デキストラン硫酸、10μg/mlの変性サケ精子DNA、50mMリン酸バッファー(pH7.5)）を用いる条件を挙げることができる。
　なお、本発明の変異体は、請求の範囲に記載された、基質特異性および／またはアミノ酸配列に関する条件を満たす限り、例えば、ユーペニシリウム属、ピレノケータ属、アルスリニウム属、カーブラリア属、ネオコスモスポラ属、クリプトコッカス属、フェオスフェリア属、アスペルギルス属、エメリセラ属、ウロクラディウム属、ペニシリウム属、フザリウム属、アカエトミエラ属、アカエトミウム属、シエラビア属、カエトミウム属、ゲラシノスポラ属、ミクロアスカス属、レプトスフェリア属、オフィオボラス属、プレオスポラ属、コニオケチジウム属、ピチア属、コリネバクテリウム属、アグロバクテリウム属、若しくはアルスロバクター属のような、他の生物種に由来するアマドリアーゼに基づき作製されたものでもよい。
　Coniochaeta sp. NISL 9330由来アマドリアーゼ（配列番号１）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る。ここで、アマドリアーゼ改変体に関して用いる１又は複数のアミノ酸置換とは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７又は１８のアミノ酸置換、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４又は１５のアミノ酸置換、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９又は１０のアミノ酸置換、例えば１、２、３、４、５、６、７又は８つのアミノ酸置換をいう。ある実施形態ではアマドリアーゼ改変体に関して用いる１又は複数のアミノ酸置換は１、２、３、４、５、６、又は７つのアミノ酸置換である。　
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のグルタミン酸
（ｄ）１０６位のアスパラギン酸
（ｅ）１１０位のグルタミン
（ｆ）１１３位のアラニン
（ｇ）３５５位のアラニン
（ｈ）４１９位のアラニン
（ｉ）６８位のアスパラギン酸
（ｊ）３５６位のアラニン
　上記Coniochaeta sp. NISL 9330由来アマドリアーゼ（配列番号１）において、好ましくは、（ａ）６２位のアルギニンは、アラニン、アスパラギンまたはアスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンは、ヒスチジン又はアラニンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０２位のグルタミン酸は、リジンへと置換される。好ましくは（ｄ）１０６位のアスパラギン酸は、アラニン、リジン、又はアルギニンへと置換される。好ましくは（ｅ）１１０位のグルタミンはロイシン又はチロシンへと置換される。好ましくは（ｆ）１１３位のアラニンはリジン又はアルギニンへと置換される。好ましくは（ｇ）３５５位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４１９位のアラニンはリジンへと置換されていてもよい。場合により（ｉ）６８位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により（ｊ）３５６位のアラニンはスレオニンへと置換されてもよい。
　Phaeosphaeria nodorum由来アマドリアーゼ（PnFX、配列番号３８）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のセリン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のリジン
（ｄ）１０６位のアスパラギン酸
（ｅ）１１０位のグリシン
（ｆ）１１３位のアラニン
（ｇ）３５１位のアラニン
（ｈ）４１６位のセリン
（ｉ）６８位のアスパラギン酸
（ｊ）３５２位のアラニン
　上記Phaeosphaeria nodorum由来アマドリアーゼ（配列番号３８）において、場合により（ａ）６２位のセリンは置換されなくともよい。また、（ａ）６２位のセリンはアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジンへと置換される。場合により（ｃ）１０２位のリジンは置換されなくともよい。好ましくは（ｄ）１０６位のアスパラギン酸はリジンへと置換される。好ましくは１１０位のグリシンはロイシンへと置換される。好ましくは１１３位のアラニンはリジンへと置換される。好ましくは３５１位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４１６位のセリンはリジンへと置換されてもよい。場合により（ｉ）６８位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により（ｊ）３５２位のアラニンはスレオニンへと置換されてもよい。
　Neocosmospora vasinfecta由来アマドリアーゼ（NvFX、配列番号５４）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のグルタミン酸
（ｄ）１０６位のグリシン
（ｅ）１１０位のグルタミン酸
（ｆ）１１３位のリジン
（ｇ）３５５位のセリン
（ｈ）４２０位のアラニン
（ｉ）６８位のアスパラギン酸
（ｊ）３５６位のアラニン
　上記Neocosmospora vasinfecta由来アマドリアーゼ（配列番号５４）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０２位のグルタミン酸はリジンへと置換される。好ましくは（ｄ）１０６位のグリシンはリジンへと置換される。好ましくは１１０位のグルタミン酸はロイシンへと置換される。場合により１１３位のリジンは置換されなくともよい。場合により３５５位のセリンは置換されなくともよい。場合により（ｈ）４２０位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。場合により（ｉ）６８位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により（ｊ）３５６位のアラニンはスレオニンへと置換されてもよい。
　Aspergillus nidulans由来アマドリアーゼ（AnFX、配列番号６２）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６１位のアルギニン
（ｂ）６２位のロイシン
（ｃ）１０１位のグルタミン酸
（ｄ）１０５位のグリシン
（ｅ）１０９位のリジン
（ｆ）１１２位のセリン
（ｇ）３５５位のアラニン
（ｈ）４２０位のアラニン
（ｉ）６７位のアスパラギン酸
（ｊ）３５６位のアスパラギン
　上記Aspergillus nidulans由来アマドリアーゼ（配列番号６２）において、好ましくは（ａ）６１位のアルギニンはアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは（ｂ）６２位のロイシンはヒスチジンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０１位のグルタミン酸はリジンと置換される。好ましくは（ｄ）１０５位のグリシンはリジンへと置換される。好ましくは１０９位のリジンはロイシンへと置換される。好ましくは１１２位のセリンはリジンへと置換される。好ましくは３５５位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４２０位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。場合により（ｉ）６７位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により（ｊ）３５６位のアスパラギンはスレオニンへと置換されてもよい。
　Eupenicillium terrenum由来アマドリアーゼ（配列番号４０）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のグルタミン酸
（ｄ）１０６位のアスパラギン
（ｅ）１１０位のリジン
（ｆ）１１３位のスレオニン
（ｇ）３５５位のアラニン
（ｈ）４１９位のグリシン
（ｉ）６８位のアスパラギン酸
（ｊ）３５６位のアスパラギン
　上記EFP-T5由来アマドリアーゼ（配列番号４０）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０２位のグルタミン酸はリジンへと置換される。好ましくは（ｄ）１０６位のアスパラギンはリジンへと置換される。好ましくは１１０位のリジンはロイシンへと置換される。好ましくは１１３位のスレオニンはリジンへと置換される。好ましくは３５５位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４１９位のグリシンはリジンへと置換されてもよい。場合により（ｉ）６８位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により（ｊ）３５６位のアスパラギンはスレオニンへと置換されてもよい。
　Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８９又は１４９）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のイソロイシン
（ｃ）１０２位のグルタミン酸
（ｄ）１０６位のセリン
（ｅ）１１０位のセリン
（ｆ）１１３位のアラニン
（ｇ）３５５位のアラニン
（ｈ）４２０位のアラニン
（ｉ）６８位のアスパラギン酸
（ｊ）３５６位のアスパラギン
　上記Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（CnFX、配列番号８９又は１４９）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは（ｂ）６３位のイソロイシンはヒスチジンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０２位のグルタミン酸はリジンへと置換される。好ましくは（ｄ）１０６位のセリンはリジンへと置換される。好ましくは１１０位のセリンはロイシンへと置換される。好ましくは１１３位のアラニンはリジンへと置換される。好ましくは３５５位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４２０位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。場合により（ｉ）６８位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により（ｊ）３５６位のアスパラギンはスレオニンへと置換されてもよい。
　Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のリジン
（ｄ）１０６位のアスパラギン酸
（ｅ）１１０位のアラニン
（ｆ）１１３位のスレオニン
（ｇ）３５３位のアラニン
（ｈ）４１８位のアラニン
（ｉ）６８位のアスパラギン酸
（ｊ）３５４位のアラニン
　上記Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジンへと置換される。場合により（ｃ）１０２位のリジンへは置換されずともよい。好ましくは（ｄ）１０６位のアスパラギン酸はリジンへと置換される。好ましくは１１０位のアラニンはロイシンへと置換される。好ましくは１１３位のスレオニンはリジンへと置換される。好ましくは３５３位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４１８位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。場合により（ｉ）６８位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により（ｊ）３５４位のアラニンはスレオニンへと置換されてもよい。
　Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のリジン
（ｄ）１０６位のアラニン
（ｅ）１１０位のグルタミン
（ｆ）１１３位のスレオニン
（ｇ）３５６位のアラニン
（ｈ）４２１位のアラニン
（ｉ）６８位のアスパラギン酸
（ｊ）３５７位のアラニン
　上記Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジンへと置換される。場合により（ｃ）１０２位のリジンへは置換されずともよい。好ましくは（ｄ）１０６位のアラニンはリジンへと置換される。好ましくは１１０位のグルタミンはロイシンへと置換される。好ましくは１１３位のスレオニンはリジンへと置換される。好ましくは３５６位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４２１位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。場合により（ｉ）６８位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により（ｊ）３５７位のアラニンはスレオニンへと置換されてもよい。
　Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のグルタミン酸
（ｄ）１０６位のアスパラギン酸
（ｅ）１１０位のアラニン
（ｆ）１１３位のアラニン
（ｇ）３５３位のアラニン
（ｈ）４１８位のアラニン
（ｉ）６８位のアスパラギン酸
（ｊ）３５４位のアラニン
　上記Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０２位のグルタミン酸はリジンへと置換される。好ましくは（ｄ）１０６位のアスパラギン酸はリジンへと置換される。好ましくは１１０位のアラニンはロイシンへと置換される。好ましくは１１３位のアラニンはリジンへと置換される。好ましくは３５３位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４１８位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。場合により（ｉ）６８位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により（ｊ）３５４位のアラニンはスレオニンへと置換されてもよい。
　Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）と９５％のアミノ酸配列同一性を有するケトアミンオキシダーゼ（Cc95FX、配列番号９９）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のグルタミン酸
（ｄ）１０６位のアスパラギン酸
（ｅ）１１０位のアラニン
（ｆ）１１３位のアラニン
（ｇ）３５３位のアラニン
（ｈ）４１８位のセリン
（ｉ）６８位のアスパラギン酸
（ｊ）３５４位のアラニン
　上記Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）と９５％のアミノ酸配列同一性を有するケトアミンオキシダーゼ（配列番号９９）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０２位のグルタミン酸はリジンへと置換される。好ましくは（ｄ）１０６位のアスパラギン酸はリジンへと置換される。好ましくは１１０位のアラニンはロイシンへと置換される。好ましくは１１３位のアラニンはリジンへと置換される。好ましくは３５３位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４１８位のセリンはリジンへと置換されてもよい。場合により（ｉ）６８位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により（ｊ）３５４位のアラニンはスレオニンへと置換されてもよい。
　Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６１位のアルギニン
（ｂ）６２位のロイシン
（ｃ）１０１位のグルタミン酸
（ｄ）１０５位のリジン
（ｅ）１０９位のアルギニン
（ｆ）１１２位のセリン
（ｇ）３５５位のアラニン
（ｈ）４２０位のアラニン
（ｉ）６７位のアスパラギン酸
（ｊ）３５６位のアスパラギン
　上記Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）において、好ましくは（ａ）６１位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは（ｂ）６２位のロイシンはヒスチジンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０１位のグルタミン酸はリジンへと置換される。場合により（ｄ）１０５位のリジンへは置換されずともよい。好ましくは１０９位のアルギニンはロイシンへと置換される。好ましくは１１２位のセリンはリジンへと置換される。好ましくは３５５位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４２０位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。場合により（ｉ）６７位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により（ｊ）３５６位のアスパラギンはスレオニンへと置換されてもよい。
　Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のリジン
（ｄ）１０６位のアスパラギン酸
（ｅ）１１０位のアラニン
（ｆ）１１３位のアラニン
（ｇ）３５３位のアラニン
（ｈ）４１８位のアラニン
（ｉ）６８位のアスパラギン酸
（ｊ）３５４位のアラニン
　上記Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジンへと置換される。場合により（ｃ）１０２位のリジンへは置換されずともよい。好ましくは（ｄ）１０６位のアスパラギン酸はリジンへと置換される。好ましくは１１０位のアラニンはロイシンへと置換される。好ましくは１１３位のアラニンはリジンへと置換される。好ましくは３５３位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４１８位のアラニンはリジンへと置換されてもよい。場合により（ｉ）６８位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により（ｊ）３５４位のアラニンはスレオニンへと置換されてもよい。
　Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）に基づく改変体は、以下の位置において１又は複数のアミノ酸置換を有するものであり得る：
（ａ）６２位のアルギニン
（ｂ）６３位のロイシン
（ｃ）１０２位のグルタミン酸
（ｄ）１０６位のセリン
（ｅ）１１０位のリジン
（ｆ）１１３位のアスパラギン酸
（ｇ）３５５位のアラニン
（ｈ）４１９位のセリン
（ｉ）６８位のアスパラギン酸
（ｊ）３５６位のアスパラギン
　上記Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）において、好ましくは（ａ）６２位のアルギニンはアラニンまたはアスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、スレオニン又はプロリンへと置換され得る。好ましくは（ｂ）６３位のロイシンはヒスチジンへと置換される。好ましくは（ｃ）１０２位のグルタミン酸はリジンへと置換される。好ましくは（ｄ）１０６位のセリンはリジンへと置換される。好ましくは１１０位のリジンはロイシンへと置換される。好ましくは１１３位のアスパラギン酸はリジンへと置換される。好ましくは３５５位のアラニンはセリンへと置換される。場合により（ｈ）４１９位のセリンはリジンへと置換されてもよい。場合により（ｉ）６８位のアスパラギン酸はアスパラギンへと置換されてもよい。場合により（ｊ）３５６位のアスパラギンはスレオニンへと置換されてもよい。Penicillium chrysogenum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼについても同様である。
　ある実施形態において、本発明のヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼは、好ましくは
基質としてヘモグロビンＡ１ｃのβ鎖を認識し、
作用としてヘモグロビンＡ１ｃのβ鎖を酸化して過酸化水素を生成し、
至適ｐＨ範囲をｐＨ６～８の範囲に有し、
作用ｐＨ範囲をｐＨ５～９の範囲に有し、
作用温度が２５～４０℃であり、
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ上での分子量が約４５～５５ＫＤａ、例えば約４８～５０ＫＤａであるものであり得る。
　本発明のアマドリアーゼ変異体又は改変体からは、ＨｂＡ１ｃに対する活性を全く示さないアマドリアーゼは除くものとする。
（アマドリアーゼをコードする遺伝子の取得）
　これらのアマドリアーゼをコードする遺伝子（以下、単に「アマドリアーゼ遺伝子」ともいう）を得るには、通常一般的に用いられている遺伝子のクローニング方法が用いられる。例えば、アマドリアーゼ生産能を有する微生物菌体や種々の細胞から常法、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ（ＷＩＬＥＹ　Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ，１９８９）記載の方法により、染色体ＤＮＡまたはｍＲＮＡを抽出することができる。さらにｍＲＮＡを鋳型としてｃＤＮＡを合成することができる。このようにして得られた染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡを用いて、染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーを作製することができる。
　次いで、上記アマドリアーゼのアミノ酸配列に基づき、適当なプローブＤＮＡを合成して、これを用いて染色体ＤＮＡまたはｃＤＮＡのライブラリーからアマドリアーゼ遺伝子を選抜する方法、あるいは、上記アミノ酸配列に基づき、適当なプライマーＤＮＡを作製して、５’ＲＡＣＥ法や３’ＲＡＣＥ法などの適当なポリメラーゼ連鎖反応（Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　Ｃｈａｉｎ　Ｒｅａｃｔｉｏｎ、ＰＣＲ法）により、アマドリアーゼをコードする目的の遺伝子断片を含むＤＮＡを増幅させ、これらのＤＮＡ断片を連結させて、目的のアマドリアーゼ遺伝子の全長を含むＤＮＡを得ることができる。
　このようにして得られたアマドリアーゼをコードする遺伝子の好ましい一例として、コニオカエタ属由来のアマドリアーゼ遺伝子（特開２００３－２３５５８５号公報）が挙げられる。
　また、別の好ましい例として、Phaeosphaeria属由来のアマドリアーゼ遺伝子、Neocosmospora属由来のアマドリアーゼ遺伝子、Aspergillus属由来のアマドリアーゼ遺伝子、及びCryptococcus属由来のアマドリアーゼ遺伝子、及びCurvularia属由来のアマドリアーゼ遺伝子、及びEupenicillium属由来のアマドリアーゼ遺伝子が挙げられる。
　これらのアマドリアーゼ遺伝子は、常法通り各種ベクターに連結されていることが、取扱い上好ましい。例えば、Coniochaeta sp. NISL 9330株由来のアマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７（国際公開第２００７／１２５７７９号）から、GenElute Plasmid Miniprep Kit（Sigma-Alcrich社製）を用いることにより、アマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７を、抽出、精製して得ることができる。他の生物由来のアマドリアーゼ遺伝子についても、当業者であれば慣用法により、同様の手順でＤＮＡを取得することができる。具体的には、Eupenicillium terrenum ATCC 18547株由来のアマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５（国際公開第２００７／１２５７７９号）を保持する大腸菌を培養し、GenElute Plasmid Miniprep Kitを用いることにより、アマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５を、細胞から抽出、精製して得ることができる。また、Aspergillus nidulans FGSC A26株由来のアマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ－ＡｎＦＸ（国際公開第２０１２／０１８０９４号）を保持する大腸菌を培養し、GenElute Plasmid Miniprep Kitを用いることにより、アマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ－ＡｎＦＸを、抽出、精製して得ることができる。また、Cryptococcus neoformans由来のアマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ－ＣｎＦＸ（国際公開第２０１２／０１８０９４号）を保持する大腸菌を培養し、GenElute Plasmid Miniprep Kitを用いることにより、アマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ－ＣｎＦＸを、抽出、精製して得ることができる。また、Neocosmospora vasinfecta由来のアマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ－ＮｖＦＸ（国際公開第２０１２／０１８０９４号）を保持する大腸菌を培養し、GenElute Plasmid Miniprep Kitを用いることにより、アマドリアーゼ遺伝子をコードするＤＮＡを含む組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ－ＮｖＦＸを、抽出、精製して得ることができる。
（ベクター）
　本発明において用いることのできるベクターとしては、上記プラスミドに限定されることなく、それ以外の、例えば、バクテリオファージ、コスミド等の当業者に公知の任意のベクターを用いることができる。具体的には、例えば、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＩＩ　ＳＫ＋（Stratagene社製）等が好ましい。
（アマドリアーゼ遺伝子の変異処理）
　アマドリアーゼ遺伝子の変異処理は、企図する変異形態に応じた、公知の任意の方法で行うことができる。すなわち、アマドリアーゼ遺伝子あるいは当該遺伝子の組み込まれた組換え体ＤＮＡと変異原となる薬剤とを接触・作用させる方法；紫外線照射法；遺伝子工学的手法；または蛋白質工学的手法を駆使する方法等を広く用いることができる。
　上記変異処理に用いられる変異原となる薬剤としては、例えば、ヒドロキシルアミン、Ｎ－メチル－Ｎ’－ニトロ－Ｎ－ニトロソグアニジン、亜硝酸、亜硫酸、ヒドラジン、蟻酸、若しくは５－ブロモウラシル等を挙げることができる。
　この接触・作用の諸条件は、用いる薬剤の種類等に応じた条件を採ることが可能であり、現実に所望の変異をアマドリアーゼ遺伝子において惹起することができる限り特に限定されない。通常、好ましくは０．５～１２Ｍの上記薬剤濃度において、２０～８０℃の反応温度下で１０分間以上、好ましくは１０～１８０分間接触・作用させることで、所望の変異を惹起可能である。紫外線照射を行う場合においても、上記の通り常法に従い行うことができる（現代化学、０２４～３０、１９８９年６月号）。
　蛋白質工学的手法を駆使する方法としては、一般的に、Ｓｉｔｅ－Ｓｐｅｃｉｆｉｃ　Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓとして知られる手法を用いることができる。例えば、Ｋｒａｍｅｒ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１２，　９４４１　（１９８４）：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　１５４，　３５０　（１９８７）：　Ｇｅｎｅ，　３７，　７３　（１９８５））、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ法（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１３，　８７４９　（１９８５）：　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，　１３，　８７６５　（１９８５）：　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ，　１４，　９６７９　（１９８６））、Ｋｕｎｋｅｌ法（Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃｉｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．，　８２，　４８８　（１９８５）：　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ．，　１５４，　３６７　（１９８７））等が挙げられる。
　また、一般的なＰＣＲ法として知られる手法を用いることもできる（Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅ，　１，　１１（１９８９）参照）。なお、上記遺伝子改変法の他に、有機合成法または酵素合成法により、直接所望の改変アマドリアーゼ遺伝子を合成することもできる。
　上記方法により得られるアマドリアーゼ遺伝子のＤＮＡ塩基配列の決定若しくは確認を行う場合には、例えば、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムApplied Biosystems 3130xlジェネティックアナライザ（Life Technologies社製）等を用いることにより行うことができる。
（形質転換・形質導入）
　上述のように得られたアマドリアーゼ遺伝子を、常法により、バクテリオファージ、コスミド、または原核細胞若しくは真核細胞の形質転換に用いられるプラスミド等のベクターに組み込み、各々のベクターに対応する宿主を常法により、形質転換または形質導入をすることができる。例えば、宿主として、エッシェリシア属に属する微生物、例えば得られた組換え体ＤＮＡを用いて、例えば、大腸菌Ｋ－１２株、好ましくは大腸菌ＪＭ１０９株、大腸菌ＤＨ５α株（ともにタカラバイオ社製）等を形質転換またはそれらに形質導入してそれぞれの菌株を得る。
（アミノ酸配列の相同性、同一性又は類似性）
　アミノ酸配列の相同性、同一性又は類似性は、ＧＥＮＥＴＹＸ（GENETYX社製）のマキシマムマッチングやサーチホモロジー等のプログラム、またはＤＮＡＳＩＳ　Ｐｒｏ（日立ソリューションズ社製）のマキシマムマッチングやマルチプルアライメント、またはCLUSTAL Wのマルチプルアライメント等のプログラムにより計算することができる。アミノ酸配列同一性を計算するために、２以上のアマドリアーゼをアライメントしたときに、該２以上のアマドリアーゼにおいて同一であるアミノ酸の位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の同一領域を決定できる。ここで２以上のアミノ酸配列について、同一性％とは、Blosum62等のアルゴリズムを利用して２以上のアミノ酸配列のアラインメントを行った際に、アラインメント可能であった領域の総アミノ酸数を分母とし、そのうち同一のアミノ酸によって占められる位置の数を分子としたときのパーセンテージをいう。故に、通常、２以上のアミノ酸配列に同一性が全く見られない領域がある場合、例えばＣ末端に同一性が全く見られない付加配列が一方のアミノ酸配列にある場合、当該同一性のない領域はアラインメント不可能であるため、同一性％の算出には利用されない。
　また、２以上のアマドリアーゼにおいて類似であるアミノ酸の位置を調べることもできる。例えばCLUSTALWを用いて複数のアミノ酸配列をアライメントすることができ、この場合、アルゴリズムとしてBlosum62を使用し、複数のアミノ酸配列をアライメントしたときに類似（similar）と判断されるアミノ酸を類似アミノ酸と呼ぶことがある。本発明の変異体において、アミノ酸置換はこのような類似アミノ酸の間の置換によるものであり得る。こうしたアライメントにより、複数のアミノ酸配列について、アミノ酸配列が同一である領域及び類似アミノ酸によって占められる位置を調べることができる。こうした情報を基に、アミノ酸配列中の相同性領域（保存領域）を決定できる。
　本明細書において「相同性領域」とは、２以上のアマドリアーゼをアライメントしたときに、ある基準となるアマドリアーゼと比較対象のアマドリアーゼの対応する位置におけるアミノ酸が同一であるか又は類似アミノ酸からなる領域であって、連続する３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上又は１０以上のアミノ酸からなる領域をいう。例えば、図１では全長アミノ酸配列の配列同一性が７４％以上であるアマドリアーゼをアライメントした。このうち、配列番号１で示されるConiochaeta sp.アマドリアーゼを基準として第１０位～３２位は同一又は類似アミノ酸からなり、よって相同性領域に該当する。同様に、配列番号１で示されるConiochaeta sp.アマドリアーゼを基準として３６～４１位、４９～５２位、５４～５８位、７３～７５位、８４～８６位、８８～９０位、１２０～１２２位、１４５～１５０位、１５６～１６２位、１６４～１７０位、１８０～１８２位、２０２～２０５位、２０７～２１１位、２１４～２２４位、２２７～２３０位、２３６～２４１位、２４３～２４８位、２５８～２６１位、２６６～２６８位、２７０～２７３位、２７５～２８７位、２９５～２９７位、３０６～３０８位、３１０～３１６位、３２４～３２９位、３３２～３３４位、３４１～３４４位、３４６～３５５位、３５７～３６３位、３７０～３８３位、３８５～３８７位、３８９～３９４位、４０５～４１０位及び４２３～４３１位は相同性領域に該当しうる。
　好ましくは、アマドリアーゼの相同性領域は、配列番号１で示されるConiochaeta sp.アマドリアーゼを基準として、第１１位～３２位、３６～４１位、５０～５２位、５４～５８位、８４～８６位、８８～９０位、１４５～１５０位、１５７～１６８位、２０２～２０５位、２０７～２１２位、２１５～２２５位、２３６～２４８位、２５８～２６１位、２６６～２６８位、２７０～２７３位、２７５～２８７位、３４７～３５４位、３５７～３６３位、３７０～３８３位、３８５～３８７位、及び４０５～４１０位のアミノ酸配列からなる領域である。
　さらに好ましくは、アマドリアーゼの相同性領域は、配列番号１で示されるConiochaeta sp.アマドリアーゼを基準として第１１～１８位、２０～３２位、５０～５２位、５４～５８位、２６６～２６８位、２７０～２７３位、２７７～２８６位、及び３７０～３８３位のアミノ酸配列からなる領域である。
　本発明のアマドリアーゼ変異体は、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するアマドリアーゼとアライメントしたときに５０％以上、好ましくは６０％以上、好ましくは７０％以上、好ましくは７５％以上、好ましくは８０％以上、好ましくは８５％以上、より好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上、最も好ましくは９９％以上の全長アミノ酸配列同一性を有し、αＦ６Ｐに対して高い反応性を有する。さらに、本発明のアマドリアーゼ変異体の相同性領域におけるアミノ酸配列は、配列番号１における相同性領域のアミノ酸配列と８０％、好ましくは８５％、好ましくは９０％、好ましくは９５％、好ましくは９８％、さらに好ましくは９９％以上の配列同一性を有する。
　ある実施形態において、アマドリアーゼの相同性領域は、配列番号１４１のアマドリアーゼを基準として第１０位～３２位、３６～４１位、４９～５２位、５４～５８位、７３～７５位、８４～８６位、８８～９０位、１２０～１２２位、１４５～１５０位、１５６～１６２位、１６４～１７０位、１８０～１８２位、２０２～２０５位、２０７～２１１位、２１４～２２４位、２２７～２３０位、２３６～２４１位、２４３～２４８位、２５８～２６１位、２６６～２６８位、２７０～２７３位、２７５～２８７位、２９５～２９７位、３０６～３０８位、３１０～３１６位、３２４～３２９位、３３２～３３４位、３４１～３４４位、３４６～３５５位、３５７～３６３位、３７０～３８３位、３８５～３８７位、３８９～３９４位、４０５～４１０位及び４２３～４３１位のアミノ酸配列からなる領域、好ましくは第１１位～３２位、３６～４１位、５０～５２位、５４～５８位、８４～８６位、８８～９０位、１４５～１５０位、１５７～１６８位、２０２～２０５位、２０７～２１２位、２１５～２２５位、２３６～２４８位、２５８～２６１位、２６６～２６８位、２７０～２７３位、２７５～２８７位、３４７～３５４位、３５７～３６３位、３７０～３８３位、３８５～３８７位、及び４０５～４１０位のアミノ酸配列からなる領域、さらに好ましくは第１１～１８位、２０～３２位、５０～５２位、５４～５８位、２６６～２６８位、２７０～２７３位、２７７～２８６位、及び３７０～３８３位のアミノ酸配列からなる領域である。
　ある実施形態において、本発明のアマドリアーゼは、
(i)　配列番号１４１に示すアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸の置換、欠失又は付加がなされたアミノ酸配列を有するアマドリアーゼであるか、または
(ii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１４１のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１４１の第１０位～３２位、３６～４１位、４９～５２位、５４～５８位、７３～７５位、８４～８６位、８８～９０位、１２０～１２２位、１４５～１５０位、１５６～１６２位、１６４～１７０位、１８０～１８２位、２０２～２０５位、２０７～２１１位、２１４～２２４位、２２７～２３０位、２３６～２４１位、２４３～２４８位、２５８～２６１位、２６６～２６８位、２７０～２７３位、２７５～２８７位、２９５～２９７位、３０６～３０８位、３１０～３１６位、３２４～３２９位、３３２～３３４位、３４１～３４４位、３４６～３５５位、３５７～３６３位、３７０～３８３位、３８５～３８７位、３８９～３９４位、４０５～４１０位及び４２３～４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有するアマドリアーゼである。ある実施形態において、本発明のアマドリアーゼは、前記(ii)に規定される相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９５％以上の配列同一性を有するアマドリアーゼである。
　ある実施形態において本発明のアマドリアーゼは、上記に加え、又は上記とは独立に配列番号１に示すアミノ酸配列における以下のアミノ酸、
（i）６８位のアスパラギン酸、及び
（ii）３５６位のアラニン、
よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を有する。
　ある実施形態において本発明のアマドリアーゼは、上記に加え、配列番号１に示すアミノ酸配列における以下のアミノ酸、
（i）２６２位のアスパラギン、
（ii）２５７位のバリン、
（iii）２４９位のグルタミン酸
（iv）２５３位のグルタミン酸、
（v）３３７位のグルタミン、
（vi）３４０位のグルタミン酸、
（vii）２３２位のアスパラギン酸、
（viii）１２９位のアスパラギン酸、
（ix）１３２位のアスパラギン酸、
（x）１３３位のグルタミン酸、
（xi）４４位のグルタミン酸、
（xii）２５６位のグリシン、
（xiii）２３１位のグルタミン酸、及び
（xiv）８１位のグルタミン酸、
よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を有する。さらなる実施形態において、本発明のアマドリアーゼは、上記に加え、場合によりカルボキシル末端からの3アミノ酸残基を欠失していてもよい。
（アミノ酸に対応する位置の特定）
　本発明において、あるベースとなるアミノ酸配列中の特定の位置のアミノ酸が別の類似するアミノ酸配列中の特定の位置のアミノ酸と対応する場合、これを対応するアミノ酸といい、そのアミノ酸の位置を対応する位置、又は相当する位置という。また、「アミノ酸の位置に対応する位置」を特定する方法としては、例えばリップマン－パーソン法等の公知のアルゴリズムを用いてアミノ酸配列を比較し、各アマドリアーゼのアミノ酸配列中に存在する保存アミノ酸残基に最大の同一性を与えることにより行う方法が挙げられる。アマドリアーゼのアミノ酸配列をこのような方法で整列させることにより、アミノ酸配列中にある挿入、欠失にかかわらず、相同アミノ酸残基の各アマドリアーゼ配列における配列中の位置を決めることが可能である。相同位置は、三次元構造中で同位置に存在すると考えられ、対象となるアマドリアーゼの特異的機能に関して類似した効果を有することが推定できる。
　なお、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの６２位のアルギニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
　すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ（配列番号４０及び１４５）、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号５４）、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８９及び１４９）、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）では６２位のアルギニン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３８）では６２位のセリン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）では６１位のアルギニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号６２及び１４７）では６１位のアルギニンである。
　また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の６３位のロイシンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの６３位のロイシンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
　すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の６３位のロイシンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ（配列番号４０及び１４５）、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号５４）、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３８）、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）では６３位のロイシン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８９及び１４９）では６３位のイソロイシン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号６２及び１４７）、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）では６２位のロイシンである。
　また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１０２位のグルタミン酸に対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１０２位のグルタミン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
　すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１０２位のグルタミン酸に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ（配列番号４０及び１４５）、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号５４）、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８９及び１４９）、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）では１０２位のグルタミン酸、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３８）、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）では１０２位のリジン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号６２及び１４７）では１０１位のグルタミン酸である。
　また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１０６位のアスパラギン酸に対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１０６位のアスパラギン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
　すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１０６位のアスパラギン酸に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ（配列番号４０及び１４５）では１０６位のアスパラギン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３８）、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）では１０６位のアスパラギン酸、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）では１０６位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号５４）では１０６位のグリシン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８９及び１４９）、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）では１０６位のセリン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）では１０５位のリジン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号６２及び１４７）では１０５位のグリシンである。
　また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１１０位のグルタミンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１１０位のグルタミンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
　すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１１０位のグルタミンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ（配列番号４０及び１４５）、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）では１１０位のリジン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）では１１０位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）では１１０位のグルタミン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号５４）では１１０位のグルタミン酸、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８９及び１４９）では１１０位のセリン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３８）では１１０位のグリシン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）では１０９位のアルギニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号６２及び１４７）では、１０９位のリジンである。
　また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１１３位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１１３位のアラニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
　すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１１３位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ（配列番号４０及び１４５）、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）では１１３位のスレオニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８９及び１４９）、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３８）、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）では１１３位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号５４）では１１３位のリジン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号６２及び１４７）、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）では１１２位のセリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）では１１３位のアスパラギン酸である。
　また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の３５５位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの３５５位のアラニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
　すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の３５５位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ（配列番号４０及び１４５）、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８９及び１４９）、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号６２及び１４７）、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）では３５５位のアラニン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）では３５３位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）では３５６位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号５４）では３５５位のセリン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３８）では３５１位のアラニンである。
　また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の４１９位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの４１９位のアラニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
　すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の４１９位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ（配列番号４０及び１４５）では４１９位のグリシン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）では４１８位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）では４２１位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号５４）、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８９及び１４９）、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）では４２０位のアラニン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３８）では４１６位のセリン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）では４１９位のセリン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号６２及び１４７）では４２０位のアラニンである。
　また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の６８位のアスパラギン酸に対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの６８位のアスパラギン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
　すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の６８位のアスパラギン酸に対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ（配列番号４０及び１４５）、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号５４）、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８９及び１４９）、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３８）、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）では６８位のアスパラギン酸、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）及びAspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号６２及び１４７）では６７位のアスパラギン酸である。
　また、本発明において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の３５６位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるコニオカエタ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの３５６位のアラニンに対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させて特定することができる。
　すなわち、「配列番号１記載のアミノ酸配列の３５６位のアラニンに対応する位置」のアミノ酸は、Eupenicillium terrenum由来のアマドリアーゼ（配列番号４０及び１４５）では３５６位のアスパラギン、Pyrenochaeta sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１３）では３５４位のアラニン、Arthrinium sp.由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１５）では３５７位のアラニン、Curvularia clavata由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号１１７）では３５４位のアラニン、Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ（配列番号５４）では３５６位のアラニン、Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号８９及び１４９）では３５６位のアスパラギン、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３８）では３５２位のアラニン、Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号６２及び１４７）では３５６位のアスパラギン、Emericella nidulans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号１１９）では３５６位のアスパラギン、Ulocladium sp.由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２１）では３５４位のアラニン、Penicillium janthinellum由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（配列番号１２３）では３５６位のアスパラギンである。
　本発明のアマドリアーゼ変異体は、一重変異体であってもよいが、２以上のアミノ酸置換を有する多重変異体であってもよい。本発明者らは、配列番号１のアミノ酸配列における第６２位、６３位、１０２位、１０６位、１１０位、１１３位、及び３５５位に対応する位置のアミノ酸を置換したアマドリアーゼが驚くべきことにＨｂＡ１ｃに対する活性を示すことを見出した。さらに本発明者らは、配列番号１のアミノ酸配列における第６８位及び３５６位に対応する位置のアミノ酸を置換したアマドリアーゼが驚くべきことにαＦ６Ｐに対する活性が増大することを見いだした。
　本明細書では、これらの位置（62/63/102/106/110/113/355/419及び68/356）の変異を、アマドリアーゼの基質特異性を変化させる変異又はアマドリアーゼの基質特異性を変化させるアミノ酸置換と呼ぶことがある。
　ある実施形態において、本発明のアマドリアーゼはαＦ６Ｐに対する比活性（U/mg）が0.1U/mg以上、0.2U/mg以上、0.3U/mg以上、0.4U/mg以上、0.5U/mg以上、0.6U/mg以上、0.7U/mg以上、0.8U/mg以上、0.9U/mg以上、例えば1U/mg以上である。該アマドリアーゼは、基質特異性を変化させるアミノ酸置換を１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上又は１０以上、有しうる。このような本発明のアマドリアーゼは、ＨｂＡ１ｃに直接作用し、本発明のＨｂＡ１ｃ測定方法に用いることができる。
　ある実施形態において、αＦ６Ｐに対する比活性（U/mg）が0.1U/mg以上である本発明のアマドリアーゼは、アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、
（a）配列番号１の６２位のアルギニン、
（b）配列番号１の６３位のロイシン、
（c）配列番号１の１０２位のグルタミン酸、
（d）配列番号１の１０６位のアスパラギン酸、
（e）配列番号１の１１０位のグルタミン、
（f）配列番号１の１１３位のアラニン、
（g）配列番号１の３５５位のアラニン、
（h）配列番号１の４１９位のアラニン、
(i) 配列番号１の６８位のアスパラギン酸、及び
(j) 配列番号１の３５６位のアラニン、
からなる群より選択される位置に対応する位置のアミノ酸が１つまたはそれ以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、例えば１０、置換されたものであり得る。なお、「配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンに対応する位置」のアミノ酸は、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３８）では６２位のセリンである。これは配列番号１のアミノ酸配列から見れば６２位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がセリンとなった、すなわちセリンに置換されたものと同等である。したがって天然のアマドリアーゼとして、Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ（配列番号３８）のような、配列番号１のアミノ酸配列の６２位のアルギニンに対応する位置のアミノ酸がセリンであるアマドリアーゼも便宜上、本明細書では、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに（a）配列番号１の６２位のアルギニンに対応する位置にアミノ酸置換を有するアマドリアーゼに含めるものとする。
　ある実施形態において、αＦ６Ｐに対する比活性（U/mg）が0.1U/mg以上である本発明のアマドリアーゼは、配列番号１記載のアミノ酸の以下（a）から（j）よりなる群から選択される位置のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸の１つまたはそれ以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、例えば１０が以下の各々に記載されるアミノ酸残基であり得る：
（a）配列番号１の６２位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、スレオニン又はプロリンである、
（b）配列番号１の６３位に対応する位置のアミノ酸がアラニン又はヒスチジンである、
（c）配列番号１の１０２位に対応する位置のアミノ酸がリジンである、
（d）配列番号１の１０６位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、リジン又はアルギニンである、
（e）配列番号１の１１０位に対応する位置のアミノ酸がロイシン又はチロシンである、
（f）配列番号１の１１３位に対応する位置のアミノ酸がリジン又はアルギニンである、
（g）配列番号１の３５５位に対応する位置のアミノ酸がセリンである、
（h）配列番号１の４１９位に対応する位置のアミノ酸がリジンである、
(i) 配列番号１の６８位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンである、
(j) 配列番号１の３５６位に対応する位置のアミノ酸がスレオニンである。
（予備的な置換について）
　アマドリアーゼは、配列番号１のアミノ酸配列の第６０位に対応する位置のアミノ酸がセリンである場合、これをグリシンへと置換することによって、置換前にαＦＶＨ活性を示さなかった酵素が、置換後にαＦＶＨ活性を示すようになることが報告されている（特開２０１０－３５４６９号公報、国際公開第２０１２／０１８０９４号参照）。したがって、本発明に用いるアマドリアーゼの配列番号１の第６０位に対応する位置のアミノ酸がセリンである場合、これを予めグリシンへと置換しておくこともできる。あるいは、野生型において配列番号１の６０位に対応する位置がグリシンであるアマドリアーゼを用いて、上記配列番号１の第６２位、６３位、１０２位、１０６位、１１０位、１１３位、３５５位及び４１９位に対応する位置並びに６８位及び３５６位に変異を導入してもよい。本発明のアマドリアーゼ変異体は、特に断らない限り、配列番号１の第６０位に対応する位置のアミノ酸がグリシンであるものを包含する。例えば、Aspergillus nidulans由来アマドリアーゼは、配列番号１の６０位に対応する配列番号１４７中の第５９位のアミノ酸が野生型ではセリンであるが、これをグリシンに置換したもの（配列番号６２）を本発明の変異体のための基となるアマドリアーゼとして用いてもよい。Penicillium janthinellum(Pj)由来アマドリアーゼ（配列番号１２３）についても同様である。
（さらなる予備的な置換について－界面活性剤耐性を向上させる変異）
　本発明者らは、アマドリアーゼのアミノ酸残基を置換することによりその界面活性剤に対する耐性を向上させることができることを確認している。本発明のアマドリアーゼは、場合により、さらにこのようなアミノ酸置換を有しうる。
　界面活性剤耐性の向上をもたらすアミノ酸の置換として、配列番号１に示すアミノ酸配列における以下の位置のアミノ酸に対応する位置のアミノ酸の置換が挙げられる。 
（１）２６２位のアスパラギンの置換、例えば、ヒスチジンへの置換。 
（２）２５７位のバリンの置換、例えば、システイン、セリン、スレオニンへの置換。 
（３）２４９位のグルタミン酸の置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。 
（４）２５３位のグルタミン酸の置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。 
（５）３３７位のグルタミンの置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。 
（６）３４０位のグルタミン酸の置換、例えば、プロリンへの置換。 
（７）２３２位のアスパラギン酸の置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。 
（８）１２９位のアスパラギン酸の置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。 
（９）１３２位のアスパラギン酸の置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。 
（１０）１３３位のグルタミン酸の置換、例えば、アラニン、メチオニン、リジン、アルギニンへの置換。 
（１１）４４位のグルタミン酸の置換、例えば、プロリンへの置換。 
（１２）２５６位のグリシンの置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。 
（１３）２３１位のグルタミン酸の置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。 
（１４）８１位のグルタミン酸の置換、例えば、リジン、アルギニンへの置換。
　界面活性剤耐性が向上したアマドリアーゼの変異体は、上記アミノ酸置換を少なくとも１つ有していればよく、複数のアミノ酸置換を有していてもよい。例えば、上記アミノ酸置換の１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３または１４を有しうる。
　なお、本明細書において、「配列番号１記載のアミノ酸配列の４４位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの４４位のグルタミン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これにより、上記の「相当する位置のアミノ酸残基」を特定する方法でアミノ酸配列を整列させた図１により特定することができる。
　すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは４４位のリジン、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ　ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは４４位のプロリン、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ　ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは４４位のプロリン、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ　ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは４４位のプロリン、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ　ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは４４位のプロリン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４４位のロイシン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ　ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは４４位のプロリン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４３位のプロリン、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ　ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは４３位のプロリン、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ　ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４４位のプロリン、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｊａｎｔｈｉｎｅｌｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは４４位のプロリンである。
　また、「配列番号１記載のアミノ酸配列の８１位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの８１位のグルタミン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
　すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは８１位のアスパラギン、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ　ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは８１位のグルタミン酸、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ　ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは８１位のヒスチジン、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ　ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは８１位のグルタミン酸、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ　ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは８１位のアスパラギン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは８１位のアスパラギン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ　ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは８１位のグルタミン酸、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは８０位のアスパラギン、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ　ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは８０位のアスパラギン、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ　ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは８１位のグルタミン酸、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｊａｎｔｈｉｎｅｌｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは８１位のアスパラギンである。
　また、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１３３位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１記載のアミノ酸配列の１３３位のグルタミン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
　すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは１３３位のグルタミン酸、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ　ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは１３３位のグルタミン酸、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ　ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは１３３位のアラニン、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ　ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは１３３位のグルタミン酸、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ　ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは１３３位のアラニン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３３位のグルタミン酸、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ　ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１３１位のグルタミン酸、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３２位のグルタミン酸、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ　ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１３２位のグルタミン酸、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ　ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３３位のリジン、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｊａｎｔｈｉｎｅｌｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３３位のアスパラギン酸である。
　また、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２５３位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１記載のアミノ酸配列の２５３位のグルタミン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
　すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは２５３位のアラニン、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ　ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２５１位のアラニン、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ　ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２５３位のグルタミン酸、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ　ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２５１位のグルタミン酸、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ　ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２５３位のバリン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５３位のグルタミン酸、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ　ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２４９位のアルギニン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５３位のアラニン、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ　ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２５３位のアラニン、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ　ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５１位のグルタミン酸、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｊａｎｔｈｉｎｅｌｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５３位のグルタミンである。
　さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２５６位のグリシンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２５６位のグリシンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
　すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは２５６位のアスパラギン、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ　ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２５４位のアスパラギン酸、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ　ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２５６位のグリシン、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ　ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２５４位のアスパラギン、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ　ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２５６位のグリシン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５６位のグルタミン酸、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ　ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２５２位のアスパラギン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５６位のアスパラギン、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ　ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２５６位のアスパラギン、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ　ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５４位のアスパラギン、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｊａｎｔｈｉｎｅｌｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５６位のアスパラギン酸である。
　さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２５７位のバリンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２５７位のバリンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
　すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは２５７位のバリン、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ　ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２５５位のスレオニン、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ　ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２５７位のシステイン、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ　ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２５５位のバリン、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ　ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２５７位のシステイン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５７位のシステイン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ　ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２５３位のセリン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５７位のスレオニン、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ　ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２５７位のスレオニン、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ　ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５５位のバリン、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｊａｎｔｈｉｎｅｌｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２５７位のバリンである。
　さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２６２位のアスパラギンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２６２位のアスパラギンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
　すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは２６２位のアスパラギン酸、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ　ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２６０位のアスパラギン、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ　ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２６２位のヒスチジン、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ　ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２６０位のアスパラギン、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ　ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２６２位のヒスチジン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６２位のアスパラギン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ　ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２５８位のアスパラギン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６２位のアスパラギン酸、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ　ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２６２位のアスパラギン酸、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ　ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６０位のアスパラギン、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｊａｎｔｈｉｎｅｌｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２６２位のアスパラギン酸である。
　さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の３３７位のグルタミンに対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの３３７位のグルタミンに対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
　すなわちＥｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは３３７位のリジン、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ　ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは３３５位のリジン、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ　ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは３３８位のグルタミン、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ　ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは３３５位のスレオニン、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ　ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは３３７位のリジン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３３７位のリジン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ　ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３３３位のリジン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３３７位のアスパラギン、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ　ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３３７位のアスパラギン、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ　ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３３５位のスレオニン、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｊａｎｔｈｉｎｅｌｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３３７位のリジンである。
　さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の３４０位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの３４０位のグルタミン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
　すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは３４０位のグルタミン酸、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ　ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは３３８位のグルタミン酸、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ　ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは３４１位のグルタミン酸、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ　ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは３３８位のグルタミン酸、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ　ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは３４０位のプロリン、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３４０位のグルタミン酸、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ　ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３３６位のリジン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３４０位のグルタミン酸、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ　ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは３４０位のグルタミン酸、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ　ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３３８位のグルタミン酸、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｊａｎｔｈｉｎｅｌｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは３４０位のグルタミン酸である。
　さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１２９位のアスパラギン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１２９位のアスパラギン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
　すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは１２９位のグルタミン酸、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ　ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは１２９位のアスパラギン酸、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ　ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは１２９位のアスパラギン酸、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ　ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは１２９位のアスパラギン酸、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ　ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは１２９位のアスパラギン酸、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１２９位のセリン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ　ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１２７位のアスパラギン酸、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１２８位のグルタミン酸、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ　ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１２８位のグルタミン酸、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ　ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１２９位のアスパラギン酸、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｊａｎｔｈｉｎｅｌｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１２９位のグルタミン酸である。
　さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の１３２位のアスパラギン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの１３２位のアスパラギン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
　すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは１３２位のアスパラギン酸、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ　ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは１３２位のアスパラギン酸、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ　ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは１３２位のアスパラギン酸、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ　ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは１３２位のアスパラギン酸、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ　ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは１３２位のグルタミン酸、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３２位のアスパラギン酸、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ　ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１３０位のアスパラギン酸、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３１位のアスパラギン酸、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ　ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは１３１位のアスパラギン酸、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ　ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３２位のアスパラギン酸、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｊａｎｔｈｉｎｅｌｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは１３２位のアスパラギン酸である。
　さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２３１位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２３１位のグルタミン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
　すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは２３１位のグルタミン酸、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ　ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２２９位のグルタミン酸、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ　ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２３１位のグルタミン酸、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ　ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２２９位のグルタミン酸、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ　ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２３１位のグルタミン酸、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３１位のグルタミン酸、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ　ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２２７位のヒスチジン、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３１位のグルタミン酸、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ　ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２３１位のグルタミン酸、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ　ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２２９位のグルタミン、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｊａｎｔｈｉｎｅｌｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３１位のグルタミン酸である。
　さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２３２位のアスパラギン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２３２位のアスパラギン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
　すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは２３２位のアスパラギン酸、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ　ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２３０位のアスパラギン酸、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ　ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２３２位のグルタミン酸、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ　ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２３０位のアスパラギン酸、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ　ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２３２位のグルタミン酸、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３２位のグリシン、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ　ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２２８位のグルタミン酸、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３２位のグルタミン酸、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ　ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２３２位のグルタミン酸、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ　ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３０位のアスパラギン酸、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｊａｎｔｈｉｎｅｌｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２３２位のアスパラギン酸である。
　さらに、「配列番号１記載のアミノ酸配列の２４９位のグルタミン酸に対応する位置」とは、確定したアマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１のアマドリアーゼの２４９位のグルタミン酸に対応するアミノ酸を意味するものである。これも上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
　すなわち、Ｅｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼでは２４９位のリジン、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ　ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２４７位のリジン、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ　ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼでは２４９位のヒスチジン、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ　ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２４７位のグルタミン酸、Ｎｅｏｃｏｓｍｏｓｐｏｒａ　ｖａｓｉｎｆｅｃｔａ由来のケトアミンオキシダーゼでは２４９位のグルタミン酸、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２４９位のグルタミン酸、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ　ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２４５位のグルタミン酸、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２４９位のアラニン、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ　ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼでは２４９位のアラニン、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ　ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２４７位のセリン、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｊａｎｔｈｉｎｅｌｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼでは２４９位のグルタミンである。
　本明細書ではこれらの位置（44位/133位/253位/257位/262位/337位/340位並びに249位/232位/129位/132位/256位/231位/81位）の変異を、アマドリアーゼの界面活性剤耐性を向上させる変異またはアマドリアーゼの界面活性剤耐性を向上させるアミノ酸置換と呼ぶことがある。ある実施形態において、本発明のアマドリアーゼは、基質特異性を変化させる変異に加え、さらに界面活性剤耐性を向上させる変異を有し得る。
（さらなる予備的な欠失について－カルボキシル末端からの３アミノ酸残基の欠失）
　本発明者らは以前に、アマドリアーゼのカルボキシル末端から、３アミノ酸残基を欠失させることにより、その熱安定性を向上させうることを報告した（国際公開第２０１３／１００００６号明細書を参照のこと。参照によりその全内容を本明細書に組み入れる）。ある実施形態において、本発明のアマドリアーゼは上記の置換に加え、さらにカルボキシル末端からの３アミノ酸残基を欠失していてもよい。
（カルボキシル末端の欠失箇所に対応する位置）
　「配列番号１記載のアマドリアーゼのカルボキシル末端からの３アミノ酸残基に対応する位置」とは、アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１に示されるＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列と比較した場合に、配列番号１記載のアミノ酸配列のカルボキシル末端からの３アミノ酸残基を意味する。Ｃｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼにおける、この位置の３残基の配列は、４３５位のプロリン、４３６位のリジン及び４３７位のロイシンからなり、これらに対応する位置のアミノ酸配列も、上記の方法でアミノ酸配列を整列させた図１より特定することができる。
　すなわちＥｕｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｔｅｒｒｅｎｕｍ由来のアマドリアーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３５位のアラニン、４３６位のヒスチジンおよび４３７位のロイシンからなり、Ｐｙｒｅｎｏｃｈａｅｔａ　ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３８位のアラニン、４３９位のリジンおよび４４０位のロイシンからなり、Ａｒｔｈｒｉｎｉｕｍ　ｓｐ．由来のケトアミンオキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４５０位のヒスチジン、４５１位のリジンおよび４５２位のロイシンからなり、Ｃｕｒｖｕｌａｒｉａ　ｃｌａｖａｔａ由来のケトアミンオキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３８位のセリン、４３９位のリジンおよび４４０位のロイシンからなり、Ｐｈａｅｏｓｐｈａｅｒｉａ　ｎｏｄｏｒｕｍ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３５位のアラニン、４３６位のアスパラギンおよび４３７位のロイシンからなり、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ　ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３６位のアラニン、４３７位のリジンおよび４３８位のメチオニンからなり、Ｅｍｅｒｉｃｅｌｌａ　ｎｉｄｕｌａｎｓ由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３６位のアラニン、４３７位のリジンおよび４３８位のメチオニンからなり、Ｕｌｏｃｌａｄｉｕｍ　ｓｐ．由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３９位のアラニン、４４０位のリジンおよび４４１位のロイシンからなり、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ　ｊａｎｔｈｉｎｅｌｕｍ由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼではカルボキシル末端の３アミノ酸が４３５位のアラニン、４３６位のリジンおよび４３７位のロイシンからなる。
　本明細書ではアマドリアーゼに関するこれらのカルボキシル末端アミノ酸残基の欠失を、アマドリアーゼの熱安定性を向上させる欠失と呼ぶことがある。ある実施形態において、本発明のアマドリアーゼは、基質特異性を変化させる変異、界面活性剤耐性を向上させる変異に加え、熱安定性を向上させる欠失を有し得る。
（アマドリアーゼの生産）
　上記のようにして得られたアマドリアーゼの生産能を有する菌株を用いて、当該アマドリアーゼを生産するには、この菌株を通常の固体培養法で培養してもよいが、液体培養法を採用して培養するのが好ましい。
　すなわち、本発明は、アマドリアーゼの生産能を有する菌株を、アマドリアーゼタンパク質を発現しうる条件下で培養する工程、及び培養物又は培養液からアマドリアーゼを単離する工程を含む、アマドリアーゼの製造方法を提供する。この方法には、本発明のアマドリアーゼをコードする遺伝子を組み込んだベクターで形質転換された宿主細胞を用いることができる。ここでアマドリアーゼタンパク質を発現しうる条件とは、アマドリアーゼ遺伝子が転写、翻訳され、当該遺伝子によりコードされるポリペプチドが産生されることをいう。
　また、上記菌株を培養する培地としては、例えば、酵母エキス、トリプトン、ペプトン、肉エキス、コーンスティープリカーあるいは大豆若しくは小麦ふすまの浸出液等の１種以上の窒素源に、塩化ナトリウム、リン酸２水素カリウム、リン酸水素２カリウム、硫酸マグネシウム、塩化マグネシウム、塩化第２鉄、硫酸第２鉄あるいは硫酸マンガン等の無機塩類の１種以上を添加し、さらに必要により糖質原料、ビタミン等を適宜添加したものが用いられる。
　また、培地に当該アマドリアーゼが作用し得る基質やその類似化合物、例えば糖化アミノ酸、糖化ペプチド類、糖化タンパク質分解物、若しくは糖化ヘモグロビンや糖化アルブミン等の糖化タンパク質を添加することにより目的の酵素の製造量を向上させることができる。
　培地の初発ｐＨは、ｐＨ７～９に調整するのが適当である。培養は、２０～４２℃の培養温度、好ましくは２５～３７℃前後の培養温度で４～２４時間、さらに好ましくは２５～３７℃前後の培養温度で８～１６時間、通気攪拌深部培養、振盪培養、静置培養等により実施するのが好ましい。
　培養終了後、該培養物よりアマドリアーゼを採取するには、通常の酵素採取手段を用いて得ることができる。例えば、常法により菌体を、超音波破壊処理、磨砕処理等するか、またはリゾチーム等の溶菌酵素を用いて本酵素を抽出するか、またはトルエン等の存在下で振盪若しくは放置して溶菌を行わせ、本酵素を菌体外に排出させることができる。そして、この溶液を濾過、遠心分離等して固形部分を除去し、必要によりストレプトマイシン硫酸塩、プロタミン硫酸塩、若しくは硫酸マンガン等により核酸を除去したのち、これに硫安、アルコール、アセトン等を添加して分画し、沈澱物を採取し、アマドリアーゼの粗酵素を得る。
　上記アマドリアーゼの粗酵素よりさらにアマドリアーゼ精製酵素標品を得るには、例えば、セファデックス、スーパーデックス若しくはウルトロゲル等を用いるゲル濾過法、イオン交換性担体、疎水性担体、ヒドロキシアパタイトを用いる吸着溶出法、ポリアクリルアミドゲル等を用いる電気泳動法、蔗糖密度勾配遠心法等の沈降法、アフィニティクロマトグラフィー法、分子ふるい膜若しくは中空糸膜等を用いる分画法等を適宜選択し、またはこれらを組み合わせて実施することにより、精製されたアマドリアーゼ酵素標品を得ることができる。このようにして、所望のアマドリアーゼを得ることができる。
（本発明のアマドリアーゼのＨｂＡ１ｃに対する反応性）
　上記のような手段で得られるアマドリアーゼは、遺伝子改変等により、そのアミノ酸配列に変異を生じた結果、ＨｂＡ１ｃに直接作用しうる。
　本発明のアマドリアーゼはまた、改変前のものと比較してαＦ６Ｐに対する反応性が向上していてもよい。具体的には、改変前のものと比較して、「αＦＶＨに対する反応性」を１とした時の「αＦ６Ｐに対する反応性」の割合が増大していてもよい。
　例えば本発明のアマドリアーゼにおける、αＦＶＨに対する反応性を１とした時のαＦ６Ｐに対する反応性の割合を示すαＦ６Ｐ／αＦＶＨは、改変前に対して１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは４０％以上向上していてもよい。
　また、本発明のアマドリアーゼにおける、αＦＶに対する反応性を１とした時のαＦ６Ｐに対する反応性の割合を示すαＦ６Ｐ／αＦＶは、改変前に対して１０％以上、好ましくは２０％以上、より好ましくは３０％以上、さらに好ましくは４０％以上向上していてもよい。なお、「αＦＶに対する反応性」は「αＦＶ酸化活性」と表記することもある。
　ＨｂＡ１ｃに直接作用する本発明のアマドリアーゼの一例としては、例えば、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３５）株により生産されるアマドリアーゼが挙げられる。このようなアマドリアーゼは、プロテアーゼ等でＨｂＡ１ｃを処理せずともＨｂＡ１ｃに直接作用することから試料中のＨｂＡ１ｃを直接測定する酵素測定系の実現を可能にし、産業利用上非常に有利である。
（アマドリアーゼ活性の測定方法）
　アマドリアーゼの活性の測定方法としては、種々の方法を用いることができるが、一例として、以下に、本発明で用いるアマドリアーゼ活性の測定方法について説明する。
　本発明におけるアマドリアーゼの酵素活性の測定方法としては、酵素の反応により生成する過酸化水素量を測定する方法や、酵素反応により消費する酸素量を測定する方法などが主な測定方法として挙げられる。以下に、一例として、過酸化水素量を測定する方法について示す。
　本発明におけるアマドリアーゼの活性測定には、断りの無い限り、αＦＶ、若しくはαＦＶＨ、またはαＦ６Ｐを基質として用いる。なお、酵素力価は、αＦＶ、若しくはαＦＶＨ、またはαＦ６Ｐを基質として測定した時、１分間に１μｍｏｌの過酸化水素を生成する酵素量を１Ｕと定義する。
　また、比活性（U/mg）は、酵素1mg当たりの酵素力価（U）である。例えばある酵素のαＦ６Ｐに対する比活性が０．１Ｕ／ｍｇであれば、酵素量を１０倍とすることで、比活性が１Ｕ／ｍｇの酵素と同じ酵素力価が得られることとなる。
　本明細書において、アマドリアーゼについて「αＦ６Ｐに対して反応性を有し」という場合、特に断らない限りこれはαＦ６Ｐに対する比活性（U/mg）が0.1U/mg以上、0.2U/mg以上、0.3U/mg以上、0.4U/mg以上、0.5U/mg以上、0.6U/mg以上、0.7U/mg以上、0.8U/mg以上、0.9U/mg以上、例えば1U/mg以上である態様を含むものとする。　αＦＶ、αＦＶＨ等の糖化ペプチドは、例えば、阪上らの方法に基づき合成、精製したものを用いることができる（特開２００１－９５５９８号公報参照）。例えば糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）を、エンドプロテイナーゼＧｌｕ－Ｃで処理することにより、糖化ヘモグロビン（ＨｂＡ１ｃ）のβ鎖サブユニット由来のα－糖化ヘキサペプチド（フルクトシルＶａｌ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ）が遊離する（Clin.Chem.,43,1994-1951(1997))。これをαＦ６Ｐ基質として使用することができる。また、このα－糖化ヘキサペプチドと同一物質である、合成基質フルクトシルＶａｌ－Ｈｉｓ－Ｌｅｕ－Ｔｈｒ－Ｐｒｏ－Ｇｌｕ（ペプチド研究所製）を用いることもできる。
Ａ：試薬の調製
（アマドリアーゼのαＦ６Ｐ、αＦＶＨまたはαＦＶに対する活性の測定用試薬の調製例）
（試薬１）：５Ｕ／ｍｌ　パーオキシダーゼ、０．４９ｍＭ　４－アミノアンチピリンを含む０．１Ｍ　リン酸緩衝液　ｐＨ６．５
５．０ｋＵのパーオキシダーゼ（キッコーマン社製）、１００ｍｇの４－アミノアンチピリン（和光純薬工業社製）を０．１Ｍのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に溶解し、１０００ｍｌに定容する。
（試薬２）：１５ｍＭ　ＴＯＯＳ溶液
５００ｍｇのＴＯＯＳ（N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-m-トルイジンナトリウム、同仁化学研究所製）をイオン交換水に溶解し、１００ｍｌに定容する。
（試薬３）：基質溶液（３０ｍＭ；　終濃度１ｍＭ）
αＦ６Ｐ（ペプチド研究所製）　２５７．１ｍｇ、若しくはαＦＶＨ（キッコーマン社製）　１２４．９ｍｇ、若しくはαＦＶ（キッコーマン社製）　８３．８ｍｇをイオン交換水に溶解し、１０ｍｌに定容する。
Ｂ：活性測定法
（アマドリアーゼのαＦ６Ｐ、αＦＶＨまたはαＦＶに対する活性の測定方法の例）
　２．７ｍｌの試薬１、１００μｌの試薬２、および１００μｌの酵素液を混和し、３７℃で５分間予備加温する。その後、試薬３を１００μｌ加えて良く混ぜた後、分光光度計（Ｕ－３０１０Ａ、日立ハイテクノロジーズ社製）により、５５５ｎｍにおける吸光度の経時変化を観測し、５５５ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの変化量（ΔAs）を測定する。なお、対照液は、１００μｌの試薬３の代わりに１００μｌのイオン交換水を加える以外は前記と同様にして、５５５ｎｍにおける吸光度の１分間あたりの変化量（ΔA0）を測定する。３７℃で１分間当たりに生成される過酸化水素のマイクロモル数を酵素液中の活性単位(Ｕ)とし、下記の式に従って算出する。
活性(U/ml)＝｛(ΔAs－ΔA0)×3.0×df｝÷(39.2×0.5×0.1)
ΔAs：反応液の1分間あたりの吸光度変化
ΔA0：対照液の1分間あたりの吸光度変化
39.2：反応により生成されるキノイミン色素のミリモル吸光係数(mM-1・cm-1)
0.5：1 molの過酸化水素による生成されるキノイミン色素のmol数
df：希釈係数
（熱処理ＨｂＡ１ｃの定量法の例）
　以下のＨｂＡ１ｃ測定用試薬を調製する。
試料：ＨｂＡ１ｃ溶液
ＨｂＡ１ｃ認証実用標準物質ＪＣＣＲＭ４２３（検査医学標準物質機構製）
総ヘモグロビン濃度１３３ｇ／ｌ、
ＨｂＡ１ｃ濃度３レベル（ＮＧＳＰ値　約５．６％、約７．７％、約１０．５％）
試薬Ａ１：試料前処理液
５．０％　ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド（同仁化学研究所製）
試薬Ａ２：試料前処理液
５．０％　ｎ－テトラデシル－β－Ｄ－マルトシド（シグマアルドリッチ社製）
試薬Ｂ：ロイコ色素、パーオキシダーゼ溶液
１５０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液　ｐＨ６．５
０．３０ｍＭ　Ｎ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－４，４′－ ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム（ＤＡ－６４、和光純薬工業製）
１５Ｕ／ｍｌ　パーオキシダーゼ（キッコーマン製）
試薬Ｃ１：アマドリアーゼ溶液
１２０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液　ｐＨ６．５
１２０Ｕ／ｍｌの本発明のアマドリアーゼ(例えばＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３５等)。
（アマドリアーゼのＨｂＡ１ｃに対する活性の測定方法の例）
　試薬Ａ１もしくは試薬Ａ２で３０倍希釈した試料（本明細書において試料希釈液と表記することがある）を高温で所定時間、例えば９８℃で２分間インキュベートした後、試料希釈液２５μｌを５０μｌの試薬Ｂに添加して３７℃で５分間インキュベートし、その後、２５μｌの試薬Ｃ１を添加してＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端の酸化により生じる過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させる。溶液中に過酸化水素が生じる場合、パーオキシダーゼの作用によりロイコ色素が発色し、７５１ｎｍの光の吸光度が増加する。試料のＨｂＡ１ｃ濃度に応じて得られた結果を基に、試料のＨｂＡ１ｃ濃度（ＮＧＳＰ値）と、過酸化水素の定量反応前後の７５１ｎｍの光の吸光度差ΔＡとをグラフにプロットすることができる。
　なお、ΔＡは下記の式に従って算出する。
ΔＡ＝（試薬Ｃ１添加５分後の吸光度）－（試薬Ｃ１添加直前の吸光度×０．７５）
　上記の例では、試薬Ｃ１添加により、反応液の容積が１．３３倍となるため、試薬Ｃ１添加直前の吸光度に０．７５を掛けたものを、試薬Ｃ１添加直後の吸光度と見なす。
（酸処理ＨｂＡ１ｃの定量法の例）
　以下の組成を有するＨｂＡ１ｃ測定用試薬を調製し、Ｂｉｏ　Ｍａｊｅｓｔｙ　ＪＣＡ－ＢＭ１６５０（日本電子製）を利用してＨｂＡ１ｃを測定する。
試料：ＨｂＡ１ｃ溶液
ＨｂＡ１ｃ認証実用標準物質ＪＣＣＲＭ４２３（検査医学標準物質機構製）
総ヘモグロビン濃度１３３ｇ／ｌ、
ＨｂＡ１ｃ濃度３レベル（ＮＧＳＰ値　約５．６％、約７．７％、約１０．５％）
試薬Ｄ：試料前処理液
８．３％　ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド（同仁化学研究所製）またはポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル（Ｂｒｉｊ５８、和光純薬工業製）
０．１Ｍ　塩酸
試薬Ｅ：ロイコ色素溶液
３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－リン酸カリウム緩衝液　ｐＨ９．０
２９０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液　ｐＨ６．５
０．１６ｍＭ　Ｎ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－４，４′－ ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム（ＤＡ－６４、和光純薬工業製）
試薬Ｆ１：パーオキシダーゼ、アマドリアーゼ溶液
１００ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液　ｐＨ６．５
４０Ｕ／ｍｌ　パーオキシダーゼ（キッコーマン製）
１８０Ｕ／ｍｌの本発明アマドリアーゼ（例えばＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３５等）
　試薬Ｄで３０倍希釈した試料２５μｌを、１２５μｌの試薬Ｅに添加して３７℃で５分間インキュベート後、５０μｌの試薬Ｆ１を添加してＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端の酸化により生じる過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させる。
　一例としてΔＡは下記の式に従って算出することができる。
ΔＡ＝（試薬Ｆ１添加５分後の吸光度）－（試薬Ｆ１添加直前の吸光度×０．７５）
（界面活性剤処理ＨｂＡ１ｃの定量法の例）
　以下の組成を有するＨｂＡ１ｃ測定用試薬を調製し、Ｂｉｏ　Ｍａｊｅｓｔｙ　ＪＣＡ－ＢＭ１６５０（日本電子製）を利用してＨｂＡ１ｃを測定する。
試料：ＨｂＡ１ｃ溶液
ＨｂＡ１ｃ認証実用標準物質ＪＣＣＲＭ４２３（検査医学標準物質機構製）
総ヘモグロビン濃度１３３ｇ／ｌ、
ＨｂＡ１ｃ濃度３レベル（ＮＧＳＰ値　約５．６％、約７．７％、約１０．５％）
試薬Ｇ１：試料前処理液
０．８０％　テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（東京化成工業製）
試薬Ｇ２：試料前処理液
０．７０％　ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（東京化成工業製）
試薬Ｈ１：ロイコ色素溶液
１２０ｍＭ　ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ６．５
１．６％　ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド（同仁化学研究所製）
０．１６ｍＭ　Ｎ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－４，４′－ ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム（ＤＡ－６４、和光純薬工業製）
試薬Ｈ２：ロイコ色素溶液
１２０ｍＭ　ＰＩＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ６．５
１．６％　ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド（同仁化学研究所製）
０．１６ｍＭ　Ｎ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－４，４′－ ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム（ＤＡ－６４、和光純薬工業製）
試薬Ｉ１：パーオキシダーゼ、アマドリアーゼ溶液
１００ｍＭ　ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ６．５
４０Ｕ／ｍｌ　パーオキシダーゼ（キッコーマン製）
１６０Ｕ／ｍｌ　本発明のアマドリアーゼ（例えばＣＦＰ－ＤＨ２等）
試薬Ｉ２：パーオキシダーゼ、アマドリアーゼ溶液
１００ｍＭ　ＰＩＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ６．５
４０Ｕ／ｍｌ　パーオキシダーゼ（キッコーマン製）
１６０Ｕ／ｍｌ　本発明のアマドリアーゼ（例えばＣＦＰ－ＤＨ２等）
　試薬Ｇ１で２５倍希釈した試料２５μｌを、１２５μｌの試薬Ｈ１に添加して３７℃で５分間インキュベート後、５０μｌの試薬Ｉ１を添加してＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端の酸化により生じる過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させる。また、試料を試薬Ｇ２で２５倍希釈した場合は、希釈試料２５μｌを、１２５μｌの試薬Ｈ２に添加して３７℃で５分間インキュベートした後、５０μｌの試薬Ｉ２を添加してＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端の酸化により生じる過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させた。
　一例としてΔＡは下記の式に従って算出することができる。
ΔＡ＝（試薬Ｉ１またはＩ２添加５分後の吸光度）－（試薬Ｉ１またはＩ２添加直前の吸光度×０．７５）
（ＨｂＡ１ｃの測定）
　ＨｂＡ１ｃを含む試料にＨｂＡ１ｃオキシダーゼ（アマドリアーゼ）を作用させる。作用時間は例えば、５秒以上、１０秒以上、又は２０秒以上、１８０分未満又は１５０分未満、例えば０．５～１２０分間、好ましくは０．５～６０分間、より好ましくは１～３０分間とすることができる。作用時間が短すぎる場合、試料中のＨｂＡ１ｃを十分に測定しきれず、良好な測定が行えない。一方、作用時間が長すぎる場合には、測定時間が延長し、測定処理の効率が悪いという問題に加え、試料及び測定試薬が測定条件下に長くさらされる結果、試料中の基質あるいは試薬中の成分の分解、変性を招くという問題を生じる。さらに、特に微量測定系においては、長時間経過による乾燥に起因する試料容量の減少による濃度変化なども誤差の原因となり得る。ＨｂＡ１ｃオキシダーゼ作用時間を０．５～６０分間、より好ましくは１～３０分間、さらに好ましくは１～１０分間とすることにより、迅速かつ良好にＨｂＡ１ｃを測定できる。作用温度は、用いる酵素の至適温度にもよるが、例えば、２０～４５℃であり、通常の酵素反応に用いられる温度を適宜選択できる。
　本発明に使用するアマドリアーゼの好適な使用量は、試料溶液中に含まれる基質の量にもよるが、例えば、終濃度が、０．１～５０Ｕ／ｍＬ、好ましくは０．２～１０Ｕ／ｍＬとなるように添加すればよい。作用させる際のｐＨは、アマドリアーゼの至適ｐＨを考慮し、反応に適したｐＨとなるように緩衝剤を用いて調整することが好ましいが、作用可能なｐＨであればこれに限定されない。例えば、ｐＨ３～１１、特に好ましくはｐＨ５～９、例えばｐＨ６～８である。
　本発明の測定方法においては、酵素や試薬の安定化や反応性向上等の目的でｐＨを調節及び／又は維持するため、必要により適宜、各種の緩衝剤を使用することが好ましい。使用可能な緩衝剤としては、例えば、Ｎ－［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン、リン酸塩、酢酸塩、炭酸塩、トリス（ヒドロキシメチル）－アミノメタン、硼酸塩、クエン酸塩、ジメチルグルタミン酸塩、トリシン、ＨＥＰＥＳ、ＭＥＳ、Ｂｉｓ－Ｔｒｉｓ、ＡＤＡ、ＰＩＰＥＳ、ＡＣＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＢＥＳ、ＭＯＰＳ、ＴＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳＯ、ＨＥＰＰＳＯ、ＥＰＰＳ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ、フタル酸、酒石酸等が挙げられる。さらに必要により、溶解補助剤、安定化剤、反応性向上剤、ＨｂＡ１ｃ変性剤等として、界面活性剤（ｎ－オクチル－β－Ｄ－グルコシド、ｎ－オクチル－β－Ｄ－チオグルコシド、ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド、ｎ－テトラデシル－β－Ｄ－マルトシド、ｎ－オクチル－β－Ｄ－マルトシド、１－ドデシルピリジニウム塩、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム塩、テトラデシルトリメチルアンモニウム塩、ドデシルトリメチルアンモニウム塩、トリトンＸ－１００、ブリッジ３５、ブリッジ５８、ツイーン８０、コール酸塩、ｎ－ヘプチル－β－Ｄ－チオグルコシド、３－オキサトリデシル－α－Ｄ－マンノシド、ｎ－ノニル－β－Ｄ－チオマルトシド、ｎ－デシル－β－Ｄ－マルトシド、ｎ－ウンデシル－β－Ｄ－マルトシド、トレハロースＣ８、トレハロースＣ１０、トレハロースＣ１２、トレハロースＣ１４、トレハロースＣ１６、ＢＩＧＣＨＡＰ、ｄｅｏｘｙ－ＢＩＧＣＨＡＰ、ＭＥＧＡ－８、ＭＥＧＡ－９、ＭＥＧＡ－１０、ヘキサデシルピリジニウム塩、オクタデシルトリメチルアンモニウム塩、デシルトリメチルアンモニウム塩、ノニルトリメチルアンモニウム塩、オクチルトリメチルアンモニウム塩、へキシルトリメチルアンモニウム塩、ドデシル硫酸ナトリウム等）、還元剤（ジチオスレイトール、メルカプトエタノール、Ｌ－システイン等）、牛血清アルブミン、糖類（グリセリン、乳糖、シュークロース等）等を適宜添加してもよい。
　本発明に用いる界面活性剤としては、本発明のＨｂＡ１ｃの測定方法を可能とする界面活性剤であれば特に制限は無く、非イオン性界面活性剤やイオン性の界面活性剤、例えば、カチオン性界面活性剤、アニオン性界面活性剤、両性界面活性剤等が挙げられる。本明細書において界面活性剤というとき、特に断らない限り、この表現は１以上の界面活性剤を包含するものとする。
　非イオン界面活性剤としては、例えば、ポリオキシエチレンアルキルエーテル、脂肪酸ソルビタンエステル、アルキルポリグルコシド、脂肪酸ジエタノールアミド、アルキルモノグリセリルエーテルなどが挙げられる。
　カチオン性界面活性剤としては、例えば、アルキルトリメチルアンモニウム塩、ジアルキルジメチルアンモニウム塩、アルキルベンジルジメチルアンモニウム塩、ピリジニウム塩、例えばアルキルピリジニウム塩、ホスホニウム塩、例えばアルキルホスホニウム塩、イミダゾリウム塩、例えばアルキルイミダゾリウム塩、イソキノニウム塩、例えばアルキルイソキノニウム塩などが挙げられる。
　また本発明のカチオン性界面活性剤としては、以下の一般式で表される第四級アンモニウム塩（I)、ピリジニウム塩(II)やホスホニウム塩(III)が挙げられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
［式中、Ｒ１～Ｒ４は、同一又は異なっていてもよく、置換若しくは非置換のＣ１～Ｃ２０アルキル、アルケニル、アリール又はベンジルを表し、Ｚ－は、１価の陰イオンを表す。］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
［式中、Ｒ５は、置換若しくは非置換のＣ１～Ｃ２０アルキルを表し、各Ｒａは、同一又は異なっていてもよく、水素原子又は置換若しくは非置換のＣ１～Ｃ２０アルキル、アルケニル、アリール又はベンジルを表し、ｎは１～５の整数を表し、Ｚ－は、１価の陰イオンを表す。］
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
［式中、Ｒ６～Ｒ９は、同一又は異なっていてもよく、置換若しくは非置換のＣ１～Ｃ２０アルキル、アルケニル、アリール又はベンジルを表し、Ｚ－は、１価の陰イオンを表す。］
　第四級アンモニウム塩としては、例えば、オクチルトリメチルアンモニウムクロリド（ＯＴＡＣ）及びブロミド（ＯＴＡＢ）、デシルトリメチルアンモニウムクロリド及びブロミド（ＤＴＡＢ）、ドデシルトリメチルアンモニウムクロリド及びブロミド、テトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド（ＴＴＡＣ）及びブロミド（ＴＴＡＢ）、ヘキサデシルトリメチルアンモニウムクロリド（ＣＴＡＣ）及びブロミド、オクタデシルトリメチルアンモニウムクロリド及びブロミド（ＳＴＡＢ）、エイコシルトリメチルアンモニウムクロリド及びブロミド、ベンジルドデシルジメチルアンモニウムクロリド及びブロミド（ＢＤＤＡＢ）、ベンジルテトラデシルジメチルアンモニウムクロリド（ＢＤＴＡＣ）及びブロミド、ベンジルセチルジメチルアンモニウムクロリド（ＢＣＤＡＣ）及びブロミド、ジオクチルジメチルアンモニウムクロリド及びブロミド、が挙げられる。
　ピリジニウム塩としては、例えば、１－デシルピリジニウムクロリド及びブロミド、１－ドデシルピリジニウムクロリド（１－ＤＰＣ）及びブロミド、１－テトラデシルピリジニウムクロリド及びブロミド、１－ヘキサデシルピリジニウムクロリド（１－ＣＰＣ）及びブロミド（１－ＣＰＢ）、Ｎ－セチル－２－メチルピリジニウムクロリド及びブロミド、Ｎ－セチル－３－メチルピリジニウムクロリド及びブロミド、Ｎ－セチル－４－メチルピリジニウムクロリド（４Ｍｅ－１－ＣＰＣ）及びブロミド、１－オクタデシルピリジニウムクロリド及びブロミド、１－エイコシルピリジニウムクロリド及びブロミドが挙げられる。
　ホスホニウム塩としては、例えば、テトラエチルホスホニウムクロリド及びブロミド、トリブチルメチルホスホニウムクロリド及びブロミド及びヨージド、テトラブチルホスホニウムクロリド及びブロミド、テトラ－ｎ－オクチルホスホニウムクロリド及びブロミド、トリブチルドデシルホスホニウムクロリド及びブロミド、トリブチルヘキサデシルホスホニウムクロリド及びブロミド（ＴＢＣＰＢ）、メチルトリフェニルホスホニウムクロリド及びブロミド及びヨージド、テトラフェニルホスホニウムクロリド及びブロミドが挙げられる。
　カチオン性界面活性剤の対となる陰イオンZ-は例えばCl-、Br-、I-等でありうる。
　アニオン性界面活性剤としては、例えば、直鎖状アルキルベンゼンスルホン酸塩、アルキル硫酸塩、アルファーオレフィンスルホン酸塩、ポリオキシエチレンアルキルエーテル硫酸塩、α－スルホ脂肪酸エステル塩及び天然脂肪酸のアルカリ金属塩などが挙げられる。このような界面活性剤としては例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）が挙げられる。
　両性界面活性剤としては、例えば、アルキルジメチルアミンオキシド、アルキルカルボキシベタインなどが挙げられる。
　本発明は、アマドリアーゼの作用による生成物又は消費物を測定することによりＨｂＡ１ｃを測定する方法を提供するが、測定が容易な生成物であり、測定対象として好ましいものとして過酸化水素が挙げられる。アマドリアーゼの作用により生成した過酸化水素は、発色基質等によって検出してもよく、本発明に用いられる発色基質としては、４－アミノアンチピリンの他に、例えば、ＡＤＯＳ（Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）－ｍ－アニシジン）、ＡＬＯＳ（Ｎ－エチル－Ｎ－（２－ヒドロキシ－３－スルホプロピル）アニリン）、ＴＯＯＳ（N-エチル-N-(2-ヒドロキシ-3-スルホプロピル)-m-トルイジンナトリウム）、ＤＡ－６７（１０－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－３、７－ビス（ジメチルアミノ）－フェノシアジン）、ＤＡ－６４（Ｎ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－４、４’－ビス（ジメチルアミノ）－ジフェニルアミン）等が挙げられる。ＡＤＯＳ、ＡＬＯＳ、ＴＯＯＳは４－アミノアンチピリンと縮合した際に発色する。ＤＡ－６４、ＤＡ－６７は４－アミノアンチピリンを必要とせず、単独で処方するだけで発色する。いずれの場合も、発色反応はパーオキシダーゼにより触媒される。過酸化水素の測定は、一般に、過酸化水素を生成する工程と同時に行うことが好ましく、アマドリアーゼの作用時と同時に進行させることが好ましい。また、測定する消費物としては、溶存酸素が挙げられ、溶存酸素計等を用いて反応液中の溶存酸素量を測定することができる。
　本発明は、上述のアマドリアーゼと過酸化水素の測定用試薬、それに所望により緩衝剤等を添加したＨｂＡ１ｃ測定用試薬を提供する。この試薬中には、各種既知の成分、例えば、界面活性剤、塩類、緩衝剤、ｐＨ調製剤や防腐剤などを適宜選択して添加することができる。上述の本発明のＨｂＡ１ｃ測定用試薬は、各試薬を異なる容器に含むものとして調製すれば良く、例えば液状品及び液状品の凍結物あるいは凍結乾燥品として提供することもできる。また、これらの測定用試薬は、乾燥物又は溶解した状態で用いてもよく、薄膜上の担体、例えば、シート含浸性の紙等に含浸させて用いてもよい。また、測定用試薬に用いられる酵素類は、常法により固定化させて反復使用することもできる。ある実施形態において、本発明のＨｂＡ１ｃ測定用試薬は、糖化タンパク質からα－フルクトシルペプチドを切り出すためのプロテアーゼ等を含まない。
　本発明のＨｂＡ１ｃ測定用試薬の仕様や使用条件は、その含有成分等に応じて最適なものを選択すればよいが、例えば、測定を２０～４５℃において行うよう設定することができる。測定に要する時間も種々の測定条件により適宜選択できるが、例えば、０．５～６０分間、好ましくは、０．５～３０分間、さらに好ましくは１～１０分間が好ましい。例えば、上記測定試薬の発色の程度（吸光度変化量）を分光光度計により測定し、標準の吸光度と比較して、試料中に含まれる糖化ペプチドあるいは糖化蛋白質を測定することができる。測定には、通常の自動分析装置を用いることもできる。
（ＨｂＡ１ｃの定量）
　本発明のＨｂＡ１ｃ測定方法は、定性的であってもよいが、定量的な測定方法とすることもできる。ここでＨｂＡ１ｃの定量的測定方法とは、試料中のＨｂＡ１ｃの濃度を決定する方法をいう。すなわち本発明の一実施形態は、アマドリアーゼを使用することを含む、試料中のＨｂＡ１ｃの定量法を提供する。この定量法は、ＨｂＡ１ｃを含む試料と本発明のアマドリアーゼとを接触させる工程、及び該アマドリアーゼのＨｂＡ１ｃに対する作用による生成物又は消費物を測定する工程を含む。ここでのＨｂＡ１ｃは天然の状態であってもよく、または変性した状態であってもよい。該定量法について用いる接触とは、本発明のアマドリアーゼがＨｂＡ１ｃの酸化反応を触媒しうるように、該アマドリアーゼと試料とを物理的に一緒にするあらゆる態様を包含し、例えば溶液中で遊離の酵素とＨｂＡ１ｃを混合する場合のみならず、固相担体に担持された本発明のアマドリアーゼにＨｂＡ１ｃを含む溶液試料を添加又は滴下するような態様も包含する。
　本発明のＨｂＡ１ｃ測定方法に用いる試料は、糖化ヘモグロビンを含む可能性のあるあらゆる生物学的試料、例えば血液、体液、リンパ液等に由来する試料とすることができる。試料は適宜、加工処理されたものでありうる。
　アマドリアーゼとＨｂＡ１ｃとの反応効率を高めるためには、変性したＨｂＡ１ｃをアマドリアーゼとの反応に用いてもよい。変性ＨｂＡ１ｃは、適当な界面活性剤との混合により取得でき、熱処理により取得でき、または界面活性剤添加および熱処理により取得でき、あるいは酸・アルカリでの変性処理により取得できる。変性処理として界面活性剤添加と熱処理の両方を行う場合、その順序は任意である。熱処理はＨｂＡ１ｃの全部または一部を変性させるのに十分な温度及び時間で行われうる。処理温度は例えば６０℃以上、７０℃以上、８０℃以上、９０℃以上、例えば９８℃とすることができる。処理時間は温度にもよるが例えば１０秒以上、２０秒、３０秒以上、１分以上、または２分以上であり得る。界面活性剤の例は上述したとおりであり、これらを適当な濃度で添加しうる。
　用いるアマドリアーゼ変異体の酵素量及び反応時間（作用時間）を一定とし、添加するＨｂＡ１ｃの量を変化させた場合に、ＨｂＡ１ｃ添加量が減少するにつれて、検出される発光基質の吸光度も比例的に減少するＨｂＡ１ｃ濃度範囲を調べることで、当該アマドリアーゼを用いた場合の検出可能な最低ＨｂＡ１ｃ濃度を決定することができる。この濃度を本明細書において検出限界濃度ということがある。本発明のＨｂＡ１ｃ定量法では、ＨｂＡ１ｃの検出限界が、測定試料中のＨｂＡ１ｃ濃度又は血中糖化ヘモグロビン濃度よりも低くなるように酵素量及び反応時間を設定することが好ましい。
　本発明の定量的測定では、予め、濃度既知のＨｂＡ１ｃを含む対照の吸光度等の測定値から最小二乗法などの回帰分析を行うことによって検量線を作成しておくこともできる。作成した検量線に対し、ＨｂＡ１ｃ濃度が未知である試料の測定値をプロットすることで、当該試料中のＨｂＡ１ｃ濃度を定量できる。
　本発明者らは、Coniochaeta由来アマドリアーゼ変異体、例えばCFP-T7-H35を用いて、良好に試料中のＨｂＡ１ｃを定量できることを示した。これは驚くべき知見である。図４－１及び図４－２を参照されたい。CFP-T7-H35はまた、αＦ６Ｐに対する活性を示す。したがって当業者であれば、こうした知見に基づき、α－フルクトシルオリゴペプチド、例えばαＦ６Ｐに対する良好な活性を示す他のアマドリアーゼも同様にＨｂＡ１ｃに直接作用し、その定量的測定に用いることができる可能性がある、と理解する。例えばαＦ６Ｐなどのα－フルクトシルオリゴペプチドに対する比活性の高いアマドリアーゼは、同様にＨｂＡ１ｃに直接作用し、その定量測定用に用いることができる蓋然性が高い。また、当業者であればそのような定量的測定のための酵素量（酵素濃度）、反応時間等の条件を適宜設定することができる。
（スクリーニング方法）
　ある実施形態において、上記の（ＨｂＡ１ｃの測定）に記載の方法を用いて、あるアマドリアーゼがＨｂＡ１ｃに直接作用するか否か、決定することができる。候補となるアマドリアーゼとしては、種々の天然アマドリアーゼまたはそれらの改変体、例えばαＦＶ活性を有するアマドリアーゼ、αＦＶＨ活性を有するアマドリアーゼ、αＦ６Ｐ活性を有するアマドリアーゼ、α－フルクトシルペプチドに対する活性を示すアマドリアーゼまたはそれらの改変体、例えば上記の（アマドリアーゼの改変体）に記載のものが挙げられる。スクリーニングは96ウェルプレート等を用いて多数の候補を一度に処理しハイスループットにて迅速に行うことができる。候補アマドリアーゼがＨｂＡ１ｃに直接作用するかスクリーニングすることができる。または候補アマドリアーゼについて、まずαＦＶ活性、αＦＶＨ活性、αＦ６Ｐ活性等を有するか否か一次選抜を行い、次いで当該活性を有するものについてＨｂＡ１ｃに直接作用するか二次選抜してもよい。スクリーニングは生物試料から調製した粗酵素抽出液またはその精製物について行うことができる。また、α－フルクトシルペプチドに対する活性を示すアマドリアーゼの遺伝子を慣用法により取得し、遺伝子組換技術を用いて酵素を製造し、これを選抜に用いてもよい。慣用法とは、α－フルクトシルペプチドに対する活性を示すアマドリアーゼを精製し、そのアミノ酸配列を決定し、その配列情報を元にPCR用プライマーを設計して遺伝子を取得する方法や、公知のアマドリアーゼの配列情報を基にPCR用プライマーを設計してある生物のゲノムライブラリーやcDNAライブラリーから遺伝子を取得する方法が挙げられるがこれに限らない。上記の（アマドリアーゼをコードする遺伝子の取得）も参照されたい。取得したアマドリアーゼ遺伝子について慣用の遺伝子組換技術を用いて適当な変異を導入し、得られた変異体がＨｂＡ１ｃに直接作用するか調べることができる。また、取得したアマドリアーゼ遺伝子について遺伝子組換技術を用いて適当な変異を導入して鎖長の長いα－フルクトシルペプチド、例えばαＦ６Ｐに対する活性を示す改変体を作製し、次いでこれが例えばαＦ６Ｐに対して０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するかを調べ、かつ／又はＨｂＡ１ｃに直接作用するか調べることもできる。こうした改変体の作製に当たっては、配列番号１のアミノ酸配列の（ａ）６２位に対応する位置のアミノ酸を、アラニン、アスパラギンまたはアスパラギン酸へと置換すること、（ｂ）６３位に対応する位置のアミノ酸をヒスチジン又はアラニンへと置換すること、（ｃ）１０２位に対応する位置のアミノ酸をリジンへと置換すること、（ｄ）１０６位に対応する位置のアミノ酸をアラニン、リジン、又はアルギニンへと置換すること、（ｅ）１１０位に対応する位置のアミノ酸をロイシン又はチロシンへと置換すること、（ｆ）１１３位に対応する位置のアミノ酸をリジン又はアルギニンへと置換すること、（ｇ）３５５位に対応する位置のアミノ酸をセリンへと置換すること、および／または（ｈ）４１９位に対応する位置のアミノ酸をリジンへと置換すること（ｉ）６８位に対応する位置のアミノ酸をアスパラギンへと置換すること、および／または（ｊ）３５６位に対応する位置のアミノ酸をスレオニンへと置換することを参考にしてもよいが、導入する変異はこれに限られず、ランダムな突然変異を導入する手法を用いることもできる。変異導入と活性の確認を複数回繰り返し、よりα－フルクトシルペプチドまたはＨｂＡ１ｃに対する活性の高い変異体を取得することもできる。上記の（アマドリアーゼ遺伝子の変異処理）も参照されたい。
　用いるアマドリアーゼには、上記の界面活性剤耐性を向上させる変異を導入してもよく、かつ／又は上記の熱安定性を向上させる欠失を行ってもよい。また、ＨｂＡ１ｃに対する活性を有する限り、酵素のその他の特性を改変する変異を導入することもできる。
　本発明のＨｂＡ１ｃ測定用キットには、上述のＨｂＡ１ｃ測定用試薬に加え、必要に応じ、その他の公知の安定化剤や夾雑物質の消去系などを包含してもよい。ＨｂＡ1ｃに作用するプロテアーゼ等を使用しＨｂＡ1ｃを酵素法により測定することを目的とした、従来の各種の試薬やキットに用いられている技術を、適宜改変して本発明のアマドリアーゼを含むＨｂＡ１ｃ測定用キットに用いることができる。ただし、本発明のＨｂＡ１ｃ測定用キットはそのようなプロテアーゼ等を必要としない。すなわち、ある実施形態において、本発明のＨｂＡ１ｃ測定用キットは、ＨｂＡ１ｃからα－フルクトシルペプチドを切り出すためのプロテアーゼ等を含まない。
　以下、実施例により、本発明をさらに具体的に説明する。ただし、本発明の技術的範囲は、それらの例により何ら限定されるものではない。
［実施例１］
（１）組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７　ＤＮＡの調製
　Coniochaeta属由来アマドリアーゼ遺伝子（配列番号２）の組換え体プラスミドを有する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７）株（国際公開第２００７／１２５７７９号参照）を、３ｍｌのＬＢ－ａｍｐ培地［１％（ｗ／ｖ）バクトトリプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ペプトン、０．５％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ、５０μｇ／ｍｌ　アンピシリン］に接種して、３７℃で１６時間振とう培養し、培養物を得た。
　この培養物を１０，０００×ｇで、１分間遠心分離することにより集菌して菌体を得た。この菌体より、GenElute Plasmid Miniprep Kit（Sigma-Aldrich社製）を用いて組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７を抽出して精製し、２．５μｇの組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７　ＤＮＡを得た。
（２）組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７　ＤＮＡの部位特異的改変操作
　得られた組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７　ＤＮＡを鋳型として、配列番号３、４の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡績社製）を用い、以下の条件でＰＣＲ反応を行った。
　すなわち、１０×ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－緩衝液を５μｌ、ｄＮＴＰが各２ｍＭになるよう調製されたｄＮＴＰｓ混合溶液を５μｌ、２５ｍＭのＭｇＳＯ４溶液を２μｌ、鋳型となるｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７　ＤＮＡを５０ｎｇ、上記合成オリゴヌクレオチドをそれぞれ１５ｐｍｏｌ、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－を１Ｕｎｉｔ加えて、滅菌水により全量を５０μｌとした。調製した反応液をサーマルサイクラー（エッペンドルフ社製）を用いて、９４℃で２分間インキュベートし、続いて、「９４℃、１５秒」－「５０℃、３０秒」－「６８℃、６分」のサイクルを３０回繰り返した。
　反応液の一部を１．０％アガロースゲルで電気泳動し、約６，０００ｂｐのＤＮＡが特異的に増幅されていることを確認した。こうして得られたＤＮＡを制限酵素ＤｐｎＩ（NEW ENGLAND BioLabs社製）で処理し、残存している鋳型ＤＮＡを切断した後、大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ－ａｍｐ寒天培地に展開した。生育したコロニーをＬＢ－ａｍｐ培地に接種して振とう培養し、上記（１）と同様の方法でプラスミドＤＮＡを単離した。該プラスミド中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムApplied Biosystems 3130xlジェネティックアナライザ（Life Technologies社製）を用いて決定し、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアラニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１）を得た。
（３）各種改変型アマドリアーゼの生産
　ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１を形質導入した大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１）株を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ－ａｍｐ培地３ｍｌにおいて、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同緩衝液に懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離して、改変型アマドリアーゼ（ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１）を含む粗酵素液０．６ｍｌを調製した。
（４）αＦ６Ｐ／αＦＶＨおよびαＦ６Ｐ／αＦＶの測定
　上述のＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１を含む酵素液を用いて、上記のＢ：活性測定法に示した方法により、αＦＶ、αＦＶＨ、αＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。また、比較のために、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７）株から生産したＣＦＰ－Ｔ７を含む酵素液を用いて同様の測定を行った。それぞれのアマドリアーゼについて、αＦＶＨ酸化活性を１００とした場合の、αＦＶ、αＦＶＨおよびαＦ６Ｐに対する酸化活性、ならびに、αＦ６Ｐ／αＦＶＨおよびαＦ６Ｐ／αＦＶを表１に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　表１に示す通り、ＣＦＰ－Ｔ７は、αＦＶ酸化活性およびαＦＶＨ酸化活性は示したが、αＦ６Ｐ酸化活性は示さなかった。これにより、ＣＦＰ－Ｔ７はα－フルクトシルジペプチドに極めて特異性が高く、α－フルクトシルヘキサペプチドには作用しないことがわかった。
　一方、変異体ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１は、αＦＶ、αＦＶＨ酸化活性に加えて、αＦ６Ｐ酸化活性も示した。
　すなわち、ＣＦＰ－Ｔ７に対しＲ６２Ａのアミノ酸置換を導入することにより、ＣＦＰ－Ｔ７に新たにαＦ６Ｐ酸化活性を付与することができ、αＦ６Ｐに対する反応性（基質特異性）が向上していることが明らかとなった。 
　続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１　ＤＮＡを鋳型として、配列番号５～８のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアラニンに置換され、かつ１１０位のグルタミンがロイシン、またはフェニルアラニン、若しくはチロシンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２、ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３、ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ４）を得た。
　ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２、またはｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３、若しくはｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ４を形質導入した大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して各種改変型アマドリアーゼ（ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ４）を含む粗酵素液０．６ｍｌを調製した。
　このようにして調製した粗酵素液を用いて、上記Ｂ：活性測定法に示した方法によりαＦＶ、αＦＶＨ、αＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。また、比較のために、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１）株から生産したＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１を含む酵素液を用いて同様の測定を行った。それぞれのアマドリアーゼについて、αＦＶＨ酸化活性を１００とした場合の、αＦＶ、αＦＶＨおよびαＦ６Ｐに対する酸化活性、ならびに、αＦ６Ｐ／αＦＶＨおよびαＦ６Ｐ／αＦＶを表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　すなわち、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２、およびＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ４は、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１と比較して、αＦ６Ｐに対する反応性（基質特異性）がさらに増大していることが明らかとなった。
　続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２　ＤＮＡを鋳型として、配列番号４、配列番号９～１２のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の１１０位のグルタミンがロイシンに置換され、かつ６２位のアルギニンがアスパラギン、またはアスパラギン酸、またはグルタミン、若しくはグルタミン酸に置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２－６２Ｎ、ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ６、ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２－６２Ｑ、ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２－６２Ｅ）を得た。
　ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２－６２Ｎ、またはｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ６、またはｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２－６２Ｑ、若しくはｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２－６２Ｅを形質導入した大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して各種改変型アマドリアーゼ（ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２－６２Ｎ、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ６、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２－６２Ｑ、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２－６２Ｅ）を含む粗酵素液０．６ｍｌを調製した。
　このようにして調製した粗酵素液を用いて、上記Ｂ：活性測定法に示した方法によりαＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。また、比較のために、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２）株から生産したＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２を含む酵素液を用いて同様の測定を行った。ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２を含む粗酵素液のαＦ６Ｐ酸化活性を１００とした場合の、それぞれのアマドリアーゼを含む粗酵素液のαＦ６Ｐ酸化活性比率は表３の通りとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　すなわち、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２－６２Ｎ、およびＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ６はＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２よりもαＦ６Ｐ酸化活性が向上していることが明らかとなった。なお６２位のアミノ酸がアルギニンである野生型酵素は表１のとおりαＦ６Ｐに対する活性を示さない。このような野生型酵素と比較すると、６２位のアルギニンをグルタミン又はグルタミン酸に置換した変異体も、それぞれ、αＦ６Ｐに対する活性が向上していることが分かる。第６２位に関し、αＦ６Ｐに対する活性を示した置換アミノ酸であるアラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン及びグルタミン酸は比較的分子量の小さなアミノ酸である。したがって６２位を同様に分子量の小さいグリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、スレオニン及びプロリンに置換することにより同様にαＦ６Ｐ活性を有する改変アマドリアーゼが得られると考えられる。本明細書では、アラニン、アスパラギン、アスパラギン酸、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、スレオニン及びプロリンを総称して分子量の小さいアミノ酸と呼ぶことがある。
　ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２、またはＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ６を含む粗酵素液を用いて、上記Ｂ：活性測定法に示した方法によりαＦＶ、αＦＶＨ、αＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。それぞれのアマドリアーゼについて、αＦＶＨ酸化活性を１００とした場合の、各基質に対する酸化活性、ならびにαＦ６Ｐ／αＦＶＨおよびαＦ６Ｐ／ＦＶは表４の通りとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　すなわち、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ６はＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２よりも大幅にαＦ６Ｐ酸化活性が向上し、αＦ６Ｐへの反応性（基質特異性）が向上していることが明らかとなった。
　続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ６　ＤＮＡを鋳型として、配列番号１３～２４のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、かつ１１０位のグルタミンがロイシンに置換され、さらに６４位のアルギニンがアラニン、またはグルタミン酸、若しくはヒスチジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ７、ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ８、ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ９）、および、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、かつ１１０位のグルタミンがロイシンに置換され、さらに１０６位のアスパラギン酸がアラニン、またはリジン、若しくはアルギニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１０、ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１１、ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１２）、及び、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、かつ１１０位のグルタミンがロイシンに置換され、さらに１１３位のアラニンがリジン、若しくはアルギニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１３、ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１４）を得た。
　ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ７、またはｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ８、またはｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ９、またはｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１０、またはｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１１、またはｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１２、またはｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１３、若しくはｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１４を形質導入した大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して各種改変型アマドリアーゼ（ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ７、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ８、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ９、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１０、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１１、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１２、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１３、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１４）を含む粗酵素液０．６ｍｌを調製した。
　このようにして調製した粗酵素液を用いて、上記Ｂ：活性測定法に示した方法によりαＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。また、比較のために、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ６）株から生産したＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ６を含む酵素液を用いて同様の測定を行った。ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ６を含む粗酵素液のαＦ６Ｐ酸化活性を１００とした場合の、それぞれのアマドリアーゼを含む粗酵素液のαＦ６Ｐ酸化活性は表５の通りとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　すなわち、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１０、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１１、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１２、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１３、およびＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１４はＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ６よりも全て大幅にαＦ６Ｐ酸化活性比率が向上し、一部のものでは飛躍的に向上した。
　ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ６、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１１、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１２、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１３、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１４を含む粗酵素液を用いて、上記Ｂ：活性測定法に示した方法によりαＦＶ、αＦＶＨ、αＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。それぞれのアマドリアーゼについて、αＦＶＨ酸化活性を１００とした場合の、各基質に対する酸化活性、ならびにαＦ６Ｐ／αＦＶＨおよびαＦ６Ｐ／ＦＶは表６の通りとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　すなわち、表６に示す通り、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１１、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１２、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１３、およびＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１４はＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ６よりもαＦ６Ｐへの反応性（基質特異性）が大幅に向上していることが明らかとなった。
　続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１１　ＤＮＡを鋳型として、配列番号２１～２４のオリゴヌクレオチド、及びＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、かつ１０６位のアスパラギン酸がリジンに、かつ１１０位のグルタミンがロイシンに置換され、さらに１１３位のアラニンがリジン、若しくはアルギニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２０、ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２１）を得た。
　ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２０、若しくはｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２１を形質導入した大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して各種改変型アマドリアーゼ（ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２０、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２１）を含む粗酵素液０．６ｍｌを調製した。
　ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１１、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２０、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２１を含む粗酵素液を用いて、上記Ｂ：活性測定法に示した方法によりαＦＶ、αＦＶＨ、αＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。それぞれのアマドリアーゼについて、αＦＶＨ酸化活性を１００とした場合の、各基質に対する酸化活性、ならびにαＦ６Ｐ／αＦＶＨおよびαＦ６Ｐ／ＦＶは表７の通りとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　すなわち、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２０およびＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２１は、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ１１よりもαＦ６Ｐに対する反応性（基質特異性）が向上していることが明らかとなった。
　続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２０　ＤＮＡを鋳型として、配列番号２５～２９のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、かつ１０６位のアスパラギン酸がリジンに、かつ１１０位のグルタミンがロイシンに、かつ１１３位のアラニンがリジンに置換され、さらに６３位のロイシンがアラニン、またはアスパラギン酸、またはヒスチジン、若しくはリジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２４、ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２５、ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２６、ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２７）を得た。
　ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２４、またはｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２５、またはｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２６、若しくはｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２７を形質導入した大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して各種改変型アマドリアーゼ（ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２４、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２５、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２６、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２７）を含む粗酵素液０．６ｍｌを調製した。
　このようにして調製した粗酵素液を用いて、上記Ｂ：活性測定法に示した方法によりαＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。また、比較のために、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２０）株から生産したＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２０を含む酵素液を用いて同様の測定を行った。ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２０を含む粗酵素液のαＦ６Ｐ酸化活性を１００とした場合の、それぞれのアマドリアーゼを含む粗酵素液のαＦ６Ｐ酸化活性は表８の通りとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　すなわち、表８に示す通り、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２４、およびＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２６はＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２０よりもαＦ６Ｐ酸化活性が向上していることが明らかとなった。
　ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２０、またはＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２４、若しくはＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２６を含む粗酵素液を用いて、上記Ｂ：活性測定法に示した方法によりαＦＶ、αＦＶＨ、αＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。それぞれのアマドリアーゼについて、αＦＶＨ酸化活性を１００とした場合の、各基質に対する酸化活性、ならびにαＦ６Ｐ／αＦＶＨおよびαＦ６Ｐ／αＦＶは表９の通りとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　すなわち、表９に示す通り、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２４、およびＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２６はＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２０よりもαＦ６Ｐに対する反応性（基質特異性）が向上していることが明らかとなった。
　続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２６　ＤＮＡを鋳型として、配列番号３０～３３のオリゴヌクレオチド、及びＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、かつ６３位のロイシンがヒスチジンに、かつ１０６位のアスパラギン酸がリジンに、かつ１１０位のグルタミンがロイシンに、かつ１１３位のアラニンがリジンに置換され、さらに１０２位のグルタミン酸がリジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２８）、および配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、かつ６３位のロイシンがヒスチジンに、かつ１０６位のアスパラギン酸がリジンに、かつ１１０位のグルタミンがロイシンに、かつ１１３位のアラニンがリジンに置換され、さらに４１９位のアラニンがリジンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２９）を得た。
　ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２６、又はｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２８、若しくはｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２９を形質導入した大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して各種改変型アマドリアーゼ（ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２６、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２８、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２９）を含む粗酵素液０．６ｍｌを調製した。
　このようにして調製した粗酵素液を用いて、上記Ｂ：活性測定法に示した方法によりαＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。また、比較のために、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２６）株から生産したＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２６を含む酵素液を用いて同様の測定を行った。ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２６を含む粗酵素液のαＦ６Ｐ酸化活性を１００とした場合の、それぞれのアマドリアーゼを含む粗酵素液のαＦ６Ｐ酸化活性は表１０の通りとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000013
　すなわち、表１０に示す通り、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２８、およびＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２９はＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２６よりもαＦ６Ｐ酸化活性が向上していることが明らかとなった。
　ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２６、又はＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２８、若しくはＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２９を含む粗酵素液を用いて、上記Ｂ：活性測定法に示した方法によりαＦＶ、αＦＶＨ、αＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。それぞれのアマドリアーゼについて、αＦＶＨ酸化活性を１００とした場合の、各基質に対する酸化活性、ならびにαＦ６Ｐ／αＦＶＨおよびαＦ６Ｐ／αＦＶは表１１の通りとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000014
　すなわち、表１１に示す通り、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２８、及びＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２９はＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２６よりもαＦ６Ｐに対する反応性（基質特異性）が向上していることが明らかとなった。
　続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２８　ＤＮＡを鋳型として、配列番号３４～３５のオリゴヌクレオチド、及びＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、かつ６３位のロイシンがヒスチジンに、かつ１０２位のグルタミン酸がリジンに、かつ１０６位のアスパラギン酸がリジンに、かつ１１０位のグルタミンがロイシンに、かつ１１３位のアラニンがリジンに置換され、さらに３５５位のアラニンがセリンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３５）を得た。
　ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３５を形質導入した大腸菌ＪＭ１０９株を、上記（３）記載の方法で培養して改変型アマドリアーゼであるＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３５を含む粗酵素液０．６ｍｌを調製した。
　このようにして調製した粗酵素液を用いて、上記Ｂ：活性測定法に示した方法によりαＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。また、比較のために、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２８）株から生産したＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２０を含む酵素液を用いて同様の測定を行った。ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２６を含む粗酵素液のαＦ６Ｐ酸化活性を１００とした場合の、それぞれのアマドリアーゼを含む粗酵素液のαＦ６Ｐ酸化活性は表１２の通りとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000015
　すなわち、表１２に示す通り、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３５はＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２８よりもαＦ６Ｐ酸化活性が向上していることが明らかとなった。
　続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７　ＤＮＡを鋳型として、配列番号４、１０のオリゴヌクレオチド、及びＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－６２Ｄ）を得た。続いて、ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－６２Ｄを形質導入した大腸菌ＪＭ１０９株を作製した。
　続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３５　ＤＮＡを鋳型として、配列番号１９３、配列番号１９４のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、かつ６３位のロイシンがヒスチジンに、かつ１０２位のグルタミン酸がリジンに、かつ１０６位のアスパラギン酸がリジンに、かつ１１０位のグルタミンがロイシンに、かつ１１３位のアラニンがリジンに、かつ３５５位のアラニンがセリンに置換され、さらに６８位のアスパラギン酸がアスパラギンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３６）を得た。
　続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３６　ＤＮＡを鋳型として、配列番号１９５、配列番号１９６のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、かつ６３位のロイシンがヒスチジンに、かつ１０２位のグルタミン酸がリジンに、かつ１０６位のアスパラギン酸がリジンに、かつ１１０位のグルタミンがロイシンに、かつ１１３位のアラニンがリジンに、かつ３５５位のアラニンがセリンに置換され、かつ６８位のアスパラギン酸がアスパラギンに置換され、さらに３５６位のアラニンがスレオニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３７）を得た。
　ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３６の安定性を向上させた変異体を得るために、安定性向上効果のある変異を導入し、かつＣ末端から３アミノ酸を除いた、配列番号１９９で示す４３４アミノ酸からなる改変型ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３６（以降、ＣＦＰ－ＤＨ１と称する）を大腸菌で発現させることを試みた。そこで、配列番号１９９のアミノ酸配列をコードし、かつ大腸菌発現用にコドンを最適化した、配列番号２００で示す１３０５ｂｐの遺伝子（終止コドンＴＡＡを含む）を、定法である遺伝子断片のＰＣＲによる全合成により取得した。このとき、配列番号２００の５´末端、３´末端にはそれぞれＥｃｏＲＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩサイトを付加した。
　続いて、取得したＣＦＰ－ＤＨ１の遺伝子を大腸菌発現用のプラスミドにサブクローニングするために以下の手順を行った。まず、上記で全合成した遺伝子、およびｐＫＫ２２３－３　Ｖｅｃｔｏｒ（ノバジェン社製）をＥｃｏＲＩサイトとＨｉｎｄＩＩＩ（タカラバイオ社製）の２種類の制限酵素で処理した後にライゲーションし、ｐＫＫ２２３－３　ＶｅｃｔｏｒのマルチクローニングサイトにＣＦＰ－ＤＨ１の遺伝子が挿入された組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－ＤＨ１　ＤＮＡを取得した。得られた組換え体プラスミドで大腸菌ＪＭ１０９を形質転換し、ＬＢ－ａｍｐ寒天培地に展開した。生育したコロニーをＬＢ－ａｍｐ培地に接種して振とう培養し、上記（１）と同様の方法でプラスミドＤＮＡを単離した。該プラスミド中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列を、マルチキャピラリーＤＮＡ解析システムApplied Biosystems 3130xlジェネティックアナライザ（Life Technologies社製）を用いて決定し、実際に、ｐＫＫ２２３－３ベクターのマルチクローニングサイトにＣＦＰ－ＤＨ１遺伝子が挿入された組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－ＤＨ１　ＤＮＡが得られたことを確認した。
　続いて、組換え体プラスミドｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－ＤＨ１　ＤＮＡを鋳型として、配列番号２０１、配列番号２０２のオリゴヌクレオチド、およびＫＯＤ　－Ｐｌｕｓ－　を用い、上記（２）と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のアマドリアーゼをコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号１９９記載のアミノ酸配列の３５６位のアラニンがスレオニンに置換された改変型アマドリアーゼをコードする組換え体プラスミド（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－ＤＨ２）を得た。
［実施例２］
（各種アマドリアーゼの生産および精製）
（Coniochaeta属由来改変型アマドリアーゼの生産および精製）
　Coniochaeta属由来の野生型アマドリアーゼ、および上記のようにして得られた改変型アマドリアーゼを生産する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７）、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－６２Ｄ）、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２０）、および大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２１）、および大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３５）を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ－ａｍｐ培地１２０ｍｌに植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液２４ｍｌを調製した。
　調製した粗酵素液を１．３５Ｍ　（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化した１２ｍｌのＢｕｔｙｌ　Ｔｏｙｏｐｅａｒｌ　６５０Ｃ樹脂（東ソー社製）に吸着させ、次に１２０ｍｌの同緩衝液で樹脂を洗浄し、続いて８４ｍｌの１．０５Ｍ　（ＮＨ４）２ＳＯ４を含む１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で樹脂に吸着していたアマドリアーゼを溶出させ回収した。
　得られたアマドリアーゼを含む粗酵素液を透析チューブ（Spectra/Por MWCO: 12,000-14,000）に移し、１０倍量の５ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）中で透析する操作を三度繰り返し、アマドリアーゼを含む粗酵素液から（ＮＨ４）２ＳＯ４を完全に除去した。続いて、１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化したＨｉＳｃｒｅｅｎ　Ｃａｐｔｏ　Ｑ　ＩｍｐＲｅｓ（ＧＥヘルスケア社製）にアマドリアーゼを含む粗酵素液をアプライしてアマドリアーゼを陰イオン交換樹脂に結合させた。その後、１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）に含まれるＮａＣｌ濃度を０ｍＭから１６０ｍＭまで直線的に増加させることにより、樹脂に結合したタンパク質を溶出させ、アマドリアーゼ活性を示す画分を回収した。得られたアマドリアーゼ活性を示す画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥによる分析により、他の夾雑タンパク質を含まない純度まで精製されていることを確認し、ＣＦＰ－Ｔ７、ＣＦＰ－Ｔ７－６２Ｄ、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２０、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２１、およびｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３５の精製標品とした。
　［実施例１］で得られた改変型アマドリアーゼを生産する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３６）、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３７）、および大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－ＤＨ２）を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ－ａｍｐ培地２００ｍｌに植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液４０ｍｌを調製した。大腸菌ＪＭ１０９（ｐＫＫ２２３－３－ＣＦＰ－ＤＨ２）の培養菌体のみ、２ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液４０ｍｌを調製した。
　Ｑ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）を充てんしたカラムを１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で平衡化した後、調製したＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３６およびＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３７を含む各粗酵素液をアプライしてアマドリアーゼを陰イオン交換樹脂に結合させた。その後、３０ｍＭのＮａＣｌ濃度を含む１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で２０カラム体積分送液し、夾雑タンパク質を溶出させた後、８０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．５）で樹脂に結合したタンパク質を溶出させ、アマドリアーゼ活性を示す画分を回収した。
　Ｑ－ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＦＦ（ＧＥヘルスケア社製）を充てんしたカラムを２ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化した後、調製したＣＦＰ－ＤＨ２を含む粗酵素液をアプライしてアマドリアーゼを陰イオン交換樹脂に結合させた。その後、４ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を２０カラム体積分送液し、夾雑タンパク質を溶出させた後、３０ｍＭのＮａＣｌを含む４ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で樹脂に結合したタンパク質を溶出させ、アマドリアーゼ活性を示す画分を回収した。
　得られたそれぞれのアマドリアーゼ活性を示す画分を、Ａｍｉｃｏｎ　Ｕｌｔｒａ　Ｕｌｔｒａｃｅｌ－３０Ｋ（ミリポア社製）により濃縮し、ＨｉＬｏａｄ　２６／６０　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ２００により精製した。樹脂の平衡化、溶出には１５０ｍＭのＮａＣｌを含む１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）を用いた。溶出した各フラクションの純度をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより評価し、夾雑タンパク質を含んでいないフラクションを回収し、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３６、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３７およびＣＦＰ－ＤＨ２の精製標品とした。
（Aspergillus oryzae RIB40由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの生産および精製）
　配列番号３６はAspergillus oryzae RIB40由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以降ＦＡＯＡｏ２と称する）のアミノ酸配列であり、配列番号３６のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号３７）を挿入した組換え体プラスミド（以降ｐＵＣ１９－ＦＡＯＡｏ２と称する）を大腸菌ＤＨ５αで発現させることにより、ＦＡＯＡｏ２が生産され、ＦＡＯＡｏ２がフルクトシルヘキサペプチドに対して作用することが示されている（国際公開第２００８／１０８３８５号公報参照）。
　上記ＦＡＯＡｏ２生産能を有する大腸菌ＤＨ５α（ｐＵＣ１９－ＦＡＯＡｏ２）を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ－ａｍｐ培地に植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液を調製した。
　調製した粗酵素液を１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）で平衡化したＱ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥヘルスケア社製）に吸着させ、次に５０ｍＭ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）で樹脂を洗浄し、続いて１００ｍＭ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ８．５）で樹脂に吸着していたＦＡＯＡｏ２を溶出させ回収した。
　得られたＦＡＯＡｏ２粗酵素液を、１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含む２０ｍＭ　ＭＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ　２６／６００　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００カラムにアプライして同緩衝液でＦＡＯＡｏ２を溶出させ、アマドリアーゼ活性を示す画分を回収した。得られた画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析し、他の夾雑タンパク質を含まない純度まで精製されていることを確認し、ＦＡＯＡｏ２の精製標品とした。
（Phaeosphaeria nodorum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼの生産株の作製）
　配列番号３８はPhaeosphaeria nodorum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼ（以降ＰｎＦＸと称する）のアミノ酸配列である（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ, １０６, ３５８－３６６, ２０１０参照）。配列番号３８のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号３９）を、定法である遺伝子断片のＰＣＲによる全合成によりｃＤＮＡを全合成することで取得した。このとき、配列番号３９の５´末端、３´末端にはそれぞれＮｄｅＩサイトとＢａｍＨＩサイトを付加した。また、クローニングした遺伝子配列から予想されるアミノ酸配列全長は図１のＰｎＦＸの配列と一致していることを確認した。
　続いて、取得した配列番号３９の遺伝子を大腸菌で発現させるために、以下の手順を行った。まず、上記で全合成した遺伝子をＮｄｅＩサイトとＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）の２種類の制限酵素で処理し、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）　Ｖｅｃｔｏｒ（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ－ＢａｍＨＩサイトに挿入することで、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ－ＰｎＦＸを取得し、上記と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ－ＰｎＦＸ）株を得た。
（Phaeosphaeria nodorum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼの生産および精製）
　上記のようにして得られたＰｎＦＸ生産能を有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ－ＰｎＦＸ）株を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ－ａｍｐ培地に植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液を調製した。
　調製したＰｎＦＸの粗酵素液を前述の非特許文献（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｂｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ, １０６, ３５８－３６６, ２０１０）記載の方法に従い、精製した。すなわち、粗酵素液を硫酸アンモニウムにより分画し、１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で透析し、陰イオン交換クロマトグラフィー（本実施例ではＱ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗを用いた）により精製し、ゲルろ過クロマトグラフィー（本実施例ではＨｉＬｏａｄ　２６／６００　Ｓｕｅｐｒｄｅｘ　２００を用いた）により精製した。得られた画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析し、他の夾雑タンパク質を含まない純度まで精製されていることを確認し、ＰｎＦＸの精製標品とした。
　得られたＣＦＰ－Ｔ７、ＣＦＰ－Ｔ７－６２Ｄ、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２０、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２１、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３５、およびＦＡＯＡｏ２、およびＰｎＦＸの精製標品を用いて、αＦＶ、αＦＶＨ、αＦ６Ｐを基質とした時の比活性を測定した。結果を表１３－１に示す。なお、比活性の算出に用いたタンパク質濃度は、２８０ｎｍにおける吸光度を利用した紫外吸収法により測定した（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉ． ４，　 ２４１１－２３，　１９９５参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000016
　得られたＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３６、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３７およびＣＦＰ－ＤＨ２の精製標品を用いて、αＦ６Ｐを基質とした時の比活性を測定した。結果を表１３－２に示す。なお、比活性の算出に用いたタンパク質濃度は、２８０ｎｍにおける吸光度を利用した紫外吸収法により測定した（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉ． ４，　 ２４１１－２３，　１９９５参照）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000017
　精製したＣＦＰ－Ｔ７はαＦＶ、αＦＶＨを酸化する活性を示したが、αＦ６Ｐを酸化する活性は示さなかった。それに対し、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３５はαＦＶ、αＦＶＨに加えてαＦ６Ｐの酸化活性も示し、αＦ６Ｐ酸化反応の比活性は４．２７Ｕ／ｍｇという高い水準に達した。
　ＣＦＰ－Ｔ７－６２Ｄ、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２０、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２１のαＦ６Ｐに対する比活性はそれぞれ０．０１８Ｕ／ｍｇ、０．８５０Ｕ/ｍｇ、０．７９５Ｕ/ｍｇであり、宿主である大腸菌由来のプロテアーゼ／ペプチダーゼの影響を排除した測定方法においても、αＦ６Ｐに対する十分に高い反応性が示された。
　また、既報のαＦ６Ｐに対して反応性を示すアマドリアーゼである、ＦＡＯＡｏ２（国際公開第２００８／１０８３８５号参照）、およびＰｎＦＸ（国際公開第２０１１／１５３２６号参照、該当文献中ではＰ．ｎ　ＦＰＯＸと記載されている）のαＦ６Ｐに対する比活性は、それぞれ０．００２２Ｕ／ｍｇ、０．００９１Ｕ／ｍｇであった。本明細書に記載の手順で作製したＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来アマドリアーゼの改変体はこれら既報のαＦ６Ｐに対して反応性を示すアマドリアーゼの２倍（アマドリアーゼ２６／比較例３）から１９４０倍（アマドリアーゼ２５／比較例２）もの比活性を示した。すなわち、本明細書に記載の手順でαＦ６Ｐに対して高い反応性を示すアマドリアーゼを得ることができた。
　なお、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２０、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ２１が示すαＦ６Ｐ／αＦＶＨの値は、粗酵素液を用いて測定した場合と、精製酵素を用いて測定した場合の間で、大きな乖離は確認できなかった。
　ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３６、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３７のαＦ６Ｐに対する比活性はそれぞれ４．６５Ｕ／ｍｇ、７．１９Ｕ/ｍｇであり、アミノ酸置換導入前のＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３５の比活性（４．２７Ｕ/ｍｇ）と比較すると、アミノ酸置換を追加するごとに向上した。また、ＣＦＰ－ＤＨ２もまたＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３５よりも高い比活性（５．３０Ｕ/ｍｇ）を示した（表１３－２）。
　なお、ＣＦＰ－ＤＨ２に導入した変異（E44P/E133A/E253K/V257C/N262H/Q337K/E340P）について、本発明者らは、これがアマドリアーゼの界面活性剤耐性を向上させることを確認している。具体的には２０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中の当該アマドリアーゼに０．０４％のテトラデシルトリメチルアンモニウムクロリド（ＴＴＡＣ）を作用させても、変異を有しないCFP由来酵素の残存活性が２９．２％となるのに対し、変異（E44P/E133A/E253K/V257C/N262H/Q337K/E340P）を導入したものが１００％の残存活性を有することを確認している。これらの変異の効果は、特願２０１３－２２１５１５号及びＰＣＴ／ＪＰ２０１４／０７１０３６号明細書に記載されており、これらの文献は参照によりその全内容を本明細書に組み入れるものとする。またＣＦＰ－ＤＨ２におけるカルボキシル末端のアミノ酸配列の欠失について、本発明者らは、これがアマドリアーゼの熱安定性を向上させることを報告した。該欠失の効果は国際公開第２０１３／１００００６号明細書に記載されている。
　こうした変異を有しないアマドリアーゼは、界面活性剤処理後であっても活性が残存しており、適切な量の酵素を用いればＨｂＡ１ｃを測定することができる。また、界面活性剤耐性の向上したアマドリアーゼや熱安定性の向上したアマドリアーゼを用いれば、測定に必要な酵素量を低減することもできる。
［実施例３］
（各種アマドリアーゼへの点変異導入）
　上記の変異を導入することによりConiochaeta属由来のアマドリアーゼのαＦ６Ｐに対する反応性が上昇した。このことから、配列同一性に基づく公知の整列処理による情報を参考にして、その他の生物種由来のアマドリアーゼのアミノ酸配列における対応する位置に同様な変異を導入することにより、同様にαＦ６Ｐに対する反応性の上昇が期待できる。そこで、実際にＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ属由来のアマドリアーゼ以外の複数のアマドリアーゼにも対応する位置に変異を導入した。
１．Eupenicillium terrenum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子への点変異導入
　配列番号４０はEupenicillium terrenum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼ（以降ＥＦＰ－Ｔ５と称する）のアミノ酸配列であり、配列番号４０のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号４１）を挿入した組換え体プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５を保持する大腸菌により生産でき、ＥＦＰ－Ｔ５はαＦＶおよびαＦＶＨ酸化活性を示すことが確認されている（国際公開第２００７／１２５７７９号公報および国際公開第２００８／０１８０９４号公報参照）。
　ＥＦＰ－Ｔ５に基質特異性改善型変異を導入するために、組換え体プラスミドｐＵＴＥ１００Ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５を鋳型にして、配列番号４２、４３の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡績社製）を用い、実施例１と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のＥＦＰ－Ｔ５変異体をコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号４０記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に置換されたＥＦＰ－Ｔ５遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＵＴＥ１００Ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５－６２Ｄ）を得た。
　続いて、上記と同様にして、ｐＵＴＥ１００Ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５－６２Ｄを鋳型とし、配列番号４４，４５の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号４０記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギンがリジンに置換されたＥＦＰ－Ｔ５遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＵＴＥ１００Ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５－６２Ｄ／１０６Ｋ）を得た。
　続いて、上記と同様にして、ｐＵＴＥ１００Ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５－６２Ｄ／１０６Ｋを鋳型とし、配列番号４６、４７の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号４０記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギンがリジンに、１１０位のリジンがロイシンに置換されたＥＦＰ－Ｔ５遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＵＴＥ１００Ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ）を得た。
　続いて、上記と同様にして、ｐＵＴＥ１００Ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌを鋳型とし、配列番号４８，４９の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号４０記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギンがリジンに、１１０位のリジンがロイシンに、１１３位のスレオニンがリジンに置換されたＥＦＰ－Ｔ５遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＵＴＥ１００Ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ）を得た。
　続いて、上記と同様にして、ｐＵＴＥ１００Ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋを鋳型とし、配列番号５０，５１の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号４０記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギンがリジンに、１１０位のリジンがロイシンに、１１３位のスレオニンがリジンに、３５５位のアラニンがセリンに置換されたＥＦＰ－Ｔ５遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＵＴＥ１００Ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５５Ｓ）を得た。
　さらに、上記と同様にして、ｐＵＴＥ１００Ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５５Ｓを鋳型とし、配列番号５２，５３の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号４０記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、６３位のロイシンがヒスチジンに、１０６位のアスパラギンがリジンに、１１０位のリジンがロイシンに、１１３位のスレオニンがリジンに、３５５位のアラニンがセリンに置換されたＥＦＰ－Ｔ５遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＵＴＥ１００Ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５－６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５５Ｓ）を得た。
２．Neocosmospora vasinfecta由来のケトアミンオキシダーゼ遺伝子への点変異導入
　配列番号５４はNeocosmospora vasinfecta由来ケトアミンオキシダーゼ（以降ＮｖＦＸと称する）のアミノ酸配列であり、配列番号５４のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号５５）を挿入した組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸを保持する大腸菌により生産でき、ＮｖＦＸはαＦＶおよびαＦＶＨ酸化活性を示すことが確認されている（国際公開第２０１２／０１８０９４号公報参照）。
　ＮｖＦＸに基質特異性改善型変異を導入するために、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸを鋳型にして、配列番号５６、５７の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡績社製）を用い、実施例１と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のＮｖＦＸ変異体をコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号５４記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に置換されたＮｖＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－ＮｖＦＸ－６２Ｄ）を得た。
　続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸ－６２Ｄを鋳型とし、配列番号５８，５９の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号５４記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のグリシンがリジンに置換されたＮｖＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ）を得た。
　さらに、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋを鋳型とし、配列番号６０，６１の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号５４記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のアルギニンがリジンに、１１０位のグルタミン酸がロイシンに置換されたＮｖＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ）を得た。
　そして、実施例１と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ）株を得た。
３．Aspergillus nidulans由来のフルクトシルアミノ酸オキシダーゼ遺伝子への点変異導入
　配列番号６２はフルクトシルペプチドオキシダーゼ活性を付与するために５９位のセリンをグリシンへ置換したAspergillus nidulans由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以降ＡｎＦＸと称する）のアミノ酸配列であり、配列番号６２のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号６３）を挿入した組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸを保持する大腸菌により生産でき、ＡｎＦＸはαＦＶおよびαＦＶＨ酸化活性を示すことが確認されている（国際公開第２０１２／０１８０９４号公報参照）。
　ＡｎＦＸに基質特異性改善型変異を導入するために、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸを鋳型にして、配列番号６４、６５の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡績社製）を用い、実施例１と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のＡｎＦＸ変異体をコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号６２記載のアミノ酸配列の６１位のアルギニンがアスパラギン酸に置換されたＡｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ－６１Ｄ）を得た。
　続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ－６１Ｄを鋳型とし、配列番号６６，６７の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号６２記載のアミノ酸配列の６１位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０５位のグリシンがリジンに置換されたＡｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ－６１Ｄ／１０５Ｋ）を得た。
　続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ－６１Ｄ／１０５Ｋを鋳型とし、配列番号６８，６９の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号６２記載のアミノ酸配列の６１位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０５位のグリシンがリジンに、１０９位のリジンがロイシンに置換されたＡｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ－６１Ｄ／１０５Ｋ／１０９Ｌ）を得た。
　そして、実施例１と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ－６１Ｄ／１０５Ｋ／１０９Ｌ）株を得た。
　続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ－６１Ｄ／１０５Ｋ／１０９Ｌを鋳型とし、配列番号１１２，７０の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号６２記載のアミノ酸配列の６１位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０５位のグリシンがリジンに、１０９位のリジンがロイシンに、１１２位のセリンがリジンに置換されたＡｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ－６１Ｄ／１０５Ｋ／１０９Ｌ／１１２Ｋ）を得た。
　続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ－６１Ｄ／１０５Ｋ／１０９Ｌ／１１２Ｋを鋳型とし、配列番号７１，７２の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号６２記載のアミノ酸配列の６１位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０５位のグリシンがリジンに、１０９位のリジンがロイシンに、１１２位のセリンがリジンに、３５５位のアラニンがセリンに置換されたＡｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ－６１Ｄ／１０５Ｋ／１０９Ｌ／１１２Ｋ／３５５Ｓ）を得た。
　続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ－６１Ｄ／１０５Ｋ／１０９Ｌ／１１２Ｋ／３５５Ｓを鋳型とし、配列番号７３，７４の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号６２記載のアミノ酸配列の６１位のアルギニンがアスパラギン酸に、６２位のロイシンがヒスチジンに、１０５位のグリシンがリジンに、１０９位のリジンがロイシンに、１１２位のセリンがリジンに、３５５位のアラニンがセリンに置換されたＡｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ－６１Ｄ／６２Ｈ／１０５Ｋ／１０９Ｌ／１１２Ｋ／３５５Ｓ）を得た。
　続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ－６１Ｄ／６２Ｈ／１０５Ｋ／１０９Ｌ／１１２Ｋ／３５５Ｓを鋳型とし、配列番号７５，７６の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号６２記載のアミノ酸配列の６１位のアルギニンがアスパラギン酸に、６２位のロイシンがヒスチジンに、１０１位のグルタミン酸がリジンに、１０５位のグリシンがリジンに、１０９位のリジンがロイシンに、１１２位のセリンがリジンに、３５５位のアラニンがセリンに置換された置換されたＡｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ－６１Ｄ／６２Ｈ／１０１Ｋ／１０５Ｋ／１０９Ｌ／１１２Ｋ／３５５Ｓ）を得た。
　そして、実施例１と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ－６１Ｄ／６２Ｈ／１０１Ｋ／１０５Ｋ／１０９Ｌ／１１２Ｋ／３５５Ｓ）株を得た。
４．Phaeosphaeria nodorum由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子への点変異導入
　ＰｎＦＸに基質特異性改善型変異を導入するために、前述の様に調製した組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ－ＰｎＦＸを鋳型にして、配列番号７７、７８の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡績社製）を用い、実施例１と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のＰｎＦＸ変異体をコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号３８記載のアミノ酸配列の６２位のセリンがアスパラギン酸に置換されたＰｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－ＰｎＦＸ－６２Ｄ）を得た。
　続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ－ＰｎＦＸ－６２Ｄを鋳型とし、配列番号７９、８０の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号３８記載のアミノ酸配列の６２位のセリンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギン酸がリジンに置換されたＰｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－ＰｎＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ）を得た。
　続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ－ＰｎＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋを鋳型とし、配列番号８１、８２の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号３８記載のアミノ酸配列の６２位のセリンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギン酸がリジンに、１１０位のグリシンがロイシンに置換されたＰｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－ＰｎＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ）を得た。
　さらに、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ－ＰｎＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌを鋳型とし、配列番号８３、８４の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号３８記載のアミノ酸配列の６２位のセリンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギン酸がリジンに、１１０位のグリシンがロイシンに、１１３位のアラニンがリジンに置換されたＰｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－ＰｎＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ）を得た。
　そして、実施例１と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ－ＰｎＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ）株を得た。
　さらに、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ－ＰｎＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋを鋳型とし、配列番号８５，８６の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号３８記載のアミノ酸配列の６２位のセリンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギン酸がリジンに、１１０位のグリシンがロイシンに、１１３位のアラニンがリジンに、３５１位のアラニンがセリンに置換されたＰｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－ＰｎＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５１Ｓ）を得た。
　さらに、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ－ＰｎＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５１Ｓを鋳型とし、配列番号８７，８８の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号３８記載のアミノ酸配列の６２位のセリンがアスパラギン酸に、６３位のロイシンがヒスチジンに、１０６位のアスパラギン酸がリジンに、１１０位のグリシンがロイシンに、１１３位のアラニンがリジンに、３５１位のアラニンがセリンに置換されたＰｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－ＰｎＦＸ－６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５１Ｓ）を得た。
　そして、実施例１と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ－ＰｎＦＸ－６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５１Ｓ）株を得た。
５．Cryptococcus neoformans由来のフルクトシルペプチドオキシダーゼ遺伝子への点変異導入
　配列番号８９はCryptococcus neoformans由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ（以降ＣｎＦＸと称する）のアミノ酸配列であり、配列番号８９のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号９０）を挿入した組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ―ＣｎＦＸを保持する大腸菌により生産でき、ＣｎＦＸはαＦＶおよびαＦＶＨ酸化活性を示すことが確認されている（国際公開第２０１２／０１８０９４号公報参照）。
　ＣｎＦＸに基質特異性改善型変異を導入するために、前述の様に調製した組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ－ＣｎＦＸを鋳型にして、配列番号９１、９２の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡績社製）を用い、実施例１と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のＣｎＦＸ変異体をコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号８９記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に置換されたＣｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－ＣｎＦＸ－６２Ｄ）を得た。
　続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ－ＣｎＦＸ－６２Ｄを鋳型とし、配列番号９３、９４の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号８９記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のセリンがリジンに置換されたＣｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－ＣｎＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ）を得た。
　続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ－ＣｎＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋを鋳型とし、配列番号９５、９６の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号８９記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のセリンがリジンに、１１０位のセリンがロイシンに置換されたＣｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－ＣｎＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ）を得た。
　続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ－ＰｎＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌを鋳型とし、配列番号９７、９８の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号８９記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のセリンがリジンに、１１０位のセリンがロイシンに、１１３位のアラニンがリジンに置換されたＣｎＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－ＣｎＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ）を得た。
　そして、実施例１と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ－ＣｎＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ）株を得た。
６．Curvularia clavata由来ケトアミンオキシダーゼと９５％の配列同一性を示すアマドリアーゼ遺伝子への点変異導入
（Curvularia clavata由来ケトアミンオキシダーゼと９５％の配列同一性を示すアマドリアーゼの生産株の作製）
　配列番号９９はCurvularia clavata由来ケトアミンオキシダーゼと９５％の配列同一性を示すアミノ酸配列を有するアマドリアーゼである（以降Ｃｃ９５ＦＸと称する）。配列番号９９のアミノ酸配列をコードする遺伝子（配列番号１００）を、定法である遺伝子断片のＰＣＲによる全合成によりｃＤＮＡを全合成することで取得した。このとき、配列番号１００の５´末端、３´末端にはそれぞれＮｄｅＩサイトとＢａｍＨＩサイトを付加した。
　続いて、取得した配列番号１００の遺伝子を大腸菌で発現させるために、以下の手順を行った。まず、上記で全合成した遺伝子をＮｄｅＩサイトとＢａｍＨＩ（タカラバイオ社製）の２種類の制限酵素で処理し、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）　Ｖｅｃｔｏｒ（ノバジェン社製）のＮｄｅＩ－ＢａｍＨＩサイトに挿入することで、組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ－Ｃｃ９５ＦＸを取得し、上記と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ－Ｃｃ９５ＦＸ）株を得た。
（Curvularia clavata由来ケトアミンオキシダーゼと９５％の配列同一性を示すアマドリアーゼ遺伝子への点変異導入）
　Ｃｃ９５ＦＸに基質特異性改善型変異を導入するために、前述の様に調製した組換え体プラスミドｐＥＴ２２ｂ－Ｃｃ９５ＦＸを鋳型にして、配列番号１０１、１０２の合成オリゴヌクレオチド、ＫＯＤ－Ｐｌｕｓ－（東洋紡績社製）を用い、実施例１と同様の条件でＰＣＲ反応、大腸菌ＪＭ１０９の形質転換および生育コロニーが保持するプラスミドＤＮＡ中のＣｃ９５ＦＸ変異体をコードするＤＮＡの塩基配列決定を行った。その結果、配列番号９９記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に置換されたＣｃ９５ＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－Ｃｃ９５ＦＸ－６２Ｄ）を得た。
　続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ－Ｃｃ９５ＦＸ－６２Ｄを鋳型とし、配列番号１０３、１０４の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号９９記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギン酸がリジンに置換されたＣｃ９５ＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－Ｃｃ９５ＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ）を得た。
　続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ－Ｃｃ９５ＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋを鋳型とし、配列番号１０５、１０６の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号９９記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギン酸がリジンに、１１０位のアラニンがロイシンに置換されたＣｃ９５ＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－Ｃｃ９５ＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ）を得た。
　続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ－Ｃｃ９５ＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌを鋳型とし、配列番号１０７、１０８の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号９９記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギン酸がリジンに、１１０位のアラニンがロイシンに、１１３位のアラニンがリジンに置換されたＣｃ９５ＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－Ｃｃ９５ＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ）を得た。
　続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ－Ｃｃ９５ＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋを鋳型とし、配列番号１０９、１１０の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号９９記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、１０６位のアスパラギン酸がリジンに、１１０位のアラニンがロイシンに、１１３位のアラニンがリジンに、３５３位のアラニンがセリンに置換されたＣｃ９５ＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－Ｃｃ９５ＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５３Ｓ）を得た。
　続いて、上記と同様にして、ｐＥＴ２２ｂ－Ｃｃ９５ＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５３Ｓを鋳型とし、配列番号１１１、１０２の合成オリゴヌクレオチドを使用して、配列番号９９記載のアミノ酸配列の６２位のアルギニンがアスパラギン酸に、６３位のロイシンがヒスチジンに、１０６位のアスパラギン酸がリジンに、１１０位のアラニンがロイシンに、１１３位のアラニンがリジンに、３５３位のアラニンがセリンに置換されたＣｃ９５ＦＸ遺伝子をコードする組換え体プラスミド（ｐＥＴ２２ｂ－Ｃｃ９５ＦＸ－６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５３Ｓ）を得た。
　そして、実施例１と同様の条件で大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株を形質転換し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ－Ｃｃ９５ＦＸ－６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５３Ｓ）株を得た。
［実施例４］
（各種アマドリアーゼの生産および精製）
（Eupenicillium terrenum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼの生産および精製）
　野生型のＥＦＰ－Ｔ５、および前述の様にして得られた改変型ＥＦＰ－Ｔ５を生産する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵＴＥ１００Ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５）、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵＴＥ１００Ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５－６２Ｄ）、大腸菌ＪＭ１０９（ｐＵＴＥ１００Ｋ’－ＥＦＰ－Ｔ５－６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５５Ｓ）を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ－ａｍｐ培地に植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液を調製した。
　調製した野生型または改変型ＥＦＰ－Ｔ５の粗酵素液に硫酸アンモニウムを３５％飽和濃度になるように添加して攪拌し、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離して上清を回収した。続いて、得られた上清に硫酸アンモニウムを７０％飽和濃度になるように追加添加して攪拌し、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離して上清を廃棄し、沈殿物を１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解させた。
　得られた野生型または改変型ＥＦＰ－Ｔ５の粗酵素液を１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で透析した後、同緩衝液で平衡化した４ｍｌのＱ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥヘルスケア社製）に供し、同緩衝液で樹脂に吸着しないタンパク質を溶出させた。続いて、得られた野生型または改変型ＥＦＰ－Ｔ５Ｍの粗酵素液を１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で透析した後、同緩衝液で平衡化したＨｉＬｏａｄ　２６／１０　Ｑ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　ＨＰカラム（ＧＥヘルスケア社製）に吸着させ、次に同緩衝液で樹脂を洗浄し、続いて同緩衝液中のＮａＣｌの濃度を０ｍＭから１００ｍＭまで直線的に増加させながら樹脂に吸着していた野生型または改変型ＥＦＰ－Ｔ５を溶出させ回収した。
　得られた野生型、または改変型ＥＦＰ－Ｔ５を含む粗酵素液を、１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ　２６／６００　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００カラムにアプライして同緩衝液で野生型または改変型ＥＦＰ－Ｔ５を溶出させ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性（アマドリアーゼ活性）を示す画分を回収した。得られた画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析し、他の夾雑タンパク質を含まない純度まで精製されていることを確認し、野生型または改変型ＥＦＰ－Ｔ５の精製標品とした。
（Neocosmospora vasinfecta由来ケトアミンオキシダーゼの生産および精製）
　野生型のＮｖＦＸ、および前述の様にして得られた改変型ＮｖＦＸを生産する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ－ＮｖＦＸ）、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＮｖＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ）を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ－ａｍｐ培地に植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液を調製した。
　調製した粗酵素液を１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＱ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥヘルスケア社製）に吸着させ、次に２０ｍＭ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で樹脂を洗浄し、続いて３００ｍＭ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で樹脂に吸着していた野生型または改変型ＮｖＦＸを溶出させ回収した。
　得られた野生型ＮｖＦＸ、または改変型ＮｖＦＸを含む粗酵素液を、１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含む２０ｍＭ　ＭＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ　２６／６００　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００カラムにアプライして同緩衝液で野生型ＮｖＦＸ、または改変型ＮｖＦＸを溶出させ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性（アマドリアーゼ活性）を示す画分を回収した。得られた画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析し、他の夾雑タンパク質を含まない純度まで精製されていることを確認し、野生型または改変型ＮｖＦＸの精製標品とした。
（Aspergillus nidulans由来フルクトシルアミノ酸オキシダーゼの生産および精製）
　野生型のＡｎＦＸ、および前述の様にして得られた改変型ＡｎＦＸを生産する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ－６１Ｄ／１０５Ｋ／１０９Ｌ）および大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＡｎＦＸ－６１Ｄ／６２Ｈ／１０１Ｋ／１０５Ｋ／１０９Ｌ／１１２Ｋ／３５５Ｓ）を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ－ａｍｐ培地に植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液を調製した。
　調製した粗酵素液を１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で平衡化したＳＰ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥヘルスケア社製）に吸着させ、次に２０ｍＭ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で樹脂を洗浄し、続いて１００ｍＭ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）で樹脂に吸着していた改変型ＡｎＦＸを溶出させ回収した。
　得られた改変型ＡｎＦＸを含む粗酵素液を、１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含む２０ｍＭ　ＭＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ　２６／６００　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００カラムにアプライして同緩衝液で改変型ＡｎＦＸを溶出させ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性（アマドリアーゼ活性）を示す画分を回収した。得られた画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析し、他の夾雑タンパク質を含まない純度まで精製されていることを確認し、改変型ＡｎＦＸの精製標品とした。
（Phaeosphaeria nodorum由来フルクトシルペプチドオキシダーゼの生産および精製）
　前述の様にして得られた改変型ＡｎＦＸを生産する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＰｎＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ）および大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＰｎＦＸ－６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５１Ｓ）を、前述の、野生型ＰｎＦＸの精製方法に従い精製した。ＨｉＬｏａｄ　２６／６００　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００カラムによる精製終了後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥにより純度を分析し、他の夾雑タンパク質を含まない純度まで精製されていることを確認し、改変型ＰｎＦＸの精製標品とした。
（Cryptococcus neoformans由来ケトアミンオキシダーゼの生産および精製）
　野生型のＣｎＦＸ、および前述の様にして得られた改変型ＣｎＦＸを生産する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ－ＣｎＦＸ）、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）（ｐＥＴ２２ｂ―ＣｎＦＸ－６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ）を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ－ａｍｐ培地に植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液を調製した。
　調製した粗酵素液を１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で平衡化したＱ　Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗ樹脂（ＧＥヘルスケア社製）に吸着させ、次に２０ｍＭ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で樹脂を洗浄し、続いて３００ｍＭ　ＮａＣｌを含む１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）で樹脂に吸着していた野生型または改変型ＣｎＦＸを溶出させ回収した。
　得られた野生型ＣｎＦＸ、または改変型ＣｎＦＸを含む粗酵素液を、１５０ｍＭ　ＮａＣｌを含む２０ｍＭ　ＭＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液（ｐＨ７．０）で平衡化したＨｉＬｏａｄ　２６／６００　Ｓｕｐｅｒｄｅｘ　２００カラムにアプライして同緩衝液で野生型ＣｎＦＸ、または改変型ＣｎＦＸを溶出させ、フルクトシルアミノ酸オキシダーゼ活性（アマドリアーゼ活性）を示す画分を回収した。得られた画分をＳＤＳ－ＰＡＧＥにより分析し、他の夾雑タンパク質を含まない純度まで精製されていることを確認し、野生型または改変型ＣｎＦＸの精製標品とした。
（Curvularia clavata由来ケトアミンオキシダーゼと９５％の配列同一性を示すアマドリアーゼの生産）
　野生型のＣｃ９５ＦＸ、および前述の様にして得られた改変型Ｃｃ９５ＦＸを生産する大腸菌ＪＭ１０９（ｐＥＴ２２ｂ－Ｃｃ９５ＦＸ）、および大腸菌ＪＭ１０９（ｐＥＴ２２ｂ－Ｃｃ９５ＦＸ－６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５５Ｓ）を、終濃度０．１ｍＭとなるようにＩＰＴＧを添加したＬＢ－ａｍｐ培地に植菌し、２５℃で１６時間培養した。得られた各培養菌体を１０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で洗浄した後、同緩衝液に菌体を懸濁して超音波破砕処理を行い、２０，０００×ｇで１０分間遠心分離し、粗酵素液を調製した。
　得られた各種アマドリアーゼの野生型酵素、および改変型酵素の精製標品を用いて、αＦ６Ｐを基質とした時の比活性を測定した。結果を表１４に示す。なお、比活性の算出に用いたタンパク質濃度は、２８０ｎｍにおける吸光度を利用した紫外吸収法により測定した（Ｐｒｏｔｅｉｎ　Ｓｃｉ． ４，　 ２４１１－２３，　１９９５参照）。
　また、Ｃｃ９５ＦＸ、またはＣｃ９５ＦＸ－６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５５Ｓを含む粗酵素液を用いて、上記Ｂ：活性測定法に示した方法によりαＦＶ、αＦＶＨ、αＦ６Ｐに対する酸化活性を測定した。それぞれのアマドリアーゼについて、αＦＶＨ酸化活性を１００とした場合の、各基質に対する酸化活性、ならびにαＦ６Ｐ／αＦＶＨおよびαＦ６Ｐ／αＦＶは表１５の通りとなった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000018
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000019
　本明細書に記載の手順で作製した、Coniochaeta由来アマドリアーゼ（ＣＦＰ－Ｔ７；比較例１）と比較してαＦ６Ｐに対する反応性を付与または増強するアミノ酸置換を各種のアマドリアーゼに導入した結果、予想通り、ＥＦＰ－Ｔ５、ＮｖＦＸ、ＡｎＦＸ、ＣｎＦＸにはαＦ６Ｐに対する反応性が新たに付与された。また、ＰｎＦＸは従来よりαＦ６Ｐに対する反応を僅かながら示したが、本明細書に記載のアミノ酸置換の導入によりαＦ６Ｐに対する比活性が１３．７倍向上した。
　また、本明細書に記載の手順で作製した、Coniochaeta由来アマドリアーゼ（ＣＦＰ－Ｔ７；比較例１）と比較してαＦ６Ｐに対する反応性を付与または増強するアミノ酸置換を、本明細書に記載の手順で作製した、Curvularia clavata由来ケトアミンオキシダーゼと９５％の配列同一性を示すアマドリアーゼ（Ｃｃ９５ＦＸ；比較例８）に導入した結果、予想通り、Ｃｃ９５ＦＸにはαＦ６Ｐに対する反応性が新たに付与され、Ｃｃ９５ＦＸ－６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５５Ｓでは、αＦ６Ｐ酸化活性がαＦＶＨ酸化活性を上回った。
　すなわち、本明細書に記載のＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ由来アマドリアーゼに対してαＦ６Ｐに対する反応性を付与または増強するするアミノ酸置換の効果は、Coniochaeta由来アマドリアーゼに対してのみ限定される訳ではなく、図１および図２に示した様なＣｏｎｉｏｃｈａｅｔａ由来アマドリアーゼと７４％以上の配列同一性を示すアマドリアーゼであれば、普遍的に同様にαＦ６Ｐに対する反応性が付与または増強された。
　表１４より、ＡｎＦＸに変異６１Ｄ／１０５Ｋ／１１０Ｌを導入したアマドリアーゼ３０はαＦ６Ｐに対して０．１以上の比活性を示した。すなわち、酵素に３重変異を導入することによりαＦ６Ｐに対して０．１以上の比活性を示す改変アマドリアーゼを取得することができた。またＰｎＦＸに６２Ｄ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋを導入したアマドリアーゼ３２もαＦ６Ｐに対して０．１以上の比活性を示した。すなわち、酵素に４重変異を導入することによりαＦ６Ｐに対して０．１以上の比活性を示す改変アマドリアーゼを取得することができた。また、変異をさらに導入することによりαＦ６Ｐに対する比活性をさらに向上させることができた。
　本明細書では、導入する置換の効果が累積することを示した。したがってアマドリアーゼのαＦ６Ｐに対する活性を向上させる変異は、ある特定の変異に限定されず、またある特定の組合せに限定されず、本明細書に示した６２位、６３位、１０２位、１０６位、１１０位、１１３位、３５５位、４１９位、６８位及び３５６位、さらにはαＦ６Ｐに対する活性を向上させるこれ以外の位置の変異が任意の組合せとして使用可能である、と当業者であれば理解する。また実施例５～７において後述するように、こうした、αＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼが、本発明のＨｂＡ１ｃ測定方法に使用できる、と当業者であれば理解する。
　以下の表に比較例と、本発明の変異体の、６２位、６３位、１０２位、１０６位、１１０位、１１３位、３５５位及び４１９位のアミノ酸及び置換があれば置換後のアミノ酸の関係を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000021
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000022
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000023
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000024
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000025
［実施例５］
（ＨｂＡ１ｃの定量）
　以下の組成を有するＨｂＡ１ｃ測定用試薬を調製し、Ｂｉｏ　Ｍａｊｅｓｔｙ　ＪＣＡ－ＢＭ１６５０（日本電子製）を利用して下記の通りＨｂＡ１ｃの測定を実施した。
試料：ＨｂＡ１ｃ溶液
ＨｂＡ１ｃ認証実用標準物質ＪＣＣＲＭ４２３－８（検査医学標準物質機構製）
総ヘモグロビン濃度１３３ｇ／ｌ、
ＨｂＡ１ｃ濃度３レベル（ＮＧＳＰ値　５．５６％、７．７４％、１０．４８％）
試薬Ａ１：試料前処理液
５．０％　ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド（同仁化学研究所製）
試薬Ａ２：試料前処理液
５．０％　ｎ－テトラデシル－β－Ｄ－マルトシド（シグマアルドリッチ社製）
試薬Ｂ：ロイコ色素、パーオキシダーゼ溶液
１５０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液　ｐＨ６．５
０．３０ｍＭ　Ｎ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－４，４′－ ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム（ＤＡ－６４、和光純薬工業製）
１５Ｕ／ｍｌ　パーオキシダーゼ（キッコーマン製）
試薬Ｃ１：ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３５溶液
１２０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液　ｐＨ６．５
１２０Ｕ／ｍｌ（２８ｍｇ／ｍｌ）ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３５（アマドリアーゼ２５）
試薬Ｃ２：ＣＦＰ－Ｔ７溶液
１２０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液　ｐＨ６．５
２８ｍｇ／ｍｌ　ＣＦＰ－Ｔ７（比較例１）
　試薬Ａ１もしくは試薬Ａ２で３０倍希釈した試料（以降試料希釈液と表記する）を９８℃で２分間インキュベートした後、試料希釈液２５μｌを５０μｌの試薬Ｂに添加して３７℃で５分間インキュベートした後、２５μｌの試薬Ｃ１または試薬Ｃ２を添加してＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端の酸化により生じる過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させた。溶液中に過酸化水素が生じた場合、パーオキシダーゼの作用によりロイコ色素が発色し、７５１ｎｍの光の吸光度が増加する。一例として、試薬Ａ２と試薬Ｃ１を使用して測定を行った場合の、試料希釈液と試薬Ｂを混合してからの経過時間と吸光度の関係を図３に示したが、この場合、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３５溶液（試薬Ｃ１）の添加直後から過酸化水素の生成に伴う吸光度上昇が確認できた。試料のＨｂＡ１ｃ濃度に応じて得られた結果を基に、試料のＨｂＡ１ｃ濃度（ＮＧＳＰ値）を横軸に、過酸化水素の定量反応前後の７５１ｎｍの光の吸光度差ΔＡを縦軸にプロットしたグラフを作成した。
　なお、ΔＡは下記の式に従って算出した。
ΔＡ＝（試薬Ｃ１または試薬Ｃ２添加５分後の吸光度）－（試薬Ｃ１または試薬Ｃ２添加直前の吸光度×０．７５）
　ここでは、試薬Ｃ１または試薬Ｃ２添加により、反応液の容積が１．３３倍となるため、試薬Ｃ１または試薬Ｃ２添加直前の吸光度に０．７５を掛けたものを、試薬Ｃ１または試薬Ｃ２添加直後の吸光度と見なした。試薬Ａ１を用いて試料を希釈した場合の結果を図４－１に、試薬Ａ２を用いて試料を希釈した場合の結果を図４－２に示した。
　試薬Ｃ１を用いた場合、ＨｂＡ１ｃ濃度とΔＡの間に良好な相関関係が成立した。それに対し、試薬Ｃ２を用いた場合、ＨｂＡ１ｃ濃度とΔＡの間に相関性は認められなかった。また、この傾向は試薬前処理液（試薬Ａ１、Ａ２）の種類によって影響を受けることはなかった。したがって、αＦ６Ｐ酸化活性を示すアマドリアーゼはＨｂＡ１ｃのβ鎖に対しても酸化活性を示し、プロテアーゼ等を処方することなく迅速かつ精確にＨｂＡ１ｃの定量を行えることが示された。
［実施例６］
（酸で前処理したＨｂＡ１ｃの定量）
　以下の組成を有するＨｂＡ１ｃ測定用試薬を調製し、Ｂｉｏ　Ｍａｊｅｓｔｙ　ＪＣＡ－ＢＭ１６５０（日本電子製）を利用して下記の通りＨｂＡ１ｃの測定を実施した。本実施例では、ＨｂＡ１ｃ試料の前処理液として酸性に調整した非イオン性界面活性剤溶液を用いた。 
試料：ＨｂＡ１ｃ溶液
ＨｂＡ１ｃ認証実用標準物質ＪＣＣＲＭ４２３－８（検査医学標準物質機構製）
総ヘモグロビン濃度１３３ｇ／ｌ、
ＨｂＡ１ｃ濃度３レベル（ＮＧＳＰ値　５．５６％、７．７４％、１０．４８％）
または
ＨｂＡ１ｃ認証実用標準物質ＪＣＣＲＭ４２３－９ｂ（検査医学標準物質機構製）
総ヘモグロビン濃度１３３ｇ／ｌ、
ＨｂＡ１ｃ濃度３レベル（ＮＧＳＰ値　５．６１％、７．７１％、１０．５５％）
試薬Ｄ１：試料前処理液
８．３％　ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド（同仁化学研究所製）
０．１Ｍ　塩酸
試薬Ｄ２：試料前処理液
８．３％　ポリオキシエチレン（２０）セチルエーテル（Ｂｒｉｊ５８、和光純薬工業製）
０．１Ｍ　塩酸
試薬Ｅ：ロイコ色素溶液
３０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－リン酸カリウム緩衝液　ｐＨ９．０
２９０ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液　ｐＨ６．５
０．１６ｍＭ　Ｎ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－４，４′－ ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム（ＤＡ－６４、和光純薬工業製）
試薬Ｆ１：パーオキシダーゼ、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３５溶液
１００ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液　ｐＨ６．５
４０Ｕ／ｍｌ　パーオキシダーゼ（キッコーマン製）
１８０Ｕ／ｍｌ（４２ｍｇ／ｍｌ）ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３５（アマドリアーゼ２５）
試薬Ｆ２ ：パーオキシダーゼ、ＥＦＰ－Ｔ５―６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５５Ｓ
１００ｍＭ　リン酸カリウム緩衝液　ｐＨ６．５
４０Ｕ／ｍｌ　パーオキシダーゼ（キッコーマン製）
３０Ｕ／ｍｌ（２７ｍｇ／ｍｌ）ＥＦＰ－Ｔ５―６２Ｄ／６３Ｈ／１０６Ｋ／１１０Ｌ／１１３Ｋ／３５５Ｓ溶液（アマドリアーゼ２８）
　試薬Ｄ１もしくは試薬Ｄ２で３０倍希釈した試料２５μｌを、１２５μｌの試薬Ｅに添加して３７℃で５分間インキュベートした後、５０μｌの試薬Ｆ１を添加してＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端の酸化により生じる過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させた。また、試薬Ｄ１で３０倍希釈した試料２５μｌを、１２５μｌの試薬Ｅに添加して３７℃で５分間インキュベートした後、５０μｌの試薬Ｆ２を添加してＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端の酸化により生じる過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させた。一例として、試薬Ｄ１で希釈した試料と試薬Ｅを混合してからの経過時間と吸光度の関係を図５－１に示したが、この場合、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３５溶液（試薬Ｆ１）の添加直後から過酸化水素の生成に伴う吸光度上昇が確認できた。各ＨｂＡ１ｃ試料の測定結果から、試料のＨｂＡ１ｃ濃度（ＮＧＳＰ値）を横軸に、過酸化水素の定量反応前後の７５１ｎｍの光の吸光度差ΔＡを縦軸にプロットしたグラフを作成した。
　なお、ΔＡは下記の式に従って算出した。
ΔＡ＝（試薬Ｆ１まはたＦ２添加５分後の吸光度）－（試薬Ｆ１まはたＦ２添加直前の吸光度×０．７５）
　ここでは、試薬Ｆ１またはＦ２添加により、反応液の容積が１．３３倍となるため、試薬Ｆ１またはＦ２添加直前の吸光度に０．７５を掛けたものを、試薬Ｆ１またはＦ２添加直後の吸光度と見なした。試薬Ｄ１およびＦ１を用いて試料を測定した場合の結果を図６－１に、試薬Ｄ２およびＦ１を用いて試料を測定した場合の結果を図６－２に、試薬Ｄ１およびＦ２を用いて試料を測定した場合の結果を図６－３に示した。
　試料の希釈に試薬Ｄ１および試薬Ｄ２のどちらを用いた場合でも、ＨｂＡ１ｃ濃度とΔＡの間に良好な相関関係が成立した。したがって、αＦ６Ｐ酸化活性を示すアマドリアーゼを用いて、変性させたＨｂＡ１ｃを測定する場合には、ＨｂＡ１ｃを酸処理により変性させても、迅速かつ精確にＨｂＡ１ｃの定量を行えることが示された。また、変性用の酸性溶液中に非イオン性界面活性剤を共存させる場合、非イオン性界面活性剤の種類は限定されないことも示された。さらに、異なる種に由来する改変アマドリアーゼを用いてＨｂＡ１ｃを直接測定することができたことから、ＨｂＡ１ｃを直接測定するためのアマドリアーゼは、αＦ６Ｐに対して一定の反応性を示すものであれば、特に限定されないこともまた示された。
［実施例７］
（イオン性界面活性剤で前処理したＨｂＡ１ｃの定量）
　以下の組成を有するＨｂＡ１ｃ測定用試薬を調製し、Ｂｉｏ　Ｍａｊｅｓｔｙ　ＪＣＡ－ＢＭ１６５０（日本電子製）を利用して下記の通りＨｂＡ１ｃの測定を実施した。本実施例では、ＨｂＡ１ｃ試料の前処理液としてイオン性界面活性剤溶液を用いた。 
試料：ＨｂＡ１ｃ溶液
ＨｂＡ１ｃ認証実用標準物質ＪＣＣＲＭ４２３－９ｂ（検査医学標準物質機構製）
総ヘモグロビン濃度１３３ｇ／ｌ、
ＨｂＡ１ｃ濃度３レベル（ＮＧＳＰ値　５．６１％、７．７１％、１０．５５％）
試薬Ｇ１：試料前処理液
０．８０％　テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（東京化成工業製）
試薬Ｇ２：試料前処理液
０．７０％　ヘキサデシルトリメチルアンモニウムブロマイド（東京化成工業製）
試薬Ｈ１：ロイコ色素溶液
１２０ｍＭ　ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ６．５
１．６％　ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド（同仁化学研究所製）
０．１６ｍＭ　Ｎ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－４，４′－ ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム（ＤＡ－６４、和光純薬工業製）
試薬Ｈ２：ロイコ色素溶液
１２０ｍＭ　ＰＩＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ６．５
１．６％　ｎ－ドデシル－β－Ｄ－マルトシド（同仁化学研究所製）
０．１６ｍＭ　Ｎ－（カルボキシメチルアミノカルボニル）－４，４′－ ビス（ジメチルアミノ）ジフェニルアミンナトリウム（ＤＡ－６４、和光純薬工業製）
試薬Ｉ１：パーオキシダーゼ、ＣＦＰ－ＤＨ２溶液
１００ｍＭ　ＭＯＰＳ－ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ６．５
４０Ｕ／ｍｌ　パーオキシダーゼ（キッコーマン製）
１６０Ｕ／ｍｌ（５１ｍｇ／ｍｌ）ＣＦＰ－ＤＨ２（アマドリアーゼ３９）
試薬Ｉ２：パーオキシダーゼ、ＣＦＰ－ＤＨ２溶液
１００ｍＭ　ＰＩＰＥＳ－ＮａＯＨ緩衝液　ｐＨ６．５
４０Ｕ／ｍｌ　パーオキシダーゼ（キッコーマン製）
１６０Ｕ／ｍｌ　ＣＦＰ－ＤＨ２
　試薬Ｇ１で２５倍希釈した試料２５μｌを、１２５μｌの試薬Ｈ１に添加して３７℃で５分間インキュベートした後、５０μｌの試薬Ｉ１を添加してＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端の酸化により生じる過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させた。また、試料を試薬Ｇ２で２５倍希釈した場合は、希釈試料２５μｌを、１２５μｌの試薬Ｈ２に添加して３７℃で５分間インキュベートした後、５０μｌの試薬Ｉ２を添加してＨｂＡ１ｃのβ鎖アミノ末端の酸化により生じる過酸化水素の定量反応を３７℃で５分間進行させた。一例として、試薬Ｇ１で希釈した試料を試薬Ｈ１を混合してからの経過時間と吸光度の関係を図７－１に示したが、この場合、ＣＦＰ－ＤＨ２溶液（試薬Ｉ１）の添加直後から過酸化水素の生成に伴う吸光度上昇が確認できた。各ＨｂＡ１ｃ試料の測定結果から、試料のＨｂＡ１ｃ濃度（ＮＧＳＰ値）を横軸に、過酸化水素の定量反応前後の７５１ｎｍの光の吸光度差ΔＡを縦軸にプロットしたグラフを作成した。
　なお、ΔＡは下記の式に従って算出した。
ΔＡ＝（試薬Ｉ１またはＩ２添加５分後の吸光度）－（試薬Ｉ１またはＩ２添加直前の吸光度×０．７５）
　ここでは、試薬Ｉ１またはＩ２の添加により、反応液の容積が１．３３倍となるため、試薬Ｉ１またはＩ２添加直前の吸光度に０．７５を掛けたものを、試薬Ｉ１またはＩ２添加直後の吸光度と見なした。試薬Ｇ１を用いて試料を希釈した場合の結果を図８－１に、試薬Ｇ２を用いて試料を希釈した場合の結果を図８－２に示した。
　試料の希釈に試薬Ｇ１および試薬Ｇ２のどちらを用いた場合でも、ＨｂＡ１ｃ濃度とΔＡの間に良好な相関関係が成立した。したがって、αＦ６Ｐ酸化活性を示すアマドリアーゼを用いて、変性させたＨｂＡ１ｃを測定する場合には、ＨｂＡ１ｃをイオン性界面活性剤により変性させても、迅速かつ精確にＨｂＡ１ｃの定量を行えることが示された。また、本測定を実施する際にはＨｂＡ１ｃの変性に用いるイオン性界面活性剤の種類は限定されないことも示された。
　上記のようにＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３５は、野生型酵素（ＣＦＰ－Ｔ７）では基質とすることができなかったペプチド鎖長の長い糖化ペプチド（αＦ６Ｐ）も基質とした。このＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３５を用いて、ＨｂＡ１ｃからαＦ６Ｐを切り出すためのプロテアーゼ等での処理工程を経ずに、ＨｂＡ１ｃの直接測定を試みたところ、驚くべきことに、実施例５に記載のとおり試料中のＨｂＡ１ｃ濃度を決定することができた。ＨｂＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼは現在までに発見されておらず、その報告例は全くない。したがって、αＦ６Ｐを基質とするアマドリアーゼがＨｂＡ１ｃに直接作用することは驚くべき知見である。
　しかしながら、αＦ６Ｐを基質とするアマドリアーゼがＨｂＡ１ｃに直接作用する例が上記実施例において実証された以上、ＣＦＰ－Ｔ７－Ｈ３５と同様にαＦ６Ｐに対する活性を有する他のアマドリアーゼもまた、直接ＨｂＡ１ｃのβ鎖を基質とする可能性が示唆される。特にαＦ６Ｐに対する比活性の高いアマドリアーゼであれば、本発明のアマドリアーゼと同様にＨｂＡ１ｃに直接作用し、したがってＨｂＡ１ｃの定量測定に用いることができる蓋然性が高いと考えられる。
　これを検証したところ、実施例６に示すように、αＦ６Ｐに対する比活性が高いEFP-T5由来のアマドリアーゼ２８を用いた結果、この酵素もまたＨｂＡ１ｃに直接作用した（図６－３）。よってαＦ６Ｐに対する活性の高い本発明のアマドリアーゼと同様にＨｂＡ１ｃに直接作用し、したがってＨｂＡ１ｃの定量測定に用いることができることが実証された。他のαＦ６Ｐに対する比活性の高いアマドリアーゼについても同様と考えられる。上記では実験の便宜のために比活性が１．０Ｕ／ｍｇ以上の酵素を用いたが、当業者であれば、０．１Ｕ／ｍｇの比活性の酵素を１０倍量にて使用することもできる、と理解する。
　また、本発明の知見はαＦ６Ｐ活性を有するアマドリアーゼがＨｂＡ１ｃに直接作用しうることを示すに留まるものではなく、同様に、α－フルクトシルオリゴペプチド、例えばαＦ３Ｐ、αＦ４Ｐ、αＦ５Ｐ、αＦ７Ｐ、αＦ８Ｐ、αＦ１０Ｐ、αＦ１６Ｐ等に対する活性を示すアマドリアーゼであれば同様にＨｂＡ１ｃに直接作用する可能性がある。
　以上のとおり、本発明のアマドリアーゼを用いたＨｂＡ１ｃ測定方法は、ＨｂＡ１ｃのプロテアーゼ等での処理を必要とせず、ＨｂＡ１ｃを迅速、簡便に、かつ、精度よく良好に定量できる。また、変性させたＨｂＡ１ｃを測定する場合、ＨｂＡ１ｃを変性させる手法は特に制限を受けることはない。これにより酵素法によるＨｂＡ１ｃの直接測定が実現し、産業上の利用価値が期待される。
配列表の簡単な説明
配列番号１　Coniochaeta sp. NISL 9330アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号２　配列番号１のアマドリアーゼの塩基配列
配列番号３－３３　PCRプライマー
配列番号３４　PCRプライマー
配列番号３５　PCRプライマー
配列番号３６　Aspergillus oryzae RIB40　（FAOAo2）　アミノ酸配列
配列番号３７：　FAOAo2塩基配列
配列番号３８　Phaeosphaeria nodorum（PnFX）　アミノ酸配列
配列番号３９　PnFX塩基配列
配列番号４０　Eupenicillium terrenum（EFP-T5）アミノ酸配列
配列番号４１　EFP-T5塩基配列
配列番号４２－５３　PCRプライマー
配列番号５４　Neocosmospora vasinfecta（NvFX）アミノ酸配列
配列番号５５　NvFX塩基配列
配列番号５６－６１　PCRプライマー
配列番号６２　Ｓ５９Ｇ置換　Aspergillus nidulans（AnFX）　アミノ酸配列
配列番号６３　AnFX塩基配列
配列番号６４－８８　PCRプライマー
配列番号８９　Cryptococcus neoformans　（CnFX）　アミノ酸配列
配列番号９０　CnFX塩基配列
配列番号９１－９８　PCRプライマー
配列番号９９　Curvularia clavataケトアミンオキシダーゼと９５％の配列同一性を示すアマドリアーゼ（Cc95FX）　アミノ酸配列
配列番号１００　Cc95FX塩基配列
配列番号１０１－１１２　PCRプライマー
配列番号１１３　Pyrenochaeta sp.(Py)アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１１４　Pyrenochaeta sp.(Py)アマドリアーゼの塩基配列
配列番号１１５　Arthrinium sp.(Ar)アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１１６　Arthrinium sp.(Ar)アマドリアーゼの塩基配列
配列番号１１７　Curvularia clavata(Cc)アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１１８　Curvularia clavata(Cc)アマドリアーゼの塩基配列
配列番号１１９　Emericella nidulans(En)アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１２０　Emericella nidulans(En)アマドリアーゼの塩基配列
配列番号１２１　Ulocladium sp.(Ul)アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１２２　Ulocladium sp.(Ul)アマドリアーゼの塩基配列
配列番号１２３　Penicillium janthinellum(Pj)アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１２４　Penicillium janthinellum(Pj)アマドリアーゼの塩基配列
配列番号１２５　Aspergillus fumigatus Amadoriase Iのアミノ酸配列
配列番号１２６　Amadoriase I塩基配列
配列番号１２７　Aspergillus oryzae FAOAo1アミノ酸配列
配列番号１２８　FAOAo1塩基配列
配列番号１２９　Aspergillus fumigatus Amadoriase IIアミノ酸配列
配列番号１３０　Amadoriase II塩基配列
配列番号１３１　Aspergillus terreus FAOD-Aアミノ酸配列
配列番号１３２　FAOD-A塩基配列
配列番号１３３　CFP-T7-H20（R62D、D106K、Q110L、A113K）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１３４　CFP-T7-H20塩基配列
配列番号１３５　PnFPOX（S62D、D106K、G110L、A113K）Phaeosphaeria nodorum アミノ酸配列
配列番号１３６　配列番号１３５のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１３７　(アマドリアーゼ２９)NvFX-62D/106K/110L（R62D、G106K、E110L）Neocosmospora vasinfectaアミノ酸配列
配列番号１３８　配列番号１３７のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１３９　(アマドリアーゼ３０)AnFX-61D/105K/109L(S59G、R61D、G105K、K1091L）Aspergillus nidulans　アミノ酸配列
配列番号１４０　配列番号１３９のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１４１　（アマドリアーゼ２５）CFP-T7-H35（R62D、L63H、E102K、D106K、Q110L、A113K、A355S）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１４２　CFP-T7-H35塩基配列
配列番号１４３　（アマドリアーゼ２８）EFP-T5-62D/63H/106K/110L/113K/355S　Eupenicillium terrenumアミノ酸配列
配列番号１４４　配列番号１４３のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１４５　Eupenicillium terrenum野生型アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１４６　Eupenicillium terrenum野生型アマドリアーゼの塩基配列
配列番号１４７　AnFX　野生型アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１４８　AnFX　野生型アマドリアーゼの塩基配列
配列番号１４９　CnFX　野生型アマドリアーゼのアミノ酸配列
配列番号１５０　CnFX　野生型アマドリアーゼの塩基配列
配列番号１５１　（アマドリアーゼ１）CFP-T7-H1（R62A）Coniochaeta sp. アミノ酸配列
配列番号１５２　CFP-T7-H1塩基配列
配列番号１５３　（アマドリアーゼ２６）CFP-T7-62D（R62D)Coniochaeta sp. アミノ酸配列
配列番号１５４　CFP-T7-62D塩基配列
配列番号１５５（アマドリアーゼ２７）EFP-T5-R62D（R62D) Eupenicillium terrenum アミノ酸配列
配列番号１５６　EFP-T5-R62D塩基配列
配列番号１５７　（アマドリアーゼ２）CFP-T7-H2（R62A、Q110L）Coniochaeta sp. アミノ酸配列
配列番号１５８　CFP-T7-H2塩基配列
配列番号１５９　（アマドリアーゼ４）CFP-T7-H4（R62A、Q110Y）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１６０　CFP-T7-H4塩基配列
配列番号１６１　（アマドリアーゼ５）CFP-T7-H2-62N（R62N、Q110L）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１６２　CFP-T7-H2-62N塩基配列
配列番号１６３　（アマドリアーゼ６）CFP-T7-H6（R62D、Q110L）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１６４　CFP-T7-H6塩基配列
配列番号１６５　（アマドリアーゼ１２）CFP-T7-H10（R62D、D106A、Q110L）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１６６　CFP-T7-H10塩基配列
配列番号１６７　（アマドリアーゼ１３）CFP-T7-H11（R62D、D106K、Q110L）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１６８　CFP-T7-H11塩基配列
配列番号１６９　（アマドリアーゼ１４）CFP-T7-H12（R62D、D106R、Q110L）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１７０　CFP-T7-H12塩基配列
配列番号１７１　（アマドリアーゼ１５）CFP-T7-H13（R62D、Q110L、A113K）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１７２　CFP-T7-H13塩基配列
配列番号１７３　（アマドリアーゼ１６）CFP-T7-H14（R62D、Q110L、A113R）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１７４　CFP-T7-H14塩基配列
配列番号１７５　（アマドリアーゼ１８）CFP-T7-H21(R62D、D106K、Q110L、A113R)Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１７６　CFP-T7-H21塩基配列
配列番号１７７　（アマドリアーゼ１９）CFP-T7-H24（R62D、L63A、D106K、Q110L、A113K）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１７８　CFP-T7-H24塩基配列
配列番号１７９　（アマドリアーゼ２１）CFP-T7-H26（R62D、L63H、D106K、Q110L、A113K）Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１８０　CFP-T7-H26塩基配列
配列番号１８１　（アマドリアーゼ２３）CFP-T7-H28（R62D、L63H、E102K、D106K、Q110L、A113K）　Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１８２　CFP-T7-H28塩基配列
配列番号１８３　（アマドリアーゼ２４）CFP-T7-H29（R62D、L63H、D106K、Q110L、A113K、A419K）　Coniochaeta sp.アミノ酸配列
配列番号１８４　CFP-T7-H29塩基配列
配列番号１８５　（アマドリアーゼ３１）（AnFX-61D/62H/101K/105K/109L/112K/355S）Aspergillus nidulansアミノ酸配列
配列番号１８６　配列番号１８５のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１８７　（アマドリアーゼ３３）（PnFX-62D/63H/106K/110L/113K/351S）Phaeosphaeria nodorumアミノ酸配列
配列番号１８８　配列番号１８７のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１８９　（アマドリアーゼ３４）（CnFX-62D/106K/110L/113K）Cryptococcus neoformansアミノ酸配列
配列番号１９０　配列番号１８９のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１９１　（アマドリアーゼ３５）（Cc95FX-62D/63H/106K/110L/113K/353S）Curvularia clavataアミノ酸配列
配列番号１９２　配列番号１９１のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号１９３－１９８　ＰＣＲプライマー
配列番号１９９　CFP-DH1(Coniochaeta sp. NISL 9330由来)（改変型アマドリアーゼ３６、CFP-T7-H36）（CFP-T7-R62D/L63H/D68N/E102K/D106K/Q110L/A113K/A355S/E44P/E133A/E253K/V257C/N262H/Q337K/E340P/ΔP435/ΔK436/ΔL437）のアミノ酸配列
配列番号２００　配列番号１９９のアミノ酸配列をコードする塩基配列
配列番号２０１－２０２　ＰＣＲプライマー
配列番号２０３　CFP-DH2(Coniochaeta sp. NISL 9330由来)（アマドリアーゼ３９）のアミノ酸配列
配列番号２０４　配列番号２０３のアミノ酸配列をコードする塩基配列。
　本明細書で引用した全ての刊行物、特許および特許出願をそのまま参考として本明細書にとり入れるものとする。

Claims (26)

  1. 　試料にヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼを作用させ、その作用によって生じる過酸化水素もしくは消費される酸素を測定することを特徴とする、試料中のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
  2. 　前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、α－フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するものである、請求項１に記載の方法。
  3. 　前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、α－フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有し、かつ、以下の(i)～(iii)からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
    (i)　アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸配列の以下（ａ）から（j）よりなる群から選択される位置に対応する位置で当該アマドリアーゼのアミノ酸配列が１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を有するアマドリアーゼ、
    （ａ）配列番号１の６２位、
    （ｂ）配列番号１の６３位、
    （ｃ）配列番号１の１０２位、
    （ｄ）配列番号１の１０６位、
    （ｅ）配列番号１の１１０位、
    （ｆ）配列番号１の１１３位、
    （ｇ）配列番号１の３５５位、
    （ｈ）配列番号１の４１９位、
    （ｉ）配列番号１の６８位、
    （ｊ）配列番号１の３５６位、
    (ii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における６２位、６３位、１０２位、１０６位、１１０位、１１３位、３５５位、４１９、６８位及び３５６位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなるアマドリアーゼ、
    (iii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１の第１０位～３２位、３６～４１位、４９～５２位、５４～５８位、６３～６５位、７３～７５位、８４～８６位、８８～９０位、１２０～１２２位、１４５～１５０位、１５６～１６２位、１６４～１７０位、１８０～１８２位、２０２～２０５位、２０７～２１１位、２１４～２２４位、２２７～２３０位、２３６～２４１位、２４３～２４８位、２５８～２６１位、２６６～２６８位、２７０～２７３位、２７５～２８７位、２９５～２９７位、３０６～３０８位、３１０～３１６位、３２４～３２９位、３３２～３３４位、３４１～３４４位、３４６～３５５位、３５７～３６３位、３７０～３８３位、３８５～３８７位、３８９～３９４位、４０５～４１０位及び４２３～４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有するアマドリアーゼ、
    である、請求項１又は２に記載の方法。
  4. 　前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の以下（a）から（j）よりなる群から選択される１つまたはそれ以上の位置に対応する位置のアミノ酸が以下の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α－フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼ、
    （a）配列番号１の６２位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、スレオニン又はプロリンである、
    （b）配列番号１の６３位に対応する位置のアミノ酸がアラニン又はヒスチジンである、
    （c）配列番号１の１０２位に対応する位置のアミノ酸がリジンである、
    （d）配列番号１の１０６位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、リジン又はアルギニンである、
    （e）配列番号１の１１０位に対応する位置のアミノ酸がロイシン又はチロシンである、
    （f）配列番号１の１１３位に対応する位置のアミノ酸がリジン又はアルギニンである、
    （g）配列番号１の３５５位に対応する位置のアミノ酸がセリンである、
    （h）配列番号１の４１９位に対応する位置のアミノ酸がリジンである、
    (i) 配列番号１の６８位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンである、
    (j) 配列番号１の３５６位に対応する位置のアミノ酸がスレオニンである、
    である、請求項３に記載の方法。
  5. 　前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の（a）から（j）よりなる群から選択される２以上の位置に対応する位置のアミノ酸が、当該（a）から（j）の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α－フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼである、請求項４に記載の方法。
  6. 　前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の（a）から（j）よりなる群から選択される３以上の位置に対応する位置のアミノ酸が、当該（a）から（j）の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α－フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼである、請求項５に記載の方法。
  7. 　前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の（a）から（j）よりなる群から選択される４以上の位置に対応する位置のアミノ酸が、当該（a）から（j）の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α－フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼである、請求項６に記載の方法。
  8. 　前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の（a）から（j）よりなる群から選択される５以上の位置に対応する位置のアミノ酸が、当該（a）から（j）の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α－フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼである、請求項７に記載の方法。
  9. 　前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の（a）から（j）よりなる群から選択される６以上の位置に対応する位置のアミノ酸が、当該（a）から（j）の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α－フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼである、請求項８に記載の方法。
  10. 　ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼがコニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、またはペニシリウム(Penicillium)属由来である、請求項１～９のいずれか１項に記載の試料中のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
  11. 　ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼがコニオカエタ　エスピー(Coniochaeta sp.)、ユーペニシリウム　テレナム(Eupenicillium terrenum)、ピレノケータ　エスピー(Pyrenochaeta sp.)、アルスリニウム　エスピー(Arthrinium sp.)、カーブラリア　クラベータ(Curvularia clavata)、ネオコスモスポラ　バシンフェクタ(Neocosmospora vasinfecta)、クリプトコッカス　ネオフォルマンス(Cryptococcus neoformans)、フェオスフェリア　ノドラム(Phaeosphaeria nodorum)、アスペルギルス　ニードランス(Aspergillus nidulans)、エメリセラ　ニードランス(Emericella nidulans)属、ウロクラディウム　エスピー(Ulocladium sp.)、またはペニシリウム ヤンシネラム(Penicillium janthinelum)もしくはペニシリウム クリソゲナム（Penicillium chrysogenum）由来である、請求項１～１０のいずれか１項に記載の試料中のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。
  12. 　ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、以下からなる群より選択されるアマドリアーゼである、請求項１に記載の試料中のヘモグロビンＡ１ｃの測定方法。 
    (i)　配列番号１４１又は１４３に示すアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸の置換、欠失又は付加がなされたアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ。 
    (ii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１４１又は１４３のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１４１の第１０位～３２位、３６～４１位、４９～５２位、５４～５８位、７３～７５位、８４～８６位、８８～９０位、１２０～１２２位、１４５～１５０位、１５６～１６２位、１６４～１７０位、１８０～１８２位、２０２～２０５位、２０７～２１１位、２１４～２２４位、２２７～２３０位、２３６～２４１位、２４３～２４８位、２５８～２６１位、２６６～２６８位、２７０～２７３位、２７５～２８７位、２９５～２９７位、３０６～３０８位、３１０～３１６位、３２４～３２９位、３３２～３３４位、３４１～３４４位、３４６～３５５位、３５７～３６３位、３７０～３８３位、３８５～３８７位、３８９～３９４位、４０５～４１０位及び４２３～４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有するアマドリアーゼ。
  13. 　アマドリアーゼがさらに、配列番号１に示すアミノ酸配列における以下のアミノ酸、
    （i）２６２位のアスパラギン、
    （ii）２５７位のバリン、
    （iii）２４９位のグルタミン酸
    （iv）２５３位のグルタミン酸、
    （v）３３７位のグルタミン、
    （vi）３４０位のグルタミン酸、
    （vii）２３２位のアスパラギン酸、
    （viii）１２９位のアスパラギン酸、
    （ix）１３２位のアスパラギン酸、
    （x）１３３位のグルタミン酸、
    （xi）４４位のグルタミン酸、
    （xii）２５６位のグリシン、
    （xiii）２３１位のグルタミン酸、及び
    （xiv）８１位のグルタミン酸、
    よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を有し、かつ
    　場合によりカルボキシル末端からの3アミノ酸残基を欠失していてもよい、請求項３～１２のいずれか１項に記載の測定方法。
  14. 　以下の（１）および（２）の成分を含むことを特徴とする、試料中のヘモグロビンＡ１ｃの測定用試薬キット。
    （１）ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用して、過酸化水素を生成する作用を有するアマドリアーゼ。
    （２）過酸化水素を測定するための試薬。
  15. 　前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、α－フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するものである、請求項１４に記載のキット。
  16. 　前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、α－フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有し、かつ、以下の(i)～(iii)からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
    (i)　アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸配列の以下（ａ）から（j）よりなる群から選択される位置に対応する位置で当該アマドリアーゼのアミノ酸配列が１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を有するアマドリアーゼ、
    （ａ）配列番号１の６２位、
    （ｂ）配列番号１の６３位、
    （ｃ）配列番号１の１０２位、
    （ｄ）配列番号１の１０６位、
    （ｅ）配列番号１の１１０位、
    （ｆ）配列番号１の１１３位、
    （ｇ）配列番号１の３５５位、
    （ｈ）配列番号１の４１９位、
    （ｉ）配列番号１の６８位、
    （ｊ）配列番号１の３５６位、
    (ii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における６２位、６３位、１０２位、１０６位、１１０位、１１３位、３５５位、４１９、６８位及び３５６位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなるアマドリアーゼ、
    (iii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１の第１０位～３２位、３６～４１位、４９～５２位、５４～５８位、６３～６５位、７３～７５位、８４～８６位、８８～９０位、１２０～１２２位、１４５～１５０位、１５６～１６２位、１６４～１７０位、１８０～１８２位、２０２～２０５位、２０７～２１１位、２１４～２２４位、２２７～２３０位、２３６～２４１位、２４３～２４８位、２５８～２６１位、２６６～２６８位、２７０～２７３位、２７５～２８７位、２９５～２９７位、３０６～３０８位、３１０～３１６位、３２４～３２９位、３３２～３３４位、３４１～３４４位、３４６～３５５位、３５７～３６３位、３７０～３８３位、３８５～３８７位、３８９～３９４位、４０５～４１０位及び４２３～４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有するアマドリアーゼ、
    である、請求項１４又は１５に記載のキット。
  17. 　前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の以下（a）から（j）よりなる群から選択される１つまたはそれ以上の位置に対応する位置のアミノ酸が以下の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α－フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼ、
    （a）配列番号１の６２位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、アスパラギン酸、アスパラギン、グルタミン、グルタミン酸、グリシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、システイン、セリン、スレオニン又はプロリンである、
    （b）配列番号１の６３位に対応する位置のアミノ酸がアラニン又はヒスチジンである、
    （c）配列番号１の１０２位に対応する位置のアミノ酸がリジンである、
    （d）配列番号１の１０６位に対応する位置のアミノ酸がアラニン、リジン又はアルギニンである、
    （e）配列番号１の１１０位に対応する位置のアミノ酸がロイシン又はチロシンである、
    （f）配列番号１の１１３位に対応する位置のアミノ酸がリジン又はアルギニンである、
    （g）配列番号１の３５５位に対応する位置のアミノ酸がセリンである、
    （h）配列番号１の４１９位に対応する位置のアミノ酸がリジンである、
    (i) 配列番号１の６８位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンである、
    (j) 配列番号１の３５６位に対応する位置のアミノ酸がスレオニンである、
    である、請求項１６に記載のキット。
  18. 　前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の（a）から（j）よりなる群から選択される２以上の位置に対応する位置のアミノ酸が、当該（a）から（j）の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α－フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼである、請求項１７に記載のキット。
  19. 　前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の（a）から（j）よりなる群から選択される３以上の位置に対応する位置のアミノ酸が、当該（a）から（j）の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α－フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼである、請求項１８に記載のキット。
  20. 　前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の（a）から（j）よりなる群から選択される４以上の位置に対応する位置のアミノ酸が、当該（a）から（j）の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α－フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼである、請求項１９に記載のキット。
  21. 　前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の（a）から（j）よりなる群から選択される５以上の位置に対応する位置のアミノ酸が、当該（a）から（j）の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α－フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼである、請求項２０に記載のキット。
  22. 　前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用するアマドリアーゼが、アマドリアーゼのアミノ酸配列を配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１記載のアミノ酸の（a）から（j）よりなる群から選択される６以上の位置に対応する位置のアミノ酸が、当該（a）から（j）の各々に記載されるアミノ酸残基であり、かつ、α－フルクトシルバリルヒスチジルロイシルスレオニルプロリルグルタミン酸（αＦ６Ｐ）に対し０．１Ｕ／ｍｇ以上の比活性を有するアマドリアーゼである、請求項２１に記載のキット。
  23. 　前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用して、過酸化水素を生成する作用を有するアマドリアーゼが、コニオカエタ(Coniochaeta)属、ユーペニシリウム(Eupenicillium)属、ピレノケータ(Pyrenochaeta)属、アルスリニウム(Arthrinium)属、カーブラリア(Curvularia)属、ネオコスモスポラ(Neocosmospora)属、クリプトコッカス(Cryptococcus)属、フェオスフェリア(Phaeosphaeria)属、アスペルギルス(Aspergillus)属、エメリセラ(Emericella)属、ウロクラディウム(Ulocladium)属、またはペニシリウム(Penicillium)属由来である、請求項１４～２２のいずれか１項に記載のキット。
  24. 　前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用して、過酸化水素を生成する作用を有するアマドリアーゼが、
    (i)　配列番号１４１又は１４３に示すアミノ酸配列に１又は数個のアミノ酸の置換、欠失又は付加がなされたアミノ酸配列を有するアマドリアーゼ、または
    (ii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１４１又は１４３のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１４１の第１０位～３２位、３６～４１位、４９～５２位、５４～５８位、７３～７５位、８４～８６位、８８～９０位、１２０～１２２位、１４５～１５０位、１５６～１６２位、１６４～１７０位、１８０～１８２位、２０２～２０５位、２０７～２１１位、２１４～２２４位、２２７～２３０位、２３６～２４１位、２４３～２４８位、２５８～２６１位、２６６～２６８位、２７０～２７３位、２７５～２８７位、２９５～２９７位、３０６～３０８位、３１０～３１６位、３２４～３２９位、３３２～３３４位、３４１～３４４位、３４６～３５５位、３５７～３６３位、３７０～３８３位、３８５～３８７位、３８９～３９４位、４０５～４１０位及び４２３～４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有するアマドリアーゼ
    である、請求項１４～２３のいずれか１項に記載のキット。
  25. 　前記ヘモグロビンＡ１ｃに直接作用して、過酸化水素を生成する作用を有するアマドリアーゼがさらに配列番号１に示すアミノ酸配列における以下のアミノ酸、
    （i）２６２位のアスパラギン、
    （ii）２５７位のバリン、
    （iii）２４９位のグルタミン酸
    （iv）２５３位のグルタミン酸、
    （v）３３７位のグルタミン、
    （vi）３４０位のグルタミン酸、
    （vii）２３２位のアスパラギン酸、
    （viii）１２９位のアスパラギン酸、
    （ix）１３２位のアスパラギン酸、
    （x）１３３位のグルタミン酸、
    （xi）４４位のグルタミン酸、
    （xii）２５６位のグリシン、
    （xiii）２３１位のグルタミン酸、及び
    （xiv）８１位のグルタミン酸、
    よりなる群から選択されるアミノ酸に対応する位置で１つまたはそれ以上のアミノ酸残基の置換を有し、かつ
    　場合によりカルボキシル末端からの3アミノ酸残基を欠失していてもよい、請求項１６～２４のいずれか１項に記載のキット。
  26. 　以下からなる群より選択されるアマドリアーゼ、
    (i)　アマドリアーゼのアミノ酸配列を、配列番号１記載のアミノ酸配列とアライメントしたときに、配列番号１に示すアミノ酸配列における６８位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンであるか、配列番号１に示すアミノ酸配列における３５６位に対応する位置のアミノ酸がスレオニンであり、かつα－フルクトシルヘキサペプチド（αＦ６Ｐ）に対する活性を有するアマドリアーゼ、
    (ii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における６８位又は３５６位に対応する位置以外の位置における１又は数個のアミノ酸が置換、欠失又は付加されたアミノ酸配列からなり、かつαＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ、
    (iii)　前記(i)のアマドリアーゼにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列における６８位に対応する位置のアミノ酸がアスパラギンであるか、配列番号１に示すアミノ酸配列における３５６位に対応する位置のアミノ酸がスレオニンであり、かつ、当該アマドリアーゼの全長アミノ酸配列が配列番号１のアミノ酸配列と７０％以上の配列同一性を有し、配列番号１の第１０位～３２位、３６～４１位、４９～５２位、５４～５８位、６３～６５位、７３～７５位、８４～８６位、８８～９０位、１２０～１２２位、１４５～１５０位、１５６～１６２位、１６４～１７０位、１８０～１８２位、２０２～２０５位、２０７～２１１位、２１４～２２４位、２２７～２３０位、２３６～２４１位、２４３～２４８位、２５８～２６１位、２６６～２６８位、２７０～２７３位、２７５～２８７位、２９５～２９７位、３０６～３０８位、３１０～３１６位、３２４～３２９位、３３２～３３４位、３４１～３４４位、３４６～３５５位、３５７～３６３位、３７０～３８３位、３８５～３８７位、３８９～３９４位、４０５～４１０位及び４２３～４３１位のアミノ酸配列からなる相同性領域におけるアミノ酸配列と当該アマドリアーゼの対応する位置の相同性領域におけるアミノ酸配列とが９０％以上の配列同一性を有し、αＦ６Ｐに対する活性を有するアマドリアーゼ。
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