WO2014054494A1 - 微生物培養器、微生物検査キット、透析液の検査方法、微生物の培養方法、微生物の検査方法、及び微生物培養器の製造方法 - Google Patents

微生物培養器、微生物検査キット、透析液の検査方法、微生物の培養方法、微生物の検査方法、及び微生物培養器の製造方法 Download PDF

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culture
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sterilization
culture bag
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裕一 恩地
正志 牛山
根玄 青木
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Definitions

  • This application discloses a microorganism incubator, a microorganism inspection kit, a dialysate inspection method, a microorganism culture method, a microorganism inspection method, and a microorganism incubator manufacturing method.
  • Microorganisms are cultured using various media.
  • the medium include a liquid medium and an agar medium that have been generally used.
  • the liquid culture medium has no limitation on the amount of sample, but has a drawback that it is not quantitative and bulky.
  • the upper limit of the amount of the sample solution in a petri dish having a diameter of 90 mm that is normally used for an agar medium is usually 1 mL, and it is difficult to inspect the sample solution exceeding 1 mL. Therefore, when inspecting a sample having a relatively low microorganism concentration, in order to inspect with a sample solution of about 1 mL, first, the original sample is subjected to enrichment culture and then subjected to the inspection.
  • a sensitivity of 1 cfu / 25 g is required for the inspection of food poisoning bacteria such as Salmonella.
  • dialysis water dialysis water
  • a large amount of samples may be required for testing.
  • dialysis water is required to have a high sensitivity capable of detecting less than one microorganism in 1 mL of a sample. If a sample solution exceeding 1 mL, for example 10 to 100 mL, can be directly and quantitatively tested for microorganisms. Simple and desirable.
  • a microorganism incubator containing a sheet-like medium in a bag-like container is, for example, a sterilized microorganism incubator by opening a zipper at the opening of the bag-like container and placing it in an atmosphere of sterilization gas. be able to.
  • the microorganism incubator sterilized in this way may have foreign substances such as microorganisms enter the container through the opening until the opening is closed after the sterilization.
  • the bag-like container using zippers as the opening / closing material of the opening portion has low hermeticity, foreign substances may enter even when the opening portion is closed. It is difficult to put a large amount of a sample having a small number of bacteria in order to detect bacteria.
  • the present application provides a microorganism culture device, a microorganism test kit, a dialysate test method, a microorganism culture method, a microorganism test method, and a microorganism culture that can suppress the presence of invading foreign substances and can contain a large amount of sample. It aims at providing the manufacturing method of a vessel.
  • the present invention has provided an inlet for putting a sample in a culture bag separately from an opening portion for putting a medium inside.
  • the present invention is a microbial incubator including a culture bag with an inlet filled with a sheet-like culture medium and sealed.
  • a microbial incubator including a culture bag with an inlet filled with a sheet-like culture medium and sealed.
  • a sample when a sample is placed in a culture bag, it is inserted through an injection port through which foreign matter is difficult to pass compared to an opened portion where the medium can be taken in and out. It is suppressed.
  • the container is highly sealed and difficult to leak out, a large amount of sample can be placed.
  • the inlet of the culture section may be any one that can be sealed after the sample has been injected.
  • spout screw cap, push-in cap, crown, rubber plug, urethane plug Any one or more of a silicon stopper, a cork stopper, a Molton stopper, a cotton stopper, a paper stopper, a three-way cock, a fastener, a chuck and a zipper can be applied.
  • the microorganism culture device may include a culture bag with an inlet sealed with a sheet-like culture medium inside, and a sterilization bag with the culture bag sealed inside. .
  • a microbial incubator since the sterilization state outside the culture bag is maintained by the sterilization bag, there is a low possibility that a foreign substance will enter the culture bag when the sample is put into the culture bag.
  • the microorganism culture vessel is for detecting aerobic bacteria
  • the culture bag may be formed of an oxygen permeable material. If the culture bag is formed of an oxygen permeable material, oxygen is supplied from the outside to the inside of the culture bag, so that aerobic bacteria can be grown.
  • the microorganism culture vessel is for detecting anaerobic bacteria
  • the culture bag may be formed of an oxygen-impermeable material. If the culture bag is made of an oxygen-impermeable material, oxygen is not supplied from the outside to the inside of the culture bag, so that anaerobic bacteria can be grown.
  • the microorganism incubator is for detecting microorganisms contained in the dialysate or reverse osmosis water
  • the culture medium in the culture bag is a predetermined supplement for supplementing the nutrient components contained in the dialysate or reverse osmosis water. It may have a nutritional component. If the medium has a predetermined supplemental nutrient component that supplements the nutrient component originally contained in the dialysate, it is grown in a culture bag without killing microorganisms in the dialysate due to overnutrition. It is possible.
  • the predetermined supplementary nutrients contained in the culture medium in the culture bag are, for example, 0.1 to 3.0 g of peptone, 0.1 to 3.0 g of yeast extract, and 0.1 to 0 per square meter.
  • 0.5 g casein degradation product 0-0.5 g glucose, 0.075-0.3 g sodium pyruvate, 0-0.3 g dipotassium phosphate, 0.1-0.5 g It may be soluble starch, 0.01-0.05 g magnesium sulfate, 0.015-0.1 g tetrazolium salt or 0.15-1.0 g indoxyl derivative. If such a component is contained in the culture medium, microorganisms in the dialysate or reverse osmosis water can be grown in the culture bag.
  • the predetermined supplementary nutrients contained in the culture medium in the culture bag are, for example, 0.38 to 9.0 g of meat extract or fish extract, 0.63 to 15.0 g of tryptone, 0 to It may be 3.0 g glucose, 0-0.3 g dipotassium phosphate, 0.015-0.1 g tetrazolium salt or 0.15-1.0 g indoxyl derivative. If such a component is contained in the culture medium, microorganisms in the dialysate or reverse osmosis water can be grown in the culture bag.
  • the predetermined supplementary nutrients contained in the culture medium in the culture bag are, for example, 2.5 to 40.0 g of malt extract, 0 to 40.0 g of glucose, and 0.25 to 4.0 g per square meter.
  • the present invention can also be understood from the aspect as a microorganism testing kit including any one of the above microorganism incubators.
  • the present invention can be understood from the aspect as a method for inspecting dialysate.
  • the present invention is sealed in a sterilization bag of a microorganism incubator provided with a culture bag with an inlet filled with a sheet-like culture medium and sealed, and a sterilization bag with the culture bag sealed inside.
  • It may be a dialysate testing method in which microorganisms are cultured and the presence or amount of the cultured microorganisms is tested.
  • the present invention can be grasped from the aspect as a microorganism culturing method.
  • the present invention is sealed in a sterilization bag of a microorganism incubator provided with a culture bag with an inlet filled with a sheet-like culture medium and sealed, and a sterilization bag with the culture bag sealed inside.
  • a sterilization bag of a microorganism incubator provided with a culture bag with an inlet filled with a sheet-like culture medium and sealed, and a sterilization bag with the culture bag sealed inside.
  • Remove the stopped culture bag from the sterile bag open the culture bag inlet, put the sample solution into the culture bag from the inlet, seal the inlet and place the culture bag under microbial culture conditions. It may be a method for culturing microorganisms.
  • the present invention can be grasped from the aspect as a microbe inspection method.
  • the present invention may be a microorganism testing method for testing the presence or amount of microorganisms cultured by the microorganism cultivation method.
  • the present invention can be understood from the aspect as a method for producing a microorganism incubator.
  • the present invention is a method for producing a microorganism incubator comprising a culture bag with an inlet filled with a sheet-like culture medium and sealed, and a sterilization bag sealed with the culture bag inside.
  • the culture bag in which the culture medium is put inside from the opened part of the culture bag is housed in a gas-permeable sterilization bag, the sterilization bag is sealed, and the sealed sterilization bag is placed in a sterilized gas atmosphere. Sterilize the medium in the culture bag contained in the sterilization bag, and close the opened part of the culture bag from the outside of the sterilization bag with the sterilization bag containing the culture bag sealed.
  • the culture bag containing the sterilized medium may be sealed.
  • a bag using a small opening portion such as a cap having a high sealing property as an injection port
  • a sterilized microorganism incubator is prepared by storing a sheet-shaped medium in a sterilized container and placing it in a sterilized gas atmosphere, the size of the opening is small. Is likely to remain. If sterilization gas remains in the bag-like container, it affects the growth of microorganisms to be cultured. It is difficult to completely remove the residual gas from the container even if a gas-permeable material is used for the bag-like container.
  • the microorganism incubator is manufactured by such a method, the culture bag is kept in the sterile bag until the culture bag is sealed after the medium is sterilized. Therefore, the possibility that foreign matter enters the culture bag after sterilization is extremely low.
  • the microorganism incubator is manufactured by such a method, the culture bag remains in the sterilization bag until the culture bag is sealed after the medium is sterilized. The open part of the culture bag can be enlarged, and the sterilization gas remaining in the culture bag can be attracted and removed from the outside of the sterilization bag through the sterilization bag having gas permeability.
  • the method for producing a microorganism incubator may be such that after the sterilization process and before the sealing process, the sterilized bag subjected to the sterilization process is placed in a vacuum to further remove the sterilization gas remaining in the sterilization bag. Good. If the removal treatment is further performed, it is possible to produce a microorganism incubator in which residual sterilization gas is suppressed.
  • the method for manufacturing the microorganism culture device may be a method in which the culture bag is further taken out from the sterilization bag. If the removal process is further performed, it is possible to distribute the sterilized culture bags.
  • the inner surface of the culture bag is made of a material that can be heat-welded at least at a lower temperature than the material that forms the inner surface of the sterilization bag among the materials that form the sterilization bag.
  • the culture bag may be heated in a state of being closed from the outside to seal the culture bag. If the sealing process is performed by heat welding from the outside of the sterilization bag, the sealing process is easy, and the sealing property of the culture bag can be improved and the entry of foreign substances can be more reliably suppressed.
  • FIG. 6 is an example of a cross-sectional view of a sterilization bag when cut along a line indicated by AA in FIG. 5. It is an example of the figure which showed a mode that the culture bag containing the culture medium was sealed.
  • FIG. 9 is an example of a cross-sectional view of a sterilization bag and a culture bag when cut along the line indicated by reference numeral BB in FIG. 8. It is an example of the figure which showed a mode that the culture bag was taken out from a sterilization bag. It is an example of the figure which showed a mode that the sample was put in a culture bag. It is an example of the figure which showed the culture bag which concerns on a 1st modification. It is an example of the figure which showed the culture bag which concerns on a 2nd modification. It is an example of the figure which showed the culture bag which concerns on a 3rd modification.
  • FIG. 1 is an example of an external view of a microorganism incubator according to an embodiment.
  • the microorganism incubator 1 is a microorganism incubator in which a sheet-shaped medium 20 is put in a bag-shaped culture bag 10 and is accommodated in a sterilization bag 30.
  • the microorganism culture device 1 is not limited to the one provided with the sterilization bag 30 that accommodates the culture bag 10, and the sterilization bag 30 may be omitted.
  • the microbial incubator 1 may constitute all or part of a microbial test kit appropriately including convenient items when testing bacteria.
  • the culture bag 10 is provided with an inlet 11 for injecting a sample into the container.
  • the culture bag 10 is formed by welding the edges of two sheets of sheet-like material (for example, a heat-meltable material such as Polymer), and the edge portions 12A and 12B are welded as shown in FIG. Has been.
  • the sterilization bag 30 is formed by welding the edges of two stacked sheets of material, and the edge portions 31A and 31B are welded as shown in FIG.
  • the sample does not leak when the sample is added, is liquid impervious, and has oxygen permeability that allows aerobic bacteria to grow. Further, it is preferably transparent or translucent in order to observe the growth of microorganisms.
  • oxygen permeability is 3mL / m 2/24 hours or more.
  • a resin film such as Polymer as described above can be used.
  • the thickness of the film at that time is suitably in the range of 150 ⁇ m.
  • the resin include polyethylene, polypropylene, and composites thereof. For example, when using polypropylene, the thickness is desirably 150 ⁇ m or less from the viewpoint of gas permeability.
  • the shape of the culture bag 10 is not particularly limited. For example, a square such as a square or a rectangle is convenient for mass production.
  • the size of the culture bag 10 can be determined freely according to the amount of the sample. For example, if the assumed amount of the sample is 10 mL, a culture bag of about 100 ⁇ 120 mm to 160 ⁇ 200 mm is prepared. This is convenient.
  • the injection port 11 of the culture bag 10 may be any as long as the sample can be injected into the container, and in addition to caps having excellent sealing properties, for example, zippers may be used.
  • the microorganism incubator 1 can be manufactured, for example, by the following manufacturing process.
  • FIG. 2 is an example of a diagram showing a state in which the culture medium 20 is put into the culture bag 10.
  • the culture medium 20 is put into the culture bag 10 from the open portion 13 before the edge portion 12B is welded.
  • FIG. 3 is an example of a diagram illustrating a state in which the culture bag 10 in which the medium 20 is placed is accommodated in the sterilization bag 30. After the culture medium 20 is put in the culture bag 10, the culture bag 10 with the open portion 13 open is put into the sterile bag 30 from the open portion 32 before the edge portion 31B is welded.
  • FIG. 4 is an example of a diagram showing a state in which the sterilization bag 30 containing the culture bag 10 is sealed. After the culture bag 10 is accommodated in the sterilization bag 30, the open portion 32 is closed with the welding sealer 2 and the sterilization bag 30 is sealed. Thereby, the sterilization bag 30 will be in the state by which two sheet-like raw materials which comprise the sterilization bag 30 mutually weld by the edge part 31B shown in FIG. 1, and the sterilization bag 30 was sealed.
  • FIG. 5 is an example of a diagram showing the sterilization bag 30 after the open portion 32 is closed with the welding sealer 2.
  • the inside of the sterilization bag 30 is closed over the entire circumference by the edge portions 31A and 31B. Accordingly, the culture bag 10 in the sterilization bag 30 is isolated from microorganisms and other foreign matters outside the sterilization bag 30.
  • FIG. 6 is an example of a cross-sectional view of the sterilization bag 30 taken along the line AA in FIG.
  • the sterilization bag 30 is formed of one of the two sheet-like materials constituting the sterilization bag 30 with a gas permeable sheet 31, and the other can be fused to the sheet 31. It is made of a heat-meltable film 33. Since the sterilization bag 30 is configured as described above, the open portion 32 can be closed by the welding sealer 2, and the sterilization bag 30 can be placed in a predetermined gas atmosphere even when the open portion 13 is closed. For example, the predetermined gas permeates the sheet 31, and the contents in the sterilization bag 30 can be exposed to the predetermined gas.
  • the sterilization bag 30 that has been sealed by closing the open portion 32 with the welding sealer 2 is placed in an atmosphere of sterilization gas, and the outside of the culture bag 10 accommodated in the sterilization bag 30.
  • the medium 20 and the like in the culture bag 10 are sterilized.
  • the sterilization bag 30 By placing the sterilization bag 30 in an atmosphere of sterilization gas, microorganisms attached to the outside and inside of the culture bag 10 accommodated in the sterilization bag 30, the medium 20 in the culture bag 10, etc. are killed.
  • the gas permeable sheet 31 of the sterilization bag 30 is provided with indicators such as ink that changes color when the gas comes into contact with the sterilization bag 30, whether or not the microorganism incubator 1 has been sterilized. Discrimination is easy.
  • the sterilization treatment include the following treatments. That is, for example, indicators that change color when in contact with gas are attached to an appropriate location such as the culture bag 10 or the sterilization bag 30, and the sterilization bag 30 containing the culture bag 10 is inserted into a sterilizer.
  • the temperature setting of the sterilizer is, for example, about 45 ° C.
  • the door of the sterilizer is closed and the inside of the can is depressurized (for example, a gauge pressure of about ⁇ 0.085 MPa) to make a vacuum state.
  • EO (ethylene oxide) gas is introduced up to a predetermined pressure (for example, a gauge pressure of 0.110 MPa).
  • a predetermined time for example, 12 hours after reaching the set pressure
  • the sterilization action gradually proceeds in the sterilizer.
  • the inside of the sterilizer is degassed and evacuated. Since the edge portion 12B of the culture bag 10 is not welded and the open portion 13 remains open, the EO gas is quickly discharged without remaining in the culture bag 10.
  • evacuation air is supplied to perform air replacement. Then, such evacuation and air replacement are further performed twice, and aeration is performed three times in total. Then, open the door of the sterilizer, take out the product, and check the discoloration of the indicator. If the discoloration of the indicator is confirmed, the sterilization process is completed.
  • FIG. 7 is an example of a diagram showing a state in which the culture bag 10 containing the culture medium 20 is sealed.
  • the sterilization bag 30 containing the culture bag 10 is kept sealed after the sterilization gas in the culture bag 10 is removed.
  • the open portion 13 of the culture bag 10 is closed from the outside of the sterilization bag 30 with the welding sealer 2, and the culture bag 10 containing the sterilized medium 20 is sealed.
  • the culture bag 10 will be in the state by which two sheet-like raw materials which comprise the culture bag 10 weld each other in the edge part 12B shown in FIG. 1, and the culture bag 10 was sealed.
  • the treatment for removing the sterilization gas in the culture bag 10 includes, for example, the sterilization bag 30 containing the culture bag 10 in a non-sterile gas atmosphere after the sterilization process and before the start of the sealing process of the culture bag 10.
  • a method of placing the sterilization bag 30 in a state where the culture bag 10 is housed in a tank capable of being evacuated for vacuuming and placing the sterilization bag 30 in a low-pressure atmosphere. is there.
  • FIG. 8 is an example of a diagram showing a sterilization bag 30 containing the culture bag 10 after the open portion 13 is closed with the welding sealer 2.
  • the inside of the culture bag 10 is closed over the entire circumference by the edge portions 12A and 12B. Accordingly, the culture medium 20 in the culture bag 10 is isolated from microorganisms and other foreign matters outside the culture bag 10.
  • FIG. 9 is an example of a cross-sectional view of the sterilization bag 30 and the culture bag 10 taken along the line indicated by the reference numeral BB in FIG.
  • the culture bag 10 has a liquid impermeability in which each of the two sheet-like materials constituting the culture bag 10 does not leak a sample and an oxygen permeability that transmits oxygen necessary for the growth of microorganisms, and While either one of the materials can be fused to the other material, the film 33 constituting the sterilization bag 30 is formed so as not to be fused.
  • the material constituting the outer surface of the film 33 of the sterilization bag 30 is “material 1 (outside)”, the material constituting the inner surface of the film 33 is “material 1 (inside)”, and the sheet 31 of the sterilization bag 30 is configured.
  • “Material 2” the material constituting the outer surface of the film 14 of the culture bag 10 “Material 3 (outside)”, the material constituting the inner surface of the film 14 “Material 3 (inside)”, the culture bag
  • the melting point of each material is as follows: By satisfying the relationship, the temperature of the welding sealer 2 when closing the open portion 13 is appropriately adjusted, and the open portion 13 of the culture bag 10 is sterilized without fusing the culture bag 10 to the sterilization bag 30.
  • the microorganism incubator 1 is completed through the above series of manufacturing steps. Since the microorganism culture device 1 according to the present embodiment is completed through the manufacturing process of the above example, for example, the culture bag is sterilized with the sterilization bag 30 omitted, and then the open portion of the culture bag is closed. Compared to the case, the possibility that fungi and other foreign substances enter the culture bag can be greatly suppressed.
  • the microorganism incubator 1 that has been completed through the series of manufacturing steps described above is shipped, for example, while the culture bag 10 is stored in the sterilization bag 30, so that the surface of the culture bag 10 in the distribution process can be obtained. It is possible to suppress the adhesion of microorganisms and other foreign matters to the skin. If the adhesion of foreign matter to the surface of the culture bag 10 is suppressed, the possibility of foreign matter entering the culture bag 10 when the injection port 11 is opened decreases.
  • the above production method is not limited to the mode in which the culture medium 20 is put into the culture bag 10 from the open portion 13 provided on the opposite side of the inlet 11 when the culture medium 20 is put into the culture bag 10.
  • the culture medium 20 may be put into the culture bag 10 from an open portion provided in the vicinity of the injection port 11 or in other portions.
  • the above manufacturing method is not limited to an embodiment in which the culture bag 10 is placed in the sterilization bag 30 from the injection port 11 side.
  • the culture bag 10 is inserted from the open portion 13 side into the sterilization bag 30. You may put it in.
  • the culture medium 20 may be stored in the culture bag 10 by the following method, for example.
  • two sheets of sheet-shaped material constituting the culture bag 10 are stacked, the medium 20 is sandwiched between them, and the edges of the sheet-shaped material are heated to weld the edge portion 12A. May be stored in the culture bag 10.
  • the culture bag 10 is not limited to the one in which the edges of the sheet-like material are heated and welded to each other, and may be formed by bonding with an adhesive tape or the like, for example.
  • the sterilization bag 30 is realizable by using the material shown in the following Table 1, for example.
  • the sterilization bag 30 may be provided with gas permeability to the sheet 31 by using, for example, the material shown in Table 1 above, and the film 33 may be provided with heat meltability that can be fused to the sheet 31. Is possible.
  • the culture bag 10 is realizable by using the material shown in the following Table 2, for example.
  • “Material 3 (outside)” corresponds to the outside (the side not touching the film 15) portion of the film 14 shown in FIG. 9, and “Material 3 (inside)” is the film shown in FIG. 14 corresponds to the inner part of the film 15 (the side touching the film 15), and the “material 4 (inner side)” corresponds to the inner part of the film 15 shown in FIG. "Outside” "corresponds to the outside (the side not touching the film 14) portion of the film 15 shown in FIG.
  • the material which comprises the culture bag 10 is not limited to the aspect shown by the said Table 2, For example, the outside of PET / PE and the inside are OPP / PE, etc. It is also possible to further modify the combination.
  • the culture bag 10 is made of a material having an oxygen permeability and a melting point as shown in Tables 3, 4 and 5 above, for example, in combination with a pattern as shown in Table 2 above, thereby leaking the sample. Sterilization while providing film 14 and 15 with a liquid impermeability and oxygen permeability that allows oxygen necessary for microbial growth, and either film can be fused to the other film. It is possible to give the films 14 and 15 heat melting property having a melting point lower than that of the film 33 constituting the bag 30.
  • the culture medium 20 accommodated in the culture bag 10 is preferably a laminate suitable for the growth of microorganisms.
  • a sheet-shaped culture medium including a porous matrix layer and a water-soluble polymer compound layer is suitable.
  • the culture medium 20 for example, there is one including a substrate, a water-soluble polymer compound layer, and a porous matrix layer.
  • the water-soluble polymer layer can contain nutrients suitable for microorganisms intended for culture.
  • the water-soluble polymer layer further includes a pH adjuster, a selective agent for suppressing the growth of microorganisms other than the intended purpose, a color former, a dye, and a surfactant for making the growth of microorganisms easier to see or confirming the growth of specific microorganisms.
  • a pH adjuster a selective agent for suppressing the growth of microorganisms other than the intended purpose
  • a color former e.g., a dye, and a surfactant for making the growth of microorganisms easier to see or confirming the growth of specific microorganisms.
  • At least one selected from inorganic salts and the like can be included.
  • Examples of the method for producing the medium 20 include a water-soluble polymer compound, a nutritional component suitable for microorganisms intended for culture, a pH adjuster, a selective agent that suppresses the growth of microorganisms other than the target, and the growth of microorganisms is easy to see.
  • a method in which an aqueous solution containing a color former, a dye, a surfactant, an inorganic salt, etc. for confirming the growth of a specific microorganism is applied on a substrate and dried to form a film.
  • An aqueous solution of a water-soluble polymer compound that is separately contained may be sequentially applied and overlaid.
  • the culture medium 20 includes a porous matrix layer and at least one water-soluble polymer compound layer, and at least one of the water-soluble polymer compound layers includes a nutrient component.
  • a specific method for producing the culture medium 20 is, for example, a method in which an aqueous solution of a water-soluble polymer compound containing a nutrient component, a salt component, and a chromogenic enzyme substrate is applied onto a film (substrate) such as polyester to form a dry film.
  • a film substrate
  • a chromogenic enzyme substrate is applied onto a film (substrate) such as polyester to form a dry film.
  • an aqueous solution of a water-soluble polymer is layered on a film (substrate) of polyester or the like, formed into a dry film, and then an aqueous solution of a water-soluble polymer containing nutritional components and the like is formed on the film. Multilayer and dry film. Further, an aqueous solution of a water-soluble polymer containing a color former (this solution may further contain a nutrient component and a pH adjuster) is layered on this film to form a dry film. And the method of laminating
  • the porous matrix When the porous matrix is overlaid, the porous matrix may be overlaid before the top layer is dried and then dried. You may apply
  • the dry film-like medium layer produced in this manner is peeled off from a film (substrate) such as polyester, or is not peeled off, and is commensurate with the amount of sample liquid to be cultured.
  • a sheet-like culture medium 20 prepared by cutting to a predetermined size is prepared, and the above-described series of manufacturing steps is performed.
  • the substrate of the medium 20 is not particularly limited as long as the tensile strength at the time of heating and drying is sufficient, but generally, for example, a polyester film having a thickness of 20 to 50 ⁇ m is used.
  • the water-soluble polymer compound forming the water-soluble polymer compound layer of the medium 20 may be any material that dissolves when a sample is added and exhibits a viscosity of 10 cps or more and does not inhibit the growth of microorganisms.
  • polyvinyl alcohol modified polyvinyl alcohol (in the polymerization of vinyl acetate, unsaturated dicarboxylic acid (for example, maleic acid, fumaric acid, glutaconic acid, allylmalonic acid, their anhydrides, or monoalkyl esters thereof) Polymerized (for example, see Japanese Examined Patent Publication No.
  • polyvinyl alcohol reacted with cyclic acid anhydride polyvinyl alcohol reacted with cyclic acid anhydride; cellulose derivative (for example, carboxymethyl cellulose (CMC), hydroxyalkyl cellulose (for example, hydroxy Starch and derivatives thereof (eg soluble starch, carboxymethylated starch); polysaccharides other than cellulose derivatives, starch and derivatives thereof (eg hyaluronic acid, guar gum, gum arabic); acrylic acid and derivatives thereof ( Eg to polyacrylic acid, polyacrylates, acrylic acid (salt) - vinyl alcohol copolymers); polyethers (e.g., polyethylene glycol, polypropylene glycol); proteins, protein derivatives (e.g., collagen) and the like.
  • CMC carboxymethyl cellulose
  • hydroxyalkyl cellulose for example, hydroxy Starch and derivatives thereof (eg soluble starch, carboxymethylated starch)
  • the water-soluble polymer compound has a viscosity of 4 mass% aqueous solution measured at 20 ° C. using an Ostwald viscometer, preferably 10 cps or more, more preferably 15 to 80 cps.
  • a water-soluble polymer compound By using such a water-soluble polymer compound, the microorganism does not enter the inside of the medium, and the microorganism that has started to split does not move on the surface of the medium. This is preferable because counting becomes easy.
  • these water-soluble polymer compounds those selected from the group consisting of cellulose derivatives and polyvinyl alcohol are preferable, and polyvinyl alcohol having a saponification degree of 75 to 95% and a molecular weight of 25,000 to 250,000 is particularly preferable.
  • the suitable content of the water-soluble polymer compound in the culture medium 20 of the microorganism culture device 1 according to this embodiment is suitably 40 to 300 g / m 2 , and preferably 70 to 150 g / m 2 .
  • Synthetic fibers for example, nylon, polyacrylonitrile, polyester (especially hydrophilized), polyolefins (especially hydrophilized polyurethane)
  • semi-synthetic fibers as materials for forming the porous matrix layer of the culture medium 20
  • rayon, etc. Natural fibers (for example, wool (animal hair), silk, cotton, cellulose, pulp, etc.), woven fabrics, fiber webs, non-woven fabrics, etc. formed of inorganic fibers (for example, glass fibers), etc.
  • examples thereof include porous films, sponges, and porous ceramics made of fiber constituent materials.
  • the porous matrix does not necessarily need to be hydrophilic.
  • porous matrix or a porous matrix subjected to hydrophilic treatment
  • the water absorption speed is increased and the work efficiency is increased.
  • a water-soluble substance to the surface of the hydrophilic or hydrophilic-treated porous matrix because the dispersibility of microorganisms is improved.
  • the porous matrices fiber webs and nonwoven fabrics are preferred.
  • Nylon, cotton, cellulose, and rayon are preferable as the fibers constituting the fiber web and the nonwoven fabric, and a fiber web or nonwoven fabric made of nylon is particularly preferable.
  • Nylon nonwoven fabric is preferably a nonwoven fabric produced by a melt blown manufacturing method.
  • porous matrix layer is a nylon melt blown nonwoven fabric having a basis weight of 40 to 100 g / m 2 and an air permeability of 7 to 24 cm / sec.
  • Specific examples of the porous matrix layer include those disclosed in WO 01/44437.
  • the nutrient component used in the culture medium 20, that is, the culture medium component may be any material as long as it is suitable for the growth of the microorganism targeted for detection.
  • a medium component obtained by removing agar from a general-purpose liquid medium or agar medium can be used.
  • a selective agent that suppresses the growth of microorganisms other than the detection purpose, an indicator for making the generated colonies easy to see, a coloring agent, etc. may be added to the sheet medium, and a coloring or fluorescent enzyme may be used to detect specific microorganisms.
  • Substrate may be added.
  • pigments, surfactants, inorganic salts, and the like can be added.
  • medium components for microorganisms include, for example, yeast extract / peptone / glucose mixture, meat extract / pepton mixture, peptone / soybean peptone / glucose mixture, phosphate phosphate, sodium chloride , Carbonates, magnesium salts, and other salts are added to test for Escherichia coli and coliforms.
  • Sodium desoxycholate / pepton / ammonium iron citrate / sodium chloride / dipotassium phosphate / lactose / neutral red, peptone ⁇ Lactose, dipotassium phosphate, eosin Y, methylene blue, etc. are used for staphylococcal testing.
  • Yellow extract such as tellurite egg yolk mixture
  • Yellow extract such as tellurite egg yolk mixture
  • Yeast extract, peptone, sucrose, sodium thiosulfate, sodium citrate, sodium cholate, ferric citrate, sodium chloride, beef bile, bromthymol blue -Thymol blue mixture, etc. for enterococci include cattle brain extract, heart extract, peptone, glucose, dipotassium phosphate, sodium nitride, bromthymol blue, 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride mixture, etc.
  • peptone / glucose mixture for fungi, peptone / glucose mixture, yeast extract / glucose mixture, potato extract / glucose mixture, etc., malt extract / pepton / glucose mixture, etc. for salmonella, peptone, meat extract, glycerin, sodium thiosulfate, L -Lysine, ammonium ammonium citrate, deoxy Sodium oxalate, sodium lauryl sulfate mixture, etc. for aqueous bacteria include peptone, yeast extract, casamino acid, glucose, phosphate, soluble starch, magnesium salt mixture, meat extract or fish meat extract, tryptone, glucose Etc. are used.
  • pH adjusters examples include phosphates and carbonates (monosodium phosphate, disodium phosphate, monopotassium phosphate, dipotassium phosphate, sodium carbonate, sodium bicarbonate, potassium carbonate, calcium carbonate, etc.) Is mentioned. Such a pH adjuster is used to maintain a pH suitable for the growth of microorganisms.
  • antibiotics such as antibiotics and synthetic antibacterial agents, pigments, surfactants, inorganic salts and the like are used.
  • antibiotics include methicillin, ceftamethazole, cefixime, ceftazidime, cefsulosin, bacitracin, polymyxin B, rifampicin, novobiocin, colistin, lincomycin, chloramphenicol, tetracycline, streptomycin, etc.
  • examples thereof include nalidixic acid and olaquindox.
  • Examples of the pigment include bacteriostatic or bactericidal crystal violet, brilliant green, malachite green, and methylene blue.
  • Examples of the surfactant include Tergitol 7, dodecyl sulfate, lauryl sulfate and the like.
  • examples of inorganic salts include selenite, tellurite, sulfite, sodium nitride, lithium chloride, oxalate, and high-concentration sodium chloride. Besides these, taurocholate, glycine, bile powder, bile salt, deoxycholate, and the like can be used.
  • a color or fluorescent enzyme substrate such as tetrazolim salt or esterase or phosphatase
  • the growth of microorganisms can be easily observed as a color or fluorescent spot.
  • a specific microorganism can be detected by adding a coloring or fluorescent enzyme substrate of an enzyme possessed by the specific microorganism.
  • a coloring or fluorescent enzyme substrate of an enzyme possessed by the specific microorganism For example, 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate, 2,3,5-triphenyltetrazolium chloride, 6-chloro-3-indoxyl- ⁇ -D-glucuronic acid and the like.
  • the nutrient component originally contained in the dialysate is not included in order to prevent the microorganisms in the dialysate or reverse osmosis water from dying due to overnutrition. It is sufficient if it has a supplementary nutrient component required for microbes in the reverse osmosis water, such as 0.1 to 3.0 g peptone and 0.1 to 3.0 g per square meter.
  • Yeast extract 0.1-0.5 g casein degradation product, 0-0.5 g glucose, 0.075-0.3 g sodium pyruvate, and 0-0.3 g dipotassium phosphate And 0.1-0.5 g soluble starch, 0.01-0.05 g magnesium sulfate, 0.015-0.1 g tetrazolium salt or 0.15-1.0 g indoxyl derivative. thing It can be.
  • the medium components are 0.1 to 3.0 g of peptone, 0.1 to 3.0 g of yeast extract, and 0.1 to 0.5 g.
  • Casein degradation product 0-0.5 g glucose, 0.075-0.3 g sodium pyruvate, 0-0.3 g dipotassium phosphate, 0.1-0.5 g soluble starch 0.01 to 0.05 g of magnesium sulfate, and 0 to 0.3 g of dipotassium phosphate is a component that serves as a pH adjuster. If the above range is exceeded, the detection speed and sensitivity may be reduced or undetectable due to a decrease in the growth rate of bacteria, a decrease in the number of viable bacteria, and the like.
  • the chromogenic substrate (component for making the grown bacteria easy to see) is 0.015-0.1 g of tetrazolium salt or 0.15-1.0 g of indoxyl derivative, and the above lower limit If it exceeds, it will be difficult to detect visually. In addition, when the above upper limit is exceeded, the growth of bacteria is inhibited and the detection sensitivity is lowered. Alternatively, the background is increased due to excessive coloration of the substrate. As a result, it becomes difficult to distinguish the number of bacteria.
  • the nutrient component originally contained in the dialysate is not included in order to prevent the microorganisms in the dialysate or reverse osmosis water from dying due to overnutrition.
  • a certain supplementary nutritional component necessary for the microbes in the reverse osmosis water such as 0.38 to 9.0 g of meat extract or fish extract per square meter, and 0.63 ⁇ 15.0 g tryptone, 0 ⁇ 3.0 g glucose, 0 ⁇ 0.3 g dipotassium phosphate, 0.015 ⁇ 0.1 g tetrazolium salt or 0.15 ⁇ 1.0 g indoxyl Derivatives can be mentioned.
  • the medium components are 0.38 to 9.0 g of meat extract or fish extract, 0.63 to 15.0 g of tryptone, and 0 to 3. It is 0 g of glucose, and 0 to 0.3 g of dipotassium phosphate is a component that serves as a pH adjuster. If the above range is exceeded, the detection speed and sensitivity may be reduced or undetectable due to a decrease in the growth rate of bacteria, a decrease in the number of viable bacteria, and the like.
  • the chromogenic substrate (component for making the grown bacteria easy to see) is 0.015 to 0.1 g of tetrazolium salt or 0.15 to 1.0 g of indoxyl derivative. If it exceeds, it will be difficult to detect visually. In addition, when the above upper limit is exceeded, the growth of bacteria is inhibited and the detection sensitivity is lowered. Alternatively, the background is increased due to excessive coloration of the substrate. As a result, it becomes difficult to distinguish the number of bacteria.
  • the nutrient component originally contained in the dialysate is not included in order to prevent the microorganisms in the dialysate or reverse osmosis water from dying due to overnutrition. What is necessary is that it has a predetermined supplementary nutrient component necessary for microbes in the reverse osmosis water, such as 2.5 to 40.0 g of malt extract and 0 to 40.0 g per square meter.
  • Glucose 0.25-4.0 g peptone, 0-0.3 g monopotassium phosphate, 0-0.1 g chloramphenicol, 0.015-0.1 g tetrazolium salt or 0 15 to 1.0 g of indoxyl derivatives.
  • the medium components are 2.5 to 40.0 g of malt extract, 0 to 40.0 g of glucose, and 0.25 to 4.0 g of peptone.
  • From 0 to 0.3 g of monopotassium phosphate is a component that serves as a pH adjuster.
  • 0 to 0.1 g of chloramphenicol is a component that serves as a selective agent. If the above range is exceeded, the detection speed and sensitivity may be reduced or undetectable due to a decrease in the growth rate of bacteria, a decrease in the number of viable bacteria, and the like.
  • the chromogenic substrate (component for making the grown bacteria easy to see) is 0.015-0.1 g of tetrazolium salt or 0.15-1.0 g of indoxyl derivative, and the above lower limit If it exceeds, it will be difficult to detect visually. In addition, when the above upper limit is exceeded, the growth of bacteria is inhibited and the detection sensitivity is lowered. Alternatively, the background is increased due to excessive coloration of the substrate. As a result, it becomes difficult to distinguish the number of bacteria.
  • the shape of the culture medium 20 is, for example, a square such as a square or a rectangle, the production is easy.
  • the area and thickness of the medium 20 are appropriately determined depending on the amount of the sample solution to be inspected, the water-soluble polymer compound used in the sheet-shaped medium, the porous matrix, and their amounts.
  • the medium 20 desirably satisfies the relationship between the mass of the water-soluble polymer compound represented by the following formula (1) and the amount of the sample liquid as the specimen, and contains the water-soluble polymer compound in the sheet-shaped medium as described above.
  • the size is preferably such that the amount is 40 to 300 g / m 2 .
  • a water-soluble polymer compound layer, a water-soluble polymer compound layer containing a nutrient component, a water-soluble polymer compound layer, and a porous matrix layer are arranged in this order on a substrate (for example, a polyester film).
  • a laminated layer can be mentioned.
  • a water-soluble polymer compound layer, a water-soluble polymer compound layer containing a nutrient component, a water-soluble polymer compound layer containing a color former, and a porous matrix layer on a substrate (for example, a polyester film) are stacked in this order.
  • the culture medium 20 of the microorganism culture device 1 for example, the microorganism culture device disclosed in International Publication No. 97/24432 pamphlet can be used.
  • the conditions for preserving the microorganism incubator 1 before use containing the medium 20 can be appropriately selected depending on the types and stability of nutrient components and color formers. It is also possible to select.
  • FIG. 10 is an example of a diagram illustrating a state in which the culture bag 10 is taken out from the sterilization bag 30.
  • FIG. 11 is an example of a diagram showing a state in which a sample is put into the culture bag 10.
  • the culture bag 10 is taken out from the sterilization bag 30 as shown in FIG. 10.
  • the inlet 11 of the culture bag 10 is opened, the sample is placed in the culture bag 10, and the inlet 11 is closed again.
  • the mass (g) of the water-soluble polymer compound in the medium 20 and the volume (mL) of the sample solution have the relationship of the above formula (1).
  • the culture bag 10 is placed under conditions such as temperature and time suitable for the microorganism to be cultured, and cultivation of the microorganism is started.
  • the microorganism culture device 1 according to the present embodiment is suitable for aerobic bacteria culture, anaerobic bacteria can be cultured by forming the culture bag 10 from an oxygen-impermeable material. It is.
  • the sample does not leak at the time of addition of the sample, is liquid impervious, and has oxygen impermeability to grow anaerobic bacteria. It is desirable. Further, it is preferably transparent or translucent in order to observe the growth of microorganisms. As a material satisfying such requirements, for example, substantially non-porous, it is preferable oxygen permeability is 0 ⁇ 20mL / m 2/24 hours.
  • microorganisms cultured by the above method By examining the presence or amount of microorganisms cultured by the above method, various microorganisms can be inspected.
  • the culture bag 10 can also change the position of the inlet 11 suitably as shown, for example in FIGS. 12-15.
  • the injection port 11 is not limited to a simple screw-type cap as shown in FIG. 16, for example, and any sample can be used as long as it can inject a sample and open / close the injection port 11. Also good.
  • caps other than the cap applicable as the inlet 11 include, for example, spouts, screw caps, push-in caps, crowns, rubber stoppers, urethane stoppers, silicone stoppers, cork stoppers, molton stoppers, cotton stoppers, paper stoppers, three-way cocks. , Fasteners, chucks, and zippers. That is, for example, a one-touch type cap as shown in FIG. 17, a rubber-type lid for inserting a sample with an injection needle or the like as shown in FIG.
  • Example 1 of medium 15 g of polyvinyl alcohol having a saponification degree of 89% and a polymerization degree of 1700 was added to 0.125 L of water, dissolved by heating, and then applied onto a 20 ⁇ m thick 0.5 ⁇ 0.5 m polyester film, and dried at 120 ° C. for 5 minutes to form a film.
  • Nylon melt blown nonwoven fabrics having a basis weight of 65 g / m 2 and an air permeability of 110 L / m 2 sec were laminated and dried at 100 ° C. for 30 seconds.
  • the sheet-like culture medium 20 is cut into 120 ⁇ 150 mm and placed in the culture bag 10, the culture bag 10 containing the culture medium 20 is placed in the sterilization bag 30, the open portion 32 is closed, sterilized with ethylene oxide gas, and opened. The portion 13 was closed to produce the microorganism incubator 1.
  • the culture bag 20 used here is made of two nylon / LLDPE (Linear Low Density Polyethylene) films (size: 150 ⁇ 220 mm), and the edge portion 12A is sandwiched between the spouts serving as the injection ports 11. Welded.
  • the sterilization bag 30 used here is a sterilization rollback (size: 200 ⁇ 350) of Medicom (Medicom is a registered trademark).
  • the culture medium 20 which concerns on a present Example has low glucose concentration and sodium carbonate density
  • a nutrient component such as a yeast extract. If nutrients become excessive, the growth of bacteria may be inhibited due to reasons such as an increase in osmotic pressure against bacteria, but the medium 20 according to the present embodiment lowers the glucose concentration and makes the sodium carbonate concentration zero. Therefore, even if a nutrient component is added, it is difficult to inhibit growth.
  • Nylon melt blown nonwoven fabrics having a basis weight of 65 g / m 2 and an air permeability of 110 L / m 2 sec were laminated and dried at 100 ° C. for 30 seconds.
  • the sheet-like culture medium 20 is cut into 120 ⁇ 150 mm and placed in the culture bag 10, the culture bag 10 containing the culture medium 20 is placed in the sterilization bag 30, the open portion 32 is closed, sterilized with ethylene oxide gas, and opened. The portion 13 was closed to produce the microorganism incubator 1.
  • the culture bag 20 used here is made of two nylon / LLDPE (Linear Low Density Polyethylene) films (size: 150 ⁇ 220 mm), and the edge portion 12A is sandwiched between the spouts serving as the injection ports 11. Welded.
  • the sterilization bag 30 used here is a sterilization rollback (size: 200 ⁇ 350) of Medicom (Medicom is a registered trademark).
  • the sheet-like culture medium 20 is cut into 120 ⁇ 150 mm and placed in the culture bag 10, the culture bag 10 containing the culture medium 20 is placed in the sterilization bag 30, the open portion 32 is closed, sterilized with ethylene oxide gas, and opened. The portion 13 was closed to produce the microorganism incubator 1.
  • the culture bag 20 used here is made of two nylon / LLDPE (Linear Low Density Polyethylene) films (size: 150 ⁇ 220 mm), and the edge portion 12A is sandwiched between the spouts serving as the injection ports 11. Welded.
  • the sterilization bag 30 used here is a sterilization rollback (size: 200 ⁇ 350) manufactured by Medicom (Medicom is a registered trademark).
  • ⁇ Comparison with MF method and simplified MF method> In relation to the examination of the dialysate, the method using the microorganism culture device 1 according to the above embodiment was compared with the conventional MF method. In this comparison, a bacterial solution was diluted with a dialysis solution to prepare about 4 CFU / mL. 25 mL of this bacterial solution was added to each of the microorganism incubator 1 according to the above embodiment and the filter of the MF method. In the MF method, the bacterial solution was suction filtered and the filter was transferred onto an R2A agar medium. The number of bacteria was measured after 3 days and 5 days after culturing at 25 ° C. (only Methylobacterium extorquens was measured after 7 days). The results are shown below.
  • the method using the microorganism culture device 1 according to the above embodiment was compared with the conventional simple MF method.
  • a bacterial solution was diluted with a dialysis solution to prepare about 0.4 CFU / mL. 25 mL of this bacterial solution was added to each of the microorganism incubator 1 according to the above embodiment and a conventional simple MF filter.
  • the simple MF method the bacterial solution was suction filtered, and 2 mL of mTGE medium was added and suction filtered. The number of bacteria was measured after 3 days and 5 days after culturing at 25 ° C. (only Methylobacterium extorquens was measured after 7 days). The results are shown below.
  • Tables 6 and 7 above are for the case where the medium according to Example 1 is used, but the data when the medium according to Example 2 is used are as follows.
  • the data when the medium according to Example 3 is used is as shown in Table 9 below.
  • Tables 6 and 7 the numbers of bacteria after 3 days and 5 days were shown, but in Tables 8 and 9 below, the numbers of bacteria after 3 days and 6 days were shown.
  • the number of bacteria was confirmed to be larger when the microorganism culture device 1 according to the above embodiment was used than when the conventional MF method was used. It can be seen that Moreover, about the culture medium which concerns on Example 2, it turns out that a substantially equivalent bacterial count is confirmed by the case where the microorganisms culture device 1 which concerns on the said embodiment is used, and the case where the conventional MF method is used. .

Abstract

　侵入する異物の存在を抑制し且つ多量の試料を入れることが可能な微生物培養器、微生物検査キット、透析液の検査方法、微生物の培養方法、微生物の検査方法、及び微生物培養器の製造方法を提供することを目的とする。微生物培養器であり、シート状の培地を内部に入れて封止した注入口付の培養袋を含む。

Description

微生物培養器、微生物検査キット、透析液の検査方法、微生物の培養方法、微生物の検査方法、及び微生物培養器の製造方法
　本願は、微生物培養器、微生物検査キット、透析液の検査方法、微生物の培養方法、微生物の検査方法、及び微生物培養器の製造方法を開示する。
　微生物の培養は、各種の培地を用いて行われる。培地には、例えば、従来から一般的に用いられている液体培地や寒天培地がある。液体培地は、試料量の制限がないものの、定量性がなく、かさばるという欠点がある。また、寒天培地は、通常用いられている直径９０ｍｍのシャーレでは試料液の量の上限が通常は１ｍＬまでであり、１ｍＬを超える試料液の検査は難しい。従って微生物濃度の比較的低い試料を検査する際、１ｍＬ程度の試料液で検査するためには、先ず、原試料を増菌培養した後に検査に供することが行われている。
　例えば、サルモネラ等食中毒菌の検査には１ｃｆｕ／２５ｇの感度が要求される。また、近年、例えば透析用の水（透析水）等のような医療系の水の検査においては、発熱性物質のみならず微生物の検査が薦められている。しかしながら、このような試料は微生物濃度がかなり低いため、検査には多量の試料が必要になる場合がある。例えば、透析水には、試料１ｍＬ中に１個未満の微生物が検出できる高い感度が求められることがあり、１ｍＬを超える例えば１０～１００ｍＬの試料液を直接、定量的に微生物検査することができれば簡便で望ましい。
　このような多量の試料の検査には、より大きな容器を用いれば、１ｍＬを超える試料の検査も可能であるが、場所をとり実用的でない。そこで、例えば、特許文献１に提案されるようなシート状の培地を大きな面積で使用すれば、１ｍＬを超える試料の定量検査も可能となるが、培地部分より大きな台紙とカバーフィルムが必要となるため省スペース性が損なわれ、大面積となるとカバーの開け閉め、試料の拡散にも時間を要することになる。また、ＭＦ（メンブランフィルタ：membrane filter）法の場合、専用のフィルターホルダーやマニホールド、或いは吸引ポンプ類が必要であり、透析液の検査に際しては専用の培地を作成する必要があるなど、作業工程が多く煩雑である。また、寒天培地を必要としない簡易的ＭＦ法の場合、液体培地を加える必要があり、菌数の測定が容易でなく、また、デバイスに試料を入れる際、菌やウイルスが手等に付着しやすい。また、呈色反応法（センシメディア法）の場合、液体培地なので定量性がなく、また、検出原理上、呼吸活性を持っていない菌がある場合に正しい検出ができない。
　そこで、近年では、省スペースで、１ｍＬを超える比較的多量の試料の微生物定量検査が簡便に実現可能な、袋状容器にシート状の培地を収容した微生物培養器が提案されている（例えば、特許文献２を参照）。
国際公開第０１／４４４３７号パンフレット 特開２００７－１２４９８５号公報 特開平７－７５５４５号公報 特開平８－１１２０８８号公報 特開平１１－１３７２４１号公報
　袋状容器にシート状の培地を収容した微生物培養器は、例えば、袋状容器の開口部分のジッパーを開けて開口状態にし、滅菌ガスの雰囲気中に置くことで滅菌済みの微生物培養器とすることができる。しかし、このようにして滅菌処理した微生物培養器は、滅菌処理後、開口部分を閉じるまでの間、開口部分を通じて容器内部に微生物等の異物が侵入する虞がある。また、開口部分の開閉物としてジッパー類を用いた袋状容器は、密閉性が低いため、開口部分を閉じた状態であっても異物類が侵入する虞があり、また、例えば、透析液といった本来的に細菌数の少ない試料を細菌検出のために多量に入れることは困難である。
　そこで、本願は、侵入する異物の存在を抑制し且つ多量の試料を入れることが可能な微生物培養器、微生物検査キット、透析液の検査方法、微生物の培養方法、微生物の検査方法、及び微生物培養器の製造方法を提供することを目的とする。
　上記課題を解決するため、本発明は、培養袋に試料を入れるための注入口を、培地を内部に入れるための開封部分とは別に設けることにした。
　詳細には、本発明は、シート状の培地を内部に入れて封止した注入口付の培養袋を含む、微生物培養器である。このような微生物培養器であれば、試料を培養袋内に入れる際は、培地を出し入れ可能な開封部分に比べて異物が通過しにくい注入口を通じて入れることになるため、侵入する異物の存在が抑制される。また、容器の密閉性が高く漏れ出しにくいため、多量の試料を入れることも可能である。
　なお、培養部の注入口は、試料の注入後に密封状態とすることが可能なものであれば如何なるものであってもよく、例えば、スパウト、スクリューキャップ、押込キャップ、王冠、ゴム栓、ウレタン栓、シリコン栓、コルク栓、モルトン栓、綿栓、紙栓、３方コック、ファスナー、チャック、ジッパーの何れか１種類以上を適用可能である。
　また、上記微生物培養器は、シート状の培地を内部に入れて封止した注入口付の培養袋と、培養袋を内部に入れて封止した滅菌袋と、を備えるものであってもよい。このような微生物培養器であれば、培養袋の外側の減菌状態が減菌袋によって保たれるため、培養袋に試料を入れる際、培養袋の中に異物が入る可能性が低い。
　また、上記微生物培養器は、好気性菌の検出用であり、培養袋は、酸素透過性の素材で形成されていてもよい。培養袋が酸素透過性の素材で形成されていれば、酸素が培養袋の外側から内側へ供給されるため、好気性菌を育成可能となる。
　また、上記微生物培養器は、嫌気性菌の検出用であり、培養袋は、酸素不透過性の素材で形成されていてもよい。培養袋が酸素不透過性の素材で形成されていれば、酸素が培養袋の外側から内側へ供給されないため、嫌気性菌を育成可能となる。
　また、微生物培養器は、透析液中または逆浸透水中に含まれる微生物の検出用であり、培養袋内の培地は、透析液中または逆浸透水中に含まれている栄養成分を補う所定の補助栄養成分を有するものであってもよい。培地が、透析液中に元々含まれている栄養成分を補う程度の所定の補助栄養成分を有するものであれば、透析液中の微生物を栄養過多により死滅させることなく、培養袋内で育成することが可能である。
　なお、培養袋内の培地が有する所定の補助栄養成分とは、例えば、一平方メートルあたり０．１～３．０ｇのペプトンと、０．１～３．０ｇの酵母エキスと、０．１～０．５ｇのカゼイン分解物と、０～０．５ｇのグルコースと、０．０７５～０．３ｇのピルビン酸ナトリウムと、０～０．３ｇのリン酸二カリウムと、０．１～０．５ｇの溶性デンプンと、０．０１～０．０５ｇの硫酸マグネシウムと、０．０１５～０．１ｇのテトラゾリウム塩または０．１５～１．０ｇのインドキシル誘導体であってもよい。この程度の成分が培地に含まれていれば、透析液中または逆浸透水中の微生物を培養袋内で育成することが可能である。
　なお、培養袋内の培地が有する所定の補助栄養成分とは、例えば、一平方メートルあたり０．３８～９．０ｇの肉エキスまたは魚肉エキスと、０．６３～１５．０ｇのトリプトンと、０～３．０ｇのグルコースと、０～０．３ｇのリン酸二カリウムと、０．０１５～０．１ｇのテトラゾリウム塩または０．１５～１．０ｇのインドキシル誘導体であってもよい。この程度の成分が培地に含まれていれば、透析液中または逆浸透水中の微生物を培養袋内で育成することが可能である。
　なお、培養袋内の培地が有する所定の補助栄養成分とは、例えば、一平方メートルあたり２．５～４０．０ｇの麦芽エキスと、０～４０．０ｇのグルコースと、０．２５～４．０ｇのペプトンと、０～０．３ｇのリン酸一カリウムと、０～０．１ｇのクロラムフェニコールと、０．０１５～０．１ｇのテトラゾリウム塩または０．１５～１．０ｇのインドキシル誘導体であってもよい。この程度の成分が培地に含まれていれば、透析液中または逆浸透水中の微生物を培養袋内で育成することが可能である。
　また、本発明は、上記何れかの微生物培養器を含む微生物検査キットとしての側面から捉えることも可能である。
　また、本発明は、透析液の検査方法としての側面から捉えることも可能である。例えば、本発明は、シート状の培地を内部に入れて封止した注入口付の培養袋と、培養袋を内部に入れて封止した滅菌袋とを備える微生物培養器の、滅菌袋に封止されている培養袋を滅菌袋から取り出し、培養袋の注入口を開いて注入口から培養袋内へ透析液を入れ、注入口を密閉してから培養袋を微生物培養の条件下に置いて微生物を培養し、培養した微生物の存在又は量を検査する、透析液の検査方法であってもよい。
　また、本発明は、微生物の培養方法としての側面から捉えることも可能である。例えば、本発明は、シート状の培地を内部に入れて封止した注入口付の培養袋と、培養袋を内部に入れて封止した滅菌袋とを備える微生物培養器の、滅菌袋に封止されている培養袋を滅菌袋から取り出し、培養袋の注入口を開いて注入口から培養袋内へ試料液を入れ、注入口を密閉してから培養袋を微生物培養の条件下に置く、微生物の培養方法であってもよい。
　また、本発明は、微生物の検査方法としての側面から捉えることも可能である。例えば、本発明は、上記微生物の培養方法によって培養した微生物の存在又は量を検査する微生物の検査方法であってもよい。
　また、本発明は、微生物培養器の製造方法としての側面から捉えることも可能である。例えば、本発明は、シート状の培地を内部に入れて封止した注入口付の培養袋と、培養袋を内部に入れて封止した滅菌袋とを備える微生物培養器の製造方法であって、培地を培養袋の開封部分から内部に入れた培養袋を、ガス透過性を有する滅菌袋に収容して滅菌袋を封止処理し、封止処理を行った滅菌袋を滅菌ガスの雰囲気中に置いて、滅菌袋内に収容されている培養袋内の培地を滅菌処理し、培養袋を収容した滅菌袋を封止したままの状態で、培養袋の開封部分を滅菌袋の外側から閉じ、滅菌処理を施した培地が入った培養袋を密封処理するものであってもよい。
　侵入する異物の存在を抑制し且つ多量の試料を入れることができるようにするために、例えば、キャップ類のような開口部分の大きさが小さく且つ密閉性も高いものを注入口として用いた袋状容器にシート状の培地を収容し、滅菌ガスの雰囲気中に置くことで滅菌済みの微生物培養器とする場合、開口部分の大きさが小さい故に、滅菌処理後の袋状容器内に滅菌ガスが残留する可能性が高くなる。袋状容器内に滅菌ガスが残留していると、培養しようとする微生物の生育に影響を与える。残留ガスは、袋状容器にガス透過性の材料を用いていても容器内から完全に抜け切ることは難しい。また、開口部分の大きさが小さいものであっても、滅菌処理後、開口部分を閉じるまでの間、開口部分を通じて容器内部に異物が侵入する可能性を排除できない。しかし、微生物培養器をこのような方法で製造すれば、培地の滅菌処理後、培養袋が密封処理されるまでの間、培養袋が滅菌袋の内部に収容されたままの状態が保たれるので、滅菌処理後の培養袋に異物が入る可能性が極めて低い。また、微生物培養器をこのような方法で製造すれば、培地の滅菌処理後、培養袋が密封処理されるまでの間、培養袋が滅菌袋の内部に収容されたままの状態となるので、培養袋の開放部分を大きくすることが可能であり、培養袋内に残留する滅菌ガスを、ガス透過性を有する滅菌袋を介して滅菌袋の外側から誘引して除去することが可能になる。
　なお、微生物培養器の製造方法は、滅菌処理後、密封処理前に、滅菌処理を行った滅菌袋を真空中に置いて、滅菌袋内に残留する滅菌ガスを取り除く除去処理を更に行ってもよい。当該除去処理を更に行えば、残留する滅菌ガスが抑制された微生物の培養器を製造することが可能である。
　また、微生物培養器の製造方法は、培養袋を減菌袋から取り出す取り出し処理を更に行うものであってもよい。当該取り出し処理を更に行えば、滅菌処理済みの培養袋を流通させることが可能である。
　また、培養袋の内面は、滅菌袋を形成する素材のうち少なくとも滅菌袋の内面を形成する素材よりも低い温度で熱溶着可能な素材で形成されており、密封処理は、開封部分を滅菌袋の外側から閉じた状態で培養袋を加熱し、培養袋を密封するものであってもよい。滅菌袋の外側から熱溶着により密封処理を行えば、密封処理が容易であり、且つ、培養袋の密封性を高めて異物の侵入をより確実に抑制することが可能となる。
　上記発明によれば、侵入する異物の存在を抑制し且つ多量の試料を入れることが可能になる。
実施形態に係る微生物培養器の外観図の一例である。 培養袋に培地を入れる様子を示した図の一例である。 培地を内部に入れた培養袋を滅菌袋に収容する様子を示した図の一例である。 培養袋を収容した滅菌袋を封止する様子を示した図の一例である。 開放部分を溶着シーラーで閉じた後の滅菌袋を示した図の一例である。 図５の符号Ａ－Ａが示す線で切断した場合の滅菌袋の断面図の一例である。 培地が入った培養袋を封止する様子を示した図の一例である。 開放部分を溶着シーラーで閉じた後の培養袋を示した図の一例である。 図８の符号Ｂ－Ｂが示す線で切断した場合の滅菌袋および培養袋の断面図の一例である。 滅菌袋から培養袋を取り出す様子を示した図の一例である。 培養袋内に試料を入れる様子を示した図の一例である。 第１変形例に係る培養袋を示した図の一例である。 第２変形例に係る培養袋を示した図の一例である。 第３変形例に係る培養袋を示した図の一例である。 第４変形例に係る培養袋を示した図の一例である。 ネジ式のキャップを示した図の一例である。 ワンタッチ式のキャップを示した図の一例である。 ゴム式の蓋を示した図の一例である。 三方弁に繋がるチューブを示した図の一例である。 板状のゴム式の蓋を示した図の一例である。
　本願発明の実施形態を以下に説明する。以下に示す実施形態は例示であり、本願発明の技術的範囲をこれらに限定するものではない。
＜微生物培養器＞
　図１は、実施形態に係る微生物培養器の外観図の一例である。微生物培養器１は、図１に示すように、袋状の培養袋１０にシート状の培地２０を入れた微生物培養器であり、滅菌袋３０に収容されている。なお、微生物培養器１は、培養袋１０を収容する滅菌袋３０が備わっているものに限定されるものでなく、滅菌袋３０は省略されていてもよい。微生物培養器１は、細菌を検査する際にあると便利なものを適宜含めた微生物検査キットの全部または一部を構成するものであってもよい。培養袋１０には、試料を容器内に注入するための注入口１１が取り付けられている。培養袋１０は、２枚重ねにしたシート状の素材（例えば、Polymer等の熱融解性材料）の縁同士を溶着したものであり、図１に示すように、縁の部分１２Ａ，１２Ｂが溶着されている。滅菌袋３０についても、培養袋１０と同様、２枚重ねにしたシート状の素材の縁同士を溶着したものであり、図１に示すように、縁の部分３１Ａ，３１Ｂが溶着されている。
　培養袋１０の材質としては試料の添加時に該試料が漏れず、液体不浸透性であって、一方好気性細菌が生育する酸素透過性を有していることが望ましい。また、微生物の生育を観察するために透明または半透明であることが好ましい。このような要求を満たす材質としては、例えば、実質的に無孔性であり、酸素透過率が３ｍＬ／ｍ2／２４時間以上であることが好ましい。具体的には、例えば、上述したようなPolymer等の樹脂フィルムが挙げられる。微生物の生育にとって十分なガス透過性があるように、その際のフィルムの厚みは１５０μｍの範囲であるのが適当である。樹脂としては具体的にポリエチレン、ポリプロピレン、及びこれらの複合物などが挙げられる。例えば、ポリプロピレンを用いる場合、ガス透過性の観点から、その厚みは１５０μｍ以下であることが望ましい。
　培養袋１０の形状は特に限定されないが、例えば、正方形や長方形といった方形であれば量産に便利である。また、培養袋１０の大きさは、試料の液量に合わせて自在に決定可能であり、例えば、想定される試料の液量が１０ｍＬとすれば１００×１２０ｍｍ～１６０×２００ｍｍ程度のものを用意すると便利である。
　また、培養袋１０の注入口１１は、試料を容器内に注入可能であれば如何なるものであってもよく、密閉性に優れるキャップ類の他、例えば、ジッパー類を用いることも可能である。
＜微生物培養器の製造方法＞
　微生物培養器１は、例えば、以下のような製造工程により製造可能である。
　図２は、培養袋１０に培地２０を入れる様子を示した図の一例である。微生物培養器１を製造するには、縁の部分１２Ｂを溶着する前の開放部分１３から培地２０を培養袋１０内に入れる。
　図３は、培地２０を内部に入れた培養袋１０を滅菌袋３０に収容する様子を示した図の一例である。培地２０を培養袋１０内に入れた後は、開放部分１３を開いたままの状態の培養袋１０を、縁の部分３１Ｂを溶着する前の開放部分３２から滅菌袋３０内に入れる。
　図４は、培養袋１０を収容した滅菌袋３０を封止する様子を示した図の一例である。培養袋１０を滅菌袋３０内に収容した後は、開放部分３２を溶着シーラー２で閉じて滅菌袋３０を封止処理する。これにより、滅菌袋３０は、滅菌袋３０を構成する２つのシート状の素材同士が、図１において示した縁の部分３１Ｂで互いに溶着し、滅菌袋３０が封止された状態となる。
　図５は、開放部分３２を溶着シーラー２で閉じた後の滅菌袋３０を示した図の一例である。開放部分３２を溶着シーラー２で閉じると、滅菌袋３０の内部は、縁の部分３１Ａ，３１Ｂにより全周に渡って閉じられた状態となる。従って、滅菌袋３０内の培養袋１０は、滅菌袋３０の外部の微生物やその他の異物から隔離された状態となる。
　図６は、図５の符号Ａ－Ａが示す線で切断した場合の滅菌袋３０の断面図の一例である。滅菌袋３０は、滅菌袋３０を構成する２枚のシート状の素材のうち何れか一方がガス透過性を有するシート３１で形成されており、何れか他方が当該シート３１に対して融着可能な熱融解性のフィルム３３で形成されている。滅菌袋３０は、このように構成されているため、開放部分３２を溶着シーラー２で閉じることが可能である他、開放部分１３を閉じた状態でも滅菌袋３０を所定のガスの雰囲気中に置けば当該所定のガスがシート３１を透過し、滅菌袋３０内の収容物を当該所定のガスに晒すことが可能である。
　そこで、本製造方法においては、開放部分３２を溶着シーラー２で閉じて封止処理を行った滅菌袋３０を滅菌ガスの雰囲気中に置き、滅菌袋３０内に収容されている培養袋１０の外側や内側、培養袋１０内の培地２０等を滅菌処理する。滅菌袋３０を滅菌ガスの雰囲気中に置くことにより、滅菌袋３０内に収容されている培養袋１０の外側や内側、培養袋１０内の培地２０等に付着していた微生物が死滅する。なお、滅菌袋３０のガス透過性を有するシート３１に、例えば、ガスが接触すると変色するインク等のインジケータ類を設けておけば、微生物培養器１が滅菌処理されたものであるか否かの判別が容易である。
　滅菌処理の具体例としては、例えば、以下のような処理が挙げられる。すなわち、例えば、ガスが接触すると変色するインジケータ類を培養袋１０あるいは滅菌袋３０等の適当な場所に貼り付け、培養袋１０を収容した滅菌袋３０を滅菌機に挿入する。滅菌機の温度設定は例えば４５℃程度にする。そして、滅菌機の扉を閉めて缶内を減圧し（例えば、ゲージ圧でー０．０８５ＭＰａ程度）、真空状態にする。次に、ＥＯ（エチレンオキサイド）ガスを所定の圧力（例えば、ゲージ圧で０．１１０ＭＰａ）まで入れる。そして、所定の時間（例えば、設定圧力に達してから１２時間）が経過するまで放置する。この間、滅菌機内では滅菌作用が徐々に進行する。所定の時間が経過後、滅菌機内をガス抜きして真空引きを行う。培養袋１０は縁の部分１２Ｂが溶着されず、開放部分１３が開いたままの状態となっているため、培養袋１０内にＥＯガスが残留することなく速やかに排出される。真空引き後は空気を供給して空気置換を行う。そして、このような真空引きと空気置換とを更に２回行い、計３回のエアレーションを実施する。そして、滅菌機の扉を開いて製品を取出し、インジケータの変色を確認する。インジケータの変色を確認したら、滅菌処理を完了したものとする。
　図７は、培地２０が入った培養袋１０を封止する様子を示した図の一例である。滅菌袋３０を滅菌ガスの雰囲気中に置いて滅菌処理を施した後は、培養袋１０内の滅菌ガスを除去する処置を行った後、培養袋１０を収容した滅菌袋３０を封止したままの状態で、培養袋１０の開放部分１３を滅菌袋３０の外側から溶着シーラー２で閉じ、滅菌処理を施した培地２０が入った培養袋１０を密封処理する。これにより、培養袋１０は、培養袋１０を構成する２つのシート状の素材同士が、図１において示した縁の部分１２Ｂで互いに溶着し、培養袋１０が密封された状態となる。
　なお、培養袋１０内の滅菌ガスを除去する処置としては、例えば、滅菌処理終了後、培養袋１０の密封処理開始前までの間、培養袋１０を収納した滅菌袋３０を非滅菌ガス雰囲気中に長時間置く方法、或いは、真空引き可能な槽内に培養袋１０を収納した状態の滅菌袋３０を配置して真空引きを行い、当該滅菌袋３０を低気圧の雰囲気中に置く方法等がある。
　図８は、開放部分１３を溶着シーラー２で閉じた後の培養袋１０を収容した滅菌袋３０を示した図の一例である。開放部分１３を溶着シーラー２で閉じると、培養袋１０の内部は、縁の部分１２Ａ，１２Ｂにより全周に渡って閉じられた状態となる。従って、培養袋１０内の培地２０は、培養袋１０の外部の微生物やその他の異物から隔離された状態となる。
　図９は、図８の符号Ｂ－Ｂが示す線で切断した場合の滅菌袋３０および培養袋１０の断面図の一例である。培養袋１０は、培養袋１０を構成する２枚のシート状の素材の各々が、試料を漏らさない液体不浸透性および微生物の生育に必要な酸素を透過する酸素透過性を有し、且つ、何れか一方の素材が他方の素材に対して融着可能でありながら、滅菌袋３０を構成するフィルム３３には融着しにくいように形成されている。
　すなわち、滅菌袋３０のフィルム３３の外側面を構成する素材を「素材１（外側）」、フィルム３３の内側面を構成する素材を「素材１（内側）」、滅菌袋３０のシート３１を構成する素材を「素材２」、培養袋１０のフィルム１４の外側面を構成する素材を「素材３（外側）」、フィルム１４の内側面を構成する素材を「素材３（内側）」、培養袋１０のフィルム１５の外側面を構成する素材を「素材４（外側）」、フィルム１５の内側面を構成する素材を「素材４（内側）」とした場合、各素材の融点が次のような関係を満たすようにすることで、開放部分１３を閉じる際の溶着シーラー２の温度を適当に調整し、培養袋１０を滅菌袋３０に融着させることなく、培養袋１０の開放部分１３を滅菌袋３０の外側から溶着シーラー２で閉じることが可能となる。
　　　「素材３，４（内側）」≪「素材１（内側）」≪「素材１（外側），素材２，素材３，４（外側）」
　微生物培養器１は、上記一連の製造工程を経ることにより完成に至る。本実施形態に係る微生物培養器１は、上記一例の製造工程を経て完成に至るため、例えば、滅菌袋３０を省略した状態で培養袋に滅菌処理を施し、その後に培養袋の開放部分を閉じる場合に比べ、菌類やその他の異物が培養袋内に侵入する可能性を大幅に抑制可能である。また、上記一連の製造工程を経ることにより完成に至った微生物培養器１は、例えば、培養袋１０を滅菌袋３０に収容したままの状態で出荷することにより、流通過程における培養袋１０の表面への微生物やその他の異物の付着を抑制することが可能である。培養袋１０の表面への異物の付着が抑制されれば、注入口１１を開けた際、培養袋１０内に異物が侵入する可能性が低下する。
　なお、上記製造方法は、培地２０を培養袋１０内に入れるに際し、注入口１１の反対側に設けた開放部分１３から培地２０を培養袋１０内に入れる態様に限定されるものでなく、例えば、注入口１１の付近あるいはその他部分に設けた開放部分から培地２０を培養袋１０内に入れてもよい。また、上記製造方法は、培養袋１０を滅菌袋３０に収容するに際し、注入口１１の側から入れる態様に限定されるものでなく、例えば、開放部分１３の側から培養袋１０を滅菌袋３０内に入れてもよい。
　また、培地２０は、例えば、次のような方法により、培養袋１０に収容した状態にしてもよい。例えば、培養袋１０を構成するシート状の素材を２枚重ねにし、それらの間に培地２０を挟み、シート状の素材の縁同士を加熱して縁の部分１２Ａを溶着させることにより、培地２０を培養袋１０に収容した状態にしてもよい。
　また、培養袋１０は、シート状の素材の縁同士を加熱して溶着したものに限定されるものでなく、例えば、粘着テープ等で接着することにより形成したものであってもよい。
＜滅菌袋の素材＞
　なお、滅菌袋３０は、例えば、以下の表１に示す材料を用いることにより実現可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　上記表１において、「素材１（外側）」は図６に示したフィルム３３の外側（シート３１に触れない側）の部分に相当し、「素材１（内側）」は図６に示したフィルム３３の内側（シート３１に触れる側）の部分に相当し、「素材２」は図６に示したシート３１に相当する。滅菌袋３０は、例えば、上記表１に示す材質のものを用いることにより、ガス透過性をシート３１に付与し、シート３１に対して融着可能な熱融解性をフィルム３３に付与することが可能である。
　また、培養袋１０は、例えば、以下の表２に示す材料を用いることにより実現可能である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　上記表２において、「素材３（外側）」は図９に示したフィルム１４の外側（フィルム１５に触れない側）の部分に相当し、「素材３（内側）」は図９に示したフィルム１４の内側（フィルム１５に触れる側）の部分に相当し、「素材４（内側）」は図９に示したフィルム１５の内側（フィルム１４に触れる側）の部分に相当し、「素材４（外側）」は図９に示したフィルム１５の外側（フィルム１４に触れない側）の部分に相当する。なお、培養袋１０を構成する素材は、上記表２に示される態様に限定されるものでなく、例えば、外側がＰＥＴ／ＰＥで内側がＯＰＰ／ＰＥといった具合に、表２に示した素材の組み合わせを更に変形することも可能である。
　ここで、上記表２に示した各材質の酸素透過度および融点は、下記の表３，４，５に示す通りである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　培養袋１０は、上記表３，４，５に示したような酸素透過度および融点を有する材質のものを、例えば、上記表２に示したようなパターンで組み合わせて用いることにより、試料を漏らさない液体不浸透性および微生物の生育に必要な酸素を透過する酸素透過性をフィルム１４，１５に付与し、且つ、何れか一方のフィルムが他方のフィルムに対して融着可能でありながら、滅菌袋３０を構成するフィルム３３よりも融点の低い熱融解性をフィルム１４，１５に付与することが可能である。
＜培地＞
　なお、培養袋１０に収容する培地２０は、微生物の生育に適する積層物であることが望ましく、例えば、多孔質マトリックス層と水溶性高分子化合物層とを含むシート状の培地が好適である。培地２０のさらなる具体的構造としては、例えば、基板、水溶性高分子化合物層及び多孔質マトリックス層を含むものがある。
　上記水溶性高分子層には、培養を目的とする微生物に適した栄養成分を含ませることができる。水溶性高分子層にはさらに、ｐＨ調製剤、目的以外の微生物の生育を抑制する選択剤、微生物の生育を見やすくする又は特定の微生物の生育を確認するための発色剤、色素、界面活性剤、無機塩類などから選ばれる少なくとも１種を含ませることができる。
　培地２０の製造方法としては、例えば、水溶性高分子化合物、及び培養を目的とする微生物に適した栄養成分、ｐＨ調製剤、目的以外の微生物の生育を抑制する選択剤、微生物の生育を見やすくする又は特定の微生物の生育を確認するための発色剤、色素、界面活性剤、無機塩類などを含む水溶液を基板上に塗布して乾燥してフィルムを形成させる方法があり、上記の各成分を別々に含む水溶性高分子化合物の水溶液を逐次塗布し重層してもよい。この場合、培地２０は、多孔質マトリックス層、及び少なくとも１層の水溶性高分子化合物層を含み、水溶性高分子化合物層の少なくとも１層は栄養成分を含むものとなる。
　培地２０の具体的な製法としては、例えば、ポリエステルなどのフィルム（基板）上に栄養成分、塩成分および、発色酵素基質を含む水溶性高分子化合物の水溶液を塗布し、乾燥フィルム化する方法などが挙げられる。
　さらに別の態様としては、例えば、ポリエステルなどのフィルム（基板）上に水溶性高分子の水溶液を重層し、乾燥フィルム化した後、このフィルム上に栄養成分などを含む水溶性高分子の水溶液を重層し、乾燥フィルム化する。さらにこのフィルム上に発色剤を含む水溶性高分子の水溶液（この水溶液にはさらに栄養成分およびｐＨ調整剤を含んでいてもよい）を重層し乾燥フィルム化する。そして、フィルム層の上に、さらに多孔質マトリックスを重層して乾燥する方法などが挙げられる。多孔質マトリックス層があることにより試料液が拡散しやすく使いやすくなる。多孔質マトリックスを重層する場合、一番上の層が乾燥する前に多孔質マトリックスを重層してから乾燥させるとよい。栄養成分、ｐＨ調製剤、選択剤、発色剤、色素、界面活性剤、無機塩類などの各種成分のすべて又は一部を、グラビアロールなどを用いて多孔質マトリックスに塗布しておいてもよい。
　本実施形態に係る微生物培養器１を製造する際は、このようにして作製した乾燥フィルム状の培地層をポリエステルなどのフィルム（基板）から剥がし、もしくは剥がさずに、培養する試料液量に見合った大きさに切断して作成したシート状の培地２０を用意し、上記一連の製造工程を実行する。
　なお、培地２０の基板としては、加熱乾燥時の引っ張り強度が十分であれば特に限定されるものではないが、一般的には、例えば２０～５０μｍ厚のポリエステルフィルムが使用される。
　培地２０の水溶性高分子化合物層を形成する水溶性高分子化合物は、試料を加えたとき溶解して１０ｃｐｓ以上の粘度を示し、微生物の生育を阻害しないものなら如何なるものであってもよい。例えば、ポリビニルアルコール；変性ポリビニルアルコール（酢酸ビニルの重合の際に、不飽和ジカルボン酸〔例えば、マレイン酸、フマール酸、グルタコン酸、アリルマロン酸、これらの無水物、またはこれらのモノアルキルエステル〕を共重合したもの（重合方法は例えば、特公昭６１－４２００２号公報参照）、ポリビニルアルコールに環状酸無水物を反応させたもの；セルロース誘導体（例えば、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）、ヒドロキシアルキルセルロース（例えば、ヒドロキシメチルセルロース）；澱粉およびその誘導体（例えば可溶性澱粉、カルボキシメチル化澱粉）；セルロース誘導体、澱粉およびその誘導体以外の多糖類（例えば、ヒアルロン酸、グアーガム、アラビアゴム）；アクリル酸およびその誘導体（例えば、ポリアクリル酸、ポリアクリル酸塩、アクリル酸（塩）－ビニルアルコールコポリマー）；ポリエーテル（例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール）；タンパク質、タンパク質誘導体（例えば、コラーゲン）が挙げられる。
　水溶性高分子化合物は、オストワルド粘度計を用いて２０℃で測定した４質量％水溶液の粘度が、好ましくは１０cps以上、さらに好ましくは１５～８０cpsを示す。このような水溶性高分子化合物を使用することにより、微生物が培地の内部に侵入することなく、また分裂を開始した微生物が培地表面を移動することなく、主としてその表面にコロニーを形成し、その計数が容易になるので好ましい。これらの水溶性高分子化合物の中でも、セルロース誘導体及びポリビニルアルコールからなる群から選ばれるものが好ましく、鹸化度７５～９５％、分子量２５０００～２５００００のポリビニルアルコールが特に好ましい。本実施形態に係る微生物培養器１の培地２０において好適な水溶性高分子化合物の含有量は、４０～３００ｇ／ｍ2が適当であり、７０～１５０ｇ／ｍ2が好ましい。
　培地２０の多孔質マトリックス層を形成するための材料として、合成繊維（例えば、ナイロン、ポリアクリロニトリル、ポリエステル（特に親水化処理したもの）、ポリオレフィン（特に親水化処理したもの）ポリウレタン）、半合成繊維（例えば、レーヨン等）、天然繊維（例えば、羊毛(獣毛)、絹、綿、セルロース、パルプ等）、無機繊維（例えば、ガラス繊維）等で形成された編織布、繊維ウェブ、不織布、上記繊維の構成素材で作られた多孔質フィルム、スポンジ、多孔質セラミックス等があげられる。多孔質マトリックスは必ずしも親水性である必要はないが、親水性の多孔質マトリックスまたは親水化処理した多孔質マトリックスを用いれば吸水速度が速くなり、作業の能率が上がる。親水性または親水化処理した多孔質マトリックスの表面に水溶性物質を塗布しておくと微生物の分散性が向上し、より好ましい。多孔質マトリックスのなかでは繊維ウェブや不織布が好ましい。繊維ウェブや不織布を構成する繊維としてはナイロン、コットン、セルロース、レーヨンが好ましく、ナイロンからなる繊維ウェブまたは不織布が特に好ましい。ナイロン不織布ではメルトブローン製法で作製した不織布が好ましい。多孔質マトリックス層の好ましい例として、目付４０～１００ｇ／ｍ2、通気度７～２４ｃｍ／ｓｅｃのナイロンメルトブロー不織布がある。多孔質マトリックス層の具体例としては、例えば、国際公開第０１／４４４３７号パンフレットに開示されているものがある。
　培地２０に用いられる栄養成分、すなわち培地成分としては、検出目的とする微生物の生育に適したものであれば如何なるものであってもよい。例えば、汎用の液体培地や寒天培地から寒天を除いた培地成分等が利用できる。さらに検出目的以外の微生物の生育を抑える選択剤や、生じたコロニーを見やすくするための指示薬、発色剤等をシート状培地に加えてもよく、また特定の微生物を検出するために発色または蛍光酵素基質を加えてもよい。その他、色素、界面活性剤、無機塩類などを添加することができる。
　微生物のための培地成分としては、例えば、一般生菌検査用としては、酵母エキス・ペプトン・ブドウ糖混合物、肉エキス・ペプトン混合物、ペプトン・大豆ペプトン・ブドウ糖混合物や、これらにリン酸塩、塩化ナトリウム、炭酸塩、マグネシウム塩などの塩類を加えた混合物が、大腸菌・大腸菌群検査用としては、デソキシコール酸ナトリウム・ペプトン・クエン酸鉄アンモニウム・塩化ナトリウム・リン酸二カリウム・乳糖・ニュートラルレッド混合物、ペプトン・乳糖・リン酸二カリウム・エオジンＹ・メチレンブルー混合物等が、ブドウ球菌検査用としては、肉エキス・ペプトン・塩化ナトリウム・マンニット・フェノールレッド・卵黄混合物、ペプトン・肉エキス・酵母エキス・ピルビン酸ナトリウム・グリシン・塩化リチウム・亜テルル酸卵黄液混合物等が、ビブリオ検査用としては、酵母エキス・ペプトン・蔗糖・チオ硫酸ナトリウム・クエン酸ナトリウム・コール酸ナトリウム・クエン酸第２鉄・塩化ナトリウム・牛胆汁・ブロムチモールブルー・チモールブルー混合物等が、腸球菌用としては、牛脳エキス・ハートエキス・ペプトン・ブドウ糖・リン酸二カリウム・窒化ナトリウム・ブロムチモールブルー・塩化２，３，５－トリフェニルテトラゾリウム混合物等が、真菌用としては、ペプトン・ブドウ糖混合物、酵母エキス・ブドウ糖混合物、ポテトエキス・ブドウ糖混合物等、麦芽エキス・ペプトン・ブドウ糖混合物等が、サルモネラ用としては、ペプトン、肉エキス、グリセリン、チオ硫酸ナトリウム、L－リジン、クエン酸鉄アンモニウム、デオキシコール酸ナトリウム、ラウリル硫酸ナトリウム混合物などが、水系細菌用としては、ペプトン、酵母エキス、カザミノ酸、グルコース、リン酸塩、溶性デンプン、マグネシウム塩混合物などや、肉エキスまたは魚肉エキス、トリプトン、グルコースなどが用いられる。
　ｐＨ調整剤としては、例えば、リン酸塩、炭酸塩（リン酸１ナトリウム、リン酸２ナトリウム、リン酸１カリウム、リン酸２カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸カリウム、炭酸カルシウムなど）などが挙げられる。このようなｐＨ調整剤は微生物の生育に適したｐＨを維持するように使用されるものである。
　選択剤としては、抗生物質，合成抗菌剤等の抗生剤、色素、界面活性剤、無機塩等が用いられる。抗生物質としては、メチシリン、セフタメタゾール、セフィキシム、セフタジジム、セフスロジン、バシトラシン、ポリミキシンＢ、リファンピシン、ノボビオシン、コリスチン、リンコマイシン、クロラムフェニコール、テトラサイクリン、ストレプトマイシン等が例示でき、合成抗菌剤としては、サルファ剤、ナリジクス酸、オラキンドックス等が例示できる。
　また、色素としては、静菌または殺菌作用のあるクリスタルバイオレット、ブリリアントグリーン、マラカイトグリーン、メチレンブルー等が例示できる。また、界面活性剤としては、Ｔｅｒｇｉｔｏｌ７，ドデシル硫酸塩，ラウリル硫酸塩等が例示できる。また、無機塩類としては、亜セレン酸塩、亜テルル酸塩、亜硫酸塩、窒化ナトリウム、塩化リチウム、シュウ酸塩、高濃度の塩化ナトリウム等が例示できる。これら以外にもタウロコール酸塩、グリシン、胆汁末、胆汁酸塩、デオキシコール酸塩等を用いることができる。
　生じたコロニーを見やすくするために、水溶性高分子化合物層にテトラゾリム塩またはエステラーゼ、フォスファターゼなどの発色または蛍光酵素基質を加えておくことで、微生物の生育を発色または蛍光スポットして容易に観察できる。また、特定の微生物が有する酵素の発色または蛍光酵素基質を加えておくことで、特定の微生物が検出できる利点がある。例えば５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルフォスフェート、２，３，５－トリフェニルテトラゾリウムクロリド、６－クロロ－３－インドキシル－β－Ｄ－グルクロン酸などがある。
　また、透析液または逆浸透水の検査を目的とする場合の培地成分としては、透析液中または逆浸透水中の微生物が栄養過多により死滅しないよう、透析液中に元々含まれている栄養成分を補う程度、或いは逆浸透水中の微量な微生物に必要な所定の補助栄養成分を有するものであればよく、例えば、一平方メートルあたり０．１～３．０ｇのペプトンと、０．１～３．０ｇの酵母エキスと、０．１～０．５ｇのカゼイン分解物と、０～０．５ｇのグルコースと、０．０７５～０．３ｇのピルビン酸ナトリウムと、０～０．３ｇのリン酸二カリウムと、０．１～０．５ｇの溶性デンプンと、０．０１～０．０５ｇの硫酸マグネシウムと、０．０１５～０．１ｇのテトラゾリウム塩または０．１５～１．０ｇのインドキシル誘導体を挙げることができる。
　上記成分のうち、培地成分（菌を生育させる為に必要な成分）は、０．１～３．０ｇのペプトンと、０．１～３．０ｇの酵母エキスと、０．１～０．５ｇのカゼイン分解物と、０～０．５ｇのグルコースと、０．０７５～０．３ｇのピルビン酸ナトリウムと、０～０．３ｇのリン酸二カリウムと、０．１～０．５ｇの溶性デンプンと、０．０１～０．０５ｇの硫酸マグネシウムであり、０～０．３ｇのリン酸二カリウムについてはｐＨ調整剤となる成分である。上記の範囲を超えた場合、菌の増殖速度の低下、生菌数の減少等により、検出速度や感度が低下、もしくは検出不能となる。
　また、上記成分のうち、発色基質（生育した菌を見やすくする為の成分）は、０．０１５～０．１ｇのテトラゾリウム塩または０．１５～１．０ｇのインドキシル誘導体であり、上記の下限を超えた場合、目視で検出し難くなる。また、上記の上限を超えた場合、菌の増殖に阻害がかかり検出感度が低下する。または、基質の過剰な着色により、バックグラウンドが高くなる。結果として、菌数を区別し難くなる。
　また、透析液または逆浸透水の検査を目的とする場合の培地成分としては、透析液中または逆浸透水中の微生物が栄養過多により死滅しないよう、透析液中に元々含まれている栄養成分を補う程度、或いは逆浸透水中の微量な微生物に必要な所定の補助栄養成分を有するものであればよく、例えば、一平方メートルあたり０．３８～９．０ｇの肉エキスまたは魚肉エキスと、０．６３～１５．０ｇのトリプトンと、０～３．０ｇのグルコースと、０～０．３ｇのリン酸二カリウムと、０．０１５～０．１ｇのテトラゾリウム塩または０．１５～１．０ｇのインドキシル誘導体を挙げることができる。
　上記成分のうち、培地成分（菌を生育させる為に必要な成分）は、０．３８～９．０ｇの肉エキスまたは魚肉エキスと、０．６３～１５．０ｇのトリプトンと、０～３．０ｇのグルコースであり、０～０．３ｇのリン酸二カリウムについてはｐＨ調整剤となる成分である。上記の範囲を超えた場合、菌の増殖速度の低下、生菌数の減少等により、検出速度や感度が低下、もしくは検出不能となる。
　また、上記成分のうち、発色基質（生育した菌を見やすくする為の成分）は、０．０１５～０．１ｇのテトラゾリウム塩または０．１５～１．０ｇのインドキシル誘導体であり、上記の下限を超えた場合、目視で検出し難くなる。また、上記の上限を超えた場合、菌の増殖に阻害がかかり検出感度が低下する。または、基質の過剰な着色により、バックグラウンドが高くなる。結果として、菌数を区別し難くなる。
　また、透析液または逆浸透水の検査を目的とする場合の培地成分としては、透析液中または逆浸透水中の微生物が栄養過多により死滅しないよう、透析液中に元々含まれている栄養成分を補う程度、或いは逆浸透水中の微量な微生物に必要な所定の補助栄養成分を有するものであればよく、例えば、一平方メートルあたり２．５～４０．０ｇの麦芽エキスと、０～４０．０ｇのグルコースと、０．２５～４．０ｇのペプトンと、０～０．３ｇのリン酸一カリウムと、０～０．１ｇのクロラムフェニコールと、０．０１５～０．１ｇのテトラゾリウム塩または０．１５～１．０ｇのインドキシル誘導体を挙げることができる。
　上記成分のうち、培地成分（菌を生育させる為に必要な成分）は、２．５～４０．０ｇの麦芽エキスと、０～４０．０ｇのグルコースと、０．２５～４．０ｇのペプトンであり、０～０．３ｇのリン酸一カリウムについてはｐＨ調整剤となる成分である。０～０．１ｇのクロラムフェニコールについては選択剤となる成分である。上記の範囲を超えた場合、菌の増殖速度の低下、生菌数の減少等により、検出速度や感度が低下、もしくは検出不能となる。
　また、上記成分のうち、発色基質（生育した菌を見やすくする為の成分）は、０．０１５～０．１ｇのテトラゾリウム塩または０．１５～１．０ｇのインドキシル誘導体であり、上記の下限を超えた場合、目視で検出し難くなる。また、上記の上限を超えた場合、菌の増殖に阻害がかかり検出感度が低下する。または、基質の過剰な着色により、バックグラウンドが高くなる。結果として、菌数を区別し難くなる。
　培地２０の形状は、例えば、正方形又は長方形等の方形であれば製造が容易である。培地２０の面積、厚みは、検査する試料液量及びシート状培地に使用する水溶性高分子化合物、多孔質マトリックス及びそれらの量によって適宜決定する。培地２０は、望ましくは、下記式（１）に示される水溶性高分子化合物の質量と検体となる試料液量の関係を満たし、及び上述したようにシート状培地における水溶性高分子化合物の含有量４０～３００ｇ／ｍ2を満たすような大きさであることが好ましい。
式（１）：０．０８＜水溶性高分子化合物の重量（ｇ）／試料液量（ｍＬ）＜０．５
　培地２０の好ましい構成として、基板（例えばポリエステルフィルム）上に、水溶性高分子化合物層、栄養成分を含む水溶性高分子化合物層、水溶性高分子化合物層、及び多孔質マトリックス層がこの順で積層されたものを挙げることができる。また、別の構成として、基板（例えばポリエステルフィルム）上に、水溶性高分子化合物層、栄養成分を含む水溶性高分子化合物層、発色剤を含む水溶性高分子化合物層、及び多孔質マトリックス層がこの順で積層されたものを挙げることができる。上記の多孔質マトリックス層には、例えば、栄養成分、ｐＨ調製剤、選択剤、発色剤、色素、界面活性剤、無機塩類などの各種成分のすべて又は一部を塗布してもよい。本実施形態に係る微生物培養器１の培地２０としては、例えば、国際公開第９７／２４４３２号パンフレットに開示された微生物培養器材を使用することもできる。
　上記培地２０を収容した使用前の微生物培養器１を保存する条件は、栄養成分や発色剤の種類や安定性などによって適宜選ぶことができ、例えば、一般的な条件である低温から常温の範囲を選択することも可能である。
＜微生物培養器の使用方法＞
　図１０は、滅菌袋３０から培養袋１０を取り出す様子を示した図の一例である。また、図１１は、培養袋１０内に試料を入れる様子を示した図の一例である。微生物培養器１を使用する際は、図１０に示すように、滅菌袋３０から培養袋１０を取り出す。このとき、滅菌袋３０に保護されていた培養袋１０の表面に異物類がなるべく付着しないように配慮することが好ましい。次に、図１１に示すように、培養袋１０の注入口１１を開いて試料を培養袋１０内に入れ、注入口１１を再び閉じる。培養にあたっては、培地２０における水溶性高分子化合物の質量（ｇ）と試料液の容量（ｍＬ）とが上記式（１）の関係にあることが望ましい。注入口１１を閉じて培養袋１０内を密閉した後は、培養袋１０を、培養しようとする微生物に適した温度及び時間などの条件下に置き、微生物の培養を開始する。なお、本実施形態に係る微生物培養器１は、好気性菌の培養に適しているが、培養袋１０を酸素不透過性の素材で形成することにより、嫌気性菌の培養を行うことも可能である。嫌気性菌の検出用として用いる場合の培養袋１０の材質としては試料の添加時に該試料が漏れず、液体不浸透性であって、一方嫌気性細菌が生育する酸素不透過性を有していることが望ましい。また、微生物の生育を観察するために透明または半透明であることが好ましい。このような要求を満たす材質としては、例えば、実質的に無孔性であり、酸素透過率が０～２０ｍＬ／ｍ2／２４時間であることが好ましい。
　上記方法によって培養した微生物の存在又は量を検査することで、微生物の様々な検査を行うことが可能となる。
＜培養袋の変形例＞
　なお、培養袋１０は、例えば、図１２から図１５に示すように、注入口１１の位置を適宜変更することも可能である。
　また、注入口１１は、例えば、図１６に示されるような単なるネジ式のキャップに限定されるものでなく、試料の注入および注入口１１の開閉が可能なものであれば如何なるものであってもよい。注入口１１として適用可能なキャップ以外の例としては、例えば、スパウト、スクリューキャップ、押込キャップ、王冠、ゴム栓、ウレタン栓、シリコン栓、コルク栓、モルトン栓、綿栓、紙栓、３方コック、ファスナー、チャック、ジッパーの何れか１種類以上を挙げることができる。すなわち、例えば、図１７に示されるようなワンタッチ式のキャップ、図１８に示されるように試料を注射針等で入れるゴム式の蓋（口にゴム栓を挿入し、それをアルミキャップ等を用いて固定してある）、或いは図１９に示されるように医療機器などで使われる薬液類注入用の三方弁等をチューブで繋いだもの、図２０に示されるようにいわゆるバイアル瓶に使われる板状のゴム式の蓋（口にゴム板で栓をし、それをアルミキャップ等を用いて固定してある）等を挙げることができる。
＜培地の実施例１＞
　水０．１２５Ｌに鹸化度８９％重合度１７００のポリビニルアルコール１５ｇを加え加熱溶解後、２０μｍ厚０．５×０．５ｍのポリエステルフィルム上に塗布し、１２０℃、５分間乾燥しフィルム化した。このフィルム上に、鹸化度８９％、重合度１７００のポリビニルアルコール８ｇ、ペプトン０．０６２５ｇ、酵母エキス０．０６２５ｇ、カザミノ酸０．０６２５ｇ、グルコース０．０１５６２５ｇ、リン酸二カリウム０．０３７５ｇ、溶性デンプン０．０６２５ｇ、硫酸マグネシウム０．００６２５ｇを水０．１２５Ｌに溶解して、１１０℃、7分間乾燥した。このフィルム上に、ポリビニルアルコール２．５ｇ、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルフォスフェート０．０７５ｇ、２，３，５－トリフェニルテトラゾリウムクロライド０．００７５ｇを水０．０５Ｌに溶解して重層し、目付６５ｇ／ｍ2、通気度１１０Ｌ／ｍ2ｓｅｃのナイロンメルトブロー不織布を張り合わせ１００℃３０秒間乾燥した。
　当該シート状の培地２０を１２０×１５０ｍｍに切断して培養袋１０に入れ、培地２０を入れた培養袋１０を滅菌袋３０に入れて開放部分３２を閉じ、エチレンオキサイドガスで滅菌を行い、開放部分１３を閉じて微生物培養器１を作製した。ここで用いた培養袋２０は、ナイロン／ＬＬＤＰＥ（Linear Low Density Polyethylene）のフィルム（大きさ：１５０×２２０ｍｍ）を２枚重ねにし、注入口１１となるスパウトを挟んだ状態で縁の部分１２Ａを溶着したものである。また、ここで用いた滅菌袋３０は、メディコム社（メディコムは登録商標）の滅菌ロールバック（大きさ：２００×３５０）である。
　なお、本実施例に係る培地２０は、グルコース濃度が低く炭酸ナトリウム濃度もゼロのため、測定試料としては、例えば、グルコースとｐＨ調整剤を含むものであることを要する。また、増殖が遅い菌を培養する場合、更に酵母エキス等の栄養成分を追加することが望ましい。栄養が過多になると、細菌に対する浸透圧の上昇等の理由により細菌の生育が阻害される可能性があるが、本実施例に係る培地２０は、グルコース濃度を下げ、炭酸ナトリウム濃度をゼロにすることで、栄養成分を追加しても増殖阻害がかかりにくい。
＜培地の実施例２＞
　水０．１２５Ｌに鹸化度８９％重合度１７００のポリビニルアルコール１５ｇを加え加熱溶解後、２０μｍ厚０．５×０．５ｍのポリエステルフィルム上に塗布し、１２０℃、５分間乾燥しフィルム化した。このフィルム上に、鹸化度８９％、重合度１７００のポリビニルアルコール８ｇ、肉エキス０．３７５ｇ、トリプトン０．６２５ｇ、グルコース０．１２５ｇを水０．１２５Ｌに溶解して、１１０℃、7分間乾燥した。このフィルム上に、ポリビニルアルコール２．５ｇ、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルフォスフェート０．０７５ｇ、２，３，５－トリフェニルテトラゾリウムクロライド０．００７５ｇを水０．０５Ｌに溶解して重層し、目付６５ｇ／ｍ2、通気度１１０Ｌ／ｍ2ｓｅｃのナイロンメルトブロー不織布を張り合わせ１００℃３０秒間乾燥した。
　当該シート状の培地２０を１２０×１５０ｍｍに切断して培養袋１０に入れ、培地２０を入れた培養袋１０を滅菌袋３０に入れて開放部分３２を閉じ、エチレンオキサイドガスで滅菌を行い、開放部分１３を閉じて微生物培養器１を作製した。ここで用いた培養袋２０は、ナイロン／ＬＬＤＰＥ（Linear Low Density Polyethylene）のフィルム（大きさ：１５０×２２０ｍｍ）を２枚重ねにし、注入口１１となるスパウトを挟んだ状態で縁の部分１２Ａを溶着したものである。また、ここで用いた滅菌袋３０は、メディコム社（メディコムは登録商標）の滅菌ロールバック（大きさ：２００×３５０）である。
＜培地の実施例３＞
　水０．１２５Ｌに鹸化度８９％重合度１７００のポリビニルアルコール１５ｇを加え加熱溶解後、２０μｍ厚０．５×０．５ｍのポリエステルフィルム上に塗布し、１２０℃、５分間乾燥しフィルム化した。このフィルム上に、鹸化度８９％、重合度１７００のポリビニルアルコール８ｇ、麦芽エキス２．５ｇ、グルコース２．５ｇ、ペプトン０．１２５ｇ、リン酸一カリウム０．０３７５ｇ、クロラムフェニコール０．０１２５ｇを水０．１２５Ｌに溶解して、１１０℃、7分間乾燥した。このフィルム上に、ポリビニルアルコール２．５ｇ、５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリルフォスフェート０．０７５ｇ、２，３，５－トリフェニルテトラゾリウムクロライド０．００７５ｇを水０．０５Ｌに溶解して重層し、目付６５ｇ／ｍ2、通気度１１０Ｌ／ｍ2ｓｅｃのナイロンメルトブロー不織布を張り合わせ１００℃３０秒間乾燥した。
　当該シート状の培地２０を１２０×１５０ｍｍに切断して培養袋１０に入れ、培地２０を入れた培養袋１０を滅菌袋３０に入れて開放部分３２を閉じ、エチレンオキサイドガスで滅菌を行い、開放部分１３を閉じて微生物培養器１を作製した。ここで用いた培養袋２０は、ナイロン／ＬＬＤＰＥ（Linear Low Density Polyethylene）のフィルム（大きさ：１５０×２２０ｍｍ）を２枚重ねにし、注入口１１となるスパウトを挟んだ状態で縁の部分１２Ａを溶着したものである。また、ここで用いた滅菌袋３０は、メディコム社（メディコムは登録商標）の滅菌ロールバック（大きさ：２００×３５０）である。
　＜ＭＦ法および簡易的ＭＦ法との比較＞
　透析液の検査に関連し、上記実施形態に係る微生物培養器１を用いた方法と、従来からあるＭＦ法との比較を行った。本比較においては、菌液を透析液で希釈して約４ＣＦＵ／ｍＬとしたものを用意した。この菌液を、上記実施形態に係る微生物培養器１とＭＦ法のフィルタとにそれぞれ２５ｍＬ添加した。ＭＦ法では、菌液を吸引ろ過後、フィルタをＲ２Ａ寒天培地上に移した。それぞれ２５℃で培養して３日後、５日後の菌数を測定した（Methylobacterium extorquensのみ7日後も測定した）。その結果を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　また、透析液の検査に関連し、上記実施形態に係る微生物培養器１を用いた方法と、従来からある簡易式のＭＦ法との比較を行った。本比較においては、菌液を透析液で希釈して約０．４ＣＦＵ／ｍＬとしたものを用意した。この菌液を、上記実施形態に係る微生物培養器１と従来からある簡易的ＭＦ法のフィルタとにそれぞれ２５ｍＬ添加した。簡易的ＭＦ法では、菌液を吸引ろ過後、ｍＴＧＥ培地を２ｍＬ加えて吸引ろ過した。それぞれ２５℃で培養して３日後、５日後の菌数を測定した（Methylobacterium extorquensのみ７日後も測定した）。その結果を以下に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　上記表６、表７より、上記実施形態に係る微生物培養器１を用いた方が、従来からあるＭＦ法あるいは簡易的ＭＦ法を用いた場合に比べ、菌数が多く確認されることが判る。この結果より、上記実施形態に係る微生物培養器１を用いた方が、従来からあるＭＦ法あるいは簡易的ＭＦ法に比べて検出される菌数の多い、高精度の細菌検査を実現可能であることが判る。
　なお、上記の表６，７に示すデータは、上記の実施例１に係る培地を用いた場合のものであるが、上記の実施例２に係る培地を用いた場合のデータについては下記の表８に示す通りであり、上記の実施例３に係る培地を用いた場合のデータについては下記の表９に示す通りである。なお、表６，７においては３日後と５日後の菌数を示したが、下記の表８，９においては３日後と６日後の菌数を示している。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　上記の表８，９より、少なくとも実施例３に係る培地については、上記実施形態に係る微生物培養器１を用いた方が、従来からあるＭＦ法を用いた場合に比べ、菌数が多く確認されることが判る。また、実施例２に係る培地については、上記実施形態に係る微生物培養器１を用いた場合と、従来からあるＭＦ法を用いた場合とで、ほぼ同等の菌数が確認されることが判る。
１・・・微生物培養器：２・・・溶着シーラー：１０・・・培養袋：２０・・・培地：３０・・・滅菌袋：１１・・・口部：１２Ａ，１２Ｂ，３１Ａ，３１Ｂ・・・縁の部分：１３，３２・・・開放部分：３１・・・シート：１４，１５，３３・・・フィルム

Claims (17)

  1. 　シート状の培地を内部に入れて封止した注入口付の培養袋を含む、微生物培養器。
  2. 　培養袋の注入口は、スパウト、スクリューキャップ、押込キャップ、王冠、ゴム栓、ウレタン栓、シリコン栓、コルク栓、モルトン栓、綿栓、紙栓、３方コック、ファスナー、チャック、ジッパーの何れか１種類以上であることを特徴とする、請求項１に記載の微生物培養器。
  3. 　シート状の培地を内部に入れて封止した注入口付の培養袋と、
    　培養袋を内部に入れて封止した滅菌袋と、を備えることを特徴とする、請求項１または２に記載の微生物培養器。
  4. 　微生物培養器は、好気性菌の検出用であり、
    　培養袋は、酸素透過性の素材で形成されていることを特徴とする、請求項１から３の何れか一項に記載の微生物培養器。
  5. 　微生物培養器は、嫌気性菌の検出用であり、
    　培養袋は、酸素不透過性の素材で形成されていることを特徴とする、請求項１から３の何れか一項に記載の微生物培養器。
  6. 　微生物培養器は、透析液中または逆浸透水中に含まれる微生物の検出用であり、
    　培養袋内の培地は、透析液中または逆浸透水中に含まれている栄養成分を補う所定の補助栄養成分を有することを特徴とする、請求項１から４の何れか一項に記載の微生物培養器。
  7. 　培養袋内の培地が有する所定の補助栄養成分とは、一平方メートルあたり０．１～３．０ｇのペプトンと、０．１～３．０ｇの酵母エキスと、０．１～０．５ｇのカゼイン分解物と、０～０．５ｇのグルコースと、０．０７５～０．３ｇのピルビン酸ナトリウムと、０～０．３ｇのリン酸二カリウムと、０．１～０．５ｇの溶性デンプンと、０．０１～０．０５ｇの硫酸マグネシウムと、０．０１５～０．１ｇのテトラゾリウム塩または０．１５～１．０ｇのインドキシル誘導体であることを特徴とする、請求項６に記載の微生物培養器。
  8. 　培養袋内の培地が有する所定の補助栄養成分とは、一平方メートルあたり０．３８～９．０ｇの肉エキスまたは魚肉エキスと、０．６３～１５．０ｇのトリプトンと、０～３．０ｇのグルコースと、０～０．３ｇのリン酸二カリウムと、０．０１５～０．１ｇのテトラゾリウム塩または０．１５～１．０ｇのインドキシル誘導体であることを特徴とする請求項６に記載の微生物培養器。
  9. 　培養袋内の培地が有する所定の補助栄養成分とは、一平方メートルあたり２．５～４０．０ｇの麦芽エキスと、０～４０．０ｇのグルコースと、０．２５～４．０ｇのペプトンと、０～０．３ｇのリン酸一カリウムと、０～０．１ｇのクロラムフェニコールと、０．０１５～０．１ｇのテトラゾリウム塩または０．１５～１．０ｇのインドキシル誘導体であることを特徴とする請求項６に記載の微生物培養器。
  10. 　請求項１から９の何れか一項に記載の微生物培養器を含む微生物検査キット。
  11. 　シート状の培地を内部に入れて封止した注入口付の培養袋と、培養袋を内部に入れて封止した滅菌袋とを備える微生物培養器の、滅菌袋に封止されている培養袋を滅菌袋から取り出し、
    　培養袋の注入口を開いて注入口から培養袋内へ透析液を入れ、
    　注入口を密閉してから培養袋を微生物培養の条件下に置いて微生物を培養し、
    　培養した微生物の存在又は量を検査する、
    　透析液の検査方法。
  12. 　シート状の培地を内部に入れて封止した注入口付の培養袋と、培養袋を内部に入れて封止した滅菌袋とを備える微生物培養器の、滅菌袋に封止されている培養袋を滅菌袋から取り出し、
    　培養袋の注入口を開いて注入口から培養袋内へ試料液を入れ、
    　注入口を密閉してから培養袋を微生物培養の条件下に置く、
    　微生物の培養方法。
  13. 　請求項１２に記載の微生物の培養方法によって培養した微生物の存在又は量を検査する微生物の検査方法。
  14. 　シート状の培地を内部に入れて封止した注入口付の培養袋と、培養袋を内部に入れて封止した滅菌袋とを備える微生物培養器の製造方法であって、
    　培地を培養袋の開封部分から内部に入れた培養袋を、ガス透過性を有する滅菌袋に収容して滅菌袋を封止処理し、
    　封止処理を行った滅菌袋を滅菌ガスの雰囲気中に置いて、滅菌袋内に収容されている培養袋内の培地を滅菌処理し、
    　培養袋を収容した滅菌袋を封止したままの状態で、培養袋の開封部分を滅菌袋の外側から閉じ、滅菌処理を施した前記培地が入った培養袋を密封処理する、
    　微生物培養器の製造方法。
  15. 　滅菌処理後、密封処理前に、滅菌処理を行った滅菌袋を真空中に置いて、滅菌袋内に残留する滅菌ガスを取り除く除去処理を更に行う、
    　請求項１４に記載の微生物培養器の製造方法。
  16. 　密封処理後、培養袋を減菌袋から取り出す取り出し処理を更に行う、
    　請求項１４または１５に記載の微生物培養器の製造方法。
  17. 　培養袋の内面は、滅菌袋を形成する素材のうち少なくとも滅菌袋の内面を形成する素材よりも低い温度で熱溶着可能な素材で形成されており、
    　密封処理は、開封部分を滅菌袋の外側から閉じた状態で培養袋を加熱し、培養袋を密封する、
    　請求項１４から１６の何れか一項に記載の微生物培養器の製造方法。
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