KR101138076B1

KR101138076B1 - 코쿠미가 증강된 저분자 대두 펩타이드 제조방법

Info

Publication number: KR101138076B1
Application number: KR1020090133092A
Authority: KR
Inventors: 조동운; 이대희; 허병석; 김용호; 김대응; 오언; 배현아; 김지혜; 신상현; 강동규
Original assignee: 샘표식품 주식회사
Priority date: 2009-12-29
Filing date: 2009-12-29
Publication date: 2012-04-24
Also published as: KR20110076393A

Abstract

본 발명은 코쿠미가 증강된 저분자 대두 펩타이드의 제조방법 및 그 용도에 관한 것이다. 상기 본 발명은 바실러스(Bacillus ) 속을 이용하여 엔도-프로테아제(endo-protease) 및 글루타미나아제(glutaminase)활성이 증가된 배양액을 전처리가 완료된 분리대두단백(isolate soy protein) 및 탈지대두(defatted soy flake)에 첨가하여 대두 펩타이드를 제조하는 것으로, 평균분자량이 300-700Da이고, 펩타이드 특유의 코쿠미가 증강된 저분자 대두 펩타이드를 제조하는 방법을 제공한다.

분리대두단백, 탈지대두, 펩타이드, 글루타미나아제, 코쿠미

Description

코쿠미가 증강된 저분자 대두 펩타이드 제조방법{METHOD FOR PRODUCING LOW MOLECULAR SOY PEPTIDE IMPROVING KOKUMI TASTE}

본 발명은 저분자 대두 펩타이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.

펩타이드는 여러 종류의 아미노산이 펩타이드 결합에 의해 중합물을 형성하고 있는 것으로 일반적으로 2-50개의 아미노산이 결합되어 있고 분자량이 10,000 Da(dalton)이하의 것을 말한다. 올리고펩타이드(oligopeptide)는 아미노산의 수가 10개 이하인 펩타이드를 말하며, 이 중 저분자 대두 펩타이드는 용해도가 높고, 산 알칼리에 의한 침전물이 거의 없으며, 수용액에서의 낮은 점도로 인해 건강식품 소재로 응용이 다양하다. 또한 영양학적으로 인체 내 흡수속도가 빠르며 알러지 유발 가능성도 매우 낮아 건강식품, 병원식, 유아식, 스포츠식 및 화장품의 소재로 사용용도가 매우 넓다. 또한 저분자 대두 펩타이드는 분자량이 낮을수록 소화흡수가 빨라 스포츠 음료에 많이 사용되고 있다. 특히 분자량 1,000 Da이상의 올리고펩타이드는 소장 내의 담즙산 및 콜레스테롤과 결합하여 배출되어 혈청 콜레스테롤 농도를 낮추는 효과와 항종양, 항고혈압, 면역증강 등의 생리활성 기능이 보고되어 있다.

또한 분자량 1,000 Da 이하의 저분자 대두 펩타이드는 단백질이나 아미노산 보다 흡수가 빠르며, 섭취 후 20분 이내 소화가 완료된다. 펩타이드가 아미노산보다 흡수가 빠른 이유는 유리아미노산의 흡수에서는 아미노산끼리 서로 경쟁적인 흡수를 하여 한 개씩 흡수되는 반면, 펩타이드는 복수로 한꺼번에 흡수되는 성질이 있기 때문이다. 더욱이 펩타이드 분자량이 500 Da과 같이 저분자량이라면 매우 빠른 흡수력과 기능성을 나타낼 수 있으며, 알러지를 유발시키는 큰 분자량의 단백질 및 올리고펩타이드가 제거되어 저알러지 식품이나 비알러지 유아식에도 사용할 수 있다고 보고되고 있다.

코쿠미(kokumi)는 일본어에서 유래된 단어로, 영어권에서는 'mouthfulness', 'continuity', 'thickness', 'heartiness'라고도 표현되고, 우리말로는 '진한 맛', '두터운 맛', '입안에 꽉 차는 맛', '농후한 맛', '진득한 맛' 등으로 표현되고 있다. 특히 간장, 된장 등의 양조발효조미료는 강한 코쿠미를 가지고 있는데, 이것은 펩타이드 및 아미노산의 특성으로 인한 것이며, 이것의 증명은 이들 양조발효 생산물을 염산 등으로 가수분해하면 코쿠미가 완전히 소멸되는 것에서 찾을 수 있다. 이런 코쿠미 부여능은 펩타이드와 같이 존재하는 아미노산의 종류에 따라 맛 특성이 달라진다.

상기 저분자 대두 펩타이드는 단일효소 및 복합효소로 제조되지만 펩타이드가 다량 함유되고 아미노산 함량이 적다. 특히 아미노산 중 코쿠미와 관계가 깊은 글루타민산(glutamic acid)함량이 매우 낮아 코쿠미 부여능이 상대적으로 작아 식품에 적용시 펩타이드 특유의 쓴맛으로 인해 사용상의 많은 제약을 받는 실정이다. 상업적 효소 중 대표적인 알칼라제(alcalase) 2.4L 같은 경우 최종 효소분해 후 반응액에 남아있는 펩타이드의 잔기에는 대부분 소수성 아미노산들이 분포되어 있어 그 맛은 매우 쓴맛을 낼 수 있다. 이러한 단점을 보완하기 위해 대한민국 공개특허 10-2009-0046342 <우마미 증진 효과가 있는 검은 콩 펩타이드>에서는 검은 콩을 엔도펩티다아제 및 엑소펩티다아제 효소로 순차적으로 가수분해하여 얻어진 물질을 고체상과 액상으로 분리 후 여과하여 분말화한 검은콩 펩타이드 조성물을 소개하고 있다. 그러나 위의 조성물은 쓴맛을 줄이고 우마미를 증진시키기 위하여 유리아미노산 용출률이 매우 큰 엑소펩티다아제를 사용하고 있어 최종 분말에서 펩타이드의 함량이 매우 감소하게 되는 단점이 있다.

상기에서 서술하고 있는 대두 펩타이드를 제조하는 방법에는 여러 가지가 있으며, 국제특허 WO 97/01966호에서는 유청 분리 단백분말을 원재료로 하여 단백질 분해효소 또는 산분해를 실시한 뒤, 정밀여과, 한외여과, 역삼투법, 전기투석법을 통해 조 단백 함량 80% 이상의 저분자 펩타이드의 제조방법을 제시하였다. 그러나 위의 방법은 염산을 이용한 등전점 pH 4.5에서의 산침전 및 가성소다를 이용한 pH 7.0의 중화공정이 수반되는 단백질 분리의 제조과정이 포함된다. 그러므로 이온정제 및 염제거 공정이 실시되어 높은 제조비용이 발생하게 된다.

이를 해결하기 위해 대한민국 공개특허공보 제2001-25612호 <저분자 펩타이드의 제조방법>에서는 단백질을 증류수, 유기용매 등에 분산시킨 후 분해촉매를 첨가하여 가열하여 제조하거나 초음파 또는 광을 사용하여 제조하는 펩타이드 제조방법이 개시되어 있으나 식품으로 사용하기에는 부적합한 촉매제를 사용하고 있는 단 점이 있다. 또한 대한민국 등록특허 10-0612600 <저분자 대두 펩타이드의 제조방법>은 유기용매를 사용하지 않고 인체에 유해하지 않은 에탄올을 사용하여 탈지대두에서 단백질 이외의 물질을 추출하여 제거한 후 효소분해하는 과정을 통해 펩타이드 순도 95%이상의 대두 펩타이드 제조 방법이 기재되어 있으나, 탈지대두에서 단순히 에탄올 및 물의 수용물질의 제거로 인해 최종 제품의 단백질 수율이 95%이상 되기 매우 어려우며, 사용한 효소 중 플래버자임 500MG는 유리아미노산 용출률이 매우 높은 엑소프로테아제로 효소반응 즉시 많은 양의 유리아미노산을 용출시켜 펩타이드 제조 사용시 펩타이드 함량을 저하시킬 수 있는 단점이 있다.

위와 같이 종래의 펩타이드 제조 방법에서는 코쿠미 증가에 따른 맛 개선과 함께 고 함량의 펩타이드 제조가 매우 어려우며, 탈지대두를 단독 원료로 하여 고 단백질의 저분자 대두 펩타이드 제조가 힘든 문제점이 있었다.

본 발명은 상기한 문제점을 해결하기 위한 저분자 대두 펩타이드 제조방법으로서, 종래의 고순도 펩타이드 제조에서 구현하기 힘들었던 코쿠미 증가 및 고함량의 펩타이드 제조를 가능하게 하는 제조방법을 제공하기 위함이다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명의 일 실시태양은 분리대두단백(isolate soy protein) 및 탈지대두(defatted soy flake)를 열처리하는 단계; 상기 단계에서 열처리된 분리대두단백 및 탈지대두를 혼합하고, 수용성 당류 및 무기물을 제거하는 단계; 배지최적화를 통해 엔도-프로테아제(endo-protease) 및 글루타미나아제(glutaminase) 활성이 증가된 바실러스( bacillus ) 속의 배양액을 준비하는 단계; 상기 단계에서 준비된 배양액을 이용하여 수용성 당류 및 무기물이 제거된 분리대두단백 및 탈지대두를 효소분해하는 단계; 및 상기 단계에서 효소분해된 결과물에서 분자량이 300 ~ 700 Da인 펩타이드를 분리하는 단계;를 포함하는 코쿠미가 증강된 저분자 대두 펩타이드 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명의 일 실시태양은 상기 제조방법에 의해 제조된 분자량이 300 ~ 700 Da이고, 코쿠미가 증강된 저분자 대두 펩타이드를 제공한다.

또한, 본 발명의 일 실시태양은 상기 고쿠미가 증강된 저분자 대두 펩타이드를 포함하는 식품을 제공한다.

본 발명의 코쿠미가 증강된 저분자 대두 펩타이드 제조 방법은 고순도, 고함량의 저분자 대두 펩타이드를 제조할 수 있으며, 높은 펩타이드 함량에도 불구하고 코쿠미가 뛰어난 장점이 있다. 이와 같은 뛰어난 코쿠미와 저분자량의 특성을 가졌기 때문에 본 발명의 저분자 대두 펩타이드는 응용식품분야에 다양한 목적으로 활용이 가능하다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명의 일 실시태양은 분리대두단백(isolate soy protein) 및 탈지대두(defatted soy flake)를 열처리하는 단계; 상기 단계에서 열처리된 분리대두단백 및 탈지대두를 혼합하고, 수용성 당류 및 무기물을 제거하는 단계; 배지최적화를 통해 엔도-프로테아제(endo-protease) 및 글루타미나아제(glutaminase) 활성이 증가된 바실러스( bacillus ) 속의 배양액을 준비하는 단계; 상기 단계에서 준비된 배양액을 이용하여 수용성 당류 및 무기물이 제거된 분리대두단백 및 탈지대두를 효소분해하는 단계; 및 상기 단계에서 효소분해된 결과물에서 분자량이 300 ~ 700 Da인 펩타이드를 분리하는 단계;를 포함하는 코쿠미가 증강된 저분자 대두 펩타이드 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 일 실시태양에서는, 상기 열처리하는 단계에서 분리대두단백은 조단백질 함량이 85~95%이고, 상기 탈지대두는 조단백질 함량이 45~ 65, 바람직하게 는 45~55%일 수 있다. 상기 탈지대두의 조단백질 함량이 45 미만이면 최종 제조되는 대두 펩타이드의 단백질 함량이 매우 떨어지기 때문이고, 65 초과인 경우는 탈지대두의 국제규격 기준에 부합하지 않기 때문이다. 45~55%일 때, 분리대두단백과 혼합하여 고단백의 대두 펩타이드를 제조하는 효과가 좋다.

본 발명의 일 실시태양에서 탈지대두의 가용성 질소 지수(NSI: Nitrogen Solubility Index)는 15~35, 바람직하게는 25~35일 수 있다. 일반적으로 콩을 구성하는 주요 단백질 중 구상단백질은 미변성 상태에서는 수용성이지만 변성하면 응고하여 불용성이 되고, 이런 단백질의 변성도를 측정하는 것으로서 가용성 질소지수(NSI)가 사용된다. NSI 값이 높을수록 가용도가 높은 것을 의미하는데 변성 전 NSI가 15 미만일 경우는 단백질이 과변성되어 단백질 분해율이 떨어지고, 35이상인 것은 변성 후 이용에 문제가 발생한다. NSI 값이 25 ~ 35인 경우에 변성 후 단백질 분해율 및 질소 이용율이 높아지게 된다.

본 발명의 일 실시태양에서, 상기 열처리하는 단계에서는 분리대두단백 및 탈지대두를 120℃이상, 바람직하게는 120-140℃의 스팀과 증자기를 이용하여 5~10분 동안 균일하게 열처리하여 단백질을 변성시킨다. 상기와 같은 열처리에 의한 단백질 변성은 단백질 분자의 입체구조를 파괴시켜 분자 내부에 매몰되어 있는 아미노산 잔기 측쇄를 노출시키므로 효소와 쉽게 접촉할 수 있게 하여 단백질 분해를 용이하게 하기 위함이다.

본 발명의 일 실시태양에서, 상기 수용성 당류 및 무기물을 제거하는 단계에서 분리대두단백과 탈지대두의 혼합비는 50:50 내지 90:10일 수 있다.

또한, 상온상태의 물에 조성물 총 중량을 기준으로 분리대두단백과 탈지대두의 혼합물을 20~30중량%의 비율로 혼합하고, 1~2시간 교반하여 수용성 당류 및 무기물을 제거한다. 이때, 먼저 수용성 당류 및 무기물을 제거한 후에 분리대두단백과 탈지대두를 혼합할 수도 있다.

상기 수용성 당류 및 무기물을 제거한 분리대두단백과 탈지대두의 혼합물을 원심분리기를 사용하여 수득한다.

본 발명의 일 실시태양에서, 배지최적화를 통해 엔도-프로테아제(endo-protease) 및 글루타미나아제(glutaminase) 활성이 증가된 바실러스 속(bacillus)의 배양액을 준비하고, 준비된 배양액을 이용하여 상기 수용성 당류 및 무기물이 제거된 분리대두단백 및 탈지대두를 효소분해한다. 본 발명에 사용된 바실러스(Bacillus ) 속 배양액은 엔도-프로테아제 뿐만 아니라 글루타미나아제(glutaminase) 고활성 배양액으로 개발되었다.

프로테아제는 엔도프로테아제와 엑소프로테아제가 있는데, 엔도프로테아제는 단백질과 펩타이드를 랜덤하게 공격하여 저분자의 펩타이드를 다량 생성하며 극소수의 유리아미노산을 만들게 하나, 엑소프로테아제는 단백질이나 펩타이드의 말단을 공격하여 다량의 유리아미노산을 생성하므로 펩타이드 제조에는 적합하지 않다.

글루타미나아제는 용액속의 글루타민(glutamine)을 글루타민산(glutamic acid)로 변화시키는 효소적 디아미네이션(deamidation)을 일으키는 효소이다. 이런 글루타미나아제는 글루타민산 함량을 증가시켜 최종산물의 우마미를 증가시키는 역할을 하게 된다. 특히 단백질이 분해되어 생기는 펩타이드 및 아미노산은 식품에 존재하는 기본적인 맛의 특성을 부여하는 주체이며, 이 중 펩타이드는 약간의 쓴맛을 가지기 때문에 식품 조리시 코쿠미를 부여하는 기능을 가지고 있다. 글루타민산(glutamic acid)함량의 증가는 약간의 우마미를 증가시켜 코쿠미 특유의 식품의 맛을 지속적으로 유지시켜 주어 농후한 맛을 주고, 짠맛과 신맛 등을 조화롭게 만들어 깊고 깔끔한 맛을 증가시킨다. 그러나 너무 많은 글루타민산(glutamic acid)함량은 우마미의 맛을 특이적으로 증가시켜 코쿠미 특유의 농후한 맛을 감소시키므로 적절한 글루타민산(glutamic acid)함량이 필요하다.

본 발명의 일 실시태양에서, 본 발명으로 제조한 대두 펩타이드는 대두 펩타이드 총 중량에 대하여 글루타민산(glutamic acid)을 3 ~ 6중량%를 포함할 수 있다. 3% 미만을 포함할 경우 기존의 상업효소를 이용한 대두 펩타이드 제조시와 큰 차이가 없어서, 코쿠미 증강 효과가 없으며, 6% 초과일 경우 글루타민산의 함량이 너무 많아, 우마미 맛이 증가될 뿐 코쿠미 특유의 맛을 감소시키기 때문이다.

본 발명의 일 실시태양에서, 상기 배양액을 준비하는 단계에서 배지최적화는 라틴방격법(latin square design) 또는 반응표면분석법(RSM)을 이용하여 탄소원, 질소원 또는 무기원의 최적 배지를 선택할 수 있다. 이때, 최적배지는 탄소원, 질소원 또는 무기원의 종류와 농도를 의미할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.

상기 라틴방격법은 통계학적 실험계획법으로서, 이를 이용하여 바실러스(Bacillus ) 속의 배양 배지원 중 탄소원, 질소원 및 무기원의 최적 배지를 결정할 수 있다.

상기 라틴방격법으로 선택한 탄소원은 비제한적인 예로 가용성 녹말(soluble starch), 말토오스(maltose), 갈락토오스(galactose), 글루코오스(glucose), 콘 스팁 리큐르(corn steep liquor), 프룩토오스(fructose), 덱스트로스(dextrose), 락토오스(lactose) 및 대두분말(soybean flour)으로 이루어진 군에서 선택한 하나 이상, 바람직하게는 갈락토오스(galactose), 콘 스팁 리큐르(corn steep liquor) 및 대두분말(soybean flour)으로 이루어진 군에서 선택한 하나 이상, 더욱 바람직하게는 콘 스팁 리큐르(corn steep liquor) 일 수 있다.

상기 라틴방격법으로 선택한 질소원은 비제한적인 예로 대두펩톤(soypeptone), 맥아 추출물(malt extract), 효모 추출물(yeast extract), 비프 추출물(beef extract), 암모늄 아세테이트(ammonium acetate), 암모늄 클로라이드(ammonium chloride), 암모늄 니트레이트(ammonium nitrate), 암모늄 설페이트(ammonium sulfate) 및 소디움 니트레이트(sodium nitrate)으로 이루어진 군에서 선택한 하나 이상, 바람직하게는 대두펩톤(soypeptone), 효모 추출물(yeast extract) 및 맥아 추출물(malt extract)으로 이루어진 군에서 선택한 하나 이상, 더욱 바람직하게는 맥아 추출물(malt extract)일 수 있다.

상기 라틴방격법으로 선택한 무기원은 비제한적인 예로 암모늄 포스페이트 다이베이식(ammonium phosphate dibasic), 암모늄 포스페이트 모노베이식(ammonium phosphate monobasic), 암모늄 설페이트(ammonium sulfate), 다이소디움 하이드로겐 포스페이트(disodium hydrogen phosphate), 포타슘 포스페이트 모노베이식(potassium phosphate monobasic), 마그네슘 설페이트 헵타하이드레이트(magnesium sulfate heptahydrate), 아연 설페이트 헵타하이드레이트(zinc sulfate heptahydrate) 및 아이로(3) 설페이트 헵타하이드레이트(iro(3) sulfate heptahydrate)으로 이루어진 군에서 선택한 하나 이상, 바람직하게는 암모늄 포스페이트 모노베이식(ammonium phosphate monobasic), 다이소디움 하이드로겐 포스페이트(disodium hydrogen phosphate) 및 마그네슘 설페이트 헵타하이드레이트(magnesium sulfate heptahydrate) 으로 이루어진 군에서 선택한 하나 이상, 더욱 바람직하게는 다이소디움 하이드로겐 포스페이트(disodium hydrogen phosphate) 일 수 있다.

상기 선택한 3개의 배지원의 최적농도를 설정하기 위하여 라틴방격법 또는 반응표면분석법(RSM)을 수행하여 결정한 최종적인 탄소원의 최적농도는 10.0-20.0g/L, 질소원의 최적농도는 10-20g/L, 무기원의 최적농도는 1.0-3.0g/L일 수 있다.

본 발명의 일 실시태양에서, 상기 단계에서 준비된 배양액을 이용하여 수용성 당류 및 무기물이 제거된 분리대두단백 및 탈지대두를 효소분해할 수 있다. 상기 효소분해하는 단계에서 효소분해 조건은 비제한적인 예로 40~50 ℃, 15~20시간, pH 6~8 일 수 있다.

본 발명의 일 실시태양에서, 상기 효소분해된 결과물에서 분자량이 300 ~ 700 Da인 펩타이드를 분리할 수 있다. 이때, 효소분해 후 90℃, 1시간 이상 살균을 실시하여 효소 및 일반세균 실활 후 원심분리기를 사용하여 순수한 수용성 반응액을 얻는다.

본 발명의 일 실시태양에서, 상기 펩타이드를 분리하는 단계에서 분리는 여 과막의 배제분자량이 10,000 ~ 100,000 Da, 바람직하게는 10,000 내지 30,000 Da의 여과막으로 한외여과(ultrafiltration) 에 의할 수 있다. 이에 의해 분리한 300 ~ 700 Da인 펩타이드를 분말화하여 코쿠미가 증강된 저분자 대두 펩타이드를 제조한다.

도 1은 본 발명에서 제조한 저분자 대두 펩타이드의 분자량 분포를 나타낸 크로마토그램이다. 그로마토그램 상의 저분자 대두 펩타이드는 300~700 Da에 분포하여 있다. 이때 분자량 측정에 사용된 말디토프의 조건은 기구; Voyager DE STR 4372(ABI), 작동모드; Reflector, 추출모드; delayed, 극성; Positive, 교정타입(Calibration type); external calibration(Calibration mixture 1), 기질; 알파-시아노-4-하이드록시시나믹산(a-Cyano-4-hydroxycinnamic acid)(Achca, sigma)이다

이하, 본 발명의 실시예를 참조하여 본 발명을 상세히 설명한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위해 예시적으로 제시한 것일 뿐, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가지는 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: 라틴 방격법을 이용한 탄소원, 질소원, 무기원의 선별 및 농도 결정

본 발명에서 사용된 탄소원은 가용성 녹말(soluble starch), 말토오스(maltose), 갈락토오스(galactose), 글루코오스(glucose), 콘 스팁 리큐르(corn steep liquor), 프룩토오스(fructose), 덱스트로스(dextrose), 락토오스(lactose), 대두분말(soybean flour)를 사용하였으며, 그 중 갈락토오스(galactose), 콘 스팁 리큐르(corn steep liquor), 대두분말(soybean flour)이 가장 프로테아제와 글루타미나아제 활성이 좋았다.

질소원은 대두펩톤(soypeptone), 맥아 추출물(malt extract), 효모 추출물(yeast extract), 비프 추출물(beef extract), 암모늄 아세테이트(ammonium acetate), 암모늄 클로라이드(ammonium chloride), 암모늄 니트레이트(ammonium nitrate), 암모늄 설페이트(ammonium sulfate), 소디움 니트레이트(sodium nitrate)를 사용하였으며, 그 중 대두펩톤(soypeptone), 효모 추출물(yeast extract), 맥아 추출물(malt extract)이 프로테아제와 글루타미나아제(glutaminase) 활성이 좋았다.

무기원은 암모늄 포스페이트 다이베이식(ammonium phosphate dibasic), 암모늄 포스페이트 모노베이식(ammonium phosphate monobasic), 암모늄 설페이트(ammonium sulfate), 다이소디움 하이드로겐 포스페이트(disodium hydrogen phosphate), 포타슘 포스페이트 모노베이식(potassium phosphate monobasic), 마그네슘 설페이트 헵타하이드레이트(magnesium sulfate heptahydrate), 아연 설페이트 헵타하이드레이트(zinc sulfate heptahydrate), 아이로(3) 설페이트 헵타하이드레이트(iro(3) sulfate heptahydrate)를 사용하였으며, 그 중 암모늄 포스페이트 모노베이식(ammonium phosphate monobasic), 다이소디움 하이드로겐 포스페이트(disodium hydrogen phosphate), 마그네슘 설페이트 헵타하이드레이트(magnesium sulfate heptahydrate)가 프로테아제와 글루타미나아제 활성이 좋았다.

상기 선택된 탄소원, 질소원, 무기원의 각각 3개의 배지들에 대해 라틴방격법에 의한 최적 배지 선택실험을 수행하였고, 종류별 탄소원, 질소원, 무기원에 대한 라틴방격법의 9개 실험구 및 실험결과를 표 1에 나타내었다. 이때 8번 실험구에서 프로테아제 역가와 글루타미나아제 역가가 가장 우수하였다. 그 결과 탄소원으로는 콘 스팁 리큐르(corn steep liquor), 질소원으로는 맥아 추출물(malt extract), 무기원으로는 다이소디움 하이드로겐 포스페이트(disodium hydrogen phosphate)가 선택되었다.

그리고, 반응표면분석법의 중심값을 설정하기 위하여 상기 선택된 3가지의 배지원에 대하여 농도에 따른 라틴방격법을 실시하였고, 농도별 탄소원, 질소원, 무기원에 대한 라틴방격법의 9개 실험구 및 실험결과를 표 2에 나타내었다. 그 결과 2번 실험구에서 프로테아제 역가와 글루타미나아제 역가가 가장 우수하였다. 그 결과 탄소원의 농도는 콘 스팁 리큐르(corn steep liquor) 10.0 g/L, 질소원의 농도는 맥아 추출물(malt extract) 7.0 g/L, 무기원의 농도는 다이소디움 하이드로겐 포스페이트(disodium hydrogen phosphate) 3.0 g/L 가 선택되었다.

요인	수준	함량 타입 (g/L)	1	2	3	4	5	6	7	8	9
A	1	갈락토오스	20			20			20
	2	콘 스팁 리큐르		20			20			20
	3	대두분말			20			20			20
B	1	대두펩톤	10	10	10
	2	효모 추출물				10	10	10
	3	맥아 추출물							10	10	10
C	1	다이소디움 하이드로겐 포스페이트	5					5		5
	2	마그네슘 설페이트 헵타하이드레이트		5		5					5
	3	암모늄 포스페이트 모노베이식			5		5		5
		엔도펩티다아제(프로테아제)활성 (Unit/ml)	0.187	0.589	0.224	-0.014	0.5588	0.1102	-0.034	0.647	0.222
		글루타미나아제 활성(Unit/ml)	0.052	0.0584	0.012	0.025	0.056	0.048	0.014	0.124	0.059

요인	수준	함량 타입 (g/L)	1	2	3	4	5	6	7	8	9
A	1	콘 스팁 리큐르	15			15			15
	2			10			10			10
	3				5			5			5
B	1	맥아 추출물	7	7	7
	2					5	5	5
	3								3	3	3
C	1	다이소디움 하이드로겐 포스페이트	5					5		5
	2			3		3					3
	3				1		1		1
		엔도펩티다아제(프로테아제)활성 (Unit/ml)	0.651	1.031	0.879	0.628	0.931	0.536	0.836	0.718	0.591
		글루타미나아제 활성 (Unit/ml)	0.128	0.256	0.058	0.075	0.163	0.042	0.095	0.086	0.037

실시예 2: 반응표면분석법(RSM)을 이용한 배지최적화

실시예 1에서 선택된 탄소원, 질소원, 무기원의 농도 중 효소역가에 결정적인 역할을 하는 탄소원 및 질소원의 최적농도를 설정하기 위하여 반응표면분석법(RSM)을 2회 수행하였다. 1차 반응표면 분석법 실험 조건은 표 3에, 그 결과는 데이터를 표 4에, 그 그래프를 도 2에 나타내었다. 또한 2차 반응표면 분석법 실험 조건은 표 5에, 그 결과는 데이터를 표 6에, 그 그래프를 도 3에 나타내었다. 그래서 최종적인 탄소원의 최적농도는 10.0-20.0g/L, 질소원의 최적농도는 10-20g/L, 무기원의 최적농도는 1.0-3.0g/L로 결정하였다. 단 실시예 1에서 두 종류 효소인 프로테아제와 글루타미나아제 역가 증감의 경향이 유사하므로 반응표면분석법에서는 프로테아제의 역가분석으로 글루타미나아제 역가 증감을 가늠하였다.

반응표면분석법을 통한 최적화가 완료된 배지에서의 바실러스(Bacillus ) 속의 프로테아제 및 글루타미나아제활성은 기존 보다 2-8배 이상 증가된 수치를 보였다.

Xn	함량 변이	수준
Xn	함량 변이	-α	-1	0	+1	+α
X1	콘 스팁 리큐르	2.92893	5	10	15	17.0711
X2	맥아 추출물	2.75736	4	7	10	11.2426

α=1.41421(중심점의 수: 3ea / 독립변수의 수: 2ea)

Xn	함량 변이	수준
Xn	함량 변이	-α	-1	0	+1	+α
X1	콘 스팁 리큐르	2.92	5	10	15	17.07
X2	맥아 추출물	2.92	5	10	15	17.07

α=1.41421(중심점의 수: 3ea / 독립변수의 수: 2ea)

기준 (Std)	런 (Run)	팩터 1 A:콘 스팁 리큐르(g/L)	팩터 2 B:맥아추출물(g/L)	반응 1 엔도 프로테아제(Unut/mL)
11	1	10.00	10.00	1.2505
8	2	10.00	17.07	1.009
9	3	10.00	10.00	1.3435
13	4	10.00	10.00	1.3295
5	5	2.93	10.00	1.3075
2	6	15.00	5.00	1.343
1	7	5.00	5.00	1.1755
6	8	17.07	10.00	1.285
10	9	10.00	10.00	1.286
7	10	10.00	2.93	1.1305
4	11	15.00	15.00	1.2965
3	12	5.00	15.00	1.1125
12	13	10.00	10.00	1.1575

실시예 3: 바실러스(Bacillus ) 속의 배양액을 이용한 대두 펩타이드 제조

조단백질 함량 85-95%의 분리대두단백(isolate soy protein) 및 조단백질 함량 45% - 55%의 탈지대두(defatted soy flake)을 각각 120-140℃의 스팀과 증자기를 이용하여 5.0-10.0분 동안 균일하게 열처리하여 단백질을 변성시켰다.

상기 증자된 분리대두단백과 탈지대두를 중량비로 분리대두단백: 탈지대두 = 50:50 ~ 90:10로 혼합하여 상온상태의 물에 고형분 20-30% 첨가비로 투입 후 1-2시간 교반하여 수용성 물질을 제거하였다. 이 후 디캔터(dexanter)를 사용하여 불용성 물질만을 수득하여 2회 이상 상온의 물로 세척하고 원심분리하여 최종 불용성 단백물질을 수득하였다.

원심분리기를 사용하여 수득된 전처리가 완료된 탈지대두 및 분리대두단백은 Bacillus 속의 배지최적화에 의해 프로테아제 및 글루타미나아제(glutaminase)활성이 증가된 배양액을 고형분과 동량 투입 후 40-50℃, 15-20시간, pH 6-8에서 효소분해를 실시하였다.

효소분해 후 90℃, 1시간 이상 가열하여 효소를 불활성화시키고, 살균한 후 원심분리기를 사용하여 순수한 수용성 반응액을 얻었다. 여과막의 배제분자량이 10,000 내지 30,000 Da인 한외여과막(UF막)을 사용하여 여과 후 분말화 하여 코쿠미가 증강된 저분자 대두 펩타이드를 제조하였다. 이 실시예 3의 대두 펩타이드의 일반성분 분석 결과를 표 7에 나타내었고, 대두 펩타이드의 유리아미노산 함량을 표 8에 나타내었다.

	대두 펩타이드 성분 함량
Total protein (%질량)	84.55
Solid content (%질량)	94.50
Free amino acid (%질량)	8.87
Total amino acid (%질량)	84.00
순수 펩타이드함량 [=TA - FA(%질량)]	75.13

유리아미노산 (%질량)	시 료 명	아미노산 함량
	ASP	0.53
	THR	0.09
	SER	0.23
	GLU	3.12
	PRO	0.58
	GLY	0.25
	ALA	0.65
	CYS	0.11
	VAL	1.89
	MET	0.08
	ILE	0.06
	LEU	0.13
	TYR	0.00
	PHE	0.16
	HIS	0.39
	LYS	0.04
	NH3	0.48
	ARG	0.09
	합계(%)	8.87

실시예 3의 방법에 따라 제조된 대두 펩타이드는 총 단백질이 84.0%이상의 고 단백질을 함유하고 있으며, 순수한 펩타이드 함량(총아미노산 함량-유리아미노산 함량)은 75.0% 이상이었다. 또한 유리아미노산 8.87% 중 글루타민산(glutamic acid)함량은 3.12%로 상대적으로 매우 높은 수치를 나타내었다.

비교예 1: 상업효소를 이용한 대두 펩타이드 제조

조단백질 함량 85-95%의 분리대두단백(isolate soy protein) 및 조단백질 함량 45% - 55%의 탈지대두(defatted soy flake)을 각각 120-140℃의 스팀과 증자기를 이용하여 5.0-10.0분 동안 균일하게 열처리하여 단백질을 변성시켰다. 상기 증자된 분리대두단백과 중량비로 분리대두단백: 탈지대두 = 50:50 ~ 90:10로 혼합하여 상온상태의 물에 조성물 총 중량을 기준으로 고형분 20-30% 첨가비로 투입 후 1-2시간 교반하여 수용성 물질을 제거하였다. 원심분리기를 사용하여 수득된 전처리가 완료된 탈지대두 및 분리대두단백은 엔도형 프로타제인 알칼라제(alcalase) 2.4L 및 엑소형 프로타제인 플라보자임 500MG를 고형분 대비 1% 투입 후 40-50℃, 15-20시간, pH 6-8에서 효소분해를 실시하였다. 효소분해 후 90℃, 1시간 이상 살균 후 원심분리기를 사용하여 순수한 수용성 반응액을 얻었다. 여과막의 배제분자량이 10,000 내지 30,000 Da인 한외여과막(UF막)을 사용하여 여과한 후 분말화하여 저분자 대두 펩타이드를 제조하였다. 이 비교예 1의 대두 펩타이드의 일반성분 분석 결과를 표 9에 나타내었고, 대두 펩타이드의 유리아미노산 함량을 표 10에 나타내었다.

	대두 펩타이드 성분 함량
총 단백질(%질량)	83.21
고형분(%질량)	95.54
유리아미노산(%질량)	17.65
총아미노산(%질량)	82.00
순수 펩타이드함량 [=TA - FA(%질량)]	64.35

유리아미노산 (%질량)	시 료 명	아미노산 함량
	ASP	1.02
	THR	0.39
	SER	1.04
	GLU	1.71
	PRO	1.65
	GLY	0.46
	ALA	1.20
	CYS	0.16
	VAL	4.95
	MET	0.35
	ILE	0.26
	LEU	0.96
	TYR	0.00
	PHE	0.69
	HIS	1.09

비교예 1의 방법에 따라 제조된 대두 펩타이드는 총 단백질이 실시예 3보다는 약간 적은 83.0%이상의 고 단백질을 함유하고 있었으며, 순수한 펩타이드 함량(총아미노산 함량-유리아미노산 함량)은 64.35% 였다. 이는 실시예 3의 펩타이드 함량인 75.0%에 비교하여 10.0%이상 떨어지는 함량을 나타내었다. 또한 유리아미노산 17.65% 중 글루타민산(glutamic acid)함량은 1.71%로 실시예 3의 함량(유리아미노산 8.87% 중 글루타민산(glutamic acid)함량 3.12%)과 비교하여 매우 떨어지는 수치를 나타내었다.

실시예 4: 대두 펩타이드의 관능평가

실시예 3에 의해 제조된 대두 펩타이드를 5% 용액으로 제조하여 관능평가를 실시하였으며, 그 결과를 도 4에 나타내었다. 대조군으로는 비교예 1에 의해 제조된 대두 펩타이드의 5% 용액이 사용되었다. 상기 두 용액의 염 함량은 모두 1%로 조정 후 관능평가를 실시하였다.

도 4를 참조하면, 실시예 3은 비교예 1에 비하여 고기풍미, 단맛 및 우마미가 높아졌으며, 특히 코쿠미의 특징인 농후한 맛(mouthfulness)이 많이 상승하였음을 확인할 수 있다. 또한, 쓴맛은 거의 없는 것으로 나타났다. 이와 같이 효소분해 특유의 펩타이드로 인한 쓴맛은 우마미의 증가와 함께 거의 사라졌으며, 코쿠미 또한 유의적으로 증가하였다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 실시예 3에 의하여 제조된 대두 펩타이드의 분자량 분포를 나타내는 그래프이다.

도 2는 탄소원, 질소원에 대한 1차 반응표면 분석법 실험 결과의 그래프이다.

도 3는 탄소원, 질소원에 대한 2차 반응표면 분석법 실험 결과 그래프이다.

도 4는 실시예 3의 샘플과 비교예 1의 샘플을 비교한 관능평가 그래프이다.

Claims

분리대두단백(isolate soy protein) 및 탈지대두(defatted soy flake)를 120℃ 보다 높고 140℃ 이하인 온도에서 열처리하는 단계;

상기 단계에서 열처리된 분리대두단백 및 탈지대두를 혼합하고, 수용성 당류 및 무기물을 제거하는 단계;

바실러스(bacillus) 속을 배지에 넣고 배양하여 엔도-프로테아제(endo-protease) 및 글루타미나아제(glutaminase) 활성이 배양 초기보다 증가된 바실러스(bacillus) 속의 배양액을 준비하는 단계;

상기 단계에서 준비된 배양액을 이용하여 수용성 당류 및 무기물이 제거된 분리대두단백 및 탈지대두를 효소분해하는 단계; 및

상기 단계에서 효소분해된 결과물에서 분자량이 300 ~ 700 Da인 펩타이드를 분리하는 단계;를 포함하고,

분리된 대두 펩타이드 총 중량에 대하여 글루타민산(glutamic acid)을 3 ~ 6중량%를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 코쿠미가 증강된 저분자 대두 펩타이드 제조 방법.
삭제
제 1항에 있어서,

상기 배지는 가용성 녹말(soluble starch), 말토오스(maltose), 갈락토오스(galactose), 글루코오스(glucose), 콘 스팁 리큐르(corn steep liquor), 프룩토오스(fructose), 덱스트로스(dextrose), 락토오스(lactose) 및 대두분말(soybean flour)으로 이루어진 군에서 선택한 하나 이상인 것을 탄소원으로 하는 것을 특징으로 하는 코쿠미가 증강된 저분자 대두 펩타이드 제조 방법.
제 1항에 있어서,

상기 배지는 대두펩톤(soypeptone), 맥아 추출물(malt extract), 효모 추출물(yeast extract), 비프 추출물(beef extract), 암모늄 아세테이트(ammonium acetate), 암모늄 클로라이드(ammonium chloride), 암모늄 니트레이트(ammonium nitrate), 암모늄 설페이트(ammonium sulfate) 및 소디움 니트레이트(sodium nitrate)으로 이루어진 군에서 선택한 하나 이상인 것을 질소원으로 하는 것을 특징으로 하는 코쿠미가 증강된 저분자 대두 펩타이드 제조 방법.
제 1항에 있어서,

상기 배지는 암모늄 포스페이트 다이베이식(ammonium phosphate dibasic), 암모늄 포스페이트 모노베이식(ammonium phosphate monobasic), 암모늄 설페이트(ammonium sulfate), 다이소디움 하이드로겐 포스페이트(disodium hydrogen phosphate), 포타슘 포스페이트 모노베이식(potassium phosphate monobasic), 마그네슘 설페이트 헵타하이드레이트(magnesium sulfate heptahydrate), 아연 설페이트 헵타하이드레이트(zinc sulfate heptahydrate) 및 아이로(3) 설페이트 헵타하이드레이트(iro(3) sulfate heptahydrate)으로 이루어진 군에서 선택한 하나 이상인 것을 무기원으로 하는 것을 특징으로 하는 코쿠미가 증강된 저분자 대두 펩타이드 제조 방법.
제 3항에 있어서,

상기 탄소원은 콘 스팁 리큐르(corn steep liquor)인 것을 특징으로 하는 코쿠미가 증강된 저분자 대두 펩타이드 제조 방법.
제 4항에 있어서,

상기 질소원은 맥아 추출물(malt extract)인 것을 특징으로 하는 코쿠미가 증강된 저분자 대두 펩타이드 제조 방법.
제 5항에 있어서,

상기 무기원은 다이소디움 하이드로겐 포스페이트(disodium hydrogen phosphate)인 것을 특징으로 하는 코쿠미가 증강된 저분자 대두 펩타이드 제조 방법.
제 1항에 있어서,

상기 배지에서 탄소원의 최적 농도는 10~20g/L, 질소원의 최적 농도는 10~20g/L, 무기원의 최적 농도는 1~3g/L인 것을 특징으로 하는 코쿠미가 증강된 저분자 대두 펩타이드 제조 방법.
제 1항에 있어서,

상기 열처리하는 단계에서 분리대두단백은 조단백질 함량이 85~95%이고, 탈지대두는 조단백질 함량이 45~65%, 가용성 질소 지수(NSI: Nitrogen Solubility Index)가 15~35 인 것을 특징으로 하는 코쿠미가 증강된 저분자 대두 펩타이드 제조 방법.
제 1항에 있어서,

상기 열처리하는 단계에서 열처리 조건은 5~10분인 것을 특징으로 하는 코쿠미가 증강된 저분자 대두 펩타이드 제조 방법.
제 1항에 있어서,

상기 수용성 당류 및 무기물을 제거하는 단계에서 분리대두단백과 탈지대두의 혼합비는 50:50 ~ 90:10인 것을 특징으로 하는 코쿠미가 증강된 저분자 대두 펩타이드 제조 방법.
제 1항에 있어서,

상기 효소분해하는 단계에서 효소분해 조건은 40~50℃, 15~20시간, pH 6~8인 것을 특징으로 하는 코쿠미가 증강된 저분자 대두 펩타이드 제조 방법.
제 1항에 있어서,

상기 펩타이드를 분리하는 단계에서 분리는 막의 배제분자량이 10,000~100,000Da인 여과막으로 한외여과(UF:ultrafiltration) 하는 것을 특징으로 하는 코쿠미가 증강된 저분자 대두 펩타이드 제조 방법.
삭제
제 1항 및 제 3항 내지 제 14항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 저분자 대두 펩타이드로서,

상기 저분자 대두 펩타이드는, 분자량이 300 ~ 700 Da이고, 대두 펩타이드 총 중량에 대하여 글루타민산(glutamic acid)을 3 ~ 6중량%를 포함하는 것을 특징으로 하는 코쿠미가 증강된 저분자 대두 펩타이드.
삭제
제 16항의 고쿠미가 증강된 저분자 대두 펩타이드를 포함하는 식품.