WO2010001977A1 - ペプチド含有調味料 - Google Patents

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WO2010001977A1
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fermented seasoning
activity
peptide
soy sauce
fermented
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PCT/JP2009/062154
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仲原 丈晴
理一郎 内田
花田 洋一
良知 遠藤
茂紀 谷沢
仁美 青田
精一 原
Original Assignee
キッコーマン株式会社
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    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23LFOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L27/00Spices; Flavouring agents or condiments; Artificial sweetening agents; Table salts; Dietetic salt substitutes; Preparation or treatment thereof
    • A23L27/20Synthetic spices, flavouring agents or condiments
    • A23L27/24Synthetic spices, flavouring agents or condiments prepared by fermentation
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A23FOODS OR FOODSTUFFS; TREATMENT THEREOF, NOT COVERED BY OTHER CLASSES
    • A23LFOODS, FOODSTUFFS, OR NON-ALCOHOLIC BEVERAGES, NOT COVERED BY SUBCLASSES A21D OR A23B-A23J; THEIR PREPARATION OR TREATMENT, e.g. COOKING, MODIFICATION OF NUTRITIVE QUALITIES, PHYSICAL TREATMENT; PRESERVATION OF FOODS OR FOODSTUFFS, IN GENERAL
    • A23L27/00Spices; Flavouring agents or condiments; Artificial sweetening agents; Table salts; Dietetic salt substitutes; Preparation or treatment thereof
    • A23L27/50Soya sauce

Definitions

  • the present invention relates to a fermented seasoning having a good flavor and having little peptide bitterness despite being rich in peptides.
  • a method for producing a peptide As a method for producing a peptide, a method of chemically synthesizing or a method of hydrolyzing a protein-containing material with a protease agent is widely used as a well-known method. In the former case, however, a chemical is used. It is unsuitable for ingestion, and in the latter case, there are problems that the production cost is high and that the ingestion is not easy due to the strong bitterness of the peptide.
  • soy sauce is a seasoning that has been used since ancient times, but a rich umami is brought about by the decomposition of enzymes produced by koji molds in soybeans and wheat.
  • This umami occurs when proteases act on the raw protein to solubilize as peptides, and peptidases act on these peptides to decompose them into amino acids such as glutamic acid.
  • soy sauce technology development for many years has focused on degrading proteins and peptides to amino acids as much as possible to enhance the taste.
  • soy sauce In the brewing of soy sauce, it is considered that the peptide remains in the soy sauce if it is not decomposed by the peptidase after being released by the protease. Therefore, although it is expected to have various beneficial physiological activities as described above, it is extremely difficult to specifically control the peptidase activity in the normal charging process, so such soy sauce or fermented seasoning The fee has never been invented.
  • the problem to be solved by the present invention is to provide a fermented seasoning that does not have a bitter taste peculiar to a peptide and is easy to be taken orally despite containing a lot of peptides having useful physiological activity.
  • LAP-I activity in moromi mash is 1.0 U / ml or less
  • leucine aminopeptidase-II activity is 0.5 U / ml
  • the fermented seasoning obtained by controlling to less than ml has a sufficient nitrogen utilization rate, but surprisingly contains much more peptide than ordinary soy sauce, and does not feel the bitterness peculiar to peptides, and is mellow. It discovered that it had abundant umami
  • the present invention 1) Bacilli culture, or a mixture of Aspergillus oryzae culture and plant-derived protein raw material, charged with salt water, and within 10 days after charging, the leucine aminopeptidase-I activity in the moromi soup is 1.0 U / ml And a fermented seasoning obtained by controlling leucine aminopeptidase-II activity to 0.5 U / ml or less, 2) The fermented seasoning according to 1) above, wherein the soluble total nitrogen is 1.2% or more and the soluble peptide is 40 mg / ml or more, 3) The fermented seasoning according to 1) or 2) above, wherein the soluble total nitrogen is 1.2% or more and the amination ratio to the soluble total nitrogen is 55% or less, 4) The fermented seasoning according to any one of 1) to 3) above, wherein the soluble total nitrogen is 1.2% or more and the free amino group concentration per 1% of the soluble total nitrogen is 0.35 mol / L or less.
  • a fermented seasoning is provided.
  • a fermented seasoning which does not have a bitter taste peculiar to peptides but can be easily taken orally despite containing a lot of useful physiologically active peptides.
  • FIG. 2 is a diagram showing an HPLC chromatogram of composition 1.
  • FIG. It is a figure which shows the HPLC chromatogram of dark mouth soy sauce. It is a figure which shows the change of the systolic blood pressure when the direction whose blood pressure is high ingested the fermented seasoning of this invention.
  • the fermented seasoning of the present invention is prepared by adding salt water to a koji mold culture or a mixture of koji mold culture and plant-derived protein raw material, and leucine aminopeptidase-I activity in moromi mash juice within 10 days after charging Is controlled to 1.0 U / ml or less and leucine aminopeptidase-II activity to 0.5 U / ml or less.
  • a soy sauce koji widely used in soy sauce brewing can be used.
  • a koji mold is inoculated into a solid medium containing soybeans, wheat, etc. It can be obtained by culturing at 45 ° C. for 12 to 240 hours.
  • liquid culture koji used for the production of fermented seasonings can also be used.
  • koji molds are inoculated into a liquid medium containing 1 to 5% soybean, wheat, wheat bran, etc. It can be obtained by culturing at 45 ° C. for 24 to 120 hours.
  • any material can be used as long as the object of the present invention can be achieved, but in order to give a suitable flavor as a seasoning, soybeans, defatted soybeans, purified soybean proteins, Wheat, wheat gluten, rice, or purified rice protein should be used.
  • These raw materials can be used after being subjected to protein denaturation treatment as they are or after being crushed and pulverized.
  • protein denaturation treatment pressure steaming and puffing treatment, which are widely used in industry, are preferable.
  • the charging conditions are as follows: Aspergillus oryzae culture and plant-derived protein material mixed at a ratio of 5:95 to 100: 0, preferably 10:90 to 80:20, and 30 to 500% by weight, preferably Add 100-300% saline.
  • the concentration of the saline solution may be adjusted to 0.1 to 20%, preferably 6 to 18%, as the salt concentration of the moromi soup.
  • this mixture is put in a container capable of temperature control and fermented at 25 to 60 ° C., preferably 30 to 55 ° C., for 6 to 720 hours, preferably 12 to 240 hours. During this time, moromi may be appropriately stirred with a stirring blade or compressed air.
  • the desired fermented seasoning can be obtained by controlling the LAP-I activity in the moromi soup to 1.0 U / ml or less and the LAP-II activity to 0.5 U / ml or less within 10 days after charging. it can.
  • the fermented seasoning is in the form of soy sauce moromi, but a liquid fermented seasoning containing a soluble peptide can also be obtained by removing solids as necessary.
  • the solid content can be removed by wrapping the moromi in a filter cloth made of synthetic fiber such as nylon and pressurizing, or by putting the moromi in a filter cloth stretched between the filter plate and the compression plate, and using compressed air.
  • a known method such as a filter press method in which pressure is applied can be used.
  • a yeast such as Tigosaccharomyces
  • 10 4 pieces / ml to 10 8 pieces / ml, preferably 10 5 to 10 7 pieces / ml of yeast are added to moromi, and 20 to 35 ° C., preferably 25 to 30 ° C., for 3 days.
  • it is preferably fermented for 5 to 10 days.
  • stirring and aeration are appropriately performed.
  • the amount of peptides hardly decreases.
  • the fermented seasoning is remarkably different from the conventionally known peptide-containing compositions, and hardly has a bitter taste, and is mild and rich with mild and rich umami and richness. It has a good aroma and can be ingested deliciously as a seasoning.
  • the fermented seasoning has a preferred flavor, it can be added to soy sauce to make soy sauce or processed soy sauce, or mixed with various raw materials to prepare soy sauce, sauce, pants, sauce, dressing, soup, side dish It is also suitable for processing into beverages and supplements.
  • the peptide can be concentrated or separated and purified from the fermented seasoning.
  • Examples of the method include vacuum concentration, ultrafiltration, dialysis, various chromatographies and the like. These are generally widely used methods.
  • Soy sauce cake was obtained by adding spores of Aspergillus soya to a solid medium containing equal amounts of heat-denatured soybean and wheat and smelting at 25 to 40 ° C. for 72 hours. Next, 14 kg of heat-denatured soybean, 2 kg of soy sauce cake, 16 L of water and 3 kg of sodium chloride were mixed and stirred at 45 ° C. and 100 rpm. After 10 days, moromi was obtained in which the LAP-I activity in the moromi mash was reduced to 1.0 U / ml or less and the LAP-II activity was reduced to 0.5 U / ml or less.
  • yeast Tigosaccharomyces rouxii was mixed at a rate of 1.5 ⁇ 10 6 pieces / ml and allowed to stand at 25 ° C. for 7 days.
  • an insoluble solid was removed from the moromi using a hydraulic press to obtain a clarified liquid.
  • enzyme inactivation and sterilization were performed by heating at 117 ° C. for 5 seconds using an HS sterilizer (manufactured by Nisaka Seisakusho), and after standing at 50 ° C. for 3 days, only the supernatant containing no sputum component was obtained. 20 L was collected (Composition 1; the present invention fermented seasoning).
  • the fermented seasoning was prepared by the same method using 3.2 kg of soybeans and 12.8 kg of soy sauce cake. (Composition 2; fermented seasoning of the present invention). Furthermore, a fermented seasoning was prepared in the same manner using 16 kg of soy sauce koji without adding soybean at the time of preparation (Composition 3; the fermented seasoning of the present invention).
  • LAP-I activity was measured by the method described in Japanese Patent No. 3727780 using L-leucine-p-nitroanilide as a substrate.
  • the LAP-II activity is described in Japanese Patent No. 3727780 by using moromi soup on a PD-10 column (GE Healthcare Buy Science) to remove free amino acids and using L-leucyl-glycyl-glycine as a substrate. It measured by the method of.
  • Acid carboxypeptidase (ACP) activity was measured according to a conventional method using an acid carboxypeptidase activity measurement kit (manufactured by Kikkoman Corp.) after removing the free amino acid from the moromi soup on a PD-10 column.
  • Dipeptidyl peptidase IV (DPP-IV) activity is determined according to Agnes Doumas et al. , Applied and Environmental Microbiology, 1998, vol. 64, no. 12, p. It was measured by the method described in 4809-4815 (Table 1). Even when ACP and DPP-IV were charged at 45 ° C. for 10 days, the activity did not change to 15 ° C., but the activity of LAP decreased at 45 ° C.
  • composition 3 fermented seasoning of the present invention.
  • compositions 1, 2 various enzyme activities in moromi decreased further
  • compositions 1, 2 the present invention fermented seasoning
  • the same fermented seasoning as the composition 3 was prepared using koji of different production lots, a case having a higher LAP activity than the present invention was also observed (Comparative Example 1).
  • Soluble total nitrogen (TN) was measured according to a conventional method using a Keltec autosampler system 1035 (manufactured by Actac). The amount of peptide was heated at 110 ° C. for 24 hours in the presence of 6N hydrochloric acid, and then analyzed for all amino acids using an amino acid analyzer L-8500 (manufactured by Hitachi, Ltd.). Asked. The amination rate is the ratio of the total amino acid concentration to TN. In addition, 6.25 which is a general nitrogen coefficient of soybean protein was used for calculation of TN.
  • the free amino group concentration was determined by reacting with an equal amount of OPA reagent (manufactured by Agilent Technologies), measuring fluorescence intensity at Ex: 350 nm, Em: 450 nm, and using a calibration curve prepared with glycine at known concentrations.
  • the amounts of Gly-Tyr and Ser-Tyr were determined by an addition calibration curve method using an LC-MS / MS system 2695-QuatroMicro API (manufactured by Waters).
  • Compositions 1, 2, and 3 (invented fermented seasoning) with reduced LAP activity have a higher amount of peptide, lower amination rate, and lower free amino group concentration per TN of 1% than concentrated soy sauce. (Table 2).
  • Comparative Example 1 prepared in the same manner as Composition 3 using cocoons of different production lots has a low peptide amount, a high amination rate, and a high free amino acid concentration per TN 1%. Therefore, in order to obtain the fermented seasoning containing a high peptide content of the present invention, it is essential to control the LAP-I activity to 1.0 U / ml or less and the LAP-II activity to 0.5 U / ml or less. It can be said that this has not been known in the past.
  • HPLC High-performance liquid chromatography
  • Composition 1 the present invention fermented seasoning
  • Puresil C18 column 4.6 ⁇ 250 mm, manufactured by Waters
  • Detection was at an absorbance of 220 nm. It is generally known that most of the peaks observed under these analysis conditions are derived from peptides. 1 and FIG.
  • composition 1 shows a wide variety of peptides, and the amount thereof is significantly higher than that of ordinary concentrated soy sauce.
  • the large peaks (indicated by ⁇ ) of 15 minutes, 18 minutes, and 23 minutes that are also observed in concentrated soy sauce are not peptides but amino acids Tyr, Phe, and Trp, respectively. It was also confirmed that the other amino acids were hardly retained in this column and eluted in 5 minutes or less.
  • a fermentation seasoning was prepared in the same manner using Alcalase 2.4L-FG (manufactured by Novozymes), which is a food protease agent, instead of soy sauce cake (Comparative Example 2). Sensory evaluation was performed using composition 1 (present invention fermented seasoning) and Comparative Example 2. The panel consisted of 8 persons, and “bitterness strength” and “taste taste” were evaluated by a paired comparison method. From the results in Table 3, it can be seen that the fermented seasoning of the present invention has a good taste with little bitterness despite containing a large amount of peptide. Although many methods for producing peptides using protease agents have been disclosed so far, the present invention is considered superior to the prior art in terms of taste.
  • Subjects were allowed to ingest the test food or control food once a day for 12 weeks by using one bag (8 ml) for cooking at any time (standard daily intake of soy sauce 8 ml at home) Per minute, containing 430 ⁇ g of Gly-Tyr and 250 ⁇ g of Ser-Tyr).
  • a gradual antihypertensive effect was observed over time by ingesting the test food of the present invention (FIG. 3), and the systolic blood pressure significantly decreased after 4 weeks of ingestion compared with the value before ingestion. Indicated.
  • systolic blood pressure significantly decreased after 8 weeks after ingestion.
  • the fermented seasoning of the present invention has a significant antihypertensive action by the peptide as compared with the reduced salt soy sauce, and contains Gly-Tyr of 40 ⁇ g / ml or more and Ser-Tyr of 20 ⁇ g / ml or more. It became clear that the effect was remarkable.
  • the fermented seasoning obtained by the present invention contains a large amount of peptide, it has no bitterness peculiar to peptides and is easy to take orally, so it can be expected to exert useful physiological activity and contribute to people's health. .

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Abstract

 有用な生理活性を有するペプチドを多く含むにも関わらず、ペプチド特有の苦味が無く経口摂取が容易な発酵調味料を提供する。麹菌培養物、もしくは麹菌培養物と植物由来タンパク質原料を混合したものに、塩水を加えて仕込み、仕込み後10日以内に諸味液汁中のロイシンアミノペプチダーゼ-I活性を1.0U/ml以下、かつ、ロイシンアミノペプチダーゼ-II活性を0.5U/ml以下に制御することにより発酵調味料を得る。

Description

ペプチド含有調味料
 本発明は、ペプチドを豊富に含有するにも関わらずペプチドの苦味がほとんどない、風味良好な発酵調味料に関する。
 近年、ペプチドが有する様々な機能性が明らかとなってきている。例えば、Gly-Tyr、Ser-Tyrは、アンジオテンシン変換酵素阻害作用ならびに血圧降下作用が報告されている(例えば、非特許文献1参照)。さらには、様々なペプチドにおいて、抗酸化、抗がん、血圧上昇抑制、血中コレステロール低下、オピオイド活性なども報告されている(例えば、非特許文献2参照)。したがって、ペプチドを摂取することにより、人々の健康に寄与する様々な生理効果が期待できる。
 ペプチドの製造法としては、化学的に合成する方法やタンパク質を含む素材をプロテアーゼ剤により加水分解する方法が周知の方法として広く用いられているが、前者の場合は化学薬品を使用することから経口摂取に不向きであり、後者の場合は製造コストが高くなったり、ペプチドの苦味が強いために経口摂取が容易にできないという問題がある。
 ペプチドの苦味の解決策としては、これまでにもいくつかの技術が考案されている。例えば、サイクロデキストリンを添加する方法(例えば、特許文献1参照)、オリゴ糖を添加する方法、(例えば、特許文献2参照)、有機酸類並びに糖類を添加する方法(例えば、特許文献3参照)、リン脂質類を添加する方法(例えば、特許文献4参照)、合成吸着樹脂と接触処理する方法(例えば、特許文献5参照)などが開示されている。しかしながら、マスキング剤によって新たな異味が生じたり、製造コストが著しく上昇するなど、効果の点において充分とはいえないのが現状である。
 ところで、醤油は古来より使用されてきた調味料であるが、大豆と小麦を麹菌の産生する酵素が分解することにより、豊かな旨味が醸し出される。この旨味は、原料のタンパク質にプロテアーゼが作用してペプチドとして可溶化し、さらにこれらのペプチドにペプチダーゼが作用してグルタミン酸をはじめとしたアミノ酸に分解することにより生じる。このため、長年にわたる醤油の技術開発は、タンパク質やペプチドを極力アミノ酸まで分解し、旨味を強化することに主眼が置かれてきた。
 醤油の醸造において、プロテアーゼによりペプチドが遊離した後、ペプチダーゼによる分解を受けなければ、醤油中にペプチドが残存すると考えられる。したがって、前述のような様々な有益な生理活性を有すると期待されるが、通常の仕込工程においてはペプチダーゼ活性を特異的に制御することは極めて困難であることから、そのような醤油あるいは発酵調味料は、これまで発明されていなかった。
日本国特開2006-75064号公報 日本国特開2007-97465号公報 日本国特開平11-118160号公報 日本国特開平8-173093号公報 日本国特開2003-40900号公報
K. Suetsuna,J. Nutr. Biochem.,1998,(9),p.415-419 Wenyi Wang et al., Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety,2005,(4),p.63-78
 本発明が解決しようとする課題は、有用な生理活性を有するペプチドを多く含むにも関わらず、ペプチド特有の苦味が無く経口摂取が容易な発酵調味料を提供することである。
 本発明者等は、上記課題を解決するため鋭意研究を重ねた結果、麹菌培養物、もしくは麹菌培養物と植物由来タンパク質原料を混合したものに、塩水を加えて仕込み、仕込み後10日以内に、諸味液汁中のロイシンアミノペプチダーゼ-I(以下、LAP-Iともいう)活性を1.0U/ml以下、かつ、ロイシンアミノペプチダーゼ-II(以下、LAP-IIともいう)活性を0.5U/ml以下に制御することにより得られる発酵調味料は、充分な窒素利用率でありながら、驚くべきことに通常の醤油より遥かに多いペプチドを含有し、ペプチド特有の苦味が感じられず、まろやかで豊富な旨味を有することを見出し、本発明に至った。
 すなわち本発明は、
1)麹菌培養物、もしくは麹菌培養物と植物由来タンパク質原料を混合したものに、塩水を加えて仕込み、仕込み後10日以内に、諸味液汁中のロイシンアミノペプチダーゼ-I活性を1.0U/ml以下、かつ、ロイシンアミノペプチダーゼ-II活性を0.5U/ml以下に制御することにより得られる発酵調味料、
2)可溶性総窒素を1.2%以上、かつ、可溶性ペプチドを40mg/ml以上含有する上記1)記載の発酵調味料、
3)可溶性総窒素が1.2%以上、かつ、可溶性総窒素に対するアミノ化率が55%以下である上記1)あるいは2)記載の発酵調味料、
4)可溶性総窒素が1.2%以上、かつ、可溶性総窒素1%あたりの遊離アミノ基濃度が0.35mol/L以下である上記1)~3)のいずれかに記載の発酵調味料、
5)ジペプチドGly-Tyrを40μg/ml以上含有する上記1)~4)のいずれかに記載の発酵調味料、
6)ジペプチドSer-Tyrを20μg/ml以上含有する上記1)~5)のいずれかに記載の発酵調味料、および
7) 発酵調味料が醤油である上記1)~6)のいずれかに記載の発酵調味料
を提供するものである。
 本発明により、有用な生理活性を有するペプチドを多く含むにも関わらず、ペプチド特有の苦味が無く経口摂取が容易な発酵調味料が提供された。
組成物1のHPLCクロマトグラムを示す図である。 濃口醤油のHPLCクロマトグラムを示す図である。 本発明の発酵調味料を血圧が高めの方が摂取したときの収縮期血圧の変化を示す図である。
 以下、本発明を詳細に説明する。
 本発明の発酵調味料は、麹菌培養物、もしくは、麹菌培養物と植物由来タンパク質原料を混合したものに塩水を加えて仕込み、仕込み後10日以内に、諸味液汁中のロイシンアミノペプチダーゼ-I活性を1.0U/ml以下、かつ、ロイシンアミノペプチダーゼ-II活性を0.5U/ml以下に制御することにより得られる。
 本発明の麹菌培養物としては、醤油醸造で広く一般的に用いられている醤油麹を使用することができ、具体的には、大豆や小麦等を含む固体培地に麹菌を接種し、25~45℃で、12~240時間培養して得ることができる。また、発酵調味料の製造に使用されている液体培養麹を使用することもでき、具体的には、大豆や小麦、小麦フスマ等を1~5%含む液体培地に麹菌を接種し、25~45℃で、24~120時間培養して得ることができる。
 本発明の植物由来タンパク質原料としては、本発明の目的を達成できる限りいかなるものを用いても良いが、調味料として好適な風味を持たせるためには、大豆、脱脂加工大豆、精製大豆タンパク質、小麦、小麦グルテン、米、精製米タンパク質を用いるのが良い。これらの原料を、そのままあるいは割砕、粉砕してから、適宜タンパク質変性処理を施し、用いることができる。タンパク質変性処理としては、工業的に広く行われている加圧蒸煮や膨化処理が好ましい。
 仕込みの条件としては、麹菌培養物と植物由来タンパク質原料を5:95~100:0、好ましくは10:90~80:20の比で混合したものに、重量比で30~500%、好ましくは100~300%の食塩水を加える。食塩水の濃度は、諸味液汁の食塩濃度として0.1~20%、好ましくは6~18%となるよう調整するのが良い。さらに、この混合物を温度制御が可能な容器に入れ、25~60℃、好ましくは30~55℃で、6~720時間、好ましくは12~240時間発酵させる。この間、攪拌翼や圧縮空気等によって適宜諸味を攪拌してもよい。麹菌培養物の初発のロイシンアミノペプチダーゼ(以下、LAPともいう)活性、麹菌培養物と植物由来タンパク質原料の混合比、仕込み温度、仕込み時間等の影響で諸味液汁中のLAP活性は変化するが、仕込み後10日以内に諸味液汁中のLAP-I活性を1.0U/ml以下、かつ、LAP-II活性を0.5U/ml以下に制御することにより、目的の発酵調味料を得ることができる。
 前記発酵調味料は醤油諸味様の形態であるが、必要に応じ固形分を除去することにより、可溶性ペプチドを含む液体状の発酵調味料を得ることもできる。固形分を除去する方法としては、ナイロンなどの合成繊維でできた濾布で諸味を包み、加圧する厚揚げ方式や、濾過板と圧搾板に張った濾布の中に諸味を入れ、圧縮空気等で加圧するフィルタープレス方式等の周知の方法を用いることができる。
 前記発酵調味料にチゴサッカロマイセス属等の酵母を添加して、発酵させることにより、香味をさらに向上させることも可能である。具体的には、諸味に10個/ml~10個/ml、好ましくは10~10個/mlの酵母を添加し、20~35℃、好ましくは25~30℃で、3日以上、好ましくは5~10日発酵させる。発酵を旺盛にするために、適宜攪拌や通気を行う。なお、この条件で発酵させてもペプチド量はほとんど減少しない。
 前記発酵調味料は、ペプチドを多量に含有するにもかかわらず、従来知られているペプチド含有組成物とは著しく異なり、苦味がほとんど感じられず、まろやかで豊富な旨味・コクと、穏やかで優れた芳香を有し、調味料としておいしく摂取できるものである。
 前記発酵調味料は、好ましい風味を有することから、醤油に添加して醤油あるいは醤油加工品としたり、各種原料と混合して、つゆ、たれ、ぽんず、ソース、ドレッシング、スープ、惣菜のもと、飲料、サプリメント等に加工して使用するにも好適である。
 さらに、前記発酵調味料からペプチドを濃縮あるいは分離精製することもできる。その方法としては、減圧濃縮、限外濾過、透析、各種クロマトグラフィー等が挙げられる。これらは、一般に広く用いられている方法である。
 以下、実施例に即して本発明を具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの記載によってなんら制限されるものではない。
<ペプチド含有発酵調味料の製造>
 加熱変性した大豆と小麦を等量含む固体培地に、麹菌アスペルギルス・ソーヤの胞子を添加して、25~40℃で72時間製麹することにより醤油麹を得た。次に、加熱変性した大豆14kg、醤油麹2kg、水16L、食塩3kgを混合し、45℃、100rpmで攪拌した。10日後に、諸味液汁中のLAP-I活性が1.0U/ml以下、かつ、LAP-II活性が0.5U/ml以下に低下した諸味を得た。次いで、酵母チゴサッカロマイセス・ルーキシーを1.5×10個/mlの割合で混合し、25℃で7日間静置した。次いで、油圧式圧搾機を用いて諸味から不溶性固形分を除去し、清澄液を得た。さらに、HS殺菌機(日阪製作所社製)を用いて117℃で5秒間加熱することにより酵素失活と殺菌を行い、50℃で3日間静置した後、滓成分を含まない上清のみを20L採取した(組成物1;本発明発酵調味料)。また、大豆3.2kg、醤油麹12.8kgを用いて、同様の方法で発酵調味料を調製した。(組成物2;本発明発酵調味料)。さらに、仕込み時に大豆を加えず、醤油麹16kgを用いて、同様の方法で発酵調味料を調製した(組成物3;本発明発酵調味料)。
 仕込後10日目の諸味をろ過し、得られた液汁の各種ペプチダーゼ活性を測定した。LAP-I活性は、L-ロイシン-p-ニトロアニリドを基質とし、特許第3727780号公報に記載の方法で測定した。LAP-II活性は、諸味液汁をPD-10カラム(GEヘルスケアバイサイエンス社製)に供して遊離アミノ酸を除去した後、L-ロイシル-グリシル-グリシンを基質とし、特許第3727780号公報に記載の方法で測定した。酸性カルボキシペプチダーゼ(ACP)活性は、諸味液汁をPD-10カラムに供して遊離アミノ酸を除去した後、酸性カルボキシペプチダーゼ活性測定キット(キッコーマン社製)を使用し、定法に従って測定した。ジペプチジルペプチダーゼIV(DPP-IV)活性は、Agnes Doumas et al.,Applied and Environmental Microbiology,1998,vol.64,No.12,p.4809-4815に記載の方法で測定した(表1)。ACPおよびDPP-IVは45℃で10日間仕込んでも15℃と活性が変化しないが、LAPは45℃で活性が低下した(組成物3;本発明発酵調味料)。麹の比率を減じると、諸味中の各種酵素活性はさらに低下した(組成物1、2;本発明発酵調味料)。組成物1では、比較例の濃口醤油諸味(初期仕込温度15℃、麹:大豆=10:0)と比べて、特にLAP活性が著しく低下していることがわかる。一方、製造ロットの異なる麹を用いて、組成物3と同様の発酵調味料を調製したところ、本発明と比較してLAP活性が高いケースも見られた(比較例1)。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
 次に、酵素活性以外の各種分析を行った。可溶性総窒素(TN)はケルテックオートサンプラーシステム1035(アクタック社製)を用い、定法に従って測定した。ペプチド量は、6N塩酸存在下で110℃、24時間加熱した後、アミノ酸分析計L-8500(日立製作所社製)によって全アミノ酸分析を行い、塩酸分解前と比較して増加した遊離アミノ酸量から求めた。アミノ化率は、TNに対する全アミノ酸濃度の割合のことである。なお、TNの計算には大豆タンパク質の一般的な窒素係数である6.25を用いた。遊離アミノ基濃度は、等量のOPA試薬(アジレントテクノロジーズ社製)と反応させた後、Ex:350nm、Em:450nmの蛍光強度を測定し、既知濃度のグリシンで作成した検量線から求めた。Gly-Tyr、Ser-Tyr量は、LC-MS/MSシステム2695-QuattroMicro API(Waters社製)を用い、添加検量線法により求めた。LAP活性を低下させた組成物1、2、3(本発明発酵調味料)では、濃口醤油と比較してペプチド量が多く、アミノ化率が低く、TN1%あたりの遊離アミノ基濃度が低いことが分かる(表2)。一方、製造ロットの異なる麹を用いて組成物3と同様に調製した比較例1では、ペプチド量が少なく、アミノ化率が高く、TN1%あたりの遊離アミノ酸濃度が高いことが分かる。これらのことから、本発明のペプチド高含有発酵調味料を得るためには、LAP-I活性を1.0U/ml以下、LAP-II活性を0.5U/ml以下に制御することが必須要件であり、このことは従来知られていなかったと言える。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
 組成物1(本発明発酵調味料)と、通常の濃口醤油を、Puresil C18 カラム(4.6×250mm、Waters社製)を接続した高速液体クロマトグラフィー(以下HPLCと略す、日本分光社製)で分析した。流速1ml/分で、0.1%トリフルオロ酢酸(TFA)を含む溶離液でアセトニトリル濃度0%-30%のグラジエント溶出を行った。検出は220nmの吸光度とした。なお、この分析条件で観察されるピークのほとんどはペプチドに由来することが一般的に知られている。図1・図2から、組成物1(本発明発酵調味料)では、通常の濃口醤油と比較して、多種多様なペプチドが見られ、その量も顕著に多いことが分かる。なお、濃口醤油でも見られる15分、18分、23分の大きなピーク(↓で示した)は、ペプチドではなく、それぞれアミノ酸のTyr、Phe、およびTrpであることを確認した。また、それ以外のアミノ酸はこのカラムにほとんど保持されず、5分以下で溶出することも確認した。
 醤油麹の代わりに食品用プロテアーゼ剤であるアルカラーゼ2.4L-FG(ノボザイムズ社製)を使用して、同様の方法で発酵調味料を調製した(比較例2)。組成物1(本発明発酵調味料)と、比較例2を使用して、官能評価を行った。パネルは8名とし、「苦味の強さ」と「味の好ましさ」を1対比較法で評価した。表3の結果から、本発明の発酵調味料は、ペプチドを多く含むにもかかわらず、苦味が少なく、好ましい味を有していることが分かる。プロテアーゼ剤によるペプチド製造法はこれまでに多くが開示されているが、本発明は呈味の点で従来技術より優れていると考えられる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
<血圧が高めの方に対する有効性試験>
 本発明の発酵調味料を用いて、Gly-Tyrを54μg/ml、Ser-Tyrを31μg/ml含有する醤油加工品を調製し、正常高値血圧者(男性36名、女性35名、計71名)および軽症高血圧者(I度高血圧者)(男性29名、女性32名、計61名)を対象に、通常の減塩しょうゆを対照食品とした二重盲検による12週間連続摂取試験を実施した。被験者には被験食品または対照食品を1日に1回、1袋(8ml)を任意の時刻に調理に利用することで12週間連続摂取させた(家庭における醤油の標準的な1日摂取量8mlあたり、Gly-Tyrを430μg、Ser-Tyrを250μg含有)。その結果、本発明の被験食品を摂取することにより経時的に緩やかな降圧効果が認められ(図3)、摂取前値との比較では、摂取4週間後以降に収縮期血圧が有意な低下を示した。また、対照食品群との比較では、収縮期血圧が、摂取8週間後以降に有意に低下した。この結果から、本発明の発酵調味料は、減塩醤油と比較してペプチドによる有意な降圧作用を有することが確認され、Gly-Tyrを40μg/ml以上、Ser-Tyrを20μg/ml以上含有するときに、その効果が顕著であることが明らかとなった。
 本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
 本出願は、2008年7月2日出願の日本特許出願(特願2008-172871)および2009年6月29日出願の日本特許出願(特願2009-153239)に基づくものであり、その内容はここに参照として取り込まれる。
 本発明により得られる発酵調味料は、ペプチドを多く含むにも関わらず、ペプチド特有の苦味が無く経口摂取が容易であることから、有用な生理活性を発揮し、人々の健康に貢献すると期待できる。

Claims (7)

  1.  麹菌培養物、もしくは麹菌培養物と植物由来タンパク質原料を混合したものに、塩水を加えて仕込み、仕込み後10日以内に、諸味液汁中のロイシンアミノペプチダーゼ-I活性を1.0U/ml以下、かつ、ロイシンアミノペプチダーゼ-II活性を0.5U/ml以下に制御することにより得られる発酵調味料。
  2.  可溶性総窒素を1.2%以上、かつ、可溶性ペプチドを40mg/ml以上含有する請求項1記載の発酵調味料。
  3.  可溶性総窒素が1.2%以上、かつ、可溶性総窒素に対するアミノ化率が55%以下である請求項1または2に記載の発酵調味料。
  4.  可溶性総窒素が1.2%以上、かつ、可溶性総窒素1%あたりの遊離アミノ基濃度が0.35mol/L以下である請求項1~3のいずれか1項に記載の発酵調味料。
  5.  ジペプチドGly-Tyrを40μg/ml以上含有する請求項1~4のいずれか1項に記載の発酵調味料。
  6.  ジペプチドSer-Tyrを20μg/ml以上含有する請求項1~5のいずれか1項に記載の発酵調味料。
  7.  発酵調味料が醤油である請求項1~6のいずれか1項に記載の発酵調味料。
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