CN102083328A - 含肽的调味料 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种发酵调味料，其含有大量具有有用的生理活性的肽，但它没有显示出肽的特征性苦味且因此易于经口摄取。所述发酵调味料是通过向已经任选混有植物由来的蛋白质材料的曲霉菌培养物中添加氯化钠水溶液，并将所得到的混合物醪化，在醪化后的10天内将醪液(醪)中的亮氨酸氨肽酶-I的活性调节到1.0U/ml以下，并将其亮氨酸氨肽酶-II的活性调节到0.5U/ml以下而得到的。

Description

含肽的调味料

技术领域

本发明涉及美味的发酵调味料，虽然所述发酵调味料富含肽，但它几乎没有肽的苦味。

背景技术

近年来，已经公开了肽所具有的各种各样的功能性。例如，已报道Gly-Tyr和Ser-Tyr具有血管紧张素转换酶抑制活性及降血压活性(例如，参见非专利文献1)。另外，还报道了各种各样肽的抗氧化、抗癌、抑制血压升高、降低血胆固醇、阿片样活性等(例如，参见非专利文献2)。因此，可以期望通过摄取肽而产生各种促进人类健康的生理学效果。

就肽的生产方法而言，化学合成方法以及使用蛋白酶制品水解含有蛋白质的材料的方法被广泛用作常规上已知的方法。然而，前者由于使用了化学品所以它不适于经口摄取，而后者的问题在于生产成本变高且由于肽的强烈苦味使它不容易做到经口摄取。

迄今为止已经设计了几种技术，作为解决肽苦味的策略。例如，已经公开了添加环糊精的方法(例如，参见专利文献1)、添加低聚糖的方法(例如，参见专利文献2)、添加有机酸和糖类的方法(例如，参见专利文献3)、添加磷脂的方法(例如，参见专利文献4)、与合成吸附树脂进行接触处理的方法(例如，参见专利文献5)等。然而，目前的情况是，就这些技术的作用而言，例如由于掩味剂而产生了新的异味、生产成本显著增加等，不能说所述这些技术是满足现状的。

附带说一下，酱油是从自古以来一直使用的调味料，而且其浓烈的美味是通过使用产生自曲霉菌的酶对大豆和小麦进行水解而产生的。通过蛋白酶的活性将材料中的蛋白质可溶化为肽、并通过肽酶的活性再将所述肽降解为包括谷氨酸在内的氨基酸，从而酿成美味。因此，许多年来所进行的酱油的技术发展是把主要目标放在通过最大限度地将蛋白质与肽降解为氨基酸来增强酱油的美味上。

在酱油的酿造中，据认为肽被蛋白酶释放出来后，当它们没有被肽酶降解时，会被保留中酱油中。因此，期望所述酱油具有上述各种有益的生理活性。然而，因为在常规的制备步骤中非常难以特异性控制肽酶的活性，所以迄今为止还没有发明出这样的酱油或发酵调味料。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：JP-A-2006-75064

专利文献2：JP-A-2007-97465

专利文献3：JP-A-11-118160

专利文献4：JP-A-8-173093

专利文献5：JP-A-2003-40900

非专利文献

非专利文献1：K.Suetsuna，J.Nutr.Biochem，1998，(9)，p.415-419

非专利文献2：Wenyi Wang等，《食品科学和食品安全的综合评论》(Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety)，2005，(4)，p.63-78

发明内容

本发明要解决的问题

本发明要解决的问题是要提供发酵调味料，虽然所述发酵调味料富含具有有益的生物学活性的肽，但它不具有肽所特有的苦味且易于经口摄取。

解决问题的手段

以解决上述问题为目标，本发明的发明人已进行了深入的研究，结果发现：通过向曲霉菌培养物或曲霉菌培养物与植物由来的蛋白质材料的混合物中添加盐水以制备醪(moromi)，并通过在制备后的10天内将在醪中的亮氨酸氨肽酶-I(在下文中有时被称为LAP-I)的活性控制在1.0U/ml以下，并将亮氨酸氨肽酶-II(在下文中有时被称为LAP-II)的活性控制在0.5U/ml以下，从而得到了发酵调味料；尽管所述发酵调味料具有充分的氮利用率，但它出乎意料地含有比普通酱油多得多的肽；没有呈现出肽所特有的苦味；并且具有丰富且浓烈的美味。这样，就完成了本发明。

即，本发明提供了

1)发酵调味料，所述发酵调味料是通过向曲霉菌培养物或曲霉菌培养物与植物由来的蛋白质材料的混合物中添加盐水，并通过在制备后的10天内将在醪中的亮氨酸氨肽酶-I的活性控制在1.0U/ml以下，并将亮氨酸氨肽酶-II的活性控制在0.5U/ml以下而得到的，

2)在上述1)中描述的发酵调味料，其含有1.2％以上的可溶性总氮及40mg/ml以上的可溶性肽，

3)在上述1)或2)中描述的发酵调味料，其中可溶性总氮为1.2％以上且基于可溶性总氮的氨基化率为55％以下，

4)在上述1)至3)的任一项中所描述的发酵调味料，其中可溶性总氮为1.2％以上且每1％可溶性总氮的游离氨基浓度为0.35mol/l以下，

5)在上述1)至4)的任一项中所描述的发酵调味料，其含有40μg/ml以上的二肽Gly-Tyr，

6)在上述1)至5)的任一项中所描述的发酵调味料，其含有20μg/ml以上的二肽Ser-Tyr，以及

7)在上述1)至6)的任一项中所描述的发酵调味料，其是酱油。

发明效果

根据本发明，提供了发酵调味料，虽然所述发酵调味料富含具有有用的生理活性的肽，但它不具有肽所特有的苦味且易于经口摄取。

附图说明

图1的图显示了组合物1的HPLC色谱图。

图2的图显示了浓口酱油的HPLC色谱图。

图3显示了当高血压患者摄取了本发明的发酵调味料后收缩压的改变。

具体实施方式

下面对本发明进行详细的描述。

本发明的发酵调味料是通过向曲霉菌培养物或曲霉菌培养物与植物由来的蛋白质材料的混合物中添加盐水，并通过在制备后的10天内将在醪中的亮氨酸氨肽酶-I的活性控制在1.0U/ml以下，并将亮氨酸氨肽酶-II的活性控制在0.5U/ml以下而得到的。

就曲霉菌培养物而言，可以使用在酱油酿造中广泛和通常使用的酱油曲，而且具体来说，所述酱油曲可以通过将曲霉分生孢子接种在含有大豆、小麦等的固体培养基上并将它在25℃至45℃下培养12小时至240小时而得到。另外，也可以使用用于生产发酵调味料的液体培养曲，而且具体来说，所述液体培养曲可以通过将曲霉分生孢子接种在含有大豆、小麦、麦麸等的液体培养基中并将它在25℃至45℃下培养24小时至120小时而得到。

就本发明的植物由来的蛋白质材料而言，虽然可以使用能够实现本发明目标的任何材料，但是为了提供适合用作调味料的风味，优选使用大豆、脱脂大豆、精制大豆蛋白、小麦、小麦面筋、大米或精制大米蛋白。这些材料可以就这样被使用，或者将它们碾碎、粉碎、并随后任选进行蛋白质变性处理后再使用。就蛋白质变性处理而言，优选在工业上广泛使用的加压蒸煮及膨化处理。

就发酵条件而言，向以5∶95至100∶0、优选10∶90至80∶20的比率进行混合的曲霉菌培养物与植物由来的蛋白质材料中添加重量比为30％至500％、优选100％至300％的盐水。优选将醪的盐浓度调整至0.1至20％、优选6至18％。此外，将混合物放入温度可控的容器中并在25℃至60℃、优选30℃至55℃下进行发酵6小时至720小时、12小时至240小时。在此期间，可以使用搅拌叶片、压缩空气等任选对醪进行混合。虽然醪中的亮氨酸氨肽酶(在下文中有时被称为LAP)的活性会由于曲霉菌培养物的初始LAP活性、曲霉菌与植物由来的蛋白质材料的混合比、它们的发酵温度与发酵时间等的影响而改变，但是可以通过在制备后的10天内将醪中的LAP-I的活性控制在1.0U/ml以下，并将LAP-II的活性控制在0.5U/ml以下，从而得到目的发酵调味料。

虽然上述发酵调味料是酱油醪样的形式，但是也可以按照需要通过除去固形成分而得到含有可溶性肽的液态发酵调味料。就除去不溶性物质的方法而言，可以使用常规上已知的方法，例如：其中使用合成纤维如尼龙等制成的滤布对醪进行包裹并挤压的方法；其中将醪放入贴在过滤板和压榨板上的滤布中并使用压缩空气等进行挤压的方法；以及类似方法。

通过向上述发酵调味料中添加属于接合酵母属的酵母菌株并进行发酵，可能会进一步增进香味。具体来说，向醪中添加10⁴个细胞/ml至10⁸个细胞/ml、优选10⁵个细胞/ml至10⁷个细胞/ml的酵母并在20℃至35℃、优选25℃至30℃下进行发酵3天以上、优选5至10天。为了使发酵旺盛，任选进行搅拌和通风。在这方面，当在这样的条件下进行发酵时，肽量几乎没有被减少。

虽然上述发酵调味料含有大量肽，但它几乎没有呈现苦味；具有丰富且浓烈的美味和醇度以及柔和且极佳的香气；并且可以作为调味料服用，十分美味；所述发酵调味料与常规上已知的含肽组合物大不相同。

因为上述发酵调味料具有所期望的风味，所以可以通过如下方式将它制成酱油或含酱油的产品而对它进行适当的应用：将它添加到酱油中或通过将它与各种材料进行混合而将它加工成柴鱼酱油(日式汁汤)、烧汁(蘸汁)、酸橘酱(基于柑橘的汁)、沙司、调料、汤、家庭菜肴底料、饮料、补品等。

另外，可以从上述发酵调味料中对肽进行浓缩或分离精制。方法的例子包括在真空浓缩、超滤、透析、各种类型的色谱法等。这些都是常规且广泛使用的方法。

虽然下面根据实施例对本发明进行了具体的描述，但是这些描述并没有限制本发明的技术范围。

实施例1

<含肽发酵调味料的生产>

通过将曲霉：酱油曲霉的分生孢子添加到含有等量的膨化大豆和小麦的固体培养基中并在25℃至40℃下进行发酵72小时，从而得到了酱油曲。然后，在45℃和100rpm下将14kg膨化大豆、2kg所述酱油曲、16升水以及3kg食盐进行混合和搅拌。此后10天，得到了醪，在所述醪中的LAP-I的活性被降低至1.0U/ml以下，并且LAP-II的活性被降低至0.5U/ml以下。然后，以1.5×10⁶个细胞/ml的比率将酵母菌-鲁式接合酵母与之混后并使其在25℃下放置7天。然后，通过使用水压机从醪中除去不溶性固形成分得到了上清液。此外，在117℃下使用HS灭菌器(由HISAKA WORKS，LTD。制造)用5秒钟进行酶失活和灭菌，并在50℃下放置3天后，单独收集不含沉淀物的20升上清液(组合物1；本发明的发酵调味料)。还使用3.2kg大豆及12.8kg所述酱油曲通过相同的方法来制备发酵调味料(组合物2；本发明的发酵调味料)。此外，使用16kg所述酱油曲通过相同的方法来制备发酵调味料，但在发酵中不添加大豆(组合物3：本发明的发酵调味料)。

对制备后第10天的各种醪进行过滤，对这样获得的味汁中的各种肽酶的活性进行测量。使用L-亮氨酸-对硝基苯胺作为底物通过在日本专利特许第3727780号公报记载的方法对LAP-I的活性进行测量。用PD-10柱(由GE Health Care Bioscience制造)对醪进行过柱以除去游离氨基酸，然后使用L-亮氨酰-甘氨酰-甘氨酸作为底物通过在日本专利特许第3727780号公报记载的方法对LAP-II的活性进行测量。用PD-10柱对醪进行过柱以除去游离氨基酸，然后使用酸性羧肽酶活性测量试剂盒(由KIKKOMAN CORPORATION制造)依照常规方法对酸性羧肽酶(ACP)的活性进行测量。通过Agnes Doumas等的《应用和环境微生物学》(Applied and Environmental Microbiology)，1998，64卷，No.12，p.4809-4815中描述的方法对二肽酰肽酶Ⅳ(DPP-Ⅳ)的活性进行测量(表1)。虽然在45℃下制备了10天时的ACP和DPP-Ⅳ的活性与在15℃的情况相比没有改变，但是在45℃下LAP的活性降低了(组合物3；本发明的发酵调味料)。当将曲的比率降低时，醪中的各种酶的活性也被进一步被降低了(组合物1和2；本发明的发酵调味料)。在组合物1的情况中，可以看出与比较例的浓口酱油的醪(初始阶段发酵温度为15℃，曲∶大豆＝10∶0)相比，尤其是LAP的活性被显著降低。在另一方面，当使用具有不同生产批次的曲制备与组合物3类似的发酵调味料时，也发现了LAP活性高于本发明的情况(比较例1)。

表1

发酵温度

曲∶大豆

LAP-I

LAP-II

ACP

DPP-Ⅳ

组合物1	45℃	1∶7	0.06	0.01	0.32	0.021
							组合物2	45℃	8∶2	0.33	0.18	1.69	0.102
组合物3	45℃	10∶0	0.78	0.30	1.90	0.111
							比较例1	45℃	10∶0	1.15	0.59	1.99	0.109
浓口酱油	15℃	10∶0	2.39	1.65	1.69	0.098

实施例2

然后，进行除酶活性以外的各种分析。使用Kjeltec自动进样系统1035(由ACTAC制造)依照常规方法对可溶性总氮(TN)进行测量。通过在6N盐酸的存在下在110℃下加热24小时然后使用氨基酸分析仪L-8500(由Hitachi，Ltd.制造)进行总氨基酸分析，从与盐酸水解前相比增加的游离氨基酸量来计算肽量。氨基化率是指基于所述TN的总氨基酸浓度的比率。在这方面，将6.25作为大豆蛋白的常规氮系数用在TN的计算中。通过用具有已知浓度的甘氨酸所制备的校准曲线来计算游离氨基的浓度，所述校准曲线是通过使所述甘氨酸与等量的OPA试剂(由Agilent Technologies，Inc.制造)进行反应并测量在Ex：350nm和Em：450nm下的荧光强度而制备的。使用LC-MS/MS系统2695-QuattroMicro API(由Waters Corporation制造)通过标准加标样品的校准添加曲线对Gly-Tyr和Ser-Tyr的量进行计算。在LAP活性被降低的组合物1、2以及3的例子(本发明的发酵调味料)中，可以看出与浓口酱油相比肽量大；氨基化率低；并且每1％TN中的游离氨基浓度低(表2)。另一方面，在使用具有不同生产批次的曲通过与组合物3中相同的方法进行制备的比较例1的例子中，可以看出肽量小；氨基化率高；以及每1％TN中的游离氨基浓度高。根据这些，为了获得含有大量肽的本发明的发酵调味料，必要条件是将LAP-I的活性控制在1.0U/ml以下，并将LAP-II的活性控制在0.5U/ml以下，而且可以说所述事实并不是常规已知的。

使用配备有Puresil C18柱(4.6×250mm，由Waters Corporation制造)的高效液相色谱法(在下文中被称为HPLC，由JSACO Corporation制造)对组合物1(本发明的发酵调味料)及普通的浓口酱油进行分析。使用含有0.1％三氟乙酸(TFA)的洗提液在1ml/分的流速下以及在0％至30％的乙腈浓度梯度下进行洗提。通过220nm的吸光度进行检测。在这方面，通常已知在所述分析条件下观察到的大多数峰都来源于肽。从图1和图2可以看出，与通常的浓口酱油相比，在组合物1(本发明中的发酵调味料)中发现了多种多样的肽，并且它们的量也相当大。在这方面，证实了存在于浓口酱油中也发现在15分钟、18分钟以及23分钟处的大峰(由↓来显示)不是肽，而分别为氨基酸Tyr、Phe以及Trp。另外，还证实了其它氨基酸几乎没有被这个柱所保留并在5分钟以下的时间被洗提。

使用食用的蛋白酶制品Alkalase 2.4 L-FG(由Novozymes制造)替代酱油曲，通过相同的方法来制备发酵调味料(比较例2)。使用组合物1(本发明的发酵调味料)以及比较例2进行感官评价。通过配对比较法由8名研究小组成员对“苦味强度”及“味道偏好”进行评估。从表3的结果可以看出，尽管本发明的发酵调味料含有大量肽，但它几乎没有呈现苦味并具有所期望的口味。虽然迄今为止已经公开了许多通过蛋白酶制品来生产肽的方法，但是据认为，就口味而言本发明优于相关的技术。

表3

	样品具有强烈苦味	样品具有所期望的口味
			组合物1	1	8
比较例2	7	0

实施例3

<在高血压患者中的效力测试>

使用本发明的发酵调味料来制备含有54μg/ml的Gly-Tyr和31μg/ml的Ser-Tyr的酱油样调味料；使用普通低盐酱油作为对照食品通过双盲试验在正常高值血压者(男性36人和女性35人，共计71人)以及轻度高血压者(I度高血压者)(男性29人和女性32人，共计61人)中进行12周的连续摄取试验。使受试者以每天一袋(8ml)的量、在任选时间用其进行烹调的方式连续摄取12周被测食品或对照食品(8ml是在家庭中酱油的标准每日摄取量，每8ml含有430μg的Gly-Tyr和250μg的Ser-Tyr)。结果，观察到了通过摄取本发明的被测食品而产生的定期的轻度降压效果(图3)。与摄取前的值相比，在摄取了4周及以后的收缩压呈现了显著的降低。另外，与对照食品组相比，摄取了8周及以后，收缩压被显著降低了。从这些结果证实了，与低盐酱油相比，本发明的发酵调味料具有肽的显著降压活性；而且显示出，当含有40μg/ml以上的Gly-Tyr以及20μg/ml以上的Ser-Tyr时，效果显著。

虽然已参照本发明的具体实施方案对本发明进行了详细的描述，但是在不背离本发明的精神和范围的情况下可以对本发明做出各种改变和修改，这对于本领域的专业人员来说是显而易见的。

本申请是建立在2008年7月2日提交的日本专利申请(特愿2008-172871)以及2009年6月29日提交的日本专利申请(特愿2009-153239)的基础上，并且通过参考将其全部内容纳入至本文中。

工业实用性

通过本发明获得的发酵调味料虽然富含肽，但它不具有肽所特有的苦味且易于经口摄取。因此，期望用它来发挥有益的生理活性并期望用它来促进人类健康。

Claims (7)

1.发酵调味料，所述发酵调味料是通过向曲霉菌培养物或曲霉菌培养物与植物由来的蛋白质材料的混合物中添加盐水，并通过在制备后的10天内将在醪中的亮氨酸氨肽酶-I的活性控制在1.0U/ml以下，并将亮氨酸氨肽酶-II的活性控制在0.5U/ml以下而得到的。

2.根据权利要求1的发酵调味料，其含有1.2％以上的可溶性总氮及40mg/ml以上的可溶性肽。

3.根据权利要求1或2的发酵调味料，其中可溶性总氮为1.2％以上且基于可溶性总氮的氨基化率为55％以下。

4.根据权利要求1至3中任一项的发酵调味料，其中可溶性总氮为1.2％以上且每1％可溶性总氮的游离氨基浓度为0.35mol/l以下。

5.根据权利要求1至4中任一项的发酵调味料，其含有40μg/ml以上的二肽Gly-Tyr。

6.根据权利要求1至5中任一项的发酵调味料，其含有20μg/ml以上的二肽Ser-Tyr。

7.根据权利要求1至6中任一项的发酵调味料，其是酱油。

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