WO2011126031A1 - シルクフィブロイン多孔質体及びその製造方法 - Google Patents

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WO2011126031A1
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porous material
amino acid
fibroin porous
fibroin
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一稔 小林
直祐 角
一男 草木
朋子 町田
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日立化成工業株式会社
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    • C08J2389/00—Characterised by the use of proteins; Derivatives thereof

Definitions

  • the present invention relates to a silk fibroin porous material and a method for producing the same.
  • Porous materials that can be produced using biological materials such as proteins and saccharides include wound dressings, hemostatic sponges, medical sustained release carriers and indexing tools, and daily necessities such as disposable diapers and sanitary products.
  • Cell culture support and tissue regeneration in the field of water purification that can be used as a support for living organisms such as microorganisms and bacteria, cosmetics and esthetics for the purpose of moisturizing, etc. for use in esthetic salons and individuals, tissue engineering and regenerative medical engineering Used in a wide range of industrial fields such as supports.
  • saccharides such as cellulose and chitin, and protein groups such as collagen, keratin, and fibroin are known.
  • collagen has been most often used as a protein, but it has become very difficult to utilize bovine-derived collagen after the occurrence of the BSE problem.
  • collagen derived from pigs has a new problem of infectious diseases
  • collagen derived from fish has problems of porous body strength and is difficult to put into practical use.
  • Keratin can be obtained from wool and feathers, but there is a problem in obtaining raw materials and it is difficult to use it industrially.
  • wool the price of raw materials is soaring, and since there is no market for feathers, it is not easy to obtain raw materials.
  • fibroin can be easily obtained from silk, and it can be expected to be stably supplied from the viewpoint of raw material acquisition, and the price is also stable. Is easy.
  • Fibroin has been used for a long time as a surgical suture in addition to clothing applications, and is currently used as an additive for food and cosmetics. It is sufficiently applicable to the field of use of porous materials.
  • Patent Document 2 there is a method for producing a porous material of fibroin by gelling while maintaining the pH of the aqueous solution of fibroin at 6 or below, or by adding a poor solvent to the aqueous solution and gelling. It has been proposed (Patent Document 2). However, this method cannot obtain a porous body having sufficient strength. Furthermore, a method for producing a porous body by maintaining a frozen state for a long time after freezing an aqueous fibroin solution has been proposed (Patent Document 3). However, according to the studies by the inventors, this technique is poor in reproducibility, and a porous body cannot often be produced.
  • Patent Document 4 and Non-Patent Document 1 a method for obtaining a fibroin porous material that is reliable and easily high in strength as compared with the above-described method for producing a silk fibroin porous material has been reported (Patent Document 4 and Non-Patent Document 1).
  • Patent Document 4 and Non-Patent Document 1 after adding a small amount of an organic solvent to an aqueous fibroin solution, it is frozen for a certain period of time and then thawed, so that it has a high water content and excellent mechanical strength. It is disclosed that hydrogels can be produced.
  • JP-A-8-41097 Japanese Patent Publication No. 6-94518 JP 2006-249115 A Japanese Patent No. 3412014
  • an object of the present invention is to provide a silk fibroin porous material that does not contain an organic solvent and has excellent safety, and a method for producing a silk fibroin porous material that does not use an organic solvent.
  • a porous material can be obtained by freezing and then thawing a solution obtained by adding an amino acid to an aqueous fibroin solution. That is, the present invention is to obtain a silk fibroin porous body by freezing and then thawing a silk fibroin porous body containing silk fibroin and an amino acid as essential components and a fibroin solution in which an amino acid is added to a fibroin aqueous solution.
  • a method for producing a characteristic silk fibroin porous material is provided.
  • a highly safe silk fibroin porous material can be easily obtained.
  • FIG. 2 is a scanning electron micrograph of a cross section of a silk fibroin porous material produced in Example 1.
  • FIG. 2 is a scanning electron micrograph of a cross section of a silk fibroin porous material produced in Example 2.
  • FIG. 4 is a scanning electron micrograph of a cross section of a silk fibroin porous material produced in Example 3.
  • FIG. 6 is a scanning electron micrograph of a cross section of a silk fibroin porous material produced in Example 5.
  • FIG. 4 is a scanning electron micrograph of a cross section of a silk fibroin porous material produced in Example 9.
  • FIG. 2 is a scanning electron micrograph of a cross section of a silk fibroin porous material produced in Example 12.
  • FIG. 2 is a scanning electron micrograph of a cross section of a silk fibroin porous material produced in Example 15.
  • FIG. 2 is a scanning electron micrograph of a cross section of a silk fibroin porous material produced in Example 16.
  • FIG. 2 is a scanning electron micrograph of a cross section of a silk fibroin porous material produced in Example 17.
  • FIG. 2 is a scanning electron micrograph of the cross section of the silk fibroin porous body produced in Example 18.
  • FIG. 2 is a scanning electron micrograph of a cross section of a silk fibroin porous material produced in Example 19.
  • FIG. 2 is a scanning electron micrograph of a cross section of a silk fibroin porous material produced in Example 20.
  • FIG. 2 is a scanning electron micrograph of a cross section of a silk fibroin porous material produced in Example 21.
  • FIG. 2 is a scanning electron micrograph of a cross section of a silk fibroin porous material produced in Example 22.
  • FIG. 2 is a scanning electron micrograph of a cross section of a silk fibroin porous material produced in Example 23.
  • FIG. 4 is a scanning electron micrograph of a cross section of a silk fibroin porous material produced in Example 24.
  • FIG. 2 is a scanning electron micrograph of a cross section of a silk fibroin porous material produced in Example 25.
  • FIG. 2 is a scanning electron micrograph of a cross section of a silk fibroin porous material produced in Example 26.
  • FIG. 1 is a scanning electron micrograph of a cross section of a silk fibroin porous material produced in Example 20.
  • the method for producing a silk fibroin porous material of the present invention is characterized in that a fibroin solution obtained by adding an amino acid to a fibroin aqueous solution is frozen and then melted to obtain a porous material.
  • the amino acid concentration can be adjusted by immersing and cleaning the porous material obtained after melting in pure water.
  • the concentration of the amino acid remaining in the obtained silk fibroin porous material is the maximum value of the amino acid concentration added when the porous material is produced, and it depends on the number of times and time of washing the porous material. From 0.01% by mass to the added amino acid concentration can be controlled. It is also possible to obtain a porous body that actively contains amino acids by omitting this washing step.
  • the fibroin used in the present invention is preferably derived from silk produced from natural silkworms such as rabbits, wild silkworms, and tengu, and transgenic silkworms, and the production method thereof is not limited.
  • fibroin is used as an aqueous fibroin solution, but fibroin is poorly soluble in water and is difficult to dissolve directly in water.
  • any known method may be used, but a method in which fibroin is dissolved in a high concentration lithium bromide aqueous solution, followed by desalting by dialysis and concentration by air drying is simple and preferable.
  • the concentration of fibroin is preferably 0.1 to 50% by mass, and preferably 0.5 to 20% by mass in a fibroin solution to which an amino acid described later is added. More preferred is 1 to 12% by mass.
  • strength as needed can be obtained by adjusting the compounding quantity of a silk fibroin. For example, in order to obtain a silk fibroin porous material with higher strength, it can be obtained by increasing the blending amount of silk fibroin within the range of up to 50% by mass, but it should be 30-50% by mass. Is preferable, and 40 to 50% by mass is more preferable.
  • the amino acid added to the fibroin aqueous solution is not particularly limited except for harmful ones, but is preferably water-soluble (water-soluble amino acid), and more preferably has high solubility in water.
  • amino acids used in the present invention include monoamino monocarboxylic acids such as valine, leucine, isoleucine, glycine, alanine, serine, threonine, and methionine, monoamino dicarboxylic acids (acidic amino acids) such as aspartic acid and glutamic acid, and glutamine.
  • Aliphatic amino acids such as diaminocarboxylic acids, aromatic amino acids such as phenylalanine and tyrosine, and amino acids having a heterocyclic ring such as proline, hydroxyproline, and tryptophan.
  • Acidic amino acids and oxyamino acids such as hydroxyproline, serine and threonine are preferred.
  • monoaminodicarboxylic acid is more preferable among acidic amino acids, aspartic acid and glutamic acid are particularly preferable, and hydroxyproline is more preferable among oxyamino acids.
  • These amino acids can be used alone or in combination of two or more.
  • the compounding amount of the amino acid is preferably 0.01 to 18% by mass, more preferably 0.1 to 5% by mass in the fibroin aqueous solution in which the amino acid is compounded. More preferably, it is 5 to 2% by mass.
  • the amino acid used in the present invention is preferably used as an aqueous solution from the viewpoint of preventing fibroin precipitation.
  • an amino acid having low solubility in water it is preferable to use an aqueous amino acid solution in which the amino acid is dissolved in heated water and then cooled to 30 ° C. or lower (for example, room temperature).
  • an amino acid is precipitated during the cooling process, it is preferably removed by a method such as filtration.
  • a silk fibroin aqueous solution in which an acidic amino acid is added to a silk fibroin aqueous solution is allowed to stand at a temperature at which the solution does not solidify before freezing, thereby increasing the strength.
  • a silk fibroin porous material can be obtained.
  • the standing of the silk fibroin aqueous solution to which the acidic amino acid is added may be performed under a predetermined temperature condition by pouring the aqueous solution into a mold or a container.
  • the temperature at the time of standing is not particularly limited as long as it does not coagulate. However, in consideration of difficulty of coagulation, difficulty of gelation of solution, or difficulty of decomposition of fibroin molecules, it is ⁇ 5. It is preferably ⁇ 50 ° C., more preferably ⁇ 3 to 20 ° C., and further preferably 3 to 10 ° C.
  • the standing temperature can be adjusted by placing a silk fibroin aqueous solution in a thermostatic bath. By adjusting the temperature at which the silk fibroin aqueous solution is allowed to stand, the pore diameter and strength of the resulting silk fibroin porous material can be adjusted. By setting the temperature to 3 to 10 ° C., the pore diameter is small. A porous body having high strength can be obtained.
  • strength can be obtained by adjusting the time to stand still.
  • the standing time is preferably 10 hours or more, more preferably 40 hours to 300 hours, and further preferably 50 hours to 300 hours. preferable.
  • a fibroin solution obtained by adding an amino acid to a fibroin aqueous solution is poured into a mold or a container, frozen in a low-temperature thermostatic bath, etc., and then thawed.
  • a fibroin porous material is produced.
  • the aqueous fibroin solution added with amino acids may be frozen at a freezing temperature at a stretch, but the aqueous fibroin solution added with amino acids before freezing is once at about 4 to -9 ° C, preferably 0 to
  • the reaction container is kept at about ⁇ 5 ° C.
  • the temperature to be maintained is about -1 to -9 ° C, preferably about -1 ° C to -5 ° C, the temperature at which the fibroin aqueous solution becomes supercooled before freezing (supercooling temperature)
  • supercooling temperature the temperature at which the fibroin aqueous solution becomes supercooled before freezing
  • a porous material is obtained by thawing the frozen fibroin solution.
  • a melting method Although natural melting, storage in a thermostat, etc. are mentioned, Natural melting is a simple method.
  • the silk fibroin porous body obtained by the production method of the present invention has a shape suitable for the purpose, such as a film shape, a block shape, a tubular shape, etc., by appropriately selecting a mold or a container for producing the porous body. Can do.
  • the internal structure and hardness of the silk fibroin porous material can be adjusted by adjusting the blending amount of silk fibroin and amino acids used as raw materials and by selecting the type of amino acid. A sheet-like or block-like silk fibroin porous body can be obtained.
  • the resulting porous material contains amino acids. If amino acids need to be removed depending on the application, the amino acids are removed from the porous material by a method such as standing in pure water or ultrasonic cleaning. It can be used after being removed. For example, the simplest method is to remove the amino acid by immersing the porous body in pure water. Moreover, as a method of adjusting the water concentration after the production of the silk fibroin porous body, for example, a method of drying the silk fibroin porous body and evaporating the water can be mentioned. Examples of the drying method include natural drying, freeze drying, and heat drying. From the viewpoint of suppressing shrinkage during drying, freeze drying is preferable.
  • the silk fibroin porous material obtained by the production method of the present invention has a sponge-like porous structure, and this porous material usually contains water and is in a water-containing state.
  • the moisture contained in the porous material can be controlled by natural drying, freeze drying, heat drying or the like, but freeze drying is preferable from the viewpoint of suppressing shrinkage during drying.
  • the pore size (pore diameter) in the porous material obtained by the production method of the present invention is about 1 to 300 ⁇ m, and the mixing ratio of fibroin and amino acid and the cooling process when freezing as described above. It can be controlled to some extent by adjusting the conditions, and is determined according to the application. In particular, by performing standing, the pore diameter can be made extremely small, preferably 1 to 50 ⁇ m.
  • the tensile elastic modulus of the silk fibroin porous material in the present invention can be adjusted as appropriate, but is usually about 0.04 to 16 (MPa), and a material having an appropriate hardness can be selected according to the application. .
  • concentration of the silk fibroin aqueous solution is preferably 20% or more during the production of the silk fibroin porous body, so that a porous body having a very high strength can be obtained. It is done.
  • the strength can be further increased by allowing the solution to stand.
  • the concentration of the silk fibroin aqueous solution is preferably 1 to 5% during the production of the silk fibroin porous body, so that a soft porous body can be obtained.
  • the tensile modulus here is a graph of the strength and strain when a 40 mm ⁇ 4 mm ⁇ 4 mm test piece is cut out from the silk fibroin porous material of the present invention and the test piece is pulled under the condition of 2 mm / min, It is obtained from the slope.
  • the porosity of the silk fibroin porous material in the present invention can be appropriately adjusted according to the application by adjusting the concentration of the silk fibroin aqueous solution used for producing the silk fibroin porous material.
  • the concentration of the fibroin aqueous solution is preferably 10% by mass or less, whereby a porous body having a porosity of 90% or more can be obtained.
  • the porosity is a value obtained as follows. First, the obtained porous body is left in pure water for 1 day to completely absorb water, weighed (wet weight), freeze-dried to completely remove water in the porous body, and weighed again. (Dry weight).
  • the silk fibroin porous material obtained by the production method of the present invention has an extremely large porosity, and exhibits excellent performance in various applications.
  • the silk fibroin porous material of the present invention does not contain a solvent, it is highly safe. Therefore, it can be applied to the medical field and fields applied to the human body. In particular, since it has high water absorption, feels good, and there is no problem with safety, it can be widely applied to the cosmetics / esthetic field for the purpose of moisturizing. Specifically, it can be suitably used as a peeling pack or a cosmetic puff. In addition, since the amino acid is contained in the porous body, a horny moisturizing effect can be expected, which is particularly useful in skin care applications. Specifically, it can be suitably used as a peeling pack or a cosmetic puff.
  • the silk fibroin porous material of the present invention can be controlled by changing the water absorption amount and has no safety problem.
  • the silk fibroin porous material was excised under endoscopic observation. It can be suitably used as a weight for pulling a living tissue.
  • the silk fibroin porous material of the present invention has high strength and water absorption, and has no problem with safety, it can be used in medical fields such as wound dressings, drug sustained release carriers, hemostatic sponges, disposable diapers and sanitary products.
  • the gel-like material can be suitably used as a wound dressing, or a cosmetic product for the purpose of moisturizing, improving rough skin, and whitening.
  • the silk fibroin porous material containing the amino acids of the present invention is also expected to have various effects due to amino acids.
  • the specific effects expected are shown below. Since wound healing promotion effect by applying amino acids such as L-arginine, L-serine, L-proline, and L-hydroxyproline has been reported, a wound dressing material and gel using the silk fibroin porous material of the present invention
  • the topical preparation can be expected to promote wound healing, and the skin care member such as a face mask can be expected to improve rough skin and prevent skin.
  • a skin care member such as a face mask using a silk fibroin porous material can be expected to have a moisturizing effect on the skin.
  • Some amino acids such as L-ornithine and its salts have been reported to have a whitening effect when applied to the skin. Therefore, skin care materials such as face masks using the silk fibroin porous material of the present invention are expected to have a whitening effect. it can.
  • Aromatic amino acids such as L-tyrosine, L-tryptophan, and L-phenylalanine have been reported to absorb ultraviolet rays. Therefore, skin care members such as face masks using the silk fibroin porous material of the present invention have sunscreen protection. The effect and whitening effect can be expected.
  • the silk fibroin porous material produced by the production method of the present invention described above contains an amino acid derived from the production process. Therefore, the present invention also provides a silk fibroin porous material containing silk fibroin and amino acids as essential components. Quantitative analysis of how much amino acid contained in the obtained silk fibroin porous material can be performed by van strike method, ninhydrin method, fluorescent label analysis, capillary electrophoresis analysis and the like.
  • An amino acid is an organic substance composed of a carboxyl group and an amino group, and a technique for mainly detecting an amino group is well known. Among them, when an automatic amino acid analyzer (for example, Hitachi L-8500) is used, qualitative and quantitative analysis of amino acids can be easily performed.
  • the automatic amino acid analyzer performs detection by performing ninhydrin coloration after separating amino acids with an ion exchange resin.
  • the concentration of amino acid remaining in the obtained silk fibroin porous body is the maximum value of the amino acid concentration added when producing the porous body, and the number of times and time of washing after producing the porous body,
  • the amino acid concentration in the porous body can be controlled from 0.01% by mass to the added amino acid concentration.
  • Example 1 Preparation of aqueous fibroin solution 20 g of fibroin powder (trade name: “SilkpowderIM” manufactured by KB Seiren Co., Ltd.) was added to 400 mL of a 9M lithium bromide aqueous solution and dissolved by stirring at room temperature for 4 hours. After centrifugation (12,000 rpm, 5 minutes), the insoluble matter precipitated by decantation is removed, and then injected into a dialysis tube (Spectrum / PorR1 Dialysis Membrane, MWCO 6,000 to 8,000, manufactured by Spectrum Laboratories, Inc).
  • a dialysis tube Spectrum Laboratories, Inc.
  • Dialysis for 12 hours is repeated 5 times against 5 L of ultrapure water collected from a water production device (Millipore, DirectQ-UV), then air-dried in a dialysis tube until the volume reaches about 1/8 and concentrated.
  • aqueous silk fibroin solution was obtained.
  • 2 mL of the obtained silk fibroin aqueous solution was taken into a polystyrene container, weighed, and then frozen in a non-Freon refrigerated freezer (“R-Y370” manufactured by Hitachi, Ltd.) whose internal temperature was adjusted to about ⁇ 20 ° C. in advance.
  • the sample was frozen in a room for 12 hours and lyophilized for 7 hours in a freeze dryer (“FDU-1200” manufactured by EYELA).
  • L-aspartic acid (amino acid) is mixed with the silk fibroin aqueous solution prepared above to measure the final concentration of 1% by mass, added to pure water heated to 80 ° C., and then maintained at 80 ° C. The mixture was stirred and dissolved for 10 minutes while heating, and then allowed to stand and cooled to room temperature to obtain an L-aspartic acid aqueous solution (amino acid aqueous solution).
  • Freezing is performed by cooling the low-temperature thermostat bath to -5 ° C in advance, placing the mold containing the silk fibroin solution in the low-temperature thermostat bath and holding it for 2 hours, and then at a cooling rate of 3 ° C / h. After cooling for 5 hours until the temperature reached ⁇ 20 ° C., the temperature was kept at ⁇ 20 ° C. for 5 hours. The frozen sample was allowed to return to room temperature by natural thawing and then removed from the mold to obtain a silk fibroin porous material. The silk fibroin porous body became a hard porous body that retained the shape of the container used as a mold.
  • the silk fibroin porous material obtained by the production method of the present invention can be used as it is depending on the purpose of use, but removes L-asparagine remaining in the water in the porous material. You can also.
  • the obtained porous material was immersed in ultrapure water, and the L-aspartic acid used was removed by exchanging the ultrapure water twice a day for 3 days.
  • the structure of the obtained silk fibroin porous material was observed using a scanning electron microscope.
  • the scanning electron microscope was measured using Philips XL30-FEG in a low vacuum no-deposition mode and an acceleration voltage of 10 kV.
  • the structure of the silk fibroin porous body was not the surface of the porous body, but the inside exposed by cutting the porous body.
  • a scanning electron micrograph of the cross section of the obtained silk fibroin porous material is shown in FIG. Note that the internal structure of the obtained porous body is basically the same whether or not there is a step of removing the used amino acid. In the porous material, pores were observed, and the size of the pores (pore diameter) was about 10 to 300 ⁇ m.
  • Example 2 a silk fibroin porous material was obtained in the same manner as in Example 1 except that the amino acid to be added, the silk fibroin concentration, and the standing conditions were as shown in Table 2 when standing. .
  • the silk fibroin porous material obtained in these examples was a hard silk fibroin porous material that retained the shape of the container used as a mold, as in Example 1.
  • About the silk fibroin porous body obtained in Examples 1, 2, 3, 5 and 9 scanning electron micrographs of the internal cross section of the silk fibroin porous body observed in the same manner as in Example 1 are shown in FIG. Shown in 3, 4 and 5. Further, various physical properties were measured in the same manner as in Example 1. The results obtained are shown in Table 2.
  • Example 12 a silk fibroin porous material was obtained in the same manner as in Example 1 except that the amino acids shown in Table 1 were used instead of L-aspartic acid.
  • the silk fibroin porous body retains the shape of the container used as a mold, and the silk fibroin porous body obtained in Examples 12 to 21 has a soft porous body and a gel-like porous body. There was a case of becoming a mass.
  • the silk fibroin porous material obtained in Examples 22 to 24 became a gel-like porous material maintaining the shape of the container used as a mold.
  • FIG. 6 to 18 show scanning electron micrographs of the internal cross section of the porous material observed in the same manner as in Example 1 for the silk fibroin porous material obtained in Examples 12 to 24, respectively.
  • the porous material pores were observed, and the size of the pores (pore diameter) was about 10 to 300 ⁇ m.
  • Example 1 a silk fibroin porous material was prepared in the same manner as in Example 1 except that L-tyrosine and L-tryptophan were used instead of L-aspartic acid, respectively, as shown in Table 1. Obtained. However, since L-tyrosine and L-tryptophan were precipitated in the cooling process after dissolving L-tyrosine and L-tryptophan in pure water, the precipitates were removed by filtration. The obtained silk fibroin porous body became a gel-like porous body that retained the shape of the container used as a mold. Scanning electron micrographs of the internal cross section of the porous body observed in the same manner as in Example 1 are shown in FIGS. 19 and 20, respectively. In any porous body, pores were observed, and the size of the pores (pore diameter) was about 10 to 300 ⁇ m.
  • Examples 27-29 Qualitative and quantitative analysis of amino acids contained in the obtained silk fibroin porous material was performed using an automatic amino acid analyzer (Hitachi L-8500).
  • the automatic amino acid analyzer can perform not only quantitative analysis but also qualitative analysis at the same time to detect by performing ninhydrin color development after separating amino acids with an ion exchange resin.
  • the silk fibroin since all the used silk fibroin may not remain as a porous body component and may remain in the aqueous solution, the silk fibroin was removed from the test solution before the measurement.
  • ion exchange resin is cation exchange resin # 2622, column size 4.6 mm x 60 mm during amino acid separation, column size 4.6 mm x 40 mm during ammonia trap, flow rate 0.30 mL /
  • the detector used visible light at 570 nm and 440 nm.
  • Table 3 It was found that amino acids in the silk fibroin porous material decreased with the washing time (number of times) for all examples. Therefore, the concentration of the amino acid remaining in the obtained silk fibroin porous material is the maximum value of the amino acid concentration added when producing the porous material, and the number and time of washing after the porous material is produced, etc.
  • the amino acid concentration in the porous body can be controlled from zero to the added amino acid concentration. It should be noted that the amino acid concentration detected before washing is equal to or lower than the concentration added at the time of silk fibroin porous body preparation, that some of the added amino acid has some form in the silk fibroin forming the porous body (for example, This is probably because it is taken in by adsorption.
  • the silk fibroin porous material of the present invention and the silk fibroin porous material obtained by the production method of the present invention are excellent in safety, they can be applied to the medical field and fields applied to the human body. Specifically, it can be widely applied in the cosmetics / esthetic field, and is extremely useful as a face mask adapted to the shape of the face.
  • medical fields such as wound dressings, drug sustained release carriers, hemostatic sponges, daily necessities such as disposable diapers and sanitary products, cell culture supports and tissue regenerative supports in tissue engineering and regenerative medical engineering, water purification applications and environmental fields
  • the present invention can be applied to various industries such as a support that becomes a place of residence for microorganisms and bacteria.

Abstract

　シルクフィブロイン及びアミノ酸を含有するシルクフィブロイン多孔質体及びフィブロイン水溶液にアミノ酸を添加したフィブロイン溶液を凍結し、次いで融解することにより、多孔質体を得ることを特徴とするシルクフィブロイン多孔質体の製造方法により、溶媒を含まず、安全性が高い多孔質体及びその製造方法を提供する。

Description

シルクフィブロイン多孔質体及びその製造方法
　本発明は、シルクフィブロイン多孔質体及びその製造方法に関するものである。
　タンパク質や糖類などの生物由来物質を利用して作製可能である多孔質体は、創傷被覆材、止血スポンジ、薬剤徐放担体や索引具等の医療分野、紙おむつや生理用品等の生活日用品分野、微生物や細菌等の住処になる支持体として活用しうる浄水分野、エステティックサロンや個人での使用による保湿等を目的とした化粧品・エステ分野、組織工学や再生医工学における細胞培養支持体や組織再生支持体など産業上幅広い分野で利用される。
　これら多孔質体を構成する生体由来物質としては、セルロースやキチン等の糖類、コラーゲン、ケラチン、フィブロイン等のタンパク質群が知られている。
　このうち、タンパク質としては、コラーゲンが一番よく利用されてきたが、ＢＳＥ問題が発生してから牛由来のコラーゲンを利用することが非常に難しくなってきた。さらに、豚由来のコラーゲンでは新たな感染症の問題があり、魚類由来のコラーゲンでは、多孔質体強度の問題があり実用化は難しい。また、ケラチンは、羊毛や羽毛から得ることができるが、原料入手に問題があり、工業的に利用することは難しい。羊毛は、原料価格が非常に高騰しており、羽毛に関しては市場がないため、原料を入手することが容易ではない。これらに対して、フィブロインは、シルクから容易に得ることが可能で、原料入手の観点からは、安定に供給されることが期待でき、さらに価格も安定しているので、工業的に利用することが容易である。
　また、フィブロインは、衣類用途以外に、手術用縫合糸として長く使用されてきた実績があり、現在では食品や化粧品の添加物としても利用され、人体に対する安全性にも問題がないことから上記した多孔質体の利用分野に十分適用可能である。
　シルクフィブロイン多孔質体を作製する手法に関しては、いくつか報告がある。例えば、フィブロイン水溶液を急速冷凍したのち結晶化溶媒に浸漬し、融解と結晶化を同時進行させることによってフィブロインの多孔質体を製造する方法が提案されている（特許文献１）。しかしながら、この方法は結晶化溶媒である有機溶媒を大量に使用する必要があり、さらに溶媒の残留の可能性も否定できず、医療分野等の上記した応用分野での使用には問題がある。
　また、フィブロイン水溶液のｐＨを６以下に保持してゲル化させるか又はその水溶液に貧溶媒を添加してゲル化させ、得られたゲルを凍結乾燥してフィブロインの多孔質体を製造する方法が提案されている（特許文献２）。しかしながら、この方法は十分な強度をもった多孔質体を得ることはできない。
　さらに、フィブロイン水溶液を冷凍した後に長時間凍結状態を維持することで多孔質体を製造する方法が提案されている（特許文献３）。しかしながら、発明者らの検討ではこの手法は再現性が乏しく、多孔質体が作製できないことが多い。
　一方、上記したシルクフィブロイン多孔質体の作製手法と比較して、確実で簡便に強度の高いフィブロインの多孔質体を得る方法が報告されている（特許文献４及び非特許文献１）。特許文献４及び非特許文献１には、フィブロイン水溶液に対して少量の有機溶媒を添加した後に、一定時間凍結させて、その後融解することによって、高含水率であり、かつ力学的強度に優れたハイドロゲルが製造できることが開示されている。
特開平８－４１０９７号公報 特公平６－９４５１８号公報 特開２００６－２４９１１５号公報 特許第３４１２０１４号公報
Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，６，３１００－３１０６（２００５）
　特許文献４の手法により作製された多孔質体も、その製造工程で少量の有機溶媒を使用しているため、本発明者らの検討によると、その残留溶媒を除去するためには大量の超純水での透析等を用いた長時間にわたる洗浄工程が必須である。また、長時間の洗浄によって検出限界以下の濃度まで溶媒を除去できたとしても、検出限界以下の微量の残留溶媒が含まれていることが懸念され、より安全性が求められる分野においては使用できないという問題があった。
　そこで、本発明は、有機溶媒を含まず、安全性に優れたシルクフィブロイン多孔質体、及び有機溶媒を使用しないシルクフィブロイン多孔質体を製造する方法を提供することを目的とする。
　本発明者らは、鋭意検討を重ねた結果、フィブロイン水溶液にアミノ酸を添加した溶液を凍結させ、次いで融解することによって多孔質体が得られることを見出した。
　すなわち、本発明は、シルクフィブロイン及びアミノ酸を必須成分として含有するシルクフィブロイン多孔質体及びフィブロイン水溶液にアミノ酸を添加したフィブロイン溶液を凍結させ、次いで融解することにより、シルクフィブロイン多孔質体を得ることを特徴とするシルクフィブロイン多孔質体の製造方法を提供するものである。
　本発明によれば、安全性の高いシルクフィブロイン多孔質体を簡便に得ることができる。
実施例１で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。 実施例２で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。 実施例３で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。 実施例５で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。 実施例９で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。 実施例１２で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。 実施例１３で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。 実施例１４で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。 実施例１５で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。 実施例１６で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。 実施例１７で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。 実施例１８で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。 実施例１９で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。 実施例２０で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。 実施例２１で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。 実施例２２で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。 実施例２３で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。 実施例２４で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。 実施例２５で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。 実施例２６で作製したシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真である。
　本発明のシルクフィブロイン多孔質体の製造方法は、フィブロイン水溶液にアミノ酸を添加したフィブロイン溶液を凍結させ、次いで融解することにより多孔質体を得ることを特徴とする。
　また、本発明のシルクフィブロイン多孔質体の製造方法においては、融解後に得られた多孔質体を純水中に浸漬して洗浄することでアミノ酸濃度を調整することができる。ここで、得られたシルクフィブロイン多孔質体に残留しているアミノ酸の濃度は、多孔質体を作製する際に加えたアミノ酸濃度が最大値であり、多孔質体を洗浄する回数や時間などで、０．０１質量％から加えたアミノ酸濃度まで制御可能である。また、この洗浄工程を省略して積極的にアミノ酸を含有させた多孔質体を得ることもできる。
　本発明において用いられるフィブロインは、家蚕、野蚕、天蚕等の天然蚕やトランスジェニック蚕から産生されるシルク由来であることが好ましく、その製造方法は問わない。本発明では、フィブロイン水溶液として用いるが、フィブロインは水に対する溶解性が悪く、直接水に溶解することが困難である。フィブロイン水溶液を得る方法としては、公知のいかなる手法を用いてもよいが、高濃度の臭化リチウム水溶液にフィブロインを溶解後、透析による脱塩、風乾による濃縮を経る手法が簡便であり、好ましい。
　本発明のシルクフィブロイン多孔質体の製造方法において、フィブロインの濃度は、後述するアミノ酸を添加したフィブロイン溶液中で０．１～５０質量％であることが好ましく、０．５～２０質量％であることがより好ましく、１～１２質量％であることがさらに好ましい。この範囲内に設定することで、十分な強度を持った多孔質体を効率的に製造することができる。また、シルクフィブロインの配合量を調節することで、必要に応じた強度のシルクフィブロイン多孔質体を得ることができる。例えば、より高い強度のシルクフィブロイン多孔質体を得るには、シルクフィブロインの配合量を５０質量％までの範囲内で高くすることで得ることが可能であるが、３０～５０質量％とすることが好ましく、４０～５０質量％とすることがより好ましい。
　次に、本発明において、フィブロイン水溶液に添加するアミノ酸としては、有害なものを除き特に制限はないが、水溶性のもの（水溶性アミノ酸）が好ましく、水への溶解度が高いものがより好ましい。
　本発明において用いられるアミノ酸としては、例えばバリン，ロイシン，イソロイシン，グリシン，アラニン，セリン，トレオニン，メチオニン等のモノアミノモノカルボン酸、アスパラギン酸，グルタミン酸等のモノアミノジカルボン酸（酸性アミノ酸）、グルタミン等のジアミノカルボン酸などの脂肪族アミノ酸；フェニルアラニン、チロシン等の芳香族アミノ酸；プロリン，ヒドロキシプロリン、トリプトファン等の複素環を有するアミノ酸などが挙げられ、中でも、形態や物性の調整が容易との観点から酸性アミノ酸や、ヒドロキシプロリン、セリン、トレオニン等のオキシアミノ酸が好ましい。
　同様の観点で、酸性アミノ酸の中でもモノアミノジカルボン酸がより好ましく、アスパラギン酸及びグルタミン酸が特に好ましく、オキシアミノ酸の中でもヒドロキシプロリンがより好ましい。これらのアミノ酸は、いずれか１種を単独であるいは２種以上組み合わせて使用することができる。
　本発明の製造方法において、アミノ酸の配合量は、アミノ酸を配合したフィブロイン水溶液中で０．０１～１８質量％であることが好ましく、０．１～５質量％であることがより好ましく、０．５～２質量％であることがさらに好ましい。
　本発明において用いるアミノ酸としては、フィブロインの析出を防止する観点から、水溶液として用いることが好ましい。本発明において、水に対する溶解度が低いアミノ酸を用いる場合には、加熱した水にアミノ酸を溶解させ、その後３０℃以下（例えば、室温）に冷却したアミノ酸水溶液を用いることが好ましい。この冷却の過程でアミノ酸が析出した場合には、ろ過などの方法で除去することが好ましい。
　なお、アミノ酸には、Ｌ型とＤ型の光学異性体があるが、本発明においては、Ｌ型とＤ型を用いた場合に、得られる多孔質体に違いが見られないため、どちらのアミノ酸を用いても良い。
　本発明の製造方法において、特に酸性アミノ酸を使用した場合は、シルクフィブロイン水溶液に酸性アミノ酸を添加したシルクフィブロイン水溶液を、凍結前に該溶液が凝固しない温度で静置することで、より高い強度のシルクフィブロイン多孔質体を得ることができる。この、酸性アミノ酸を添加したシルクフィブロイン水溶液の静置は、該水溶液を型あるいは容器に流し込んで、所定の温度条件下で行えばよい。
　静置する際の温度は、凝固しない温度であれば特に制限はないが、凝固のしにくさ、溶液のゲル化のしにくさ、あるいはフィブロイン分子の分解の起こりにくさを考慮すると、－５～５０℃であることが好ましく、－３～２０℃がより好ましく、３～１０℃がさらに好ましい。静置する温度は、シルクフィブロイン水溶液を恒温槽中に入れるなどして調節できる。シルクフィブロイン水溶液を静置する温度を調節することで、得られるシルクフィブロイン多孔質体の細孔直径や強度を調整することができ、温度を３～１０℃とすることで、細孔直径が小さく、高い強度の多孔質体が得られる。
　シルクフィブロイン水溶液を静置する時間に特に制限はないが、静置する時間を調節することで、必要に応じた強度のシルクフィブロイン多孔質体を得ることができる。例えば、より高い強度の多孔質体が必要であれば静置する時間を１０時間以上とすることが好ましく、４０時間～３００時間とすることがより好ましく、５０時間～３００時間とすることがさらに好ましい。
　本発明のシルクフィブロイン多孔質体の製造方法では、フィブロイン水溶液にアミノ酸を添加したフィブロイン溶液を、型あるいは容器などに流し込み、低温恒温槽などの中に入れて凍結させ、次いで融解することによって、シルクフィブロイン多孔質体を製造する。
　凍結の方法としては、アミノ酸を添加したフィブロイン水溶液を一気に凍結温度まで下げて凍結してもよいが、凍結の前にアミノ酸を添加したフィブロイン水溶液を一旦、４～－９℃程度、好ましくは０～－５℃程度で３０分以上保持して反応容器内を均一にしてから、凍結温度まで下げて凍結した方が均一な構造のシルクフィブロイン多孔質体を得る上で好ましい。さらに、この保持する温度を－１～－９℃程度、好ましくは－１℃～－５℃程度にした場合には、フィブロイン水溶液が、凍結の前に過冷却状態となる温度（過冷却温度）になり、より均一な構造のシルクフィブロイン多孔質体を得ることができる。また、この過冷却温度に保持する時間を調整すること、過冷却温度から凍結温度に下げるまでの温度勾配を調整すること等により、さらに均一な構造のシルクフィブロイン多孔質体をえることができるほか、多孔質体の構造や強度をある程度制御することが可能である。
　次に、凍結したフィブロイン溶液を、融解することによって多孔質体を得る。融解の方法としては、特に制限はなく、自然融解や恒温槽での保管等が挙げられるが、自然融解が簡便な方法である。
　なお、本発明の製造方法により得られるシルクフィブロイン多孔質体は、多孔質体作製時の型あるいは容器を適宜選択することにより、フィルム状、ブロック状、管状等、目的に応じた形状とすることができる。また、原料として用いるシルクフィブロインやアミノ酸の配合量の調整や、アミノ酸の種類の選択により、シルクフィブロイン多孔質体の内部構造と固さを調整することができ、種々の固さを有するゲル状やシート状・ブロック状のシルクフィブロイン多孔質体を得ることができる。
　得られた多孔質体にはアミノ酸が含まれるが、用途に応じて、アミノ酸を除去する必要がある場合には、純水中に静置、超音波洗浄などの方法で多孔質体からアミノ酸を除去して用いることができる。たとえば、多孔質体を、純水中に浸漬して、アミノ酸を除去することが最も簡便な方法として挙げられる。
　また、シルクフィブロイン多孔質体製造後に、水分濃度を調整する方法としては、例えば、シルクフィブロイン多孔質体を乾燥して水分を蒸発させる方法が挙げられる。乾燥の方法としては、自然乾燥、凍結乾燥、加熱乾燥などが挙げられるが、乾燥時の収縮が抑えられるという観点からは、凍結乾燥が好ましい。
　本発明の製造方法により得られるシルクフィブロイン多孔質体は、スポンジ状の多孔質構造を有しており、通常この多孔質体には水が含まれ、含水状態である。多孔質に含まれる水分は、自然乾燥、凍結乾燥、加熱乾燥などで制御できるが、乾燥時の収縮が抑えられる観点からは、凍結乾燥が好ましい。
　本発明の製造方法により得られる多孔質体中の細孔の大きさ（細孔直径）は１～３００μｍ程度であり、フィブロインとアミノ酸の混合比や、上記のように凍結する際の冷却プロセスの条件を調整することである程度制御でき、用途に応じて決定される。特に、静置を行うことにより、細孔直径を好ましくは１～５０μｍという極めて小さいものとすることができる。
　本発明におけるシルクフィブロイン多孔質体の引張弾性率は、適宜調整可能であるが、通常０．０４～１６（ＭＰａ）程度であり、用途に応じて適切な硬さのものを選択することができる。例えば、強度の高い多孔質体が好ましい用途においてはシルクフィブロイン多孔質体作製時にシルクフィブロイン水溶液の濃度を２０％以上とすることが好ましく、そうすることで非常に高い強度を有する多孔質体が得られる。ここで、シルクフィブロイン水溶液に酸性アミノ酸を添加した後、溶液を静置することでさらに強度を高めることもできる。柔らかな多孔質体が好ましい用途ではシルクフィブロイン多孔質体作製時にシルクフィブロイン水溶液の濃度を１～５％とすることが好ましく、そうすることで柔らかな多孔質体が得られる。また、ここで引張弾性率は、本発明のシルクフィブロイン多孔質体から４０ｍｍ×４ｍｍ×４ｍｍの試験片を切り出し、この試験片を２ｍｍ／ｍｉｎの条件で引っ張ったときの強度とひずみをグラフ化し、傾きから求めたものである。
　また、本発明におけるシルクフィブロイン多孔質体の空孔率は、シルクフィブロイン多孔質体作製に使用するシルクフィブロイン水溶液の濃度を調整することで用途に応じて適宜調整可能である。例えば、高い空孔率が求められる用途においては、フィブロイン水溶液の濃度を１０質量％以下とすることが好ましく、それにより空孔率９０％以上の多孔質体を得ることができる。ここで、空孔率は、以下のようにして得られる値である。まず、得られた多孔質体を純水中に１日静置し完全に吸水させ、秤量した後（湿重量）、凍結乾燥して多孔質体中の水分を完全に除去し、再度秤量する（乾燥重量）。次いで、水の密度を１ｇ／ｃｍ3、フィブロインの密度を１．２ｇ／ｃｍ3、含水状態のシルクフィブロイン多孔質体の密度を１ｇ／ｃｍ3と仮定し、次式に従って得られる値をシルクフィブロイン多孔質体の空孔率とした。
　　空孔率＝（湿重量－乾燥重量／１．２）／湿重量×１００
　このように、本発明の製造方法で得られたシルクフィブロイン多孔質体は極めて大きい空孔率を有するものであり、様々な用途において、優れた性能を示すものである。
　本発明のシルクフィブロイン多孔質体は、溶媒を含まないため安全性が高い。したがって、医療分野や、人体に適用する分野への応用が可能である。特に、吸水性が高く、肌触りがよく、かつ安全性にも問題がないことから、保湿等を目的とした化粧品・エステ分野等に広く適用することができる。具体的には、ピーリングパックや化粧用パフとして好適に使用することができる。しかも、アミノ酸を多孔質体中に含んでいるため、角質の保湿効果が期待でき、スキンケア用途等において特に有用である。具体的には、ピーリングパックや化粧用パフとして好適に使用することができる。また、凍結に用いる容器の形状を変えることで、所望の形状のものを容易に得ることができることから、例えば、顔の形状に合わせたフェイスマスクとして好適に使用することができる。
　また、本発明のシルクフィブロイン多孔質体は、吸水量を変えることでその重さを制御することができ、かつ安全性にも問題がないことから、例えば、内視鏡観察下で切除された生体組織を牽引するための重りとして、好適に使用し得る。
　その他、本発明のシルクフィブロイン多孔質体は、強度・吸水性が高く、かつ安全性にも問題がないことから、創傷被覆材や薬剤徐放担体、止血スポンジ等の医療分野、紙おむつや生理用品等の生活日用品分野、組織工学や再生医工学における細胞培養支持体や組織再生支持体、浄水用途・環境分野における微生物や細菌等の住処になる支持体などに好適に使用することができる。
　また、本発明のシルクフィブロイン多孔質体の内、特にゲル状のものは創傷被覆材や、保湿、肌荒れ改善、美白などを目的とした香粧品として好適使用することができる。
　アミノ酸には様々な生理作用が報告されているため、本発明のアミノ酸を含有するシルクフィブロイン多孔質体にもアミノ酸に起因する様々な効果が期待される。期待される具体的な効果を下記に示す。
　Ｌ－アルギニン、Ｌ－セリン、Ｌ－プロリン、Ｌ－ヒドロキシプロリンなどのアミノ酸は塗布することによる創傷治癒促進効果が報告されいるため、本発明のシルクフィブロイン多孔質体を用いた創傷被覆材及びゲル状外用剤には創傷治癒促進効果が、フェイスマスクなどのスキンケア部材には肌荒れ改善、予防効果などが期待できる。
　Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－アスパラギン酸、グリシン、Ｌ－セリン、Ｌ－リジン、Ｌ－プロリン、Ｌ－ヒドロキシプロリンなど多くのアミノ酸は塗布することで肌に対する保湿効果が報告されているため、本発明のシルクフィブロイン多孔質体を用いたフェイスマスクなどのスキンケア部材には肌に対する保湿効果が期待できる。
　Ｌ－オルニチンやその塩など一部のアミノ酸は肌に塗布することによる美白効果が報告されているため、本発明のシルクフィブロイン多孔質体を用いたフェイスマスクなどのスキンケア部材には美白効果が期待できる。
　Ｌ－チロシン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－フェニルアラニンなどの芳香族アミノ酸には紫外線吸収効果が報告されているため、本発明のシルクフィブロイン多孔質体を用いたフェイスマスクなどのスキンケア部材には、日焼け防止効果、美白効果などが期待できる。
　上述の本発明の製造方法により製造されたシルクフィブロイン多孔質体は、製造工程に由来するアミノ酸を含有する。従って、本発明はまた、シルクフィブロイン及びアミノ酸を必須成分として含有するシルクフィブロイン多孔質体をも提供する。
　得られたシルクフィブロイン多孔質体中に含有されるアミノ酸がどの程度残留しているかの定量分析に関しては、バンストライク法、ニンヒドリン法、蛍光ラベル分析、キャピラリ電気泳動分析などで可能である。アミノ酸は、カルボキシル基とアミノ基からなる有機物であるが、主にアミノ基を検出する手法が良く知られている。その中でも、自動アミノ酸分析計（例えば、日立Ｌ－８５００）を使用すると、簡便にアミノ酸の定性・定量分析が可能である。自動アミノ酸分析計は、イオン交換樹脂でアミノ酸を分離したのちに、ニンヒドリン発色を行って検出する。得られたシルクフィブロイン多孔質体に残留しているアミノ酸の濃度は、多孔質体を作製する際に加えたアミノ酸濃度が最大値であり、多孔質体を作製後に洗浄する回数や時間などで、多孔質体中のアミノ酸濃度は、０．０１質量％から加えたアミノ酸濃度まで制御可能である。ただし、使用したフィブロインが全て多孔質体成分とならないで一部残留している可能性があるため、測定前にフィルターなどを利用して試験液からフィブロインを除去する必要がある。
　以下に、本発明を実施例によりさらに具体的に説明するが、本発明は、これらの実施例によってなんら限定されるものではない。
実施例１
（フィブロイン水溶液の調製）
　フィブロイン粉末（ＫＢセーレン社製、商品名：「ＳｉｌｋｐｏｗｄｅｒＩＭ」）２０ｇを９Ｍ臭化リチウム水溶液４００ｍＬに添加し、室温で４時間撹拌して溶解した。遠心分離（１２，０００ｒｐｍ、５分間）後、デカンテーションで沈殿した不溶物を除去したのち、透析チューブ（Spectrum Laboratories, Inc製、Spectra/PorR1 Dialysis Membrane、MWCO6,000～8,000）に注入し、純水製造装置（Millipore製、DirectQ-UV）から採水した超純水５Ｌに対して１２時間の透析を５回繰り返し、次いで、透析チューブ中で体積が１／８程度になるまで風乾し濃縮して、シルクフィブロイン水溶液を得た。
　得られたシルクフィブロイン水溶液２ｍＬをポリスチレン製容器に分取し、秤量した後、庫内温度をあらかじめ－２０℃程度に調整しておいたノンフロン冷蔵冷凍庫（日立製作所製「Ｒ－Ｙ３７０」）の冷凍室で１２時間かけて凍結し、凍結乾燥機（ＥＹＥＬＡ社製、「ＦＤＵ－１２００」）中で７時間凍結乾燥した。得られた乾燥物を凍結乾燥機から取り出して３０秒以内に秤量し、重量減少からシルクフィブロイン水溶液中のシルクフィブロイン濃度（質量％）を定量した。
（アミノ酸水溶液の調製）
　Ｌ－アスパラギン酸（アミノ酸）を上記で調製したシルクフィブロイン水溶液と混合した際の最終濃度が１質量％となる量をはかりとり、８０℃に加熱した純水に加えた後、８０℃を維持するように加熱しながら１０分間撹拌して溶解後、静置して室温まで冷却し、Ｌ－アスパラギン酸水溶液（アミノ酸水溶液）を得た。
（シルクフィブロイン多孔質体の製造）
　上記シルクフィブロイン水溶液にＬ－アスパラギン酸水溶液を添加し、最終的にシルクフィブロイン濃度が５質量％、Ｌ－アスパラギン酸濃度が１質量％であるシルクフィブロイン溶液を調製した。
　このシルクフィブロイン溶液をアルミ板で作製した型（内側サイズ；８０ｍｍ×４０ｍｍ×４ｍｍ）に流し込み、低温恒温槽（ＥＹＥＬＡ社製ＮＣＢ－３３００）に入れて凍結保存した。
　凍結は、予め低温恒温槽を－５℃に冷却しておいて低温恒温槽中にシルクフィブロイン溶液を入れた型を投入して２時間保持し、その後、冷却速度３℃／ｈで、槽内が－２０℃になるまで５時間かけて冷却した後、－２０℃で５時間保持した。凍結した試料を自然解凍で室温に戻してから、型から取り出すことによってシルクフィブロイン多孔質体を得た。該シルクフィブロイン多孔質体は、型として用いた容器の形状を保持した硬い多孔質体となった。
　本発明の製造方法によって得られるシルクフィブロイン多孔質体は、使用する目的によっては、得られたシルクフィブロイン多孔質体をそのまま使用できるが、多孔質体中の水分中に残留するＬ－アスパラギンを取り除くこともできる。本実施例では、得られた多孔質体を超純水に浸漬し、超純水を１日２回、３日間交換することによって、使用したＬ－アスパラギン酸を除去した。
（走査型電子顕微鏡による観察）
　得られたシルクフィブロイン多孔質体の構造を、走査型電子顕微鏡を用いて観察した。走査型電子顕微鏡は、Ｐｈｉｌｉｐｓ社製ＸＬ３０－ＦＥＧを使用して、低真空無蒸着モード、加速電圧１０ｋＶで測定を行った。なお、シルクフィブロイン多孔質体の構造は、多孔質体の表面ではなく、多孔質体を切断して露出させた内部を観察した。得られたシルクフィブロイン多孔質体の断面の走査型電子顕微鏡写真を図１に示す。なお、使用したアミノ酸を除去する工程がある場合でも、無い場合でも、得られる多孔質体の内部構造は基本的に同じである。該多孔質体には、細孔が観察され、その細孔の大きさ（細孔直径）は、１０～３００μｍ程度であった。
（引張弾性率）
　シルクフィブロイン多孔質体の力学的特性を、ＩＮＳＴＲＯＮ社マイクロテスター５５４８型を用いて評価した。作成したシルクフィブロイン多孔質体から４０ｍｍ×４ｍｍ×４ｍｍの試験片を切り出し、この試験片を２ｍｍ／ｍｉｎの条件で引っ張ったときの強度とひずみをグラフ化し、傾きから引張弾性率を求めた。その結果を表２に示す。なお、引張弾性率は、作製した多孔質体から５点の試験片を作製し、さらに異なる日に作製したシルクフィブロイン多孔質体から５点の試験片を切り出し、それら１０点について測定を行った平均値を示している。
（空孔率）
　得られたシルクフィブロイン多孔質体を純水中に１日静置し完全に吸水させ、秤量した後（湿重量）、凍結乾燥してシルクフィブロイン多孔質体中の水分を完全に除去し、再度秤量した（乾燥重量）。水の密度を１ｇ／ｃｍ3、シルクフィブロインの密度を１．２ｇ／ｃｍ3、含水状態のシルクフィブロイン多孔質体の密度を１ｇ／ｃｍ3と仮定し、次式に従ってシルクフィブロイン多孔質体の空孔率の測定を行った。その結果を表２に示す。
　　空孔率＝（湿重量－乾燥重量／１．２）／湿重量×１００
実施例２～１１
　実施例１において、添加するアミノ酸、シルクフィブロイン濃度、及び静置を行う場合は静置条件を第２表に示されるようにした以外は実施例１と同様にしてシルクフィブロイン多孔質体を得た。これらの実施例で得られたシルクフィブロイン多孔質体は、実施例１と同様に、型として用いた容器の形状を保持した硬いシルクフィブロイン多孔質体であった。実施例１、２、３、５及び９で得られたシルクフィブロイン多孔質体について、実施例１と同様にして観察したシルクフィブロイン多孔質体の内部断面の走査型電子顕微鏡写真を各々図２、３、４及び５に示す。また、実施例１と同様にして、各種物性の測定を行った。得られた結果を第２表に示す。
実施例１２～２４
　実施例１において、Ｌ－アスパラギン酸に代えて、第１表に示されるアミノ酸を用いたこと以外は実施例１と同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。該シルクフィブロイン多孔質体は、型として用いた容器の形状を保持したものであり、実施例１２～２１で得られたシルクフィブロイン多孔質体は、柔らかい多孔質体となる場合とゲル状の多孔質体になる場合があった。
　また、実施例２２～２４で得られたシルクフィブロイン多孔質体は、型として用いた容器の形状を保持したゲル状の多孔質体となった。実施例１２～２４で得られたシルクフィブロイン多孔質体について、実施例１と同様にして観察した多孔質体の内部断面の走査型電子顕微鏡写真を各々図６～１８に示す。該多孔質体には、細孔が観察され、その細孔の大きさ（細孔直径）は、１０～３００μｍ程度であった。
実施例２５及び２６
　実施例１において、Ｌ－アスパラギン酸に代えて、第１表に示されるように、それぞれＬ－チロシン及びＬ－トリプトファンを用いたこと以外は実施例１と同様にして、シルクフィブロイン多孔質体を得た。但し、Ｌ－チロシン及びＬ－トリプトファンをそれぞれ純水に溶解させた後の冷却過程で、Ｌ－チロシン及びＬ－トリプトファンの析出が生じたので、ろ過により析出物を除去した。得られたシルクフィブロイン多孔質体は、型として用いた容器の形状を保持したゲル状の多孔質体となった。
　実施例１と同様にして観察した多孔質体の内部断面の走査型電子顕微鏡写真をそれぞれ図１９及び２０に示す。いずれの多孔質体においても、細孔が観察され、その細孔の大きさ（細孔直径）は、１０～３００μｍ程度であった。
実施例２７～２９
（アミノ酸含有率）
　得られたシルクフィブロイン多孔質体中に含有されるアミノ酸の定性・定量分析を、自動アミノ酸分析計（日立製Ｌ－８５００）を使用して行った。自動アミノ酸分析計は、イオン交換樹脂でアミノ酸を分離したのちに、ニンヒドリン発色を行って検出するために定量分析のみならず、定性分析も同時に行える。ただし、使用したシルクフィブロインが全て多孔質体成分とならないで一部水溶液中に残留している可能性があるため、測定前に試験液からシルクフィブロインを除去した。
　実施例１，５，９で作製したシルクフィブロイン多孔質体を最後の超純水で洗浄する工程において、洗浄前、１２時間洗浄後、２４時間洗浄後、３６時間洗浄後、４８時間洗浄後、６０時間洗浄後、７２時間洗浄後に各々試料を回収し、それらのシルクフィブロイン多孔質体中に含まれる水分を回収した。次に、ミリポア社アミコンウルトラ遠心フィルターキット（分画分子量：５０００及び１００００）を用いて、シルクフィブロインを除去し、濾液を回収した。これら濾液を自動アミノ酸分析計で測定し、含まれるアミノ酸の定性・定量分析を行った。試料量は１０マイクロリットル、イオン交換樹脂は陽イオン交換樹脂である＃２６２２、アミノ酸分離時のカラムサイズ４．６ｍｍ×６０ｍｍ、アンモニアトラップ時のカラムサイズ４．６ｍｍ×４０ｍｍ、流速は０．３０ｍＬ／分、検出器は５７０ｎｍと４４０ｎｍの可視光を使用した。得られた結果を第３表に示す。全ての実施例について、洗浄時間（回数）とともに、シルクフィブロイン多孔質体中のアミノ酸が減少していくことが分かった。したがって、得られたシルクフィブロイン多孔質体に残留しているアミノ酸の濃度は、多孔質体を作製する際に加えたアミノ酸濃度が最大値であり、多孔質体を作製後に洗浄する回数や時間などで、多孔質体中のアミノ酸濃度は、ゼロから加えたアミノ酸濃度まで制御可能である。なお、洗浄前で検出されたアミノ酸濃度がシルクフィブロイン多孔質体作製時に添加した濃度以下であることは、添加したアミノ酸の一部が多孔質体を形成しているシルクフィブロインに何らかの形（例えば、吸着など）で取り込まれているからであると思われる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 　　　
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
            
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　本発明のシルクフィブロイン多孔質体および本発明の製造方法により得られるシルクフィブロイン多孔質体は、安全性に優れるため、医療分野や、人体に適用する分野への応用が可能である。具体的には、化粧品・エステ分野等に広く適用することができ、顔の形状に合わせたフェイスマスクとして極めて有用である。
　また、創傷被覆材や薬剤徐放担体、止血スポンジ等の医療分野、紙おむつや生理用品等の生活日用品分野、組織工学や再生医工学における細胞培養支持体や組織再生支持体、浄水用途・環境分野における微生物や細菌等の住処になる支持体など種々の産業に適用が可能である。

Claims (13)

  1. 　シルクフィブロイン及びアミノ酸を含有するシルクフィブロイン多孔質体。
  2. 　前記アミノ酸が酸性アミノ酸である請求項１に記載のシルクフィブロイン多孔質体。
  3. 　前記アミノ酸がオキシアミノ酸である請求項１に記載のシルクフィブロイン多孔質体。
  4. 　前記酸性アミノ酸がモノアミノジカルボン酸である請求項２に記載のシルクフィブロイン多孔質体。
  5. 　前記モノアミノジカルボン酸がアスパラギン酸又はグルタミン酸である請求項４に記載のシルクフィブロイン多孔質体。
  6. 　前記オキシアミノ酸がヒドロキシプロリンである請求項３に記載のシルクフィブロイン多孔質体。
  7. 　フィブロイン水溶液にアミノ酸を添加したフィブロイン溶液を凍結し、次いで融解することにより、多孔質体を得ることを特徴とするシルクフィブロイン多孔質体の製造方法。
  8. 　融解後に得られた前記多孔質体を、純水中に浸漬してアミノ酸を除去する工程をさらに含む請求項７に記載のシルクフィブロイン多孔質体の製造方法。
  9. 　融解後に得られた前記多孔質体を、純水中に浸漬してアミノ酸を除去する工程を含まない請求項７に記載のシルクフィブロイン多孔質体の製造方法。
  10. 　前記アミノ酸を添加したフィブロイン溶液を凍結前に、一定時間過冷却状態で保持することを特徴とする請求項７～９のいずれかに記載のシルクフィブロイン多孔質体の製造方法。
  11. 　前記アミノ酸を添加したフィブロイン溶液を凍結前に、該溶液が凝固しない温度で１０時間以上静置することを特徴とする請求項７～１０のいずれかに記載のシルクフィブロイン多孔質体の製造方法。
  12. 　前記アミノ酸の添加量が、フィブロイン溶液中で０．０１～１８質量％である請求項７～１１のいずれかに記載のシルクフィブロイン多孔質体の製造方法。
  13. 　フィブロインの濃度が、前記アミノ酸を添加したフィブロイン溶液中で０．１～４０質量％である請求項７～１２のいずれかに記載のシルクフィブロイン多孔質体の製造方法。
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